CN102329817B

CN102329817B - 一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法

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Publication number: CN102329817B
Application number: CN2011102073268A
Authority: CN
Inventors: 金华; 姜国斌; 郭鹏; 王颖; 刘磊
Original assignee: Dalian Nationalities University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2031-07-22
Also published as: CN102329817A

Abstract

本发明涉及一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法，本发明涉及一种利用基因工程技术培育吴屯杨抗逆新品种的方法，本发明取材方便，直接用吴屯杨叶片作为外植体，对影响基因转化的因素，即抗生素敏感性进行了优化，建立了吴屯杨高效遗传转化系统。为吴屯杨抗逆新品种的培育提供一种转化效率更高的方法，可缩短培育吴屯杨抗逆新品种的时间，为林木的遗传改良提供了一个新途径。

Description

一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法。

背景技术

杨树是重要的速生用材树种，在以往的研究中多以提高杨树产量为目标，忽视了对其抗逆性等性状的改良。同时，环境不断恶化，杨树生产受到干旱、盐碱等自然灾害的严重制约。目前，杨树在全世界及我国人工林中占有较大比重，因此培育抗逆转基因杨树新品种具有十分重要的现实意义。自1987年Fillatti等首次获得抗除草剂杨树基因工程植株以来，杨树基因转化研究已获得了较大进展。白杨派已有银白杨的一些派间杂交种、毛白杨等获得了转基因植株。但目前尚未有青杨派特别是吴屯杨(Populus wutunensis)转基因系统建立的报告。

抗逆性速生吴屯杨是姜国斌^[1]教授的课题组在辽宁西部新民县大柳屯乡吴屯村发现的一种被当地老百姓称之为“吴屯杨”的杨树无性系，在当地的自然环境下高径生长表现优异。大连民族学院生命科学学院通过多年的试验地和盆栽试验对比等研究，对被害率、苗木活力、苗木组织和细胞内离子分区及含量分析、幼嫩组织ATPase活性的细胞化学分析、渗透调节物质含量、光合特性等生理生化指标进行测定，确定了该树种的抗逆和速生等优良特性。吴屯杨具有繁殖容易，育苗、造林成活率高，根系发达，适应性强，生长速度快、材质优良等特点，是优良天然杂交种，可用于营造防护林，大、小径阶用材林等。2008年12月，经专家认定，该品种通过了辽宁省林木品种审定。目前，抗逆性速生吴屯杨已在在辽宁省西部的阜新蒙古族自治县、新民县以及大连等地推广应用。

发明内容

本发明直接用吴屯杨叶片作为外植体，取材方便。在已建立起的高效组培再生体系的基础上，建立了以叶片为外植体的吴屯杨基因转化方法，为今后利用转基因技术对吴屯杨进行遗传改良提供技术上的支持，同时也为林木的遗传改良提供了一个新途径。

本发明的技术依据为：

草丁膦(Phosphinothricin，PPT)是一种非选择性、广谱、无残留的高效灭生性除草剂，能强烈抑制植物叶片中谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，导致细胞内氨离子积累、破坏细胞结构而致植株死亡。bar基因能消除PPT对植物体的毒害作用，它编码乙酰转移酶PAT，使乙酰辅酶A与草丁膦游离氨基结合，形成AC-PAT复合物，使草丁膦失去活性，从而使植株具有PPT抗性。

农杆菌AGL0为目前在植物遗传转化中常用的一农杆菌品系，本发明使用的农杆菌AGL0是由韩国生命工学研究院赠送，其含有质粒pCAMBIA3300，质粒pCAMBIA3300上携带有上述bar基因^[2]作为筛选基因。因此，经农杆菌AGL0介导转化的阳性植株便具有抗除草剂抗性，当用除草剂为筛选试剂来选择转化细胞时，阳性的PPT抗性芽能够在筛选培养基上正常生长，而未成功转化bar基因的假阳性苗则无法在筛选培养基上正常生长。

MS(Murashige and Skoog，1962)培养基，是植物组培的常用培养基，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。本发明所用的植物培养基均以MS为基本培养基，附加了不同浓度的激素。

本发明是通过如下步骤实现的：

a.将吴屯杨无菌苗的叶片沿垂直主脉切2～4个切口，切口深达主脉，正面向上，放入预培养培养基中，光照培养2～3天，培养温度为25～27℃，光照强度为3000～4000Lux，光照时间为16～18小时/天；

所述的预培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

b.挑取农杆菌AGL0的菌落接种到含有卡那霉素50mg/L的10～15ml YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取10～100μl的菌液转接至30～50ml的YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养至菌体OD₆₀₀达到0.8～1.0时，于4℃，12000rpm条件下离心5min得到菌体，用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮菌体，获得侵染菌液；

c.将步骤a获得的叶片浸入步骤b获得的侵染菌液中，于26℃下、100rpm条件下，震荡10分钟，进行侵染；

d.步骤c获得的叶片，除去叶片上的多余菌液，转移到共培养培养基上，暗培养2～3天，培养温度为25～27℃；

所述共培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 200μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

e.步骤d获得的叶片，除去叶片上的多余液体，转移到初次筛选培养基上，培养21天后，换到二次筛选培养基上，培养至分化出不定芽，所述的初次及二次筛选培养温度为25～27℃，光照强度为3000～4000Lux，光照时间为16～18小时/天；

所述的初次筛选培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+Cef400mg/L+0.8～1.0mg/L PPT+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

所述的二次筛选培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+Cef400mg/L+1.2～1.6mg/L PPT+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

f.待抗性芽伸长至2～5cm，将抗性芽接入生根培养基中，每瓶接种3株，2周；

所述的生根培养基为：1/2MS+IBA 0.03mg/L+NAA 0.03mg/L+Cef 400mg/L+PPT 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

g.CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法(HexadecyltrimethyAmmonium Bromide)能够提取植物基因组DNA，属于一般分子生物学常规操作。采用CTAB法提取转基因植株的DNA，作为被检模板，采用PCR(Polymerase ChainReaction)法对候选植株进行鉴定，所用引物如下：

上游引物：5’-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3’，

下游引物：5’-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’。

PCR反应条件：

94℃1min，68℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃下继续延伸10min。

PCR又称为“多聚酶链式反应”，是本领域技术人员公知的实验方法，根据PCR引物以及PCR反应条件，本领域技术人员可依据常识确定PCR反应体系，扩增出目的基因。

上述步骤e中初次筛选培养基的优选为：

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

上述步骤e中二次筛选培养基的优选为：

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

有益效果：本发明与现有技术相比显著优点是：以吴屯杨叶片作为外植体建立高效的吴屯杨遗传转化系统，在短时间内可选育出吴屯杨抗逆新品种。

附图说明

图1：初次筛选培养基上获得的PPT抗性芽；

图2：二次筛选培养基上获得的PPT抗性芽；

图3：转基因吴屯杨基因组PCR检测；

具体实施方式

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。

含bar基因的农杆菌AGL0：由韩国生命工学研究院赠送；

6-BA：6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤，购自生工生物(上海)有限公司；

NAA：1-naphthlcetic acid，a-萘乙酸，购自生工生物(上海)有限公司；

AS：Acetosyringone，乙酰丁香酮，购自生工生物(上海)有限公司；

Cef：Ceftriaxone，头孢曲松钠，购自生工生物(上海)有限公司；

PPT：Phosphinothricin，草丁膦，购自生工生物(上海)有限公司；

DL500DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；

Taq酶，dNTP及10×缓冲液均购自生工生物(上海)有限公司；

酵母提取物、蛋白胨、NaCl均购自生工生物(上海)有限公司；

YEP液体培养基(单位g/L)：酵母提取物：10；蛋白胨：10；NaCl：5。

MS培养基：购自Duchefa公司，商品号：M0222.0050，使用浓度为4.4g/L，1/2MS培养基的浓度为2.2g/L。

实施例1

a.将作为转化外植体的吴屯杨无菌苗的叶片沿垂直主脉切3个切口，切口深达主脉，正面向上，放入预培养培养基中，共50个叶片，每个培养皿接种9～11个叶片，共接种5个培养皿，光照培养2天，培养温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为16小时/天；

上述预培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

b.挑取带有bar基因的农杆菌AGL0的菌落接种到含有卡那霉素50mg/L的10mlYEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取100μl的菌液转接至30ml的YEP液体培养基中经过200rpm震荡培养，当菌体0D₆₀₀达到0.8时，4℃条件下，通过12000rpm离心5min收集菌体，用30ml的MS液体培养基重新悬浮菌体，获得侵染菌液；

c.将经步骤a处理的叶片全部浸入步骤b获得的30ml侵染菌液中，于26℃、100rpm条件下，震荡10分钟，进行侵染；

d.侵染后的叶片放置在无菌的滤纸上，除去多余菌液，转移到共培养培养基上，每个培养皿接种5个叶片，暗培养2天，培养温度为26℃；

上述共培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 200μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

e.共培养后的叶片放置于无菌的滤纸上，除去多于液体，每个培养皿9～11个叶片，转移到初次筛选培养基上，培养21天后收获15个抗性芽，将收获到的15个抗性芽，每瓶接种5～6株换到二次筛选培养基上，培养至分化出不定芽，共收获11个。

上述初次及二次筛选培养温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为16小时/天；

上述初次筛选培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

上述二次筛选培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

图1为初次筛选培养基上获得的PPT抗性芽，其中(2)指向正常转化苗，(1)、(3)、(4)、(5)未见任何抗性芽生长。图2为二次筛选培养基上获得的PPT抗性芽，其中(7)、(8)指向阳性转化苗，转化苗正常生长，根不断伸长，顶芽缓慢生长，叶片逐渐伸展，叶面逐渐扩展；(6)、(9)指向假阳性苗，筛选培养基中的PPT对叶片生长具有显著的抑制效应，使得假阳性苗不能生长、或者在生长过程中逐渐死亡。

f.待抗性芽伸长至4cm，将11个抗性芽分别接入生根培养基中，每瓶接种5～6株；经过温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为16小时/天的培养，天后，获得抗PPT吴屯杨无性系5株。

上述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.03mg/L+NAA 0.03mg/L+Cef400mg/L+PPT1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

g.利用以上已建立起来的吴屯杨转基因体系，得到了抗PPT吴屯杨无性系5株。对所得5株PPT抗性吴屯杨无性系均作PCR检测。采用CTAB法提取5株转基因植株DNA，作为被检模板，扩增目的基因片段。

根据bar基因编码区序列合成一对特异PCR引物，目标产物410bp：

上游引物：5’-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3’，

下游引物：5’-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’；

PCR反应体系：

候选植株DNA： 1μl

引物1： 1μl

引物2： 1μl

dNTP： 2μl

10×PCR缓冲液： 2.5μl

Taq酶： 0.25μl

无菌水： 12.25μl

反应总体积 20μl

上述候选植株DNA浓度为10ng/μl，引物1、引物2浓度为10μM，dNTP的浓度为10μM。

PCR反应条件：

扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。采用CTAB法^[3]提取农杆菌AGL0的质粒pCAMBIA做为阳性对照，以提取未转化植株叶片DNA做为阴性对照，进行PCR鉴定。PCR产物经电泳分析，电泳结果如附图3所示，其中，M：DL500DNAMarker，CK⁺：阳性对照，CK^-：阴性对照，R1～R5：待检植株。从电泳图中可以看出，在待检植株中，R1得到一条约为410bp的片段，与CK⁺阳性对照组所示的条带大小基本一致，因此可以说明外源bar基因已经整合到吴屯杨基因组中，初步确认R1为转bar基因阳性植株。而R2～R5植株基因组中没有扩增出对应片段，为假阳性植株；

实施例2除草剂临界浓度的确定

由于用于基因转化的农杆菌AGL0带有bar基因，因此经农杆菌AGL0介导转化的阳性植株便具有了抗除草剂抗性，以除草剂为筛选试剂来选择转化细胞，为了确定吴屯杨对除草剂的抗性，进行了叶片对除草剂抗性的临界浓度的试验，将均匀一致的叶片分别置于含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L PPT的培养基上：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，接种密度为每个培养皿5个叶片，筛选培养温度为26℃，光照强度为3400Lux，光照时间为16小时/天。观察叶片对一系列浓度梯度除草剂的反应，培养30天后进行统计，得到除草剂临界浓度的确定。所述的对照培养基为：MS培养基附加了1.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

PPT浓度(mg/L)	叶片表现状况
		0	深绿色，正常分化不定芽
0.5	部分失绿，分化不定芽
		1.0	叶片变黄色，无不定芽分化
1.5	叶片变黄色，大部分坏死
		2.0	整个叶片枯死
2.5	整个叶片枯死

实验证明：叶片对PPT非常敏感，低浓度的PPT就可抑制叶片不定芽的分化。在不含PPT的对照培养基中，叶片都产生大量的丛生芽。随着PPT浓度的增大，叶片变黄，进一步坏死，不定芽发生从多到少到完全不出芽。叶片在含PPT0.5mg/L的筛选培养基上，产生少量不定芽，但不定芽的颜色淡黄，随着培养时间的延长，不定芽多数死亡，当浓度为1.0mg/L时，叶片全部变黄，不能分化出芽，因此PPT 1.0mg/L为叶片不定芽的临界浓度。

初次筛选时，如果PPT的浓度过高，不仅未转基因的细胞死掉，转基因的细胞也会受其影响而死掉，二次筛选时转基因的细胞已长出很多，提高PPT的浓度，使得未转基因的细胞快速死亡，转基因的细胞团正常生长。因此最优筛选条件的PPT的选择为：初次筛选培养基选择PPT浓度1.0mg/L；二次筛选培养基选择PPT浓度1.5mg/L。

参考文献：

[1]金华；姜国斌；王颖；马金龙；闫艳华.吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方法[P].CN201010291353.3.大连民族学院.2011-01-26

[2]Raza Ahmad et al.，Stress-induced expression of choline oxidase inpotato plant chloroplasts confers enhanced tolerance to oxidative，salt，and drought stresses，Plant Cell Report，(2008)27：687-698.

[3]Porebski S，Bailey L G，Baum B R.Modification of CTAB DNA extractionprotocol for plants containing high polysaccharide and polyphenolcomponents.Plant Mol.Biol.Report，1997，15：8-15.

Claims

1.一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法，具体步骤为：

d.步骤c获得的叶片,除去叶片上的多余菌液，转移到共培养培养基上，暗培养2～3天，培养温度为25～27℃；

所述共培养培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 200μmol/L蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

f.待抗性芽伸长至2～5cm，将抗性芽接入生根培养基中，每瓶接种3株，培养2周；

g.采用CTAB法提取转基因植株的DNA，作为被检模板，采用PCR法对候选植株进行鉴定，所用引物如下，

上游引物：5’-CGGTCTGCACCATCGTCAACC-3’，

下游引物：5’-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3’；

PCR反应条件：

94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 2min，35个循环，72℃下延伸10min；

上文所述的转基因吴屯杨，其中，转基因指的是bar基因。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法，其特征是，所述的步骤e中

初次筛选培养基为：

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

二次筛选培养基为：

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef400mg/L+PPT1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。