CN105671039A - 大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用 - Google Patents

大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用。本发明大豆始花期主效QTL位点位于大豆第15号染色体Gm15:48600kb-49850kb区间，分子标记位于大豆第15号染色体Gm15:49588kb。该分子标记的上游引物序列为Seq？ID？NO.1，下游引物序列为Seq？ID？NO.2。在用该引物对扩增NJZNRIL群体中始花期长短不同的两组材料及新配置的次级群体中，含有180bp特异DNA片段的材料有一个较大的始花期表型值。本发明所提供的分子标记可用于大豆品种或品系始花期长短的筛选或鉴定，提高育种效率。

Description

大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用
技术领域
本发明涉及大豆分子标记辅助育种，属于大豆遗传育种领域，尤其涉及大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用。
背景技术
大豆始花期是重要的生育期性状之一，是一个复杂数量性状，易受环境因素影响，目前在Soybase上，公布了至少70个大豆始花期QTL，分布在20个连锁群上。大豆始花期不仅是控制大豆由营养生长向生殖生长转变的重要节点，而且前人的研究结果还表明大豆始花期对许多产量相关性状都有影响。在不同大豆产区，都具有与之相适应的生态类型，因此准确预测大豆始花期对筛选适合的大豆品种进行育种具有重要意义。
由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰，可以从分子水平定向选择目标性状基因，克服了简单基于表型选择的常规育种方法中存在的选择效率低和育种周期长等缺点。因此分子标记辅助选择是减少育种时间提高育种效率的一个有效的方法。而分子辅助选择的关键是能否检测到在多环境下控制目标性状的主效QTL及与之紧密连锁的实用分子标记。随着数量性状作图方法、分子生物学和基因组学的迅速发展，数量性状定位以及分子标记技术广泛应用为分子辅助育种提供了基础。
发明内容
本发明的目的是提供大豆始花期主效QTL紧密连锁的分子标记indel15-1。
本发明的另一目的是提供该分子标记的引物对。
本发明的又一个目的是提供该大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1或其引物对在检测所述的大豆始花期主效QTL及鉴定大豆始花期长短中的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实施：
一个大豆始花期主效QTL，该位点位于大豆第15号染色体Gm15:48600kb-49850kb，所述的紧密连锁标记indel15-1位于大豆第15号染色体Gm15:49588kb。所述的主效QTL位点在‘NJZNRIL’群体中6个环境下都可以检测到，最高可以解释24％的表型变异，6个环境平均有18％的表型解释率；在ZN-164与NN1138-2的回交构建的BC2F2群体中解释了19.8％的表型变异。
本发明所述的大豆始花期主效QTL的紧密连锁标记indel15-1，该分子标记的上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。
本发明所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1在检测所述的大豆始花期QTL中的应用。
本发明所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1在鉴定大豆始花期长短中的应用。
本发明所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对，该引物对的上游引物序列为SeqIDNO.1，下游引物序列为SeqIDNO.2。
本发明所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对在检测本发明所述的大豆始花期主效QTL中的应用。
本发明所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对在鉴定大豆始花期长短中的应用。
一种利用本发明所述分子标记或引物对检测所述的大豆始花期主效QTL的方法，利用本发明所述的引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180～210bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆始花期主效QTL。
一种利用本发明所述分子标记或引物对鉴定大豆品种始花期长短的方法，优选用所述的indel15-1引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆始花期增效QTL位点，预测该大豆具有较大的始花期，如果获得210bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆始花期减效QTL位点，预测该大豆具有较小的始花期。
本发明大豆始花期主效QTL连锁的分子标记indel15-1是通过下列步骤筛选的：
(1)利用ZXD和NN1138-2杂交，得到杂种F1，通过‘单粒传’法构建群体，获得236个F2:8代重组自交系(‘NJZNRIL’)；
(2)使用SLAF-seq技术对ZXD和NN1138-2及236重组自交家系进行基因分型，利用Highmap作图软件进行遗传连锁图谱构建；
(3)对ZXD和NN1138-2构建的‘NJZNRIL’群体的始花期进行测定，利用复合区间作图法(WinQTLcart2.5)进行定位，在第15号染色体48600kb-49850kb内检测到大豆始花期主效QTL；
(4)根据大豆第15号染色体48600kb-49850kb的序列信息，设计分子标记；
(5)利用‘NJZNRIL’衍生的162个BC2F2次级群体，测定大豆始花期，同时鉴定新设计分子标记的遗传带型；
(6)根据次级群体表型数据和分子标记数据，单标记分析后，发现紧密连锁标记indel15-1，贡献率为19.8％(P<0.00001)，而且其遗传带型清晰可见，无杂带。
有益效果：
本发明在国际上首次鉴定了一个位于大豆Gm15号染色体Gm15:48600kb-49850kb区域控制大豆始花期主效QTL，同时发现一个紧密连锁的分子标记indel15-1；indel15-1分子标记在重组自交系群体和衍生的次级群体的表现使其在大豆始花期的育种中具有非常重要的价值。
1、首次鉴定了位于大豆Gm15号染色体Gm15:48600kb-49850kb附近的一个与控制大豆始花期相关的分子标记indel5-1；
2、在次级群体中，大豆始花期与分子标记indel5-1呈极显著相关；在‘NJZNRIL’两组表型不同的家系中基因型和表型一致；因此该分子标记在今后的大豆始花期辅助选择育种中具有巨大的应用前景；
3、本发明提出了利用大豆种质资源中始花期QTL的方法。
附图说明
图1：NJZNRIL群体在6个环境下第15号染色体QTL作图表现。
图2：BC2F2群体部分单株分子标记indel15-1扩增产物。
其中前1为ZXD扩增带型，后2为NN1138-2扩增带型，M：50bpDNAMarker。
图3：NJZNRIL群体分子标记indel15-1扩增产物。
其中前1为ZXD扩增带型，2为NN1138-2扩增带型，M：50bpDNAMarker，3～20为NJZNRIL群体中始花期较长单株扩增带型，21～36为NJZNRIL群体中始花期较短单株扩增带型。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明，下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：大豆始花期主效QTL的获得
(1)‘NJZNRIL’群体构建
利用大豆材料ZXD和NN1138-2进行杂交，得到杂种F1，通过“单籽传”法构建群体，获得236个F2:8代重组自交系群体(‘NJZNRIL’)。
“单籽传”法步骤如下：在父母本杂交当代从母本植株上收获的一粒种子种植后长成一个F1代单株，其自交(即自花授粉)结实收获1株F2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的F2代株行，它的每一单株自交结实收获F3代种子，将分离的同类性状植株单株收获并脱粒装袋，每株种子次年单独种植一个F3株行，自交结实收获F4代种子，……，直至各家系内不同植株之间的性状完全稳定一致。像这样最初由单粒种子经过连续多代自交、分离、纯化、种植、选育及鉴定等程序，最终发展成一个有数百个重组自交系构成的大群体，即为“单籽传”法构建群体。
(2)‘NJZNRIL’群体遗传图谱的构建
采用CTAB法提取大豆叶片的基因组DNA，使用SLAF-seq技术对ZXD和NN1138-2及236重组自交家系进行基因分型，利用Highmap作图软件进行遗传连锁图谱构建。最终构建出了包含3255个标记谱覆盖20个连锁群，遗传距离总长为2144.85cM的遗传图谱。
(3)‘NJZNRIL’群体大豆始花期表型测定
播种后隔日调查每一个家系的出苗期(VE，Emergence)，始花期(R1，Beginningbloom)为出苗期至小区50％以上植株主茎任一节上出现花朵的天数(VE至R1)。
(4)结果与分析
利用WinQTLcart2.5结合群体表型数据和分子数据，进行大豆始花期的QTL定位。如表1及图1所示，在第15号染色体48600kb-49850kb附近发现控制大豆始花期的主效QTL，6个环境平均有18％的表型解释率。
表1NJZNRIL群体在6个环境下15染色体定位结果
实施例2：大豆始花期主效QTL紧密连锁标记indel15-1的获得
(1)分子标记开发
利用公布的大豆物理图谱信息及国家大豆改良中心测序材料的序列信息，在第15号染色体Gm15:48600kb-49850kb区域设计分子标记。
(2)次级群体表型测定
(3)次级群体分子标记鉴定
采用CTAB法提取NJZNRIL衍生的次级群体大豆材料叶片的基因组DNA，以indel15-1引物对进行扩增实验。PCR反应体系(10ul)，其中含有3ulDNA模板(15ng)、上、下游引物(0.2mmol/L)各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24uldNTP(10mmol/L，N＝A，C，G，T)，0.12ulTaq酶(5U/ul)和1.4ulddH2O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。PCR扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。
(4)结果与分析
结果显示在162个BC2F2单株中indel5-1只有两种等位变异，如图2所示，条带大小分别为180bp和210bp。拥有180bp带型的单株具有一个较长始花期(平均46.18天)，拥有210bp带型的单株具有较小始花期(平均43.28天)，在单标记分析中indel5-1的表型解释率为19.8％(P<0.00001)。Indel15-1分子标记上游引物序列为SeqIDNO.1，下游引物序列为SeqIDNO.2。
表2分子标记indel15-1在次级群体中的表现
实施例3：indel15-1引物对在大豆始花期选择上的应用
(1)双亲本基因组扩增检测
用于验证大豆始花期QTL材料为NJZNRIL群体中随机选取的分别具有较长和较短始花期的两组材料。
(2)群体扩增检测及标记分析
采用CTAB分别提取每份材料叶片的基因组DNA，以indel15-1引物对进行扩增实验。PCR反应体系(10ul)，其中含有3ulDNA模板(15ng)、上、下游引物(0.2mmol/L)各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24uldNTP(10mmol/L，N＝A，C，G，T)，0.12ulTaq酶(5U/ul)和1.4ulddH2O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。
PCR扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。
(3)结果与分析
如图3所示，在随机选择的两组材料中，3-20号材料都有一个较长始花期，平均的始花天数为49.5天；21-36号材料都有一个较短的始花期，平均始花天数为45.7天。发现3-20号材料的DNA扩增产物都为180bp条带，即含有该文所述大豆始花期主效QTL的增效基因(NN1138-2)；21-36号材料的DNA扩增产物都为210bp条带，基因型和表型的符合率达到100％，结果表明了用indel15-1分子标记筛选大豆始花期长短有较好的效果。

Claims (7)

1.大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1，其特征在于：所述大豆始花期主效QTL位点位于大豆第15号染色体Gm15:48600kb-49850kb，所述分子标记indel15-1位于大豆第15号染色体Gm15:49588kp。
2.根据权利要求1所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1，其特征在于：所述分子标记的上游引物序列为SeqIDNO.1，下游引物序列为SeqIDNo.2。
3.一种扩增权利要求1所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物序列为SeqIDNO.1，下游引物序列为SeqIDNO.2。
4.权利要求1所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1或权利要求3所述的扩增权利要求1所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对在检测所述的大豆始花期主效QTL中的应用。
5.一种利用权利要求1所述分子标记或权利要求3所述引物对检测所述的大豆始花期主效QTL的方法，其特征在于：利用权利要求3所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，获得180～210bp的扩增片段，则表明存在所述的大豆始花期主效QTL。
6.权利要求1所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1或权利要求3所述的扩增权利要求1所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对在鉴定大豆始花期长短中的应用。
7.一种利用权利要求1所述分子标记或权利要求3所述引物对鉴定大豆始花期长短的方法，其特征在于：利用权利要求3所述的大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1的引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，获得180bp的扩增片段，则表明存在大豆始花期增效QTL位点，该大豆具有较长的始花期；获得210bp的扩增片段，则表明存在大豆始花期减效QTL位点，该大豆具有较短的始花期。
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