CN108103093A - 一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，属于遗传工程技术领域。本发明首次建立了一种牛筋草的遗传转化体系方法，包括愈伤组织的诱导和继代、转化、诱导分化、生根筛选培养和炼苗移栽、转基因植株的PCR检测等步骤。该方法优点在于：(1)愈伤组织诱导率高，为遗传转化提供了大量的受体材料。(2)经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验过程，大大减少了转化后的工作量。(3)利用传统的单子叶遗传转化方法，获得了稳定、高效的一种牛筋草遗传转化体系方法。

Description

一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，更具体涉及一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法。
背景技术
牛筋草(Eleusineindica)是禾本科一年生杂草，不仅分布广泛、适应能力强的特点，而且具有强的繁殖能力、分蘖能力强，已成为世界十大恶性杂草之一。由于除草剂的长期大量使用，目前已有265种杂草对15类除草剂产生了抗药性，而牛筋草已对7类除草剂产生了多重抗性。近年来，遗传转化法为抗病虫草害的研究提供了重要的技术手段。
迄今为止，有关牛筋草遗传转化体系的研究还未曾报道，这大大地限制了牛筋草抗药性研究的发展。所以，建立一种稳定、高效的牛筋草遗传转化体系，是研究牛筋草抗药性遗传机理的重要的方法手段。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法。该方法高效稳定，以成熟的敏感型牛筋草种子为外植体，建立其遗传转化体系。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～ 3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗。
(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入 OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养。
(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养。
(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部大约2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h 光照培养。
(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否可扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。
所述的诱导培养基IC：N6+0.5～2mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+ (30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。
优选的，所述的诱导培养基IC：N6+0.5～1mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。
更优选的，所述的诱导培养基IC：N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。
所述的继代培养基AC：N6+0.25～1mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白 +3～4g·L-1植物凝胶+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1；
优选的，所述的继代培养基AC：N6+0.25～0.5mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+3～4g·L-1植物凝胶+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1；
更优选的，所述的继代培养基AC：N6+0.25mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+3g·L-1植物凝胶+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1；
所述的预培养所用的培养基同继代培养基AC。
所述的共培养培养基CC：诱导培养基IC+100～300μmol·L-1乙酰丁香酮 AS，pH＝5.2±0.1。
优选的，所述的共培养培养基CC：诱导培养基IC+300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1。
所述的筛选培养基SC1：诱导培养基IC+25～30mg·L-1潮霉素+300～400 mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1；
优选的，所述的筛选培养基SC1：诱导培养基IC+30mg·L-1潮霉素+300 mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1；
所述的筛选培养基SC2：诱导培养基IC+15～20mg·L-1潮霉素+200～300 mg·L-1羧苄青霉素；pH＝6.0±0.1。
优选的，所述的筛选培养基SC2：诱导培养基IC+15mg·L-1潮霉素+200 mg·L-1羧苄青霉素；pH＝6.0±0.1。
所述的分化培养基DC：MS+0.5～2mg·L-1 6-BA+0.5～2mg·L-1KT+0～ 0.2mg·L- 1NAA+0～0.2mg·L-1IAA+0～200mg·L-1羧苄青霉素+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝6.0±0.1。
优选的，所述的分化培养基DC：MS+0.5mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1KT+0.05 mg·L- 1NAA+0.05mg·L-1IAA+200mg·L-1羧苄青霉素+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝6.0±0.1。
所述的生根筛选培养基RC：1/2MS+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂+25～30mg·L-1潮霉素，pH＝5.8±0.1。
优选的，所述的生根筛选培养基RC：1/2MS+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+ 30mg·L-1潮霉素，pH＝5.8±0.1。
步骤(1)中所述的消毒优选为用0.05％HgCl2消毒灭菌10min。
步骤(2)中所述的低温处理为4℃静置处理20～40min；优选为4℃静置处理30min；
步骤(2)中所述的目的农杆菌为质粒pCAMBIA1305.1插入根癌农杆菌得到的；
所述的目的农杆菌为通过含有目的基因的农杆菌双元表达载体导入根癌农杆菌中的。
所述的目的基因为GUS基因；
所述的表达载体为pCAMBIA1305.1，由华南农业大学林学院提供，且是常规市售载体。
所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，由华南农业大学农学院提供。
所述的目的农杆菌悬浮液是通过YEB培养基培养得到。
所述的YEB培养基：牛肉膏酵母粉5g·L-1+酵母粉1g·L-1+蛋白胨5g·L-1+蔗糖5g·L-1+MgSO4·7H2O为0.5g·L-1+15g·L-1琼脂，pH＝7.0±0.1。
步骤(2)中所述的“二次间歇抽真空”浸染为抽真空10min+静置5min+ 抽真空10min+静置5min；
步骤(4)中所述的基质为土壤：沙子：营养土＝2:2:1。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明首次建立了一种牛筋草的遗传转化体系方法，其优点在于(1)愈伤组织诱导率高，为遗传转化提供了大量的受体材料。(2)经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验过程，大大减少了转化后的工作量。(3)利用传统的单子叶遗传转化方法，获得了稳定、高效的一种牛筋草遗传转化体系方法。
附图说明
图1是实施例为愈伤组织的诱导(a)和继代(b)。
图2是实施例为潮霉素抗性浓度的选择；其中，a、b、c、d、e、f依次为0、 20、25、30、40、50mg·L-1的潮霉素处理，以a为对照。
图3是实施例为愈伤组织对羧苄青霉素敏感性的测定；其中，a、b、c、d、 e、f依次为0、100、200、300、400、500mg·L-1的羧苄青霉素，以a为对照。
图4是实施例为羧苄青霉素的抑菌情况；其中，a、b、c、d、e、f依次为0、 100、200、300、400、500mg·L-1的羧苄青霉素，以a为对照。
图5是实施例为农杆菌介导的愈伤组织GUS瞬时染色图片。
图6是实施例为转化愈伤组织的筛选(a)和分化(b)。
图7是实施例为农杆菌介导的转基因植株的GUS染色图片。
图8是实施例为抗性植株的移栽。
图9是实施例为GUS基因PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，用75％酒精浸泡1min，于0.05％ HgCl2消毒灭菌10min，最后在超净台上用无菌ddH2O反复清洗5遍，风干，接入诱导培养基IC中。30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为实施例的材料。培养条件： 25±2℃、24h黑暗。预培养所用的培养同继代培养基AC。
愈伤组织的诱导(a)和继代(b)，如图1所示。
实施例1抗生素浓度的选择
(1)潮霉素浓度的选择：挑选淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织置于灭菌的培养皿内，称量鲜重，记录空培养皿的重量，后转接于含潮霉素0、 20、30、40、50mg·L-1的继代培养基AC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+3g·L-1植物凝胶+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)中，25℃、24 h黑暗条件，设一个处理三个重复，一个重复8个愈伤组织。30d后转入灭菌的空培养皿内，称量鲜重，计算愈伤组织的增重量(表1)。结合图2结果表明， 30mg·L-1潮霉素浓度应作为转基因牛筋草抗性筛选浓度。
表1潮霉素浓度的选择
浓度(mg·L-1) 愈伤增重量(mg)
0(ck) 210±0.0289a
20 60±0.0058b
25 6.7±0.0033c
30 -3.3±0.0033c
40 -3.3±0.0033c
50 -6.7±0.0033c
(2)羧苄青霉素浓度的选择：挑选淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤切成相近大小，转接于附加了0、100、200、300、400、500mg·L-1羧苄青霉素的继代培养基AC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+3g·L-1植物凝胶+0.8g·L-1水解酪蛋白 +30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)上，30d后观察愈伤组织生长情况，拍照(图3)确定愈伤组织对羧苄青霉素的敏感性；挑选淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织，接入含pCAMBIA1305.1的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，浸染25min，悬浮液浓度为OD600＝0.6；将感染后的外植体移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转接于附加了0、100、200、300、400、500mg·L-1羧苄青霉素的继代培养基AC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+3g·L-1植物凝胶+0.8g·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)上，30d后观察羧苄青霉素的抑菌情况，拍照(图4)。培养条件：25℃、24h黑暗培养。发现300mg·L-1的羧苄青霉素既能达到抑制根癌农杆菌的效果，又不影响转基因愈伤组织的正常生长。
实施例2一种根癌农杆菌介导的牛筋草愈伤组织的瞬时转化
(1)农杆菌悬浮液浓度对转化率的影响：将愈伤组织接入含 pCAMBIA1305.1的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，浸染25min，使农杆菌吸附到外植体上，悬浮液浓度OD600值分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8，无菌滤纸吸取多余菌液，接入共培养培养基CC(N6+0.5mg·L-12,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+200μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1)中；共培养3d，脱菌风干后，转接于含300mg·L-1羧苄青霉素的诱导培养基IC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1) 中，培养条件：25℃、24h黑暗培养，设一个处理三个重复，一个重复8个愈伤组织。20d后进行愈伤组织GUS瞬时染色(图5，表2)。当OD600＝0.5时，GUS 瞬时转化率达到最高。
表2 OD600值与侵染时间及共培养时间对遗传转化的影响
(2)侵染时间：农杆菌悬浮至OD600＝0.6，将备好的愈伤组织浸没于含pCAMBIA1305.1的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，分别振荡10、20、25、30、 40min后，无菌滤纸吸取多余菌液，接入共培养培养基CC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D +0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+200μmol·L-1乙酰丁香酮AS， pH＝5.2±0.1)中；共培养3d，脱菌风干后，转接于含300mg·L-1羧苄青霉素的诱导培养基IC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)中，设一个处理三个重复，一个重复8个愈伤组织。20d 后进行组织GUS瞬时染色，统计染色率(表2)。当侵染时间为30min时，GUS 瞬时转化率达到最高。
(3)共培养时间：农杆菌悬浮至OD600＝0.6，将备好的愈伤组织浸没于目的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，振荡25min后，无菌滤纸吸取多余菌液，接入共培养培养基CC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+200μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1)中；共培养0、1、2、 3、4d，脱菌风干后，转接于含300mg·L-1羧苄青霉素的诱导培养基IC(N6+0.5 mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)中，设一个处理三个重复，一个重复8个愈伤组织。20d后进行组织GUS瞬时染色，统计染色率(表2)。当共培养3d时，GUS瞬时转化率达到最高。
(4)低温处理和真空渗入对转化的影响：将备好的愈伤组织于4℃低温静置30min后，农杆菌悬浮至OD600＝0.6，将处理过的愈伤浸没于含 pCAMBIA1305.1的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，抽真空后，无菌滤纸吸取多余菌液，接入共培养培养基CC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+200μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1)中；共培养 3d，脱菌风干后，转接于含300mg·L-1羧苄青霉素的诱导培养基IC(N6+0.5 mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)上，设一个处理三个重复，一个重复8个愈伤组织。20d后进行组织GUS瞬时染色，统计染色率(表3)。结果显示，抽真空侵染20min能显著促进愈伤组织的转化。
表3侵染方式和AS浓度对遗传转化的影响
(5)AS浓度对转化率的影响：农杆菌悬浮至OD600＝0.6，将备好的愈伤组织浸没于含pCAMBIA1305.1的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，振荡25min后，用无菌滤纸吸取多余菌液，接入含AS浓度为100、200、300、400、500μmol·L-1的共培养培养基CC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖 +8g·L-1琼脂+乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1)中；共培养3d，脱菌风干后，转接于含300mg·L-1羧苄青霉素的诱导培养基IC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1)中，20d后进行愈伤组织GUS 瞬时染色。设一个处理三个重复，一个重复8个愈伤组织。AS浓度高于 300μmol·L-1对牛筋草愈伤组织产生毒害作用，低于300μmol·L-1降低转化率。因此，牛筋草的遗传转化的共培养基中附加300μmol·L-1AS为宜。
实施例3一种根癌农杆菌介导的牛筋草愈伤组织转化方法
(1)转化和筛选：挑选预培养的淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织，浸入备好的含pCAMBIA1305.1的EHA105根癌农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，其间不断振荡，倒去菌液，取外植体置于灭菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养培养基CC(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白 +30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1)中，24 h暗培养3d，经脱菌后，将转化的愈伤组织接入筛选培养基SC1(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+30mg·L-1潮霉素+ 300mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1)中进行一次筛选(图6a)，30d后进行二次筛选，培养基为筛选培养基SC2(N6+0.5mg·L-1 2,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白 +30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+15mg·L-1潮霉素+200mg·L-1羧苄青霉素， pH＝6.0±0.1)。
(2)分化：待筛选的愈伤产生新的愈伤组织后，转接于分化培养基DC(MS +0.5mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1KT+0.05mg·L-1NAA+0.05mg·L-1IAA+ 200mg·L-1羧苄青霉素+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝6.0±0.1。)中，图6b。
(3)生根筛选和GUS鉴定(图7)：待芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC(1/2MS+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+30mg·L-1潮霉素，pH＝5.8±0.1) 中；待幼苗根系发达时，开瓶炼苗3d，洗净琼脂凝胶，分别剪取根、叶2～4cm，加入GUS染液浸没过组织，于37℃保温培养16～24h，待有蓝色反应后，用 70％酒精脱色三次，脱去叶绿素，统计GUS+转化率。8株转基因植株中有6株的根和叶呈现出明显蓝色发应。
(4)移栽：转基因植株鉴定后，将阳性苗移至含土壤：沙子：营养土＝2:2:1 的花盆中，12h光照培养(图8)。
(5)转基因植株的PCR凝胶电泳上检测：用改良的CTAB法提取牛筋草的基因组DNA。取3μL所提取的DNA进行PCR扩增。产物于1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳上检测，凝胶成像仪上拍照观察(图9)。以野生型牛筋草为“-”对照，质粒pCAMBIA1305.1为“+”对照，预期产物长度为742bp，结果表明，野生型在PCR反应中未出现预期产物，8株转基因牛筋草有6株出现预期产物，转化率与GUS染色鉴定结果相同。
引物序列如下：
GUSPF：5′-TTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTC-3′；
GUSPR：5′-CGCTGACCTTCAGATAGGC-3′。
改良的CTAB法提取牛筋草的基因组DNA，具体方法如下：
(1)取0.5g左右的牛筋草叶片于液氮中研磨成细粉，移至干净的2mL离心管中。加入500～700μL预热的2×CTAB，上下颠倒混匀。将离心管置于65℃恒温金属浴中，每10min上下颠倒混匀一次，30～40min后取出，冷却。
(2)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋振荡器上剧烈震动，混合均匀。
(3)12,000rpm离心10min，将上清水相移至2mL离心管中，加入2～4μL RNase消化1.5h。
(4)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋振荡器上剧烈震动混匀。12,000 rpm离心5min。将上清水相移至2mL离心管中。
(5)加入等体积预冷异丙醇，充分颠倒混匀，于-20℃静置1h。
(6)10,000rpm离心3min，收集白色沉淀，尽可能去除上清液体。白色沉淀即为DNA。
(7)加入720μL 75％乙醇及80μL 3mol·L-1NaAc，重悬DNA，清洗沉淀。静置30min。
(8)10,000rpm离心3min，收集沉淀，尽可能去除上清。
(9)加入800μL 75％乙醇，重悬DNA，清洗沉淀。
(10)11000rpm离心5min，收集沉淀，尽可能去除上清。将离心管置于50℃恒温金属浴上，烘干剩余乙醇。
(11)加入50μL ddH2O溶解DNA，于-20℃保存。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GUSPF
<400> 1
ttcttggtta ggaccctttt ctc 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GUSPR
<400> 2
cgctgacctt cagataggc 19

Claims (10)

1.一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗；
(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养；
(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养；
(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h光照培养；
(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。
2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的诱导培养基IC：N6+0.5～2mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。
3.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的继代培养基AC：N6+0.25～1mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+3～4g·L-1植物凝胶+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。
4.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：
所述的共培养培养基CC：诱导培养基IC+100～300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1。
5.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的筛选培养基SC1：诱导培养基IC+25～30mg·L-1潮霉素+300～400mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1。
6.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的筛选培养基SC2：诱导培养基IC+15～20mg·L-1潮霉素+200～300mg·L-1羧苄青霉素；pH＝6.0±0.1。
7.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的分化培养基DC：MS+0.5～2mg·L-1 6-BA+0.5～2mg·L-1KT+0～0.2mg·L-1NAA+0～0.2mg·L-1IAA+0～200mg·L-1羧苄青霉素+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝6.0±0.1。
8.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的生根筛选培养基RC：1/2MS+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂+25～30mg·L-1潮霉素，pH＝5.8±0.1。
9.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的低温处理为4℃静置处理20～40min；
步骤(2)中所述的目的农杆菌为为通过含有目的基因的农杆菌双元表达载体导入根癌农杆菌中的。
10.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的“二次间歇抽真空”浸染为抽真空10min+静置5min+抽真空10min+静置5min；
步骤(4)中所述的基质为土壤：沙子：营养土＝2:2:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234308A (zh) * 2018-10-25 2019-01-18 华侨大学 一种根癌农杆菌介导的转基因菘蓝再生植株转化方法
CN109371057A (zh) * 2018-11-05 2019-02-22 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草高通量遗传转化的方法
CN112544441A (zh) * 2020-11-10 2021-03-26 江苏省农业科学院 一种鸡爪槭新品种组培再生体系的建立方法

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魏吉平: "牛筋草遗传转化体系的建立及其抗百草枯的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

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