CN103805604A - 大豆开花基因GmFT2a启动子 - Google Patents

Abstract

大豆开花基因GmFT2a启动子，它涉及大豆开花基因GmFT2a启动子序列。本发明的目的是提供大豆开花基因GmFT2a启动子。本发明的大豆开花基因GmFT2a启动子核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示。GmFT2a基因启动子起开花促进作用，本发明通过大豆遗传转化验证，阐明GmFT2a的启动子在大豆开花期中起调控开花作用。本发明不但对于揭开大豆开花期和生育期的分子机理具有非常重要的意义，而且也可以利用开发的分子标记进行分子标记辅助育种，加快育种进程，提高育种效率。本发明应用于大豆基因工程领域。

Description

大豆开花基因GmFT2a启动子

技术领域

本发明涉及大豆开花基因GmFT2a启动子序列，属于植物基因工程领域和作物分子育种领域。

背景技术

大豆为人类提供重要的植物蛋白质和油份。在世界范围内，北至高纬度的北欧瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等广泛区域内均有大豆栽培，但单个品种或种质资源一般适宜种植的纬度跨度较小，这种区域适应性与大豆光周期和生育期基因或者数量性状位点（Quantitative Trait Locus，QTL）密切相关。选育生态适应性广的优良大豆品种是实现高产、优质、高效大豆产业的根本途径。但常规育种在广适应品种选育中进展缓慢，利用分子育种手段有望定向调节大豆光周期和生育期，加快广适应品种的选育。模式植物拟南芥和水稻的研究结果表明，开花素(Florigen，FT蛋白)从叶片转运到茎尖诱导花的形成（Corbesier等，2007；Tamaki等，2007）。

我们从大豆中克隆了10个FT基因，这10个基因成对的复制在大豆连锁群上。基因表达分析的结果显示，在开花诱导条件即短日照条件下，有两个FT基因（GmFT2a和GmFT5a）在花芽形成期（25～30天左右），在三出复叶中大量表达，而其他基因表达量极低或者不表达。并且这两个基因呈现生物钟规律的基因表达类型，在光照开始4个小时表达强度最高之后逐渐减弱。在非诱导的长日照条件下，只有一个FT基因（GmFT5a）相对表达，从而导致了在此条件下大豆开花期较晚，生育期延长。利用大豆光敏色素A基因的双突变体（Harosoy-e3e4）研究则发现，在长日照条件下，Harosoy-e3e4的开花期与其野生型植株在短日照条件下的开花期一致。而且，在双突变体中，在花芽形成期，GmFT2a和GmFT5a的表达被大量诱导而且呈现与短日照完全相同的生物钟规律的基因表达。这些研究结果从分子水平上初步揭示了大豆开花期和生育期的分子机理，即（1）在诱导的短日照条件下，有两个FT基因参与表达导致花期很短，然而在非诱导的长日照条件下，只有一个FT基因参与表达从而导致开花期变长；（2）大豆经过自身进化使光敏色素A基因失活来适应在高纬度区域生存，而这一进化过程又是最终通过调控两个大豆中主要的FT基因表达来实现的；（3）在长日照条件下，长日照植物拟南芥的光敏色素A基因诱导FT基因的表达，而短日照植物大豆的光敏色素A基因却抑制FT基因的表达，说明短日照植物含有与长日照植物不同的光周期反应调控机制（Kong等2010）。此外，通过大豆遗传转化技术，研究者进一步验证了GmFT2a具有大豆开花促进功能（Sun等2011）。Jiang等（2013）研究表明大豆光周期敏感性和开花时间与GmFT2a的启动子多态性密切相关。但是，GmFT2a基因的启动子如何影响着大豆生育期（开花期及成熟期）是一个非常重要的科学问题，相关研究鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供大豆开花基因GmFT2a启动子。

本发明的大豆开花基因GmFT2a启动子核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本发明的有益效果：

本发明是在克隆出大豆开花基因GmFT2a（Kong等2010）的基础上，进一步对GmFT2a基因的启动子序列进行深入系统的研究，我们已证实GmFT2a基因具有促进大豆开花的功能，本发明对不同品种中GmFT2a基因的启动子序列进行了研究，并确定了GmFT2a的启动子对大豆生开花期关系密切。

通过QTL技术分析可知，从大豆品种TK780中获得的开花基因GmFT2a的启动子具有序列表中Seq ID No：1的核苷酸序列，从大豆品种H4中获得的开花基因GmFT2a的启动子具有序列表中的Seq ID No：2的核苷酸序列，两者相比，除少数SNP外，如Seq ID No：1所示的序列，在GmFT2a基因上游958bp处有一个42碱基的插入，在1677bp处有一个10碱基的缺失。如Seq ID No：2所示的序列，GmFT2a基因上游958bp有一个42碱基的缺失，在1677bp处有一个10碱基的插入。通过生物信息学分析，结果表明Seq ID No：1比Seq ID No：2多出2个顺式元件，分别和双组份信号系统的细胞分裂素信号途径、花粉的成熟和萌发相关。

进一步的大豆遗传转化实验表明，转GmFT2a基因启动子序列Seq ID No：2的植株比转对照GmFT2a基因启动子序列Seq ID No：1的植株早开花，说明GmFT2a基因启动子序列Seq ID No：2起开花促进作用。

本发明要解决开花期及成熟期长的问题，提供了大豆开花基因FT启动子，本发明为分子手段培育广适应作物品种创造了条件，将在植物的遗传改良中发挥重要作用，本发明通过大豆遗传转化验证，表明含开花基因GmFT2a启动子转基因植株与对照相比，其促进开花的功能明显增强，阐明GmFT2a的启动子在大豆开花期中起调控开花作用。

本研究不但对于揭开大豆开花期和生育期的分子机理具有非常重要的意义，而且同时也可以利用开发的分子标记进行分子标记辅助育种，加快育种进程，提高育种效率，本发明应用于大豆基因工程领域。

附图说明

图1为pTF101.1-GmFT2a-P质粒过表达载体结构示意图，其中FT2a-P表示GmFT2a的启动子；

图2为未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因与转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆开花时间图，其中1为未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆，2为转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆；

图3为未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆营养生殖状态图；

图4为转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆开花状态图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的大豆开花基因GmFT2a启动子核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本实施方式是在分子水平上首次成功地克隆、验证大豆开花基因GmFT2a的启动子的功能。

本实施方式是在克隆出大豆开花基因GmFT2a（Kong等2010）的基础上，进一步对GmFT2a基因的启动子序列进行深入系统的研究，我们已证实GmFT2a基因具有促进大豆开花的功能，本实施方式对不同品种中GmFT2a基因的启动子序列进行了研究，并确定了GmFT2a的启动子对大豆生开花期关系密切。

通过QTL技术分析可知，从大豆品种TK780中获得的开花基因GmFT2a的启动子具有序列表中Seq ID No：1的核苷酸序列，从大豆品种H4中获得的开花基因GmFT2a的启动子具有序列表中的Seq ID No：2的核苷酸序列，两者相比，除少数SNP外，如Seq ID No：1所示的序列，在GmFT2a基因上游958bp处有一个42碱基的插入，在1677bp处有一个10碱基的缺失。如Seq ID No：2所示的序列，GmFT2a基因上游958bp有一个42碱基的缺失，在1677bp处有一个10碱基的插入。通过生物信息学分析，结果表明Seq ID No：1比Seq ID No：2多出2个顺式元件，分别和双组份信号系统的细胞分裂素信号途径、花粉的成熟和萌发相关。

进一步的大豆遗传转化实验表明，转GmFT2a基因启动子序列Seq ID No：2的植株比转对照GmFT2a基因启动子序列Seq ID No：1的植株早开花，说明GmFT2a基因启动子序列Seq ID No：2起开花促进作用。

本实施方式利用PCR方法从大豆中克隆出大豆开花基因GmFT2a的启动子。

本实施方式通过大豆遗传转化手段，将GmFT2a的启动子序列Seq ID No：2连着GmFT2a基因在一起转入大豆品种TK780（GmFT2a的启动子序列Seq ID No：1，属功能缺失型），能使大豆品种TK780早花10天左右。

通过以下试验验证本发明的效果：

（1）大豆开花基因GmFT2a启动子的获得

利用SSR标记构建大豆重组自交系H4×TK780的连锁图谱，在以e1nlRIL群体背景下，定位到了一个QTLs，位于J连锁群的GmFT2a基因位点。通过对H4和TK780的重测序结果分析表明，两者间GmFT2a基因cDNA序列没有差异。分别以大豆品种H4和TK780的叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，通过F1与R1引物扩增GmFT2a基因的启动子，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35循环，再72℃延伸90秒，将PCR产物在ABI3130测序仪（ABI公司）上进行测序；

其中，引物F1的序列为GCCGATCATGACAGTGCATG；引物R1的序列为CTTCCACTAGGCATGGGATA。

测序结果表明大豆品种TK780中开花基因GmFT2a的启动子具有序列表中Seq ID No：1的核苷酸序列，大豆品种H4中开花基因GmFT2a的启动子具有序列表中的Seq ID No：2的核苷酸序列。

大豆GmFT2a的启动子序列Seq ID No：1与GmFT2a的启动序列Seq ID No：2相比，除少数SNP外，前者在GmFT2a基因上游958bp处有一个42碱基的插入，在1677bp处有一个10碱基的缺失，从而改变GmFT2a基因的功能。

（2）大豆开花基因GmFT2a启动子的功能验证

利用F2和R2为引物，以（1）中H4中开花基因GmFT2a的启动子为模板通过PCR进行5’与3’扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90秒，共35循环，再72℃延伸10min，获得含有PstI-XbaI双酶酶切位点的大豆开花基因GmFT2a的启动子；将获得的含有酶切位点的大豆开花基因GmFT2a的启动子克隆到pTF101.1-GmFT质粒中，替换35S启动子，获得pTF101.1-GmFT2a-P质粒，以大豆品种TK780为材料，利用农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因大豆，将含有H4型启动子的转基因大豆与未转入H4型GmFT2a的启动子的大豆在长日照条件下种植，观察大豆生长及开花状态。

其中，pTF101.1质粒在2006年《Plant Cell Reports》中刊登的名称为″Improvedcotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation”的文章中公开，由文章的作者惠赠；大豆品种TK780和H4由北海道大学Abe交警惠赠。

其中，引物F2的序列为CTGCAGGCCGATCATGACAGTGCATG；引物R2的序列为TCTAGACTTCCACTAGGCATGGGATA。

其中pTF101.1-GmFT2a-P质粒结构示意图如图1所示。

未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆营养生殖状态图如图3所示，转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆开花状态图如图4所示，由图3和图4可以看出，当转入H4型GmFT2a的启动子的大豆开花时，未转入H4型GmFT2a的启动子的大豆还没有开花，表明转入H4型GmFT2a的启动子能互补TK780中GmFT2a的启动子功能缺失，同时也进一步说明GmFT2a的启动子是此QTL的候选基因。

未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因与转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆开花时间图如图2所示，其中1为未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆品种TK780，2为转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆品种TK780，由图2可以看出，TK780的开花时间约平均33.75天，而转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆品种TK780的开花时间平均为23天，表明转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆开花时间比未转入Seq ID No：2启动子序列连着GmFT2a基因的大豆开花时间早10天，从而说明GmFT2a的启动子在大豆开花中起促进功能，同时也进一步说明GmFT2a的启动子是此QTL的候选基因。

Claims (1)

1.大豆开花基因GmFT2a启动子，其特征在于大豆开花基因GmFT2a启动子核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

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