CN112544441A - 一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组培技术领域，具体公开了一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法，其特征在于，该方法包括步骤S001.创造组培条件、S002.外植体消毒、S003.启动培养、S004.增殖培养、S005.生根培养等五个步骤。通过上述五个步骤建立组培再生技术体系，以当年生枝条为外植体，75％酒精消毒40s，0.1％氯化汞消毒20min，流水冲洗后接种到培养基上进行启动培养，诱导腋芽萌发。将萌发的腋芽切下，接种到培养基上进行增殖培养，诱导产生丛生芽。通过不定芽对羧苄青霉素和潮霉素的敏感性的研究，发现当Carb浓度为700mg/L或者Hyg浓度为10mg/L时，丛生芽基本停止增殖。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，特别是指一种鸡爪槭新品种‘金陵丹枫’ 组培再生体系的建立方法。
背景技术
‘金陵丹枫’是槭树科槭属鸡爪槭(Acer palmatum)的一个园艺新品种， 由江苏省农业科学院经过多年选育而成。其叶片掌状5～7裂，叶片边缘具有重 锯齿，叶基部近心脏形，新叶为亮红色，观赏期长达100余天。由本案发明人 自主创新选育的新品种‘金陵丹枫’已获得植物新品种权证书与江苏省林木良 种认定证书。该新品种‘金陵丹枫’可孤植，群植或作为高档盆栽用，具有极 高的观赏和应用价值。
在‘金陵丹枫’种苗的生产中，通常采用嫁接的方式，但是嫁接成活率受 多种外界因素影响较大，如砧木和接穗的质量，嫁接季节和温湿度等，不利于 大规模生产。‘金陵丹枫’扦插不易生根，繁殖较困难。因此亟待建立‘金陵 丹枫’的组培再生体系，解决批量生产的问题。目前国内虽有少量鸡爪槭品种 已建立了组培再生体系，如‘金陵黄枫’，‘赤枫’，‘日本红枫’等，但是 不同品种的鸡爪槭对不同培养基和植物激素的适应性差异很大，还需要针对不 同品种细致研究其适宜的组培繁殖技术。
本发明以自主创新选育的新品种‘金陵丹枫’当年生枝条作为外植体，通 过启动培养，增殖培养和生根培养等阶段，筛选最适宜‘金陵丹枫’生长的激 素浓度。我们还研究了‘金陵丹枫’不定芽对不同浓度的羧苄青霉素 (Carbenicillin，Carb)和潮霉素(Hygromycin，Hyg)的敏感性，以期为‘金 陵丹枫’转基因体系的建立提供依据。
发明内容
本发明实施方式的目的在于提供一种鸡爪槭新品种‘金陵丹枫’组培再生 体系的建立方法，该方法包括以下步骤：
步骤S001、创造组培条件
向培养基中添加蔗糖20g/L，琼脂5g/L，调整培养基pH值至5.7，并调 节组培环境光照强度为100μmol/m2/s，光周期为16h/8h，温度为25±2℃；
步骤S002、外植体消毒
将采集到的鸡爪槭外植体当年生枝条剪去叶片，切取约3cm的带芽茎段， 用洗洁剂清洗，然后流动清水冲洗1h，再用75％酒精以及0.1％氯化汞交互式 消毒分别不低于5min，同时添加0.2％的聚氧乙烯山梨糖醇酯，消毒完毕后再使 用无菌水漂洗3次，最后在无菌滤纸上晾干表面水分；
步骤S003、启动培养
将上述步骤S002中消毒处理后获得的无菌外植体分别接种到含有IAA、 IBA、NAA、6-BA、TDZ不同生长素的培养基中，培养45d后，统计腋芽诱导率， 观察腋芽萌动及后续生长状况；
步骤S004、增殖培养
将生长状况良好且长约1cm的腋芽剪下，放入含有细胞分裂素6-BA或KT 与生长素IBA或NAA混合的培养基中，培养45d后统计平均增殖系数；
步骤S005、生根培养
将经过上述步骤S004增殖培养获得的约1cm丛生芽分别剪下，转移到含 有不同浓度生长素IAA(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L)、IBA(0.1、0.2、 0.3、0.4和0.5mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L)配比的培 养基中，培养30d后统计生根数及平均根长。
对经过所述步骤S004增殖培养后的腋芽进行羧苄青霉素抗性试验，该实验 方式如下：选取增殖培养基上获得的生长状况良好的健壮不定芽接种到含有不 同浓度Carb(0、100、200、300、400、500、600和700mg/L)的增殖培养基 中，培养45d后统计不定芽的诱导率及平均增殖系数，同时观察不定芽的成活 率及生长状况。
对经过所述步骤S004增殖培养后的腋芽进行羧苄青霉素抗性试验，该实验 方式如下：选取增殖培养基上获得的生长状况良好的健壮不定芽接种到含有不 同浓度Hyg的(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15和17.5mg/L)增殖培养基中， 培养45d后统计不定芽的增值率及增殖系数，同时观察不定芽的成活率及生长 状况。每个处理重复3次，每个处理50个芽。
附图说明
图1为本发明鸡爪槭‘金陵丹枫’丛生芽分化及生根情况图。图1中，将 丛生芽到生根的过程分为6个阶段，其中阶段a为单个不定芽侧拍、b为单个 不定芽顶拍、c为增殖产生的丛生芽侧拍、d为增殖产生的丛生芽顶拍、e为不 定芽长成的小苗、f为生根小苗。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对 本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解， 在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。 但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可 以实现本发明所要求保护的技术方案。
本实施例所涉及的一种鸡爪槭新品种‘金陵丹枫’组培再生体系的建立方 法，该方法的具体实现如下：
将田间采集的外植体茎段用不同的消毒时间进行处理，结果如表1所示。 ‘金陵丹枫’外植体使用75％酒精消毒40s和0.1％氯化汞消毒20min的组合 处理时，既能保证‘金陵丹枫’外植体具有较低的污染率(17.6％)，又能保持 较高的腋芽萌发率(90.3％)。因此，选用该处理对‘金陵丹枫’外植体消毒效 果最佳。
表1不同消毒处理对外植体的影响
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著(P＜0.05).
不同激素配比对外植体启动培养的影响
将无菌外植体上接种到不同激素配比的NN69培养基中，接种约10d后腋 芽开始萌动，同时茎基部开始形成愈伤组织。接种45d后统计腋芽诱导率，结 果如表2，在NN69培养基中添加单种激素对‘金陵丹枫’外植体启动培养的影 响显著优于同时添加多种激素。其中添加IBA浓度为0.1mg/L时，腋芽诱导率 最高(90.6±3.1)，腋芽生长快且长势健壮。并最终选择该培养基为‘金陵丹 枫’最佳培养基。
表2不同激素配比对外植体启动培养的影响
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(P＜0.05).
不同激素配比对芽增殖培养的影响
将无菌外植体在启动培养基上生长的腋芽剪下，放入不同激素浓度配比的 NN69培养基中培养45d后，统计观察腋芽平均增殖系数(增殖系数＝产生的丛 生芽数/接种的腋芽数×100％)。统计结果如表3所示，‘金陵丹枫’腋芽在不 同激素组合的增殖培养基中的平均增殖系数差异明显。6BA和IBA组合的平均 增殖系数为3.1～3.6，TDZ和IBA组合的平均增殖系数为2.2～2.9，KT和IBA 组合的平均增殖系数为6.2～8.3，明显优于其它激素组合。其中在添加0.4mg/L KT和0.1mg/L IBA的NN69培养基中腋芽的增殖系数最高，为8.3，显著高于 添加其它激素组合的培养基，且该培养基上生长的丛生芽状态良好，长势健壮， 利于进行生根培养。
表3不同激素配比对芽增殖培养的影响
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(P＜0.05).
不同浓度生长素对生根的影响
将在增殖培养基上产生的丛生芽剪下，分别转移到含有不同生长素浓度的 NN69培养基中，观察统计不定芽的生根状况。试验结果显示，‘金陵丹枫’不 定芽在添加不同生长素的培养基中生根状况差异显著。在添加IAA的培养基上， 生根率仅为55.9％～60.8％，平均根系量仅为3.5～3.7，平均根长仅为1.9～2.9 cm。在添加IBA的培养基上，生根率明显升高，为75.9％～95.6％，平均根系量 为4.3～7.1，平均根长为3.0～3.9cm。在添加NAA的培养基上，生根率仅为 67.8％～80.1％，平均根系量仅为3.1～3.9，平均根长仅为2.3～2.9cm。不定 芽在添加0.3mg/L IBA的培养基上，生根率最高，平均根系量和平均根长最大，小苗长势最好(表4)。鸡爪槭‘金陵丹枫’丛生芽分化及生根情况见图1
表4不同浓度生长素对生根的影响
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(P＜0.05).
不同浓度的羧苄青霉素对诱导丛生芽的影响
抗生素Carb可以有效抑制农杆菌的生长，同时也会抑制丛生芽的诱导和增 殖。随着Carb浓度的增高，‘金陵丹枫’丛生芽的诱导率和平均增殖系数显著 降低(表5)，表明‘金陵丹枫’丛生芽对Carb非常敏感。Carb浓度为700mg/L 时，丛生芽诱导率仅为45.9％，且丛生芽基本停止增殖。
表5不同浓度的羧苄青霉素对诱导丛生芽的影响
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显著。(P＜0.05).
不同浓度的潮霉素对诱导丛生芽的影响
抗生素Hyg在遗传转化筛选过程中起着重要作用。Hyg也会抑制丛生芽的 诱导和增殖，甚至会导致丛生芽白化死亡。Hyg对‘金陵丹枫’丛生芽的生长 影响尤为明显。当Hyg浓度为10.0mg/L时，丛生芽的诱导率仅为20.3％，且 丛生芽几乎不增殖。当Hyg浓度为12.5mg/L时，丛生芽不被诱导，且20.6％ 丛生芽出现白化死亡现象。
表6不同浓度的潮霉素对诱导丛生芽的影响
表中小写英文字母表示同一组中不同均值在0.05水平上的差异显者。(P＜0.05).
本发明以鸡爪槭‘金陵丹枫’为研究对象，建立了组培再生技术体系。以 当年生枝条为外植体，75％酒精消毒40s，0.1％氯化汞消毒20min，流水冲洗 后接种到NN69+0.1mg/LIBA的培养基上进行启动培养，诱导腋芽萌发。将萌 发的腋芽切下，接种到NN69+0.4mg/LKT NN69+0.1mg/L IBA的培养基上进行 增殖培养，诱导产生丛生芽。从产生的丛生芽切下的单个不定芽接种到 NN69+0.3mg/L IBA的培养基上进行生根培养，长成带根小苗后可以移栽到穴 盘。通过‘金陵丹枫’不定芽对羧苄青霉素和潮霉素的敏感性的研究，发现当Carb浓度为700mg/L或者Hyg浓度为10mg/L时，丛生芽基本停止增殖。
进行组培再生体系的建立第一步是要解决外植体的污染问题。由于本发明 试验的外植体取自大田的当年生枝条，附生菌较多，故采用了75％酒精消毒和 0.1％氯化汞消毒组合消毒的方式，这与前人的研究结果一致[3]。在组培过程中， 常用的基本培养基有MS[7]、WPM[8]、NN69[9]、B5[10]、White[11]等，不同基本 培养基对槭属植物再生体系的建立具有重要影响。鸡爪槭‘赤枫’使用了MS 培养基作为基本培养基[4]，日本红枫‘青龙’使用了WPM培养基[5]，鸡爪槭‘金 陵黄枫’使用了NN69培养基[3]。本试验也选择NN69作为基本培养基进行培养。 植物生长调节剂是组培再生体系建立过程中不可或缺的物质，其种类、浓度和 配比等是诱导腋芽生长，腋芽增殖和不定芽生根的关键因子[12，13]。鸡爪槭‘赤 枫’[4]、复叶槭[14]、红翅槭[15]和尖尾槭[16]均采用了6-BA和IAA的组合实现 了腋芽的增殖。鸡爪槭‘金陵黄枫’利用TDZ和NAA组合使用时，腋芽增殖系 数最高[3]。日本红枫‘青龙’在TDZ和IBA组合中增殖最快[5]。这说明槭属植 物对激素种类和浓度的感知具有较大差异，不同基因型的槭属植物需要不同激 素浓度和配比。
羧苄青霉素对根癌农杆菌具有很好的抑制作用，但是高浓度的羧苄青霉素 会抑制不定芽的生长和增殖，浓度过低又不足以抑制农杆菌生长。在贡菊叶片 诱导不定芽的过程中，当羧苄青霉素为250mg/L时，不定芽的诱导不受影响[17]。 蓝莓与树莓在分化阶段羧苄青霉素的临界值为200～300mg/kg[18]。‘金陵丹 枫’不定芽对羧苄青霉素的临界值则为300～400mg/L。在转基因体系建立过 程中，潮霉素做为抗性筛选标记具有重要作用。潮霉素浓度过高会导致植物细 胞死亡，严重抑制植株生长。不同物种对潮霉素的敏感性差异巨大。巨霸杨对 潮霉素临界浓度为4～6mg/L[19]。甘蔗在愈伤组织形成过程中，潮霉素的筛选浓度为30mg/L[20]。‘金陵丹枫’不定芽对潮霉素较为敏感，潮霉素浓度为2.5 mg/L时，已经影响丛生芽的诱导率和增殖系数。
本发明建立了鸡爪槭‘金陵丹枫’组培再生体系，为大量工厂化育苗提供 了技术支撑；并且开展了不定芽对羧苄青霉素和潮霉素的抗性试验，筛选出了 临界浓度，以期为‘金陵丹枫’遗传转化体系的建立和优化提供参考。同时为 进一步目的基因的导入和分子遗传育种改良奠定了基础。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实 施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本 发明的精神和范围。
Claims (4)
1.一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S001、创造组培条件
向培养基中添加蔗糖20g/L，琼脂5g/L，调整培养基pH值至5.7，并调节组培环境光照强度为100μmol/m2/s，光周期为16h/8h，温度为25±2℃；
步骤S002、外植体消毒
将采集到的鸡爪槭外植体当年生枝条剪去叶片，切取约3cm的带芽茎段，用洗洁剂清洗，然后流动清水冲洗1h，再用75％酒精以及0.1％氯化汞交互式消毒分别不低于5min，同时添加0.2％的聚氧乙烯山梨糖醇酯，消毒完毕后再使用无菌水漂洗3次，最后在无菌滤纸上晾干表面水分；
步骤S003、启动培养
将上述步骤S002中消毒处理后获得的无菌外植体分别接种到含有IAA、IBA、NAA、6-BA、TDZ不同生长素的培养基中，培养45d后，统计腋芽诱导率，观察腋芽萌动及后续生长状况；
步骤S004、增殖培养
将生长状况良好且长约1cm的腋芽剪下，放入含有细胞分裂素6-BA或KT与生长素IBA或NAA混合的培养基中，培养45d后统计平均增殖系数；
步骤S005、生根培养
将经过上述步骤S004增殖培养获得的约1cm丛生芽分别剪下，转移到含有不同浓度生长素IAA(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L)、IBA(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L)配比的培养基中，培养30d后统计生根数及平均根长。
2.根据权利要求1所述的一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法，其特征在于，对经过所述步骤S004增殖培养后的腋芽进行羧苄青霉素抗性试验，该实验方式如下：选取增殖培养基上获得的生长状况良好的健壮不定芽接种到含有不同浓度Carb(0、100、200、300、400、500、600和700mg/L)的增殖培养基中，培养45d后统计不定芽的诱导率及平均增殖系数，同时观察不定芽的成活率及生长状况。
3.根据权利要求1所述的一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法，其特征在于，对经过所述步骤S004增殖培养后的腋芽进行羧苄青霉素抗性试验，该实验方式如下：选取增殖培养基上获得的生长状况良好的健壮不定芽接种到含有不同浓度Hyg的(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15和17.5mg/L)增殖培养基中，培养45d后统计不定芽的增值率及增殖系数，同时观察不定芽的成活率及生长状况。每个处理重复3次，每个处理50个芽。
4.根据权利要求2所述的一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法，其特征在于，当Carb浓度为700mg/L或者Hyg浓度为10mg/L时，丛生芽停止增殖。
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