CN110468147A

CN110468147A - 一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统

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Publication number: CN110468147A
Application number: CN201811243473.9A
Authority: CN
Inventors: 张永亮; 胡佳成; 李大伟; 姜志豪; 李召雷
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2038-10-24
Also published as: CN110468147B; WO2020083339A1; US20210348176A1

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统。所述基因编辑载体系统包括分别含有大麦条纹花叶病毒RNAα、RNAβ和RNAγ的人造质粒；在RNAβ或RNAγ中，整合有所需的sgRNA序列。本发明基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统可以对本生烟等双子叶植物和小麦、玉米等单子叶植物的基因组进行高效的基因编辑。

Description

一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统。

背景技术

基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑操作，对靶标基因的编辑效率与靶标细胞中Cas9蛋白和sgRNA的表达量息息相关。通常，基于瞬时表达载体的基因编辑载体可以通过基因枪导入植物组织当中，也可以通过农杆菌介导的转化导入植物当中。但是由于瞬时表达载体本身并不能在靶标细胞中复制和转移，从而最终能够获得sgRNA和Cas9蛋白的细胞的数目是有限的，获得Cas9蛋白和sgRNA的细胞中，二者的含量也是有限的，从而对基因编辑的效率会产生不利的影响。为此，往往需要同时转化大量的受体组织，进行较大规模的组织培养操作才可能筛选出目标突变体，因而相当费时费力，成本较高。相对而言，基于植物病毒的基因编辑载体由于其可以高效复制，从而可以有较提高靶标细胞中sgRNA和/或Cas9蛋白的含量；此外，某些基于植物病毒的基因编辑载体在宿主植物中仍可以保持系统运动的能力，从而使能够获得sgRNA和/或Cas9蛋白的细胞比例大大增加进而有利于提升对靶标基因的编辑效率。同时，基于植物病毒的基因编辑载体在操作上也较为简单，通过农杆菌浸润或者摩擦接种的方式即可侵染宿主植物，从而实现对宿主植物内源基因进行基因编辑的目的。

目前报道的基于植物病毒的基因编辑载体主要包括植物双生病毒，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)等，它们各自均具有一些重要优点，但也同时存在一些不足之处。

植物双生病毒为DNA病毒，在侵染植物时，双生病毒可能与宿主细胞竞争复制、翻译等相关因子，干扰植物正常生长，同时也给植物组培再生带来困难。基于双生病毒复制子的基因编辑载体往往无法在植物中进行运动和扩散。此外，双生病毒目前仍然是对农作物威胁最为严重的病毒种类之一，可以引发严重的症状，对作物造成巨大的破坏，且双生病毒可以经由昆虫(例如烟粉虱)进行传播，一旦扩散，难以控制。

2016年报道了基于RNA病毒TRV的基因编辑载体。TRV的基因组包含两条单链RNA，虽然基于TRV的基因编辑载体保持了系统运动的能力，但是TRV的寄主范围较为有限，其一般并不侵染包括大麦，小麦，玉米等重要作物在内的单子叶植物，从而限制了其在这些重要的农作物上的应用。

2017年报道了基于TMV的基因编辑载体。但是由于其在设计时，去除了病毒本身的运动蛋白，使病毒丧失了系统运动的能力，因而其得以发挥作用的部位较为有限。此外，TMV同样不能侵染小麦，玉米等禾本科作物。

因此，急需开发一种可应用单子叶禾本科作物(例如小麦)的基因编辑载体，并保留病毒在宿主植物中的系统运动能力和复制能力。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于大麦条纹花叶病毒(BSMV)的基因编辑载体系统。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统。

所述大麦条纹花叶病毒的为多分体RNA病毒，基因组包含三条正义、单链基因组RNA，分别称为RNAα(GenBank：U35767.1)，RNAβ(GenBank：U35770.1)和RNAγ(GenBank：U13917.1)。

其中RNAα编码的αa蛋白和RNAγ编码的γa蛋白构成病毒的复制酶；RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和三联体运动蛋白TGBs；RNAγ还编码一个小蛋白γb，它是一个多功能的蛋白。当RNAα，RNAβ，RNAγ同时存在时，病毒可以在适当的环境下在宿主植物中复制和运动；当仅有RNAα和RNAγ同时存在时，病毒可以在适当的环境下在宿主植物中复制。BSMV可以侵染包括大麦，小麦，玉米，谷子等在内的多种单子叶植物以及双子叶植物本生烟。

需要说明的是，当所述基因编辑载体系统需要应用于玉米的基因编辑时，所述RNAβ为在野生型大麦条纹花叶病毒RNAβ(GenBank：U35770.1)的基础上发生突变的β链，所述突变导致RNAβ编码的TGB1蛋白的第404位由氨基酸G(甘氨酸)突变为E(谷氨酸)，相关突变信息可参考胡悦博士学位论文(大麦条纹花叶病毒TGB1蛋白磷酸化修饰在病毒侵染和运动中的功能分析，胡悦，中国农业大学博士学位论文，2015)。

本发明所提供的基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统，包括分别含有上述RNAα、RNAβ、和RNAγ的人造质粒；并将所需的sgRNA序列整合在RNA β中或RNAγ中。

即，所述载体系统包括：(1)含有RNAα的人造质粒，(2)含有RNA β并整合有sgRNA的人造质粒，(3)含有RNAγ的人造质粒；

或包括：(1)含有RNAα的人造质粒，(2)含有RNA β的人造质粒，(3)含有RNAγ并整合有sgRNA的人造质粒。

所述人造质粒优选为含有HDVRz核酶的质粒，该HDVRz核酶可以使BSMV的基因组RNA得以正确转录出来，并具有侵染性，可以侵染相应的宿主植物。

所述含有HDVRz核酶的人造质粒包括但不限于pCB301、pCass4-Rz等。

在本发明的具体实施方式中，采用人造质粒pCB301构建载体系统，所述人造质粒pCB301为南京农业大学陶小荣教授馈赠(Yao,M.,Zhang,T.,Tian,Z.,Wang,Y.,Tao,X.,2011.Construction of Agrobacterium-mediated cucumber mosaic virus infectiouscDNA clones and 2b deletion viral vector.Scientia Agricultura Sinica,2011,44(26):4886-4890.)

所述人造质粒pCB301上包含一个多克隆位点，通过其中的Stu I和BamH I两个酶切位点将大麦条纹花叶病毒的三条基因组RNA分别克隆到pCB301上，产物分别称为pCB301-BSMVα，pCB301-BSMVβ和pCB301-BSMVγ。

本发明经过实验研究发现，大麦条纹花叶病毒基因组上存在多个可以插入外源片段而不影响病毒本身的复制和运动的位点，例如γb的5`端和3`端；以及外壳蛋白CP的编码序列中间部分可以替换为外源片段而不影响病毒的复制和运动。

因此，当将所需的sgRNA序列整合在RNA β中时，为了使整合的sgRNA序列不影响病毒的系统运动，需将sgRNA表达骨架连同上下游序列在CP基因(编码CP蛋白的基因)核苷酸序列第74-435bp之间的区域中进行插入或替换。在本发明的具体实施方式中，作为一种示例性操作，将sgRNA表达骨架连同上下游序列替换了CP基因第74-393位的核苷酸序列。

当将所需的sgRNA序列整合在RNAγ中时，为了使整合的sgRNA序列不影响病毒的系统运动，本发明选择在γb ORF的3’端插入所需sgRNA。

本领域技术人员应当理解，sgRNA包含两个部分，位于5`端的spacer部分和紧连着的位于3`端的骨架部分；spacer的核苷酸序列是可以改变的，其长度根据Cas9蛋白的不同也可以发生变化。在本发明技术方案中，spacer的上游和/或骨架部分的下游除了大麦条纹花叶病毒基因组上本身序列之外，还可以带有额外的序列，可以是另一个或者多个sgRNA的序列和/或者是病毒自身及sgRNA以外的其他序列。

进一步地，本发明针对技术方案中所涉及到的sgRNA序列整合进行具体说明如下：

本发明通过PCR扩增或者合成所需sgRNA的序列，并通过酶切连接或者同源重组等方法，将sgRNA序列克隆到上述特定位置。

具体来说，首先通过反向PCR将病毒载体线性化，通过扩增或者合成sgRNA表达框序列并在其两端添加20bp左右的与病毒载体同源的序列，进而通过重组反应将sgRNA克隆到病毒载体上，其插入位点可以是CP内部，也可以是γb之后。sgRNA序列的两端还可以添加额外的序列，所谓额外的序列，可以是病毒载体上的序列，也可以是sgRNA上的序列，还可以是这二者之外的序列，长度可以在几bp到几百bp。当然，也可以通过如酶切连接等方法将sgRNA序列克隆到病毒载体上。

在本发明的一种具体实施方式中，以本生烟PDS基因作为靶向基因设计sgRNA，并将该sgRNA整合到CP内部，所述基因编辑载体系统包括：(1)含有RNAα的pCB301，(2)含有RNAβ并整合有sgRNA的pCB301，(3)含有RNAγ的pCB301。

在本发明的另一种具体实施方式中，以本生烟PDS基因作为靶向基因设计sgRNA，并将该sgRNA整合到γb之后，所述基因编辑载体系统包括：(1)含有RNAα的pCB301，(2)含有RNA β的pCB301，(3)含有RNAγ并整合有sgRNA的pCB301。

第二方面，本发明提供了所述基因编辑载体系统在对植物进行基因编辑中的应用。

本发明中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物包括但不限于大麦、小麦、燕麦、玉米、谷子；所述双子叶植物包括但不限于本生烟。

进一步地，本发明所述基因编辑载体系统可实现对单子叶植物的基因编辑，克服了现有技术中基于TRV或TMV的基因编辑载体不能侵染小麦、玉米等禾本科作物的缺陷和不足。

第三方面，本发明还提供一种对植物进行基因编辑的方法，为利用本发明所述的基因编辑载体系统进行。

本发明所述基因编辑载体系统可以通过基因枪轰击，体外转录产物摩擦接种，农杆菌浸润等方法导入植物组织细胞中，并可以在大麦、小麦，玉米，短柄草，苋色藜，本生烟等植物中复制和运动；所述基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体，其序列中包含sgRNA的序列，在Cas9蛋白存在的条件下，可以实现对本生烟等植物基因组的编辑。例如，将所述一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体，以农杆菌浸润的方法在本生烟上进行接种，在Cas9蛋白存在的条件下，其可以对直接接种区域以内的和系统侵染的植物组织进行基因编辑。

本发明经过实验证明，将本发明所述的基因编辑载体系统通过农杆菌浸润的方法侵染本生烟后，在Cas9蛋白存在的条件下，可以对本生烟的农杆菌浸润叶和系统叶的内源基因实现编辑，且效率可以达到70％以上。

将本发明所述的基因编辑载体系统通过体外转录BSMV及其突变体的RNA，通过摩擦接种侵染小麦或者玉米后，在Cas9蛋白存在的条件下，可以对小麦或者玉米的系统叶的内源基因实现编辑。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统，可以将sgRNA序列替换部分CP的序列，也可以将sgRNA克隆到γb的3`端而不影响其在宿主植物上的系统侵染；sgRNA序列的两端可以添加额外的核苷酸序列而不破坏其正常功能；所述基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体可以对接种区域之外的植物基因组进行编辑。

相比于已经报道的基于TRV的基因编辑载体，本发明所述载体系统可以侵染一些重要的作物，包括大麦，小麦，燕麦，谷子和玉米。

相比于已经报道的基于TMV的基因编辑载体，本发明所述载体系统可以保留病毒在宿主植物中的系统运动能力和复制能力，从而可以实现更大范围的植物组织细胞的进行基因编辑，而不仅仅局限于病毒在植物上的接种区域。

相比较于已经报道的基于双生病毒的基因编辑载体，本发明所述载体系统，在实现较高编辑效率的前提下，并不会同植物细胞竞争诸如复制、翻译等原件并干扰正常的植物细胞周期；另外，BSMV作为RNA病毒，不会整合到植物的基因组当中而在植物基因组中引入额外的外源片段。且本发明所提供的基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体可以利用多分体病毒的不同基因组RNA整合sgRNA序列。

附图说明

图1为实施例1所述的β-CP-Tgcas-gNbPDS4载体示意图。

图2为实施例2所述的γ-gRNA-gNbPDS4载体示意图。

图3为实施例3中包含于所述pT7-ge-BSγ-SmR-TaGASR7-T1中的BSMV RNAγ的cDNA结构示意图。

图4为实验例1中对所述NbPDS544酶切结果图。

图5为实验例1中将所述NbPDS544克隆至T载体测序的结果图。

图6为实验例1中对所述NbPDS544酶切结果图。

图7为实验例1中将所述NbPDS544克隆至T载体测序的结果图。

图8为实验例2中对所述TaGASR7-A1,TaGASR7-B1，TaGASR7-D1酶切结果图。

图9为实验例2中将所述TaGASR7-A1,TaGASR7-B1，TaGASR7-D1克隆至T载体测序的结果图。

图10为实验例2中对所述ZmTMS5-994酶切结果图。

图11为实验例2中将所述ZmTMS5-994克隆至T载体测序的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例以本生烟PDS基因作为靶向基因，说明基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统的构建与应用。

一、构建

1、通过Stu I和BamH I两个酶切位点将大麦条纹花叶病毒的三条基因组RNA分别克隆到pCB301上，产物分别称为pCB301-BSMVα，pCB301-BSMVβ和pCB301-BSMVγ。

2、所述sgRNA序列至少包含两部分，第一部分为序列5`端的所谓spacer部分，其长度在20bp左右，另一部分为所谓sgRNA骨架部分。所述骨架部分由金唯智公司合成并克隆至pENTR4-gRNA7载体上。

3、设计引物F1和R1并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F1：ATACACAAGTTGTGGTGCAAgagaccGAATTCggtctcAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

R1：ATGGGTTAGTTGTGGCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC。

以上述pENTR4-gRNA7载体为模板，利用上述F1和R1引物扩增出所述sgRNA骨架部分，并在骨架上游添加两个Bsa I酶切位点，用于后期通过Bsa I位点酶切连接插入spacer部分，骨架的下游添加7个T，同时扩增产物两端还分别包含一段大麦条纹花叶病毒载体上的同源序列，产物称为sgRNA表达骨架。

4、设计引物F2和R2并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F2：GCCACAACTAACCCATCTCC；

R2：CCACAACTTGTGTATCCCATTG。

以pCB301-BSMVβ为模板，以引物F2和R2进行反向PCR将pCB301-BSMVβ线性化，并缺失掉CP编码框的第74-393位核苷酸序列，得到的产物称为β-CP_Δ74-393。

5、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述PCR扩增得到的sgRNA表达骨架和β-CP_Δ74-393进行重组反应。得到的产物将sgRNA表达骨架连同上下游序列替换了大麦条纹花叶病毒CP第74-393位核苷酸序列(CP总长597bp，实验证明缺失CP第74-435位核苷酸，仍不会影响病毒的运动，但设计此基因编辑载体时，优选的是缺失CP的74-393位核苷酸序列，并将sgRNA表达骨架插入其中)，产物称为β-CP-gsca。

6、设计引物F3和R3并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F3：ATGGGATACACAAGTTGTGGGGTGCTTGATGCTTTGGATAAG；

R3：ccGAATTCggtctcTTGCAACCACAGTAAGTACTTGTAGTTAAG。

以pCB301-BSMVγ为模板，利用引物F3和R3，扩增出一段长度为316bp的序列，此序列包含了RNAγ的亚基因组的一段长度为277bp的亚基因组启动子(γb蛋白由sgRNAγ，即RNAγ的亚基因组RNA翻译得到，我们扩增出的这段277bp的亚基因组启动子，实际上覆盖了sgRNAγ的核心启动子，并在其上下游均做了一定长度的延伸，因而这段277bp的序列其长度并不是绝对的)，产物称为sgγP277。

7、设计引物F4和R4并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F4：TGCAAgagaccGAATTCggtc；

R4：CCACAACTTGTGTATCCCATTG。

以β-CP-gsca为模板，利用上述引物进行反向PCR，将β-CP-gsca线性化，产物称为线性化的β-CP-gsca。

8、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述sgγP277和上述线性化的β-CP-gsca进行重组反应，从而将sgγP277克隆到β-CP-gsca，得到的产物称为β-CP-gcas。

9、设计引物F5和R5并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F5：AgagaccGAATTCggtctcAG；

R5：ACATCAGGACCTAGAGTTCACC。

以上述β-CP-gcas为模板，利用上述F5和R5引物进行反向PCR，去除sgγP277的3’端一段长度为85bp的序列，经T4 PNK酶处理之后，经T4 ligase连接，得到的产物称为β-CP-Tgcas。

10、设计引物F6和R6并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F6：GACTCCATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG；

R6：GCTACTACCAAACATCAGGACCTAGAGTTC。

以上述β-CP-Tgcas为模板，利用上述引物进行反向PCR后，以NEB公司生产的T4PNK激酶处理后自连，从而将反向PCR线性化的产物环化，产物称为BSMVβ-CP-Tgcas-gNbPDS4(也可简称为β-CP-Tgcas-gNbPDS4)。

BSMVβ-CP-Tgcas-gNbPDS4已包含了一个20bp的spacer且其中包含一个Nco I酶切位点，从而在pCB301-BSMVβ上插入了完整的所谓sgRNA序列以及一段长度为277bp的sgRNAγ的亚基因组启动子。所得基因编辑载体构造如图1所示。

BSMVβ-CP-Tgcas-gNbPDS4是针对本生烟的PDS(phytoene desaturase)基因所设计的，因而20bp的spacer部分与PDS基因同源，spacer本身可以根据需要进行替换，其长度也可以调整。此外，也可以采用其他方法得到同样的克隆产物。

二、应用

1、农杆菌介导的瞬时表达所涉及的实验试剂的配制

试剂配制及接种方法参考李正刚博士学位论文(大麦条纹花叶病毒TGB1蛋白的核质穿梭及其劫持核仁蛋白fibrillarin的功能分析，李正刚，中国农业大学博士学位论文，2017)。

所用的的试剂包括：1M MES(Morpholineethanesulfonic acid，2-(N-吗啉)，乙磺酸)；50mM As(Acetosyringone，乙酰丁香酮)：1M MgCl₂。向去离子水中加入10mM MES，10mMMgCl₂，150μM As，配制得到农杆菌悬浮缓冲液。

2、以农杆菌浸润法接种本生烟：

将pCB301-BSMVα，BSMVβ-CP-Tgcas-gNbPDS4，pCB301-BSMVγ和pHSE401分别转化农杆菌EHA105。挑取活化的上述农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃摇床培养过夜；4000rpm离心10min，弃上清，用农杆菌悬浮缓冲液重悬细胞；紫外分光光度计测量悬浮液OD₆₀₀，将三种转入BSMV及其突变体的农杆菌以农杆菌悬浮缓冲液调浓度至OD₆₀₀＝0.3，将转入pHSE401的农杆菌以农杆菌悬浮缓冲液调浓度至OD₆₀₀＝0.5，混匀；将调整好浓度的农杆菌混合液于28℃培养箱孵育2～4h后，用灭菌的无针头注射器注射4-6周的本生烟叶片。

实施例2

本实施例以本生烟PDS基因作为靶标基因，说明基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统的构建与应用。

一、构建

以下步骤中涉及到的模板与实施例1相关，具体步骤如下：

1、设计引物F7和R7并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F7：AAAAAAAAAAAAATGTTTGATCAGATCATTCAAATCTGATGGTGCCCATC；

R7：TTACTTAGAAACGGAAGAAGAATCATCACATCCAACAGAAT。

以上述pCB301-BSMVγ为模板，利用引物F7和R7反向PCR线性化pCB301-BSMVγ，得到的产物称为线性化的pCB301-BSMVγ。

2、设计引物F8和R8并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F8：TCTTCTTCCGTTTCTAAGTAAGGTGCTTGATGCTTTGGATAAGGC；

R8：GAATGATCTGATCAAACATTTTTTTTTTTTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC。

以上述β-CP-gcas为模板，利用引物F8和R8进行PCR，扩增出的产物包含完整的sgRNA骨架，并且同样包含了两个相向排布的Bsa I酶切位点。得到的产物称之为sgRNA-cas。

3、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述线性化的pCB301-BSMVγ和上述sgRNA-cas进行重组反应，得到的产物称为γ-gcas。

4、设计引物F9和R9并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F9：GACTCCATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC；

R9：GCTACTACCAATTACTTAGAAACGGAAGAAGAATCATCACATC。

以上述γ-gcas为模板，利用引物F9和R9进行反向PCR后，产物经T4 PNK酶处理，再经T4 ligase酶连接，得到的产物去除了上述sgγP277序列，并包含了完整的sgRNA序列，包含的20bp的spacer和本生烟PDS基因同源。得到的产物称为pCB301-BSMVγ-gRNA-gNbPDS4(也可简称为γ-gRNA-gNbPDS4)。所得基因编辑载体构造如图2所示。

实际使用时，F9和R9可以根据需要进行设计，将spacer替换成需要的序列，从而用于编辑不同的基因和不同的靶标。

二、应用

以农杆菌浸润法接种本生烟：

将pCB301-BSMVα，pCB301-BSMVβ和pCB301-BSMVγ-gRNA-gNbPDS4转化农杆菌EHA105。挑取活化的上述农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃摇床培养过夜；4000rpm离心10min，弃上清，用农杆菌悬浮缓冲液重悬细胞；紫外分光光度计测量悬浮液OD₆₀₀，将三种转入BSMV及其突变体的农杆菌以农杆菌悬浮缓冲液调浓度至OD₆₀₀＝0.3，将转入pHSE401的农杆菌以农杆菌悬浮缓冲液调浓度至OD₆₀₀＝0.5，混匀；将调整好浓度的农杆菌混合液于28℃培养箱孵育2～4h后，用灭菌的无针头注射器注射4-6周的本生烟叶片。

实验例1

本实验例用于说明实施例1(由于对含有β链的载体进行sgRNA的整合，在附图及下文中以其中的特征载体β-CP-Tgcas-gNbPDS4代表实施例1的完整载体系统)和实施例2(由于对含有γ链的载体进行sgRNA的整合，在附图及下文中以其中的特征载体γ-gRNA-gNbPDS4代表实施例2的完整载体系统)对靶标基因(本生烟PDS基因)的编辑效果。

通过农杆菌浸润的方式接种BSMV基因编辑载体以及瞬时表达Cas9蛋白，接种BSMV及相应突变体(β-CP-Tgcas-gNbPDS4或者γ-gRNA-gNbPDS4)农杆菌的浓度为OD₆₀₀＝0.3，Cas9表达载体pHSE401的农杆菌浓度为OD₆₀₀＝0.5。接种后第4天和第7天，以CTAB法分别提取接种区域的基因组DNA，以之为模板，扩增出包含靶标位点的一段长度为544bp的DNA片段，称为NbPDS544，靶标位点包含一个Nco I酶切位点。当用Nco I对此片段进行酶切时，可以看到，相比于从健康叶片和经野生型BSMV病毒侵染的叶片所提DNA扩增的NbPDS544，经β-CP-Tgcas-gNbPDS4和γ-gRNA-gNbPDS4侵染的叶片，扩增出的NbPDS544经Nco I酶切后，出现了明显的未能切开的条带，表明靶标位置可能发生了突变(如图4所示)。

将经Nco I酶切后的NbPDS544连接到T载体上进行测序，可以看到，靶标位点发生了不同类型的突变，包括一些碱基插入，碱基缺失，碱基替换。证明靶标位点确实发生了突变，而这种突变是对照所不存在的(如图5所示)。

β-CP-Tgcas-gNbPDS4和γ-gRNA-gNbPDS4在系统叶区域对其靶标基因本生烟PDS基因的编辑效果如图8所示。对本生烟分别接种野生型的BSMV或者包含β-CP-Tgcas-gNbPDS4和γ-gRNA-gNbPDS4的基于BSMV的基因编辑载体，在本生烟系统发病之后，在系统叶片通过农杆菌浸润的方法瞬时表达Cas9蛋白，3天之后，采用CTAB法提取瞬时表达了Cas9蛋白的系统叶基因组DNA，以之为模板，扩增出包含靶标位点的一段长度为544bp的DNA片段，称为NbPDS544，靶标位点包含一个Nco I酶切位点。当用Nco I对此片段进行酶切时，可以看到，相比于从健康叶片和经野生型BSMV病毒侵染的叶片所提DNA扩增的NbPDS544，经β-CP-Tgcas-gNbPDS4和γ-gRNA-gNbPDS4侵染的叶片，扩增出的NbPDS544经Nco I酶切后，出现了明显的未能切开的条带，表明靶标位置可能发生了突变(如图6所示)。

将以系统叶所提取的基因组DNA为模板所扩增的NbPDS544连接到T载体上进行测序，可以看到，部分T载体上对应的靶标位点发生了不同类型的突变，证明这些靶标位点确实发生了编辑，而这种突变是对照组所不存在的(如图7所示)。

实施例3

本实施例以小麦TaGASR7基因和玉米ZmTMS5基因作为靶向基因，说明基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统的构建及在小麦和玉米上的应用。

一、构建

对于小麦和玉米的接种，采用的是用BSMV的体外转录产物摩擦接种小麦叶片的策略。所涉及的基础载体包括由Andrew O.Jackson教授惠赠的pT7-α_ND，pT7-β_ND，pT7-γ_ND(Petty,I.T.D.,Hunter,B.G.,Wei,N.&Jackson,A.O.(1989).Infectious barley stripemosaic virus RNA transcribed in vitro from full-length genomic cDNAclones.Virology,171,342-349)以及将pT7-β_ND中TGB1的第404位氨基酸G(甘氨酸)突变为氨基酸E(谷氨酸)得到的pT7-β_G404E。

1、设计引物F10和R10并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F10：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC；

R10：TTACTTAGAAACGGAAGAAGAATCATCACATCC。

以上述pCB301-BSMVγ-gRNA-gNbPDS4为模板，以F10和R10为引物，进行高保真PCR扩增，得到的产物称为线性化的pCB301-ge-BSγ。

2、合成一段长度为861bp的双链DNA片段，称为SmR861。此片段包含两个相向排列的Sap I酶切位点，该DNA片段的5`→3`序列为：

GGATGTGATGATTCTTCTTCCGTTTCTAAGTAACGAAGAGCatgggggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataaGCTCTTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。

3、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述线性化的线性化的pCB301-ge-BSMVγ和上述SmR861进行重组反应，得到的产物称为pCB301-ge-BSγ-SmR。

4、设计引物F11和R11并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F11：AAAAAAAAAAAAATGTTTGATCAGATCATTCAAATCTGATGGTGCCCATC；

R11(即R7)：TTACTTAGAAACGGAAGAAGAATCATCACATCCAACAGAAT。

以上述pT7-γ_ND为模板，以F11和R11为引物进行高保真PCR扩增，得到的产物称为线性化的pT7-γ_ND。

5、设计引物F12和R12并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F12：TTCTTCTTCCGTTTCTAAGTAACGAAGAGCatgggggaagcggtgat；

R12(即R8)：GAATGATCTGATCAAACATTTTTTTTTTTTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC。

以上述pCB301-ge-BSγ-SmR为模板，以F12和R12为引物进行高保真PCR扩增，得到的产物称为ge-BSγ-SmR。

6、以中美泰和公司的2×Master Assembly Mix将上述线性化的线性化的线性化的pT7-γ_ND和上述ge-BSγ-SmR进行重组反应，得到的产物称为pT7-ge-BSγ-SmR。

7、设计引物F15和R15并交由Invitrogen公司合成，引物的序列为：

F15：TAATTGTTGCCGTAGGTGCCCGG；

R15：AACCCGGGCACCTACGGCAACAA。

8、分别将F15和R15稀释至浓度为100μM。以T4 PNK处理F15和R15，50μL反应体系如下：F15 20μL，R15 20μL，10×T4 ligase buffer(NEB)5μL，ddH₂O 4μL，T4 PNK(NEB)1μL。于37℃培养箱中反应45min。

9、转移反应体系至PCR管中，在PCR仪中退火使得F15和R15自发互补配对，形成双链DNA片段，反应条件为：

95℃，5min；95℃，1min，之后每次降低1℃，并保持一分钟，直到温度降至16℃；16℃，10min。反应完成后，及时取出，置于冰上，用于下一步反应或者于-20℃保存。产物称为Oligo-TaGASR7-T1。

10、以NEB公司生产的Sap I限制性内切酶酶切上述pT7-ge-BSγ-SmR，使酶切产物终浓度为20ng/μL。产物称为Sap I线性化的pT7-ge-BSγ-SmR。

11、连接。利用NEB公司生产的T4 ligase连接Sap I线性化的pT7-ge-BSγ-SmR和Oligo-TaGASR7-T1，20μL反应体系如下：Oligo-TaGASR7-T1 10μL，10×T4 ligase buffer(NEB)2μL，Sap I线性化的pT7-ge-BSγ-SmR 1μL，ddH₂O 6μL，T4 ligase(NEB)1μL。于室温(20℃左右)连接2h以上，或者于16℃连接过夜。

12、将连接产物转化大肠杆菌JM109，经培养后，筛选阳性菌落提取质粒并测序，筛选正确的克隆，称为pT7-ge-BSγ-SmR-TaGASR7-T1。

13、将F15和R15分别替换为

F17：TAAGGTGAAGCAGAAGCTTAAGC；

R17：AACGCTTAAGCTTCTGCTTCACC；

继续完成第9至12步，得到的产物称为pT7-ge-BSγ-SmR-ZmTMS5-T2。

实验例2

本实验例用于说明实施例3对靶标基因(小麦TaGASR7基因和玉米ZmTMS5基因)的编辑效果。

体外转录并接种小麦和玉米。所用小麦品系为中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴研究员惠赠，所用玉米为中国农业大学赵海铭老师惠赠，所用小麦和玉米品系转入并表达Cas9蛋白。以Mlu I线性化pT7-ge-BSγ-SmR-TaGASR7-T1，pT7-ge-BSγ-SmR-ZmTMS5-T2和pT7-α_ND。以Spe I线性化pT7-β_ND和pT7-β_G404E。取200-400ng经线性化的质粒模板，加入6μL 5×Trans Buffer，3μL 100mM DTT，30U HPRI，2μL rNTP(A、U和C均为10mM，G为1mM)(上海生工生物)，10U T7 RNA聚合酶(Promega)，5mM Ribo m⁷G Cap Analog(Promega)，最后以DEPC-ddH2O将反应体系补足至30μL，于37℃培养箱反应3-5h后取2μL进行电泳检测，剩余体外转录物按照1：1：1混合后，加入与混合液等体积的2×FES缓冲液进行混合，用于摩擦接种二叶期的小麦叶片和玉米。

在接种的第14天，30天分别采集叶片，提取基因组DNA进行检测。

检测方法：

分别以提取的小麦和玉米叶片基因组DNA为模板，对于小麦，以引物F16：CCTTCATCCTTCAGCCATGCAT，分别配合引物R16-A：CCACTAAATGCCTATCACATACG，R16-B：AGGGCAATTCACATGCCACTGAT，R16-D：CCTCCATTTTTCCACATCTTAGTCC。

高保真PCR扩增出包含靶标位点的长度分别为560bp，569bp，582bp的DNA片段，分别称为TaGASR7-A1,TaGASR7-B1，TaGASR7-D1；这三个片段的靶标位点均包含一个Bcn I酶切位点。当用Bcn I对这些片段进行酶切时，可以看到，相比于从健康叶片所提DNA扩增的TaGASR7-A1,TaGASR7-B1，TaGASR7-D1，经pT7-ge-BSγ-SmR-TaGASR7-T1侵染的叶片，扩增出的DNA片段经Bcn I酶切后，出现了明显的未能切开的条带，表明靶标位置可能发生了突变(如图8所示)。所述TaGASR7-A1,TaGASR7-B1，TaGASR7-D1克隆至T载体测结果如图9所示。对于玉米，以引物F18:TCAAGAGACTTGCGTCATCTTCCC和R18：GCATGCTCAACTGAAATTGAGTCGTC进行高保真PCR扩增出包含靶标位点的长度为994bp的DNA片段，ZmTMS5-994；此片段的靶标位点包含一个Afl II酶切位点。当用Afl II对此片段进行酶切时，可以看到，相比于从健康叶片所提DNA扩增的ZmTMS5-994，经pT7-ge-BSγ-SmR-ZmTMS5-T2侵染的叶片，扩增出的DNA片段经Afl II酶切后，出现了明显的未能切开的条带，表明靶标位置可能发生了突变(如图10所示)。

将经Afl II酶切后的ZmTMS5-994连接到T载体上进行测序，可以看到，靶标位点发生了不同类型的突变，包括一些碱基插入，碱基缺失，碱基替换。证明靶标位点确实发生了突变，而这种突变是对照所不存在的(如图11所示)。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统

<141> 2018-04-28

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atacacaagt tgtggtgcaa gagaccgaat tcggtctcag ttttagagct agaaatagc 59

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggttagt tgtggcaaaa aaagcaccga ctcggtgcca c 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccacaacta acccatctcc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccacaacttg tgtatcccat tg 22

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggataca caagttgtgg ggtgcttgat gctttggata ag 42

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgaattcgg tctcttgcaa ccacagtaag tacttgtagt taag 44

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcaagagac cgaattcggt c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccacaacttg tgtatcccat tg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agagaccgaa ttcggtctca g 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acatcaggac ctagagttca cc 22

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gactccatgg ttttagagct agaaatagca ag 32

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctactacca aacatcagga cctagagttc 30

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaaaaaaaa aaatgtttga tcagatcatt caaatctgat ggtgcccatc 50

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttacttagaa acggaagaag aatcatcaca tccaacagaa t 41

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcttcttccg tttctaagta aggtgcttga tgctttggat aaggc 45

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaatgatctg atcaaacatt tttttttttt taaaaaaagc accgactcgg tgcc 54

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gactccatgg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggc 44

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctactacca attacttaga aacggaagaa gaatcatcac atc 43

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 35

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttacttagaa acggaagaag aatcatcaca tcc 33

<210> 21

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggatgtgatg attcttcttc cgtttctaag taacgaagag catgggggaa gcggtgatcg 60

ccgaagtatc gactcaacta tcagaggtag ttggcgtcat cgagcgccat ctcgaaccga 120

cgttgctggc cgtacatttg tacggctccg cagtggatgg cggcctgaag ccacacagtg 180

atattgattt gctggttacg gtgaccgtaa ggcttgatga aacaacgcgg cgagctttga 240

tcaacgacct tttggaaact tcggcttccc ctggagagag cgagattctc cgcgctgtag 300

aagtcaccat tgttgtgcac gacgacatca ttccgtggcg ttatccagct aagcgcgaac 360

tgcaatttgg agaatggcag cgcaatgaca ttcttgcagg tatcttcgag ccagccacga 420

tcgacattga tctggctatc ttgctgacaa aagcaagaga acatagcgtt gccttggtag 480

gtccagcggc ggaggaactc tttgatccgg ttcctgaaca ggatctattt gaggcgctaa 540

atgaaacctt aacgctatgg aactcgccgc ccgactgggc tggcgatgag cgaaatgtag 600

tgcttacgtt gtcccgcatt tggtacagcg cagtaaccgg caaaatcgcg ccgaaggatg 660

tcgctgccga ctgggcaatg gagcgcctgc cggcccagta tcagcccgtc atacttgaag 720

ctagacaggc ttatcttgga caagaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca gatcagttgg 780

aagaatttgt ccactacgtg aaaggcgaga tcaccaaggt agtcggcaaa taagctcttc 840

ggttttagag ctagaaatag c 861

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aaaaaaaaaa aaatgtttga tcagatcatt caaatctgat ggtgcccatc 50

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcttcttcc gtttctaagt aacgaagagc atgggggaag cggtgat 47

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

taaggtgaag cagaagctta agc 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aacgcttaag cttctgcttc acc 23

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcaagagact tgcgtcatct tccc 24

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcatgctcaa ctgaaattga gtcgtc 26

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

taattgttgc cgtaggtgcc cgg 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aacccgggca cctacggcaa caa 23

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccttcatcct tcagccatgc at 22

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ccactaaatg cctatcacat acg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agggcaattc acatgccact gat 23

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cctccatttt tccacatctt agtcc 25

Claims

1.一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统，其特征在于，包括分别含有大麦条纹花叶病毒RNAα、RNA β和RNAγ的人造质粒；在RNA β或RNAγ中，整合有所需的sgRNA序列。

2.根据权利要求1所述的基因编辑载体系统，其特征在于，在RNAγ中γb的5`端或3`端、或RNAβ中外壳蛋白CP编码序列的中间部分整合所需的sgRNA序列。

3.根据权利要求2所述的基因编辑载体系统，其特征在于，将sgRNA表达骨架连同上下游序列在外壳蛋白CP编码序列的第74-435bp之间的区域中进行插入或替换。

4.根据权利要求1-3任一项所述的基因编辑载体系统，其特征在于，所述人造质粒含有HDVRz核酶。

5.根据权利要求4所述的基因编辑载体系统，其特征在于，所述人造质粒包括但不限于pCB301或pCass4-Rz。

6.权利要求1-5任一项所述的基因编辑载体系统在对植物进行基因编辑中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.一种对植物进行基因编辑的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的基因编辑载体系统进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。