CN114703198A - 一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用，番茄转运蛋白SlZIF1的克隆可用于番茄果穗和株型调控中；番茄转运蛋白SlZIF1的克隆先通过SIZIF1基因的获得及超表达SIZIF1‑PRI101载体构建；再进行T0代番茄植株遗传转化与获得；经过转基因植株的鉴定，并通过试验结果表明超量表达材料除了在植株顶部有果穗，在植株下部真叶之间新增果穗；而野生型番茄MT只在植株顶部有番茄果穗，在植株下部无果穗；本发明超表达SIZIF1具有增加番茄产量的潜质，能形成更加合理地株型，具有重大的应用价值。

Description

一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用
技术领域
本发明属于番茄培育技术领域，特别涉及一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用。
背景技术
转基因番茄在世界很多地区和国家都得到了商业化种植。种植的转基因番茄性状包括耐储藏、抗病毒、抗真菌、抗虫、抗除草剂、抗冻、耐盐、品质改良和高产等。番茄是全球经济效益较高的蔬菜之一。抗病毒、抗真菌、抗虫番茄能够提高野生番茄的抗病力；耐储藏番茄可以减少番茄产后经济损失，均衡供应期；而高产番茄则能直接提高经济效益，为番茄产业带来无限的商机。番茄的果穗和株型对产量有着至关重要的作用。
发明内容
本发明之目的在于提供一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用，解决现有技术中的问题，旨在通过改善番茄植株的果穗分布，形成更加合理的株型，以提高番茄产量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆，包括以下步骤：
一、SIZIF1基因的获得及超表达SIZIF1-PRI101载体构建；
（1）、提取MicroTom番茄各个组织的总RNA，然后反转录得到总cDNA；
（2）、以总cDNA作为模板，
前引物SlZIF1-PRI101NN-F:5’-ATGGCGGGCGAATTAGAAAC-3’，
后引物SlZIF1-PRI101NN-R:5’TTGTGTTTCAACAAGGAATGGTTTG-3’，
进行PCR扩增，PCR产物大小为1437bp；
PCR扩增产物使用凝胶DNA回收试剂盒进行回收；
（3）、质粒PRI101酶切，
使用限制性内切酶SmaI、EcoRI对质粒PRI101进行双酶切；
（4）、同源重组，
使用E×naseII将步骤一所得到的PCR产物和PRI101酶切产物进行同源重组得到重组的SIZIFI-PRI101载体；
（5）、大肠杆菌转化，
将重组产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂板过夜，挑取单菌落，摇菌，吸取200μL测序；LB液体或固体培养基中加入10μL、100mg/ml的卡那霉素，对其进行测序分析，测序引物PRI101-seq：5’-CTGAACTTGTGGCCGTTTAC-3’；测序结果与序列表中的序列相同；
二、T0代番茄植株遗传转化与获得；
（1）、农杆菌转化，
将含有重组载体SIZIF1-PRI101的大肠杆菌菌液，吸取200μL至20mlLB液体培养基中在摇床进行培养；LB液体培养基中加入10μL、100mg/ml的卡那霉素，2.5μL、50mg/ml的利福平；使用快速质粒DNA小量试剂盒提取质粒，取1μg质粒置于50μL的农杆菌GV3101，使用冻融法转入农杆菌中；
（2）、T0代番茄植株转化，
A、番茄无菌苗培养：首先选用饱满、大小一致的番茄种子，播种前用无菌水在三角瓶里浸泡10-20min，其次用75%的乙醇消毒1min，再用50%的次氯酸钠消毒15min，最后用无菌水清洗3-4次；消毒完后播种于1/2MS固体培养基，置于光周期为光照16h/黑暗8h的组培间培养7-8天；
B、外植体预培养：无菌苗培养7-8天后，将子叶用刀片切成2-3段，放在预培养培养基上，置于组培间暗培养一天；
C、农杆菌活化与培养：播种完3-4天，将农杆菌划在含有抗生素的LB平板培养基上；待番茄子叶切好后，挑取单菌落进行过夜摇菌；
D、外植体共培养：吸取1ml菌液到1.5ml离心管中，使用分光光度计测得OD；根据测得的OD植，吸取菌液，10000r/min离心30s，然后用悬浮液将菌体悬浮并稀释至OD=0.1-0.3备用；将高温灭菌后的悬浮液倒入培养基中，然后把暗培养后的子叶放入悬浮液中侵染，侵染后用无菌滤纸吸干，再次放入原预培养培养基暗培养两天；
E、筛选与再生：将侵染后的番茄子叶转接到筛选培养基中生长两周后，然后为了降低芽点畸形率，将产生芽点的子叶再转入再生培养基中；
F、转基因植株生根及移栽：芽点生长两周形成约1cm长的幼芽后，用刀片将带有生长点的幼芽切断转入生根培养基中；培养两到三周后，进行炼苗并洗去根部的培养基栽入营养钵中，待成活后进行转基因检测。
优选的，所述PCR扩增的PCR反应体系50μL：PCRMix25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH2O、19μL；反应程序：预变性：98℃、30s；变性：98℃、10s；延伸：55℃、30s；终延伸：72℃、1min30s；35个循环。
优选的，所述酶切：50μL的酶切体系；质粒4μg；SmaI、1μL；EcoRI、1μL；10×FastBuffer 5μL；ddH2O、39μL；反应程序：37℃、2h。
本发明还提供番茄转运蛋白SlZIF1的克隆的应用，用于番茄果穗和株型调控中。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明超量表达材料除了在植株顶部有果穗，在植株下部真叶之间新增果穗；而野生型番茄MT只在植株顶部有番茄果穗，在植株下部无果穗；本发明超表达SIZIF1具有增加番茄产量的潜质，能形成更加合理地株型，具有重大的应用价值。
附图说明
图1为本发明的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
采用如下实验材料：
番茄品种MicroTom；
超表达质粒载体：PRI101；
PCR Mix(P520)：2×Phanta Flash Master Mix (Dye plus)为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的产品；
限制性内切酶SmaI、EcoRI为赛默飞世尔科技公司的产品；
同源重组酶E×naseII为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的产品；
凝胶DNA回收试剂盒为杭州新景生物试剂开发有限公司；
快速质粒DNA小量试剂盒为杭州新景生物试剂开发有限公司；
大肠杆菌感受态DH5α为擎科生物科技有限公司的产品；
农杆菌感受态GV3101为北京华越洋生物科技有限公司的产品；
柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒为生工生物工程（上海）股份有限公司的产品；
LB液体培养基：称取5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10gNacl溶于少量蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1L。121℃高压灭菌20min；
LB固体培养基：称取5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10gNacl、15g琼脂粉溶于少量蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1L。121℃高压灭菌20min；
1/2MS固体培养基：称取2.2gMS粉末、15g蔗糖溶于少量蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1L，调PH至5.82，加入7.4g琼脂后121℃高压灭菌20min；
PerfectStart Uni RT＆qPCR Kit为北京全式金生物技术有限公司的产品。
引物合成及测序均由擎科生物科技有限公司完成。
一、SIZIF1基因的获得及超表达SIZIF1-PRI101载体构建；获得步骤如下：
（1）、提取MicroTom番茄各个组织（根、茎、叶、花、幼叶、老叶、幼果、绿熟期果实、破色期果实、黄熟期果实、红熟期果实）的总RNA，然后反转录得到总cDNA；
（2）、以总cDNA作为模板，
前引物SlZIF1-PRI101NN-F:5’-ATGGCGGGCGAATTAGAAAC-3’，
后引物SlZIF1-PRI101NN-R:5’TTGTGTTTCAACAAGGAATGGTTTG-3’，
进行PCR扩增，PCR产物大小为1437bp(图1中A)；
PCR反应体系（50μL）：PCRMix（P520）25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH2O、19μL；反应程序：预变性：98℃、30s；变性：98℃、10s；延伸：55℃、30s；终延伸：72℃、1min30s；35个循环；
PCR扩增产物使用凝胶DNA回收试剂盒进行回收；
（3）、质粒PRI101酶切，
使用限制性内切酶SmaI、EcoRI对质粒PRI101进行双酶切(图1中B)；
50μL的酶切体系；质粒4μg；SmaI、1μL；EcoRI、1μL；10×Fast Buffer 5μL；ddH2O、39μL；反应程序：37℃、2h；
（4）、同源重组，
使用E×naseII将步骤一所得到的PCR产物和PRI101酶切产物进行同源重组得到重组的SIZIFI-PRI101载体；
（5）、大肠杆菌转化，
将重组产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂板过夜，挑取单菌落，摇菌（37℃、8-10h），吸取200μL由擎科公司测序（图1中C）；LB液体或固体培养基中加入10μL、100mg/ml的卡那霉素，
由擎科生物科技有限公司对其进行测序分析，测序引物PRI101-seq：5’-CTGAACTTGTGGCCGTTTAC-3’；测序结果与序列表中的序列相同。
二、T0代番茄植株遗传转化与获得；
（1）、农杆菌转化，
将含有重组载体SIZIF1-PRI101的大肠杆菌菌液，吸取200μL至20mlLB液体培养基中在摇床进行培养（37℃、8-10h）；LB液体培养基中加入10μL、100mg/ml的卡那霉素，2.5μL、50mg/ml的利福平；使用快速质粒DNA小量试剂盒提取质粒，取1μg质粒置于50μL的农杆菌GV3101，使用冻融法转入农杆菌中（图1中D）；
（2）、T0代番茄植株转化，
A、番茄无菌苗培养：首先选用饱满、大小一致的番茄种子，播种前用无菌水在三角瓶里浸泡10-20min，其次用75%的乙醇消毒1min，再用50%的次氯酸钠（生活84消毒液和无菌水体积比1:1）消毒15min，最后用无菌水清洗3-4次；消毒完后播种于1/2MS固体培养基，置于光周期为光照16h/黑暗8h的组培间培养7-8天；
B、外植体预培养：无菌苗培养7-8天后，将子叶用刀片切成2-3段，放在预培养培养基上，置于组培间暗培养一天；
C、农杆菌活化与培养：播种完3-4天，将农杆菌划在含有相应抗生素的LB平板培养基上；待番茄子叶切好后，挑取单菌落进行过夜摇菌；
D、外植体共培养：吸取1ml菌液到1.5ml离心管中，使用分光光度计测得OD；根据测得的OD植，吸取菌液，10000r/min离心30s，然后用悬浮液将菌体悬浮并稀释至OD=0.1-0.3备用；将高温灭菌后的悬浮液倒入培养基中，然后把暗培养后的子叶放入悬浮液中侵染，侵染后用无菌滤纸吸干，再次放入原预培养培养基暗培养两天；
E、筛选与再生：将侵染后的番茄子叶转接到筛选培养基中生长两周后，然后为了降低芽点畸形率，将产生芽点的子叶再转入再生培养基中；
F、转基因植株生根及移栽：芽点生长两周形成约1cm长的幼芽后，用刀片将带有生长点的幼芽切断转入生根培养基中；培养两到三周后，进行炼苗并洗去根部的培养基栽入营养钵中，待成活后进行转基因检测。
三、转基因植株的鉴定；
（1）、DNA水平的鉴定，
A、先检测转化植株叶片基因组DNA是否包含35S强启动子序列，判断是否为阳性植株；使用CTAB法提取各转基因植株叶片的总DNA，以提取的总DNA为模板，前引物为P35S：5’-ACGCACAATCCCACTATCCT-3’，后引物为PRI101-Seq：5’-CTGAACTTGTGGCCGTTTAC-3’，PCR扩增产物为1685bp；若PCR扩增条带中含有1685bp的DNA片段，则为阳性植株；若PCR扩增条带中不含有1685bp的DNA片段，则为阴性植株；
PCR反应体系（10μL）：PCRMix（P520）5μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL，ddH20、3μL；反应程序：预变性：98℃、30s；变性：98℃、10s；延伸：55℃、30s；终延伸：72℃、1min30s；总共35个循环；
B、DNA水平检测时，需设置阳性对照（以实施例1中构建的超表达载体SIZIF1-PRI101作为PCR模板）；
（2）、RNA水平检测鉴定（实时荧光定量PCR），
A、使用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒提取实施例3中鉴定得到的阳性植株和MicroTom的总RNA，然后使用PerfectStart Uni RT＆qPCR Kit将RNA反转录成cDNA；
B、以cDNA为模板，
特异性前引物：QNEWSIZIFI-F：5’-TATGGACTGTGAGCCCCAGA-3’，
后引物：QNEWSIZIFI-R：5’-TATTGTGACAGAGAGCGCGA-3’，
特异性引物使用National Center for Biotechnology Information (nih.gov)Primer Blast设计，PCR扩增片段239bp；
PCR反应体系（10μL）：cDNA模板2μL，QNEWSIZIFI-F和QNEWSIZIFI-R各0.4μL，qPCRMix5μL，Nuclease-free Water2.2μL；
反应程序：变性：94℃、30s；预变性：94℃、5s；延伸：60℃、15s；终延伸72℃、10s；共40循环；
根据荧光定量PCR结果，验证了DNA检测中的阳性转基因植株的表达量，（图1中F）；
（3）、T0代番茄植株表型鉴定，
选取2株T0代转基因待测番茄依次命名为OE-SIZIF1-16、OE-SIZIF1-35；
待待测番茄生长至绿熟期，观察番茄植株表型，
部分实验结果如图1中E（从左到右依次为MicroTom的果实、OE-SIZIF1-16的果实、OE-SIZIF1-35的果实）；结果表明2个超量表达材料除了在顶部有果穗，在第1-2片真叶之间新增了1-2个果穗，而野生型番茄MT只在植株顶部有番茄果穗，在植株下部无果穗，属于自封顶型番茄；以上结果表明超表达SIZIF1增加番茄产量的潜质，能形成更加合理地株型，具有重大的应用价值。
基因序列
>Solyc01g096720.2.1
ATGGCGGGCGAATTAGAAACTCCGCTGATAAATAAGAAATATTACTACGAAAATTGTCCGGGTTGTAAAGTGGATCAACACAAGTCGGGTCAAACCGGTTTACCAATTAAGGAGCTTTTCACTATATGGATTGTCATCCTTGGTACAGCACTTCCAATATCATCACTCTTTCCATTTCTTTATTTCATGATAAAGGACTTTCACATTGCAAAAAGAGAGGAAGATATTAGTACGTATGCAGGTTTTGTAGGTTCTTCATTTATGGTTGGAAGAGCTTTGACATCTGTTTTTTGGGGAGCAGTGGCTGATCGATATGGACGAAAACCAGTTATAGTTTTCGGCACTTTTGCAGTGGTTGTTTTCAACACTCTCTTTGGTCTTAGTGTCAACTTTTGGATGGCAATTGCTACGCGATTTCTACTTGGTTTTTTAAATGGTTTGATTGGACCAATAAAGGCATATGCTGCAGAAATCTTCCGTGAAGAATATCAAGCACTGGGAATGTCAACGATTAGTACTGCTTGGGGTATTGGATTGATTATTGGTCCATCTTTAGGAGGCTTCCTTGCTCAGCCTGCAGAGAAATATCCGACTGTATTCTCAAAGGATTCTATATTTGGGAGATTTCCCTATTTCTTGCCTTGCTTATGTATATCACTGTTTTCCTTGGCTGTGGGTATTGCTTCATTTTGGCTCCCGGAAACATTACACAATCACGATTCAAGAATGCCGCCTCAAAGTTCATATGAGGCTCTGGAGGAGGCTGCATCTGATACAAAAGACGGAAATGAATCAGCCCCAAAAGAAAACCTTTTTAACAACTGGCCATTGATGTCATCGATCATCTTATACTGTGTCTTTTCTCTTCATGATATGGCTTATACAGAGATCTTCTCATTATGGACTGTGAGCCCCAGAAAGTTTGGAGGCTTAAGTTATTCAACTGTTGATGTTGGTGAAGTACTATCGATCTCAGGATTTGGCCTTCTAGTCTTTCAACTATCTCTATATCCATTGGTTGAGAAGTGTGTTGGCCCTATCGTCATTACTCGAGTTGCAGGAGTTTTGTCCATTGCTGTGCTGACAAGTTACCCTTACATCGCCTTGCTATCTGGGATCGCGCTCTCTGTCACAATAAATATTGCATCTGTGATCAAGAATGCTTTATCTATATCTATCATAACAGGTTTGTTCATATTGCAAAACAAAGCAGTGGACCAGCGACAACGTGGAGCTGCTAATGGAATTGCCATGACAGCAATGTCAATTTTTAAAGCTATAGGTCCAGCAGGGGCAGGAGTAGTCTTTTCTTGGGCACAAAAAAGGCTTGACGCTTCCATTCTTCCAGGTGATCAAGTAGTGTTCTTTGTGCTGAATGTGATTGAGGCAATTGGTGTGTTGCTGACATTCAAACCATTCCTTGTTGAAACACAATAA
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆，其特征在于，包括以下步骤：
一、SIZIF1基因的获得及超表达SIZIF1-PRI101载体构建；
（1）、提取MicroTom番茄各个组织的总RNA，然后反转录得到总cDNA；
（2）、以总cDNA作为模板，
前引物SlZIF1-PRI101NN-F:5’-ATGGCGGGCGAATTAGAAAC-3’，
后引物SlZIF1-PRI101NN-R:5’TTGTGTTTCAACAAGGAATGGTTTG-3’，
进行PCR扩增，PCR产物大小为1437bp；
PCR扩增产物使用凝胶DNA回收试剂盒进行回收；
（3）、质粒PRI101酶切，
使用限制性内切酶SmaI、EcoRI对质粒PRI101进行双酶切；
（4）、同源重组，
使用E×naseII将步骤一所得到的PCR产物和PRI101酶切产物进行同源重组得到重组的SIZIFI-PRI101载体；
（5）、大肠杆菌转化，
将重组产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂板过夜，挑取单菌落，摇菌，吸取200μL测序；LB液体或固体培养基中加入10μL、100mg/ml的卡那霉素，对其进行测序分析，测序引物PRI101-seq：5’-CTGAACTTGTGGCCGTTTAC-3’；测序结果与序列表中的序列相同；
二、T0代番茄植株遗传转化与获得；
（1）、农杆菌转化，
将含有重组载体SIZIF1-PRI101的大肠杆菌菌液，吸取200μL至20mlLB液体培养基中在摇床进行培养；LB液体培养基中加入10μL、100mg/ml的卡那霉素，2.5μL、50mg/ml的利福平；使用快速质粒DNA小量试剂盒提取质粒，取1μg质粒置于50μL的农杆菌GV3101，使用冻融法转入农杆菌中；
（2）、T0代番茄植株转化，
A、番茄无菌苗培养：首先选用饱满、大小一致的番茄种子，播种前用无菌水在三角瓶里浸泡10-20min，其次用75%的乙醇消毒1min，再用50%的次氯酸钠消毒15min，最后用无菌水清洗3-4次；消毒完后播种于1/2MS固体培养基，置于光周期为光照16h/黑暗8h的组培间培养7-8天；
B、外植体预培养：无菌苗培养7-8天后，将子叶用刀片切成2-3段，放在预培养培养基上，置于组培间暗培养一天；
C、农杆菌活化与培养：播种完3-4天，将农杆菌划在含有抗生素的LB平板培养基上；待番茄子叶切好后，挑取单菌落进行过夜摇菌；
D、外植体共培养：吸取1ml菌液到1.5ml离心管中，使用分光光度计测得OD；根据测得的OD植，吸取菌液，10000r/min离心30s，然后用悬浮液将菌体悬浮并稀释至OD=0.1-0.3备用；将高温灭菌后的悬浮液倒入培养基中，然后把暗培养后的子叶放入悬浮液中侵染，侵染后用无菌滤纸吸干，再次放入原预培养培养基暗培养两天；
E、筛选与再生：将侵染后的番茄子叶转接到筛选培养基中生长两周后，然后为了降低芽点畸形率，将产生芽点的子叶再转入再生培养基中；
F、转基因植株生根及移栽：芽点生长两周形成约1cm长的幼芽后，用刀片将带有生长点的幼芽切断转入生根培养基中；培养两到三周后，进行炼苗并洗去根部的培养基栽入营养钵中，待成活后进行转基因检测。
2.根据权利要求1所述的番茄转运蛋白SlZIF1的克隆，其特征在于：所述PCR扩增的PCR反应体系50μL：PCRMix25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH2O、19μL；反应程序：预变性：98℃、30s；变性：98℃、10s；延伸：55℃、30s；终延伸：72℃、1min30s；35个循环。
3.根据权利要求1所述的番茄转运蛋白SlZIF1的克隆，其特征在于：所述酶切：50μL的酶切体系；质粒4μg；SmaI、1μL；EcoRI、1μL；10×Fast Buffer 5μL；ddH2O、39μL；反应程序：37℃、2h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的番茄转运蛋白SlZIF1的克隆的应用，其特征在于：用于番茄果穗和株型调控中。
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