CN103387984B - microRNA396d或其编码基因在调控水稻株高中的应用 - Google Patents
microRNA396d或其编码基因在调控水稻株高中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种microRNA396d或其编码基因在调控水稻株高中的应用。本发明提供的microRNA396d或其编码基因在调控植物株高中的应用；所述microRNA396d的核苷酸序列为序列表中的序列2或序列表中的序列3。本发明的实验证明，本发明发现的microRNA396d，将其编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA396d的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显的株高增加的表型，说明该microRNANA与水稻株高调控密切相关。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种microRNA396d或其编码基因在调控水稻株高中的应用。
背景技术
在过去的几十年里，全球人口迅速增长，全球粮食危机日益严重。由于半矮秆基因(sd-1)引入水稻而促进世界范围内水稻产量的大幅度提高，对于解决日益增加的粮食危机具有重要的作用。这项矮化育种的成就举世瞩目，被誉为绿色革命。茎是支撑植物直立生长，及稳定性的重要单位。合适的株高是对于决定植株的生长，特别是对于禾本科作物的结实具有重要的作用。因此，研究植株生长机理，对合理有效地利用这些资源，改良品种无疑具有重要的意义。近年来，对水稻矮化相关基因的遗传学、矮化突变体的激素调控以及矮化相关基因的克隆和利用等方面开展了广泛而深入的研究，尤其在利用基因工程手段控制水稻株高方面取得了很大进步。
水稻植株矮化一般认为是矮秆基因的作用导致水稻植株形态学或细胞学的变化，如节间变短和细胞个数减少等；同时，基因的表达还受到外部环境和内源条件的影响。而植物激素几乎参与水稻生长发育的整个过程，它们既可以独立地发挥生理作用，也可以通过与其他激素或基因的相互作用来精确地调节植物的发育。目前通过对拟南芥和其他植物矮秆突变体的研究表明，赤霉素(Gibberellin,GA)和油菜素类固醇(Brassinosteroid,BR)是决定植株高度的两个重要的激素，少数植物矮化突变与生长素(Auxin,IAA)有关。水稻矮化突变体dwarf1(d1)是GA钝感型突变体，表现为矮化、叶宽且呈墨绿色、花序紧密。研究表明，水稻dwarf1基因编码的是GTP结合蛋白，该蛋白在植物的生长发育中发挥着重要作用。水稻slr1突变体是由于SLR1基因失去功能的突变而导致的突变体，SLR1基因编码的产物是GA信号传导的抑制剂，与拟南芥的GA1和RGA、小麦的Rht、玉米的d8及大麦的SLN1基因编码的产物类似，都是调控株高的一类蛋白。SLR1蛋白定位于细胞核，在细胞核中发挥作用，来调控GA信号传导，GA上游信号能促进SLR1蛋白的快速降解，从而使GA信号能传导到下游。brd1的矮化突变体表现为典型的BR缺乏症状：茎秆严重矮化，株高只有10-30cm；叶片弯曲僵硬，呈畸形；根冠、穗形和谷粒等偏小。在外施BR复合物后能恢复部分生长性状，是BR缺失型突变体。Mori等发现，在黑暗中，brd1表现出结构型光形态建成的特性，及暗中去黄化。内源BR含量分析发现，BR合成途径中的BR-6-氧化酶减少，进一步分析发现，水稻中BR-6-氧化酶基因os-BR6ox缺失了0.2kb片段。
通过基因工程手段调控农作物生长，可以使生产成本更低廉、效益更高。近年来，已经克隆了很多与株高密切相关的基因。如拟南芥中的GA1、RGA，玉米中的d8，小麦的Rht，大麦中的SLN1，水稻中的Dwarf1等，利用这些基因控制GA或者BR的生物合成或者信号传导从而获得适合的株高，将是未来生产的重要(Akira Ikeda,2001)。
MicroRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。从2002年开始，microRNA一直是每年医学生物学的明星分子，它们是基因表达、修饰、转录和翻译的调节者。无论是在动物模型还是植物模型上，科学家们都发现microRNA对多种生命过程具有重要的调控作用。miRNA与siRNA相似，它们是调控基因转录后调节的重要因子。siRNA的沉默基因的机制十分清晰，然而，microRNA的转录后调控机制却不十分清晰。
发明内容
本发明的一个目的是提供microRNA396d或其编码基因或表达microRNA396d的重组载体的应用。
本发明提供的microRNA396d或其编码基因或表达microRNA396d的重组载体在调控植物株高中的应用；所述microRNA396d的核苷酸序列为序列表中的序列2或序列表中的序列3。
序列表中的序列2所示的RNA为序列3所示RNA的前体；
上述应用中，所述microRNA396d的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述表达microRNA396d的重组载体为将所述microRNA396d的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA396d的载体。
上述表达microRNA396d的重组载体具体为所述microRNA396d的编码基因（序列1）插入pUN1301载体的Kpn I和BamH I之间得到的载体。
上述序列1编码序列2所示RNA。
上述应用中，所述调控植物株高为降低植物株高。
上述应用中，所述应用为将所述microRNA396d的编码基因导入目的植物中，，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。
上述应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为将所述microRNA396d的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。
上述方法中，所述microRNA396d的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
上述方法中，所述重组载体为将所述microRNA396d的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA396d的载体。
上述重组载体具体为将所述microRNA396d的编码基因插入pUN1301载体的Kpn I和BamH I之间得到的载体。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体，为将所述microRNA396d的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA396d的载体；
上述重组载体具体为microRNA396d的编码基因插入pUN1301载体的Kpn I和BamHI之间得到的载体。
本发明的实验证明，本发明发现的microRNA396d，将其编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA396d的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现降低株高的表型，说明该microRNANA与水稻株高调控密切相关。
附图说明
图1为扩增到OsmicroRNA396d包含前体序列在内的基因组DNA
图2为转基因水稻的Northern以及Real-time-PCR鉴定
图3为OsmicroRNA396d超表达转基因水稻表型观察
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、microRNA396d在调控水稻株高中的应用
一、microRNA396d的编码基因OsmicroRNA396d的获得
基于本实验室前期水稻相关基因的筛选结果，选定其中一个感兴趣的EST片段。该EST片段即为水稻中的一个GRF基因。由于该基因是水稻中OsmicroRNA396d的靶基因，那么就将重点放在研究该microRNANA上。利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和TIGR（http://www.tigr.org）两个网站的检索，得到该microRNA对应的前体及成熟体的序列。
根据数据库分析的结果设计引物，5′端引物：5′-CGGGATCCTGGAATTCCGGGAGTCCC-3′(下划线序列为BamH I位点)，3′端引物：5′-GG GGTACCAAGCCACAGAAGTCAACAAACA-3′(下划线序列为Kpn I位点)，以以三叶期中花十号水稻（Oryza sativa L.cv Zhonghua 10）（李梅芳，水稻花培品种-中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页，公众可从中国科学院植物研究所获得，以下简称为野生型水稻。）幼苗总DNA为模板，幼苗总DNA为模板，采用PCR方法扩增到包含前体序列在内的838bp DNA。具体操作过程如下：
提取buffer：
1)取50-100mg材料，液氮中研磨；
2)加入800μl新配制的提取buffer，剧烈振荡使其全部悬浮；
3)65℃水浴温育20min，每5min颠倒混匀一次；
4)加入250μl预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰上5min；
5)取上清，用等量酚/氯仿抽提一次，12000rpm离心5min；
6)上清加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA；
7)4℃，12000rpm离心15min，去上清；
8)沉淀用70%乙醇洗涤；
9)干燥后，溶于20μl含100μg/ml RNase的ddH2O中。
取1μl上述基因组DNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应：0.2μl LA Taq（5U/μl）、10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTPs,0.5μl 5′端引物(10μM)，0.5μl3′端引物(10μM)，加ddH2O终体积20μl。引物序列如前，PCR程序为：94°C预变性2分钟后进入PCR循环，循环参数为94℃ 30秒变性→58℃ 30秒复性→72℃ 50秒延伸，35个循环后在72℃继续合成10分钟。
扩增的PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，得到分子量大约0.8kb的条带。
用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收上述0.8kb的PCR产物，取3.5μl回收产物，加入T4-DNA连接酶1μl（3U/μl）、2×连接酶缓冲液5μl、p-Teasy载体（Promega）0.5μl（50mg/ml）4℃连接过夜，得到重组质粒。
将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重组质粒的大肠杆菌菌株。选用pGEM-T Easy载体上的T7和SP6启动子序列为引物，对该大肠杆菌中重组质粒内的PCR产物测序，该PCR产物具有序列表中的序列1所示的核苷酸，该PCR产物的基因命名为OsmicroRNA396d，其编码的OsmicroRNA396d，该OsmicroRNA396d的核苷酸序列为序列表中的序列2，其对应的成熟体microRNA396d的核苷酸序列为序列表中的序列3。将含有该PCR产物的重组质粒命名为质粒pTeasy-OsmicroRNA396d。
二、OsmicroRNA396d超表达载体pUN1301-OsmicroRNA396d的构建
1.pUN1301载体的获得
1）剪取约0.2g玉米（品种名：中作-中单8,北京中农作科技发展有限公司）幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1%SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟,弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH2O中，得到玉米基因组DNA。
2）取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，在带有Hind III识别位点的5′引物（GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG）和带有BamHI识别位点的3′引物（CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG）为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，得到的片段经测序验证，具有序列表中序列4所示的核苷酸，为玉米泛素启动子（UbiPro）。
3）用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列（277bp）从质粒载体pBI 121（北京拜尔迪生物技术有限公司目录号：MP-091）上切下，连接到载体pUC19（北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801）的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与2）中经Hind III和BanH I双酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）相连，得到重组载体，命名为pUN19。
4）用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切（37℃条件下，先加入EcoR I进行部分酶切，酶切时间为半小时，65℃下20分钟使EcoR I酶失活,后加入HindIII完全酶切3小时即可)从3）构建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。
按照上述转化克隆载体的方法把pUN1301转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含潮霉素抗性平板筛选得到含有重组质粒pUN1301的大肠杆菌菌株。参照上述克隆载体碱裂解法从上述大肠杆菌中分离提取pUN1301质粒，备用。
2.pUN1301-OsmicroRNA396d的构建
用限制性内切酶Kpn I和BamH I对质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、Kpn I 1μl（10U/μl）、BamH I 0.8μl（10U/μl），加ddH2O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pUN1301大片段，溶于20μl ddH2O中。
用限制性内切酶Kpn I和BamH I对质粒pTeasy-OsmicroRNA396d进行双酶切。酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、Kpn I 1μl（10U/μl）、加ddH2O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时。再加入BamH I 0.2μl（10U/μl），37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司所的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收838bp的OsmicroRNA396d DNA片段，备用。
取回收的838bp的OsmicroRNA396d DNA溶液10μl、回收的载体pUN1301溶液6μl，与T4DNA连接酶2μl(3U/μl)、10x连接酶缓冲液2μl混合，16℃连接16小时。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列1插入pUN1301载体的Kpn I和BamH I之间得到的载体，将该质粒命名为pUN1301-OsmicroRNA396d，即为植物表达载体质粒。
三、转基因水稻的获得
将上述pUN1301-OsmicroRNA396d质粒用电击法转化农杆菌EHA105（Hiei Y，Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Effcient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6:271–282，公众可从中国科学院植物研究所获得。），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，提取阳性克隆的超表达工程菌的质粒，为pUN1301-OsmicroRNA396d，将该阳性克隆的超表达工程菌命名为EHA105/pUN1301-OsmicroRNA396d。
将EHA105/pUN1301-OsmicroRNA396d侵染中花十号水稻（Oryza sativa L.cvZhonghua 10，以下简称为野生型水稻）愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代。两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代（2周/代）。取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，在分化培养箱（12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗。待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，得到15株T0代转OsmicroRNA396d水稻。
所用培养基如下表1：
表1所用培养基配方
四、转基因水稻的鉴定
1、GUS组织化学染色：
将上述T0代转OsmicroRNA396d水稻叶片分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70%乙醇脱色。呈蓝色的即为阳性植株。GUS染色液（pH 7.0）组分为：100mM Na3PO4(pH 7.0)，0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/ml X-Gluc。
结果为得到12株GUS阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻。
2、RT-PCR
利用荧光实时定量PCR法，以基因特异序列为引物对GUS阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻中OsmicroRNA396d成熟体的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。
提取编号为5#、8#、10#的GUS阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻的RNA，反转录得到cDNA，吸取1μl反转录后的cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix（SYBR Green Realtime PCR MasterMix（TOYOBO））,4μl模板,1μl 5′端引物(10μM)(5′-GGCGGTCCACAgGCTTTCTT-3′)，1μl 3′端引物(10μM)(5′-TGGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′)，加ddH2O终体积20μl。用U6作为内参，其5′端引物：5′-GGGACATCCGATAAAATTGGAA-3′，3′端引物为：5′-CGATTTGTGCGTGTCATCCTT-3′。PCR程序为：95℃预变性5分钟,进入PCR循环，循环参数为95℃ 5秒→60℃ 10秒→72℃ 1秒，共45个循环。以野生型水稻（WT）为对照。
结果如图2所示，可以看出，与野生型水稻相比，编号为5#（OE5）、8#（OE8）、10#（OE10）的GUS阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻中OsmicroRNA396d的表达丰度均有了不同程度的上调，说明目的基因连接的载体已经成功转入水稻。
因此，可以看出，经过GUS和RT-PCR鉴定均为阳性的为阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻，共得到12株阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻。
采用同样的方法将空载体pUN1301转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，按照上述方法鉴定，OsmicroRNA396d基因没有过量表达，说明为阳性。
将上述阳性T0代转OsmicroRNA396d水稻和T0代转空载体水稻分别收种、播种，传代直到得到T2代转OsmicroRNA396d水稻和T2代转空载体水稻。
五、转基因水稻的表型观察
将野生型水稻、编号为5#、8#、10#T2代转OsmicroRNA396d水稻和T2代转空载体水稻的种子播在花卉营养土和蛭石的混合物里（两者的混合比例为9:1），30℃萌发后放在温室里（25℃）培养至三叶期，经过室外壮苗后，5月中旬移栽到室外水稻网室中进行培养至抽穗期。
每个株系6株，实验重复三次，结果取平均值。
对植株株高进行观察，结果如下：
拍照如图3A和图3B所示，A为野生型水稻、编号为5#、8#、10#T2代转OsmicroRNA396d水稻的株高，B为野生型水稻和T2代转OsmicroRNA396d水稻的主茎去掉叶片后的节间图(p、p1-p5)，可以看出编号为5#、8#、10#T2代转OsmicroRNA396d水稻株高明显低于野生型水稻。
在播种后约第120天统计野生型水稻、编号为8#T2代转OsmicroRNA396d水稻株高，结果如图3C所示（每个柱形图从上到下依次为p、p1-p5），野生型水稻和编号为8#T2代转OsmicroRNA396d水稻株高分别为98.5厘米和65.2厘米。
T2代转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。
Claims (7)
1.microRNA396d或其编码核酸分子或表达microRNA396d的重组载体在调控植物株高中的应用；所述植物为水稻；
所述microRNA396d的核苷酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述microRNA396d的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述表达microRNA396d的重组载体为将所述microRNA396d的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA396d的载体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物株高为降低植物株高。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用为将microRNA396d的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。
5.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1-4中任一所述的应用中的所述microRNA396d的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物；所述植物为水稻。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述microRNA396d的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述重组载体为将所述microRNA396d的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA396d的载体。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20141231 Termination date: 20190508 |