CN116376862B - 一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关RdCHS4蛋白、重组载体及其应用 - Google Patents

一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关RdCHS4蛋白、重组载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关的RdCHS4蛋白、重组载体及其应用。本发明提供了一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关的RdCHS4蛋白，所述RdCHS4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。实施例结果表明：本发明提供的RdCHS4蛋白可使拟南芥CHS突变体幼苗子叶及下胚轴恢复为紫色，转基因烟草植株花瓣颜色加深。可见，本发明提供的RdCHS4蛋白可以促进植株花色苷的形成。

Description

一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关RdCHS4蛋白、重组载体及其 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关RdCHS4蛋白、重组载体及其应用。
背景技术
花色苷是影响植物颜色呈现的最主要色素物质之一，它可以赋予植物从红色到紫色等一系列不同颜色。研究显示花色苷除可以赋予花、果实等组织颜色外，其还有很多重要的功能，如花色苷还可以保护植物细胞免受紫外线的伤害，抵抗病原体与食草动物，作为信号分子促进植物与微生物之间的相互作用，影响花粉的生长与发育、植物体内激素的转运等。另外大量实验已经证明花色苷与人体健康之间也有密切的关系，它具有抗氧化、抗病毒、抗细胞增殖等生物活性，已经被用于治疗动脉硬化及心脑血管等疾病，是现阶段研究者们重点关注的次生代谢产物之一。
花色苷是由编码其合成的结构基因控制合成的，与花色苷代谢相关的关键酶基因(Chalcone synthase，CHS)是一个多基因家族，长1.2kb左右。该基因的编码区比较保守，对于进化分析具有十分重要的意义。同时，CHS基因的突变或关键酶CHS的失活可以影响并改变目标植物的颜色或是花色苷含量。例如，牵牛花中转入反向插入双元载体的CHS基因后，其花色由红色变为粉色或夹有白色部分，甚至有些花完全变成白色；在蓝猪耳中转含CHS基因片段的干涉表达载体，花色由蓝色变成了白色或灰白色。由此表明，CHS是影响植物花色苷合成的重要关键酶，同时其也是改良植物颜色表型及有益保健成分(花色苷)的靶点酶。研究显示，CHS基因最早是1983年，从欧芹悬浮培养细胞中分离得到的，现已从烟草、矮牵牛、紫薯、草莓、苜蓿、荔枝、蝴蝶兰、葡萄等植物中克隆到了CHS基因。随着cDNA克隆技术的不断完善，国内也有研究人员从众多植物中陆续克隆到了CHS基因的cDNA或基因组DNA序列，但是目前关于马缨杜鹃CHS基因的克隆与功能研究未见任何报道，这极大地限制了人们对杜鹃属植物CHS的利用及对其花色苷生物合成的调控与改良。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关的RdCHS4蛋白，该RdCHS4蛋白可以促进植株花色素苷合成。
本发明提供了一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关的RdCHS4蛋白，所述RdCHS4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供了编码上述技术方案所述的RdCHS4蛋白的基因，所述基因的ORF序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了一种重组载体，包括出发载体和上述技术方案所述的基因。
优选的，所述出发载体包括原核表达载体或真核表达载体。
本发明提供了上述技术方案所述的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
利用扩增引物扩增上述技术方案所述的基因，得扩增产物；
将所述扩增产物连接到出发载体，得到所述重组载体。
优选的，所述出发载体为原核表达载体时，所述扩增引物包括上游引物RdCHS4-32/28F和下游引物RdCHS4-32/28R；
所述上游引物RdCHS4-32/28F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述下游引物RdCHS4-32/28R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选的，所述出发载体为真核表达载体时，所述扩增引物包括上游引物RdCHS4-121F和下游引物RdCHS4-121R；
所述上游引物RdCHS4-121F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述下游引物RdCHS4-121R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明提供了上述技术方案所述的RdCHS4蛋白或上述技术方案所述的基因或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的构建方法构建得到的重组载体在促进植物花色素苷合成中的应用。
优选的，所述应用包括如下步骤：将编码所述RdCHS4蛋白的基因转入植物细胞，诱导查尔酮合酶基因RdCHS4表达。
优选的，所述植物包括烟草和/或拟南芥。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关的RdCHS4蛋白，所述RdCHS4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明所述RdCHS4蛋白由查尔酮合酶基因RdCHS4编码合成，编码形成的RdCHS4蛋白即查尔酮合酶是花色苷合成途径中第一个关键酶，是植物多种花色苷生物合成与积累所必需的酶。它催化一分子丙二酰CoA和三分子香豆酰CoA缩合成柚皮素查尔酮，控制花色苷代谢途径的起始。通过转基因及功能鉴定证实本发明所述的查尔酮合酶基因RdCHS4合成的查尔酮合酶可以促进植株花色苷的形成。实施例结果表明：查尔酮合酶基因RdCHS4转基因使拟南芥CHS突变体幼苗子叶及下胚轴恢复为紫色，RdCHS4转基因烟草植株花瓣颜色加深。可见，本发明所述查尔酮合酶基因RdCHS4合成的查尔酮合酶可以促进植株花色苷的形成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1的RdCHS4基因的多序列比对分析结果；
图2为实施例1的RdCHS4基因的系统进化分析结果；其中，FhCHS为Freesiahybrida，NCBI登录号AEO45114.1；IgCHS为Iris germanica，BAE53636.1；VvCHS为Vitisvinifera,BAA31259.1；AtCHS为Arabidopsis thaliana,AAA32771.1；ZmCHS为Zea mays，CAA42763.1；OsCHS为Oryza sativa,BAA19186.2；GbCHS为Ginkgo biloba,AAT68477.1；MsCHS2为Medicago sativa,P30074.1；PnCHS为Psilotum rudum,BAA87922；EaCHS为Equisetum arvense,Q9MBB1.1；AmQNS为Aegle marmelos,AGE44110,RgACS为Rutagraveolens,CAC14058.1；RpBAS为Rheuampalmatum,AAK82824.1；VvSTS为Vitis vinifera,ABV82966.1；PsSTS为Pinus sylvestris,CAA43165；Gh2PS为Gerbera hybrida,P48391.2；RpALS为Rheum palmatum,AAS87170；CsOLS为Cannabis sativa,B1Q2B6；HIVPS为Huamuluslupulus,ACD69659.1；HaBPS为Hypericum androsaemum,AAL79808.1；MdBIS1为Malusdomestica,NP001315967；BfBBS为Bromheadiafiniaysoniana，CAA10514.1；WtPKS1为Wachendorfia thyrsiflora,AAW50921；RdORS为Rhododendron dauricum,BAV83003；AtPKSA为Arabidopsis thaliana,O23674；AtPKSB为Arabidopsis thaliana,Q8LDM2；上述登录号全部为NCBI登录号；
QNS代表喹诺酮合酶、OLS代表橄榄醇合酶、ALS代表芦荟松合酶、BIS代表3,5-二羟基二苯酚合酶和ORS代表苔黑素合酶。
图3为实施例2的大肠杆菌BL21的生长曲线；
图4为实施例2的RdCHS4体外产物检测；其中A为RdCHS4重组蛋白的纯化；B为柚皮素查尔酮标准品；C为pET32a(+)-BL21空载体蛋白阴性对照；D为RdCHS4酶活反应；A中1代表maker；2代表BL21；3代表pET32空载体蛋白；4代表纯化后RdCHS4蛋白。
图5为实施例3的RdCHS4转基因拟南芥植株表型与代谢产物分析，其中A为RdCHS4转基因拟南芥表型变化；B为RT-PCR检测结果；C为花色素苷定量分析结果；
图6为实施例3的RdCHS4转基因烟草花瓣的表型变化及花色素苷检测分析，其中A为RdCHS4转基因烟草表型变化；B为RT-PCR检测结果；C为花色素苷定量分析；D为花色素苷液相检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种RdCHS4蛋白，所述RdCHS4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明所述RdCHS4蛋白序列长度为393个氨基酸，蛋白质分子量为42.8KD。
本发明还提供了一种编码上述技术方案所述RdCHS4蛋白的基因，所述基因的ORF序列如SEQ ID NO:3所示。本发明编码RdCHS4蛋白的基因RdCHS4优选为查尔酮合酶基因。
本发明根据马缨杜鹃全长转录组测序结果设计上游引物RdCHS4-F1和下游引物RdCHS4-R1，以马缨杜鹃cDNA为模板进行PCR扩增，得到编码RdCHS4蛋白的基因RdCHS4。本发明根据马缨杜鹃全长转录组测序结果设计的引物在基因开放阅读框外。
在本发明中，所述上游引物RdCHS4-F1的核苷酸序列优选为AAATGGCTCCTGGTGGTGTGTC(如SEQ ID NO:1所示)，所述下游引物RdCHS4-R1的核苷酸序列优选为GCTGCCATTTCCAGTATCAAC(如SEQ IDNO:2所示)。
在本发明中，以马缨杜鹃cDNA为模板进行PCR扩增时的扩增体系优选以20μL计，包括：1μL上游引物(引物自身浓度10μM)，1μL下游引物(引物自身浓度10μM)，模板(马缨杜鹃cDNA)1μL，无菌ddH2O补足至20μL；所述PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性8min；94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸8min，30个循环。
本发明还提供了一种重组载体，包括出发载体和上述技术方案所述的编码RdCHS4蛋白的基因RdCHS4。
在本发明中，所述出发载体优选包括原核表达载体或真核表达载体；所述原核表达载体优选包括pET32a；所述真核表达载体优选包括pBI121。
本发明还提供了上述技术方案所述重组载体的构建方法，包括如下步骤：
利用扩增引物扩增上述技术方案所述的基因，得扩增产物；
将所述扩增产物连接到出发载体，得到所述重组载体。
本发明利用扩增引物扩增上述技术方案所述的基因，得扩增产物。本发明优选将原核表达载体和所述扩增产物重组，构建原核表达重组载体；以真核表达载体和所述扩增产物重组，构建真核表达重组载体。
在本发明中，所述原核表达重组载体的构建方法优选包括：利用扩增引物扩增上述技术方案所述的基因，得扩增产物；将所述扩增产物连接到原核表达载体，得到所述原核表达重组载体。本发明所述扩增引物优选包括上游引物RdCHS4-32/28F和下游引物RdCHS4-32/28R；本发明所述上游引物RdCHS4-32/28F核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示，本发明所述下游引物RdCHS4-32/28R核苷酸序列优选如SEQ ID No.6所示。本发明所述RdCHS4-32/28F和RdCHS4-32/28R引物分别优选带有BamH I与Hind III酶切位点。本发明中构建原核表达重组载体和真核表达重组载体的设计的引物正好位于开放阅读框。
在本发明中，构建所述原核表达重组载体时的扩增体系优选以20μL计，包括：1μL上游引物(引物自身浓度10μM)，1μL下游引物(引物自身浓度10μM)，模板(马缨杜鹃cDNA)1μL，无菌ddH2O补足至20μL。本发明中，查尔酮合酶基因RdCHS4构建原核表达重组载体的PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性8min；94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸8min，30个循环。
在本发明中，所述真核表达重组载体的构建方法优选包括：利用扩增引物扩增上述技术方案所述的基因，得扩增产物；将所述扩增产物连接到真核表达载体，得到所述真核表达重组载体。本发明所述扩增引物优选包括上游引物RdCHS4-121F和下游引物RdCHS4-121R；所述上游引物RdCHS4-121F的核苷酸序列优选如SEQ ID No.7所示；所述下游引物RdCHS4-121R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。本发明所述RdCHS4-121F和RdCHS4-121R引物分别优选带有BamH I与Hind III酶切位点。
在本发明中，构建所述真核表达重组载体时的扩增体系优选以20μL计，优选包括：1μL上游引物(引物自身浓度10μM)，1μL下游引物(引物自身浓度10μM)，模板(马缨杜鹃cDNA)1μL，无菌ddH2O补足至20μL。在本发明中，查尔酮合酶基因RdCHS4的PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性8min；94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸8min，30个循环。
本发明在构建所述真核表达重组载体的过程中，将所述扩增产物连接到真核表达载体前，优选将所述的扩增产物和克隆载体连接，得到重组质粒。在本发明中，所述克隆载体优选为pMD18-T。
得到所述重组质粒后，本发明优选将所述重组质粒酶切之后再和真核表达载体连接，得到所述真核表达重组载体。本发明所述重组质粒优选利用Xba I和BamH I限制性内切酶进行酶切。本发明优选将重组质粒连接到真核表达载体的Xba I和BamH I的限制性内切酶位点之间。本发明所述连接的温度优选为16℃，所述连接的时间优选为连接过夜，本发明所述连接过夜优选为14～16h。本发明所述重组质粒和真核表达载体连接时的摩尔比优选为(9～11):1，更优选为10:1。
本发明提供了上述技术方案所述的RdCHS4蛋白或上述技术方案所述的编码RdCHS4蛋白的基因或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的构建方法构建得到的重组载体在促进植物花色素苷合成中的应用。本发明所述应用优选包括如下步骤：将编码所述RdCHS4蛋白的基因转入植物细胞，诱导查尔酮合酶基因RdCHS4表达。
本发明所述植物优选包括烟草和/或拟南芥。在本发明实施例中，转基因拟南芥植株优选通过如下方法实现：将与马缨杜鹃花色苷代谢相关的查尔酮合酶基因RdCHS4转化入拟南芥植株，得到诱导查尔酮合酶基因RdCHS4表达的转基因拟南芥植株。本发明所述的转化入植物细胞的方式优选包括农杆菌转化法，优选利用农杆菌介导植物遗传转化。本发明所述农杆菌转化法采用常规的方法即可，没有特殊的限定。
本发明所述农杆菌株优选为根癌农杆菌GV3101。本发明所述RdCHS4蛋白过表达转基因拟南芥植株优选利用RT-PCR扩增方法进行验证。
在本发明中，RT-PCR扩增使用的体系优选包括：1μL上游引物(引物自身浓度10μM)，1μL下游引物(引物自身浓度10μM)，模板(马缨杜鹃cDNA)1μL，无菌ddH2O补足至20μL。RT-PCR扩增的程序优选包括：94℃预变性8min；94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸8min，30个循环。
得到转基因拟南芥植株，本发明优选收获T1代转基因拟南芥植株种子种植T1代转基因烟草，将所述T1代转基因烟草种子播种于含50mg/L～100mg/L的Kan+和50mg/L～100mg/L的Carbenicilina(羧苄西林)的MS培养基上，筛选得到T1代转基因拟南芥植株。相比于拟南芥CHS突变体，T1代转基因拟南芥植株的叶柄基部恢复为紫色，将叶柄基部颜色恢复为紫色的转基因拟南芥植株培养至成熟，收取T2代转基因拟南芥植株的种子。本发明所述T2代转基因拟南芥植株的种子优选播种于蔗糖质量浓度为3％的1/2MS培养基中，观察T2代转基因拟南芥植株幼苗的颜色。
在本发明实施例中，转基因烟草植株优选通过注射法与组织培养得到，得到诱导查尔酮合酶基因RdCHS4表达的转基因烟草植株植株后，观察转基因烟草植株植株的花瓣表型变化，本发明所述转基因烟草植株的花瓣颜色加深，并通过RT-PCR验证转基因烟草植株中是否存在RdCHS4基因。
本发明所述花色素苷的改良通过促进植株花色素苷合成实现。
本发明利用所述的RdCHS4基因在大肠杆菌细胞中表达重组的RdCHS4蛋白，本发明所述RdCHS4蛋白均可以催化香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应生成柚皮素查尔酮，证明我们克隆得到的RdCHS4蛋白为查尔酮合酶。当RdCHS4基因转入拟南芥CHS突变体后，可以使拟南芥CHS突变子叶和下胚轴中的花色素苷合成得到恢复；当RdCHS4基因转入烟草植株中，能够加深烟草的花色。本发明的马缨杜鹃RdCHS4基因可以控制马缨杜鹃花色素苷的合成，同时可应用于其它植物花色素苷的改良。本发明RdCHS4基因在转基因植物花卉的花色修饰及药用植物药用成分的改良方面具有潜在的应用价值。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1马缨杜鹃RdCHS4基因的克隆
(1)获得RdCHS4目的基因
1.以马缨杜鹃基因组(参见现有技术“Jihua.The draft genome assembly ofRhododendron delavayi Franch.var.delavayi.[J].GigaScience,2017,6(10).”)为参考，重组拼接得到马缨杜鹃全长转录组测序结果(委托北京百迈客生物科技有限公司测序，测序结果参见“https://international.biocloud.net/”)，根据马缨杜鹃全长转录组测序结果设计上游引物RdCHS4-F1(AAATGGCTCCTGGTGGTGTGTC，SEQ ID NO:1)和下游引物RdCHS4-R1(GCTGCCATTTCCAGTATCAAC，SEQ ID NO:2)。
2.合成CHS基因的cDNA
CHS基因的cDNA的合成方法：提取CHS基因的RNA后合成cDNA。
2.1RNA提取
RNA提取方法：(1)取50-100mg马缨杜鹃花瓣材料，用力、快速研磨，研磨过程中约2min添加一次液氮，防止材料降解，直至研磨充分。(2)预冷药匙，利用预冷后的药匙在Buffer RLS管中加入适量磨好的材料，于漩涡振荡器上振荡混匀，漩涡振荡器的温度为4℃，转速为12000rpm，振荡时间为2min，得到上清液。(3)将步骤(2)得到的上清液装入过滤柱FS中，弃沉淀，在温度为4℃条件下进行离心，离心转速为12000rpm，离心时间为2min，得到上清液。(4)将步骤(3)得到的上清装入自备的RNase-Free EP管中，然后向其中加入250μl的无水乙醇，轻轻混匀后，液体和沉淀全部倒入RM(RNA提取试剂盒中用于吸附RNA的柱子名称)中，在温度为4℃条件下离心，离心转速为8000rpm，离心时间为2min，弃废液。(5)向RM中加入350μl Buffer RW1，在温度为4℃条件下离心，离心转速为12000rpm，离心时间为1min，弃废液。(6)在RM中央滴加80μl DNaseI混合液，在温度为30℃条件下静置15min。(7)重复步骤(6)1次。(8)向RM中加入500μl Buffer RW2，在温度为4℃条件下离心，离心转速为12000rpm，离心时间为1min，弃废液。(9)重复步骤(8)1次。(10)在温度为4℃条件下空离，空离转速为12000rpm，空离时间为2min。(11)将RM放入新管，并向吸附膜中央滴加40μlRNase-FreeWater，静置1min。在温度为4℃条件下离心，离心转速为12000rpm，离心时间为1min(可反复多次洗脱，以提高回收率)。(12)跑胶验证后，提取到的RNA置于-80℃保藏。
2.2cDNA合成方法
(1)反转录体系1：提取得到的RNA模板1μl，引物Oligo-dT181μl，DEPC-treatedwater10μl，总体积12μl，将上述反应混合物离心并混匀，在72℃水浴锅中反应10min后立即插入冰中，备用。
(2)反转录体系2：4μl M-MLV5×Reactionbuffer，1μl dNTP mix(2.5mM)，0.5μlRibonuclease Inhibitor，1μlM-MLV RT(200units/μl)，1.5μl DEPC-treated water，总体积8μL。将上述溶液离心并混匀后将反转录体系1加入其中，总体积达到20μl，再次离心并混匀。
(3)PCR运行程序：第一步42℃，60min，第二步70℃，15min，第三步4℃，10min(暂存)，上述程序运行完成后，测cDNA浓度，-20℃保存，备用。
3.以步骤2得到的cDNA为模板，利用步骤1得到的引物进行PCR扩增，其中PCR扩增反应体系如下：上游引物(引物自身浓度10μM)1μL，下游引物(引物自身浓度10μM)1μL，模板(马缨杜鹃cDNA)1μL，无菌ddH2O补足至20μL。PCR扩增的程序为：94℃预变性8min；94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸8min，30个循环。
4.对步骤3得到的PCR产物纯化后连接到克隆载体pMD18-T上经测序可知，获得开放阅读框为1182bp的扩增片段，1182bp的扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，扩增片段编码393个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，将扩增得到的基因命名为RdCHS4。
SEQ ID NO:3：5’-ATGGCTCCTGGTGGTGTGTCAGTGGAGGAATTCCG AAAGGCCCAGCGGGCACAGGGCCCGGCGACGGTCTTGGCCATCGGGACGGCTACTCCTGCTAACTGCGTTAACCAGGCTGAGTATCCCGATTACTACTTTCGGATTACCAACAGCGAGCACAAGACTGATCTGAAGGAGAAATTCAAGCGCATGTGCGAGAAATCAATGATCAAGAAACGCTACATGTACTTAACCGAAGAAATTCTGAAGGAAAACCCGAGTGTGTGCGAGTACATGGCCCCGTCGCTGGACGCTCGCCAGGACATGGTTGTGGTTGAGGTCCCGAAACTGGGCAAGGAAGCTGCGACCAAAGCCATCAAAGAATGGGGCCAACCCAAGTCCAAGATCACCCACCTCGTTTTCTGCACCACTTCAGGCGTCGACATGCCCGGTGCCGATTACCAGCTCACCAAACTCCTCGGCCTCCGTCCCTCCGTCAAGCGCCTCATGATGTACCAACAGGGCTGCTTCGCCGGCGGCACGGTCCTCCGCCTCGCCAAAGACCTCGCCGAGAACAACGCCGGCTCCCGCGTCCTCGTCGTCTGCTCCGAAATCACCGCCGTCACCTTCCGCGGCCCCTCCGACACCCACCTCGACTCCCTCGTCGGCCAGGCCCTCTTCGGCGACGGGGCCGCCGCCGTCATCGTCGGCTCCGACCCCTTACCAGTCGAGCGCCCGCTCTTCCAGCTCGTCTCCGCGGCCCAGACCATCCTGCCCGACTCCGACGGGGCCATCGACGGCCACCTCCGCGAGGTGGGGCTCACATTCCACCTCCTCAAGGACGTGCCCGGCCTGATATCGAAAAACATCGAGAAGTCTCTGGTGGAAGCCTTCACTCCGATCGGCATCAGCGACTGGAACTCGTTGTTCTGGATCGCGCACCCGGGCGGCCCCGCGATCCTGGACCAGGTCGAGCTGAAACTCGGGTTGAAGGAGGAGAAACTCGGGGCGACCCGGCACGTGCTGAGCGAGTACGGTAACATGTCGAGCGCGTGCGTGCTGTTCATTTTGGATGAGATGAGGAGGAAGTCGTTGGAGGAAGGGAGAGGGACGACGGGTGAGGGGTTGGAGTGGGGCGTTCTTTTCGGGTTCGGGCCGGGTTTGACGGTGGAGACGGTTGTGCTCCATAGCGTTCCGGCTCACTGA-3’。
SEQ ID NO:4：MAPGGVSVEEFRKAQRAQGPATVLAIGTATPANCVNQA EYPDYYFRITNSEHKTDLKEKFKRMCEKSMIKKRYMYLTEEILKENPSVCEYMAPSLDARQDMVVVEVPKLGKEAATKAIKEWGQPKSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAENNAGSRVLVVCSEITAVTFRGPSDTHLDSLVGQALFGDGAAAVIVGSDPLPVERPLFQLVSAAQTILPDSDGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGLISKNIEKSLVEAFTPIGISDWNSLFWIAHPGGPAILDQVELKLGLKEEKLGATRHVLSEYGNMSSACVLFILDEMRRKSLEEGRGTTGEGLEWGVLFGFGPGLTVETVVLHSVPAH。
3.将获得的基因RdCHS4与拟南芥、香雪兰和葡萄已知功能的CHS进行比对分析，比对分析采用多序列比对方法，具体为：利用DNAMAN软件对RdCHS4与拟南芥、香雪兰和葡萄的查尔酮合酶进行多序列比对，参照文献标记其保守区，见图1，图1中黄色框为形成活性位点的保守氨基酸残基；蓝色框为决定底物特异性的两个保守苯丙氨酸残基；黑色三角表示形成底物结合和催化口袋的关键氨基酸；绿色框是标志性基序；红色框是香豆酰的辅酶A的结合基序；随后，将不同植物来源的查尔酮合酶的氨基酸序列与RdCHS4进行系统进化分析，进化分析方法：从NCBI中下载不同植物糖基转移酶氨基酸序列，利用Clustalw完成多序列比对，然后利用MEGA6.0完成系统进化树的构建，结果见图2。根据图1～2可知，马缨杜鹃的RdCHS4具有查尔酮合酶普遍存在的活性位点及糖基转移底物结合位点。马缨杜鹃的RdCHS4基因可能具有查尔酮合酶的功能。马缨杜鹃的RdCHS4基因编码的RdCHS4蛋白属于查尔酮合酶。
实施例2马缨杜鹃RdCHS4的酶活检测
1)原核表达载体的构建
1.以实施例1克隆得到的全长RdCHS4基因为模板，利用带有BamH I与Hind III酶切位点的引物(RdCHS4-32/28F：CGGGATCCATGGCTCCTGGTGGTGTG(SEQ ID NO:5)；RdCHS4-32/28R：CCCAAGCTTTCAGTGAGCC GGAACGCT(SEQ ID NO:6))进行RdCHS4开放阅读框的PCR扩增。引物核苷酸序列中划横线部分为酶切位点。通过PCR扩增，分别得到5’和3’均端带有BamH I和Hind III酶切位点的RdCHS4产物，随后经胶回收、连接载体、转化JM109感受态细胞，菌液PCR及酶切的鉴定后，将相应质粒送测序，测序结果显示成功在RdCHS4两端引入酶切位点。
2.将上述测序正确的菌液接菌，并大量提取质粒、酶切，酶切产物验证大小及亮度无误后与pET32a(+)载体连接，转入JM109感受态细胞，次日在转化板上随机挑取克隆，进行菌液PCR、酶切验证，酶切结果显示，条带大小符合预期后，将验证为阳性的克隆送测序，测序结果与原始序列相一致后，证明原核表达载体构建成功。
3.将成功构建的重组质粒(原核表达载体)命名为pET32-RdCHS4，并导入大肠杆菌BL21细胞中，准备可溶性重组蛋白的大量制备。
2)可溶性重组蛋白的诱导表达与纯化
1.将导入pET32-RdCHS4后的大肠杆菌BL21划线接种于含Amp+(100μg/mL)的LB固体培养基中，37℃恒温培养箱倒置培养16h。挑取克隆后的大肠杆菌BL21的菌落，过夜培养。次日按1％的接菌量将大肠杆菌BL21菌液接种于5ml含有LB液体培养基的试管中，温度为37℃，震荡培养的转速为200rpm，每半小时拿出来一支，4℃暂时保存。其中一只试管只含有LB液体培养基不接种大肠杆菌BL21，作空白对照。将各个时间段的菌液取出2ml，测定OD600值，每个时间点重复测三次，绘制生长曲线，见图3。
根据图3可知，2h后大肠杆菌BL21进入生长对数期，在2.5h时生长速度最快，菌的状态最佳。
2.取步骤1接种大肠杆菌BL212.5h后得到的培养物，对含有目的基因的RdCHS4的大肠杆菌BL21培养物进行IPTG诱导。具体的：步骤1大肠杆菌BL21在37℃，200rpm的培养条件下震荡培养2.5h后，在大肠杆菌BL21培养物中加入IPTG使其终浓度为0.1-1mM，随后在恒温摇床中继续诱导培养，测定不同恒温条件和诱导时间下的RdCHS4蛋白含量。根据RdCHS4蛋白含量的结果可以看出，RdCHS4蛋白的最佳诱导表达条件为15℃，0.1mM IPTG条件下诱导48h。
3.按照步骤2最佳诱导表达条件大量制备RdCHS4蛋白，并通过镍柱与咪唑洗脱对目的蛋白RdCHS4蛋白进行分离与纯化，将洗脱后得到的蛋白进行大量收集并完成透析，利用变色硅胶在低温条件下完成目的蛋白的浓缩，将得到的目的蛋白RdCHS4保存于-80℃冰箱中，待酶活检测。
RdCHS4蛋白分离、纯化、透析、浓缩的详细步骤如下：
①分离纯化：
a.装柱：在Ni-NTA预装柱中缓慢加入Ni填料，用20％乙醇压实，当Ni填料到2ml左右时，用10ml 20％乙醇进一步压实，最后用20mM PBS缓冲液平衡柱子，4℃保存备用。
b.RdCHS4重组蛋白的大量制备
(1)在最佳诱导条件下按1％的接菌量接菌扩摇后，按照上述条件大量制备大肠杆菌培养物，培养基为LB液体培养基。
(2)将大肠杆菌培养物分装至50ml离心管中，置于高速离心机中进行离心，温度设置为：4℃，转速：5000rmp，离心10min，倒掉上清，收集菌体。
(3)每50ml菌液加入5ml 20mM PBS悬浮菌体，插入冰中，冰浴30min。
(4)超声：超声功率设置为45％，超5s停5s，设定10min，超声破碎细胞，待菌液冷却后重复超声一次。
(5)破壁后的菌液置于高速离心机中离心，设置温度为4℃，转速6000rpm离心15min，上清即为蛋白粗提取液。
c.上样：将收集的上清溶液(蛋白粗提取液)重复上Ni柱3次，并用3倍体积的20mM的PBS溶液平衡。
d.咪唑洗脱：平衡后，用咪唑浓度依次为10mM、20mM、50mM、80mM、200mM、500mM的洗脱缓冲液进行洗脱，每个浓度梯度收集5管洗脱液，每管2ml洗脱液。
e.洗柱：用20mM PBS缓冲液洗柱，洗净后用20％乙醇浸泡，4℃保存。
f.SDS-PAGE电泳验证：将过柱后收集的各管洗脱液进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的洗脱及纯化情况，见图4中A，根据图4中A可知，重组蛋白pET32-RdCHS4的蛋白质分子量为62.8KD，为RdCHS4重组蛋白和空载体蛋白之和，空载体蛋白的大小约为20KD。
②透析与浓缩：
a.透析袋的处理：将透析袋裁剪至15～20cm，在质量浓度为2％Na2HCO3溶液(含1mMEDTA-2Na，pH为8.0)中煮沸10min，去离子水清洗干净后置于1mM EDTA-2Na(pH为8.0)中煮沸10min，用去离子水将透析袋清洗干净后，浸泡在去离子水中，4℃保存备用。旧的透析袋经检查不漏液后，用蒸馏水加热煮沸30min后可重复使用。
b.根据SDS-PAGE电泳的结果，收集条带单一且浓度较好的蛋白洗脱液，装到处理好的透析袋中，依次用2L的透析液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中在4℃冷冻层析柜中进行透析，每种透析液透析10小时。透析液Ⅰ为500mM的氯化钠溶液和20mM的PBS溶液，透析液Ⅱ为300mM的氯化钠溶液和20mM的PBS溶液，透析液Ⅲ为100mM的氯化钠溶液和20mM的PBS溶液，透析液Ⅳ为0mM的氯化钠溶液和20mM的PBS溶液。
c.将装入透析袋中的蛋白包埋于预冷的变色硅胶中，置于4℃冰箱中进行浓缩，浓缩至1～2ml左右，取少许样品进行SDS-PAGE电泳验证浓缩情况，RdCHS4重组蛋白纯度达到90％以上，剩余样品-80℃保存备用。
3)RdCHS4蛋白的酶活检测分析
将得到的目的蛋白RdCHS4进行酶活检测。以对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物，参照表1进行酶活反应体系的配置，混合完毕后置于30℃水浴锅中反应5min，待反应结束后，4℃、12000rpm离心10min将上清转移至棕色上样瓶，利用HPLC检测反应产物。柚皮素查尔酮标准品见图4中B，pET32a(+)-BL21空载体蛋白阴性对照见图4中C，RdCHS4酶活反应如图4中D所示，根据图4中B、C、D可知，RdCHS4能够催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应生成柚皮素查尔酮，证明RdCHS4具有查尔酮合酶活性。重组蛋白RdCHS4酶活反应体系见表1。
表1重组蛋白RdCHS4酶活反应体系
实施例3RdCHS4对拟南芥和烟草花色苷合成的影响
1)双元表达载体的构建(真核表达载体的构建)
为验证RdCHS4基因对拟南芥和烟草花色苷合成的影响，以克隆得到的全长RdCHS4基因作为模板，分别带有BamH I和Xba I酶切位点的引物(RdCHS4-121F：GCTCTAGAATGGCTCCTGGTGGTGTG(SEQ ID NO:7))；(RdCHS4-121R：CGGGATCCTCAGTGAGCCGGAACGCT(SEQ ID NO:8))进行RdCHS4开放阅读框的PCR扩增。引物的核苷酸序列中划横线的部分为酶切位点。
利用上述引物大量扩增目的片段，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收具有Xba I和BamH I酶切位点的目的基因RdCHS4，并进行琼脂糖凝胶电泳验证。将条带大小和亮度符合要求的扩增产物用于连接。将验证正确的胶回收产物与pMD18-T克隆载体通过T4连接酶在16℃的条件下连接过夜(14-16h)，次日转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，待转化板长出克隆后的大肠杆菌JM109，随机挑取单克隆大肠杆菌JM109进行菌液PCR。将筛选获得的目的基因RdCHS4阳性克隆大肠杆菌JM109接菌、提取质粒并进行Xba I和BamH I双酶切验证，验证为阳性的质粒送测序。
重组质粒pMD18-T+RdCHS4(X+B)和真核表达载体质粒pBI121同时用Xba I和BamHI限制性内切酶进行双酶切。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳验证，切下大小正确的目的片段RdCHS4和载体片段pBI121，进行回收并验证。验证无误，将载体片段pBI121与目的片段RdCHS4按摩尔比1：10混合，16℃过夜连接14-16h。利用中间载体pMD18-T是为了引入酶切位点，同时在做酶切的时候比PCR产物更好判断是否酶切成功。
将全部连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，涂布于Kan+(终浓度为1mg/mL)抗性的LB固体培养基表面；次日挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆进行接菌、提取重组质粒、Xba I和BamH I双酶切鉴定成功后送测序，测序结果正确的重组质粒命名为pBI121-RdCHS4，pBI121-RdCHS4即真核表达载体。
2)转基因拟南芥植株表型变化与花色素苷分析
利用上述构建好的真核表达载体pBI121-RdCHS4，利用农杆菌侵染拟南芥，通过Kan+抗性筛选获得过表达转基因RdCHS4拟南芥植株。将转基因拟南芥植株单株培养，并收集种子，将收取的种子种在含有Kan抗性(Kan终质量浓度为1mg/ml)和质量浓度为3％蔗糖的1/2MS培养基上，观察T2代幼苗的表型变化。与CHS突变体拟南芥植株相比，转基因RdCHS4拟南芥植株子叶与下胚轴中的花色素苷合成成功恢复，同时分别提取野生型、突变体和转基因植株的总RNA，通过RT-PCR验证发现(提取RNA和PCR扩增程序同实施例1)，在转基因RdCHS4拟南芥植株中成功检测到RdCHS4基因，而野生型拟南芥与CHS突变体拟南芥中没有检测到，同时提取野生型拟南芥、CHS突变体拟南芥和转基因RdCHS4拟南芥幼苗的花色素苷，利用HPLC完成定量分析，具体方法如下：
将适量拟南芥CHS突变体种子(购自于Nottingham Arabidopsis Stock Center)、野生型拟南芥种子分别均匀撒在盛有湿润土壤的花盆中，并盖保鲜膜，保鲜膜用牙签插孔透气，置于25℃恒温光照培养室中，每隔2～3天浇一次水；待发芽后揭膜间苗，5～8株/盆；待野生型拟南芥和拟南芥CHS突变体植物生长至盛花期时去荚留花，作为农杆菌侵染材料。
将pBI121-RdCHS4转移到根癌农杆菌GV3101中，pBI121-RdCHS4转移后的根癌农杆菌GV3101接种于5ml含Rif(利福平)(终浓度为50mg/L)和Kan+(卡那霉素)(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中，30℃，200rpm，震荡培养48h。
将上述培养后的GV3101菌液全部接种于250ml含Rif(终浓度为50mg/L)和Kan+(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中扩摇至菌液OD600值为1.0以上。
将培养好的新鲜GV3101菌液分别转入50ml离心管中进行离心，温度设置为：4℃，转速：5000rpm，离心15min后倒掉废液，保留GV3101菌体沉淀。
取质量浓度为5％蔗糖溶液重悬菌体后，加入质量浓度为5％蔗糖溶液，并且每100ml悬浮液需加入60μl silwet-77(表面活性剂)，置于磁力搅拌器上搅拌均匀。
停止搅拌后，取一盆CHS突变体种子生长后的拟南芥倒扣在根癌农杆菌GV3101菌液中，使花朵完全浸泡在菌液中，保持5min。重新将菌液搅拌均匀后再继续侵染下一盆CHS突变体种子生长后的拟南芥。取出后的侵染后的CHS突变体拟南芥横放于托盘中，并加少量蒸馏水扣盖，在黑暗环境中室温过夜处理，次日将侵染后的CHS突变体拟南芥转移至光照培养架上正常培养，定期浇水和喷洒营养液，得到转基因RdCHS4拟南芥。转基因RdCHS4拟南芥生长至成熟期后收取T1代种子，命名为pBI121-RdCHS4-T1。
转基因T1代(pBI121-RdCHS4-T1)拟南芥种子的筛选：
(1)取适量转基因T1代种子于1.5ml EP管中，按照1：8(巴氏消毒液：水)的体积比例加入巴氏消毒液，上下摇晃15min洗涤种子。
(2)洗涤完毕后12000rpm，室温离心1min。
(3)在超净工作台子用无菌水清洗三次后播种于含1％蔗糖的1/2MS筛选培养基上(Kan终浓度为50mg/L，Carbenicilina终浓度为100mg/L)。
(4)4℃春化2d后置于光照培养架上培养。
(5)转基因T1代拟南芥种子发芽后将筛选出的绿色抗性苗移栽至土壤中。
野生型拟南芥种子和叶柄基部为紫色，拟南芥CHS突变体种子和叶柄基部为黄色。基因RdCHS4导入拟南芥CHS突变体后，此时部分T1代拟南芥种子发芽后的转基因拟南芥植株使拟南芥CHS突变体叶柄基部恢复为紫色，将颜色恢复的植株培养至成熟，并单株收取T2代RdCHS4转基因种子，可见种子颜色也成功由黄色恢复为紫色。
表型观察：取适量野生型拟南芥、CHS突变体拟南芥及T2代RdCHS4转基因拟南芥种子在超净工作台中播种于含3％蔗糖的1/2MS培养基(花色苷诱导培养基)中，春化后培养5天在体式显微镜下观察幼苗颜色差异，见图5中A，根据图5中A可知，RdCHS4转基因拟南芥子T2代种子颜色也成功由黄色恢复为紫色。RdCHS4转基因拟南芥使拟南芥CHS突变体幼苗子叶及下胚轴恢复为紫色。
收集野生型、CHS突变体及表型恢复的RdCHS4转基因拟南芥幼苗提取总RNA，利用RT-PCR方法验证重组载体是否成功转入拟南芥突变体中，见图5中B，根据图5中B可知拟南芥幼苗RdCHS4-1(转基因植株1)和RdCHS4-3(转基因植株3)可以表达RdCHS4蛋白。
收集野生型、CHS突变体及表型恢复的RdCHS4转基因拟南芥幼苗提取花色苷，进行定性与定量分析，花色苷定性与定量分析的具体方法如下：
(1)花色苷的提取和检测的具体方法：
a.样品的研磨：取适量马缨杜鹃花瓣置于预冷研钵中快速研磨，并不断添加液氮防止样品氧化，样品研磨充分后使粉末集中在研钵底部。
b.花色苷的提取：配置花色苷提取液(H2O：MeOH：HCl(75/24/1v/v/v))，用移液枪取1ml提取液于棕色小瓶中，迅速加入0.3g充分研磨的马缨杜鹃花瓣粉末，并轻轻摇匀，摇匀后将棕色小瓶置于4℃冰箱中抽提12h。
c.将抽提后的样品转移至1.5ml离心管中，在4℃下，12000rpm离心15min，上清用0.22μm滤膜过滤后，收集滤出液保存至棕色上样小瓶中，用于高效液相及高效液相分析。
(2)花色苷高效液相检测条件：
高效液相色谱仪流动相A为体积浓度为5％甲酸水溶液、流动相B为色谱纯甲醇溶液，分析时间为65min，后运行5min。流动相流速设置为1ml/min，色谱柱柱温设置为30℃；样品在520nm波长进行检测。梯度洗脱条件如下：时间(0～10min)流动相A体积浓度为86～83％，流动相B体积浓度为14～17％；时间(10～35min)流动相A体积浓度为83～76％，流动相B体积浓度为17～23％；时间(35～60min)流动相A体积浓度为76～53％，流动相B体积浓度为23～47％；时间(60～65min)流动相A体积浓度为53～86％，流动相B体积浓度为47～14％；(65～70min)流动相A体积浓度为86％，流动相B体积浓度为14％。
(3)花色苷的定量分析方法
a.选取矢车菊素3-O-糖苷标准品用于绘制标准曲线，并进行定量分析。
b.根据预实验结果确定矢车菊素3-O-糖苷的最大使用浓度为250μg/ml，并以此为母液进行梯度浓度稀释，配置不同浓度矢车菊素3-O-葡萄糖苷标准品，每种浓度的标准品上样检测三次。
c.经高效液相色谱仪检测后，将不同浓度的标准品作为横坐标，三次上样检测峰面积的平均值为纵坐标进行绘制标准曲线，标准曲线为y＝38.12x+97.955。根据标准曲线计算花色苷含量。
收集野生型、CHS突变体及表型恢复的RdCHS4转基因拟南芥幼苗提取花色苷，进行定性与定量分析的结果见图5中C和表2～4，根据图5中C和表2～4可知野生型拟南芥幼苗中花色苷含量为272.26μg/g，CHS突变体拟南芥幼苗中未检测到花色苷，转基因拟南芥幼苗RdCHS4-1(转基因植株1)和RdCHS4-3(转基因植株3)中花色苷含量分别为276.25μg/g和282.95μg/g。
表2野生型(WT)拟南芥幼苗花色苷含量
表3转基因拟南芥幼苗RdCHS4-1花色苷含量
表4转基因拟南芥幼苗RdCHS4-3花色苷含量
3)转基因烟草植株表型变化与花色素苷分析
通过注射法与组织培养获得转基因烟草植株(参照Sparkes I.A，Runions J.，KearnsA，et al.Rapid，transient expression offluorescent fusionproteinsintobacco plants and generation ofstablytransformedplants[J].Nat Protoc，2006，1(4)：2019-2025.)，待烟草成功生根后，移栽到土壤中继续培养，待开花后观察花瓣表型变化。与野生型植株相比，烟草花瓣颜色加深，通过RT-PCR验证发现，在转基因植株中成功检测到RdCHS4，而野生型中没有检测到，检测结果见图6，图6中A为RdCHS4转基因烟草表型变化，图6中B为RT-PCR检测结果，图6中C为花色素苷定量分析，图6中D为花色素苷液相检测图，根据图6中A可知RdCHS4转基因烟草花朵颜色明显加深，根据图6中B可知在野生型烟草中没有检测到RdCHS4的表达，而在转基因植株中成功检测到RdCHS4基因的表达，根据图6中C和D可知野生型烟草中花色苷含量为1.13mg/g，转基因烟草RdCHS4-1(转基因植株1)和RdCHS4-3(转基因植株3)花朵中花色苷含量分别为2.08mg/g和1.47mg/g。
综上，本发明提供的马缨杜鹃花色苷代谢相关的查尔酮合酶基因RdCHS4编码的RdCHS4蛋白为查尔酮合酶，可以催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应生成柚皮素查尔酮。当RdCHS4基因转入拟南芥CHS突变体后，可以使拟南芥突变子叶和下胚轴中的花色素苷合成得到恢复，同时加深烟草的花色。本发明所述马缨杜鹃RdCHS4基因可以控制马缨杜鹃花色素苷的合成，同时可应用于其它植物花色素苷的改良。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种与马缨杜鹃花色苷代谢相关的RdCHS4蛋白，其特征在于，所述RdCHS4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.编码权利要求1所述的RdCHS4蛋白的基因，其特征在于，所述基因的ORF序列如SEQID NO:3所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包括出发载体和权利要求2所述的基因。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述出发载体为原核表达载体或真核表达载体。
5.权利要求3或4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用扩增引物扩增权利要求2所述的基因，得扩增产物；
将所述扩增产物连接到出发载体，得到所述重组载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述出发载体为原核表达载体时，所述扩增引物包括上游引物RdCHS4-32/28F和下游引物RdCHS4-32/28R；
所述上游引物RdCHS4-32/28F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述下游引物RdCHS4-32/28R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述出发载体为真核表达载体时，所述扩增引物包括上游引物RdCHS4-121F和下游引物RdCHS4-121R；
所述上游引物RdCHS4-121F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述下游引物RdCHS4-121R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
8.权利要求1所述的RdCHS4蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的重组载体或权利要求5所述的构建方法构建得到的重组载体在促进植物花色素苷合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：将编码所述RdCHS4蛋白的基因转入植物细胞，诱导查尔酮合酶基因RdCHS4表达。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述植物包括烟草和/或拟南芥。
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