CN106381302A - 基于trv‑vigs技术快速鉴定菊花脑基因功能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了基于TRV‑VIGS技术快速鉴定菊花脑基因功能的方法，通过构建含有内源目的基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒，借助叶片注射法瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的基因发生沉默，从而鉴定该内源目的基因的功能。本发明方法建立了TRV‑VIGS沉默菊花脑内源基因从而鉴定基因功能的体系，其具有快速，高通量，易于操作等优势，为开展菊花脑基因功能研究提供了新途径。

Description

基于TRV-VIGS技术快速鉴定菊花脑基因功能的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于TRV-VIGS技术快速鉴定菊花脑基因功能的方法。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium)原产中国，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏与经济价值高。然而，菊花为异源六倍体，基因组大且高度杂合，基因组信息缺乏，加之农杆菌介导的恒定遗传转化基因型依赖性强且遗传转化效率低，严重制约了菊花的基因功能鉴定进程。菊花脑(Chrysanthemum nankingense)为菊属近缘二倍体野生种，先前研究表明其参与了栽培菊花起源(张俊等，2009)，我们研究发现两个物种同源基因序列同源性高。
病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)指携带一段寄主植物目的基因cDNA片段的病毒载体侵染植株引发寄主中序列同源基因的沉默，从而实现对该基因的功能鉴定(Senthil-Kumar&Mysore,2011)。八氧番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)是类胡萝卜素合成路径的关键酶之一，该基因沉默导致叶片光氧化白化，在沉默早期即可观察到白化表型，因此该基因是目前病毒诱导基因沉默体系中应用最广泛的标记基因(Senthil-Kumar&Mysore,2014)。近年来VIGS技术已成为一种重要的反向遗传学工具用于基因功能的研究，与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比，VIGS技术研究周期短，不需要遗传转化及突变体获取，操作简单，具有速度快、成本低、高通量等优势，因而成为功能基因组学研究领域最具吸引力的技术手段之一(Becker&Lange，2010)。目前，VIGS技术已在多种植物组织中取得了成功，如拟南芥叶片(Turnage等，2002)、烟草花瓣(Liu等，2004)、大麦叶片(Holzberg等，2002)等。
目前已有多种病毒用于沉默载体的构建，其中TRV病毒(烟草脆裂病毒)载体因其寄主范围较广及低毒性的特点是目前应用最为广泛的病毒沉默载体。目前已证实，TRV病毒载体可用于茄科植物，如烟草、番茄、矮牵牛以及非茄科植物拟南芥等(Gao et al,2008)，而基于TRV-VIGS技术快速鉴定菊科植物菊花脑基因功能的研究未见报道。
参考文献：
张莉俊，戴思兰.菊花种质资源研究进展[J].植物学报,2009,44(5):526-535.
Becker A,Lange M.VIGS-Genomics goes functional.Trends in PlantScience,2010,15(1):1-4.Senthil-Kumar,M.,Mysore,K.S.,2014.Tobacco rattlevirus-based virus-induced gene silencing in Nicotiana benthamiana.Natureprotocols 9,1549-1562.
Gao X,Britt RC Jr,Shan L,He P,2011.Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton.Journal of visualized experiments:JoVE.
Holzberg S,Brosio P,Gross C and Pogue G P.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.Plant Journal,2002,30:315-327.
Liu Y,Nakayama N,Schiff M,Litt A,Irish VF,Dinesh-Kumar SP.Virusinduced gene silencing of a DEFICIES ortholog in Nicotiana benthamiana.PlantMolecular Biology,2004,54:701-711.
Senthil-Kumar M,Mysore KS.2011b.New dimensions for VIGS in plantfunctional genomics.Trends in Plant Science,16(12)：656–665.
Turnage MA,Muangsan N,Peele CG,Robertson D.Geminivirus-based vectorsfor gene silencing in Arabidopsis.Plant Journal,2002,30:107-114.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供TRV-VIGS技术法沉默菊花脑内源基因的方法，为开展菊花脑基因功能快速鉴定提供了新路径。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
CnPDS基因片段，具有如下(Ⅰ)～(Ⅲ)中任一所述的核苷酸序列：
(Ⅰ)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
(Ⅱ)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的互补序列；
(Ⅲ)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
上述的CnPDS基因片段在构建基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体中的应用。
含有上述CnPDS基因片段的重组表达载体、转基因细胞系或转基因工程菌。
上述的重组表达载体是基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体，为将上述的CnPDS基因片段插入到TRV2载体的EcoRI和KpnI位点之间得到的植物表达载体TRV2-CnPDS。
上述的转基因工程菌通过将上述的植物表达载体TRV2-CnPDS转化感受态农杆菌获得。
上述的CnPDS基因片段、上述的重组表达载体和转基因工程菌在快速鉴定菊花脑基因功能中的应用。
一种快速鉴定菊花脑基因功能的方法，将含有内源目的基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的基因发生沉默，从而鉴定该内源目的基因的功能。
上述的快速鉴定菊花脑基因功能的方法，其所述的含有内源目的基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒为上述的植物表达载体TRV2-CnPDS；通过叶片注射法将上述的植物表达载体TRV2-CnPDS瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的基因发生沉默，从而鉴定该内源目的基因的功能。
上述的快速鉴定菊花脑基因功能的方法，具体包括如下步骤：
(1)构建植物表达载体TRV2-CnPDS：以菊花脑的cDNA为模板，以CnPDS-EcoRI-F:SEQ ID NO.2和CnPDS-KpnI-R:SEQ ID NO.3为引物进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物采用EcoRI和KpnI进行双酶切，得到酶切片段，与EcoRI和KpnI双酶切线性化的表达载体TRV2连接，转化DH5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体TRV2-CnPDS构建成功，将TRV2-CnPDS通过电转化转入农杆菌GV3101；
(2)制备侵染液：从添加了Rif 50μg/mL、Gen 25μg/mL和Kan 50μg/mL的LB平板上挑取含有植物表达载体TRV2-CnPDS、TRV2-Empty对照载体、TRV1载体的阳性农杆菌GV3101单克隆分别在添加了Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL和Kan 50μg/mL的LB液体培养基中进行培养，然后分别将菌液转入添加了Rif 50μg/mL和Kan 50μg/mL的LB液体培养基中培养至OD600为1.3～1.5，然后离心去上清收集各菌体，采用侵染缓冲液重悬各菌体并调节OD600至1.3～1.5，黑暗静置后将TRV1与TRV2-Empty或TRV2-CnPDS悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑叶片侵染液；所述侵染缓冲液的配方为10mM MES，200μM AS(乙酰丁香酮)，50mM MgCl2水溶液，pH＝5.6；
(3)将步骤(2)制备的侵染液注射转化菊花脑幼苗的叶片得到转化后的幼苗；
(4)转化后培养：将转化后的幼苗用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d后，再转入光下培养；
(5)转化株表型观察：侵染14d后观察植株的叶片白化表型，并拍照记录；
(6)内源目的基因CnPDS的RT-PCR检测：选取TRV1/TRV2-CnPDS侵染植株未注射的白化叶片提取RNA，并反转录为cDNA，以转化TRV1/TRV2-Empty的未注射叶片为对照，设计CnPDS基因引物和CnEF1α引物，RT-PCR检测内源目的基因CnPDS的表达水平。内源基因表达水平低(被沉默后)，叶片出现白化表型。根据表达水平降低与白化叶片表型的关联性来判定CnPDS的功能(防止叶片光氧化的功能)。
进一步优选的，所述的CnPDS基因引物包括上游引物CnPDS-RT-F:SEQ ID NO.4和下游引物PDS-RT-R:SEQ ID NO.5，所述的CnEF1α引物包括上游引物CnEF1α-F：SEQ ID NO.6和下游引物CnEF1α-R:SEQ ID NO.7。
本发明的技术方案为基于TRV-VIGS技术快速鉴定菊花脑基因功能的方法，使用去除针尖的注射器对菊花脑进行叶背注射，通过叶片注射法将含有内源目的基因的TRV2病毒沉默表达载体质粒如TRV-CnPDS载体瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源基因发生沉默，从而鉴定基因功能。
本发明中所述的TRV-VIGS体系为含有内源目的基因的TRV2病毒沉默表达载体质粒，以便于目的基因在植物中沉默。
利用农杆菌介导的叶背注射法将内源目的基因瞬时转化菊花脑叶片，使内源目的基因在菊花脑中沉默。
上述方法详细具体过程为：
植株的获得：采用播种后14d，有2片完全展开叶的菊花脑幼苗；以2片展开叶用作注射。
植物表达载体TRV2-CnPDS的构建：以菊花脑叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物用高保真酶进行PCR扩增，在CnPDS基因的上下游分别引入EcoRI和KpnI酶切位点，上游引物为：CnPDS-EcoRI-F:SEQ ID NO.2，下游引物为CnPDS-KpnI-R:SEQ ID NO.3，将扩增的CnPDS片段PCR产物采用EcoRI和KpnI进行双酶切，得到酶切片段，与EcoRI和KpnI双酶切线性化的表达载体TRV2连接，转化DH5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体TRV2-CnPDS构建成功。将TRV2-CnPDS转入农杆菌GV3101。
侵染缓冲液配制：其配方为10mM MES，200μM AS，50mM MgCl2水溶液，pH＝5.6。
侵染液制备：从LB(Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL，Kan 50μg/mL)平板挑取含有正确构建质粒TRV2-CnPDS、TRV2-Empty对照载体、TRV1载体的阳性农杆菌单克隆分别在5mL LB(Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL，Kan 50μg/mL)液体培养基中28℃过夜培养16h。然后分别将菌液转入50mL LB(Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL，Kan 50μg/mL)液体培养基中，28℃过夜培养至OD600为1.3～1.5，然后4000rpm，25℃，离心10min，去上清，收集各菌体，采用侵染缓冲液重悬各菌体并调节OD600至1.3～1.5。室温黑暗静置3h。而后将TRV1与TRV2-Empty或TRV2-CnPDS悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑叶片侵染液。侵染液为两组混合液：对照组为TRV2-Empty+TRV1的混合液；处理组为TRV2-CnPDS+TRV1的混合液。预期结果：对照组叶片不白化，处理组叶片出现白化。
菊花脑叶片注射转化：注射前20min对菊花脑进行叶面喷水。以去除针头的注射器(1mL)吸取上述步骤制备的侵染液，出水口对准叶片背部基部近中脉处，缓推注射器活塞，同时指腹抵压注射部位叶片的近轴面，以使侵染液渗入叶片，每株注射0.3ml侵染液。
转化后培养：将转化后的幼苗用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d，然后再转入光下培养。
叶片白化表型观察：TRV2-CnPDS侵染14d后，观察植株的叶片白化表型，并拍照记录。
RT-PCR检测：选取TRV1/TRV2-CnPDS侵染植株未注射的白化叶片提取RNA，并反转录为cDNA，以转化TRV1/TRV2-Empty的未注射叶片为对照。设计CnPDS基因引物(上游引物CnPDS-RT-F:SEQ ID NO.4，下游引物PDS-RT-R:SEQ ID NO.5)，CnEF1α引物(上游引物CnEF1α-F：SEQ ID NO.6，下游引物CnEF1α-R:SEQ ID NO.7)，RT-PCR检测内源CnPDS基因的表达水平。
本发明的有益效果：
本发明方法含有内源目的基因的TRV2病毒沉默表达载体质粒，借助叶片注射法瞬时转化菊花脑，使菊花脑内源目的基因发生沉默。本发明构建得到菊花脑TRV-VIGS沉默内源基因的系统，成本低，快速鉴定基因功能，其具有快速，高通量，易于操作与实现等优势，为规模化开展菊花脑基因功能研究提供依据。
附图说明
图1：植物重组表达质粒TRV2-CnPDS片段图谱
图2：植物表达载体TRV2-CnPDS转化大肠杆菌后的菌液PCR扩增检测电泳
M：DNA ladder；1-2：大肠杆菌克隆；
图3：植物表达载体TRV2-CnPDS转化农杆菌后的菌液PCR扩增检测电泳
M：DNA ladder；1-2：农杆菌克隆；
图4：病毒重组载体TRV2-CnPDS转化菊花脑叶片后的白化表型
图5：RT-PCR检测TRV2-CnPDS转化株中CnPDS基因的表达
M：DNA ladder；1：TRV2-Empty转化株阴性对照；2-3：TRV2-CnPDS转化株。
具体实施方式
下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
在以下实施例中，除非特殊说明，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。
实施例1
1、CnPDS基因片段的克隆
以菊花脑为材料，取叶片0.3g，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法提取叶片的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录获得cDNA，根据菊花脑文库中该基因的序列信息，运用primer 5软件设计特异引物扩增CnPDS；
上游引物CnPDS-EcoRI-F：5’-TACGTGAATTCTTGCACCAGCAGAAGAAT-3’(SEQ IDNO.2)，
下游引物CnPDS-KpnI-R：5’-TCAGGTACCAGACTCGCCTCAGCAATCAC-3’(SEQ IDNO.3)；
以叶片的cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，CnPDS-EcoRI-F、CnPDS-KpnI-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP 4.0μL(2.5mmol·L-1)，Pfu DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.8μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min。
2、植物表达载体TRV2-CnPDS的构建
CnPDS-EcoRI-F、CnPDS-KpnI-R引物扩增的PCR产物采用EcoRI、KpnI进行双酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到EcoRI、KpnI双酶切的TRV2载体，热激法转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆PCR电泳检测并测序验证(图1和图2)，序列测定为SEQ ID NO.1。
将上述构建的植物表达载体TRV2-CnPDS电转化感受态的农杆菌，所用农杆菌菌株为GV3101，挑取单克隆PCR电泳检测(图3)，选取阳性克隆摇菌及保存，用于转化菊花脑叶片。同时TRV2-Empty(空载)转化农杆菌GV3101，作为转化菊花脑叶片的阴性对照。
3、农杆菌GV3101介导的TRV2-CnPDS瞬时转化菊花脑叶片
采用播种后14d，有2片完全展开叶的菊花脑扦插苗，2片完全展开叶备注射。
从LB(Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL，Kan 50μg/mL)平板挑取含有正确构建质粒TRV2-CnPDS、TRV2-Empty对照载体、TRV1载体的阳性农杆菌单克隆分别在5mL LB(Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL，Kan 50μg/mL)液体培养基中28℃过夜培养16h。然后分别将菌液转入50mLLB(Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL，Kan 50μg/mL)液体培养基中，28℃过夜培养至OD600为1.5，然后4000rpm，25℃，离心10min，去上清，收集各菌体，采用侵染缓冲液重悬各菌体并调节OD600至1.5。室温黑暗静置3h。而后将TRV1与TRV2-Empty或TRV2-CnPDS悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑叶片侵染液。
注射前20min对菊花脑进行叶面喷水。以去除针头的注射器(1mL)吸取制备的侵染液，出水口对准叶片背面基部近中脉处，缓推注射器活塞，同时指腹抵压注射部位叶片的近轴面，以使侵染液渗入叶片，每株注射0.3ml侵染液。
4、植物表达载体TRV2-CnPDS转化菊花脑叶片后的表型观察
注射TRV2-CnPDS载体的菊花脑植株，14d后，注射叶片以外的新生叶片出现了典型的PDS基因被抑制的光漂白现象(图4)。而含有TRV2–Empty载体注射的菊花脑植株，不能观察到此表型。
5、RT-PCR检测CnPDS表达水平
选取TRV2-CnPDS注射叶片以外出现白化表型的叶片，称取0.1g，采用Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取叶片总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以空载体TRV2-Empty注射叶片以外的叶片为阴性对照，设计PDS基因引物(上游引物PDS-RT-F:SEQ IDNO.4，下游引物PDS-RT-R:SEQ ID NO.5)，CnEF1α引物(上游引物CnEF1α-F：SEQ ID NO.6，下游引物CnEF1α-R:SEQ ID NO.7)，RT-PCR检测TRV2-CnPDS注射叶片中CnPDS基因的表达(图5)。内源基因表达水平低(被沉默后)，叶片出现白化表型。根据表达水平降低与白化叶片表型的关联性来判定CnPDS的功能(防止叶片光氧化的功能)。
综上所述，本发明构建了TRV2-CnPDS沉默载体，并通过农杆菌介导的叶片注射法对菊花脑进行了瞬时转化，实现了内源基因的沉默。应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明方法加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明附权利要所求的保护范围。

Claims (10)

1.CnPDS基因片段，其特征在于：具有如下(Ⅰ)～(Ⅲ)中任一所述的核苷酸序列：
(Ⅰ)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
(Ⅱ)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的互补序列；
(Ⅲ)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的CnPDS基因片段在构建基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体中的应用。
3.含有权利要求1所述CnPDS基因片段的重组表达载体、转基因细胞系或转基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默载体，为将权利要求1所述的CnPDS基因片段插入到TRV2载体的EcoRI和KpnI位点之间得到的植物表达载体TRV2-CnPDS。
5.根据权利要求3所述的转基因工程菌，其特征在于：该转基因工程菌通过将权利要求3所述的植物表达载体TRV2-CnPDS转化感受态农杆菌获得。
6.权利要求1所述的CnPDS基因片段、权利要求3～5中任一所述的重组表达载体和转基因工程菌在快速鉴定菊花脑基因功能中的应用。
7.一种快速鉴定菊花脑基因功能的方法，其特征在于：将含有内源目的基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的基因发生沉默，从而鉴定该内源目的基因的功能。
8.根据权利要求7所述的快速鉴定菊花脑基因功能的方法，其特征在于：所述的含有内源目的基因片段的TRV2病毒沉默表达载体质粒为权利要求4中所述的植物表达载体TRV2-CnPDS；通过叶片注射法将权利要求4中所述的植物表达载体TRV2-CnPDS瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的基因发生沉默，从而鉴定该内源目的基因的功能。
9.根据权利要求8所述的快速鉴定菊花脑基因功能的方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)构建植物表达载体TRV2-CnPDS：以菊花脑的cDNA为模板，以CnPDS-EcoRI-F:SEQ IDNO.2和CnPDS-KpnI-R:SEQ ID NO.3为引物进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物采用EcoRI和KpnI进行双酶切，得到酶切片段，与EcoRI和KpnI双酶切线性化的表达载体TRV2连接，转化DH5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体TRV2-CnPDS构建成功，将TRV2-CnPDS通过电转化转入农杆菌GV3101；
(2)制备侵染液：从添加了Rif 50μg/mL、Gen 25μg/mL和Kan 50μg/mL的LB平板上挑取含有植物表达载体TRV2-CnPDS、TRV2-Empty对照载体、TRV1载体的阳性农杆菌GV3101单克隆分别在添加了Rif 50μg/mL，Gen 25μg/mL和Kan 50μg/mL的LB液体培养基中进行培养，然后分别将菌液转入添加了Rif 50μg/mL和Kan 50μg/mL的LB液体培养基中培养至OD600为1.3～1.5，然后离心去上清收集各菌体，采用侵染缓冲液重悬各菌体并调节OD600至1.3～1.5，黑暗静置后将TRV1与TRV2-Empty或TRV2-CnPDS悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑叶片侵染液；所述侵染缓冲液的配方为10mM MES，200μM AS(乙酰丁香酮)，50mM MgCl2水溶液，pH＝5.6；
(3)将步骤(2)制备的侵染液注射转化菊花脑幼苗的叶片得到转化后的幼苗；
(4)转化后培养：将转化后的幼苗用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d后，再转入光下培养；
(5)转化株表型观察：侵染14d后观察植株的叶片白化表型，并拍照记录；
(6)内源目的基因CnPDS的RT-PCR检测：选取TRV1/TRV2-CnPDS侵染植株未注射的白化叶片提取RNA，并反转录为cDNA，以转化TRV1/TRV2-Empty的未注射叶片为对照，设计CnPDS基因引物和CnEF1α引物，RT-PCR检测内源目的基因CnPDS的表达水平。
10.根据权利要求9所述的快速鉴定菊花脑基因功能的方法，其特征在于所述的CnPDS基因引物包括上游引物CnPDS-RT-F:SEQ ID NO.4和下游引物PDS-RT-R:SEQ ID NO.5，所述的CnEF1α引物包括上游引物CnEF1α-F：SEQ ID NO.6和下游引物CnEF1α-R:SEQ ID NO.7。
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