CN104357453A - 促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因 - Google Patents
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Abstract
促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，它涉及两个水稻开花基因的不同组合决定着水稻可以在黑龙江哪个积温带种植。本发明提供了两个开花基因的丧失功能的突变类型，并设计了相应的分子标记，利用这些标记对对黑龙江水稻材料的开花基因进行鉴定，把开花基因的基因型和开花期进行关联分析，验证了这两个基因的突变，可以显著影响黑龙江水稻的抽穗期，两个基因之间的四种组合方式，决定水稻的适合种植区域。本发明不但对于揭开水稻开花期的分子机理具有非常重要的意义，而且也可以利用开发的分子标记进行分子标记辅助育种，加快育种进程，提高育种效率。本发明应用于水稻基因工程领域。
Description
技术领域
本发明涉及水稻抽穗期基因Hd2，Hd4在黑龙江水稻品种中分型。
背景技术
黑龙江是我国优质粳稻的主产区和商品粮区，属于北方高纬度寒地稻作区，南北纬度跨度大(43°25′N到53°33′N)，对水稻生长来说，可以分成4个积温带，越往北部，积温越低，要求品种熟期越早，在霜冻来临前，完成水稻成熟。在每个积温带又分成早熟区和晚熟区，就导致每个品种种植适应区狭窄，因而虽然审定品种很多，但是种植面积大的品种少，一些优良品种，由于生育期的限制，不能够跨区种植。控制水稻抽穗期的基因众多，目前，已经有大量控制水稻抽穗期基因被报道，也有多个数量性状基因被克隆。但长日照条件下，控制水稻开花的基因主要是Hd1，Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8，以及最近克隆的Hd16，这些基因的不同组合形式，又将对抽穗期进行微调，研究黑龙江省水稻品种的开花基因的基因型、以及不同基因间的组合方式，将有助于揭示控制黑龙江省水稻生育期的主效基因和微效基因，以及不同积温区的品种中，各种开花基因的组合方式，进一步通过分子辅助育种的方式，人工改造不同开花基因的组合方式，来选育适合当地的水稻品种，加速育种进程；同时，对优良品种进行开花基因的改造，扩大优良品种的种植区域。
发明内容
本发明的促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，能够鉴定适合黑龙江省不同积温带种植的水稻品种中，控制水稻抽穗期基因的基因型和组合方式。
促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，所述的Hd2和Hd4基因突变型促进水稻提早抽穗，其中，Hd2基因的突变是在氨基酸710位置由亮氨酸突变为脯氨酸，Hd4基因在序列157碱基G突变为T。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用三积温区主栽品种空育131和第二积温区东农422的F7重组自交系，进行生育期基因的定位，发现Hd2是在黑龙江省区控制水稻在不同积温带分布的主效基因，同时以136种不同水稻品种为材料，探明了其余Hd4基因的基因类型。
在北方品种中，选取136种不同水稻品种，将基因型分型组合数据与抽穗期关联分析，发现Hd2与Hd4是决定北方水稻积温带分布的主效基因。Hd2或Hd4基因的突变可以促 进水稻提早抽穗，而Hd2与Hd4同时突变的品种变现为极早抽穗。
附图说明
图1为Hd2基因在序列2129的碱基由T突变为C，导致氨基酸710位置由亮氨酸突变为脯氨酸的突变结构示意图；
图2为依据此突变位点设计Hd2-CAPS得到的PCR扩增产物使用XcmI消化的电泳图；其中，1和3为Hd2基因的野生型电泳图，2和4为Hd2基因的突变型电泳图；
图3为Hd2基因类型与水稻抽穗期关联分析柱状图；其中，A为Hd2基因的突变型型，B为Hd2基因的野生型；
图4为Hd4基因在序列157碱基G突变为T的突变结构示意图；
图5为依据此突变位点设计Hd4-CAPS得到的PCR扩增产物使用XhoI消化的电泳图；其中，1-3为Hd4基因的野生型电泳图，4为Hd4基因的突变型电泳图；
图6为Hd4基因类型与水稻抽穗期关联分析柱状图；其中，A为Hd4基因的突变型，B为Hd4基因的野生型；
图7为136种水稻品种中Hd2与Hd4基因的4种不同组合形式在黑龙江省的分布的饼状图；
图8为136种水稻品种中Hd2与Hd4基因的4种不同组合形式在黑龙江省不同积温带的分布的柱状图；
图9为黑龙江省内的积温带分布情况。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，Hd2和Hd4基因突变型促进水稻提早抽穗，其中，Hd2基因的突变是在氨基酸710位置由亮氨酸突变为脯氨酸，Hd4基因在序列157碱基G突变为T。
本实施方式的Hd2与Hd4同时突变的水稻品种开花极早，极适宜在北方高寒地区种植，在第三积温带分布广泛。
本实施方式的Hd2基因在氨基酸710位置由亮氨酸突变为脯氨酸，导致功能缺失从而能够使北方高寒地区种植的水稻提前开花(抽穗)；
Hd4基因在序列157碱基G突变为T导致终止密码子出现，氨基酸翻译提前终止丧失功能；从而能够使北方高寒地区种植的水稻提前开花(抽穗)。
由于，Hd2与Hd4是决定北方水稻积温带分布的主效基因，本实施方式的Hd2或Hd4基因的突变可以促进水稻提早抽穗，因而Hd2与Hd4同时突变的品种变现为极早抽穗。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：Hd2/Hd4基因促进提前抽穗的水稻是南北纬度为43°25′N到53°33′N区域的水稻。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：Hd2/Hd4基因促进提前抽穗的水稻是南北纬度为43°25′N到53°33′N的第三积温带区域的水稻。其它与具体实施方式一至三之一相同。
本实施方式的Hd2/Hd4基因适用于黑龙江省的水稻，能够促进黑龙江地区的水稻提前抽穗。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
本实施例的促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因的获得如下：
(1)Hd2基因的获得
利用空育131(KY131)×东农422(DN422)杂交获得的F7重组自交系作为QTL群体，通过Mapmaker/Exp3.0构建遗传图谱，使用Mapmaker/QTL1.1计算抽穗期与株高的QTL位点，在RM5455与RM1362区间发现一个主效位点，与报道的Hd2/OsPRR37位点重叠。TRIzol(Invitrogen)法提取KY131和DN422的RNA，利用SuperscriptII Reverse Transcriptase.反转录获得cDNA，以此cDNA模板采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS，以Hd2-CAPS为引物，扩增Hd2基因片段；
其中，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸2min，共40循环，再72℃延伸10min；
所述的空育131(KY131)和东农422(DN422)是市面购买得到的。
(2)Hd4基因的获得
根据已经发表的Hd4基因序列，设计引物，在黑龙江品种中进行Hd4基因的测序，从测序的40个品种中，只发现一种突变类型，根据此种突变类型，设计Hd4-CAPS为引物，从而对黑龙江136个材料进行Hd4基因的分型；
其中，PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环，再72℃延伸10min；
(3)Hd2基因的基因型鉴定
一、取长至三叶真叶期的待测品种(所有136份材料)叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA；
二、以步骤一提取的50ng基因组DNA为模板，以Hd2-CAPS为引物采用购买自TransStart公司的HiFi酶进行扩增，PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环，再72℃延伸10min；
三、取经步骤二PCR的产物约8μl，经Xcm1限制性内切酶(购买自Takara公司)，在37℃消化3h；
四、将步骤三酶切后的产物，采用8％非变性PAGE胶电泳进行检测；其中，野生型被切掉27bp，突变体大小不变，电泳结果如图2所示；
将PCR产物(Hd2基因)测序，比对结果表明空育131中的Hd2/OsPRR37基因的保守CCT区域发生点突变(如图1所示)；
连续两年统计136份材料抽穗期，将抽穗期数据与基因型进行方差分析(结果如图3所示)，结果表明Hd2基因突变可以促使水稻在长日照下提早开花；
(4)Hd4基因的基因型鉴定
一、取长至三叶真叶期的待测品种(所有136份材料)叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA；
二、以步骤一提取的50ng基因组DNA为模板，以Hd4-CAPS为引物采用购买自TransStart公司的HiFi酶进行扩增，PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环，再72℃延伸10min；
三、取经步骤二PCR的产物约8μl，经Xho11限制性内切酶(购买自Takara公司)，在37℃消化3h；
四、将步骤三酶切后的产物，采用8％非变性PAGE胶电泳进行检测，其中，野生型材料切掉26bp，突变体大小不变，电泳结果如图5所示；
Hd4基因在序列157碱基G突变为T导致终止密码子出现，氨基酸翻译提前终止丧失功能(结果如图4所示)；从而能够使北方高寒地区种植的水稻提前开花(抽穗)。
连续两年统计136份材料抽穗期，将抽穗期数据与基因型进行方差分析(结果如图6所示)，结果表明Hd4基因突变同样可以促使水稻在长日照下提早开花；
(5)Hd基因的基因型分型与水稻品种积温带分布
依据北方控制水稻抽穗期的主效基因Hd2与Hd4，对136份材料进行基因型分类，如图5A所示，Hd2与Hd4同时突变的品种居多，这样的水稻品种开花极早，极适宜在北方高寒地区种植，因而在第三积温带分布广泛，如图9所示。
其中，Hd2-CAPS引物与Hd4-CAPS引物的序列如下表所示：
表1 Hd2-CAPS引物与以Hd4-CAPS引物的序列
结果分析：
本实施例采用构建的空育131x东农422重组自交系群体F7代，进行抽穗期基因的定位，鉴定到一个主效的QTL，贡献率达50％以上(表2)。该QTL与报道的Hd2/OsPRR37位点重叠。对空育131和东农422的Hd2/OsPRR37基因进行测序，结果表明空育131中的Hd2/OsPRR37基因的保守CCT区域发生点突变。
表2 重组自交系抽穗期和株高的QTL定位
本实施例是首先选取40种黑龙江省水稻品种，克隆得到四个抽穗期基因Hd2，Hd4片段，对单一条带的PCR产物测序，获悉各基因突变或缺失位点，对基因类型初步分型，随后选取其余96种水稻品种，设计Hd2-CAPS，Hd4-CAPS，鉴定不同品种的四种基因型(表3)，将统计获得的2012年及2013年这136种水稻品种的抽穗期数据与基因型进行相关性分析，从而得到黑龙江省不同抽穗期基因组合形式的水稻品种分布情况。
表3 黑龙江省136种水稻品种的Hd基因的基因型和抽穗期及积温带分布
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
Claims (3)
1.促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，其特征在于所述的Hd2和Hd4基因突变型促进水稻提早抽穗，其中，Hd2基因的突变是在氨基酸710位置由亮氨酸突变为脯氨酸，Hd4基因在序列157碱基G突变为T。
2.根据权利要求1所述的促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，其特征在于Hd2/Hd4基因促进提前抽穗的水稻是南北纬度为43°25′N到53o33′N区域的水稻。
3.根据权利要求2所述的促进水稻提前抽穗的Hd2/Hd4基因，其特征在于Hd2/Hd4基因促进提前抽穗的水稻是南北纬度为43°25′N到53°33′N的第三积温带区域的水稻。
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