CN102676520B - microRNA444a或其编码基因在调控水稻株高中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种microRNA444a或其编码基因在调控水稻株高中的应用。本发明提供microRNA444a或其编码基因在调控植物株高中的应用；所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2。本发明的实验证明，本发明发现的microRNA444a，将其的编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA444a的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显的株高降低的表型，说明该microRNANA与水稻株高调控密切相关。

Description

microRNA444a或其编码基因在调控水稻株高中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种microRNA444a或其编码基因在调控水稻株高中的应用。

背景技术

microRNA广泛存在于真核生物的基因组中，在生物的生长和发育的过程中起着重要的调节作用，包括生长发育、代谢、信号传导和植物的胁迫响应。microRNAs长度一般在21-25nt之间，它在转录后水平负调控靶基因的表达,主要通过降解靶基因mRNA、抑制其翻译和染色体修饰进而调节基因的表达。研究发现microRNA在生物的转录调控网络中发挥着极其重要的作用，例如参与植物信号的转导、植物的形态建成、叶的发育和非生物胁迫反应等等。

在模式植物拟南芥根的发育方面，microRNA160通过负调控其靶基因ARF10、ARF16和ARF17的转录本水平控制根冠细胞的形成；microRNA390的表达受生长素调节，控制拟南芥侧生根发育；在拟南芥的器官发育中，microRNA164通过调节CUC进而影响拟南芥根和叶等组织器官的形态，而microRNA165/166通过调节PHB、PHV和REV表达来影响拟南芥叶片极性；microRNA172负调控AP2表达来影响拟南芥花器官的表达。2007年在《Nature Genetics》研究了microRNA172控制玉米的性决定和组织细胞的命运进而调控组织分支的发育，同一年《Nature Genetics》研究发现番茄的microRNA319可以控制复叶的发育；2010年研究发现水稻中的microRNA156负调控OsSPL14的表达进而参与调控水稻理想株型的发育，即减少分蘖数、增强抗倒伏和增加谷物产量的性状。2009年在《Cell》上建立了microRNA156和microRNA172调节拟南芥从营养生长到生殖生长时空的调控网络，2010年《Development》详细的研究了microRNA396b通过调节细胞的增殖最终影响了拟南芥叶片发育。在水稻中，越来越多的microRNAs被克隆和研究，2005年《the Plant Cell》报道了水稻中的一些microRNAs，发现了一个新的microRNA(microRNA444a)，它在单子叶植物中十分保守，比如在水稻、小麦、大麦和玉米中都发现了它的存在，拟南芥中却没有检测到它的表达。组织表达模式显示microRNA444a在水稻的叶片、茎、根、花序和幼苗中都有表达。详细深入研究microRNA444a在水稻中的生物学功能具有重要的意义。特别能调节水稻株型的发育，比如株高、分蘖数、分蘖角度、叶夹角和穗子的发育的调控。

在植物中，水稻矮化育种是第一次粮食作物绿色革命的主题。通过水稻矮化突变体和转基因的研究进一步地利用到农业生产上，达到提高水稻产量的目的。目前，已经鉴定出的水稻矮化突变体大约有60多个。比如最早发现的水稻矮化突变体d1(dwarf 1)和d61(dwarf 61)等表现出植株矮化的表型。在这些矮化突变体中，OsGA20ox2(SD1)基因是著名的绿色革命基因，它编码GA合成途径中的一个关键酶，功能缺失将导致水稻的半矮化，这项研究已经应用到水稻育种上，同年，Itoh等人发现了水稻另一个半矮化品种Tan-Ginbozu(d35Tan-Ginbozu)。发现更多的水稻矮化突变体及影响水稻植株高度的基因将为水稻的分子育种提供重要的素材。

发明内容

本发明的一个目的是提供microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体的应用。

本发明提供的microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体在调控植物株高中的应用；

所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2。

序列表中的序列2所示的RNA为序列3或序列4所示RNA的前体。

上述应用中，所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸。

所述表达microRNA444a的重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

所述表达microRNA444a的重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸编码序列2所示RNA。

上述应用中，所述调控植物株高为降低植物株高。

上述应用中，所述应用为将所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。

上述应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述microRNA444a的编码基因通过重组载体导入目的植物中。

上述方法中，所述重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

上述重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体；

上述重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。

本发明的实验证明，本发明发现的microRNA444a，将其编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA444a的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现降低株高的表型，说明该microRNANA与水稻株高调控密切相关。

附图说明

图1为扩增到OsmicroRNA444a包含前体序列在内的基因组DNA

图2为超表达载体pUN1301-OsmiR444a的物理图谱

图3为转基因水稻的Northern以及Real-time-PCR鉴定

图4为OsmicroRNA444a超表达转基因水稻表型观察

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、microRNA444a在调控水稻株高中的应用

一、microRNA444a的编码基因OsmicroRNA444a的获得

1、编码基因OsmicroRNA444a的克隆

根据数据库分析的结果设计引物，5′端引物：5′-GAAGATCTGCAATTGGGGGCAGCAAGC-3′(下划线序列为BglII位点)，3′端引物：5′-CGAGCTCTGGCAACAGGAGGCAGCAAG-3′(下划线序列为SacI位点)，提取粳稻中花十号三叶期幼苗总基因组，采用RT-PCR方法扩增到4392bp全长cDNA。

具体操作过程如下：

1）植物基因DNA的提取：选取0.5g三叶期中花十号水稻（Oryza sativa L.cvZhonghua 10）的幼苗（李梅芳，水稻花培品种—中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页，公众可从中国科学院植物研究所获得，以下简称为野生型水稻。）为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含729μL基因组提取buffer(0.1M Tris-HCl(PH 8.0)、50mM EDTA(pH 8.0)、0.5M NaCl)，再加入18.4μL β-mercaptoethanol剧烈振荡使其全部悬浮；接着加入52.8μL 65C预热的20%SDS；65C水浴温育30min，每5min颠倒混匀一次；然后加入250μL冰上预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰上放置20min；4℃，12,000g离心10min，取上清；加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），抽提一次，4℃，12,000g离心10min，用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）再抽提一次；收集上清并加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，-20℃放置30min；4℃，12,000g离心10min，弃去上清；沉淀用1ml的70%乙醇洗2次；干燥后，溶于20μL ddH₂O中。

2）PCR扩增：提取的基因组稀释100倍，用作模板按以下体系进行PCR反应：0.2μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase（5U/μl）、10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTPs,0.5μl5′端引物(10μM)，0.5μl 3′端引物(10μM)，加ddH₂O终体积20μl。引物序列5′端引物：5′-GAAGATCTGCAATTGGGGGCAGCAAGC-3′(下划线序列为BglII位点，序列3)，3′端引物：5′-CGAGCTCTGGCAACAGGAGGCAGCAAG-3′(下划线序列为SacI位点，序列4)，PCR程序为：94C预变性30s后进入PCR循环，循环参数为98C 10秒变性→52C 15秒复性→72C 4分钟20秒延伸,35个循环后在72C继续合成10分钟。

扩增的PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，从图中可以看出，得到分子量大约4.39kb的条带，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收该片段得到20μl回收产物。进行测序分析，测序结果该PCR片段的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸，将该PCR产物的基因为OsmicroRNA444a，其编码的OsmicroRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列2，OsmicroRNA444a剪切成熟体为microRNA444a，其核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4。

二、OsmicroRNA444a超表达载体pUN1301-OsmicroRNA444a的构建

1、含有OsmiR444a的载体pTE-OsmiR444a

取3.5μl上述PCR产物的回收产物，加入1μl（3U/μl）T4-DNA连接酶、5μl 2×连接酶缓冲液、0.5μl（50mg/ml）pGEM-T Easy载体（Promega）4℃连接过夜，得到连接产物，用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重组质粒的大肠杆菌菌株。采用碱裂解法从菌株中分离提取质粒，以pGEM-T Easy载体上的T7和SP6启动子序列为引物，进行测序分析，该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸插入pGEM-T Easy载体中，将测序正确的质粒命名为pTE-OsmiR444a。

2、pUN1301载体的获得

1）剪取约0.2g玉米（品种名：中作-中单8,北京中农作科技发展有限公司）幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1%SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟,弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

2）取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，在带有Hind III识别位点的5′引物（GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG）和带有BamHI识别位点的3′引物（CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG）为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，得到的片段经测序验证，具有序列表中序列5所示的核苷酸，为玉米泛素启动子（UbiPro）。（玉米泛素启动子（UbiPro）也可以人工合成获得。）

3）用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列（277bp）从质粒载体pBI 121（北京拜尔迪生物技术有限公司目录号：MP-091）上切下，连接到载体pUC19（北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801）的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与2）中经Hind III和BamH I双酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）相连，得到重组载体，命名为pUN19。

4）用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切（37C条件下，先加入EcoR I进行部分酶切，酶切时间为半小时，65C下20分钟使EcoR I酶失活,后加入HindIII完全酶切3小时即可)从3）购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

3、pUN1301-OsmicroRNA444a的构建

用限制性内切酶BglII和SacI对2步骤获得的质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、BglII1μl（10U/μl）、SacI 0.8μl（10U/μl），加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pUN1301大片段，溶于20μl ddH₂O中。

用限制性内切酶BglII和SacI对1步骤获得的质粒pTE-OsmiR444a进行双酶切。酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、BglII 1μl（10U/μl）、加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时。再加入SacI 0.2μl（10U/μl），37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收4392bp的OsmiR444a片段。

将10μl回收的4392bp的OsmiR444a溶液、6μl回收的载体pUN1301大片段溶液、2μl(3U/μl)T4DNA连接酶和2μl 10x连接酶缓冲液混和，16℃连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，结果该重组质粒为将序列表中的序列1自5’末端第49-4406位核苷酸插入pUN1301的BglII和SacI酶切位点间得到的载体，命名为pUN-OsmiR444a，且pUN-OsmiR444a中启动子、基因和终止子的结构正确（见图2）。在该表达载体中采用玉米泛素启动子（UbiPro）启动目的片段OsmiR444a在植物中超表达。

三、转基因水稻的获得

将上述pUN1301-OsmicroRNA444a质粒用电击法转化农杆菌EHA105（Hiei Y，Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6:271–282，公众可从中国科学院植物研究所获得。），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，提取阳性克隆的超表达工程菌的质粒，为pUN1301-OsmicroRNA444a，将该阳性克隆的超表达工程菌命名为EHA105/pUN1301-OsmicroRNA444a。

将EHA105/pUN1301-OsmicroRNA444a侵染中花十号水稻（Oryza sativa L.cvZhonghua 10，以下简称为野生型水稻）的愈伤组织，再将导入EHA105/pUN-OsmiR444a的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代；两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代（2周/代）；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基（1），上，在分化培养箱（12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基（2），上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得10个株系共60棵T0代转OsmicroRNA444a水稻。

所用培养基如下表1：

表1所用培养基配方

四、转基因水稻的鉴定

1、GUS组织化学染色：

将上述三获得的60棵T0代转OsmicroRNA444a水稻的2-3mm长的根段分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70%乙醇脱色。根呈蓝色的植株即为阳性转基因材料。GUS染色液（pH 7.0）组分为：100mM Na₃PO₄(pH7.0)，0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/mlX-Gluc。

结果共鉴定出8个株系合计40棵阳性T0代转OsmicroRNA444a水稻。

将阳性T0代转OsmicroRNA444a水稻移至温室栽培，按照不同株系收种，得到T1代转基因种子，在此基础上经过繁种得到纯合T2代种子，在以后的实验中选取编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻作为材料。

2、定量PCR鉴定

从编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻的幼苗中提取总RNA，经过RNase free DNase I处理2μg总RNA用M-MLV反转录酶进行反转录成cDNA第一条链。将植物总RNA反转录成cDNA，利用Primer Express2.0程序(Applied Biosystems)设计基因特异引物，并以ACTIN1引物为内标参照，引物长为20bp，Tm值为55-60C，GC含量在40-60%之间，扩出的目的片段长度为100-150bp。将反转录产物稀释50-100倍，取5μl做模板，利用SYBR GREEN PCR试剂盒(

Green Realtime PCR Master Mix,Toyobo,Japan)进行反应溶液的配置，在实时定量PCR仪MX3000P(Stratagene,USA)上运行PCR程序，95C 1min；95C15s，55C 10s，72C 15s；共45循环；95C 20s，55C 20s，95C 30s。根据CT值计算基因的相对表达量。

而miRNA实时荧光定量PCR检测，首先提取水稻的总RNA，接着利用PEG沉淀smallRNA，即在308μl的总RNA溶液中（总RNA的量不要超过21mg）加入70μl 30%(W/V)PEG8000溶液；在上述混合液中再加入42μl 5M NaCl溶液，混匀；

混合体系：

308μl total RNA

70μl  30%(W/V)PEG8000溶液

42μl 5M NaCl溶液

共420μl，按照步骤依次加入70μl 30%(W/V)PEG8000溶液和42μl 5M NaCl溶液。

在冰上放置30min沉淀后，4C 13000rpm离心10min，小心吸取上清转入另一个新RNase free管中；在上清中加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀；在-20C沉淀过夜或30min后，4C最大转速离心15-20min，小心去除上清；得到的沉淀物用70%的乙醇洗涤两次，在室温下干燥（注意不要太干）；溶于30μl ddH2O（可以在50C孵育5分钟）。准备好的small RNA可以利用Poly A加A方法做实时定量PCR，用5.8S rRNA做内参详细方法见。并分别转录获得cDNA（参照实施例1中的方法），以野生型水稻（水稻中花十号）为对照。利用荧光实时定量PCR法，以cDNA为模板，以1μl 5′端引物1(10μM)(5′-TTGCTGCCTCAAGCTTGCTG-3′)，1μl reverse primer引物1(10μM)(5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3')为引物，对T2代转OsmicroRNA444a中OsmiR444a的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBR Green Realtime PCRMasterMix（TOYOBO）。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10 lSYBR Green Realtime PCR Master Mix,4μl模板,1μl 5′端引物1(10μM)，1μl 3′端引物1(10μM)，加ddH2O终体积20μl。

用5.8S RNA作为内参，5.8S RNA的5′端引物：5'-GAACGACTCTCGGCGGCTA-3'，3′端引物为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3'。PCR程序为：预变性2分钟,进入PCR循环，循环参数为94℃15秒→58℃10秒→72℃10秒，共40个循环。

结果如图3所示，在5.8SRNA作为内参的情况下，与野生型水稻（ZH10）相比，miROE5、miROE8和miROE12的T2幼苗中OsmiR444a的表达丰度有了不同程度的上调，说明目的基因（OsmiR444a）再转录水平已经成功表达。

采用同样的方法将空载体pUN1301转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，按照上述方法鉴定，OsmicroRNA444a基因没有过量表达，说明为阳性，将T0代转空载体水稻播种传代得到T2代转空载体水稻。

五、转基因水稻的表型观察

将编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻、野生型水稻（ZH10）和T2代转空载体水稻的种子，在光照培养箱中（光强为10000μmol/m²/s,光照时间为16h/d,温度为30℃），接着把生长的幼苗种植于水稻田中。

每个株系15株，实验重复三次，结果取平均值。

对植株株高进行观察，结果如下：

拍照如图4A，其中从左到右依次为ZH10、miROE5、miROE8和miROE12，为可以看出miROE5、miROE8、miROE12水稻株高明显低于野生型水稻。

在播种后约第120天统计野生型水稻（ZH10）、编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻株高，结果如图4B所示，野生型水稻（ZH10）、编号为5（miROE5）、8（miROE8）、12（miROE12）的T2代转OsmicroRNA444a水稻株高株高分别为117.90厘米、107.20厘米、102.80厘米和74.50厘米。

T2代转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。

Claims (6)

1.microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体在调控植物株高中的应用；

所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:2自5’末端第49-4406位核苷酸；

所述调控植物株高为降低植物株高；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:1自5’末端第49-4406位核苷酸；

所述表达microRNA444a的重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用为将所述microRNA444a的编码基因导入植物中，得到株高小于所述植物的转基因植物。

4.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求2中的microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物；

所述目的植物为水稻。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述microRNA444a的编码基因通过重组载体导入目的植物中。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。

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