ES2546394T3 - Uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético - Google Patents

Uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético Download PDF

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Abstract

Un método para la creación de un elemento vegetal que codifica los duplos ARNbcl mal emparejados que cuentan con un núcleo de más de 100 nucleótidos de longitud y un bucle que no incluye un intrón, incluyendo el método los pasos de: (i) amplificación de un fragmento de ADN del gen diana; (ii) tratamiento de una fracción del fragmento de ADN del gen diana con bisulfito, causando así una mutación química arbitraria de nucleótidos de citosina a nucleótidos timina; (iii) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud; (iv) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud; y (v) ligadura del fragmento tratado y del no tratado del gen diana para que el fragmento tratado y el no tratado estén en una orientación de direcciones opuestas, respectivamente.

Description

E08709912
15-09-2015
DESCRIPCIÓN
Uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético
5 Contexto del invento
Este invento tiene que ver con el silenciamiento genético. En particular, el invento se relaciona al uso de duplos horquillados de ARN bicatenarios en el silenciamiento genético.
Se pueden usar ARN horquillados cortos (ARNhc) expresados a partir de promotores ARN Pol II y Pol III para silenciar los genes diana. Los ARNhc se expresan en el núcleo, y al igual que los microARN (miARN), se transportan al citoplasma, donde la maquinaria de interferencia por ARN (iARN) produce ARN interferentes pequeños (ARNip). Normalmente, ARNhc incluyen duplos ARN bicatenarios (ARNbc) de hasta 30 pares de base (bp) o nucleótidos, lo que limita el número de ARNip funcionales que pueden generarse a partir de la horquilla precursora.
15 Los ARNbc horquillados largos (ARNhl) y los duplos ARNbc pueden procesarse mediante la maquinaria iARN y transformarse en ARNip funcionales. Normalmente, ARNhl y los duplos ARNbc contienen al menos tres eventos de división DICER y por ello tienen entre 60bp y 66bo, e incluso más.
Es importante tener en cuenta que ARNhl son capaces de generar diferentes ARNip, y el número de los diferentes ARNip diana generados es directamente proporcional a la longitud de los duplos ARNbc (es decir, los ARNhl). Aparte de tener como meta una mayor secuencia genética, los múltiples ARNic tienen diferentes dianas al mismo tiempo, evitando la posible creación de variantes mutantes (es decir, para las secuencias de genes virales o cancerígenos) que pueden “salirse” de los efectos buscados por ARNip. La escapada mutacional es un fenómeno
25 observado con frecuencia en los estudios que usan ARNhp y ARNip contra dianas virales, y no sólo se limita a la secuencia diana, sino que también se usa en secuencias flanqueantes que afectan a las estructuras secundarias ARN locales.
Sin embargo, existen dificultades a la hora de clonar hoquillas ARNbcl. Además, los duplos largos de ARNbc usados en las células mamíferas son conocidos por activar el sistema no específico de respuesta interferón en células mamíferas (p.ej.: las vías PKR y Rnase L). Estas dificultades en la clonación y en el efecto inmuno-estimulatorio han limitado la aplicación generalizada de horquillas largas para el silenciamiento genético en las células mamíferas y en otras células. Referencia a AKASHI HIDEO ET AL: “Escape de la respuesta interferón asociada con la interferencia ARN mediante el uso de vectores que codifican horquillas largas modificadas ARN”, publicado en BIOSISTEMAS
35 MOLECULARES, SOCIEDAD REAL DE QUÍMICA, vol.1, nº 5-6, 1 de diciembre de 2005, la cual revela una metodología diseñada para evitar la respuesta interferón durante el silenciamiento genético en mamíferos, y encuentra aplicación para ARNbc. Aunque el método revelado es efectivo, hay un problema al extender la metodología enseñada en este documento para generar ARNbcl mayores de 220bp, y es que los ARNbcl, cuando se ordenan en direcciones opuestas, tienen una tendencia a formar una estructura de ADN cruciforme. Las mayores dificultades respecto a repeticiones largas directamente invertidas se encuentran en la formación de cruces cruciformes, los cuales causan inestabilidad genética. Esto puede provocar la re-organización o a la división de los elementos de ADN ya que la maquinaria de recombinación de la célula podría reconocer a los cruces cruciformes como cruces Holliday, los cuales son substratos de recombinación homóloga.
45 Resumen del invento
Según una primera encarnación del invento, se ha proporcionado un método para construir un elemento vegetal mediante la codificación de un duplo ARNbcl incompatible con un tallo de más de 100 nucleótidos de longitud y un bucle que no incluye un intrón, el método incluye los siguientes pasos:
(i)
amplificar un fragmento de AND del gen Diana;
(ii)
tratar una fracción del fragmento de AND del gen Diana con bisulfito, causando por consiguiente una mutación
química aleatoria de nucleótidos citosina a nucleótidos timina; 55
(iii) se ejecuta una RCP en un fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud;
(iv)
se ejecuta una RCP en un fragmento sin tratar para generar un fragmento sin tratar de más de 100 nucleótidos de longitud;
(v)
se ligan los fragmentos tratados a los fragmentos sin tratar del gen diana para que los fragmentos tratados y sin tratar estén ordenados unos al lado de los otros, respectivamente.
65 Puede que exista una secuencia de intervención de codificación en bucle entre el fragmento tratado y el que está sin tratar. Esta secuencia de horquilla interventora de codificación en bucle puede incluir al menos un sitio de restricción.
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El método puede incluir además el paso de clonación del elemento que codifica el duplo ARNbcl e insertarlo en el casete de expresión.
5 Según otra encarnación del invento, se proporciona un ADN polinucleótido construido de acuerdo al método de arriba, que comprende:
una secuencia sin modificar de un gen vegetal diana o una parte de la misma consistente en más de 100 nucleótidos de longitud; y
una secuencia modificada de un gen vegetal diana o una parte de la misma consistente en más de 100 nucleótidos de longitud, en la que la secuencia modificada difiere de la secuencia sin modificar en el hecho de que los nucleótidos citosinos aleatorios en la secuencia genética diana o la parte de la misma que ha sido modificada a nucleótidos timina mediante mutación bisulfita;
15 en la que tanto la secuencia modificada como la no modificada se encuentran en dirección inversa a la otra secuencia; y
en la que la secuencia ARN transcrita del ADN polinucleótido forma un duplo entre la secuencia modificada y la no modificada para que un duplo ARN bicatenario largo (ARNbcl) con un núcleo de más de 100 nucleótidos de longitud entre las secuencias modificadas y las no modificadas con desequilibrios de pares de base donde los nucleótidos se han modificado, pudiendo el duplo ARNbcl inhibir la expresión del gen diana.
Las modificaciones de nucleótidos son modificaciones de nucleótidos citosina a timina, y la proporción de 25 modificaciones de nucleótidos puede ser de uno cada cuatro a 10 nucleótidos.
Puede haber otra secuencia de nucleótidos entre las secuencias modificadas y las complementarias, formando dicha secuencia de nucleótidos un bucle de horquilla en la secuencia ARN entre las secuencias modificadas y las complementarias.
El gen diana puede seleccionarse a partir del grupo formado por genes metazoarios, vegetales y virales. Los genes metazoarios pueden contener genes de mamíferos, de insectos y nematodos. EN particular, el gen diana puede ser un gen BC1 o AC1 del mosaico vírico de la yuca sudafricana (SACMV).
35 Cuando el gen diana es el gen SACMV BC1, la secuencia modificada puede contener la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 13, 16, 17 o 18, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma; y el fragmento complementario puede contener una secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 14, 15, 19 o 20, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma. Por ejemplo, el polinucleótido puede incluir la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21.
Cuando el gen diana es el gen SACMV AC1, la secuencia modificada puede contener la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 33, 34, 35, 38, 39 o 40, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma; y la secuencia complementaria puede contener una secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 36, 37, 41 o 42, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma. Por
45 ejemplo, el polinucleótido puede incluir la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 53.
Las secuencias modificadas y complementarias pueden consistir en más de 60 nucleótidos.
Las secuencias modificadas y complementarias pueden consistir en más de 80 nucleótidos.
Las secuencias modificadas y complementarias pueden consistir en más de 100 nucleótidos.
La amplificación de cadena específica puede usarse para amplificar las secuencias modificadas y complementarias, de forma que se asegure de que la cadena correcta del gen diana se amplifica.
55 Aquí también se discute un ARN polinucleótido que corresponde al ADN polinucleótido descrito arriba.
Las modificaciones de nucleótidos en la secuencia modificada son modificaciones de citosina a uracilo, de forma que las discordancias de pares de base son discordancias G:U.
La secuencia modificada puede estar expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 27, 28 o 29, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma; y la secuencia complementaria puede estar expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 25, 26, 30 o 31, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma. Por ejemplo, el ARN polinucleótido puede incluir la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 32.
65 La secuencia modificada puede estar expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 44, 45, 48, 49 o 50, o una
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secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma; y la secuencia complementaria puede estar expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 46, 47, 51 o 52, o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma. Por ejemplo, el ARN polinucleótido puede incluir la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 54.
5 Aquí también se discute un duplo ARN bicatenario (ARNbcl) que inhiba la expresión del gen diana. El duplo ARNbcl comprende:
una secuencia modificada del gen diana o de parte del mismo, donde todo o una porción substancial de cualquier tipo de nucleótido en la secuencia de gen diana o de parte de la misma ha sido químicamente modificada a otro tipo de nucleótido; y
una secuencia complementaria de un gen diana sin modificar o de parte del mismo;
en el que los nucleótidos de las secuencias modificadas o complementarias del duplo ARNbcl con pares de base 15 desiguales han sido modificados.
Los ARNbcl pueden describirse substancialmente como se describe arriba, o formarse a partir del ADN o ARN polinucleótido descrito arriba.
Según a otra encarnación del invento, se ha proporcionado un vector de ácido nucleico que incluye una casete de expresión que cuenta con el ADN polinucleótido descrito arriba.
El casete de expresión puede incluir un impulsor ARN Pol II o un ARN Pol III. La expresión de casete puede incluir también una señal de terminación que es una señal de terminación ARN Pol II o ARN Pol III.
25 Aquí también se discute un método de construir un elemento que codifique un duplo ARNbcl, y el método incluye:
(i)
RCP aislando un fragmento codificador de un gen diana para obtener un producto RCP sin tratar;
(ii)
el tratamiento de al menos una fracción de producto RCP sin tratar con un mutágeno químico, así mismo causando la mutación química de nucleótidos de un tipo de nucleótidos de otro tipo para obtener un producto RCP tratado;
(iii) llevar a cabo RCP en el producto RCP tratado para producir una secuencia de nucleótido con una proporción de 35 nucleótidos desiguales en comparación con el producto RCP sin tratar;
(iv)
llevar a cabo RCP en el producto RCP sin tratar; y
(v)
organizar el producto RCP a partir de (iii) codificando una cadena homosentido y el producto RCP sin tratar a partir de (iv) codificando una cadena antisentido para que el producto RCP tratado y el producto RCP sin tratar estén en sentido inverso respecto a cada uno.
El aislamiento del RCP puede hacerse mediante un RCP de cadena específica.
45 El paso (ii) incluye el sometimiento del producto RCP a un mutágeno químico bisulfito, normalmente causante de una mutación química de citosinas no metiladas a timinas, y produciendo una secuencia nucleótida con mutaciones de citosina a uracilo en el paso (iii).
Según otra encarnación del invento, se ha proporcionado un método de silenciamiento del gen diana en un vegetal. El método incluye los siguientes pasos:
construir un elemento de acuerdo al método descrito arriba;
introducir un casete de expresión que incluya el elemento descrito arriba en el vegetal; y
55 hacer que el casete de expresión exprese una secuencia ARN codificada mediante el elemento que silencia el gen diana.
EL ADN o ARN polinucleótido o el iARNbc descrito arriba puede usarse para silenciar el gen diana.
EL ADN o ARN polinucleótido descrito arriba puede usarse en el método de fabricación de una composición que se use en un método de silenciamiento de un gen diana en un sujeto metazoario o vegetal.
Breve descripción de los dibujos
65 Ahora se describirá el invento en más detalle mediante el uso de ejemplos, y con referencia a los dibujos que
acompañan este documento, en los que:
La Figura 1 es una ilustración esquemática del procedimiento de generación de ARN de horquillas largas (ARNhl), que incluyen cambios de secuencia homosentido para producir desigualdades G:U en el duplo ARNbc. Los cebadores RCP se indican como P1-P6 y los sitios de digestión de enzimas de restricción se indican como RE1-RE3.
La Figura 2 muestra un flujo de trabajo y una metodología para la construcción de casetes simultáneos para el gen BC1 de SACMV. La metodología se aplicó a la construcción de un casete simultáneo para el gen AC1 de SACMV. Se aplican las variaciones en los sitios de encimas de restricción.
La Figura 3 muestra los genomas SACMV ADN A y SACMV ADN B.
La Figura 4 muestra el genoma MSV
La Figura 5A muestra un 1.2% electroforesis en gel de agarosa de productos RCP BC1 y MSV AC1. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 3: Producto RCP BC1. Línea 4: Producto RCP MSV AC1.
La Figura 5B muestra un 1.2% electroforesis en gel de agarosa de producto RCP SACMV AC1. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 2: Producto RCP MSV AC1.
La Figura 6A muestra un 1.2% electroforesis en gel de agarosa de sodio tratado con bisulfito y fragmentos no tratados de BC1 y MSV AC1. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 3: BC1 tratado, 5 min, con cebadores BC1 modificados. Línea 4: BC1 tratado 10 min con cebadores BC1 modificados. Línea 5: BC1 tratado 15 min, con cebadores BC1 modificados. Línea 6: BC1 tratado 2.5 horas con cebadores BC1 modificados. Líneas 7-8: Controles H2O. Línea 9: BC1 tratado, 5 min, con cebadores BC1 no modificados. Línea 9: BC1 tratado, 5 min, con cebadores BC1 no modificados, Línea 10: BC1 tratado 10 min con cebadores BC1 no modificados. Línea 11: BC1 tratado 15 min, con cebadores BC1 no modificados. Línea 12: BC1 tratado 2.5 horas con cebadores BC1 no modificados. Líneas 13: Controles H2O. Línea 17: BC1 no tratado con cebadores modificados Línea 18: Control H2O. Línea 20: BC1 no tratado con cebadores no modificados. Línea 21: Control H2O. Línea 24: MSV AC1 tratado 2.5 horas con cebadores modificados. Línea 25: Control H2O. Línea 27: MSV AC1 tratado 2.5 horas con cebadores no modificados. Línea 28: Control H2O. Línea 30: MSV AC1 no tratado con cebadores modificados. Línea 31: Control H2O. Línea 33: MSV AC1 no tratado con cebadores no modificados. Línea 34: Control H2O.
La Figura 6Bb muestra un 1.2% electroforesis en gel de agarosa de sodio tratado con bisulfito y fragmentos no tratados de SACMV AC1. Línea 1: AC1 tratados 2.5 horas con cebadores AC1 modificados. Línea 2: AC1 no tratados con cebadores AC1 modificados. Línea 3: AC1 tratados 2.5 horas con cebadores AC1 no modificados. Línea 4: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 5: Control H2O con cebadores AC1 modificados. Línea 6: Control H2O con cebadores AC1 no modificados.
La Figura 7 muestra un pTZ57R plásmido que contiene insertos BC1 o MSV AC1 en las orientaciones requeridas. Este diagrama se usó como base para la evaluación del posicionamiento.
La Figura 8A muestra un 1.5% electroforesis en gel de agarosa de clones sin tratar de BC1. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 3-8: Digestión de Clones E26 a E21 y Hinc II para la evaluación del posicionamiento. Líneas 10-15: Digestión de Clones E26 a E21 EcoRi y Pstl para la evaluación de los insertos.
La Figura 8B muestra un 1.5% electroforesis en gel de agarosa de un clon no tratado de MSV AC1. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 3: Digestión de Clon G3 EcoRI y Xhol para la evaluación del posicionamiento.
La Figura 8C muestra un 1.5% electroforesis en gel de agarosa de un clon no tratado de pTZ-SACMV AC1. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 2: Digestión de Clon EcoRI y Bglll para la evaluación del posicionamiento.
La Figura 9A muestra un 1% electroforesis en gel de agarosa de digestión de Clones B4 y E22. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 3-4: Digestión de Clones B4 (BC1 tratado con bisulfito de sodio) con Scal y Bglll. Línea 6-7: Digestión de Clon E22 (BC1 no tratado) con Scal y BamHl.
La Figura 9B muestra un 1% electroforesis en gel de agarosa de Digestión de Clones F3 y G3. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Líneas 3 y 4: Digestión de Clon G3 (MSV AC1 no tratado) con Scal y BamHl. Línea 6
7: Digestión de Clon E22 (MSV AC1 tratado con bisulfito de sodio) con Scal y Bglll.
La Figura 9C muestra un 1% electroforesis en gel de agarosa de un clon pTZ-SACMV AC1. Línea 1 y 3: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 2: Digestión de Clon AC1 tratado con Scal y Bglll. Línea 4: Digestión de Clon AC1 no tratado con Scal y BamHl.
La Figura 10A muestra un 1% electroforesis en gel de agarosa de clones BC1 hp. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder
Plus (Fermentas). Líneas 3-7: Clones BC1 hp 8 – 4 cortados con Xhol y Xbal. La Figura 10B muestra un 1% electroforesis en gel de agarosa de clones MSV AC1 hp. Línea 1: O’Generuler 1kb Ladder Plus (Fermentas). Línea 3-7: Clones MSV hp 1 – 6 cortados con Xhol y Sall.
La Figura 10C muestra un 1% electroforesis en gel de agarosa de clon pTZ-SACMV AC1 hp. Línea 1: O’Generuler
1kb Ladder Plus (Fermentas). Líneas 2: Clon pTZ-SACMV AC1 hp cortado con Pst1.
La Figura 11 muestra un plásmido pTZ57R que contiene un inserto doble en una posición simultánea.
La Figura 12A muestra la secuencia BC1 ORF y la secuencia MSV AC1 ORF con el área diana resaltada.
La Figura 12B muestra la secuencia SACMV AC1 ORF con el área diana resaltada.
La Figura 13 muestra la secuencia SACMV AC1 con el área diana indicada.
La Figura 14 muestra la secuencia SACMV BC1 invertida.
La Figura 15 muestra la secuencia MSV BC1 invertida.
La Figura 16 muestra la secuencia de gen diana SACMV BC1
La Figura 17 muestra la región de gen diana SACMV BC1
La Figura 18 muestra la región de gen diana SACMV BC1 modificado (es decir, una modificación C a G).
La Figura 19 muestra el complemento de la secuencia de gen diana SACMV BC1.
La Figura 20 muestra únicamente el complemento la región de gen diana SACMV BC1.
La Figura 21 muestra la secuencia de gen diana SACMV BC1 al revés.
La Figura 22 muestra la región de gen diana SACMV BC1 al revés.
La Figura 23 muestra la región de gen diana SACMV BC1 modificado al revés.
La Figura 24 muestra el complemento inverso de la secuencia de gen diana del gen SACMV BC1.
La Figura 25 muestra el complemento inverso de la región de gen diana del gen SACMV BC1
La Figura 26 muestra la secuencia de horquilla SACMV BC1.
La Figura 27 muestra la secuencia ARN del gen diana SACMV BC1.
La Figura 28 muestra la secuencia ARN de la región de gen diana SACMV BC1.
La Figura 29 muestra la secuencia ARN de la región de gen diana SACMV BC1 modificado.
La Figura 30 muestra la secuencia ARN del gen diana SACMV BC1 complementario.
La Figura 31 muestra la secuencia ARN de la región diana SACMV BC1 complementaria.
La Figura 32 muestra la secuencia ARN del gen diana SACMV BC1 inverso.
La Figura 33 muestra la secuencia ARN de la región diana SACMV BC1 a la inversa.
La Figura 34 muestra la secuencia ARN de la región diana modificada SACMV BC1 a la inversa.
La Figura 35 muestra la secuencia ARN del complemento inverso del gen diana SACMV BC1.
La Figura 36 muestra la secuencia ARN del complemento inverso de la región del gen diana SACMV BC1.
La Figura 37 muestra la secuencia ARN de la horquilla SACMV BC1.
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La Figura 38 muestra la secuencia del gen diana SACMV AC1. La Figura 39 muestra únicamente la región del gen diana SACMV AC1.
5 La Figura 40 muestra la región de gen diana SACMV AC1 modificado (es decir, una modificación C a G). La Figura 41 muestra el complemento de la secuencia de gen diana SACMV AC1. La Figura 42 muestra únicamente el complemento la región de gen diana SACMV AC1.
10
La Figura 43 muestra la secuencia de gen diana SACMV AC1 a la inversa. La Figura 44 muestra la región de gen diana SACMV AC1 a la inversa.
15 La Figura 45 muestra la región de gen diana SACMV AC1 modificado a la inversa. La Figura 46 muestra el complemento inverso de la secuencia de gen diana del gen SACMV AC1. La Figura 47 muestra el complemento inverso de la región de gen diana del gen SACMV AC1.
20
La Figura 48 muestra la secuencia ARN del gen diana SACMV AC1. La Figura 49 muestra la secuencia ARN de la región de gen diana SACMV AC1.
25 La Figura 50 muestra la secuencia ARN de la región de gen diana SACMV AC1 modificado. La Figura 51 muestra la secuencia ARN del gen diana SACMV AC1 complementario. La Figura 52 muestra la secuencia ARN de la región diana SACMV AC1 complementaria.
30
La Figura 53 muestra la secuencia ARN del gen diana SACMV AC1 a la inversa. La Figura 54 muestra la secuencia ARN de la región diana SACMV AC1 a la inversa.
35 La Figura 55 muestra la secuencia ARN de la región diana modificada SACMV AC1 a la inversa. La Figura 56 muestra la secuencia ARN del complemento inverso del gen diana SACMV AC1. La Figura 57 muestra la secuencia ARN del complemento inverso de la región del gen diana SACMV AC1.
40
La Figura 58 muestra la secuencia del gen diana MSV AC1. La Figura 59 muestra sólo la región del gen diana MSV AC1.
45 La Figura 60 muestra la región de gen diana MSV AC1 modificado (es decir, una modificación C a G). La Figura 61 muestra el complemento de la secuencia de gen diana MSV AC1. La Figura 62 muestra únicamente el complemento la región de gen diana MSV AC1.
50
La Figura 63 muestra la secuencia de gen diana MSV AC1 a la inversa. La Figura 64 muestra la región de gen diana MSV AC1 a la inversa.
55 La Figura 65 muestra la región de gen diana MSV AC1 modificado a la inversa. La Figura 66 muestra el complemento inverso de la secuencia de gen diana del gen MSV AC1. La Figura 67 muestra el complemento inverso de la región de gen diana del gen MSV AC1.
60
La Figura 68 muestra la secuencia de horquilla MSV AC1. La Figura 69 muestra la secuencia ARN del gen diana MSV AC1. 65 La Figura 70 muestra la secuencia ARN de la región de gen diana MSV AC1.
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La Figura 71 muestra la secuencia ARN de la región de gen diana MSV AC1 modificado.
La Figura 72 muestra la secuencia ARN del gen diana MSV AC1 complementario.
5 La Figura 73 muestra la secuencia ARN de la región diana MSV AC1 complementaria.
La Figura 74 muestra la secuencia ARN del gen diana MSV AC1 a la inversa.
La Figura 75 muestra la secuencia ARN de la región diana MSV AC1 a la inversa.
La Figura 76 muestra la secuencia ARN de la región diana modificada MSV AC1 a la inversa.
La Figura 77 muestra la secuencia ARN del complemento inverso del gen diana MSV AC1.
15 La Figura 78 muestra la secuencia ARN del complemento inverso de la región del gen diana MSV AC1.
La Figura 79 muestra la secuencia ARN de la horquilla MSV AC1.
La Figura 80 muestra la secuencia de horquilla SACMV AC1.
La Figura 81 muestra la secuencia ARN de la horquilla SACMV AC1.
Descripción detallada del invento
25 Aquí describimos los duplos ARN bicatenarios largos (ARNbcl) que se han emparejado mal con pares de base.
Aunque se conozcan los duplos ARNbcl, existe en la actualidad una limitación respecto a la capacidad de producir réplicas invertidas directas. Se usan tecnologías actuales, como los elementos de horquillas con uniones de estrones, ya que son más estable que las réplicas invertidas, aunque pueden ser menos efectivas. Los casetes de ADN para la expresión de horquillas ARN con una longitud de entre 20bp y 65bp incluyen el uso de oligonucleótidos sintéticos para compensar el casete ADN. Sin embargo, este enfoque limita gravemente el tamaño de la expresada horquilla ARN larga que puede producirse.
La complementariedad de las secuencias RCP amplificadas de nucleótidos obstaculiza un enfoque alternativo para
35 generar ARNhl mediante RCP de los fragmentos diana deseados y después la clonación, al compensar el núcleo de la horquilla ARN, resultando en estructuras cruciformes difíciles de clonar. Un método para evitar la formación de estas estructuras es el uso de bucles largos de intrones entre las secuencias madre de nucleótidos, las cuales están unidas fuera de la transcripción ARN después de la transcripción, dejando el duplo ARNbc.
El método del presente invento prevé la utilización de secuencias RCP amplificadas de nucleótidos para compensar el núcleo de la horquilla ARN que contiene bases mal emparejadas, con una media de cada 4 a 6 o 10 pares de base, aunque esto dependerá del contenido C.T del ADN y la duración y condición bajo la cual se trata químicamente el ADN. Estas bases mal emparejadas se introducen generalmente en la cadena homosentido, asegurando que sea menos propicia la formación de estructuras cruciformes, aunque dejando a la secuencia diana
45 la cadena antisentido con identidad de secuencia, asegurando que pueda suceder así la inhibición ARNl de la expresión del gen diana.
Los duplos ARNbcl descritos aquí pueden usarse en células mamíferas sin estimulación de la respuesta interferón no-específica.
Las bases mal emparejadas del duplo ARNbcl son normalmente desajustes G:U, aunque cualquier emparejamiento no-Watson – Crick que incluya titubeo (es decir, donde el par de base mal emparejado es menos estable que en la unión convencional A:U o G:C), puede también usarse como pares de base púricos o piramidina – purina o piramidino. Los desajustes se producen a partir de la modificación o substitución de algunos de los nucleótidos en el
55 duplo ARNbcl, como mediante la modificación de citosina a uracil (los pares de base GU son aparentemente más estables que los pares de base UG. La estabilidad de los pares de base UG es igual a la estabilidad de los pares de base AU/UA. Los pares de base GU son más estables que los pares de base GC/CG).
Es importante tener en cuenta que todos estos maridajes son posibles, aunque causen una mayor distorsión de la estructura de la horquilla ARN debido a sus diferentes niveles de estabilidad. (Glese, M.R., Betschart, K., Dale, T., Riley, C.K., Rowan, C., Sprouse, K.J., Serra, M.J. 1998. Stability of ARN Hairpins Closed by Wobble Base Pairs. Biochemistry 37: 1094-1100). En los ejemplos específicos de abajo, las bases mal emparejadas en el duplo ARNbcl se producen por mutación química de la cadena homosentido amplificada por RCP del duplo ARNbcl con bisulfito de sodio, aunque aquellos que sepan y tengan la habilidad de hacerlo, pueden usar otros métodos de modificación de 65 ácido nucleico para generar bases mal emparejadas que tengan un bisulfito conocido. El bisulfito de sodio modifica las citosinas no metiladas a timosinas para que, a partir de la transcripción, la secuencia de nucleótidos mal
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emparejada incluya mutaciones de citosina a uracilo. Es también posible sintetizar completamente un fragmento de nucleótidos que expresen el duplo ARNbcl de tal forma que haya bases mal emparejadas en la cadena de homosentido.
5 Las mutaciones C a T se optimizaron para conseguir una estabilidad máxima, pero no las mutaciones G a A, mediante el uso de cebadores RCP específicos de cadena.
El gen diana puede seleccionarse a partir de cualquier organismo. Además, los duplos ARNbcl pueden usarse para desactivar en los genes los agentes patógenos que infectan a estos organismos, como bacterias y virus. Por
10 ejemplo, se han usado ARNip en la inhibición de un buen número de patógenos en genes, incluyendo el virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH), el virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatistis B (HBV) y el virus de la gripe. Además, los ARNip han sido examinados para la inhibición de oncogenes en el tratamiento del cáncer al igual que contra elementos transponibles, elementos rebeldes y genes contagiosos.
15 Pueden crearse plantas transgénicas para expresar los duplos ARNbcl que inhiben a expresión de los genes patógenos mediante la creación de una planta resistente a dicho patógeno, por ejemplo mediante la selección de genes a partir del mosaico vírico de la yuca (p.ej.: BC1) o el virus del estriado del maíz (p.ej.: AC1). La planta puede también ser capaz de generar una progenie transgénica resistente al patógeno. Es también posible diseñar una expresión de tejido específico, como en las hojas de la planta, para que el duplo ARNbc se exprese sólo localmente.
20 Los elementos silenciadores pueden también expresarse de forma transitoria.
La inactivación de genes en varios organismos mediante ARNbcl puede producir fenotipos nuevos que pueden usarse para uso comercial o para investigación científica.
25 Los genes diana deberían seleccionarse de forma que no tengan identidad de secuencia que alberguen genes que no requieran silenciarse. Aunque pueda seleccionarse todo el gen, es también posible usar sólo una parte del gen diana para generar duplos ARN bicatenarios, como una región del gen diana que se conserva entre diferentes tensiones o variantes de los organismos a seleccionar, limitando así el efecto del escape mutacional de ARNip. No se requiere que haya identidad de secuencia al 100% con respecto a la secuencia diana para la cadena antisentido
30 del duplo ARN bicatenario para generar ARNip que funcione. Normalmente, las secuencias con alrededor del 95%, será suficiente 90% o incluso un 80% de identidad de secuencia para que el ARNip generado se una e inicie el silenciamiento de la secuencia diana. El duplo ARN bicatenario debe generarse a partir de una marco de lectura abierto, preferiblemente un exón. En los ejemplos específicos de abajo, la región diana fue seleccionada en base a estos requisitos preferidos.
35 La habilidad para generar ARNip múltiples a partir de un duplo individual de ARN bicatenario largo contempla la posibilidad de seleccionar al mismo tiempo diferentes lugares, evitando la posible generación de variantes mutantes (es decir, secuencias genéticas virales o cancerígenas) que pudieran “escaparse” de los efectos diana de ARNip.
40 La longitud de los fragmentos de nucleótidos que conforman el núcleo del duplo ATN bicatenario largo puede ser de 60 nucleótidos, preferiblemente de 80 o mayor de 100 nucleótidos, y puede incluso ser tan larog como sea posible para la amplificación RCP de un fragmento de nucleótido. En la actualidad, el tamaño máximo normal es de aproximadamente 9000 bp de longitud, aunque en la actualidad resulta económicamente prohibitivo sintetizar completamente nucleótidos que puedan clonarse para expresar los duplos ARN bicatenarios largo, se está
45 reduciendo el coste de la sintetización de ADN y es posible que este método pueda usarse como alternativa a la amplificación RCP de los fragmentos de genes diana.
Aunque en los ejemplos específicos hay una secuencia de codificación en bucle entre los fragmentos de nucleótidos que conforman el elemento simultáneo de 6 bp a 10 bp, la longitud de la secuencia bucle no resulta material para la 50 transcripción de o la función del duplo ARN bicatenario largo. Como se ha indicado más arriba, la secuencia bucle puede ser de unos 1000 bp, como en el caso de intrón, pero es también posible que no se incluya ninguna secuencia de bucle, o que dicha secuencia de bucle no se incluya en el intrón (es decir, puede incluir uno o más lugares de restricción). Allá donde una transcripción ARN que contenga fragmentos nucleótidos complementarios que pueda formar un núcleo se exprese sin una secuencia de bucle incluida, se formará de forma natural un bucle
55 de base cuatro.
Los ejemplos específicos proporcionados para la amplificación RCP de una parte seleccionada del gen diana, seguida por el tratamiento de una porción del producto RCP generado con bisulfito, producen el producto RCP modificado con desajustes de pares de base comparado con el producto no modificado.
60 Estos fragmentos modificados y no modificados se clonan en un vector disponible comercialmente estándar, de forma que los fragmentos se disponen unos al lado de los otros o de cabo a rabo con finales de 3’ o 5’, respectivamente. El elemento clonado con disposición contigua puede amplificarse mediante amplificación plásmida típica. También es posible clonar estos productos en vectores alternativos conocidos por aquellos versados en este
65 arte, como vectores cósmidos o bacteriófagos.
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También es posible aislar y mutar estos fragmentos a partir de digestión restrictiva y no amplificada.
El vector en el que se clona la disposición simultánea contiene una secuencia promotora y terminadora operativamente enlazada a la disposición simultánea en los ejemplos específicos, formando así un casete de 5 expresión para transcribir los duplos de ARN bicatenario largo en la célula huésped.
El promotor CaMV 35S, que se trata de un promotor Pol II, y es el promotor más ampliamente usado en los estudios de transformación de plantas se usó para las plantas de este estudio. Se ha demostrado que el promotor CaMV 35S funciona mejor en plantas dicotiledóneas que con las monocotiledóneas. Un ejemplo de otro promotor Pol II usado en la transformación de plantas es el promotor ubiquitina de arroz, que dota de mejor expresión a las platas monocotiledóneas (Wang, J., Oard, J.H., Promotores de ubiquitina de arroz: análisis de supresión y utilidad potencial en los sistemas de transformación de plantas. Informes de Células Vegetales 22: 129-234). El terminador usado en este estudio es la octopina sintasa (OCS). Lamentablemente, los elementos terminadores están caracterizados y entendidos de forma muy endeble de momento, por lo que se usa todo el gen OCS para asegurar una terminación y
15 un procesamiento adecuado. Los promotores y terminadores Pol III se han usado también para la expresión de miARN artificial en plantas (Qu, J., Ye, J., Fang, R. 2007. Artificial MicroARN-mediated virus resistance in plants. Journal of Virology 81: 6690-6690). Pueden usarse promotores alternativos conocidos por aquellos versados en la materia para la expresión de trascripciones ARN. El vector podría incluir también más elementos para la selección, como genes de resistencia antibiótica (p.ej.: kanamicina) o proyecciones azul-blanquecinas (p.ej.: gen Galactosidasa-β).
Una vez se han generado los casetes de expresión que codifican el duplo ARN bicatenario largo de acuerdo al invento, pueden introducirse dentro del sujeto seleccionado para silenciar el gen diana de interés. Como se indicó arriba, el sujeto puede ser cualquier organismo o parte de organismo en el que el proceso ARNl funciona para
25 silenciar la expresión del gen diana.
El casete de expresión puede introducirse en el sujeto mediante métodos variables de introducción conocidos por aquellos versados en la materia, dependiendo del organismo a tratar. Por ejemplo, en las plantas se puede introducir el casete de expresión dentro de la planta con el uso de Agrobacterium transformados con una expresión plásmida el duplo ARN bicatenario largo, o los plásmidos que expresan el duplo ARN bicatenario largo pueden revestirse con partículas de oro y bombardearse en partes de la planta, como las hojas. Estas pueden entonces propagarse en nuevas plantas a partir de callos de hojas, puede permitirse la expresión ARN bicatenaria larga para que ocurra in situ en las hojas.
35 En células de animales, los casetes de expresión pueden transformarse en células en cultivos de tejidos permitiendo la expresión de la transcripción ARN bicatenaria larga, o pueden introducirse in vivo en animales u órganos específicos de animales. Hay muchos método conocidos para la introducción de vectores de expresión en células animales en cultivos de tejidos (p.ej.: transfección CaCI2 y transfección liposoma) al igual que en animales (p.ej.: bombardeo de capa-plásmida de oro, inmunización mediante pistola de aire o inyección) y todas pueden usarse para la introducción del casete de expresión que expresa el duplo ARN bicatenario largo.
El casete de expresión, una vez introducido en la célula huésped, contempla la transcripción del duplo ARN bicatenario largo que se procesa mediante maquinaria de células ARNi en múltiples ARNip que seleccionan y silencian el gen diana. En el caso de los ejemplos específicos, el ARNip generado se selecciona en el gen BC1 del
45 virus mosaico de la yuca, o a la expresión inhibidora del gen AC1 del virus de maíz estriado.
El presente invento se describe con más detalle en los siguientes ejemplos. Dichos ejemplos, sin embargo, no deben interpretarse como limitantes en absoluto el alcance del invento.
Ejemplos
La metodología aquí descrita describe la clonación de una región específica de BC1 ORF de SACMV y una región específica del AC1 ORF de MSV de forma que los fragmentos idénticos se clonan de forma adyacente con orientación de direcciones opuestas (vea la Figura 1). La clonación se facilita mediante el tratamiento de uno de los
55 fragmentos con bisulfito de sodio antes de la re-amplificación y sub-clonación en una orientación de direcciones opuestas para expresar el duplo ARN bicatenario largo. El duplo ARN bicatenario largo es capaz de ser reconocido por las vías iARN para la respectiva inactivación de SACMV (vea la Figura 2) y MSV en plantas infectadas.
Ejemplo 1
1.1 Selección del Virus Mosaico de la Yuca Sudafricana (SACMV)
Los cebadores RCP se diseñaron para amplificar una región 222bp de BC1 ORF (SEQ ID NO: 1) en el componente ADN B del virus mosaico de la yuca sudafricana (Figuras 3 y 12). Los códigos BC1 para una proteína de movimiento
65 a larga distancia que permite que la infección SACMV se esparza sistemáticamente por toda la planta.
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1.2 Selección del Virus del maíz espigado (MSV)
Los cebadores RCP se diseñaron para amplificar una región 246 bp de réplica MSV de proteína A asociada (MSV AC1) (SEQ ID NO:2) (Figuras 4 y 12). Esta proteína se requiere para la réplica de MSV. 5 Ejemplo 2
2.1 Amplificación RCP de secuencias diana
Para la amplificación BC1, se usaron 400nmol de cebadores RCP BC1 F (no mod) 5’ AAACATTCCACGGACATACG 3’ (SEQ ID NO: 3) y BC1 R (no mod) 5’ TGGTAGCCCAATCTGAGACCTT 3‘ (SEQ ID NO: 4) con 15.4ng de plantilla de ADN de SACMV ADN-B. Para la amplificación de MSV AC1, se usaron 400nmol de cebadores RCP MSV AC1 F (no mod) 5’ AGAGCTCCCCTTTGATTGG 3’ (SEQ ID NO: 5) y MSV AC1 R (no mod) 5‘ TCCATCCATTGGAGGTCAGAAAT 3’ (SEQ ID NO: 6) con 23.28ng plantilla de ADN de MSV. Se usó el sistema
15 Triplemaster de Alta Fidelidad (Eppendorf) con polimerasa dirigida por ADN según las recomendaciones de los fabricantes. Las reacciones se ciclaron en un termociclador Eppendorf a 95oC durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 95oC durante 15 segundos. Se dio un paso de extensión final de 72oC durante 20 minutos para permitir la incorporación de coberturas 3` A al producto RCP. Se produjeron productos RCP con los tamaños esperados (Figura 5). Los productos RCp se purificaron mediante el uso de un Equipo de Purificación de Producto RCP de alta pureza (Roche)
2.2 Modificación de productos RCP con bisulfito de sodio
La depuración de los residuos de citosina en los productos RCP se consiguió mediante la aplicación de un
25 tratamiento de bisulfito de sodio en el equipo de Metilación-oro de EZ ADN (Zymo Research) a 120ng BC1, y 360ng en productos MSV AC1 RCP respectivamente. Las reacciones se establecieron de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Las muestras se colocaron en un termociclador por 10 minutos a 98oC para desnaturalizar el ADN bicatenario, y después se sometieron a un proceso de metilación a 64oC. Los productos BC1 RCP se depuraron en 4 puntos de tiempo diferentes: 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos y 2.5 horas. Los productos MSV AC1 RCP se sometieron a un proceso de metilación por sólo 2.5 horas, como recomienda el fabricante.
2.3 Amplificación RCP de plantillas bisulfito de sodio tratado y de ADN sin tratar.
Los fragmentos BC1 de bisulfito de sodio tratado se amplificaron mediante el uso de cebadores oligonucleótidos
35 originales BC1 F (no mod) y BC1 R (no mod), al igual que el uso de un segundo conjunto de cebadores modificados: BC1 F (mod-Xhol+Spel) 5’ GATCCTCGAGACTAGTAAATATTCTACGGACATACG 3‘ (SEQ ID NO: 7) y BC1 R (mod
– bglll) 5’ GATCAGATCTTAGTAGCCCAATCTAAGACCTTGT 3’ (SEQ ID NO: 8). Estos cebadores se diseñaron para unirse preferiblemente a la cadena positiva de la plantilla de ADN modificado, al igual que facilita pasos de clonación direccional futuros mediante la introducción de restricción de lugares de endonucleasa en los extremos 3` y 5` del producto RCP. Los fragmentos MSV AC1 de bisulfito de sodio tratado se amplificaron de forma similar mediante el uso de cebadores originales MSV AC1 F (no mod) y MSV AC1 R (no mod), a cebadores modificados: MSV AC1 F (Mod + Spel) 5’ GATCACTAGTAGAGTTCTCC TTTGATTGG 3’ (SEQ ID NO: 9) y MSV AC1 R (Mod + BglII +BclI) 5‘ CTAGAGATCTTGATCATCCATCCATTAGAGATCAGAAAT 3’ (SEQ ID NO: 10). La amplificación RCP se realizó de la forma descrita en 2.1.
45 Se observó que los cebadores modificados al igual que los cebadores originales eran capaces de amplificar de forma eficiente tanto el bisulfito de sodio tratado como los fragmentos BC1 y MSV AC1 no tratados (Figura 6).
Ejemplo 3
3.1 Clonación de productos RCP
Los productos RCP tratados se purificaron mediante el uso de un equipo de Purificación de Producto RCP de gran pureza (Roche) y se clonó en pTZ57R (Fermentas) mediante el uso del equipo de clonación InsT/A Clone de
55 producto RCP (Fermentas). Las reacciones se establecieron tal y como recomienda el fabricante; se añadieron 39.96ng (extremos de +/-0.54pmol) del producto BC1 RCP (Bisulfito de sodio tratado y no tratado, respectivamente) se añadieron a 165ng lineal pTZ57R (extremos de 0.54pmol) y 44.28ng (extremos de 0.54pmol) del producto MSV AC1 RCP (bisulfito de sodio tratado y no tratado, respectivamente) se añadieron a 165ng lineal pTZ57R (extremos de 0.54pmol).
Las mezclas de ligaduras se incubaron a 22oC por un mínimo de 1 hora, y después se usaron para transformar las células competentes DH5a. Tras esto, se añadieron 15µl de la mezcla de ligadura a 50µl de células competentes e incubadas en hielo por 20 minutos.
65 Las células fueron sometidas entonces a un tratamiento térmico al colocarlas a 42oC por 90 segundos, y después en hielo por 2 minutos. Las células transformadas fueron sembradas por diseminación en placas de agar LB
imagen1
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conteniendo 100µg/ml de Ampicilina, al igual que X-Gal y IPTG para proyección azul blanquecino. Las placas se incubaron por la noche a 37oC, tras lo cual se seleccionaron colonias blancas y se inocularon en caldo LB de 3ml con 100µg/ml de Ampicilina. Tras incubarse por la noche a 37oC, se llevaron a cabo minipreparaciones de ADN lisis alcalino mediante el uso de un equipo de Minipreparación Plásmida de Alta Pureza (Roche).
5
3.2 Proyección de clones
Se realizó un análisis de restricción en clones tratados y sin tratar de BC1 y MSV AC1 presuntivos para la detección de insertos y de la orientación. Los clones BC1 (bisulfito tratado) se detectaron usando EcoRI y Xhol, mientras que
10 los clones si tratar se detectaron mediante digestión con HincII. Los clones MSV AC1 (bisulfito tratado) se detectan usando EcoRI y Bglll, mientras que los clones no tratados se detectan mediante la digestión con EcoRI y Xhol.
Los clones de bisulfito tratados que presuntamente estaban en la orientación derecha se secuenciaron, y los clones sin tratar se digirieron de nuevo para confirmar la orientación. La figura 7 ilustra pTZ57R con insertos en la
15 orientación derecha.
3.2.1 Clones de bisulfito tratado BC1 y MSV AC1 – secuenciación
No se encontró correlación entre el tiempo de incubación y la metilación de Cs, y las muestras BC1 parecían haber
20 sido sometidas a la metilación en su máxima expresión tras 5 minutos. El clon A1 tiene un inserto en la orientación incorrecta, y no puede usarse. El clon D1 tiene cambios de guanina a adenina, lo que fue causado por la amplificación arbitraria de la cadena negativa de la plantilla de ADN por los cebadores RCP durante la primera ronda de RCP, seleccionando por ello la cadena errónea. La metilación parece ser un proceso arbitrario, ya que un alineamiento múltiple de clones A1, B4, C3 mostró un patrón no distintivo de residuos que habían sido cambiados.
25 Se seleccionó el clon B4 para usarse en la construcción de la horquilla BC1, ya que tenía un número suficiente de depuraciones.
3.2.2 Clones sin tratar BC1 y MSV rep A – una mayor detección
30 Tabla 1: Resultados de la secuenciación
Cambios de Cambios de
Nombre del clon Descripción Orientación correcta
citosina a timina* guanina a adenina
A1 BC1 tratado 5 min 42 0 N B4 BC1 tratado 10 min 39 0 S C3 BC1 tratado 15 min 39 0 S D1 BC1 tratado 2.5 h 0 7 S F3 MSV AC1 tratado 2.5 h 58 0 S
* Hay un total de 70 residuos de citosina en el fragmento BC1
Se detectó la orientación de numerosos clones BC1 y MSV AC1 mediante la digestión con restricción de 35 endonucleasas como se mencionó antes.
Se verificó que los clones E21 a E26 (BC1 sin tratar) estaban en la orientación correcta, y tienen un inserto del tamaño correcto. De forma similar, el clon G3 (MSV AC1 sin tratar) estaba en la orientación correcta (Figura 8 Figura 3).
40 Ejemplo 4
4. La construcción de horquillas a partir de clones seleccionados.
45 Para construir las horquillas a partir de los clones seleccionados, los clones BC1 y MSV AC1 (bisulfito de sodio tratado) se digirieron con Scal y Bglll. De forma similar, los clones sin tratar se digirieron con Scal y BamHl. Se usó electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos resultantes.
Para el clon B4, se escindió el fragmento 2042bp (fragmento superior) del gel y se purificó mediante el uso del
50 equipo de extracción de gel MinElute (Qiagen). Para el clon E22, se escindió y purificó el fragmento 1312 bp (fragmento superior), y para el clon G3 se escindió y purificó el fragmento 1337 bp (fragmento inferior).
Se añadió aproximadamente un 50ng de fragmento no modificado a cada 50ng de fragmento modificado, respectivamente, para una mezcla de ligadura que contiene 1X tapón de ligadura, PEG 4000 y T4 ADN polimerasa 55 (Fermentas). Esta mezcla se incubó a 22oC durante un mínimo de 1 hora, tras lo cual las células competentes se
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transformaron como se describió previamente y se cubrió. Se detectaron los clones presuntivos BC1 hp mediante la digestión de restricción con Xhol y Xbal. Los clones presuntivos MSV AC1 hp se detectaron mediante la digestión de Xbal y Sall (Figura 11).
5 La digestión demostró que hay presentes horquillas con los tamaños esperados. Se seleccionaron BC1 hp7 y MSV hp 3 para una mayor construcción del casete silenciador. Se escindieron los fragmentos (Figura 10) del gel y se purificaron para una posterior clonación en el vector pART 7.
Actualmente, se están llevando a cabo experimentos para detectar ARNip procesado a partir de los casetes de
10 horquilla SACMV en el transgénico Nicotiana benthamiana y la yuca. Se cuestionarán las plantas transgénicas con SACMV para determinar el silenciamiento de AC1 y BC1 y el efecto del silenciamiento putativo en la carga viral. El solicitante anticipa que las líneas vegetales que expresan el ARNip surgido de las horquillas ARNbcl mal emparejadas tendrán cargas víricas reducidas tras la infección con SACMV. Se anticipa que la estabilidad del ARNbcl mal emparejado será comparable a la ARNbc con intrón largo insertado en plantas y será más efectivo que
15 las réplicas invertidas emparejadas perfectamente. La estabilidad de las réplicas invertidas con intrón largo insertado depende fundamentalmente del contenido G:C del gen dina, y por ello en el método descrito aquí, se puede conseguir una estabilidad mayor del contenido G:C debido a la naturaleza de las mutaciones descritas.
Aunque el invento se ha descrito con detalle respecto a las encarnaciones específicas del mismo, aquellos versados
20 en la materia apreciarán que se pueden realizar alteraciones, modificaciones y otros cambios sin salirse de la esfera de este invento. Por ello se pretende que las especificaciones cubran o abarquen todas las mencionadas modificaciones, alteraciones y/o cambios.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para la creación de un elemento vegetal que codifica los duplos ARNbcl mal emparejados que cuentan
    con un núcleo de más de 100 nucleótidos de longitud y un bucle que no incluye un intrón, incluyendo el método los 5 pasos de:
    (i) amplificación de un fragmento de ADN del gen diana;
    (ii) tratamiento de una fracción del fragmento de ADN del gen diana con bisulfito, causando así una mutación 10 química arbitraria de nucleótidos de citosina a nucleótidos timina;
    (iii) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud;
    15 (iv) Amplificación RCP en el fragmento tratado para generar un fragmento tratado de más de 100 nucleótidos de longitud; y
    (v) ligadura del fragmento tratado y del no tratado del gen diana para que el fragmento tratado y el no tratado estén
    en una orientación de direcciones opuestas, respectivamente. 20
  2. 2. Un método, según la especificación 1, en el que hay una secuencia interventora de codificación en bucle entre el fragmento tratado y el no tratado, preferiblemente incluyendo al menos un lugar de restricción.
  3. 3. Un método, según las especificaciones 1 o 2, en el que se incluyen los pasos de clonación del elemento 25 codificando el duplo ARNbcl e insertándolo en un casete de expresión.
  4. 4. Un método, según las especificaciones 1 o 2, en el que la proporción de bases mal emparejadas en el fragmento tratado comparado con el fragmento no tratado es de uno cada 4 a cada 10 nucleótidos.
    30 5. Un método de silenciar el gen diana en una planta, incluyendo el método los pasos de:
    (i) construir una construcción de acuerdo al método de las especificaciones 1 a 4;
    (ii)
    introducir un casete de expresión que incluya el elemento dentro de una planta; y 35
    (iii) hacer que el casete de expresión exprese una secuencia ARN codificada por el elemento que silencia el mencionado gen diana.
  5. 6. Un polinucleótido ADN construido de acuerdo al método de cualquiera de las especificaciones 1 a 4 incluyendo: 40
    (i)
    una secuencia no modificada de un gen vegetal Diana o de una parte del mismo consistente en más de 100 nucleótidos de longitud; y
    (ii)
    una secuencia modificada del gen diana o de parte del mismo consistente en más de 100 nucleótidos de longitud,
    45 donde la secuencia modificada difiere de la secuencia no modificada en el hecho de que se han modificado nucleótidos de citosina aleatorios en la secuencia de gen diana, o de parte de la misma, convirtiéndolos en nucleótidos de timina mediante la mutación del bisulfito;
    donde cada una de la secuencia modificada o de la no modificada está orientación inversa respecto a la otra 50 secuencia, y
    donde la secuencia ARN transcrita a partir de un polinucleótido de ADN forma un duplo entre la secuencia modificada y la no modificada para que un duplo ARN bicatenario largo (ARNbcl) con un núcleo mayor de 100 nucleótidos de longitud se forme entre las secuencias modificadas y no modificadas con desajustes en los pares de
    55 base donde los nucleótidos se han modificado, siendo el duplo ARNbcl capaz de inhibir la expresión del gen diana.
  6. 7. Un polinucleótido de acuerdo a la especificación 6, donde la secuencia modificada y la no modificada están orientados en direcciones opuestas, respectivamente.
    60 8. Un polinucleótido de acuerdo a las especificaciones 6 o 7, donde la proporción de las modificaciones de nucleótidos es de uno cada cuatro a 10 nucleótidos.
  7. 9. Un polinucleótido de acuerdo a las especificaciones 6 a 8, que incluye una secuencia de nucleótidos más entre las
    secuencias modificadas y las no modificadas, formando la secuencia nucleótida extra una horquilla en bucle en la 65 secuencia ARN entre las secuencias modificadas y las no modificadas.
    14
  8. 10.
    Un polinucleótido de acuerdo a las especificaciones 6 a 9, donde el gen diana es un gen AC1 o BC1 proveniente del virus mosaico de la yuca sudafricana (SACMV), preferiblemente donde la secuencia modificada tenga la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 13, 16, 17 o 18 o una secuencia que sea al menos un 80% idéntica a la misma, o es una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 38, 39 o 40 o una secuencia expuesta en de SEQ ID NO: 21 o de SEQ ID NO: 53.
  9. 11.
    Un vector de ácido nucleico que incluya un casete de expresión con polinucleótido de ADN de cualquier de las especificaciones 6 a 10.
    15
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