CN116004711A - 基于vigs的石菖蒲根状茎基因沉默体系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系，包括辅助载体以及重组载体；所述辅助载体为烟草脆裂病毒PTRV1，重组载体为含目的基因片段的烟草脆裂病毒PTRV2；所述目的基因片段来源于石菖蒲根状茎。本发明还提供了一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法。本发明具有时间短、速度快、高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化的特点，通过所述方法对石菖蒲根状茎进行侵染，可使目标基因表达水平降低，为下一步石菖蒲功能基因组学的研究提供技术平台，为下一步验证石菖蒲基因功能奠定基础。

Description

基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系及其构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系及其构建方法。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)，是植物抵抗病毒感染的一种机制，通过在病毒基因组中插入合适的目的基因构建成重组的病毒载体，实现对植物内源基因表达抑制的一种新的基因工程技术。VIGS技术无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便、成本低等优点，是目前功能基因组学研究领域常用的技术手段之一，广泛用于植物的生长发育、抗虫病和代谢调控等相关基因的功能研究。目前这一技术在茄科植物烟草、土豆、番茄；豆科大豆、豌豆；十字花科拟南芥；禾本科大麦、小麦、水稻、玉米等植物中得到广泛应用，在各种器官、组织，包括花、茎、叶、根、果实、种子中均有应用。虽然VIGS在许多植物中得到应用，但是该技术在菖蒲属植物中及石菖蒲中的应用和研究较少。

菖蒲是天南星科(Araceae Juss)菖蒲属(Acorus L)植物，分布于亚洲，包括印度东北部、泰国北部、中国、韩国、日本等国。生长于海拔20m至2600m的地区，多生在山涧水石空隙中或山沟流水砾石间，不喜阳光。禾草状多年生草本植物，其根茎具气味，花果期2～6月。石菖蒲作为药用植物的一种，其根茎作为主要药用部位起作用，其中挥发油细辛醚为熟知的一种药用成分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系及其构建方法，以期为下一步石菖蒲功能基因组学研究提供方案，为下一步验证石菖蒲基因功能奠定基础。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系，包括辅助载体以及重组载体；所述辅助载体为烟草脆裂病毒PTRV1，重组载体为含目的基因片段的烟草脆裂病毒PTRV2；所述目的基因片段来源于石菖蒲根状茎。

作为本发明的优选方式之一，所述目的基因片段为DIR基因特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的优选方式之一，所述目的基因片段编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

一种上述基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，包括如下步骤：

S1、提取石菖蒲根状茎总RNA，反转录为石菖蒲根状茎cDNA；

S2、利用特异性引物进行石菖蒲cDNA片段PCR扩增，纯化获得目的基因片段；

S3、将步骤S2中的目的基因片段与烟草脆裂病毒PTRV2进行重组连接，获得含目的基因的重组载体；

S4、将步骤S3中的重组载体以及烟草脆裂病毒PTRV1分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体的菌液、含辅助载体的菌液；

S5、将步骤S4中的含重组载体的菌液、含辅助载体的菌液按体积比1：1混匀获得侵染液；将所述侵染液注射到石菖蒲根状茎，实现对特定目标基因的沉默。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤S2中，当目的基因片段为石菖蒲根状茎的用于沉默DIR基因特异性片段时，对应的所述特异性引物为引物1和引物2；所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤S4中，筛选得到阳性菌株后，将其制成菌液接种至含抗生素的LB平板培养基上；待长出单克隆菌斑，挑取单克隆菌斑置于含抗生素的LB液体培养基中培养，得到单克隆菌液；然后将所述单克隆菌液以1：20的体积比转入液体诱导LB培养基中进行诱导培养，最终获得含重组载体的菌液/含辅助载体的菌液。

作为本发明的优选方式之一，所述含抗生素的LB平板培养基和所述含有抗生素的LB液体培养基中所含的抗生素为：50mg/ml卡那霉素、50mg/ml利福平。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤S5中，侵染液的组成为：以无菌水为母液，并加入200umol/L的乙酰丁香酮，10mmol/L的氯化镁，10mmol/L的MES，pH调至5.7，菌液OD600值调至1.0～1.2，现用现配。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤S5中，侵染液侵染石菖蒲根状茎具体操作如下：将所述侵染液注入石菖蒲根状茎，根状茎材料为移出组培瓶两周后生根的组培苗，注射后暗处理12～24h，之后进行光周期养护。

作为本发明的优选方式之一，所述的光周期养护的培养条件：光照时间16～18h/d，温度为24～27℃，光照强度为25umol/(m²·s)，空气相对湿度为75％。

本发明相比现有技术的优点在于：

本发明具有时间短、速度快、高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化的特点，通过所述方法对石菖蒲根状茎进行侵染，可使目标基因表达水平降低，为下一步石菖蒲功能基因组学的研究提供技术平台，为下一步验证石菖蒲基因功能奠定基础。

附图说明

图1是实施例2中石菖蒲基因沉默体系的构建方法流程图；

图2是实施例2中对照组、空载组及沉默组石菖蒲植株的表型图；

图3是实施例2中沉默基因DIR的PCR电泳图(图中，M为marker，DIR23为PCR检测后样本)；

图4是实施例2中qRT-PCR检测VIGS沉默株系中DIR基因表达量对比图图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系，包括辅助载体以及重组载体；辅助载体为烟草脆裂病毒PTRV1，重组载体为含目的基因片段的烟草脆裂病毒PTRV2；其中，所述目的基因片段为来源于石菖蒲根状茎的DIR基因特异性片段。

具体地，所述DIR基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

本实施例的一种上述实施例1中基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，如图1所示，包括如下步骤：

一、石菖蒲总RNA提取及cDNA合成

1、取样生长发育良好的石菖蒲材料，取样后液氮速冻，然后转移至-80℃超低温冰箱保存以备提取石菖蒲总RNA使用。

2、将-80℃超低温冰箱留存的实验材料取出，进行石菖蒲RNA提取。本试验使用福际生物技术有限公司的试剂盒提取RNA，具体提取操作如下：

(1)在Buffer PRL2和Buffer PRW2中加入标准体积的无水乙醇；

(2)取500ul Buffer PRL1于2ml离心管中，加入10ulβ-巯基乙醇，混匀待用；

(3)取适量石菖蒲材料，尽量剪碎，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨；

(4)迅速称取研磨好的植物材料50mg，转移至Buffer PRL1中，剧烈震荡混匀，室温静置5min；

(5)所有上清液转移至DNA-Cleaning Column中，13300rpm离心2min，移除DNA-Cleaning Column，保留收集管内上清液(切勿将沉淀吸入上清液中)；

(6)小心转移经过DNA-Cleaning Column离心过滤的上清液到2ml新的RNase-Free离心管中，向其中加入约1.7倍体积的Buffer PRL2，轻柔混匀；

(7)将750ul上述混合液小心转移至RNA-only Column中，轻轻盖上离心柱盖子，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；

(8)将RNA-only Column放回收集管中，将剩余混合液全部加入RNA-only Column中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；

(9)向RNA-only Column加入500ul Buffer PRW1，轻轻盖上离心柱盖子，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；

(10)向RNA-only Column中加入700ul无水乙醇，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；

(11)向RNA-only Column加入700ul Buffer PRW2，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；

(12)重复步骤(11)；

(13)将RNA-only Column放回收集管中，12000rpm空管离心2min，弃掉收集管；

(14)将RNA-only Column转移至新的离心管中，向RNA-only Column的膜中央滴加50～200ul已于65℃预热的RNase-Free ddH₂O，室温放置2min后，12000rpm离心1min收集RNA溶液；

(15)为了提高RNA产量，可将离心得到的RNA溶液重新加至RNA-only Column中，重复步骤(14)，得到的RNA溶液可直接用于下游实验或放置-80℃保存。

3、将上述提取石菖蒲RNA采用两步法反转录成cDNA：

(1)基因组DNA去除污染

a.反应体系如下：

组分	体积
		模板RNA	50ng～1μg(1000/RNA浓度)
dsDNase	1μL
		10×ds buffer	1μL
Nuchease-Free water	To 10μL

b.轻柔吸打混匀，瞬离；

c.PCR反应程序：37℃温浴，2min；

55℃温浴，5min；

4℃，2min。

(2)cDNA合成

a.反应体系如下：

组分	体积
		步骤(1)反应产物	10μL
5×RTШsuper mix	4μL
		Nuchease-Free water	6μL

b.轻柔吸打混匀，瞬离；

c.PCR反应程序：50℃ 温浴15min；

              85℃ 温浴5min；

              4℃  2min。

d.将反转录产物放入-80℃保存。

二、沉默片段DIR的扩增

根据克隆得到的石菖蒲序列信息，选取保守区域以外的241bp(DIR)片段为目的片段，利用Primer Premier 5进行引物设计，引物序列分别加Xba1和BamH1酶切位点，用于后期与载体连接。最终设计的引物为引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

配置反应体系，3000rpm，10s离心，将反应体系放入PCR扩增仪中进行体外复制，反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

其中，基因克隆PCR体系和反应条件如下：

组分	体积
		PCR Master MixⅡ	12.5μL
Primer F(上述“引物1”)	1μL
		Primer R(上述“引物2”)	1μL
模板DNA	1μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	To 25μL

PCR程序如下：

以石菖蒲的cDNA为模板，利用引物进行扩增，PCR电泳结果显示获得的片段长度符合预期，经过回收及转化大肠杆菌感受态DH5ɑ细胞，经菌落PCR及测序比对后，得出使用该引物扩增得到的片段是正确的。

三、重组载体的构建

1、PTRV2载体的转化

(1)大肠杆菌感受态DH5ɑ细胞从-80℃冰箱拿出，迅速插入冰中，5nin待菌块融化，分装成20ul每管，向其中加入2ul PTRV2质粒，并用手轻轻拨打EP管底轻轻混匀，避免用移液枪进行吸打，冰中静置25min；

(2)42℃水浴热激1min，迅速放回冰中静置5min，轻拿轻放避免出现晃动以降低转化效率；

(3)向离心管中加入200ul不含抗生素的无菌液体培养基，混匀之后放入37℃摇床，转速200rpm复苏60min；

(4)将全部菌液涂布到含有卡那抗性的固体培养基上；

(5)将平板倒置于37℃的恒温培养箱中过夜，过夜培养好的菌斑进行菌落PCR及测序。

2、进行重组载体的构建

(1)将测序正确的菌液PTRV2利用高纯度质粒小提试剂盒进行质粒提取。

(2)使用Xba1和BamH1限制性内切酶对PTRV2载体质粒进行双酶切。

酶切反应体系和反应条件如下：

组分	体积
		Qcut	5μL
质粒DNA(3ug)	5μL
		Xba1	1μL
BamH1	1μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	To 50μL

37℃反应1h，然后加loading buffer10ul，质粒作为对照，跑胶验证是否切开，若切开，进行胶回收，胶回收后获得与目的基因带有相同酶切位点的线性PTRV2载体。

(3)使用同源重组酶将线性载体与目的基因PCR产物进行连接，反应调节为50℃恒温反应15min。

连接反应体系如下：

组分	体积
		目的基因胶回收产物	1μL
酶切后的载体	1.5μL
		同源重组连接酶	2.5μL

(4)将连接体系转化感受态细胞，具体操作步骤同上。

(5)待菌落长至直径2mm左右，进行PCR鉴定。选出阳性克隆菌液，送北京擎科生物公司测序，提取验证正确的菌株质粒。

四、重组载体以及烟草脆裂病毒PTRV1的转化

1、将测序正确的重组载体质粒以及烟草脆裂病毒PTRV1、烟草脆裂病毒PTRV2空载质粒分别转化至农杆菌感受态GV3101。

农杆菌转化步骤如下：

(1)从-80℃取出保存的感受态农杆菌于冰上融化；

(2)每20μL感受态加1μg质粒DNA混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min；

(3)加入600μL无抗生素的LB液体培养基，28℃振荡培养2～3h；

(4)6000rpm离心三分钟收集菌，留取100μL左右的上清轻轻吸打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天；

(5)挑单菌落培养并鉴定，鉴定正确的菌液每500μL加入30％甘油500μL置于-80℃保存。

2、筛选得到阳性菌株后，将其制成菌液接种至含抗生素的LB平板培养基上；待长出单克隆菌斑，挑取单克隆菌斑置于含抗生素的LB液体培养基中培养，得到单克隆菌液；然后将所述单克隆菌液以1：20的体积比转入液体诱导LB培养基中进行诱导培养，分别获得含重组载体的菌液、含烟草脆裂病毒PTRV1的菌液、含烟草脆裂病毒PTRV1的菌液。

此处，含抗生素的LB平板培养基和所述含有抗生素的LB液体培养基中所含的抗生素为：50mg/ml卡那霉素、50mg/ml利福平。

五、菌株的侵染

1、侵染液的制备

(1)将含有PTRV1、PTRV2和重组载体DIR-PTRV2的农杆菌菌液转接到含有相应抗生素的液体培养基中，28℃，200r/min在摇床震荡培养至菌液浓度达到OD₆₀₀：0.8-1.0；

(2)震荡完成后，6000r/min离心10min，弃上清收集菌体；

(3)利用配置完成的侵染液重悬菌体。其中，侵染液的组成为：以无菌水为母液，并加入200umol/L的乙酰丁香酮，10mmol/L的氯化镁，10mmol/L的MES，pH调至5.7，现用现配。

取少量悬浮菌液使用紫外分光光度计测量其浓度，使菌体浓度达到OD₆₀₀：1.0～1.2，然后黑暗静置2-3h。最后，将含PTRV1载体的菌液与含PTRV2载体的菌液以体积比1：1混匀，待用；同时，将含PTRV1载体的菌液与含重组载体DIR-PTRV2的菌液以体积比1：1混匀，待用。

2、侵染实验设计

本实验共设计三组处理，分别为：

对照组：未侵染植株；

空载组：PTRV1+PTRV2，即含PTRV1载体的菌液与含PTRV2载体的菌液以体积比1：1混匀后的混合液；

沉默组：PTRV1+PTRV2-DIR，即含PTRV1载体的菌液与含重组载体DIR-PTRV2的菌液以体积比1：1后的混合液。

其中，石菖蒲植株均采用组培苗，将其移入土壤中培养至生根，用1ml无菌注射器在石菖蒲根状茎部位进行注射接种，侵染后植株黑暗处理2～24h，后续正常光周期养护。光周期养护的培养条件：光照时间16～18h/d，温度为24～27℃，光照强度为25umol/(m²·s)，空气相对湿度为75％。

对照组、空载组及沉默组石菖蒲植株的表型如图2所示。由图2可知，对照组与沉默组相比，植株表型并无明显区别，沉默组叶片有较少卷曲，说明DIR基因的沉默对其表型并没有显著影响。

3、接种后检测

为了鉴定携带沉默载体的农杆菌侵染后是否成功沉默了DIR基因，侵染完成后，进行对照组、空载组和沉默组取样，提取石菖蒲总RNA，反转录成cDNA。

(1)提取完成的石菖蒲总RNA进行DIR基因沉默的病毒分子检测；

(2)以实验材料cDNA为模板，根据PTRV2的基因序列设计引物，进行病毒分子PCR检测；

(3)反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。由图3可知，检测到目的基因-DIR基因，表示侵染成功。

4、qRT-PCR检测目的基因的表达

以石菖蒲的GAPDH1基因作为内参基因为对照，设计荧光定量引物检测石菖蒲中DIR基因的表达，结果如图4所示。由图4可知，本发明构建的沉默体系可以有效抑制DIR基因的表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系，其特征在于，包括辅助载体以及重组载体；所述辅助载体为烟草脆裂病毒PTRV1，重组载体为含目的基因片段的烟草脆裂病毒PTRV2；所述目的基因片段来源于石菖蒲根状茎。

2.根据权利要求1所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系，其特征在于，所述目的基因片段为DIR基因特异性片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系，其特征在于，所述目的基因片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1～3任一所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取石菖蒲根状茎总RNA，反转录为石菖蒲根状茎cDNA；

S2、利用特异性引物进行石菖蒲cDNA片段PCR扩增，纯化获得目的基因片段；

S3、将步骤S2中的目的基因片段与烟草脆裂病毒PTRV2进行重组连接，获得含目的基因的重组载体；

S4、将步骤S3中的重组载体以及烟草脆裂病毒PTRV1分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性，分别获得含重组载体的菌液、含辅助载体的菌液；

S5、将步骤S4中的含重组载体的菌液、含辅助载体的菌液按体积比1：1混匀获得侵染液；将所述侵染液注射到石菖蒲根状茎，实现对特定目标基因的沉默。

5.根据权利要求4所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，当目的基因片段为石菖蒲根状茎的用于沉默DIR基因特异性片段时，对应的所述特异性引物为引物1和引物2；所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求4所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，筛选得到阳性菌株后，将其制成菌液接种至含抗生素的LB平板培养基上；待长出单克隆菌斑，挑取单克隆菌斑置于含抗生素的LB液体培养基中培养，得到单克隆菌液；然后将所述单克隆菌液以1：20的体积比转入液体诱导LB培养基中进行诱导培养，最终获得含重组载体的菌液/含辅助载体的菌液。

7.根据权利要求6所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，所述含抗生素的LB平板培养基和所述含有抗生素的LB液体培养基中所含的抗生素为：50mg/ml卡那霉素、50mg/ml利福平。

8.根据权利要求4所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，所述步骤S5中，侵染液的组成为：以无菌水为母液，并加入200umol/L的乙酰丁香酮，10mmol/L的氯化镁，10mmol/L的MES，pH调至5.7，菌液OD600值调至1.0～1.2，现用现配。

9.根据权利要求4所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，所述步骤S5中，侵染液侵染石菖蒲根状茎具体操作如下：将所述侵染液注入石菖蒲根状茎，根状茎材料为移出组培瓶两周后生根的组培苗，注射后暗处理12～24h，之后进行光周期养护。

10.根据权利要求9所述的基于VIGS的石菖蒲根状茎基因沉默体系的构建方法，其特征在于，所述的光周期养护的培养条件：光照时间16～18h/d，温度为24～27℃，光照强度为25umol/(m²·s)，空气相对湿度为75％。

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