CN101161058A - 一种抗根癌病樱桃砧木苗的选育方法及组培快繁技术 - Google Patents
一种抗根癌病樱桃砧木苗的选育方法及组培快繁技术 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种抗根癌病樱桃砧木苗的选育方法属于农业中的果树繁殖和选育方法，具体涉及一种采用组培快繁技术快速筛选和繁殖生产抗根癌病樱桃砧木苗的方法，包括无菌抗根癌病樱桃砧木试管苗的选择、试管苗的增殖扩繁培养、试管苗的壮苗培养、试管苗的生根培养和试管苗的移栽培养步骤，由于采用了本发明所述的技术方案使得本发明具有可以快速获得大量性状稳定的抗根癌病樱桃砧木、减少了培育成本、改变了以往樱桃砧木根癌病发病率高，造成树势弱，结果品质差，大树易死亡境况的有益效果。
Description
技术领域：
本发明属于农业中的果树繁殖和选育方法，具体涉及一种采用组培快繁技术快速筛选和繁殖生产抗根癌病樱桃砧木苗的方法。
背景技术：
目前我国甜樱桃分布主要集中在渤海湾沿岸，以烟台市和大连市郊区为最多。山东省是我国甜樱桃栽培面积最大、产量最多的一个省，除烟台市各区县外，青岛、威海、济南、日照、淄博、潍坊、枣庄、泰安、临沂等地也有分布。辽宁省集中分布在大连市的金州区和甘井子区。河北省主要分布在秦皇岛市山海关区，北戴河区及昌黎县。此外，北京、河南、山西、陕西、内蒙古、新疆、湖北、江西、四川等十几个省、自治区、直辖市也都有引种和栽培。近几年由于人民生活水平的提高、甜樱桃作为观光休闲农业不断发展。
樱桃扦插不易生根，生产上都采用嫁接繁殖樱桃苗木，嫁接苗包括砧木和接穗品种两个部分。由于砧木对地上部分的生长、结果以及本身的抗病性有很大影响，因此选育合适的砧木非常重要。
生产上常用的樱桃砧木根癌病发病率高，造成树势弱，结果品质差，大树易死亡，给果农造成了很大的经济损失。在一定程度上也限制了樱桃这一产业的发展速度。为此，选择抗根癌病的樱桃砧木，对调整农业种植结构、促进观光休闲农业的发展、樱桃老果园的更新换代和新果园的建立都有重要的意义。
花卉、果树和林木的组培快繁技术是北京市海淀区植物组织培养技术实验室20多年来重点研究的一套应用于生产中并产生较好效果和较大经济效益的生物技术之一。该技术的主要要点是将在田间生长的植物体的一部分组织或器官，在超净工作台上进行消毒、接种，通过在培养室中培养诱导其分化、促使其增殖生长和生根，最后经过移栽过渡形成一个正常的植株。这一生物技术应用于花卉、果树和林木的快速繁殖，在国家外专局、市科委、市财政局、海淀区科委和农林委等10多个项目中得到应用(其中有两个项目获得北京市科技进步三等奖，两个获得国家发明专利)。
我们在组培快繁工作中，所确定的接种材料通常是综合性状优良，材料本身资源少、用常规方法繁殖慢或繁殖困难的植物。因此，需要通过组培快繁技术体系的建立获得大量的组培苗用于研究、生产、应用和推广。
发明内容：
本发明公开了一种利用植物组织培养技术进行抗根癌病樱桃砧木快速筛选和繁殖的方法。
本发明所公开的方法包括樱桃砧木的组培快繁过程和抗根癌病樱桃砧木的快速筛选过程，以下对樱桃砧木的组培快繁过程和抗根癌病樱桃砧木的快速筛选过程分别进行详细的说明。
一、樱桃砧木的组培快繁过程：包括外植体的选择、扩繁培养、壮苗培养、生根培养和组培苗移栽方法等在内的樱桃砧木组培快繁技术，具体的过程步骤如下：
1、外植体即抗根癌病樱桃砧木试管苗的选择：
一般来说，多年生的木本植物相对带菌多，在组培快繁过程中外植体污染率较高。因此，降低外植体污染率，是木本植物组培快繁技术需要解决的关键问题之一。
由于不同时期外植体污染情况存在很大差异，在试验过程中，选择休眠的枝条、早春休眠枝水培萌发的新梢、生长季新梢等不同时期的外植体材料进行接种，在消毒方法相同的条件下，接种两个星期后统计污染率。统计结果如表1。
表1 不同时期的外植体材料污染情况比较
| 取材时期 | 休眠枝 | 水培新梢 | 生长季新梢 |
| 污染率(％) | 100 | 18.8 | 92.9 |
从表1可以看出，不同时期的外植体材料接种时污染率差异显著，这是由于不同生长时期的枝条本身带菌量不同和对消毒剂的敏感性不同所至。休眠期的枝条带菌量大，木质化程度高，消毒剂不易渗透，因此，外植体的污染率就高；休眠枝水培条件下萌发的新梢处于旺盛生长时期，枝条本身和外界环境带菌量相对较少，枝条木质化程度低，消毒剂易于渗透，消毒效果好，所以外植体污染率低；由于生长季多为雨季，细菌繁殖快，外植体和周围环境中菌类含量会有所增高，这也是处于生长季的新梢外植体污染率较高的原因。
利用樱桃砧木种子、(易发生败育种子的)未成熟胚和枝条作为外植体进行接种，接种时期为种子在沙藏后30天-60天，其中所述的未成熟胚为受精后胚败育前获得的未成熟胚，所述的枝条为早春水培新梢或温室苗的新梢，当新梢长到10公分左右时，剪取新梢用于组培快繁的外植体材料。此时的外植体由于带菌量少、褐化轻，易于获得无菌试管苗；
对所得的无菌试管苗进行抗根癌病筛选，选取瘿瘤的重量分级为0级的抗根癌病樱桃砧木试管苗，其步骤如下：将无菌樱桃砧木试管苗茎中下部接种农杆菌后，置于无激素的MS培养基中进行培养，40天后统计病发率即把瘿瘤从发病部位取下并称重，其中抗根癌病樱桃砧木试管苗的抗性强弱以结瘤百分率和瘿瘤重量表示如下：
结瘤百分率(％)＝结瘤的植株数/接瘤的植株数
按瘿瘤的重量分级：0级、无瘤产生；1级、瘤体重量≤10mg(以不大于植株直径的瘿瘤的重量为标准)；2级、瘤体重量10mg以上(瘿瘤大于茎的直径，影响植株生长的均为2级)。
病情指数(％)＝∑(受害级值×每级株数)/(最高级值×总株数)×100；
上述接种的过程如下：
a、材料
要检测的樱桃砧木试管苗或组培生根苗(以吉赛拉为对照)；
b、病原菌及悬浮液的制备
把农杆菌(胭脂碱型农杆菌C58)在固体培养基YEB上划线培养，于4℃保存，接种前挑取C58单菌落接种于YEB的液体培养基中，27℃振荡培养，OD600值达0.5，用于活体接瘤实验；
c、接种与培养
用无菌注射器蘸取农杆菌菌液，在樱桃砧木试管苗茎中下部用无菌注射器接种农杆菌，接种后的试管苗培养于无激素的MS培养基中，组培生根苗栽植于花盆中，每个品种接30株以上；
2、扩繁培养：
经由步骤(1)对外植体的选择，获得无菌试管苗后，当小试管苗长到1cm以上时，切下小苗并将其转移到扩繁培养基MS+6BA 0.5-2.0mg/L(即在基本培养基的组成上加入1.0mg/L激素6BA配成的培养基)上，温度控制在20℃-24℃左右，光强1500Lx-2500Lx，光照12小时，促使樱桃砧木试管苗增殖，采用上述扩繁培养基和培养条件，能使樱桃砧木试管苗的分化率达到100％，月增殖倍数达到6.6，并且生长良好，可以满足大规模生产的需求；
本发明申请人对樱桃砧木试管苗的增殖进行了不同基本培养基、不同激素、不同培养条件等方面的试验来确定最佳的实施条件：
2.1基本培养基对试管苗增殖的影响：
为了筛选适宜樱桃砧木试管苗生长和分化的培养基，首先选择了MS、AS、NTH、MILLER、WHITE、WP等基本培养基进行了试验。试验结果证明：在其它条件相同的情况下，樱桃砧木试管苗在MS培养基上增殖和生长情况较好，月增殖倍数较高(见表2)，且试管苗叶色浓绿、生长健壮。因此，MS培养基是适宜樱桃砧木试管苗增殖和生长的培养基类型。
表2 基本培养基对樱桃砧木试管苗增殖的影响
| 培养基 | MS | AS | NTH | MILLER | WHITE | WP |
| 月增殖倍数 | 3.2 | 2.8 | 2.4 | 1.9 | 1.6 | 2.1 |
2.2细胞分裂素对试管苗增殖的影响：
选用6BA和KT两种细胞分裂素，浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg/L，以不加细胞分裂素的培养基为对照，试验结果见表3。
表3 不同细胞分裂素对樱桃砧木试管苗增殖的影响
| 细胞分裂素(mg/L) | 6BA | KT | CK | ||||||
| 0.5 | 1.0 | 2.0 | 4.0 | 0.5 | 1.0 | 2.0 | 4.0 | ||
| 月增殖倍数 | 4.7 | 6.6 | 5.8 | 3.2 | 0.6 | 0.8 | 1.4 | 3.6 | 0.6 |
从表3可以看出，6BA对樱桃砧木试管苗增殖的促进作用好于KT，其中6BA浓度为1.0mg/L时，樱桃砧木试管苗的月增殖倍数最高达到6.6。
2.3温度对试管苗增殖的影响：
在其它条件相同的情况下，把樱桃砧木试管苗放在22±2℃和25±2℃两种温度下培养。表4的试验统计结果表明：在25±2℃的培养室内，樱桃砧木试管苗的增殖倍数比22±2℃时有所提高，但试管苗较细弱、易发生玻璃化；在22±2℃的温度条件下培养，樱桃砧木试管苗生长健壮、生长情况良好。
表4 温度对樱桃砧木试管苗增殖的影响
| 温度 | 月增殖倍数 | 玻璃化现象 | 试管苗生长状况 |
| 22±2℃25±2℃ | 3.24.7 | 无有 | 叶片较绿，生长正常叶片黄绿，苗细弱 |
3、壮苗培养：
在步骤(2)中由于有些樱桃砧木试管苗节间较短，不能很好地拔高生长，造成成苗率低，给试管苗的生根和移栽带来很大困难。因此，当樱桃砧木试管苗增殖到一定数量后，需要对步骤(2)扩繁后的试管苗进行壮苗培养，所采用的壮苗培养基为MS+GA 5-10mg/L，壮苗时间以一个月左右为宜，否则会造成樱桃组培苗细弱、黄化和脱叶；
为了获取壮苗培养的最佳条件，本发明进行了影响抗根癌病樱桃砧木试管苗成苗率的试验。试验中发现，培养温度的改变、培养基中加入活性炭等物质，对樱桃砧木试管苗的成苗率影响不大；GA对促进樱桃砧木试管苗的生长具有重要的作用。选用GA5、10、20mg/L三种不同的浓度进行试验，以不加GA的培养基为对照，试验结果如表5。
表5 不同因素对樱桃砧木试管苗成苗率的影响
| 因素 | GA(mg/L) | 温度(℃) | 活性炭(％) | |||||
| 0 | 5 | 10 | 20 | 22 | 25 | 0 | 0.25 | |
| 成苗率(％) | 4.5 | 22.6 | 45.3 | 56.8 | 10 | 15 | 17 | 20 |
注：成苗率＝1.5cm以上苗数/总苗数
从表5可以看出，随着GA浓度的增加，成苗率有所增加；但同时也发现，随着GA浓度和培养时间的增加，樱桃砧木试管苗黄化现象明显，茎尖会出现褐化死亡，还会降低樱桃砧木试管苗的生根率。在实际应用中较适宜的GA浓度是5-10mg/L，培养时间以一个月左右为宜。
4、生根培养：
经过步骤(3)壮苗培养后的樱桃砧木试管苗，转接到MS+IBA 1.0mg/L或MS+NAA 0.5mg/L的生根培养基中，促使樱桃砧木试管苗的生根，采用上述的生根培养基，其生根率能达到93.7％；
本发明对影响抗根病樱桃砧木苗的生根因素进行了试验，内容如下：
樱桃砧木试管苗生根的影响因素很多，重点对不同株系、生长素、培养基中蔗糖和活性炭的含量、苗的剪切部位以及插苗方式等进行了试验研究。
4.1不同株系樱桃砧木试管苗生根率的差异
在试验中发现，在没有激素作用的情况下，不同株系樱桃砧木试管苗的生根率存在很大差异(见表6)，这可能是不同株系的基因型不同所致。
表6 不同株系樱桃砧木试管苗的生根率
| 株系 | 7号 | 8号 | 11号 | 17号 |
| 生根率(％) | 100 | 87.5 | 80 | 49.7 |
4.2生长素对樱桃砧木试管苗生根的影响
选生根率相对较低的樱桃砧木株系试管苗进行生根试验，试验结果见表7。试验结果证明：生长素IBA(1.0mg/L)和NAA(0.5mg/L)对樱桃砧木试管苗生根均有较好的促进作用，使生根率达到93％以上。
表7 生长素对樱桃砧木试管苗生根的影响
| 生长素(mg/L) | 0 | IBA0.5 | IBA1.0 | NAA0.1 | NAA0.5 |
| 生根率(％) | 55.6 | 83.1 | 93.7 | 79.7 | 93.7 |
4.3蔗糖和活性炭对樱桃砧木试管苗生根的影响
进行蔗糖(浓度为20g/L和30g/L)和活性炭(加活性炭0.25％和不加活性炭)对试管苗生根影响的试验结果表明：蔗糖对樱桃砧木试管苗的生根有促进作用；而活性炭对樱桃砧木试管苗的生根表现出双重作用，在没有生长素的情况下活性炭可以促进樱桃砧木试管苗的生根，在生长素存在的情况下活性炭对樱桃砧木试管苗的生根有抑制作用(见表8)。这种情况出现的原因可能是在无生长素存在的条件下，活性炭吸附了一些抑制生根的因子，从而促进了根的发生；而在生长素存在的条件下，活性炭对生长素的吸附作用较大，降低了生长素对生根的促进作用，与不加活性炭相比使生根率有所下降。
表8 活性炭(AC)对樱桃砧木试管苗生根的影响
| 培养基 | MS+IBA0.5+AC | MS+IBA0.5 | MS+AC | MS |
| 生根率(％) | 69.0 | 82.4. | 54.0 | 32.1 |
4.4苗的剪切部位和扦插深度对樱桃砧木试管苗生根的影响
把樱桃砧木试管苗的剪切部位分为两种：一种是在节间剪，另一种是在节处剪(贴着叶下)；另外，把扦插的方式也分为两种：浅插(不超过1/2培养基深度)和深插(超过1/2培养基深度)。试验结果证明：贴着叶下剪切樱桃砧木试管苗的生根率相对较高，这可能是由于节处的细胞相对活跃、分生力强、对激素作用敏感的缘故；而苗的扦插方式对樱桃砧木试管苗的生根率影响不大，但是，浅插更有利于樱桃砧木试管苗根的生长。
5、组培苗移栽：
当樱桃砧木试管苗生根后，从培养容器中取出，洗净琼脂，进行移栽过渡，过渡苗一般用容器加基质进行栽培，樱桃砧木试管苗移栽过渡的基质为蛭石，樱桃砧木试管苗在此基质中移栽过渡的成活率最高可以达到95％以上，移栽过渡成活后的樱桃砧木苗根据情况可以进行容器栽植或田间定植。
为了提高樱桃砧木试管生根苗的移栽成活率，对试管生根苗的状态、移栽基质等方面进行了试验研究。
5.1试管生根苗的状态对移栽成活的影响
根据试管生根苗根发育的不同时期把苗分为根原基、短根(根长1CM以下)和长根(根长1CM以上)三种情况，并把三种类型的樱桃砧木试管苗分别移栽在相同的条件下。一个月后统计试验结果表明：三种情况樱桃砧木试管生根苗的移栽成活率相差不显著。
5.2基质对试管生根苗移栽成活的影响
以沙子、蛭石、营养土、园田土、沙子+营养土、蛭石+营养土、园田土+营养土为基质，分别移栽樱桃砧木试管生根苗并观察其移栽成活情况，一个月后统计试验结果表明：蛭石中移栽的樱桃砧木试管生根苗成活率最高(见表9)。但是在蛭石中的樱桃苗，后期会出现生长量小，叶片发黄等现象，一定要加强肥水管理，并在移栽成活后及时倒苗。
表9 不同栽培基质对樱桃砧木组培生根苗移栽成活的影响
| 基质 | 沙子 | 沙子+营养土 | 蛭石 | 蛭石+营养土 | 营养土 | 田土+营养土 | 田土 |
| 成活率(％) | 88.5 | 81.3 | 95.8 | 86.5 | 70.8 | 80.2 | 72.9 |
依照上述的方法，我们已经建立了抗根癌樱桃砧木的组培快繁技术方法，各项指标均达到了产业化生产的要求。
有益效果：
1、由于本发明采用了植物组织培养和筛选技术，因此采用本发明技术方案可以快速获得大量性状稳定的抗根癌病樱桃砧木；
2、由于采用了本发明的技术方案，在试管苗时期即进行抗根癌病筛选，使得不具有抗性的樱桃苗在早期即被排除，减少了培育的成本；
3、采用本发明公开的扩繁培养基和培养条件，可以使抗根癌病樱桃砧木试管苗的分化率达到100％，月增殖倍数达到6.6，并且生长良好，可以满足大规模生产的需求；
4、采用本发明公开的的生根培养基，使得抗根癌病樱桃砧木试管苗生根率达到93.7％；
5、采用本发明的技术方案改变了以往樱桃砧木根癌病发病率高，造成树势弱，结果品质差，大树易死亡的境况。
具体实施方式
本发明具体实施方式仅以枝条作为外植体为例来对获得抗根癌病樱桃砧木苗的选育方法进行说明，以其它外植体为试管苗获得抗根癌病樱桃砧木苗的选育方法可以参照本本发明的选育方法进行。
实施例1：
1、外植体即抗根癌病樱桃砧木试管苗的选择：
取早春水培新梢或温室苗的新梢，当新梢长到10公分左右时，剪取新梢用于组培快繁的外植体材料；
对所得的无菌试管苗进行抗根癌病筛选，选取抗根癌病樱桃砧木试管苗，其步骤如下：将无菌樱桃砧木试管苗茎中下部接种农杆菌后，置于无激素的MS培养基中进行培养，40天后选取按瘿瘤的重量分级为0级的抗根癌病樱桃砧木试管苗作为后续操作的材料；
2、扩繁培养：
经由步骤1对外植体的选择，获得无菌试管苗后，当小试管苗长到1cm以上时，切下小苗并将其转移到扩繁培养基MS+6BA 0.5mg/L上，温度控制在20℃左右，光强1500Lx，光照12小时，促使樱桃砧木试管苗增殖，经过增殖樱桃砧木试管苗的分化率达到100％，月增殖倍数达到6.6，并且生长良好，可以满足大规模生产的需求；
3、壮苗培养：
将经由步骤2获得的试管苗置于壮苗培养基MS+GA 5mg/L，壮苗28天；
4、生根培养：
经过步骤(3)壮苗培养后的樱桃砧木试管苗，转接到MS+IBA 1.0mg/L的生根培养基中，促使樱桃砧木试管苗的生根，生根率能达到93.7％；
5、组培苗移栽：
当樱桃砧木试管苗生根后，从培养容器中取出，洗净琼脂，进行移栽过渡，将过渡苗移栽到蛭石基质中，移栽过渡成活后的樱桃砧木苗根据情况可以进行容器栽植或田间定植。
实施例2：
采用与实施例1相同的步骤，在步骤2中将试管苗扩繁的条件改为培养基MS+6BA 1.0mg/L上，温度控制在22℃左右，光强1800Lx，光照12小时，在步骤3中将壮苗培养条件改为壮苗培养基MS+GA 7mg/L，壮苗30天，步骤4中的生根培养条件变为MS+NAA 0.5mg/L的生根培养基中。
实施例3：
采用与实施例1相同的步骤，在步骤2中将试管苗扩繁的条件改为培养基MS+6BA 1.1mg/L上，温度控制在24℃左右，光强2000Lx，光照12小时，在步骤3中将壮苗培养条件改为壮苗培养基MS+GA 8mg/L，壮苗31天，步骤4中的生根培养条件变为MS+NAA 0.5mg/L的生根培养基中。
实施例4：
采用与实施例1相同的步骤，在步骤2中将试管苗扩繁的条件改为培养基MS+6BA 2.0mg/L上，温度控制在21℃左右，光强2500Lx，光照12小时，在步骤3中将壮苗培养条件改为壮苗培养基MS+GA 10mg/L，壮苗31天，步骤4中的生根培养条件变为MS+IBA 1.0mg/L的生根培养基中。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种抗根癌病樱桃砧木苗的选育方法，它包括以下步骤：
(1)、无菌抗根癌病樱桃砧木试管苗的选择：将无菌樱桃砧木试管苗茎中下部接种农杆菌后，置于无激素的MS培养基中进行培养，选取抗根癌病樱桃砧木试管苗；
(2)、将步骤(1)获得的抗根癌病樱桃砧木试管苗置于扩繁培养基MS+6BA 0.5-2.0mg/L上，在20℃-24℃温度下，1500Lx-2500Lx光强的条件下，光照12小时，使抗根癌病樱桃砧木试管苗增殖；
(3)、将步骤(2)中增殖的抗根癌病樱桃砧木试管苗置于壮苗培养基MS+GA 5-10mg/L，壮苗28-31天；
(4)、将经步骤(3)壮苗后的抗根癌病樱桃砧木试管苗转接到生根培养基中，进行生根培养；
(5)、将生根后的抗根癌病樱桃砧木试管苗移栽到育苗移栽基质中进行栽培获得抗根癌病樱桃砧木苗。
2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于：步骤(4)中所述的生根培养基为MS+IBA 1.0mg/L或MS+NAA 0.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于：所述步骤(5)中的育苗移栽基质为蛭石。
4.权利要求1步骤(2)中使用的培养基，其特征为：所述培养基的组成为MS+6BA 0.5-2.0mg/L。
5.权利要求1步骤(3)中使用的培养基，其特征在于：所述的培养基为MS+GA 5-10mg/L。
6.权利要求1步骤(4)中使用的培养基，其特征在于：所述培养基为MS+IBA 1.0mg/L或MS+NAA 0.5mg/L。
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