CN1398511A - 杨树转抗虫基因技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程、生物遗传工程技术，涉及一种杨树转抗虫基因技术。其特征在于：是以杨树优良品种欧美杨107为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；本发明可培育转基因抗虫及耐干旱、耐盐碱、抗风沙的速生杨树，应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目。转基因杨具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面有广阔的市场前景。

Description

杨树转抗虫基因技术

技术领域    本发明专利属于生物工程、生物遗传工程技术，涉及一种杨树转抗虫基因技术。

背景技术    杨树是退耕还林的主要树种之一，具有适应地域广，生长速度快，成活率高、种植简单等特点。国内外均将其作为绿化环保的首要树种，用于防风固沙、保上留肥、防止土壤沙化。欧美许多发达国家运用转基因等先进手段对杨树进行改良研究。欧美杨107属黑杨欧美杨杂交品种，起源于意大利，1984年引入我国，是从17个国家引进的331个无性系中选育出来的6个新品种之一。特性特征是树干高大通直、树皮灰色较粗、分枝角度小、树冠窄、侧枝细、叶片小而密、满冠；雌株。速生，胸径年平均生长量3.5～5cm，树高平均生长量3.5M，3～4年伐可作纸浆材及中小径民用材，7～8年主伐可作于径材。于径通直、材质优良，其纤维长度和木材密度均优于I-214杨等普通杨树，是纸浆材和板材的优良树种，纤维长度1145μm，木材密度0.395，形率为0.66。树冠窄，抗风能力强，不易风倒、风折。抗病虫害，对光肩星天牛具有明显抗性。抗寒，最低温-31℃可安全越冬。

发明内容    本发明的目的是为增加杨树对榆毒蛾幼虫和天幕毛幼虫的杀虫活性，加快杨树生长速度，降低主要病虫害造成的损失，提高林木经济价值，提供一种杨树转抗虫基因技术。

本发明杨树转抗虫基因技术内容简述：

本发明杨树转抗虫基因技术，其特征在于：是以杨树优良品种欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；

试验选用的材料为：

1、菌种和质粒：含Bt基因的植物表达载pCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404；

2、植物材料：欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)；

3、供试昆虫：榆毒蛾(Leucoma candida Staudmder)幼虫和天幕毛虫幼虫；

4、主要化学试剂：Km (卡那霉素)、Cb (羧苄青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR扩增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA；

5、培养基：(1)、农杆菌培养基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏( Beet Extract)5g/L；酵母提取物((YeastExtract)5g/L；MgSO₄·7H₂O0.5g/L；固体则加入1.4％琼脂，以1mol/LNaOH调pH值为7.2；(2)、植物组织培养基以MS为基本培养基，附加不同浓度激素，配置各种培养基：

继代培养基：MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；

共培养培养基：茎段：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L：

              叶片：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L：

筛选分化培养基：茎段：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；

叶片：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg5mg/L+250mg/LCb；

生根培养基：MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；

各培养基均含3％蔗糖和0.7％琼脂，PH值为5.8，抗生素抽滤灭菌，其它成分高压灭菌；

杨树转抗虫基因技术方法为：

1、潮霉素临界浓度的确定：

设计6个潮霉素的浓度梯度：0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段，切成0.5cm大小，置于培养基中，一个月后观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；

2、菌液的准备：

(1)、菌种的活化

从甘油管中挑取含有植物植物表达载体的农杆菌菌液划线于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒温箱中，过夜培养形成单菌落；

(2)、菌液的培养

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种于10mlYEB液体培养基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震荡培养过夜，次日早晨取过夜培养的菌液0.8～1ml加至20ml新鲜的不含抗生素的YEB液体培养基中，继续震荡培养3～5h，至菌液浓度OD₆₀₀＝0.3～0.5时，8000rpm离心5min，沉淀用MS液悬浮，并稀释20～30倍即可用于转化；

3、叶盘法转化杨树：

利用叶盘法(Horsch，1985)对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，室温下不断摇动使外植体与菌液充分接触10min，取出后用无菌滤纸吸去表面多于的菌液，放入铺有一层滤纸的共培养培养基中，25℃下暗培养2～3d，然后转入选择分化培养基中培养；

4、菌液浓度及侵染时间对转化效果的影响：

(1)、菌液浓度的影响

取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD₆₀₀值为0.1、0.3、0.5、0.8的农杆菌菌液中侵染10min，观察不同的菌液浓度对转化效果的影响；

(2)、侵染时间的影响

取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD₆₀₀值为0.3、0.5、的农杆菌菌液中侵染10、20、30、40min，观察不同侵染时间对转化效果的影响；

5、转化植株的获得：

经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，在温度为25～28℃，光/暗周期为16/8h的条件下培养两周后，逐渐有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，当抗性芽长至2cm左右时，转移至生根培养基上诱导生根；

6、转化植株的鉴定：

(1)、潮霉素抗性鉴定

取转化植株的叶片和非转化对照植株的叶片，切成0.5～1cm大小，放置含有Hyg5mg/L的分化培养基上，观察其分化状况；

将转化芽与非转化芽分别接种于含有Hyg7mg/L的继代培养基中观察其生长情况；

(2)、转基因植株的PCR检测

质粒DNA的提取：挑取农杆菌单菌落接种于5mlYEB液体培养基中(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)，28℃震荡培养过夜，将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，8000rpm离心3min，收集菌体；倒掉上清液，沉淀中加入10ul溶液1(50mM葡萄糖、25mMTris-Hcl，PH8.0，10mMEDTA-Na₂，PH80)，以牙签悬浮菌体，冰浴5～10min；加入200ul溶液2(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，轻轻颠倒混匀，冰浴10～15min；10000rpm离心5min，上清用等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)反复抽提2～3次；水相转入新管，加入两倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，10000rpm离心8min，沉淀吹干后溶于适量TE缓冲液中；

植物总DNA的提取：取适量新鲜的植物叶片，置于研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将研碎的样品转入无菌离心管中，立即加入400ulSDS提取缓冲液(100mM NaCL，50mMEDTA，0.5％SDS，50mMTris，PH7.4)轻轻混匀粉末，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)颠倒混匀，10000rpm离心4min，重复抽提2～3次，直至中间蛋白质层看不见为止；吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20℃放置30min，有DNA沉淀产生；1000rpm离心5min沉淀DNA，去尽上清液，沉淀吹干后溶于适量TE缓冲液中：

总DNA的PCR扩增：以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR仪检测转基因植物中外源基因的整合情况；

扩增引物为：5′端引物5′-GGTAATGGTAACGCCATGCTCCTT 3′

            3′端引物5′-CCAGTTACTGCAACACTCGAGGCT 3′

PCR反应系统：在0.5ml灭菌离心管中加入

10×PCRbuffer                   2ul

4×dNTP(2mM)                    2ul

Primer1(10pmol/u1)              2ul

Primer2(10pmol/ul)              2ul

Taq酶(1u/ul)                    1ul

模板DNA(约25ng)                 2ul

D₂H₂O                        9ul

总体积                          20ul

上封10ul石蜡油，按以下条件进行35个循环

94℃(denaturing)                1min

60℃(annealing)                 30S

72℃(exteuding)                 1.5min

反应结束后，取反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测结果：同时以未经转化的107杨DNA的PCR产物为阴性对照；

7、转基因植株抗虫活性测定：

将30头一龄幼虫放入瓶口封闭的玻璃瓶中，在20℃±2℃的人工气候箱中饲养，每隔两天换叶片一次，同时检查昆虫的死亡数并鉴别虫龄；

将存活的幼虫称重、计算幼虫死亡率、校正死亡率、幼虫平均体重；采用下列公式计算：

8、转基因植株苗其生长与形态观察：

选择抗虫性强、中等、无显著抗虫性的转基因系号，以及未转基因(CK)等的嫩枝扦插小苗高20cm，栽植在苗圃试验地上，每个系号40株、生长120天高生长停止后，逐株测定苗高；各系号选出最大值的5株，求其平均值和标准差进行检验，同时观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形、分角、叶片形态。

本发明以杨树优良品种欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗，得到了20余万株转基因苗。2002年8月12-13日通过了辽宁省科学技术厅组织的科学技术成果鉴定，专家评定采用本发明可培育转基因抗虫及耐干旱、耐盐碱、抗风沙的速生杨树，可应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目。转基因杨比较一般杨树具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面有广阔的市场前景。

具体实施方式    本发明杨树转抗虫基因技术于2000年6月～2002年6月，进行了上述实验研究，由于用于基因转化的农杆菌带有抗潮霉素的基因，因此以潮霉素为筛选试剂来选择转化细胞，为了确定107杨对潮霉素的抗性，进行了叶片及茎段对潮霉素抗性的临界浓度的试验，将均匀一致的叶片及茎段分另别置于含0、3、5、7、10、15mg/L的分化培养基上，观察叶片及茎段对一系列浓度梯度潮霉素的反应，培养30天后进行统计，得出潮霉素临界浓度的确定。Hyg(mg/L)                 叶片表现状况                               茎段表现状况0                   深绿色，分化出大量绿色不定芽             深绿色，分化出大量绿色不定芽3                   头部失绿，出芽                           深绿色，大量不定芽5                   叶片变黄，部分坏死，不出芽               淡黄色，出芽7                   叶片变黄，大部分坏死                     茎段变黄，大部分坏死10                  整个叶片枯死状                           整个茎段枯死状15                  整个叶片枯死状                           整个茎段枯死状

实验证明：外植体对潮霉素非常敏感，低浓度的潮霉素即抑制外植体不定芽的分化。在不含潮霉素的对照培养基，两种外植体都产生大量绿色丛生芽。随着潮霉素浓度的增大，引起外植体变黄，进一步坏死，不定芽发生有多到少到完全不出芽。叶片在含Hyg3mg/L的分化培养基上，产生少量不定芽，但不定芽的颜色淡黄，随着培养时间的延长，不定芽多数死亡，当浓度为5mg/L时，叶片全部变黄，部分坏死，不能分化出芽，因此Hyg5mg/L为叶片不定芽的临界浓度。茎段在含Hyg3mg/L的培养基上，可正常分化出大量不定芽，当浓度为5mg/L时，茎段诱导不定芽的数量下降，并且芽的颜色多为淡黄色，继续培养很难成活，当Hyg的浓度大于7mg/L时，茎段大部分坏死，不能分化出芽，因此Hyg7mg/L可作为茎段不定芽发生的临界浓度。

我们于2002年7月已在鞍山东四方台生产基地栽植15000株实验苗。将于2003年底在新疆栽植30万亩，用于林纸一体化原材料基地建设，预计抗虫及速生可比一般杨树创利3亿元人民币。

Claims (2)

1、一种杨树转抗虫基因技术，其特征在于：是以杨树优良品种欧美杨107(Populus×euramericana cl.“74/76”)为试材，采用杨树转抗虫基因技术进行了组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的外植体再生体系、进行了遗传转化条件的研究，确定了叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；

试验选用的材料为：

(1)、菌种和质粒：含Bt基因的植物表达载pCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404；

(2)、植物材料：欧美杨107(Populus×euramericana cl.

“74/76”)；

(3)、供试昆虫：榆毒蛾(Leucoma candida Staudinder)幼虫和

天幕毛虫幼虫；

(4)、主要化学试剂：Km(卡那霉素)、Cb(羧苄青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR扩增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA：

(5)、培养基：(1)、农杆菌培养基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏(Beet Extract)5g/L；酵母提取物((Yeast Extract)5g/L；MgSO₄·7H₂O0.5g/L；固体则加入1.4％琼脂，以1mol/LNaOH调pH值为7.2；(2)、植物组织培养基以MS为基本培养基，附加不同浓度激素，配置各种培养基：

继代培养基：MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；

共培养培养基：茎段：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L；

              叶片：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L；

筛选分化培养基：茎段：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；

叶片：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg 5mg/L+250mg/LCb；

生根培养基：MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；

各培养基均含3％蔗糖和0.7％琼脂，PH值为5.8，抗生素抽滤灭菌，其它成分高压灭菌；

2、根据权利要求1所述的杨树转抗虫基因技术，其特征在于：杨树转抗虫基因技术方法为：

(1)、潮霉素临界浓度的确定：

设计6个潮霉素的浓度梯度：0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段，切成0.5cm大小，置于培养基中，一个月后观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；

(2)、菌液的准备：

①、菌种的活化

从甘油管中挑取含有植物植物表达载体的农杆菌菌液划线于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒温箱中，过夜培养形成单菌落；

②、菌液的培养

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种于10mlYEB液体培养基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震荡培养过夜，次日早晨取过夜培养的菌液0.8～1ml加至20ml新鲜的不含抗生素的YEB液体培养基中，继续震荡培养3～5h，至菌液浓度OD₆₀₀＝0.3～0.5时，8000rpm离心5min，沉淀用MS液悬浮，并稀释20～30倍即可用于转化：

(3)、叶盘法转化杨树：

利用叶盘法(Horsch，1985)对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，室温下不断摇动使外植体与菌液充分接触10min，取出后用无菌滤纸吸去表面多于的菌液，放入铺有一层滤纸的共培养培养基中，25℃下暗培养2～3d，然后转入选择分化培养基中培养；

(4)、菌液浓度及侵染时间对转化效果的影响：

①、菌液浓度的影响

取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD₆₀₀值为0.1、0.3、0.5、0.8的农杆菌菌液中侵染10min，观察不同的菌液浓度对转化效果的影响；

②、侵染时间的影响

取杨树无菌苗的茎段作为外植体，分别在OD₆₀₀值为0.3、0.5、的农杆菌菌液中侵染10、20、30、40min，观察不同侵染时间对转化效果的影响；

(5)、转化植株的获得：

经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，在温度为25～28℃，光/暗周期为16/8h的条件下培养两周后，逐渐有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，当抗性芽长至2cm左右时，转移至生根培养基上诱导生根；

(6)、转化植株的鉴定：

①、潮霉素抗性鉴定

取转化植株的叶片和非转化对照植株的叶片，切成0.5～1cm大小，放置含有Hyg5mg/L的分化培养基上，观察其分化状况；

将转化芽与非转化芽分别接种于含有Hyg7mg/L的继代培养基中观察其生长情况；

②、转基因植株的PCR检测

质粒DNA的提取：挑取农杆菌单菌落接种于5mlYEB液体培养基中(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rit50ug/ml)，28℃震荡培养过夜，将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，8000rpm离心3min，收集菌体；倒掉上清液，沉淀中加入10ul溶液1(50mM葡萄糖、25mMTris-Hcl，PH8.0，10mMEDTA-Na₂，PH8.0)，以牙签悬浮菌体，冰浴5～10min；加入200ul溶液2(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，轻轻颠倒混匀，冰浴10～15min；10000rpm离心5min，上清用等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)反复抽提2～3次；水相转入新管，加入两倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，10000rpm离心8min，沉淀吹干后溶于适量TE缓冲液中；

植物总DNA的提取：取适量新鲜的植物叶片，置于研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将研碎的样品转入无菌离心管中，立即加入400ulSDS提取缓冲液(100mM NaCL，50mMEDTA，0.5％SDS，50mMTris，PH7.4)轻轻混匀粉末，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)颠倒混匀，10000rpm离心4min，重复抽提2～3次，直至中间蛋白质层看不见为止；吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20℃放置30min，有DNA沉淀产生；1000rpm离心5min沉淀DNA，去尽上清液，沉淀吹干后溶于适量TE缓冲液中；

总DNA的PCR扩增：以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR仪检测转基因植物中外源基因的整合情况；

扩增引物为：5′端引物5′-GGTAATGGTAACGCCATGCTCCTT 3′

            3′端引物5′-CCAGTTACTGCAACACTCGAGGCT 3′

PCR反应系统：在0.5ml灭菌离心管中加入

10×PCRbuffer                    2ul

4×dNTP(2mM)                     2ul

Primer1(10pmol/ul)               2ul

Primer2(10pmol/ul)               2ul

Taq酶(1u/ul)                     1ul

模板DNA(约25ng)                  2ul

D₂H₂O                         9ul

总体积                           20ul

上封10ul石蜡油，按以下条件进行35个循环

94℃(denaturing)                 1min

60℃(annealing)                  30S

72℃(exteuding)                  1.5min

反应结束后，取反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测结果；同时以未经转化的107杨DNA的PCR产物为阴性对照，：

(7)、转基因植株抗虫活性测定：

将30头一龄幼虫放入瓶口封闭的玻璃瓶中，在20℃±2℃的人工气候箱中饲养，每隔两天换叶片一次，同时检查昆虫的死亡数并鉴别虫龄；

将存活的幼虫称重、计算幼虫死亡率、校正死亡率、幼虫平均体重；采用下列公式计算：

(8)、转基因植株苗其生长与形态观察：

选择抗虫性强、中等、无显著抗虫性的转基因系号，以及未转基因(CK)等的嫩枝扦插小苗高20cm，栽植在苗圃试验地上，每个系号40株、生长120天高生长停止后，逐株测定苗高；各系号选出最大值的5株，求其平均值和标准差进行检验，同时观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形、分角、叶片形态。