JP2021533812A - 非標準塩基対を含むｒｎａ分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新しい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造、及び遺伝子サイレンシングにおけるそれらの使用に関する。

Description

本発明は、新しい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造、及び遺伝子サイレンシングにおけるそれらの使用に関する。
ＲＮＡサイレンシングは、真核生物において進化的に保存された遺伝子サイレンシングメカニズムであり、ヘアピン構造化ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）と呼ばれる任意の形態であり得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される。基本的なＲＮＡサイレンシング経路では、ｄｓＲＮＡはＤｉｃｅｒタンパク質によってプロセシングされ、短い２０〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子ＲＮＡ二重鎖となり、そのうちの１本の鎖がアルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質に結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。このサイレンシング複合体は、相補的な一本鎖ＲＮＡを見つけて結合するためのガイドとして低分子ＲＮＡを使用し、ＡＧＯタンパク質はＲＮＡを切断し、その結果、その分解を引き起こす。
植物には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復関連ｓｉＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、及び外因性（ウイルス及び導入遺伝子）ｓｉＲＮＡ（ｅｘｏｓｉＲＮＡ）経路など、複数のＲＮＡサイレンシング経路が存在する。ｍｉＲＮＡは、ＭＩＲ遺伝子由来のＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される短いステムループ前駆体ＲＮＡからのＤｉｃｅｒ−様１（ＤＣＬ１）によって核内でプロセシングが行われる２０〜２４ｎｔの低分子ＲＮＡである。ｔａｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡで切断されたＴＡＳ ＲＮＡ断片からＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６（ＲＤＲ６）によって合成された長いｄｓＲＮＡのＤＣＬ４プロセシングに由来するサイズが主に２１ｎｔの段階的ｓｉＲＮＡである。２４ｎｔのｒａｓｉＲＮＡは、ＤＣＬ３によってプロセシングが行われ、前駆体ｄｓＲＮＡは、ゲノム内の反復ＤＮＡから植物特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＶ（ＰｏｌＩＶ）及びＲＤＲ２の複合機能によって生成される。ｅｘｏｓｉＲＮＡ経路は、ｔａｓｉＲＮＡ経路及びｒａｓｉＲＮＡ経路と重複しており、ＤＣＬ４及びＤＣＬ３の両方がｅｘｏｓｉＲＮＡプロセシングに関与している。ＤＣＬ１、ＤＣＬ３、及びＤＣＬ４に加えて、モデル植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ及び他の高等植物は、ＤＣＬ２または同等物をコードし、２２−ｎｔ ｅｘｏｓｉＲＮＡなどの２２−ｎｔ ｓｉＲＮＡを生成し、植物の全身的及び移行性遺伝子サイレンシングにおいて重要な役割を果たす。これらの植物の低分子ＲＮＡは全て、ＨＵＡエンハンサー１（ＨＥＮ１）によって３’末端ヌクレオチドの２’−ヒドロキシル基でメチル化されており、この３’末端の２’−Ｏ−メチル化は植物細胞内において低分子ＲＮＡを安定化すると考えられている。ｍｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、及びｅｘｏｓｉＲＮＡは、動物の転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡの配列特異的分解に関与する動物細胞の低分子ＲＮＡと機能的に類似している。しかし、ｒａｓｉＲＮＡは植物に固有であり、ＲＮＡ指令ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）として知られている転写遺伝子サイレンシングメカニズムである同族ＤＮＡでのｄｅ ｎｏｖｏシトシンメチル化を指示するように機能する。
ｄｓＲＮＡによって誘導されるＲＮＡサイレンシングは、様々な真核生物系の遺伝子活性を低下させるために幅広く利用されており、複数の遺伝子サイレンシング技術が開発されている。多くの場合、様々な生物が、様々な遺伝子サイレンシングアプローチに適用され得る。例えば、長いｄｓＲＮＡ（少なくとも１００塩基対の長さ）は、ｄｓＲＮＡ誘導インターフェロン応答のために哺乳類細胞においてＲＮＡサイレンシングを誘導するのにはあまり適していないため、哺乳類細胞では一般に短いｄｓＲＮＡ（３０塩基対未満）が使用され、長いｄｓＲＮＡステムを有する植物ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）は非常に有効である。植物では、様々なＲＮＡサイレンシング経路が、人工ｍｉＲＮＡ、人工ｔａｓｉＲＮＡ、及びウイルス誘導遺伝子サイレンシング技術などの様々な遺伝子サイレンシング技術に繋がっている。しかし、植物におけるＲＮＡサイレンシングの適用は、これまでのところ、主に長いｈｐＲＮＡ導入遺伝子を使用することによって上手く達成されている。ｈｐＲＮＡ導入遺伝子構築物は、典型的には、スペーサー配列（ｈｐＲＮＡのループを形成）によって分離された標的遺伝子配列（ｈｐＲＮＡのｄｓＲＮＡステムから転写される場合）の完全に相補的なセンス配列及びアンチセンス配列で構成される逆方向反復からなる。これは、植物細胞で発現するためにプロモーターと転写ターミネーターとの間に挿入される。スペーサー配列は、構築物の調製中に細菌内の逆方向反復ＤＮＡを安定化させるように機能する。得られたｈｐＲＮＡ転写産物のｄｓＲＮＡステムは、ＤＣＬタンパク質によってプロセシングが行われ、標的遺伝子のサイレンシングを指示するｓｉＲＮＡとなる。ｈｐＲＮＡ導入遺伝子は、遺伝子発現をノックダウンし、代謝経路を改変し、作物改良のために植物における疾患及び害虫耐性を高めるために広く使用されており、現在では、作物改良における技術の多くの応用が成功していることが報告されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
しかし、近年の研究では、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子は、標的遺伝子サイレンシングの安定性及び有効性を損なう自己誘導転写抑制を受けやすいことが示唆されている。全ての導入遺伝子は、位置またはコピー数に依存する転写サイレンシングを受ける可能性があるが、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子は、ＲｄＤＭ経路を介してＤＮＡメチル化を自身の配列に向けることができるｓｉＲＮＡを生成するため、固有のものであり、これは転写自己サイレンシングを引き起こす可能性を有する。
Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１９
ｄｓＲＮＡにより誘導される遺伝子サイレンシングは、生物の表現型の変化において有益な手段であることが証明されているが、ＲＮＡｉに使用可能である代替的な、好ましくは改善されたｄｓＲＮＡ分子が必要とされている。
本発明者らは、２つ以上のループ配列を有する形態（本明細書ではループ末端ｄｓＲＮＡ（ｌｅｄＲＮＡ）と呼ばれる）など、複数の非標準塩基対ヌクレオチドもしくは非塩基対ヌクレオチド、またはその両方を含む１つ以上の二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ分子を産生するための遺伝子構築物の新しい設計を考案した。これらのＲＮＡ分子は次の特徴のうちの１つ以上を有する；ＲＮＡ分子は容易に合成され、ＲＮＡ分子をコードする遺伝子構築物の転写時に細胞内により高いレベルまで蓄積する、ＲＮＡ分子はより容易にｄｓＲＮＡ構造を形成し、真核細胞において標的ＲＮＡ分子の効率的なサイレンシングを誘導する、及び植物細胞において、ＲＮＡ分子は、プロセシング時に環状ＲＮＡ分子を形成し得る。ＲＮＡ分子は、植物に局所的に適用するとき、または昆虫などの動物に給餌する時にも効果的である。
第１の態様において、本発明は、長さが少なくとも２０の連続するヌクレオチドである第１のセンスリボヌクレオチド配列と、長さが少なくとも２０の連続するヌクレオチドである第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列と、を含み、これにより、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、ｄｓＲＮＡ領域を形成することができる、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を含むキメラリボ核酸（ＲＮＡ）分子を提供し、
ｉ）第１のセンスリボヌクレオチド配列は、５’から３’の順で共有結合し、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉ）第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、５’から３’の順で共有結合し、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉｉ）第１の５’リボヌクレオチドが第２の３’リボヌクレオチドと塩基対形成してｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対を形成し、
ｉｖ）第２の５’リボヌクレオチドが第１の３’リボヌクレオチドと塩基対形成してｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対を形成し、
ｖ）第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの約５％〜約４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、
ｖｉ）ｄｓＲＮＡ領域が、２０の連続する標準的な塩基対を含まず、
ｖｉｉ）ＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断されて、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができ、
ｖｉｉｉ）ＲＮＡ分子もしくは少なくともいくつかのａｓＲＮＡ分子、またはその両方が、真核細胞内の標的ＲＮＡ分子の発現または活性を低下させることができ、
ｉｘ）ＲＮＡ分子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは細胞内、またはその両方において転写により酵素的に作成されることができる。
第１の態様の好ましい実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列は、長さが少なくとも４のヌクレオチド、または４〜１，０００のリボヌクレオチド、または４〜２００のリボヌクレオチド、または４〜５０のリボヌクレオチド、または少なくとも１０のヌクレオチド、または１０〜１，０００のリボヌクレオチド、または１０〜２００のリボヌクレオチド、または１０〜５０リボヌクレオチドのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列に共有結合されており、これにより、第１の結合リボヌクレオチド配列が、第１の３’リボヌクレオチド及び第２の５’リボヌクレオチドのいずれか、または第２の３’リボヌクレオチド及び第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、このため、配列は、ＲＮＡの単一の連続鎖内に含まれる。別の実施形態では、第１の結合リボヌクレオチド配列は、第２の３’リボヌクレオチド及び第１の５’リボヌクレオチドのいずれかに、または好ましくは、第１の３’リボヌクレオチド及び第２の５’リボヌクレオチドに共有結合されており、それにより、配列は、ＲＮＡの単一の連続鎖内に含まれる。
最も単純な形では、そのようなＲＮＡ分子はヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）と呼ばれている。より好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡの第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの約５％〜約４０％のリボヌクレオチドが、全体で、非標準塩基対、好ましくはＧ：Ｕ塩基対で塩基対を形成している。すなわち、第１のセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの全ては、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドと標準塩基対または非標準塩基対のいずれかで塩基対になっており、それにより、ｄｓＲＮＡ領域は、いくつかの非標準塩基対を含む２０の連続した塩基対を含む。ｄｓＲＮＡ領域は、それによって、２０の連続した標準塩基対を含まない。本発明のｈｐＲＮＡのより好ましい実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡのある領域に完全に相補的である。本実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡの領域内のＣヌクレオチドをｈｐＲＮＡ内のＵヌクレオチドにより置換することにより、標的ＲＮＡの領域とは配列が異なる。このような分子は、実施例６〜１１のＧ：Ｕ塩基対を含むヘアピンＲＮＡ内に例示される。好ましい実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の長さは、２０〜約１０００ヌクレオチド、または２０〜約５００ヌクレオチド、または本明細書に記載の他の長さである。より好ましくは、ｈｐＲＮＡは、植物細胞内もしくは真菌細胞内で産生されるか、または植物細胞内もしくは真菌細胞内に導入される。これらの実施形態において、標的ＲＮＡは、細胞内の内因性遺伝子の転写物であってもよく、または植物病原体の転写物であってもよく、または昆虫害虫などの害虫の転写物であってもよい。
より好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２のセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結されており、これにより、第１の結合リボヌクレオチド配列は、第１の３’リボヌクレオチド及び第２の５’リボヌクレオチドに共有結合され、また、ＲＮＡ分子は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、第２の３’リボヌクレオチド及び第２のセンスリボヌクレオチド配列に共有結合された第２の結合リボヌクレオチド配列をさらに含み、それによってｌｅｄＲＮＡ構造を形成する。好ましい代替的実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結されており、これにより、第１の結合リボヌクレオチド配列は、第２の３’リボヌクレオチド及び第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、また、ＲＮＡ分子は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、第２の３’リボヌクレオチド及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列に共有結合された第２の結合リボヌクレオチド配列をさらに含み、それによってｌｅｄＲＮＡ構造を形成する。
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズして第２のｄｓＲＮＡ領域を形成することができ、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結され、これにより、第１の結合リボヌクレオチド配列が、第１の３’リボヌクレオチド及び第２の５’リボヌクレオチドに共有結合され、ＲＮＡ分子は、さらに、または任意には、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、第２の３’リボヌクレオチド及び第２のセンスリボヌクレオチド配列に共有結合されているか、または第２のセンスリボヌクレオチド配列と第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する第２の結合リボヌクレオチド配列を含み、それによりｌｅｄＲＮＡ構造が形成される。さらなる好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結され、これにより、第１の結合リボヌクレオチド配列は、第２の３’リボヌクレオチド及び第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、ＲＮＡ分子は、さらに、または任意に、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、第１の３’リボヌクレオチド及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列に共有結合されているか、または第２のセンスリボヌクレオチド配列と第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する第２の結合リボヌクレオチド配列を含み、それにより、ｌｅｄＲＮＡ構造を形成している。より好ましい実施形態では、第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子中に存在する場合、それぞれ、長さが少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含む。これらの実施形態では、第１及び第２のセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子と配列的に関連しないか、または標的ＲＮＡ分子と配列的に関連する介在リボヌクレオチド配列によって共有結合されていてもよく、または第１及び第２のセンスリボヌクレオチド配列は、介在リボヌクレオチド配列なく、共有結合されていてもよい。第１及び第２のセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する１つの連続センスリボヌクレオチド領域を形成してもよい。さらなる実施形態では、第１及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の相補体と配列的に関連しないか、またはＲＮＡ分子の相補体と配列的に関連する介在リボヌクレオチド配列によって共有結合されていてもよく、または第１及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、介在リボヌクレオチド配列なく、共有結合されている。第１及び第２のアンチセンスセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の相補体に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する１つの連続アンチセンスリボヌクレオチド領域を形成してもよい。これらの実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、これらの配列は、好ましくは、第２のセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの５％〜４０％が、塩基対形成によってハイブリダイズし、第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、好ましくはＧ：Ｕ塩基対で塩基対が形成され、第２のｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する標準塩基対を含まず、ＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより、第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断されて、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができる。
最も好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子全体及びＲＮＡ分子内の各ｄｓＲＮＡ領域を考慮すると、塩基対形成によってハイブリダイズする各センスリボヌクレオチド配列及びその対応するアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドのうち５％〜４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、ＲＮＡ分子全体が、そのｄｓＲＮＡ領域のいずれにおいても２０の連続した標準塩基対を含まず、またＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより、各アンチセンスリボヌクレオチド配列が切断され、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができる。
好ましい実施形態では、各結合リボヌクレオチド配列は、独立して、長さが４〜約２０００ヌクレオチド、好ましくは長さが４〜約１２００ヌクレオチド、より好ましくは長さが４〜約２００ヌクレオチド、最も好ましくは長さが４〜約５０ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’リーダー配列もしくは３’トレーラー配列、またはその両方をさらに含む。
第２の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成するために互いにハイブリダイズすることができるセンスリボヌクレオチド配列及びアンチセンスリボヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ領域を含むキメラリボ核酸（ＲＮＡ）分子を提供し、ここで、
ｉ）センスリボヌクレオチド配列は、５’から３’の順で共有結合し、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉ）アンチセンスリボヌクレオチド配列は、５’から３’の順で共有結合し、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉｉ）第１の５’リボヌクレオチドが第２の３’リボヌクレオチドと塩基対形成してｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対を形成し、
ｉｖ）第２の５’リボヌクレオチドが第１の３’リボヌクレオチドと塩基対形成してｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対を形成し、
ｖ）センスリボヌクレオチド配列及びアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの約５％〜約４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、
ｖｉ）ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する標準的な塩基対を含まず、
ｖｉｉ）ＲＮＡ分子は、真核細胞内またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それによりアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断され、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができ、
ｖｉｉｉ）ＲＮＡ分子もしくは少なくともいくつかのａｓＲＮＡ分子、またはその両方が、真核細胞内の標的ＲＮＡ分子の発現または活性を低下させることができ、
ｉｘ）ＲＮＡ分子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは細胞内、またはその両方において転写により酵素的に作成されることができる。
当業者であれば認識するであろうが、センスリボヌクレオチド配列及びアンチセンスリボヌクレオチド配列の長さが２０未満の連続ヌクレオチドである場合を除き、第１の態様に関連する実施形態の各々は、第２の態様に適用される。
第３の態様では、本発明は、第１のＲＮＡ成分、第１のＲＮＡ成分に共有結合した第２のＲＮＡ成分、ならびに任意に、（ｉ）第１及び第２のＲＮＡ成分を共有結合する結合リボヌクレオチド配列、（ｉｉ）５’リーダー配列、ならびに（ｉｉｉ）３’トレーラー配列、のうちの１つ以上またはその全てを含むＲＮＡ分子であって、
第１のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、第１の５’及び３’リボヌクレオチドは、ＲＮＡ分子において互いに塩基対形成し、第１のＲＮＡ配列は、少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの第１のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第１のループ配列、及び少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子内の第１のセンスリボヌクレオチド配列とハイブリダイズし、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の第１の領域にハイブリダイズすることができ、
該第２のＲＮＡ成分は、存在する場合は結合リボヌクレオチド配列を介して、または該結合リボヌクレオチド配列が存在しない場合は直接、該第１の５’リボヌクレオチドまたは該第１の３’リボヌクレオチドに共有結合し、
該第２のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、該第２の５’及び３’リボヌクレオチドは、該ＲＮＡ分子において互いに塩基対形成し、該第２のＲＮＡ配列は、第２のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第２のループ配列、及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、該第２のセンスリボヌクレオチド配列は、該ＲＮＡ分子内の第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
該５’リーダー配列は、存在する場合、該第２のＲＮＡ成分が該第１の３’リボヌクレオチドに結合する場合は該第１の５’リボヌクレオチドに共有結合するか、または該第２のＲＮＡ成分が該第１の５’リボヌクレオチドに結合する場合は該第２の５’リボヌクレオチドに共有結合するリボヌクレオチドの配列からなり、
該３’トレーラー配列は、存在する場合、該第２のＲＮＡ成分が第１の３’リボヌクレオチドに結合する場合は第２の３’リボヌクレオチドに共有結合するか、または該第２のＲＮＡ成分が該第１の５’リボヌクレオチドに結合する場合は該第１の３’リボヌクレオチドに共有結合するリボヌクレオチドの配列からなる、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を提供する。
第４の態様では、本発明は、第１のＲＮＡ成分、第１のＲＮＡ成分に共有結合した第２のＲＮＡ成分、ならびに任意に、（ｉ）第１及び第２のＲＮＡ成分を共有結合する結合リボヌクレオチド配列、（ｉｉ）５’リーダー配列、ならびに（ｉｉｉ）３’トレーラー配列のうちの１つ以上またはその全てを含むＲＮＡ分子であって、
該第１のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、該第１の５’及び３’リボヌクレオチドは、塩基対形成し、該第１のＲＮＡ配列は、第１のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第１のループ配列、及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、該第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列はそれぞれ少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドからなり、それにより該第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドは、該第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドと完全に塩基対形成し、該第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドまたは該第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の第１の領域またはその相補体のそれぞれ、またはその両方に対して配列が同一であり、
該第２のＲＮＡ成分は、存在する場合は結合リボヌクレオチド配列を介して、該第１の５’リボヌクレオチドまたは該第１の３’リボヌクレオチドに共有結合し、
該第２のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、該第２の５’及び３’リボヌクレオチドは、塩基対形成し、該第２のＲＮＡ配列は、第２のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第２のループ配列、及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、該第２のセンスリボヌクレオチド配列は、該第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列と塩基対形成し、
該５’リーダー配列は、存在する場合、該第２のＲＮＡ成分が該第１の３’リボヌクレオチドに結合する場合は該第１の５’リボヌクレオチドに共有結合するか、または該第２のＲＮＡ成分が該第１の５’リボヌクレオチドに結合する場合は該第２の５’リボヌクレオチドに共有結合するリボヌクレオチドの配列からなり、
該３’トレーラー配列は、存在する場合、該第２のＲＮＡ成分が第１の３’リボヌクレオチドに結合する場合は第２の３’リボヌクレオチドに共有結合するか、または該第２のＲＮＡ成分が該第１の５’リボヌクレオチドに結合する場合は該第１の３’リボヌクレオチドに共有結合するリボヌクレオチドの配列からなる、ＲＮＡ分子を提供する。
上記の態様の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡ分子はキメラＲＮＡ分子である。
第５の態様において、本発明は、第１のＲＮＡ成分と、第１のＲＮＡ成分に共有結合した第２のＲＮＡ成分を含むキメラＲＮＡ分子であって、
該第１のＲＮＡ成分は、互いにハイブリダイズして第１のｄｓＲＮＡ領域を形成することができる第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列、ならびに該第１のセンスリボヌクレオチド配列と第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する少なくとも４のヌクレオチドの第１の介在リボヌクレオチド配列を含む、第１の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を含み、
該第２のＲＮＡ成分は、第２のセンスリボヌクレオチド配列、第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列、及び第２のセンスリボヌクレオチド配列と第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する少なくとも４のリボヌクレオチドの第２の介在リボヌクレオチド配列を含み、該第２のセンスリボヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子内の第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
該第１のＲＮＡ成分において、
ｉ）第１のセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉ）第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉｉ）第１の５’リボヌクレオチドが、第２の３’リボヌクレオチドと塩基対形成し、
ｉｖ）第２の５’リボヌクレオチドが、第１の３’リボヌクレオチドと塩基対形成し、
ｖ）第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの５％〜４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、
ｖｉ）第１のｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する標準的な塩基対を含まず、
該キメラＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断されて、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができ
（ａ）該キメラＲＮＡ分子もしくは少なくともいくつかのａｓＲＮＡ分子、またはその両方が、真核細胞内の標的ＲＮＡ分子の発現または活性を低下させることができ、
（ｂ）第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、標的ＲＮＡ分子の相補体の領域に対して配列が少なくとも５０％同一である、好ましくは、配列が少なくとも９０％または１００％同一である少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの配列を含むか、または
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方である、該キメラＲＮＡ分子を提供する。
ＲＮＡ分子が第１のＲＮＡ成分を有する実施形態において、第１のＲＮＡ成分の第１の５’リボヌクレオチド及び第１の３’リボヌクレオチドが、互いに塩基対を形成する。その塩基対は、本明細書では、第１のＲＮＡ成分の自己ハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対として定義される。第１のセンスリボヌクレオチド配列が、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の５’リボヌクレオチドに共有結合しており、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の３’リボヌクレオチドに共有結合している実施形態において、第１の５’リボヌクレオチドは、センス配列とアンチセンス配列の一方に直接連結され、第１の３’リボヌクレオチドはセンス配列とアンチセンス配列の他方に直接連結される。
好ましい実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドは、全て、標的ＲＮＡ分子の第１の領域のヌクレオチドと塩基対形成することができる。この文脈では、塩基対形成は、標準または非標準であり得、例えば、少なくともいくつかのＧ：Ｕ塩基対を有する。各Ｇ：Ｕ塩基対に対して独立して、Ｇは、標的ＲＮＡ分子の第１の領域、または好ましくは第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列中に存在し得る。あるいは、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの全てが、標的ＲＮＡ分子の第１の領域のヌクレオチドに塩基対形成するのではない。例えば、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドのうちの１、２、３、４または５は、標的ＲＮＡ分子の第１の領域に塩基対形成されていない。一実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列は、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の５’リボヌクレオチドに共有結合しているか、または第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の３’リボヌクレオチドに共有結合しているか、またはその両方である。
上記の態様のうちの一実施形態において、ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ分子の領域またはその相補体のいずれかと少なくとも部分的に同一である標的ＲＮＡ分子に配列が関連する１つ以上の結合リボヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、第１及び第２のＲＮＡ成分のセンス配列と共に１つの連続センス配列の一部を形成するか、または第１及び第２のＲＮＡ成分のアンチセンス配列と共に１つの連続アンチセンス配列の一部を形成する。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、２０未満のリボヌクレオチドである結合リボヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズする。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の相補体の一部と同一である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１〜１０リボヌクレオチドである。
上記の態様の実施形態では、ＲＮＡ分子は、（ｉ）第１及び第２のＲＮＡ成分を共有結合する結合リボヌクレオチド配列、（ｉｉ）５’伸長配列、ならびに（ｉｉｉ）３’伸長配列のうちの１つ以上またはその全てを含み、それぞれ、５’伸長配列は、存在する場合、第１のＲＮＡ成分または第２のＲＮＡ成分に共有結合するリボヌクレオチドの配列からなり、３’伸長配列は、存在する場合、第２のＲＮＡ成分または第１のＲＮＡ成分に共有結合するリボヌクレオチドの配列からなる。一実施形態では、第１のＲＮＡ成分及び第２のＲＮＡ成分は、結合リボヌクレオチド配列を介して共有結合する。代替的実施形態では、第１のＲＮＡ成分及び第２のＲＮＡ成分は、存在するいかなる結合リボヌクレオチド配列なしで直接結合する。
第１〜第５の態様の実施形態では、ＲＮＡ分子は標的ＲＮＡ分子の領域とそれぞれ配列が同一である２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ分子はセンスリボヌクレオチド配列と塩基対形成する１つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、該１つ以上のアンチセンス配列は、標的分子の領域に相補的、好ましくは完全に相補的である。一実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、同じ標的ＲＮＡ分子の異なる領域と配列が同一であり、標的ＲＮＡ分子内で連続していても連続していなくてもよい。一実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、異なる標的ＲＮＡ分子の領域と配列が同一である。一実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、介在ループ配列を持たない、すなわち、それらは標的ＲＮＡ分子に対して連続している。
第１〜第５の態様の好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列、及びそれと塩基対形成するセンスリボヌクレオチド配列を含み、そのアンチセンス配列は、それぞれ標的ＲＮＡ分子の領域に相補的であり、好ましくは完全に相補的である。相補的である標的ＲＮＡ分子の領域は、標的ＲＮＡ分子内で連続していても連続していなくてもよい。一実施形態では、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、同じ標的ＲＮＡ分子の異なる領域と相補的である。一実施形態では、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列の第２のものは、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列の第１のものとは異なる標的ＲＮＡ分子の領域に相補的である。好ましい実施形態では、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列は介在ループ配列を持たない、すなわち、それらは標的ＲＮＡ分子の相補体に対して連続している。好ましい実施形態では、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列及びセンスリボヌクレオチド配列の一方または両方は、標準的な塩基対、またはいくつかの標準的及びいくつかの非標準塩基対、好ましくはＧ：Ｕ塩基対を介してその全長に沿って塩基対形成する。
第１〜第５の態様の１つの好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は一本鎖のリボヌクレオチドである。最も単純な形態では、ＲＮＡ分子は、５’末端、少なくとも２１ヌクレオチド長であるセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２１の連続するヌクレオチドにわたってセンスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対形成されているアンチセンスリボヌクレオチド配列、介在ループ配列、及び３’末端を有するヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）構造を含む。ＲＮＡ分子は、５’−リーダー配列及び／または３’−トレーラー配列を含み得る。別の形態では、ＲＮＡ分子は、５’末端、少なくとも２１ヌクレオチド長である少なくとも１つのセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２１の連続するヌクレオチドにわたって各センスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対形成したアンチセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２つのループ配列、及び３’末端を有する一本鎖のリボヌクレオチドを含む。５’から３’の順序は、センスリボヌクレオチド配列、次いでアンチセンスリボヌクレオチド配列、またはその逆であり得る。一実施形態では、５’末端のリボヌクレオチドと３’末端のリボヌクレオチドとが隣接しており、それぞれが塩基対形成しており、直接共有結合はしていない（例えば、図１を参照のこと）。
第１〜第５の態様の別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列、標的ＲＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、該標的ＲＮＡの第２領域は該標的ＲＮＡの第１領域とは異なり、該ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡと少なくとも５０％の配列同一性を有する１つのみのセンスリボヌクレオチド配列を含み、該２つのアンチセンス配列は、ＲＮＡ分子内で連続していない。一実施形態では、標的ＲＮＡの第１及び第２領域は、標的ＲＮＡ内で連続している。あるいは、それらは連続していない。
第１〜第５の態様の別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡの第１領域と少なくとも６０％同一である第１のセンスリボヌクレオチド配列、標的ＲＮＡの第２領域と少なくとも６０％同一である第２のセンスリボヌクレオチド配列を含み、該標的ＲＮＡの第２領域は該標的ＲＮＡの第１領域とは異なり、該ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスリボヌクレオチド配列を１つだけ含み、２つのセンス配列は、ＲＮＡ分子内で連続していない。一実施形態では、標的ＲＮＡの第１及び第２領域は、標的ＲＮＡ分子内で連続している。あるいは、それらは連続していない。好ましい実施形態では、第１及び第２のセンスリボヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的ＲＮＡのそれぞれの領域と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である、すなわち、第１のセンス配列は、その標的領域と少なくとも７０％同一であり、第２の配列はその標的配列と少なくとも８０％同一、などであり得る。
第１〜第４の態様の１つの好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’末端、少なくとも２１ヌクレオチド長である少なくとも１つのセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２１の連続するヌクレオチドにわたって各センスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対形成したアンチセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２つのループ配列、及び３’末端を有する一本鎖のリボヌクレオチドである。より好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子における塩基対形成は、いくつかの非標準塩基対、最も好ましくはいくつかのＧ：Ｕ塩基対を含む長さが少なくとも２１の連続する塩基対である二本鎖領域に含まれ、該二本鎖領域は長さが少なくとも２１ヌクレオチドである少なくとも１つのセンスリボヌクレオチド配列を含む。
第３及び第４の態様の好ましい実施形態では、第２のＲＮＡ成分は、
ｉ）第２のセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第２の５’リボヌクレオチド、第３のＲＮＡ配列、及び第３の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉ）第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第３の５’リボヌクレオチド、第４のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉｉ）第２の５’リボヌクレオチドが、第２の３’リボヌクレオチドと塩基対形成し、
ｉｖ）第３の３’リボヌクレオチドが、第３の５’リボヌクレオチドと塩基対形成することを特徴とし、
該キメラＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断され、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができる。最も好ましくは、第２のアンチセンス配列から生成されたａｓＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ成分の第１のアンチセンス配列から生成されたａｓＲＮＡなしで、またはそれと組み合わせて、標的ＲＮＡの発現を低下させることができる。
第５の態様の好ましい実施形態では、第２のＲＮＡ成分は、
ｉ）第２のセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第３の５’リボヌクレオチド、第３のＲＮＡ配列、及び第３の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉ）第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第４の５’リボヌクレオチド、第４のＲＮＡ配列、及び第４の３’リボヌクレオチドからなり、
ｉｉｉ）第３の５’リボヌクレオチドが、第４の３’リボヌクレオチドと塩基対形成し、
ｉｖ）第３の３’リボヌクレオチドが、第３の５’リボヌクレオチドと塩基対形成することを特徴とし、
該キメラＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断され、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができる。
上記の好ましい実施形態の各々は、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの５％〜４０％、及び／または第２のセンスリボヌクレオチド配列と第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列、及び／またはハイブリダイズする全てのセンスリボヌクレオチド配列とその対応するアンチセンスリボヌクレオチド配列は、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されない、及び／または相補的センス配列とアンチセンス配列との間に形成されたｄｓＲＮＡ領域が、２０の連続する標準的な塩基対を含まない、ことがより好ましい。より好ましくは、好ましくは、ＲＮＡ分子内の全てのｄｓＲＮＡ領域に対して、センスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチド及びその対応するアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの約１２％、約１５％、約１８％、約２１％、約２４％、約２７％、約３０％、１０％〜３０％、または１５％〜３０％、またはさらに好ましくは１６％〜２５％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されない。さらに好ましくは、ＲＮＡ分子内のｄｓＲＮＡ領域（複数可）のリボヌクレオチドの約１２％、約１５％、約１８％、約２１％、約２４％、約２７％、約３０％、１０％〜３０％、または１５％〜３０％、またはさらにより好ましくは１６％〜２５％は、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されており、ＲＮＡ分子内のｄｓＲＮＡ領域（複数可）の他の全てのリボヌクレオチドが標準塩基対で塩基対形成されている。好ましい実施形態では、第１または第２のｄｓＲＮＡ領域、または全てのｄｓＲＮＡ領域の非標準塩基対の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％が全体でＧ：Ｕ塩基対である。最も好ましくは、これらの実施形態では、
（ａ）該キメラＲＮＡ分子もしくは少なくともいくつかのａｓＲＮＡ分子、またはその両方が、真核細胞内の標的ＲＮＡ分子の発現または活性を低下させることができ、または
（ｂ）第１及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列、好ましくはＲＮＡ分子中の全てのアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の相補体の領域に対して配列が少なくとも５０％同一であり、好ましくは少なくとも６０％同一である、より好ましくは少なくとも７０％同一である、さらにより好ましくは少なくとも８０％同一である、最も好ましくは少なくとも９０％同一である、または標的ＲＮＡ分子の相補体の領域に対して１００％同一である、少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの配列を含むか、
または、（ａ）及び（ｂ）の両方である。
第１〜第５の態様の一実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’リーダー配列または５’伸長配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、３’トレーラー配列または３’伸長配列を含む。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’リーダー／伸長配列及び３’トレーラー／伸長配列の両方を含む。
第１〜第５の態様の一実施形態では、ＲＮＡ分子の各リボヌクレオチドは、他の２つのヌクレオチドに共有結合している、すなわち、共有結合閉環（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｌｅ）である。あるいは、ＲＮＡ分子はダンベル型として示される場合があるが（図１）、二本鎖構造の一部にギャップまたはニックがある。
第１〜第５の態様の一実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも１つまたは全てのループ配列は、２０ヌクレオチドよりも長い。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも１つのループは、４〜１，２００リボヌクレオチド長、または４〜１０００リボヌクレオチド長である。より好ましい実施形態では、全てのループは、４〜１，０００リボヌクレオチド長である。より好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも１つのループは、４〜２００リボヌクレオチド長である。さらにより好ましい実施形態では、全てのループは、４〜２００リボヌクレオチド長である。さらにより好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも１つのループは、４〜５０リボヌクレオチド長である。最も好ましい実施形態では、全てのループは、４〜５０リボヌクレオチド長である。実施形態では、ループの最小長は、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、または５０ヌクレオチドである。一実施形態では、真核細胞は、脊椎動物細胞または植物細胞であり、ＲＮＡ分子の各ループは、独立して、２０〜５０のリボヌクレオチド長、または２０〜４０のリボヌクレオチド長、または２０〜３０のリボヌクレオチド長である。
好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子中の少なくとも１つのループ配列は、真核細胞に内因性であるＲＮＡ分子、例えば、真核細胞中のｍｉＲＮＡまたは他の調節性ＲＮＡなどに相補的である１つ以上の結合配列を含む。容易に理解されるであろうように、この特徴は、ループ長特徴、非標準塩基対形成、及びＲＮＡ分子に関して上述した他の特徴のいずれかと組み合わせてもよい。実施形態では、少なくとも１つのループ配列は、１つのｍｉＲＮＡに対する複数の結合配列、もしくは複数のｍｉＲＮＡに対する結合配列、またはその両方を含む。一実施形態では、ＲＮＡ分子中の少なくとも１つのループ配列は、ポリペプチドまたは機能性ポリヌクレオチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームは、好ましくは翻訳開始配列に作動可能に連結されており、それにより、オープンリーディングフレームは、目的の真核細胞で翻訳され得る。例えば、翻訳開始配列は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を含むか、またはＩＲＥＳから構成される。ＩＲＥＳは、好ましくは真核生物ＩＲＥＳである。翻訳されたポリペプチドは、長さが好ましくは５０〜４００アミノ酸残基、または５０〜３００アミノ酸残基、または５０〜２５０アミノ酸残基、または５０〜１５０アミノ酸残基である。そうしたＲＮＡ分子は、植物細胞内で産生された場合、ループ配列の大部分または全てを含む環状ＲＮＡ分子を形成するようにプロセシングされ得、高レベルのポリペプチドを提供するために翻訳され得る。
第１〜第５の態様の実施形態では、ＲＮＡ分子は、二本鎖領域にバルジがないか、または１つ、または２つ以上のバルジを有する。本文脈において、バルジは、ｄｓＲＮＡ領域において塩基対形成されておらず、ｄｓＲＮＡ領域の相補配列の対応する位置にミスマッチしたヌクレオチドを持たないセンスまたはアンチセンスリボヌクレオチド配列中の、ヌクレオチドまたは２つ以上の連続するヌクレオチドである。ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、ｄｓＲＮＡ構造が形成される場合にｄｓＲＮＡ領域からループアウトするセンス配列もしくはアンチセンス配列、またはその両方内に２つまたは３つを超えるヌクレオチドの配列を含み得る。ループアウトする配列自体が、何らかの内部塩基対を形成する場合があり、例えば、それ自体がステムループ構造を形成する場合がある。
第１〜第５の態様の実施形態では、ＲＮＡ分子は、二本鎖領域にバルジがないか、または１つ、または２つ以上のバルジを有する。本文脈において、バルジは、ｄｓＲＮＡ領域において塩基対形成されておらず、ｄｓＲＮＡ領域の相補配列の対応する位置にミスマッチしたヌクレオチドを持たないセンスまたはアンチセンスリボヌクレオチド配列中の、ヌクレオチドまたは２つ以上の連続するヌクレオチドである。ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、ｄｓＲＮＡ構造が形成される場合にｄｓＲＮＡ領域からループアウトするセンス配列もしくはアンチセンス配列、またはその両方内に２つまたは３つを超えるヌクレオチドの配列を含み得る。ループアウトする配列自体が、何らかの内部塩基対を形成する場合があり、例えば、それ自体がステムループ構造を形成する場合がある。
一実施形態では、ＲＮＡ分子は、３つ、４つ、またはそれ以上のループを有する。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、２つのループしかない。一実施形態では、ＲＮＡ分子の、第１の二本鎖領域、または第１及び第２のｄｓＲＮＡ領域、または各ｄｓＲＮＡ領域は、二本鎖領域において塩基対形成していない１つ、もしくは２つ、もしくはそれ以上のヌクレオチド、または独立して、二本鎖領域において塩基対形成していないヌクレオチドの最大２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％を含む。
第１〜第５の態様の好ましい実施形態では、本発明の標的ＲＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはその両方は、真核細胞内にある。例えば、真核細胞は、植物細胞、動物細胞、または真菌細胞であり得る。一実施形態では、真核細胞は、真菌細胞であり、例えば、１つ以上の植物種の真菌病原体の細胞、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、またはうどんこ病の原因となる真菌の細胞である。一実施形態では、真核細胞は、例えば昆虫細胞などの節足動物細胞である。好ましい昆虫は、アブラムシなど、吸汁性昆虫である。例えば、昆虫としては、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ昆虫、Ｄｉｐｔｅｒａｎ昆虫であってもよい。一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡを含む細胞とは異なる細胞、例えば細菌細胞または他の微生物細胞で産生される。好ましい実施形態では、微生物細胞は、ＲＮＡ分子をコードする遺伝子構築物からの転写によってＲＮＡ分子が産生される細胞であり、ＲＮＡ分子は、１つ以上のループ配列、１つ以上のｄｓＲＮＡ領域、またはその両方内の切断によって、実質的に、または好ましくは優勢に、微生物細胞内でプロセシングされていない。微生物細胞は、例えば、Ｄｉｃｅｒ酵素を持たない酵母細胞または別の真菌細胞などである。ＲＮＡ分子を産生するために非常に好ましい細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。微生物細胞は生きているものであってもよいし、加熱処理などの何らかの処理によって死滅させたものであってもよく、または乾燥粉末の形態であってもよい。同様に、一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、本発明のＲＮＡ分子が産生される場合に標的ＲＮＡを含まない真核細胞で産生されるが、例えば標的ＲＮＡがウイルスＲＮＡまたは他の導入されたＲＮＡである場合、本発明のＲＮＡ分子及び／またはそのプロセシングされたＲＮＡ産物を含む真核細胞は、標的ＲＮＡの宿主となり得る。そのような細胞は、ウイルスまたは他の導入されたＲＮＡから予防的に保護され得る。
第１〜第５の態様の好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは細胞内、またはその両方において転写により酵素的に作成されることができる。一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、細胞内で発現される、すなわち、ＲＮＡ分子をコードする１つ以上の核酸からの転写により細胞内で産生される。ＲＮＡ分子をコードする１つ以上の核酸は、細胞内のベクター上に存在し得るか、細胞のゲノム（細胞の核ゲノムまたは細胞の色素体ＤＮＡのいずれか）に組み込まれ得るＤＮＡ分子であることが好ましい。ＲＮＡ分子をコードする１つ以上の核酸は、ウイルスベクターなどのＲＮＡ分子であってもよい。
したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡ分子を含む細胞を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、細胞内で発現され、細胞から単離及び／または精製された、本明細書に記載のＲＮＡ分子を提供する。したがって、本発明は、第１〜第５の態様の１つ以上、及びこの文脈で説明されている実施形態のいずれかにしたがって単離したＲＮＡ分子の調製を提供し、これは、標的ＲＮＡを含むか、または標的ＲＮＡを潜在的に含む細胞への投与に適している。
一実施形態では、１つ以上の標的ＲＮＡがタンパク質をコードする。あるいは、１つ以上の標的ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡなどのタンパク質をコードしていない。
第１〜第５の態様の実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域を形成するセンスリボヌクレオチド配列及びその対応するアンチセンスリボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドの約１２％、約１５％、約１８％、約２１％、約２４％、または約１５％〜約３０％、または好ましくは約１６％〜約２５％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されない。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域、またはＲＮＡ分子の全てのｄｓＲＮＡ領域の非標準塩基対の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％、がＧ：Ｕ塩基対である。各Ｇ：Ｕ塩基対のＧヌクレオチドは、独立してセンスリボヌクレオチド配列にあり得るか、または好ましくはアンチセンスリボヌクレオチド配列にあり得る。ｄｓＲＮＡ領域のＧ：Ｕ塩基対のＧヌクレオチドに関して、好ましくは少なくとも５０％がアンチセンスリボヌクレオチド配列にあり、より好ましくは少なくとも６０％または７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％または９０％、最も好ましくは、それらの少なくとも９５％がｄｓＲＮＡ領域のアンチセンスリボヌクレオチド配列にある。この特徴は、独立して、ＲＮＡ分子内の１つ以上または全てのｄｓＲＮＡ領域に適用され得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域、またはＲＮＡ分子の全てのｄｓＲＮＡ領域のリボヌクレオチドの２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、より好ましくは１％未満が塩基対形成されない、または最も好ましくはその全てが塩基対形成されない。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域、または全てのｄｓＲＮＡ領域の４分の１〜６分の１のリボヌクレオチドが、非標準塩基対形成されるか、またはＲＮＡ分子内で塩基対形成されない。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域、または全てのｄｓＲＮＡ領域は、１０または９または好ましくは８つの連続する標準的な塩基対を含まない。代替的実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、少なくとも８つの連続する標準的な塩基対、例えば８〜１２または８〜１４または８〜１０の連続する標準的な塩基対を含む。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内、またはＲＮＡ分子内の全てのｄｓＲＮＡ領域内の全てのリボヌクレオチドは、標準的な塩基対または非標準塩基対と塩基対形成する。一実施形態では、センスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド、またはアンチセンスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド、またはその両方は、塩基対形成をしない。一実施形態では、各センスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド及び各アンチセンスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチドは、本発明のＲＮＡ分子内で塩基対形成されない。
一実施形態では、ＲＮＡ分子のアンチセンスリボヌクレオチド配列の１つ以上または全てが、標的ＲＮＡ分子の領域の相補体、または標的ＲＮＡ分子内で連続していてもよい、または連続していなくてもよい２つのそのような領域に対して配列が、１００％未満同一、または約８０％〜９９．９％同一、または約９０％〜９８％同一、または約９５％〜９８％同一、好ましくは９８％〜９９．９％同一である。好ましい実施形態では、アンチセンスＲＮＡ配列のうちの１つ以上は、標的ＲＮＡ分子の補体の領域、例えば、２１、２３、２５、２７、３０、または３２の連続するヌクレオチドを含む領域に対して、配列が１００％同一である。一実施形態では、センスもしくはアンチセンスリボヌクレオチド配列、好ましくはその両方は、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、または約１００〜約１，０００の連続するヌクレオチド長である。植物細胞または真菌細胞のＲＮＡ分子を使用する場合、または非脊椎動物細胞のために使用する場合、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが好ましい。脊椎動物細胞においてＲＮＡ分子を使用する場合、５０ヌクレオチド以下、例えば３１〜５０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ中のセンス及びアンチセンスリボヌクレオチド配列の長さが好ましい。しかし、ｄｓＲＮＡ領域中に５０より多い塩基対を有するＲＮＡ分子、例えば１００またはさらには２００塩基対までの塩基対を有するＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ領域中にＧ：Ｕ塩基対で塩基対を形成するヌクレオチドの１０〜３０％を有することを条件として、脊椎動物細胞において使用することができる。一実施形態では、センスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチドの数は、ハイブリダイズする対応するアンチセンスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチドの数の約９０％〜約１１０％、好ましくは９５％〜１０５％、より好ましくは９８％〜１０２％、さらにより好ましくは９９％〜１０１％である。最も好ましい実施形態では、センスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチド数は、対応するアンチセンスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチド数と同じである。これらの特徴は、ＲＮＡ分子の各ｄｓＲＮＡ領域に適用することができる。
第１〜第５の態様の実施形態では、ＲＮＡ分子の第１の３’リボヌクレオチド及び第２の５’リボヌクレオチドは、少なくとも４のリボヌクレオチド、または４〜１，０００のリボヌクレオチド、または好ましくは４〜２００のリボヌクレオチド、より好ましくは４〜５０のリボヌクレオチドからなるループ配列により共有結合している。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、第１の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列、または第２の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列、またはその両方をさらに含む。一実施形態では、キメラＲＮＡ分子は、第２の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列、または第１の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列、またはその両方をさらに含む。本実施形態では、ＲＮＡ分子は、核酸分子からの転写により単一のＲＮＡ転写物として生成され、次いで２本のＲＮＡ鎖を含むようにプロセシングされる可能性があるが、ハイブリダイズしてＲＮＡ分子を形成する２本の別々のＲＮＡ鎖を含む。
任意のイントロンからスプライシングで切り出された後であるが、Ｄｉｃｅｒ酵素または他のＲＮＡｓｅによるＲＮＡ分子のプロセシングの前に一本鎖のＲＮＡとして生成された本発明のＲＮＡ分子の全長は、典型的には５０〜２０００リボヌクレオチド、好ましくは６０または７０〜２０００リボヌクレオチド、より好ましくは８０または９０〜２０００リボヌクレオチド、さらにより好ましくは１００または１１０〜２０００リボヌクレオチドである。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の最小長は１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、または２００ヌクレオチドであり、最大長は４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１５００、または２０００リボヌクレオチドである。これらの前述の最小長と最大長の各組み合わせが検討される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、または細菌もしくは他の微生物細胞、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞などの細胞、または標的ＲＮＡ分子が下方制御される真核細胞での転写による、そのような長さのＲＮＡ分子の生成は、容易に達成される。
第１〜第５の態様の一実施形態では、キメラＲＮＡ分子は、同じまたは好ましくは異なる配列である２つ以上のｄｓＲＮＡ領域を含む。
第１〜第５の態様の好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、真核細胞で発現される、すなわち細胞内での転写により産生される。これらの実施形態では、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有する類似のＲＮＡ分子のプロセシングと比較すると、長さが２２及び／または２０リボヌクレオチドのＲＮＡ分子のプロセシングにより、より大きな割合のｄｓＲＮＡ分子が形成される。すなわち、これらの実施形態のＲＮＡ分子は、そのｄｓＲＮＡ領域がＲＮＡ分子から生成された２０〜２４ヌクレオチドのａｓＲＮＡの総数の割合として、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する類似のＲＮＡ分子よりも２２及び／または２０リボヌクレオチドの短鎖アンチセンスＲＮＡを提供するためにより容易にプロセシングされる。異なって表現すると、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有する類似のＲＮＡ分子のプロセシングと比較すると、長さが２３及び／または２１リボヌクレオチドのＲＮＡ分子のプロセシングにより、より小さい割合のｄｓＲＮＡ分子が形成される。すなわち、これらの実施形態のＲＮＡ分子は、そのｄｓＲＮＡ領域がＲＮＡ分子から生成された２０〜２４ヌクレオチドのａｓＲＮＡの総数の割合として、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する類似のＲＮＡ分子よりも２３及び／または２１リボヌクレオチドの短鎖アンチセンスＲＮＡを提供するためのプロセシングは容易でない。好ましくは、遺伝子構築物からの転写によって細胞内で産生されるＲＮＡ転写物の少なくとも５０％は、Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされない。一実施形態では、ＲＮＡ分子が真核細胞内で発現される場合、すなわち細胞内での転写によって産生される場合、ＲＮＡ分子のプロセシングによって形成される短鎖アンチセンスＲＮＡ分子のより大きな割合は、標準塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有する類似のＲＮＡ分子のプロセシングと比較して、５’末端に共有結合した１つ超のリン酸塩を有する。すなわち、短鎖アンチセンスＲＮＡ分子のより大きな割合は、ゲル電気泳動実験で分子の移動度シフトとして観察され得る変化した電荷を有する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子の２つ以上の特徴の組み合わせを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子、好ましくは本明細書に記載されるキメラＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、染色体などのより大きなＤＮＡ分子に組み込むことができるＤＮＡ構築物である。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞においてＲＮＡ分子の発現を指示することができるプロモーターに作動可能に連結されている。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは植物細胞もしくは動物細胞などの真核細胞であり得る。一実施形態では、プロモーターはポリヌクレオチドに対して異種である。ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、キメラまたは組換えポリヌクレオチド、または単離及び／または外因性ポリヌクレオチドであり得る。一実施形態では、プロモーターはｉｎ ｖｉｔｒｏで機能することができ、例えばバクテリオファージプロモーター、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどである。一実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一実施形態では、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであり、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写中または転写後にスプライシングで切り出されることができる少なくとも１つのループ配列中にイントロンを含むＲＮＡ前駆体分子をコードする。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの使用に適したバイナリーベクターなどのプラスミドベクターである。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、順に、宿主細胞においてＲＮＡ分子の転写を開始することができるプロモーター、ＲＮＡ分子、好ましくはｈｐＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーター、ならびに転写終結及び／またはポリアデニル化領域を含むキメラＤＮＡである。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、センスリボヌクレオチド配列、ループ配列及びアンチセンスリボヌクレオチド配列を含むヘアピンＲＮＡ構造を含み、より好ましくは、センスリボヌクレオチド配列及びアンチセンスリボヌクレオチド配列は、塩基対を形成して、ｄｓＲＮＡ領域を形成し、ｄｓＲＮＡ領域内のリボヌクレオチドの約５％〜約４０％が、非標準塩基対、好ましくはＧ：Ｕ塩基対で塩基対を形成している。好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞または真菌細胞である。
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが真核宿主細胞、好ましくは植物、または真菌細胞にある実施形態では、本発明のＲＮＡ分子をコードする領域に作動可能に連結されるポリヌクレオチドまたはベクターのプロモーター領域は、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有するＲＮＡ分子をコードする対応するポリヌクレオチドまたはベクターのプロモーターと比較した場合、より低いレベルのメチル化を有する。一実施形態では、より低いレベルのメチル化は、対応するポリヌクレオチドまたはベクターのプロモーターと比較した場合、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満である。一実施形態では、宿主細胞は、本発明のＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドまたはベクターの少なくとも２つのコピーを含む。本実施形態では、
ｉ）真核細胞における標的ＲＮＡ分子の発現及び／または活性の減少レベルが、ポリヌクレオチドまたはベクターの単一コピーを有する対応する真核細胞と比較して少なくとも同じである、及び／または、
ｉｉ）真核生物細胞における標的ＲＮＡ分子の発現及び／または活性の減少レベルが、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有するＲＮＡ分子を含む対応する細胞と比較した場合に低い。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡ分子、キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（長さ２０〜２４ｎｔ）、本明細書に記載のポリヌクレオチド、またはそれらを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞などの酵母細胞、植物細胞、または非ヒト動物細胞、好ましくは植物細胞などの非ヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、細胞培養中の非ヒト細胞またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、動物細胞以外の細胞などの真核細胞である。一実施形態では、細胞は、原核細胞などの微生物細胞である。一実施形態では、宿主細胞は生きている。代替的実施形態では、宿主細胞は死んでいる、及び／または生殖不能である。宿主細胞は、転写及び／またはプロセシングによりＲＮＡ分子が産生された細胞であってもよく、または転写及び／またはプロセシングによりＲＮＡ分子が産生された細胞以外の細胞、例えば、標的ＲＮＡ分子を含む細胞であってもよい。
一実施形態では、宿主細胞は、好ましくは植物細胞または真菌細胞であり、キメラＲＮＡ分子もしくはキメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方を含み、キメラＲＮＡ分子は、５’から３’の順で、第１のセンスリボヌクレオチド配列、ループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列、及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、宿主細胞は真核生物細胞であり、この細胞は、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含み、
ｉ）真核細胞における標的ＲＮＡ分子の発現または活性の低下のレベルが、細胞がポリヌクレオチドの単一コピーを有する場合の標的ＲＮＡ分子の発現または活性の低下のレベルとほぼ同じか、またはそれよりも大きい、及び／または
ｉｉ）真核細胞における標的ＲＮＡ分子の発現または活性の減少レベルが、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有するＲＮＡ分子を含む対応する細胞と比較した場合に低い。
別の態様では、本発明は、本発明のＲＮＡ分子、好ましくは本明細書に記載のキメラＲＮＡ分子、それらを含む本発明のキメラＲＮＡ分子もしくはポリヌクレオチドもしくはベクター、またはそれらを含む宿主細胞のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（長さ２０〜２４ｎｔ）を含む非ヒト生物、好ましくは動物または植物を提供する。一実施形態では、非ヒト生物、好ましくは植物または菌類は、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、トランスジェニックである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、非ヒト生物のゲノムに安定して組み込まれている。また、本発明としては、ＲＮＡ分子、もしくはキメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（長さ２０〜２４ｎｔ）、またはその両方、及び／または本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを含む動植物の部位、及びそこから得られる産生物、例えば、種子、作物、収穫物、及びそこから産生される収穫後の産生物も挙げられる。
別の態様では、本発明は、本発明のＲＮＡ分子を生成する方法であって、該方法が、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞または無細胞発現系において発現させることを含む、方法を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子をコードするキメラＤＮＡ分子である。本実施形態では、本方法はさらに、ＲＮＡ分子を少なくとも部分的に精製することをさらに含んでも含まなくてもよい
別の態様では、本発明は、細胞または非ヒト生物、好ましくは植物細胞、植物または真菌を産生する方法であって、該方法が、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターまたはＲＮＡ分子を細胞、好ましくは動物細胞、植物細胞または真菌に導入することを含み、好ましくは、該ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドまたはベクターまたはその一部が細胞のゲノムに安定的に組み込まれるようにする、方法を提供する。一実施形態では、細胞は動物細胞、例えばヒト細胞であり、これは培養中の動物細胞であってもよい。一実施形態では、非ヒト生物は、細胞またはその子孫細胞から、例えば、トランスジェニック植物を再生し、任意にそこから子孫植物を産生することによって生成される。一実施形態では、非ヒト生物は、細胞または１つ以上の子孫細胞を非ヒト生物に導入することにより生成される。ポリヌクレオチドまたはベクターの細胞のゲノムへの安定した組み込みの代わりに、ポリヌクレオチドまたはベクターを、例えば、細胞または生物において一過的にＲＮＡ分子を産生するために、ポリヌクレオチドまたはベクターをゲノムに組み込むことなく細胞に導入してもよい。一実施形態では、非ヒト生物、例えば動物または植物は、害虫または病原体、例えば動物の害虫または病原体、植物の害虫または病原体、好ましくは昆虫の害虫または真菌の病原体に対して耐性がある。一実施形態では、方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターまたはＲＮＡ分子を含む１つ以上の非ヒト生物、好ましくは植物を、害虫または病原体に対する耐性について試験を行うステップを含む。試験対象の非ヒト生物、例えば植物は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターまたはＲＮＡ分子が最初に導入された非ヒト生物、好ましくは植物からの子孫であってもよく、したがって、方法は、そのような子孫を得るステップを含んでいてもよい。本方法は、害虫または病原体に対して耐性を有する非ヒト生物、例えば動物または植物を特定するステップ及び／または選択するステップをさらに含んでもよい。例えば、それぞれが本発明のポリヌクレオチドまたはベクターまたはＲＮＡ分子を含む複数の非ヒト生物（例えば動物または植物）を試験して、害虫または病原体に対して耐性を有するものを特定することができ、特定された非ヒト生物、動物、または植物から子孫を得ることができる。
別の態様では、本発明は、本発明の宿主細胞または生物またはその一部の抽出物であって、該抽出物が、本発明のＲＮＡ分子、該キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（２０〜２４ｎｔ長）、またはその両方、及び／または本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを含む、抽出物を提供する。一実施形態では、本発明は、本発明のＲＮＡ分子、該キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（２０〜２４ｎｔ長）、またはその両方、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の方法により生成される抽出物のうちの１つ以上、及び１つ以上の好適な担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、ヒトまたは他の動物への投与に適した組成物などの医薬組成物である。医薬組成物は、疾患の予防もしくは治療、または化粧品用途などの局所用途に適していてもよい。一実施形態では、組成物は、植物、好ましくはフィールドの植物もしくは植物集団、例えば、局所噴霧、または昆虫もしくは昆虫集団への適用に適している。一実施形態では、組成物は、例えばフィールドの作物に噴霧することによる作物への適用に適している。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子、または該キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（２０〜２４ｎｔ長）、またはその両方を含む抽出物または組成物は、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチド及び／またはベクターの安定性を増強し、これにより、ＲＮＡ分子、ポリヌクレオチドまたはベクターが、例えば、生物の細胞などの細胞により取り込まれるのを助ける、少なくとも１つの化合物をさらに含む。一実施形態では、化合物は、トランスフェクション促進剤、例えば脂質含有化合物である。
別の態様では、本発明は、細胞または生物、例えば、その一部における標的ＲＮＡ分子のレベル及び／または活性を低下または下方制御する方法であって、該方法が、本発明の１つ以上のＲＮＡ分子（複数可）、または該キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（２０〜２４ｎｔ長）、またはその両方、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の組成物を細胞または生物に送達することを含む、方法を提供する。この文脈において、送達することは、ＲＮＡ分子もしくは短鎖ＲＮＡ分子、またはそれらの混合物、または本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを細胞または生物に送り込む、接触させる、露出させる、形質転換させる、または他の方法で導入することを介して行うことができる。導入することは、本発明のＲＮＡ分子、ポリヌクレオチドもしくはベクターの取り込みを増加させる剤、例えばトランスフェクション促進剤、ＤＮＡ結合ポリペプチドもしくはＲＮＡ結合ポリペプチドの助けにより使用することによって増強されてもよく、またはそのような剤を添加することなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターに対してトランスジェニックである種子を植え付け、その種子を本発明のＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック植物に生育させることによって行われてもよい。一実施形態では、標的ＲＮＡ分子はタンパク質をコードする。一実施形態では、本方法は、複数の標的ＲＮＡ分子（該標的ＲＮＡ分子は異なっている）のレベル及び／または活性を低下させる、例えば遺伝子ファミリーなどからの配列に関連する２つ以上の標的ＲＮＡのレベル及び／または活性が低下する。このように、一実施形態では、キメラＲＮＡ分子もしくはキメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方を、細胞もしくは生物、好ましくは植物細胞、植物、真菌もしくは昆虫に、細胞もしくは生物への局所適用によって接触させるか、または生物のための飼料中に提供する。
別の態様では、本発明は、非ヒト生物（例えば、動物の害虫もしくは病原体、または植物の害虫もしくは病原体など）を制御する方法であって、該方法は、本発明の１つ以上のＲＮＡ分子（複数可）、またはキメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（２０〜２４ｎｔ長）、またはその両方、または本発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、本発明の宿主細胞、本発明の方法により生成される抽出物、または本発明の組成物を非ヒト生物に送達することを含み、該ＲＮＡ分子及び／または短鎖ＲＮＡ分子が、非ヒト生物に有害な影響を与える、方法を提供する。一実施形態では、非ヒト生物は、例えば昆虫などの節足動物、または例えば草などの植物である。一実施形態では、非ヒト生物は植物であり、昆虫は植物またはその一部を食し、これにより昆虫が防除される。防除は、害虫もしくは病原体の生存率の低下、または害虫もしくは病原体の適応度もしくは生殖率の低下、またはその両方を含んでいてもよい。防除は、ＲＮＡ分子が最初に導入された害虫または病原体の子孫の生存及び／または生殖が低下することを包含し得る。
本発明の別の態様は、害虫または病原体による非ヒト生物、例えば動物または植物への損傷を減少させる方法であって、該方法は、１つ以上の本発明のＲＮＡ分子（複数可）、もしくはキメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（長さ２０〜２４ｎｔ）、またはその両方、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、本発明の宿主細胞、本発明の方法によって生成される抽出物、または本発明の組成物を害虫もしくは病原体に送達すること、または害虫または病原体と接触させることを含む方法に関する。一実施形態では、方法は、本発明のポリヌクレオチドに対してトランスジェニックである種子を播種することを含み、それによって得られた植物は、本発明のＲＮＡ分子を生成するための導入遺伝子を発現し、それによって害虫または病原体によって引き起こされる損傷を減少させる。本発明は、それによって、動物または植物の害虫または病原体を防除する手段を農家に提供する。本発明は、細胞または生物に提供された本発明のＲＮＡ分子、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含む細胞または生物、例えば動物もしくは植物、またはその一部、及びＲＮＡ分子もしくは該キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（長さ２０〜２４ｎｔ）、またはその両方、または本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを含む害虫または病原体にも適用される。害虫または病原体は、生存していても死んでいてもよい。本発明はまた、ＲＮＡ分子もしくは短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方を含む後代細胞または生物に関する。
一実施形態では、本発明は、対象における疾患を予防するかまたは治療する方法であって、該方法は、本発明の１つ以上のＲＮＡ分子（複数可）、または該キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子（２０〜２４ｎｔ長）、またはその両方、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、本発明の宿主細胞、本発明の方法により生成される抽出物、または本発明の組成物を対象に投与することを含み、該ＲＮＡ分子もしくは短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方が、疾患の少なくとも１つの症状に対して有益な影響を与える、方法を提供する。一実施形態では、ＲＮＡ分子または短鎖ＲＮＡ分子、ポリヌクレオチド、ベクターまたは組成物は、局所投与、経口投与、または注射される。一実施形態では、対象は、脊椎動物である。一実施形態では、脊椎動物は、ヒトなどの哺乳動物、ウシもしくはヒツジなどの家畜、またはニワトリ及び他の家禽などの鳥類である。
別の態様では、本発明は、対象の疾患の予防または治療に使用するための、本発明のＲＮＡ分子、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、本発明の宿主細胞、本発明の方法により生成された抽出物、または本発明の組成物を提供し、該ＲＮＡ分子もしくは短鎖ＲＮＡ分子、または両方は、疾患の少なくとも１つの症状に対して有益な影響を与える。一実施形態では、本発明は、対象の疾患の予防または治療のための医薬品を製造するための、本発明のＲＮＡ分子、またはそれから生成される短鎖ＲＮＡ分子、発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、本発明の宿主細胞、本発明の方法により生成された抽出物、または本発明の組成物の使用であって、該ＲＮＡ分子、もしくはそれから生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方が、疾患の少なくとも１つの症状に対して有益な影響を与える、使用を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のＲＮＡ分子（複数可）、またはそれから生成される短鎖ＲＮＡ分子、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクター、本発明の宿主細胞、本発明の方法により生成された抽出物、または本発明の組成物を含むキットを提供する。キットは、キットの使用説明書をさらに含んでいてもよい。
トランスジェニック発現系でより広く使用されている一方で、本明細書で論じるように、疾患及び／または害虫を防除するために作物に噴霧するなど、ｄｓＲＮＡ分子の大規模生成の必要性に依存するｄｓＲＮＡ技術の適用も存在する。本発明者らは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、そこで発現するｄｓＲＮＡ分子が切断されないことから、大規模生成工程での使用に適した生物として特定した。このように、さらなる態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡ分子を製造するためのプロセスを提供し、該プロセスは、
ａ）１つ以上のｄｓＲＮＡ分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを培養することと、
ｂ）ｄｓＲＮＡ分子を産生するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからｄｓＲＮＡ分子を採取することと、を含み、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、少なくとも１リットルの容量で培養する。
ｄｓＲＮＡは、本発明のｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡなどの任意の構造を有することができる。
一実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、少なくとも１０リットル、少なくとも１００リットル、少なくとも１，０００リットル、少なくとも１万リットル、または少なくとも１０万リットルの容積で培養される。
一実施形態では、該プロセスは、本発明のＲＮＡ分子を少なくとも０．１ｇ／リットル、少なくとも０．５ｇ／リットルまたは少なくとも１ｇ／リットル生成する。
本プロセスを用いて生成されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはそこから単離されたｄｓＲＮＡ分子（精製または部分的に精製された（例えば、抽出）状態のいずれか）は、本明細書に記載されている方法、これらに限定されないが、例えば、細胞もしくは生物中の標的ＲＮＡ分子のレベル及び／または活性を低下もしくは下方制御する方法、害虫もしくは病原体による非ヒト生物への損傷を減少させる方法、非ヒト生物を防除する方法、または対象の疾患を予防するもしくは治療する方法に使用することができる。
本明細書のいかなる実施形態も、特段明記されない限り、必要な変更を加えて、他の任意の実施形態に適用されると解釈するものとする。
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲を制限されることはなく、それらの実施形態は、例示のみを目的とする。本明細書に記載されるように、機能的に同等の製品、組成物及び方法は明らかに本発明の範囲内である。
本明細書全体を通じて、特段明記されない限り、または文脈上、特に必要とされていない限り、単一のステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群への言及は、これらのステップ、物質の組成、ステップの群、または物質の組成の群の１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
本発明は、以下の非限定的な例により、及び添付の図面を参照して、以下に記載される。
２つのｌｅｄＲＮＡ分子の概略図である。（Ａ）このｌｅｄＲＮＡ分子は、介在するスペーサー配列を含まずに共有結合し、標的ＲＮＡと同一性を有する、２つの隣接するセンス配列とみなすことができるセンス配列、センス配列に相補的で２つの領域に分割されたアンチセンス配列、５’領域及び３’領域、ならびにアンチセンス配列からセンスを分離する２つのループを含む。（Ｂ）このｌｅｄＲＮＡ分子は、介在するスペーサー配列を含まずに共有結合し、標的ＲＮＡの相補体と同一性を有する、２つの隣接するアンチセンス配列とみなすことができるアンチセンス配列、アンチセンス配列に相補的で２つの領域に分割されたセンス配列、ならびにアンチセンス配列からセンスを分離する２つのループを含む。転写、例えばＴ７またはＳｐ６プロモーターなどのプロモーターからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成されたＲＮＡ分子は、相補的なセンス配列とアンチセンス配列との間の塩基対形成によって自己アニーリングし、両端にループがあり、アンチセンスまたはセンス配列のいずれかに「ニック」を有する二本鎖領域を形成する。追加の配列は、５’−または３’−伸長として５’及び／または３’末端に結合され得る。 ｌｅｄＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの形成において、センス／アンチセンスアニーリングまたはヘアピンＲＮＡよりも効率的である。二本鎖ＲＮＡ分子の３つの形態の概略図を示す：Ａは２つの別々の鎖のアニーリングによって形成された従来のｄｓＲＮＡ、Ｂは５’−及び３’−伸長を有するヘアピンＲＮＡ、及びＣはｌｅｄＲＮＡ分子である。下段のパネルは、ＧＵＳ遺伝子またはＧＦＰ遺伝子のいずれかを標的とする３種類のＲＮＡ分子のＲＮＡ転写物のゲル電気泳動後の写真を示す。 処理済み（Ａ及びＢ）及び未処理の遠位（Ｃ及びＤ）組織のノーザンブロットハイブリダイゼーションは、ｌｅｄＲＮＡがｄｓＲＮＡよりも安定しており、タバコの葉の組織全体に広がることを示す。遠位組織（Ｃ及びＤ、上部パネル）では、強力なｌｅｄＲＮＡシグナルとは対照的に、ｄｓＲＮＡシグナルを検出できなかった。 ｌｅｄＲＮＡ処理は、処理領域（１）及び上記の未処理領域（３）の両方でＧＵＳの下方制御を誘導した。 ｌｅｄＲＮＡは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉でＦＡＤ２．１遺伝子のサイレンシングを誘導する。 ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、６及び２４時間目にｌｅｄＦＡＤ２．１で処理することにより、ＦＡＤ２．１ ｍＲＮＡの強い下方制御が確認される。 ＧＵＳ標的遺伝子の領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）及びｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物のセンス配列（配列番号１１のヌクレオチド９〜２０８）のアラインメントである。５２のシチジン（Ｃ）ヌクレオチドがチミジン（Ｔ）ヌクレオチドで置換された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＣにはアスタリスクが付けられていない。 ＧＵＳ標的遺伝子の領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）及びｈｐＧＵＳ［１：４］構築物のセンス配列（配列番号１２のヌクレオチド９〜２０８）のアラインメントである。ｈｐＧＵＳ［１：４］の各４番目のヌクレオチドを対応する野生型センス配列に対して置換し、これにより、４番目のヌクレオチド毎に、ＣがＧに変更され、ＧがＣに変更され、ＡがＴに変更され、ＴがＡに変更された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＧ及びＣにはアスタリスクが付けられておらず、置換されたＡ及びＴはセミコロンで示されている。 ＧＵＳ標的遺伝子の領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）及びｈｐＧＵＳ［２：１０］構築物のセンス配列（配列番号１３のヌクレオチド９〜２０８）のアラインメントである。ｈｐＧＵＳ［２：１０］の１０ヌクレオチドの各ブロックの各９番目及び１０番目のヌクレオチドを対応する野生型センス配列に対して置換し、これにより、９番目及び１０番目のヌクレオチド毎に、ＣがＧに変更され、ＧがＣに変更され、ＡがＴに変更され、ＴがＡに変更された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＧ及びＣにはアスタリスクが付けられておらず、置換されたＡ及びＴはセミコロンで示されている。 ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とする改変ヘアピンＲＮＡをコードする遺伝的構築物の構造を示す概略図である。 ＧＵＳ標的遺伝子を提供するタバコ植物を形質転換するために使用されるベクターｐＷＢＰＰＧＨの概略図である。Ｔ−ＤＮＡは、ベクターの右境界（ＲＢ）から左境界（ＬＢ）まで伸びている。Ｔ−ＤＮＡの選択マーカー遺伝子は、ハイグロマイシン耐性をコードする３５Ｓ−ＨＰＴ−ｔｍ１’遺伝子である。 ＧＵＳ標的遺伝子の発現を低下させるための改変ヘアピンＲＮＡをコードする構築物で形質転換した植物のＧＵＳ活性である。ｈｐなし：ｈｐＧＵＳ構築物なしの対照ＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４植物である。対応する対照ＰＰＧＨ１１またはＰＰＧＨ２４植物と比較して１０％未満のＧＵＳ活性を示す植物の数、及び試験された植物の数に対するそのような植物の割合は括弧内に示されている。 （Ａ）全てのトランスジェニック植物の平均ＧＵＳ活性：ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］は５９植物、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］は７４、ｈｐＧＵＳ［１：４］は３３、ｈｐＧＵＳ［２：１０］は４１である。（Ｂ）全てのサイレント植物の平均ＧＵＳ活性：ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］は３２、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］は７１、ｈｐＧＵＳ［１：４］は３３、ｈｐＧＵＳ［２：１０］は２８である。 ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］、またはｈｐＧＵＳ［１：４］を含むトランスジェニック後代植物のＧＵＳ活性である。 ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物で形質転換された１６の植物からのＤＮＡのサザンブロットのオートラジオグラフである。ゲル電気泳動の前にＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＯＣＳ−Ｔプローブでプローブした。レーン１：サイズマーカー（ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたラムダＤＮＡ）；レーン２及び３：親植物ＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４のＤＮＡ；レーン４〜１９：１６の異なるトランスジェニック植物のＤＮＡである。 トランスジェニックタバコ植物で発現したヘアピンＲＮＡに由来するセンス（上段パネル）及びアンチセンス（下段パネル）ｓＲＮＡを検出するノーザンブロットハイブリダイゼーション実験のオートラジオグラムである。レーン１及び２は、ｈｐＧＵＳ構築物を欠く親植物ＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４から得られたＲＮＡを含んでいた。レーン３〜１１はｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物のＲＮＡを含み、レーン１２〜２０はｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物のＲＮＡを含んでいた。 トランスジェニック植物からアンチセンスｓＲＮＡを検出するためのノーザンブロットハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。レーン１〜１０はｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物由来であり、レーン１１〜１９はｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物由来であった。アンチセンスｓＲＮＡは、２０〜２４ｎｔ長に対応する移動度を有する。ブロットは、レーンローディング対照としてＵ６ ＲＮＡに対するアンチセンスで再プローブした。 トランスジェニック植物のアンチセンスｓＲＮＡを検出するための繰り返しノーザンブロットハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。 トランスジェニック植物のｈｐＧＵＳ構築物の３５Ｓプロモーター及びセンスＧＵＳ領域のジャンクション領域のＤＮＡメチル化分析である。ジャンクション断片を、ＭｃｒＢＣ酵素による植物ＤＮＡの事前処理あり（＋）またはなし（−）のいずれかでＰＣＲ増幅した。 トランスジェニック植物のｈｐＧＵＳ構築物の３５Ｓプロモーター領域のＤＮＡメチル化分析である。３５Ｓ断片は、ＭｃｒＢＣ酵素による植物ＤＮＡの事前処理あり（＋）またはなし（−）のいずれかでＰＣＲ増幅した。 プロセシングされたＲＮＡのサイズ分布及び存在量である。（Ａ）ＥＩＮ２構築物である。（Ｂ）ＧＵＳ構築物である。 ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構築物のセンス配列（上段配列、配列番号２２のヌクレオチド１７〜２１６）と、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＩＮ２標的遺伝子に対応するｃＤＮＡの領域のヌクレオチド配列（下段配列、配列番号２７）とのアラインメントである。センス配列は、野生型配列の４３シチジン（Ｃ）ヌクレオチドをチミジン（Ｔ）ヌクレオチドで置き換えることによって作成された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＣにはアスタリスクが付けられていない。 ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］構築物のセンス配列（上段配列、配列番号２４のヌクレオチド１３〜２１２）と、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＣＨＳ標的遺伝子に対応するｃＤＮＡの領域のヌクレオチド配列（配列番号２８、下段配列）とのアラインメントである。センス配列は、野生型配列の６５シチジン（Ｃ）ヌクレオチドをチミジン（Ｔ）ヌクレオチドで置き換えることによって作成された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＣにはアスタリスクが付けられていない。 ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］構築物のアンチセンス配列（上段配列、配列番号２５のヌクレオチド８〜２０７）と、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＩＮ２標的遺伝子の相補体の領域のヌクレオチド配列（下段配列、配列番号２９）とのアラインメントである。アンチセンス配列は、野生型配列の４９シチジン（Ｃ）ヌクレオチドをチミジン（Ｔ）ヌクレオチドで置き換えることによって作成された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＣにはアスタリスクが付けられていない。 ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］構築物のアンチセンス配列（上段配列、配列番号２６のヌクレオチド１３〜２１２）と、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＣＨＳ標的遺伝子の相補体の領域のヌクレオチド配列（下段配列、配列番号３０）とのアラインメントである。アンチセンス配列は、野生型配列の４９シチジン（Ｃ）ヌクレオチドをチミジン（Ｔ）ヌクレオチドで置き換えることによって作成された。保存されたヌクレオチドにはアスタリスクが付けられ、置換されたＣにはアスタリスクが付けられていない。 エチレン非感受性２（ＥＩＮ２）及びカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）ｈｐＲＮＡ構築物の概略図である。３５ＳはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターであり、ＥＩＮ２及びＣＨＳ領域は、野生型配列（ｗｔ）またはＧ：Ｕ改変配列（Ｇ：Ｕ）のいずれかとして示される。矢印はＤＮＡ断片の方向を示し、右から左の矢印はアンチセンス配列を示す。制限酵素部位も示されている。 ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］またはｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］のいずれかを含む、ＥＩＮ２アッセイにおけるトランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａ実生の胚軸長である。 アクチン２ ＲＮＡのレベルに正規化された、ｈｐＣＨＳ［ｗｔ］またはｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］構築物のトランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａトランスジェニックにおけるＣＨＳ ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲである。Ｃｏｌ−０は野生型（非トランスジェニック）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａである。 ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］またはｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］で形質転換された植物のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションのオートラジオグラフである。上段パネルは、系統の胚軸長を示す。オートラジオグラフは、アンチセンスｓＲＮＡを検出するためにＥＩＮ２センスプローブでプローブされたノーザンブロットを示す。同じブロットを、ローディング対照（Ｕ６ ＲＮＡ）としてＵ６ ＲＮＡプローブで再プローブした。 トランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物のゲノムＤＮＡにおける３５Ｓプロモーター及び３５Ｓ−センスＥＩＮ２配列のＤＮＡメチル化分析である。 プロモーター及びヘアピンＲＮＡ構築物の５’領域におけるＤＮＡメチル化のレベルである。 ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］集団の最もメチル化されていない系統の３５Ｓプロモーターは、依然として著しいメチル化を示す。 Ｇ：Ｕ ｈｐＥＩＮ２系統の３５Ｓプロモーターは、弱いメチル化のみを示す（１０％未満）。 ７２時間目のＣＨＯ及びＶｅｒｏ細胞においてＧ：Ｕ遺伝子サイレンシングしたｌｅｄＲＮＡ及びｈｐＲＮＡである。 ４８時間目にＨｅｌａ細胞において試験したダンベルプラスミドである。 ｄｓＲＮＡ分子の可能な改変例である。 モモアカアブラムシにおけるＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１遺伝子の発現を下方制御するためのｌｅｄＲＮＡを添加した人工飼料を摂取後のアブラムシのパフォーマンスの低下である。上段パネル（Ａ）：５０ｎｇ／μｌのｌｅｄＲＮＡ１００μｌを１０日間投与した後の成虫アブラムシあたりの平均幼虫数である。下段パネル（Ｂ）：ＭｐＣ００２、ＭｐＲａｃｋ−１、または対照ｌｅｄＧＦＰの２００ｎｇ／μｌのｌｅｄＲＮＡを含む１００μｌを摂取後、５日間のタイムコースで生存するアブラムシの割合である。 完全長センスＧＵＳ転写物をプローブとして使用して、ｌｅｄＧＵＳ及びｈｐＧＵＳ ＲＮＡを検出するためのノーザンブロットハイブリダイゼーションである。下部の「＋」は高ＧＵＳ発現を示し、「−」はＧＵＳ発現が少ない／ＧＵＳ発現がない、すなわち強いＧＵＳサイレンシングを示す。 長いｈｐＥＩＮ２及びｌｅｄＥＩＮ２ ＲＮＡを検出するためのノーザンブロットハイブリダイゼーション（上のパネル）及び２つの構築物に由来するｓｉＲＮＡ（下のパネル）である。 ＧＵＳ ｈｐＲＮＡ構築物から発現した転写物のステムループ構造を模式的に示した図である。転写物は、相補的なセンス配列及びアンチセンス配列を有しており、これらの配列は、ＧＵＳ配列特異的なｄｓＲＮＡステムを形成するために塩基対形成しており、ステムの塩基対長（ｂｐ）、及びループ内のヌクレオチド数（ｎｔ）を示している。ＧＦＰ ｈｐＲＮＡ構築物は、完全に標準的な塩基対形成するＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡステムを形成する転写物（ＧＦＰｈｐ［ＷＴ］、または塩基対の約２５％をＧ：Ｕ塩基対として有するｄｓＲＮＡステム（ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］、ＧＵＳコーディング配列の領域に由来するループを有する）をコードしていた。ＧＦＰｈｐ転写物のループ配列は、それぞれｍｉＲ１６５／ｍｉＲ１６６に相補的な２つの配列を含み、したがって、これらのｍｉＲＮＡの結合部位を提供する。 ｈｐＲＮＡをコードする導入遺伝子が、植物細胞で発現した時にループ配列の異なる断片を生成することを示すノーザンブロットハイブリダイゼーション解析を示す図である。（Ａ）ＧＵＳ標的遺伝子（ＧＵＳ）及び１１００ｎｔのスペーサー／ループ配列を有する長いｈｐＲＮＡ導入遺伝子ＧＵＳｈｐ１１００の発現を示す。導入遺伝子の発現を増強するために、キュウリモザイクウイルス２ｂ ＲＮＡサイレンシングサプレッサー（ＣＭＶ２ｂ）をコードする構築物を含めた。（Ｂ）安定的に形質転換されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物における２つの短鎖ｈｐＲＮＡ導入遺伝子ＧＵＳｈｐ９３−１及びＧＵＳｈｐ９３−２の発現によるＲＮＡを示すノーザンブロット分析である。ＲＮＡサンプルは、ＲＮＡｓｅ Ｉで処理した（＋）または処理しなかった（−）のいずれかであった。両ＲＮＡブロットは、ループ特異的アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズした。 ＧＵＳｈｐ１１００のループは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞内で高レベルまで蓄積され、ＲＮａｓｅ Ｒの消化に耐性があった。 ＧＵＳｈｐ１１００構築物を発現するトランスジェニックＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、全長ヘアピンＲＮＡ転写物に対応する単一のＲＮＡ分子種を示した。下段パネルは、トランスジェニックＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＮＡサンプルのノーザンブロットハイブリダイゼーションを示す。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現したＧＵＳｈｐ１１００転写物は完全長のままであり、環状ループＲＮＡを形成していない。最初の４つのレーンは、野生型Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉から単離された総ＲＮＡを補充したＧＵＳｈｐ１１００の完全長またはｄｓＲＮＡステムのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を使用した。 ｈｐＲＮＡループは、ｍｉＲＮＡの効果的な配列特異的リプレッサーとして使用され得る。（Ａ）ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］構築物は、トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に強いｍｉＲ１６５／１６６抑制表現型を誘導した。（Ｂ）トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物からのＲＮＡ中のＧＦＰｈｐ転写物の存在量を決定するためのノーザンブロットハイブリダイゼーションである。（Ｃ）ＧＦＰｈｐループの環状ＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ分析である。
配列表の見出し（ＫＥＹ ＴＯ ＴＨＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ）
配列番号１−ＧＦＰ ｌｅｄＲＮＡのリボヌクレオチド配列
配列番号２−ＧＵＳ ｌｅｄＲＮＡのリボヌクレオチド配列
配列番号３−Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＦＡＤ２．１ ｌｅｄＲＮＡのリボヌクレオチド配列
配列番号４−ＧＦＰ ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号５−ＧＵＳ ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号６−Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＦＡＤ２．１ ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号７−ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列
配列番号８−ＧＵＳをコードするヌクレオチド配列
配列番号９−Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＦＡＤ２．１をコードするヌクレオチド配列
配列番号１０−ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とするヘアピンＲＮＡ分子をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列
配列番号１１−ヘアピンＲＮＡ分子ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列
配列番号１２−ヘアピンＲＮＡ分子ｈｐＧＵＳ［１：４］をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列
配列番号１３−ヘアピンＲＮＡ分子ｈｐＧＵＳ［２：１０］をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列
配列番号１４−ＧＵＳ遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド７８１〜１０２０のヌクレオチド配列
配列番号１５−ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］ＲＮＡのヘアピン構造（そのループを含む）のリボヌクレオチド配列
配列番号１６−ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡのヘアピン構造（そのループを含む）のリボヌクレオチド
配列番号１７−ｈｐＧＵＳ［１：４］ＲＮＡのヘアピン構造（そのループを含む）のリボヌクレオチド
配列番号１８−ｈｐＧＵＳ［２：１０］ＲＮＡのヘアピン構造（そのループを含む）のリボヌクレオチド
配列番号１９−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＩＮ２遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１２０４０６）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２０−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＣＨＳ遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１２１３９６，１７０３ｎｔ）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２１−制限酵素部位が隣接するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＩＮ２遺伝子に対応するｃＤＮＡ由来の２００ｎｔセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２２−ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の構築に使用される、４３ＣがＴに置き換えられたことを除いて配列番号２１と同様のＥＩＮ２の２００ｎｔセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２３−制限酵素部位が隣接するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＣＨＳ遺伝子に対応するｃＤＮＡ由来の２００ｎｔセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２４−ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］の構築に使用される、６５ＣがＴに置き換えられたことを除いて配列番号２３と同様のＣＨＳの２００ｎｔセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２５−ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］の構築に使用される、５０ＣがＴに置き換えられたＥＩＮ２の２００ｎｔアンチセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２６−ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］の構築に使用される、４９ＣがＴに置き換えられたＣＨＳの２００ｎｔアンチセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２７−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＥＩＮ２遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１２０４０６）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド６０１〜９００のヌクレオチド配列
配列番号２８−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＣＨＳ遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１２１３９６）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド８１３〜１１１２のヌクレオチド配列
配列番号２９−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＥＩＮ２遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１２０４０６）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド６５２〜８９１の相補体のヌクレオチド配列
配列番号３０−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＣＨＳ遺伝子に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド８０４〜１１０３の相補体のヌクレオチド配列
配列番号３１−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｃＤＮＡのＦＡＮＣＭ Ｉタンパク質コード領域（アクセッション番号ＮＭ＿００１３３３１６２）標的領域ヌクレオチド６７５〜１１７４（５００ヌクレオチド）
配列番号３２−Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのｃＤＮＡのＦＡＮＣＭ Ｉタンパク質コード領域。標的領域ヌクレオチド８９６〜１３９５（５００ｂｐ）
配列番号３３−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ Ｉタンパク質コード領域を標的とするｈｐＦＡＮＣＭ−Ａｔ［ｗｔ］をコードするヌクレオチド配列。ＦＡＮＣＭセンス配列、ヌクレオチド３８〜５３７；ループ配列、ヌクレオチド５３８〜１３０６；ＦＡＮＣＭアンチセンス配列、ヌクレオチド１３０７〜１８０６。
配列番号３４−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ Ｉタンパク質コード領域を標的とするｈｐＦＡＮＣＭ−Ａｔ［Ｇ：Ｕ］をコードするヌクレオチド配列。ＦＡＮＣＭセンス配列、ヌクレオチド３８〜５３７；ループ配列、ヌクレオチド５３８〜１３０６；ＦＡＮＣＭアンチセンス配列、ヌクレオチド１３０７〜１８０６。
配列番号３５−Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ Ｉタンパク質コード領域を標的とするｈｐＦＡＮＣＭ−Ｂｎ［ｗｔ］をコードするヌクレオチド配列。ＦＡＮＣＭセンス配列、ヌクレオチド３４〜５３３；ループ配列、ヌクレオチド５３４〜１３００；ＦＡＮＣＭアンチセンス配列、ヌクレオチド１３０１〜１８００。
配列番号３６−Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ Ｉタンパク質コード領域を標的とするｈｐＦＡＮＣＭ−Ｂｎ［Ｇ：Ｕ］をコードするヌクレオチド配列。ＦＡＮＣＭセンス配列、ヌクレオチド３４〜５３３；ループ配列、ヌクレオチド５３４〜１３００；ＦＡＮＣＭアンチセンス配列、ヌクレオチド１３０１〜１８００。
配列番号３７−Ｂ．ｎａｐｕｓ ＤＤＭ１遺伝子に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列（アクセッション番号ＸＲ＿００１２７８５２７）
配列番号３８−Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１タンパク質コード領域を標的とするｈｐＤＤＭ１−Ｂｎ［ｗｔ］をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号３９−Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１タンパク質コード領域を標的とするｈｐＤＤＭ１−Ｂｎ［Ｇ：Ｕ］をコードするヌクレオチド配列。ＤＤＭ１センス配列、ヌクレオチド３５〜５３６；ループ配列、ヌクレオチド５３７〜１３０４；ＤＤＭ１アンチセンス配列、ヌクレオチド１３０５〜１８０５。
配列番号４０−ＥＧＦＰ ｃＤＮＡ。
配列番号４１−ｈｐＥＧＦＰ［ｗｔ］のコード領域のヌクレオチド配列（プロモーターに対してアンチセンス／ループ／センスの順）
配列番号４２−ＥＧＦＰセンス配列において１５７ＣがＴへ置換されたｈｐＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］のコード領域のヌクレオチド配列。
配列番号４３−ＥＧＦＰセンス配列においてＣからＴへの置換がないｌｅｄＥＧＦＰ［ｗｔ］のコード領域のヌクレオチド配列。
配列番号４４−ＥＧＦＰセンス配列において１６２ＣがＴへ置換されたｌｅｄＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］のコード領域のヌクレオチド配列。
配列番号４５−隣接する制限酵素部位のないヘアピンＲＮＡ分子ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列。
配列番号４６−隣接する制限酵素部位のないヘアピンＲＮＡ分子ｈｐＧＵＳ［１：４］をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列。
配列番号４７−隣接する制限酵素部位のないヘアピンＲＮＡ分子ｈｐＧＵＳ［２：１０］をコードする構築物にＧＵＳセンス領域を提供するために使用されるヌクレオチド配列。
配列番号４８−隣接する配列のないｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の構築に使用される、４３ＣがＴに置き換えられたことを除いて配列番号２１と同様のＥＩＮ２の２００ｎｔセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。
配列番号４９−隣接する配列のないｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］の構築に使用される、６５ＣがＴに置き換えられたことを除いて配列番号２３と同様のＣＨＳの２００ｎｔセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。
配列番号５０−隣接する配列のないｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］の構築に使用される、５０ＣがＴに置き換えられたＥＩＮ２の２００ｎｔアンチセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号５１−隣接する配列のないｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］の構築に使用される、４９ＣがＴに置き換えられたＣＨＳの２００ｎｔアンチセンス配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。
配列番号５２−２００ｂｐのＧＵＳセンス配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（ＧＵＳ−ＷＴ−Ｆ）
配列番号５３−２００ｂｐのＧＵＳセンス配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（ＧＵＳ−ＷＴ−Ｒ）
配列番号５４−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］断片の生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ＧＵＳ−ＧＵ−Ｆ）
配列番号５５−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ＧＵＳ−ＧＵ−Ｒ）
配列番号５６−４番目のヌクレオチド毎に置換されたｈｐＧＵＳ［１：４］断片の生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ＧＵＳ−４Ｍ−Ｆ）
配列番号５７−４番目のヌクレオチド毎に置換されたｈｐＧＵＳ［１：４］断片の生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ＧＵＳ−４Ｍ−Ｒ）
配列番号５８−９番目と１０番目毎にヌクレオチドが置換されたｈｐＧＵＳ［２：１０］断片の生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ＧＵＳ−１０Ｍ−Ｆ）
配列番号５９−９番目と１０番目毎にヌクレオチドが置換されたｈｐＧＵＳ［２：１０］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ＧＵＳ−１０Ｍ−Ｒ）
配列番号６０−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（３５Ｓ−Ｆ３）
配列番号６１−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（ＧＵＳｗｔ−Ｒ２）
配列番号６２−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（ＧＵＳｇｕ−Ｒ２）
配列番号６３−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（ＧＵＳ４ｍ−Ｒ２）
配列番号６４−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（３５Ｓ−Ｆ２）
配列番号６５−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（３５Ｓ−Ｒ１）
配列番号６６−野生型２００ｂｐのＥＩＮ２センス配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（ＥＩＮ２ｗｔ−Ｆ）
配列番号６７−野生型２００ｂｐのＥＩＮ２センス配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（ＥＩＮ２ｗｔ−Ｒ）
配列番号６８−野生型２００ｂｐのＣＨＳセンス配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＨＳｗｔ−Ｆ）
配列番号６９−野生型２００ｂｐのＣＨＳセンス配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＨＳｗｔ−Ｒ）
配列番号７０−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ＥＩＮ２ｇｕ−Ｆ）
配列番号７１−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ＥＩＮ２ｇｕ−Ｒ）
配列番号７２−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ＣＨＳｇｕ−Ｆ）
配列番号７３−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ＣＨＳｇｕ−Ｒ）
配列番号７４−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ａｓＥＩＮ２ｇｕ−Ｆ）
配列番号７５−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］断片の生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ａｓＥＩＮ２ｇｕ−Ｒ）
配列番号７６−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード）（ａｓＣＨＳｇｕ−Ｆ）
配列番号７７−全てのＣがＴに置き換えられたｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］断片を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（リバース）（ａｓＣＨＳｇｕ−Ｒ）
配列番号７８−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（ＣＨＳ−２００−Ｆ２）
配列番号７９−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（ＣＨＳ−２００−Ｒ２）
配列番号８０−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（Ａｃｔｉｎ２−Ｆｏｒ）
配列番号８１−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（Ａｃｔｉｎ２−Ｒｅｖ）
配列番号８２−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（Ｔｏｐ−３５Ｓ−Ｆ２）
配列番号８３−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（Ｔｏｐ−３５Ｓ−Ｒ２）
配列番号８４−フォワードプライマーをコードするヌクレオチド配列（Ｌｉｎｋ−３５Ｓ−Ｆ２）
配列番号８５−リバースプライマーをコードするヌクレオチド配列（Ｌｉｎｋ−ＥＩＮ２−Ｒ２）
配列番号８６−センスｓｉ２２のリボヌクレオチド配列
配列番号８７−アンチセンスｓｉ２２のリボヌクレオチド配列
配列番号８８−フォワードプライマーのリボヌクレオチド配列
配列番号８９−リバースプライマーのリボヌクレオチド配列
配列番号９０−フォワードプライマーのリボヌクレオチド配列
配列番号９１−リバースプライマーのリボヌクレオチド配列
配列番号９２−ｄｓＲＮＡ分子の可能な改変
配列番号９３−Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＤＤＭ１遺伝子に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列（アクセッション番号ＸＲ＿００１２７８５２７）。
配列番号９４−Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子を標的とするヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡ）構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号９５−Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子を標的とする、Ｇ：Ｕ塩基対を有するヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡ）構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号９６−Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子を標的とする、ｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号９７−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＦＡＮＣＭ遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿００１３３３１６２）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号９８−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とするヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡ）構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号９９−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とする、Ｇ：Ｕ塩基対を有するヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡ）構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１００−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とする、ｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０１−Ｂ．ｎａｐｕｓ ＦＡＮＣＭ遺伝子（アクセッション番号ＸＭ＿０２２７１９４８６．１）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０２−Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とするヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡ）構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０３−Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とする、Ｇ：Ｕ塩基対を有するヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡ）構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０４−Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とする、ｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０５−Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＴＯＲ遺伝子に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１０６−Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＴＯＲ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０７−オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅのアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子（アクセッション番号ＬＴ６０１５８９）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１０８−オオムギ（Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅ）のＡＬＳ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１０９−オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅのＨｖＮＣＥＤ１遺伝子（アクセッション番号ＡＫ３６１９９９）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１１０−オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅのＨｖＮＣＥＤ２遺伝子（アクセッション番号ＤＱ１４５９３１）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１１１−オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ及びコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍのＮＣＥＤ１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１１２−オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ及びコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍのＮＣＥＤ２遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１１３−ＡＢＡ−ＯＨ−２をコードするオオムギ遺伝子（アクセッション番号ＤＱ１４５９３３）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１１４−オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ及びコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＢＡ−ＯＨ−２遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１１５−ＥＩＮ２をコードするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子（Ａｔ５ｇ０３２８０）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１１６−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＥＩＮ２遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１１７−ＣＨＳをコードするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１２１３９６）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１１８−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＣＨＳ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１１９−Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ Ｎ様遺伝子（アクセッション番号ＸＭ＿０１９６０４３４７）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１２０−Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ Ｎ様遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１２１−Ｖｉｔｉｓ ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ ＭＬＯ遺伝子（アクセッション番号ＫＲ３６２９１２）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１２２−Ｖｉｔｉｓ ＭＬＯ遺伝子を標的とする第１のｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１２３−Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅのＭｐＣ００２遺伝子に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１２４−Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅのＭｐＲａｃｋ−１遺伝子に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１２５−Ｍ．ｐｅｒｓｉｃａｅ Ｃ００２遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするキメラ構築物のヌクレオチド配列。
配列番号１２６−Ｍ．ｐｅｒｓｉｃａｅ Ｒａｃｋ−１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするキメラ構築物のヌクレオチド配列。
配列番号１２７−Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ ＡＢＣホワイト遺伝子に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１２８−Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａのＡＢＣトランスポーターホワイト遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１２９−Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ ｈｕｍｉｌｅ ＰＢＡＮタイプの神経ペプチド様（ＸＭ＿０１２３６８７１０）に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３０−アルゼンチンアリのＰＢＡＮ遺伝子（アクセッション番号ＸＭ＿０１２３６８７１０）を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３１−Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＶ型プロトンＡＴＰａｓｅ触媒サブユニットＡ（アクセッション番号ＸＭ＿０２３４４３５４７）をコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３２−Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＲＮＡｓｅ １／２をコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３３−Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのキチンシンターゼをコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３４−Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのエクジソン受容体（ＥｃＲ）をコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３５−Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのγ−チューブリン１／１様をコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３６−ＴａＭｌｏ標的遺伝子（ＡＦ３８４１４４）。
配列番号１３７−ＴａＭｌｏをコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１３８−Ｖｉｔｉｓ ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ ＭＬＯ遺伝子（アクセッション番号ＫＲ３６２９１２）に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
配列番号１３９−Ｖｉｔｉｓ ＭＬＯ遺伝子を標的とする第１のｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１４０−Ｃｙｐ５１ホモログ１（アクセッション番号ＫＫ７６４６５１．１、遺伝子座ＲＳＡＧ８＿００９３４）。
配列番号１４１−Ｃｙｐ５１ホモログ２（アクセッション番号ＫＫ７６４８９２．１、遺伝子座番号ＲＳＡＧ８＿１２６６４）。
配列番号１４２−Ｃｙｐ５１をコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１４３−ＣｅｓＡ３標的遺伝子（アクセッション番号ＪＮ５６１７７４．１）。
配列番号１４４−ＣｅｓＡ３をコードする遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列。
一般的な技術及び定義
特段明記されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、遺伝子サイレンシング、タンパク質化学、及び生化学における）により一般に理解されているのと同じ意味を持つと解釈されるべきである。
特に指示されない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。このような手法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改定版を含む），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改定版を含む）などのソースの文献にわたって記載及び説明されている。
本明細書で使用される「アンチセンス調節エレメント」または「アンチセンスリボ核酸配列」または「アンチセンスＲＮＡ配列」という用語は、それがハイブリダイズする標的ＲＮＡ分子の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的であるＲＮＡ配列を意味する。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡ配列は、例えば標的ＲＮＡ分子の翻訳を減少させることにより、標的ＲＮＡ分子の発現もしくは量またはその活性を調節（増加または減少）する。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡ配列は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを変化させ、異なるスプライスバリアントを生成する。アンチセンス配列の例示的な成分には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、及びこれらのキメラの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
「アンチセンス活性」という用語は、本開示の文脈において、アンチセンスＲＮＡ配列のその標的ＲＮＡ分子へのハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能な及び／または測定可能な活性を指すために使用される。そのような検出及び／または測定は、直接的または間接的であり得る。一例では、アンチセンス活性は、標的ＲＮＡ分子転写物の量を検出及びまたは測定することにより評価される。アンチセンス活性はまた、標的ＲＮＡ分子に関連する表現型の変化として検出されてもよい。本明細書において使用される場合、「標的ＲＮＡ分子」という用語は、本開示によるアンチセンスＲＮＡ配列により調節される遺伝子転写物を指す。したがって、「標的ＲＮＡ分子」は、その発現または活性がアンチセンスＲＮＡ配列により調節されることができる任意のＲＮＡ分子であり得る。例示的な標的ＲＮＡ分子には、それらの前駆体形を含む、標的タンパク質、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡまたはその一部を含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。標的ＲＮＡは、病原体もしくは害虫のゲノムＲＮＡ、例えばウイルスなど、またはそれらから誘導されるＲＮＡ分子、例えばウイルス性病原体の複製形態など、またはそれらからの転写物であり得る。例えば、標的ＲＮＡ分子は、内因性遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または発現が特定の表現型、形質、障害または疾患状態に関連する真核細胞に導入されるかもしくは導入され得る遺伝子、または感染因子からの核酸分子からのＲＮＡであり得る。一例では、標的ＲＮＡ分子は真核細胞にある。別の例では、標的ＲＮＡ分子はタンパク質をコードする。この文脈においては、アンチセンス活性は、例えば、酵素活性などの活性、または酵素以外の機能を通じて、またはその機能に関連する表現型を通じて、標的タンパク質の量を検出及びまたは測定することにより評価することができる。本明細書において使用される場合、「標的タンパク質」という用語は、本開示によるアンチセンスＲＮＡ配列により調節されるタンパク質を指す。
特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的ＲＮＡ分子及び／または切断された標的ＲＮＡ分子及び／または選択的にスプライスされた標的ＲＮＡ分子の量を検出及び／または測定することにより評価される。
アンチセンス活性は、様々な方法を使用して検出または測定することができる。例えば、アンチセンス活性は、特定の試料の活性を比較し、その活性を対照試料の活性と比較することにより検出または評価することができる。
「標的とする」という用語は、本開示の文脈において、アンチセンスＲＮＡ配列と特定の標的ＲＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子内のヌクレオチドの特定の領域との会合を指すために使用される。一例では、本開示によるアンチセンスＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ分子の少なくとも１つの領域に相補性を共有する。この文脈においては、「相補性」という用語は、リボヌクレオチド上の塩基間の水素結合を介して、標的ＲＮＡ分子上のリボヌクレオチドの配列と塩基対形成することができるリボヌクレオチドの配列を指す。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）に対して相補性であり、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）に対して相補性である。
特定の実施形態では、「相補的塩基」は、本発明のＲＮＡ分子またはその標的ＲＮＡ分子中のセンスＲＮＡ配列のリボヌクレオチドと塩基対形成することができるアンチセンスＲＮＡ配列のリボヌクレオチドを指す。例えば、アンチセンスＲＮＡ配列の特定の位置にあるリボヌクレオチドが、標的ＲＮＡ分子の特定の位置にあるリボヌクレオチドと水素結合できる場合、アンチセンスＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ分子間の水素結合の位置は、そのリボヌクレオチドにおいて相補的であるとみなされる。対照的に、「非相補的」という用語は、互いに水素結合を形成しないか、さもなければハイブリダイゼーションをサポートしない一対のリボヌクレオチドを指す。「相補的」という用語はまた、アンチセンスＲＮＡ配列が相補性を介して別の核酸にハイブリダイズする能力を指すために使用することもできる。特定の実施形態では、ＲＮＡ配列及びその標的は、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに結合して本発明のＲＮＡ分子及び／または標的ＲＮＡ分子のアンチセンスＲＮＡ配列とセンスＲＮＡ配列間の安定した会合を可能にするリボヌクレオチドにより占有される場合、互いに相補的である。当業者は、アンチセンスＲＮＡ配列及び標的が会合したままでいる能力を除外することなくミスマッチの包含が可能であることを認識する。したがって、ミスマッチした（すなわち、標的の対応するヌクレオチドに相補的ではない）約２０％までのヌクレオチドを含み得るアンチセンスＲＮＡ配列が、本明細書に記載される。好ましくは、アンチセンス化合物は、約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは５％以下のミスマッチを含むか、またはミスマッチがない。残りのリボヌクレオチドは、相補的であるか、そうでなければアンチセンスＲＮＡ配列とセンスＲＮＡ配列または標的ＲＮＡ分子との間のハイブリダイゼーション（例えば、Ｇ：ＵまたはＡ：Ｇペア）を阻害しない。当業者は、本明細書に記載のアンチセンスＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ分子の少なくとも１つの領域に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％（完全に）相補性であることを認識するであろう。
本明細書において使用される場合、「キメラＲＮＡ分子」とは、自然界では自然に見られない任意のＲＮＡ分子を指す。一例では、本明細書に開示されるキメラＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡの領域（複数可）にミスマッチを作成するように改変されている。例えば、キメラＲＮＡ分子を改変して、シトシンをウラシルに変換してもよい。一例では、キメラＲＮＡ分子は、非メチル化シトシンをウラシルに変換するのに十分な時間及び条件下で、バイサルファイトによる処理を介して改変される。
当業者は、様々なリボヌクレオチドの組み合わせが塩基対形成できることを理解するであろう。標準的及び非標準塩基対形成の両方が、本開示により企図される。一例では、塩基対形成は、ＤＮＡ分子におけるＡ：ＴもしくはＧ：Ｃ、またはＲＮＡ分子におけるＵ：ＡもしくはＧ：Ｃを含み得る。別の例では、塩基対形成は、Ａ：ＧまたはＧ：ＴまたはＵ：Ｇを含み得る。
本開示で使用される「標準的な塩基対形成」という用語は、デオキシリボヌクレオチドに関してはＡ：ＴもしくはＧ：Ｃ、またはリボヌクレオチドに関してはＡ：ＵもしくはＧ：Ｃである、２つのヌクレオチド間の塩基対形成を意味する。
本開示で使用される「非標準塩基対形成」という用語は、２つのＤＮＡまたは２つのＲＮＡ配列の文脈において、標準的な塩基対形成以外の２つのヌクレオチドの塩基間の相互作用を意味する。例えば、非標準塩基対形成は、ＧとＵの間（Ｇ：Ｕ）、またはＡとＧの間（Ａ：Ｇ）の対形成を含む。非標準塩基対形成の例には、プリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジンが含まれる。本開示の文脈において、最も一般的には、非標準塩基対形成はＧ：Ｕである。あまり好ましくない非標準塩基対形成の他の例は、Ａ：Ｃ、Ｇ：Ｔ、Ｇ：Ｇ、及びＡ：Ａである。
本開示は、一連のリボヌクレオチドにわたって「ハイブリダイズ」するＲＮＡ成分について言及する。当業者は、「ハイブリダイズ」及び「ハイブリダイズする」などの用語が、相補的核酸配列に基づいてアニーリングする分子を説明するために使用されることを理解するであろう。そのような分子は、ハイブリダイズのために１００％相補的である必要はない（すなわち、それらは「完全に塩基対形成」する必要はない）。例えば、配列相補性に１つ以上のミスマッチがあり得る。一例では、本明細書で定義されるＲＮＡ成分は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ＲＮＡ分子の長さによるハイブリダイゼーション温度の変動を含む、当技術分野でよく知られているパラメーターを指す。リボヌクレオチドハイブリダイゼーションパラメーターは、そのような方法をまとめた参考文献、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（上記）、及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（上記）に見出され得る。例えば、本明細書で使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中での６５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２ｘＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を指すことができる。２０〜２４ヌクレオチド長のＲＮＡ配列などの短いＲＮＡ成分は、より低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」という用語は、ＲＮＡ分子の長さによるハイブリダイゼーション温度の変動を含む、当技術分野でよく知られているパラメーターを指す。例えば、本明細書で使用される低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中での４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２ｘＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中での３０℃での１回以上の洗浄を指すことができる。
本発明はまた、連続するリボヌクレオチドにわたって「完全に塩基対形成する」ＲＮＡ成分を包含する。「完全に塩基対形成する」という用語は、本開示の文脈において、一連の連続するリボヌクレオチド塩基対形成を指すために使用される。完全に塩基対形成した一連の連続するリボヌクレオチドは、その一連内にギャップまたは塩基対形成のないヌクレオチドを含まない。「連続する」という用語は、一連のリボヌクレオチドを指すために使用される。連続した一連を構成するリボヌクレオチドは、連続した一連のホスホジエステル結合により結合され、各リボヌクレオチドは次のリボヌクレオチドに直接結合される。
本発明のＲＮＡ分子は、センス配列及び対応するアンチセンス配列を含む。これらの配列間の関係は、本明細書で定義される。標的ＲＮＡ分子に関するアンチセンス配列の配列関係及び活性もまた、本明細書で定義される。
「共有結合された」という用語は、本開示の文脈において、第１及び第２のＲＮＡ成分または任意のＲＮＡ配列またはリボヌクレオチド間の結合を指すために使用される。当業者であれば理解されるように、共有結合または連結は、原子間の電子対の共有を伴う化学結合である。一例では、第１及び第２のＲＮＡ成分またはセンスＲＮＡ配列及びアンチセンスＲＮＡ配列は、自己相補性によりフォールディングされ得る単一のＲＮＡ鎖の一部として共有結合される。この例では、該成分は、ホスホジエステル結合により１つ以上のリボヌクレオチドにわたって共有結合される。
本開示の文脈において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基の塩基対形成による相補的ポリヌクレオチドの対形成を意味する。特定の機序に限定されないが、対形成の最も一般的な機序には、相補的なリボヌクレオチド間の水素結合（ワトソンクリック水素結合であり得る）が含まれる。
本明細書において使用される場合、「ＲＮＡ分子は非ヒト生物に有害な影響を及ぼす」という語句または類似の語句は、分子の標的ＲＮＡ分子が非ヒト生物において存在し、該標的ＲＮＡ分子を発現する細胞の標的ＲＮＡ分子への曝露が、該ＲＮＡ分子を欠く同様の細胞と比較した場合に標的ＲＮＡ分子のレベル及び／または活性の低下をもたらすことを意味する。一実施形態では、標的ＲＮＡ分子は、成長、生殖、または生存に重要なタンパク質をコードする。一例として、非ヒト生物が作物害虫もしくは病原体、または動物の害虫もしくは病原体である場合、ＲＮＡ分子は、害虫または病原体による摂食、細胞アポトーシス、細胞分化及び発生、有性生殖の能力または欲求、筋形成、筋攣縮、筋収縮、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節及び輸送、細胞膜電位の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感知、触角形成、翼形成、脚形成、卵形成、幼生成熟、消化酵素の形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、幼生期移行、蛹化、蛹化からの出現、細胞分裂、エネルギー代謝、呼吸、キチン代謝、細胞骨格構造の形成に有害な影響を及ぼし得る。別の例では、非ヒト生物は草であり、ＲＮＡ分子はアミノ酸生合成、光合成、脂肪酸合成、細胞膜の完全性、色素合成または成長に有害な影響を及ぼす。
本明細書において使用される場合、「ＲＮＡ分子は疾患の少なくとも１つの症状に有益な影響を与える」という語句または類似の語句は、分子の標的ＲＮＡが対象において存在し、該標的ＲＮＡを発現する細胞のＲＮＡ分子への曝露が、該ＲＮＡ分子を欠く同様の細胞と比較した場合に標的ＲＮＡのレベル及び／または活性の低下をもたらすことを意味する。一実施形態では、標的ＲＮＡは、疾患の存在下で役割を果たすタンパク質をコードする。一実施形態では、疾患は、がんまたはがん性疾患、感染症、心血管疾患、神経疾患、プリオン病、炎症性疾患、自己免疫性疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、ミトコンドリア病、内分泌疾患、生殖関連疾患及び状態、ならびに細胞または生物において発現された遺伝子産物のレベルに応答し得る任意の他の兆候である。
本開示によるＲＮＡ分子及びそれを含む組成物は、対象に投与することができる。「対象」、「患者」、または「個人」などの用語は、本開示において、文脈において互換的に使用することができる用語である。一例では、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、イヌもしくはネコなどのコンパニオンアニマル、またはウマもしくはウシなどの家畜動物であり得る。一例において、対象はヒトである。例えば、対象は成人であり得る。別の例では、対象は子供であり得る。別の例では、対象は青年であり得る。別の例では、本開示によるＲＮＡ分子及びそれを含む組成物は、昆虫に投与することができる。別の例では、本開示によるＲＮＡ分子及びそれを含む組成物は、植物に投与することができる。別の例では、本開示によるＲＮＡ分子及びそれを含む組成物は、真菌細胞または集団に投与することができる。
本明細書で使用されるように、「耐性」またはその変形は、ＲＮＡ分子の存在により耐性が増加するという点で相対的な用語であり、例えば、害虫または病原体の生殖の減少、または生物に対する損傷のレベルの減少を示す。
本明細書で使用されるように、「標的と配列的に関連しない」という用語は、介在するＲＮＡ配列の全長に沿って５０％未満の同一性を有する分子を指す。一方、「標的と配列的に関連する」という用語は、介在するＲＮＡ配列の全長に沿って５０％以上の同一性を有する分子を指す。
「及び／または」という用語、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に支援すると解釈されるべきである。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、別段明記されない限り、指定された値の＋／−２０％、より好ましくは、＋／−１０％を指す。
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を含むが、他のいかなる要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を除外しないことを意味すると理解される。
非標準塩基対形成
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、互いにハイブリダイズして、いくつかの非標準塩基対を有する、すなわち標準的及び非標準塩基対を組み合わせた、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成することができるセンスリボヌクレオチド配列及びアンチセンスリボヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、それぞれが１つの（連続する）アンチセンスリボヌクレオチド配列の領域にハイブリダイズして、いくつかの非標準塩基対を有するｄｓＲＮＡ領域を形成することができる２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列を含む。例えば、図１Ｂを参照のこと。一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、それぞれが１つの（連続する）センスリボヌクレオチド配列の領域にハイブリダイズして、いくつかの非標準塩基対を有するｄｓＲＮＡ領域を形成することができる２つ以上のアンチセンスセンスリボヌクレオチド配列を含む。例えば、図１Ａを参照のこと。一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、２つ以上のアンチセンスセンスリボヌクレオチド配列及び２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列を含み、各アンチセンスリボヌクレオチド配列は、アンチセンスリボヌクレオチド配列にハイブリダイズして、２つ以上のｄｓＲＮＡ領域を形成することができ、その一方または両方がいくつかの非標準塩基対を含む。
以下の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子の完全長のｄｓＲＮＡ領域（すなわち、ｄｓＲＮＡ領域全体）は、（連続する）ｄｓＲＮＡ領域が１つしかない場合、またはＲＮＡ分子に２つ以上のｄｓＲＮＡ領域がある場合はＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域のそれぞれについては、文脈上の特徴としてみなされる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも５％は非標準塩基対形成である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも６％は非標準塩基対形成である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも７％は非標準塩基対形成である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも８％は非標準塩基対形成である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも９％または１０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも１１％または１２％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも１５％または約１５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも２０％または約２０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも２５％または約２５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の少なくとも３０％または約３０％は非標準塩基対である。これらの各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の最大４０％は非標準塩基対であることが好ましく、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の最大３５％は非標準塩基対であり、さらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の最大３０％は非標準塩基対である。一実施形態では、あまり好ましくないが、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の約３５％は非標準塩基対である。一実施形態では、さらにあまり好ましくないが、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の約４０％は非標準塩基対である。上記の各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、センス配列またはアンチセンス配列のいずれか、または両方において、１つ以上の非塩基対形成リボヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域における塩基対の１０％〜４０％は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１０％〜３５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１０％〜３０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１０％〜２５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１０％〜２０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１０％〜１５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１５％〜３０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１５％〜２５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の１５％〜２０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の５％〜３０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の５％〜２５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の５％〜２０％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の５％〜１５％は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域の塩基対の５％〜１０％は非標準塩基対である。上記の各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、センス配列またはアンチセンス配列のいずれか、または両方において、１つ以上の非塩基対形成リボヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも１つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも２つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも３つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも４つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも５つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも６つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも７つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも８つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含み、２０の連続する塩基対の少なくとも９つの塩基対は、非標準塩基対である。これらの各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の２０の連続する塩基対のうち最大１０が非標準塩基対であることが好ましく、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大９の塩基対が非標準塩基対であり、さらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域内の最大８の塩基対が非標準塩基対であり、なおさらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大７つの塩基対が非標準塩基対であり、最も好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大６の塩基対が非標準塩基対である。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、非標準塩基対の全てがＧ：Ｕ塩基対である。好ましくは、上記の実施形態の特徴は、本発明のＲＮＡ分子に存在する２０の連続する塩基対の１つ１つに適用する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも１つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも２つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも３つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも４つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも５つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも６つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも７つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも８つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２１の連続する塩基対を含み、２１の連続する塩基対の少なくとも９つの塩基対は、非標準塩基対である。これらの各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の２１の連続する塩基対のうち最大１０が非標準塩基対であることが好ましく、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大９の塩基対が非標準塩基対であり、さらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域内の最大８の塩基対が非標準塩基対であり、なおさらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大７つの塩基対が非標準塩基対であり、最も好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大６の塩基対が非標準塩基対である。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、非標準塩基対の全てがＧ：Ｕ塩基対である。好ましくは、上記の実施形態の特徴は、本発明のＲＮＡ分子に存在する２１の連続する塩基対の１つ１つに適用する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも１つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも２つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも３つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも４つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも５つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも６つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも７つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも８つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２２の連続する塩基対を含み、２２の連続する塩基対の少なくとも９つの塩基対は、非標準塩基対である。これらの各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の２２の連続する塩基対のうち最大１０が非標準塩基対であることが好ましく、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大９の塩基対が非標準塩基対であり、さらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域内の最大８の塩基対が非標準塩基対であり、なおさらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大７つの塩基対が非標準塩基対であり、最も好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大６の塩基対が非標準塩基対である。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、非標準塩基対の全てがＧ：Ｕ塩基対である。好ましくは、上記の実施形態の特徴は、本発明のＲＮＡ分子に存在する２２の連続する塩基対の１つ１つに適用する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも１つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも２つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも３つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも４つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも５つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも６つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも７つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも８つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２３の連続する塩基対を含み、２３の連続する塩基対の少なくとも９つの塩基対は、非標準塩基対である。これらの各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の２３の連続する塩基対のうち最大１０が非標準塩基対であることが好ましく、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大９の塩基対が非標準塩基対であり、さらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域内の最大８の塩基対が非標準塩基対であり、なおさらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大７つの塩基対が非標準塩基対であり、最も好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大６の塩基対が非標準塩基対である。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、非標準塩基対の全てがＧ：Ｕ塩基対である。好ましくは、上記の実施形態の特徴は、本発明のＲＮＡ分子に存在する２３の連続する塩基対の１つ１つに適用する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも１つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも２つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも３つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも４つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも５つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも６つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも７つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも８つの塩基対は、非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２４の連続する塩基対を含み、２４の連続する塩基対の少なくとも９つの塩基対は、非標準塩基対である。これらの各実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の２４の連続する塩基対のうち最大１０が非標準塩基対であることが好ましく、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大９の塩基対が非標準塩基対であり、さらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域内の最大８の塩基対が非標準塩基対であり、なおさらにより好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大７つの塩基対が非標準塩基対であり、最も好ましくは、ｄｓＲＮＡ領域の最大６の塩基対が非標準塩基対である。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、非標準塩基対の全てがＧ：Ｕ塩基対である。好ましくは、上記の実施形態の特徴は、本発明のＲＮＡ分子に存在する２４の連続する塩基対の１つ１つに適用する。
以下の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子の完全長のｄｓＲＮＡ領域（すなわち、ｄｓＲＮＡ領域全体）は、（連続する）ｄｓＲＮＡ領域が１つしかない場合、またはＲＮＡ分子に２つ以上のｄｓＲＮＡ領域がある場合はＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域のそれぞれについては、文脈上の特徴としてみなされる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する標準的な塩基対を含まない、すなわち２０の連続する塩基対の全てのサブ領域は少なくとも１つの非標準塩基対、好ましくは少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１９の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１８の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１７の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１６の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１５の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１４の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１３の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１２の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１１の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、９の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、８の連続する標準的な塩基対を含まない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、７の連続する標準的な塩基対を含まない。上記の実施形態では、ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域、またはＲＮＡ分子のありとあらゆるｄｓＲＮＡ領域における連続する標準的な塩基対の最長のサブ領域は、５、６または７の連続する標準的な塩基対、すなわち、言及したより短い長さまでであることが好ましい。上記の実施形態の特徴のそれぞれは、好ましくは、ＲＮＡ分子において以下の特徴と組み合わされる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０〜１９または２０の連続する塩基対を含む。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１２〜１９または２０の連続する塩基対を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１４〜１９または２０の連続する塩基対を含む。これらの実施形態ではｄｓＲＮＡ領域は１５の連続する塩基対を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１６、１７、１８、または１９の連続する塩基対を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する塩基対を含む。好ましくは、上記の実施形態では、連続する塩基対は、少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含む少なくとも１つの非標準塩基対を含み、より好ましくは、連続する塩基対の領域内の全ての非標準塩基対は、Ｇ：Ｕ塩基対である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対のサブ領域、すなわち、４つの標準的な塩基対の各末端に隣接する少なくとも１つ、好ましくは１つまたは２つ（２以下）の非標準塩基対、を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ２つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ３つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ４または５つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ６または７つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ８〜１０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ１１〜１５のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜５０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜４０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜３０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する４つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜２０のサブ領域を含む。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、サブ領域内の連続する標準的な塩基対に隣接する全ての非標準塩基対は、Ｇ：Ｕ塩基対である。上記の実施形態の変形形態では、隣接する非標準塩基対の一方または両方が、サブ領域の一部または全てについて、センス配列、アンチセンス配列、または両方の配列において非塩基対リボヌクレオチドに置き換えられる。上記の実施形態において、サブ領域の最大数は、ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域の長さによって決まることが容易に理解される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ２つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ３つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ４または５つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ６または７つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ８〜１０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ１１〜１５のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜５０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜５０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜３０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する５つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜２０のサブ領域を含む。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、サブ領域内の連続する標準的な塩基対に隣接する全ての非標準塩基対は、Ｇ：Ｕ塩基対である。上記の実施形態の変形形態では、隣接する非標準塩基対の一方または両方が、サブ領域の一部または全てについて、センス配列、アンチセンス配列、または両方の配列において非塩基対リボヌクレオチドに置き換えられる。上記の実施形態において、サブ領域の最大数は、ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域の長さによって決まることが容易に理解される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ２つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ３つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ４または５つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ６または７つのサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ８〜１０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ１１〜１６のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜６０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜６０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜３０のサブ領域を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、非標準塩基対が隣接する６つの標準的な塩基対がそれぞれ２〜２０のサブ領域を含む。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、サブ領域内の連続する標準的な塩基対に隣接する全ての非標準塩基対は、Ｇ：Ｕ塩基対である。上記の実施形態の変形形態では、隣接する非標準塩基対の一方または両方が、サブ領域の一部または全てについて、センス配列、アンチセンス配列、または両方の配列において非塩基対リボヌクレオチドに置き換えられる。上記の実施形態において、サブ領域の最大数は、ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域の長さによって決まることが容易に理解される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対のサブ領域を含み、塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ２つのサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ３つのサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ４つのサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ５つのサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ１０のサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１５の連続する塩基対がそれぞれ４つのサブ領域を含み、１５の連続する塩基対の２〜６は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ２〜５０のサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ２〜４０のサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ２〜３０のサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０の連続する塩基対がそれぞれ２〜２０のサブ領域を含み、１０の連続する塩基対の２〜４は非標準塩基対である。一実施形態では、ＲＮＡ分子の１つの（連続した）もしくはそれ以上の、または全てのｄｓＲＮＡ領域における非標準塩基対は、非塩基対に隣接していない。別の実施形態では、非標準塩基対は、非塩基対から少なくとも２つの連続塩基対である。別の実施形態では、非標準塩基対は、非塩基対から少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の連続塩基対である。一実施形態では、ＲＮＡ分子の１つの（連続した）もしくはそれ以上の、または全てのｄｓＲＮＡ領域における非標準塩基対は、ループ配列に隣接していない。別の実施形態では、非標準塩基対は、ループ配列からの少なくとも２つの連続塩基対である。別の実施形態では、非標準塩基対は、ループ配列から少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の連続塩基対である。好ましくは、上記の実施形態では、非標準塩基対は少なくとも１つのＧ：Ｕ塩基対を含み、より好ましくは、サブ領域の非標準塩基対の全てがＧ：Ｕ塩基対である。上記の実施形態の変形形態では、２〜４または２〜６の非標準塩基対のうちの１つ以上が、サブ領域の一部または全てについて、センス配列、アンチセンス配列、または両方の配列において非塩基対リボヌクレオチドに置き換えられる。上記の実施形態において、サブ領域の最大数は、ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域の長さによって決まることが容易に理解される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の標準塩基対と非標準塩基対の比率は、２．５：１〜３．５：１であり、例えば約３：１である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の標準塩基対と非標準塩基対の比率は、３．５：１〜４．５：１であり、例えば約４：１である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の標準塩基対と非標準塩基対の比率は、４．５：１〜５．５：１であり、例えば約５：１である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域内の標準塩基対と非標準塩基対の比率は、５．５：１〜６．５：１であり、例えば約６：１である。ＲＮＡ分子の異なるｄｓＲＮＡ領域は異なる比率を有する場合がある。
上記の実施形態では、ＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域（複数可）における非標準塩基対は、好ましくは全てＧ：Ｕ塩基対である。一実施形態では、非標準塩基対の少なくとも９９％はＧ：Ｕ塩基対である。一実施形態では、非標準塩基対の少なくとも９８％はＧ：Ｕ塩基対である。一実施形態では、非標準塩基対の少なくとも９７％はＧ：Ｕ塩基対である。一実施形態では、非標準塩基対の少なくとも９５％はＧ：Ｕ塩基対である。一実施形態では、非標準塩基対の少なくとも９０％はＧ：Ｕ塩基対である。一実施形態では、非標準塩基対の９０〜９５％はＧ：Ｕ塩基対である。例えば、１０の非標準塩基対がある場合、少なくとも９（９０％）がＧ：Ｕ塩基対である。
別の実施形態では、非標準塩基対の３％〜５０％はＧ：Ｕ塩基対である。別の実施形態では、非標準塩基対の５％〜３０％はＧ：Ｕ塩基対である。別の実施形態では、非標準塩基対の１０％〜３０％はＧ：Ｕ塩基対である。別の実施形態では、非標準塩基対の１５％〜２０％はＧ：Ｕ塩基対である。
上記実施形態の一例では、ＲＮＡ分子の１つの（連続した）もしくはそれ以上の、または全てのｄｓＲＮＡ領域において、少なくとも３つのＧ：Ｕ塩基対が存在する。別の例では、少なくとも４、５、６、７、８、９または１０のＧ：Ｕ塩基対形成が存在する。別の例では、少なくとも３〜１０のＧ：Ｕ塩基対形成が存在する。別の例では、少なくとも５〜１０のＧ：Ｕ塩基対形成が存在する。
非標準塩基対（複数可）を含むｄｓＲＮＡ領域は、アンチセンス調節エレメントとして作用する２０の連続するヌクレオチドのアンチセンス配列を含む。一実施形態では、アンチセンス調節エレメントは、真核細胞内の標的ＲＮＡ分子に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、または最も好ましくは、１００％相補的である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、同じ標的ＲＮＡ分子に対して（すなわち、同じ標的ＲＮＡ分子の異なる領域に対して）相補的であるか、または異なる標的ＲＮＡ分子に対して相補的である、２、３、４、または５のアンチセンス調節エレメントを含む。
一実施形態では、センス及びアンチセンス配列がハイブリダイズする場合、センスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド、またはアンチセンスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド、またはその両方は、ｄｓＲＮＡ領域において塩基対形成されない。本実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、センス配列とアンチセンス配列とが共有結合するいかなるループ配列も含まない。ｄｓＲＮＡ領域またはサブ領域の１つ以上のリボヌクレオチドは、塩基対形成しない場合がある。したがって、本実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域のセンス鎖は、その対応するアンチセンス鎖と完全に塩基対形成しない。
一実施形態では、キメラＲＮＡ分子は、分子のループの基部に非標準塩基対を含まない。別の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上、または全ての非標準塩基対が標準塩基対に隣接している。
一実施形態では、キメラＲＮＡ分子は、少なくとも１つの植物ＤＣＬ−１切断部位を含む。
一実施形態では、標的ＲＮＡ分子は、ウイルスＲＮＡ分子ではない。
一実施形態では、標的ＲＮＡ分子は、南アフリカキャッサバモザイクウイルスＲＮＡ分子ではない。
一実施形態では、キメラＲＮＡ分子は、標準的な塩基対、非標準塩基対、または標準塩基対及び非標準塩基対に隣接している少なくとも１つの非塩基対または非塩基対のストレッチを含む。例えば、これは、本明細書に記載のバルジであってもよい。
一実施形態では、キメラＲＮＡ分子は、１１を超える標準的な塩基対を有する二本鎖領域を含まない。
さらに、一実施形態では、任意選択で上記実施形態の特徴のいずれかと組み合わせて、センス配列（複数可）におけるリボヌクレオチドの総数及びアンチセンス配列（複数可）におけるリボヌクレオチドの総数は、同一ではない場合があるが、好ましくは同一である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域のセンスリボヌクレオチド配列（複数可）内のリボヌクレオチドの総数は、アンチセンスリボヌクレオチド配列（複数可）内のリボヌクレオチドの総数の９０％〜１１０％である。一実施形態では、センスリボヌクレオチド配列（複数可）内のリボヌクレオチドの総数は、アンチセンスリボヌクレオチド配列（複数可）内のリボヌクレオチドの総数の９５％〜１０５％である。一実施形態では、本開示のキメラＲＮＡ分子は、内部または末端のバルジまたはループなどの１つ以上の構造要素を含むことができる。バルジ及びループの様々な実施形態は、上述されている。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、バルジまたはループなどの構造要素によって分離されている。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、介在する（スペーサー）配列によって分離されている。スペーサー配列のリボヌクレオチドのいくつかは、ＲＮＡ分子の他のリボヌクレオチド、例えばスペーサー配列内の他のリボヌクレオチドと塩基対形成してもよく、またはそれらはＲＮＡ分子において塩基対形成しなくてもよく、またはそれぞれのいくつかであってもよい。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は末端ループに結合される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は末端ループが隣接している。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡ領域が、５の連続する塩基対の任意のサブ領域に少なくとも３つの非標準塩基対を有する場合、非標準塩基対は連続しておらず、１つ以上の標準的な塩基対によって分離されている、すなわち、ｄｓＲＮＡ領域には３つ以上の連続する非標準塩基対がない。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、４つ以上の連続する非標準塩基対がない。例えば、一実施形態では、ｄｓＲＮＡ領域は、１０塩基対のサブ領域に少なくとも３つの非標準塩基対を含み、各非標準塩基対は４つの標準的な塩基対によって分離されている。
一実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、２つ以上のｄｓＲＮＡ領域を含む。例えば、ＲＮＡ分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のｄｓＲＮＡ領域を含む。この例では、ｄｓＲＮＡ領域のうちの１つ以上または全ては、非標準塩基対形成及び／またはアンチセンス調節エレメントの数などの上記で例示された特性を含み得る。
サイレンシング活性
本開示のＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ分子の領域に実質的に相補的であるセンスリボヌクレオチド配列を含むため、アンチセンス活性を有する。例えば、リボヌクレオチド配列は、真核細胞の標的ＲＮＡ分子の領域に実質的に相補的である。一例では、標的ＲＮＡ分子は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞中にあり得る。本明細書で定義されるＲＮＡ分子のそのような成分は、「アンチセンス調節エレメント」と称される場合もある。「実質的に相補的」とは、センスリボヌクレオチド配列が、真核細胞における標的ＲＮＡ分子の相補体と比較して、挿入、欠失、及び個々の点変異を有し得ることを意味する。好ましくは、相同性は、アンチセンス活性を有するセンスリボヌクレオチド配列と標的ＲＮＡ分子との間で少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％である。例えば、センスリボヌクレオチド配列は、真核細胞における標的ＲＮＡ分子の第１の領域と配列が同一である約１５、約１６、約１７、約１８、約１９またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。別の例では、センスリボヌクレオチド配列は、真核細胞における標的ＲＮＡ分子の第１の領域と配列が同一である約２０の連続するヌクレオチドを含むことができる。
「アンチセンス活性」は、標的ＲＮＡ分子の発現を調節（増加または減少）する、本明細書で定義されるＲＮＡ分子からのアンチセンス調節エレメントを指すために本開示の文脈で使用される。
様々な例では、本開示によるアンチセンス調節エレメントは、結合基によって一緒に結合された複数のモノマーサブユニットを含むことができる。例としては、プライマー、プローブ、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｐｌｉｃｅｒ）、ギャップマー、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡが挙げられる。したがって、本開示によるＲＮＡ分子は、一本鎖、二本鎖、環状、分岐、またはヘアピン構造を有するアンチセンス調節エレメントを含むことができる。一例では、アンチセンス配列は、内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含むことができる。
一例では、本開示のＲＮＡ分子は、キメラオリゴヌクレオチドなどのキメラオリゴマー成分を含む。例えば、ＲＮＡ分子は、異なるように改変されたヌクレオチド、混合骨格アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一例では、キメラオリゴマー化合物は、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／または標的ＲＮＡ分子に対する結合親和性の増加をもたらすように改変された少なくとも１つの領域を含むことができる。
アンチセンス調節エレメントは、様々な長さを有することができる。様々な例にわたって、本開示は、Ｘ−Ｙ結合塩基からなるアンチセンス調節エレメントを提供し、該Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０（ただし、Ｘ＜Ｙの場合）から選択される。例えば、特定の実施形態では、本開示は、以下：８〜９、８〜１０、８〜１１、８〜１２、８〜１３、８〜１４、８〜１５、８〜１６、８〜１７、８〜１８、８〜１９、８〜２０、８〜２１、８〜２２、８〜２３、８〜２４、８〜２５、８〜２６、８〜２７、８〜２８、８〜２９、８〜３０、９〜１０、９〜１１、９〜１２、９〜１３、９〜１４、９〜１５、９〜１６、９〜１７、９〜１８、９〜１９、９〜２０、９〜２１、９〜２２、９〜２３、９〜２４、９〜２５、９〜２６、９〜２７、９〜２８、９〜２９、９〜３０、１０〜１１、１０〜１２、１０〜１３、１０〜１４、１０〜１５、１０〜１６、１０〜１７、１０〜１８、１０〜１９、１０〜２０、１０〜２１、１０〜２２、１０〜２３、１０〜２４、１０〜２５、１０〜２６、１０〜２７、１０〜２８、１０〜２９、１０〜３０、１１〜１２、１１〜１３、１１〜１４、１１〜１５、１１〜１６、１１〜１７、１１〜１８、１１〜１９、１１〜２０、１１〜２１、１１〜２２、１１〜２３、１１〜２４、１１〜２５、１１〜２６、１１〜２７、１１〜２８、１１〜２９、１１〜３０、１２〜１３、１２〜１４、１２〜１５、１２〜１６、１２〜１７、１２〜１８、１２〜１９、１２〜２０、１２〜２１、１２〜２２、１２〜２３、１２〜２４、１２〜２５、１２〜２６、１２〜２７、１２〜２８、１２〜２９、１２〜３０、１３〜１４、１３〜１５、１３〜１６、１３〜１７、１３〜１８、１３〜１９、１３〜２０、１３〜２１、１３〜２２、１３〜２３、１３〜２４、１３〜２５、１３〜２６、１３〜２７、１３〜２８、１３〜２９、１３〜３０、１４〜１５、１４〜１６、１４〜１７、１４〜１８、１４〜１９、１４〜２０、１４〜２１、１４〜２２、１４〜２３、１４〜２４、１４〜２５、１４〜２６、１４〜２７、１４〜２８、１４〜２９、１４〜３０、１５〜１６、１５〜１７、１５〜１８、１５〜１９、１５〜２０、１５〜２１、１５〜２２、１５〜２３、１５〜２４、１５〜２５、１５〜２６、１５〜２７、１５〜２８、１５〜２９、１５〜３０、１６〜１７、１６〜１８、１６〜１９、１６〜２０、１６〜２１、１６〜２２、１６〜２３、１６〜２４、１６〜２５、１６〜２６、１６〜２７、１６〜２８、１６〜２９、１６〜３０、１７〜１８、１７〜１９、１７〜２０、１７〜２１、１７〜２２、１７〜２３、１７〜２４、１７〜２５、１７〜２６、１７〜２７、１７〜２８、１７〜２９、１７〜３０、１８〜１９、１８〜２０、１８〜２１、１８〜２２、１８〜２３、１８〜２４、１８〜２５、１８〜２６、１８〜２７、１８〜２８、１８〜２９、１８〜３０、１９〜２０、１９〜２１、１９〜２２、１９〜２３、１９〜２４、１９〜２５、１９〜２６、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２９、１９〜３０、２０〜２１、２０〜２２、２０〜２３、２０〜２４、２０〜２５、２０〜２６、２０〜２７、２０〜２８、２０〜２９、２０〜３０、２１〜２２、２１〜２３、２１〜２４、２１〜２５、２１〜２６、２１〜２７、２１〜２８、２１〜２９、２１〜３０、２２〜２３、２２〜２４、２２〜２５、２２〜２６、２２〜２７、２２〜２８、２２〜２９、２２〜３０、２３〜２４、２３〜２５、２３〜２６、２３〜２７、２３〜２８、２３〜２９、２３〜３０、２４〜２５、２４〜２６、２４〜２７、２４〜２８、２４〜２９、２４〜３０、２５〜２６、２５〜２７、２５〜２８、２５〜２９、２５〜３０、２６〜２７、２６〜２８、２６〜２９、２６〜３０、２７〜２８、２７〜２９、２７〜３０、２８〜２９、２８〜３０、または２９〜３０結合塩基を含むアンチセンス調節エレメントを提供する。
本開示によるＲＮＡ分子は、複数のアンチセンス調節エレメントを含むことができる。例えば、ＲＮＡ分子は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアンチセンス調節エレメントを含むことができる。一例では、アンチセンス調節エレメントは同じである。この例では、ＲＮＡ分子は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアンチセンス調節エレメントのコピーを含むことができる。別の例では、本開示によるＲＮＡ分子は、異なるアンチセンス調節エレメントを含むことができる。例えば、アンチセンス調節エレメントは、脂質生合成などの経路において複数の遺伝子を標的とするために提供され得る。この例では、ＲＮＡ分子は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の異なるアンチセンス調節エレメントを含むことができる。
本開示によるアンチセンス調節エレメントは、様々な標的ＲＮＡ分子の発現または量を調節（増加または減少）することができる。一例では、標的ＲＮＡ分子は脂肪酸生合成遺伝子である。そのような遺伝子の例には、アセチルトランスアシラーゼ、アシル輸送タンパク質（「アシルキャリアタンパク質」）、ステアリルデサチュラーゼまたはミクロソームＤ１２−デサチュラーゼなどのデサチュラーゼ、特にＦａｄ２−１遺伝子、マロニルトランスアシラーゼ、−ケトアシル−ＡＣＰシンセターゼ、３−ケト−ＡＣＰレダクターゼ、エノイル−ＡＣＰヒドラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどのチオエステラーゼ、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ、をコードする遺伝子が挙げられる。一例では、標的ＲＮＡ分子はＦＡＤ２遺伝子である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１２４３６０（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）、ＡＦ０４２８４１（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、Ｌ２６２９６（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、Ａ６５１０２（Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ）により記載のもの）。例えば、標的ＲＮＡ分子はＦＡＤ２．１遺伝子であり得る。別の例では、標的ＲＮＡ分子はＦＡＤ２．２遺伝子であり得る。別の例では、標的ＲＮＡ分子はＦＡＤ２．１及びＦＡＤ２．２遺伝子であり得る。標的ＲＮＡ分子であり得る脂質組成の改変に関与する他の遺伝子の例は、当該分野で公知である（例えば、Ｓｈｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｐｒｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｏｌｉｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｄｕｎｗｅｌｌ，２０００；Ｂｒａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｉｓｈｏｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９３；ＵＳ ５，５３０，１９２及びＷＯ９４／１８３３７を参照のこと）。
別の例では、標的ＲＮＡ分子は、昆虫の遺伝子転写物などの節足動物の遺伝子である。そのような遺伝子の例には、ＣＨＳ１及び／またはＣＨＳ２などのキチンシンターゼ遺伝子、または昆虫の活動、行動、生殖、成長及び／または発達を制御する他の遺伝子が挙げられる。様々な病原体の様々な必須遺伝子が当業者に知られている（例えば、線虫耐性遺伝子はＷＯ９３／１０２５１、ＷＯ９４／１７１９４にまとめられている）。
別の例では、標的ＲＮＡ分子は疾患に関連している。例えば、標的ＲＮＡ分子は、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子転写物であり得る。例示的ながん遺伝子は、ＡＢＬ１、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＮＲＡＳ、ＲＥＴまたはＳＲＣを含む。例示的な腫瘍抑制遺伝子は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２、接着分子、サイクリンキナーゼ及びそれらの阻害剤を含む。
別の例では、標的ＲＮＡ分子は、果実の成熟の遅延に関連している。果実の成熟遅延は、例えば、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、β−（１−４）グルカナーゼ（セルラーゼ）、β−ガラクタナーゼ（β−ガラクトシダーゼ）、またはエチレン生合成の遺伝子、例えば１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼなど、カロテノイド生合成の遺伝子、例えばプレフィトエンまたはフィトエン生合成の遺伝子、例えばフィトエンデサチュラーゼからなる群から選択される遺伝子の遺伝子発現を低下させることにより達成することができる。
別の例では、標的ＲＮＡ分子は老化症状の遅延に関連している。好適な標的ＲＮＡ分子は、シンナモイル−ＣｏＡ：ＮＡＤＰＨレダクターゼまたはシンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼを含む。さらなる標的ＲＮＡ分子が記載されている（ＷＯ１９９５／０７９９３において）。
別の例では、標的ＲＮＡ分子は、食品、好ましくは種子の繊維含量の改変に関連している。例えば、ＲＮＡ分子は、コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはシンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼの発現を低下させ得る。
ｌｅｄＲＮＡ分子
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、第２のＲＮＡ成分と共有結合している第１のＲＮＡ成分を含む。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、自己ハイブリダイズするか、または折り畳まれて、「ダンベル」またはｌｅｄＲＮＡ構造を形成する。例えば、図１を参照のこと。一実施形態では、該分子はさらに以下の１つ以上を含む：
第１のＲＮＡ成分と第２のＲＮＡ成分とを共有結合させる結合リボヌクレオチド配列；
５’リーダー配列；及び
３’トレーラー配列。
一実施形態では、第１のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、第１の５’及び３’リボヌクレオチドは、ＲＮＡ分子において互いに塩基対形成し、第１のＲＮＡ配列は、少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの第１のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第１のループ配列、及び少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子内の第１のセンスリボヌクレオチド配列とハイブリダイズし、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の第１の領域にハイブリダイズすることができる。
別の実施形態では、第１のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、第１の５’及び３’リボヌクレオチドは、ＲＮＡ分子において互いに塩基対形成し、第１のＲＮＡ配列は、少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの第１のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第１のループ配列、及び少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子内の第１のセンスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対を形成し、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の第１の領域の相補体と同一の配列である。これら２つの実施形態のこの第１のＲＮＡ成分の例は、図１Ａの左半分または図１Ｂの右半分に模式的に示されている。
別の実施形態では、第１のＲＮＡ成分は、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、第１の５’リボヌクレオチド及び第１の３’リボヌクレオチドが、第１のＲＮＡ成分中で互いに塩基対を形成し、第１のＲＮＡ配列は、第１のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第１のループ配列、及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列（各々が少なくとも２０の連続リボヌクレオチドである）、これにより、第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続リボヌクレオチドが、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続リボヌクレオチドと完全に塩基対形成し、第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の第１の領域と実質的に同一の配列である。
これらの実施形態では、第１の５’リボヌクレオチドと第１の３’リボヌクレオチドとの間に形成される塩基対は、第１のＲＮＡ成分の自己ハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対であるとみなされ、すなわち、それはｄｓＲＮＡ領域の末端を規定する。
一実施形態では、第１のセンス配列は、標的ＲＮＡの領域と実質的な配列同一性を有し、この同一性は、長さが２０ヌクレオチド未満の配列に対するものであり得る。一実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９の連続リボヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０の連続リボヌクレオチド及び標的ＲＮＡ分子の第１の領域の配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または９９％である。別の実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９の連続リボヌクレオチドと標的ＲＮＡ分子の第１の領域とは１００％同一である。一実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列の５’末端からの第１の３、第１の４、第１の５、第１の６、または第１の７リボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の領域と１００％同一であり、残りのリボヌクレオチドが、標的ＲＮＡ分子と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。
一実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド及び標的ＲＮＡ分子の第１の領域は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。ここでも、本実施形態では、第１の３、第１の４、第１の５、第１の６、または第１の７のリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の領域と１００％同一であり得、残りのリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。別の実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドと、標的ＲＮＡ分子の第１の領域とは、１００％同一である。
一実施形態では、第１のアンチセンス配列は、標的ＲＮＡの領域の相補体と実質的な配列同一性を有し、この同一性は、相補体の長さが２０ヌクレオチド未満の配列に対するものであってもよい。一実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９の連続リボヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０の連続リボヌクレオチド及び標的ＲＮＡ分子の第１の領域の相補体の配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または９９％である。別の実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９の連続リボヌクレオチドと標的ＲＮＡ分子の第１の領域の相補体とは１００％同一である。一実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の５’末端からの第１の３、第１の４、第１の５、第１の６、または第１の７リボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の領域の相補体と１００％同一であり、残りのリボヌクレオチドが、標的ＲＮＡ分子の相補体と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。
一実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド及び標的ＲＮＡ分子の第１の領域の相補体は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。ここでも、本実施形態では、第１の３、第１の４、第１の５、第１の６、または第１の７のリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の領域の相補体と１００％同一であり、残りのリボヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子の相補体と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。別の実施形態では、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドと、標的ＲＮＡ分子の第１の領域とは、１００％同一である。
別の実施形態では、該第２のＲＮＡ成分は、５’から３’の順に、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、該第２の５’及び３’リボヌクレオチドは、塩基対形成し、該第２のＲＮＡ配列は、第２のセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも４のリボヌクレオチドの第２のループ配列、及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、該第２のセンスリボヌクレオチド配列は、該第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列と塩基対形成する。本実施形態では、第２の５’リボヌクレオチドと第２の３’リボヌクレオチドとの間に形成される塩基対は、第２のＲＮＡ成分の自己ハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対であるとみなされる。
一実施形態では、ＲＮＡ分子は、転写が始まる部位からＲＮＡ分子の残りの部分をコードするポリヌクレオチドの開始まで、遺伝子構築物中のプロモーターからの転写の結果として生じ得る５’リーダー配列、または５’伸長配列を含む。この５’リーダー配列または５’伸長配列は、分子の残りの部分と比較して比較的短いことが好ましく、ＲＮＡｓｅ処理により実施形態のためにＲＮＡ分子から転写後に除去されてもよい。５’リーダー配列または５’伸長配列は、大部分が非塩基対であり得るか、または１つ以上のステムループ構造を含んでもよい。この実施形態では、５’リーダー配列は、第２のＲＮＡ成分が第１の３’リボヌクレオチドに連結されている場合には第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、第２のＲＮＡ成分が第１の５’リボヌクレオチドに連結されている場合には第２の５’リボヌクレオチドに共有結合されているリボヌクレオチドの配列からなり得る。一実施形態では、５’リーダー配列は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも１００、少なくとも２００のリボヌクレオチド長であり、好ましくは２５０のリボヌクレオチドの最大長である。別の実施形態では、５’リーダー配列は、少なくとも５０のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、５’リーダー配列は、適切な増幅反応を介してＲＮＡ分子を増幅するための伸長配列として作用し得る。実施形態では、伸長配列は、ポリメラーゼを介して増幅を促進し得る。
別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードする構築物中の転写終結またはポリアデニル化シグナルまで転写が継続する結果として生じ得る３’トレーラー配列または３’伸長配列を含む。３’トレーラー配列または３’伸長配列は、ポリＡテールを含み得る。この３’トレーラー配列または３’伸長配列は、分子の残りの部分と比較して比較的短いことが好ましく、ＲＮＡｓｅ処理により実施形態のためにＲＮＡ分子から転写後に除去されてもよい。３’トレーラー配列または３’伸長配列は、大部分が非塩基対であり得るか、または１つ以上のステムループ構造を含んでもよい。この実施形態では、３’トレーラー配列は、第２のＲＮＡ成分が第１の３’リボヌクレオチドに連結されている場合には第２の３’リボヌクレオチドに共有結合され、第２のＲＮＡ成分が第１の５’リボヌクレオチドに連結されている場合には第１の３’リボヌクレオチドに共有結合されているリボヌクレオチドの配列からなり得る。一実施形態では、３’リーダー配列は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも１００、少なくとも２００のリボヌクレオチド長であり、好ましくは２５０のリボヌクレオチドの最大長である。別の実施形態では、３’リーダー配列は、少なくとも５０のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、３’トレーラー配列は、適切な増幅反応を介してＲＮＡ分子を増幅するための伸長配列として作用し得る。実施形態では、伸長配列は、ポリメラーゼを介して増幅を促進し得る。
一実施形態では、リボヌクレオチドのうちの２つを除く全てが、２つの他のヌクレオチドに共有結合されている、すなわち、ＲＮＡ分子は、自己相補領域を有する１つのＲＮＡ鎖のみからなり、したがって、１つの５’末端ヌクレオチド及び１つの３’末端ヌクレオチドのみを有する。別の実施形態では、リボヌクレオチドのうちの４つを除く全てが、２つの他のヌクレオチドに共有結合されている、すなわち、ＲＮＡ分子は、ハイブリダイズする相補的領域を有する２つのＲＮＡ鎖からなり、したがって、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドのみを有する。別の実施形態では、各リボヌクレオチドは、２つの他のヌクレオチドに共有結合されている、すなわちＲＮＡ分子は、自己相補領域を有すると同時に環状であり、したがって、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを有さない。
一実施形態では、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、センスＲＮＡ配列もしくはアンチセンスＲＮＡ配列またはその両方の不対ヌクレオチドによって生じる１つ以上のバルジを含むことができる。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、一連のバルジを含む。実施形態では、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のバルジを有し得る。各バルジは、独立して、１、２またはそれ以上の不対ヌクレオチドから１０までのヌクレオチドであってもよい。長い配列は、ｄｓＲＮＡ領域内のセンス配列またはアンチセンス配列からループアウトすることがあり、内部で塩基対形成され得るかまたは塩基対形成ないままであり得る。別の実施形態では、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、バルジを含まない、すなわち、ｄｓＲＮＡ領域の全長に沿って完全に塩基対形成されている。
別の実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列は、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の５’リボヌクレオチドに共有結合しているか、または第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の３’リボヌクレオチドに共有結合しているか、またはその両方である。別の実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の介在ヌクレオチドが存在している。そのような介在ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ分子とは配列的に関連しないが、隣接するセンス配列及びアンチセンス配列の塩基対形成の安定化を支援し得ることが理解されている。
別の実施形態では、第１のセンスリボヌクレオチド配列の２０の連続したヌクレオチドは、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の５’リボヌクレオチドに共有結合されており、第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の２０の連続したヌクレオチドは、いかなる介在ヌクレオチドもなしで第１の３’リボヌクレオチドに共有結合されている。別の実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の介在ヌクレオチドが存在している。介在ヌクレオチドは、ＲＮＡ分子の二本鎖領域の一部として塩基対形成され得るが、標的ＲＮＡとは配列的に関連しない。これらの介在ヌクレオチドは、二本鎖領域に安定性の増大を提供すること、またはＲＮＡ分子の２つの末端を一緒に保持すること、及び非塩基対５’末端もしくは３’末端、またはその両方を残さないことを支援し得る。
一実施形態では、上述の第１及び第２のＲＮＡ成分は、結合リボヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の第１の領域と配列が実質的に同一である第１のセンスリボヌクレオチド配列と該分子の他の成分との間のスペーサーとして作用する。例えば、結合リボヌクレオチド配列は、この領域とループとの間のスペーサーとして作用し得る。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ分子の第１の領域と配列が実質的に同一である複数のセンスリボヌクレオチド配列、及びこれらの配列間のスペーサーとして作用する結合リボヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、標的ＲＮＡ分子の第１の領域と配列が実質的に同一である少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０のリボヌクレオチド配列がＲＮＡ分子内に提供され、それぞれが結合リボヌクレオチド配列によって他（複数可）から分離されている。
一実施形態では、上述のＲＮＡ分子は、５’リーダー配列を含む。この実施形態では、５’リーダー配列は、第２のＲＮＡ成分が第１の３’リボヌクレオチドに連結されている場合には第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、第２のＲＮＡ成分が第１の５’リボヌクレオチドに連結されている場合には第２の５’リボヌクレオチドに共有結合されているリボヌクレオチドの配列からなる。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、コレステロールなどの脂質基、またはビオチンなどのビタミン、またはポリペプチドの付着による実施形態では、改変された５’末端または３’末端を有する。このような修飾は、ＲＮＡが機能するべき真核生物細胞へのＲＮＡ分子の取り込みを支援し得る。
一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１００未満のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、５０未満のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、２０未満のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１０未満のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、５未満のリボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１〜１００リボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１〜５０リボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１〜２０リボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１〜１０リボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列は、１〜５リボヌクレオチド長である。一実施形態では、結合リボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドは、塩基対形成されていない。好ましい実施形態では、結合リボヌクレオチド配列のリボヌクレオチドは全て塩基対形成されているか、またはリボヌクレオチドの１、２または３を除く全てのリボヌクレオチドが塩基対形成されている。
実施形態では、第１または第２のＲＮＡ成分は、ヘアピン構造を含む。好ましい実施形態では、第１及び第２のＲＮＡ成分は、それぞれヘアピン構造を含む。これらの実施形態では、ヘアピン構造はステムループであり得る。したがって、一実施形態では、ＲＮＡ分子は、それぞれがヘアピン構造を含む第１及び第２のＲＮＡ成分を含むことができ、ヘアピンはリンカー配列によって共有結合されている。例えば、図１を参照のこと。一実施形態では、リンカー配列は１つ以上の不対のリボ核酸（複数可）である。一実施形態では、リンカー配列は、１〜１０の不対のリボヌクレオチドである。
一実施形態では、ＲＮＡ分子は、二重ヘアピン構造、すなわち「ｌｅｄＲＮＡ構造」または「ダンベル構造」を有する。本実施形態では、第１のヘアピンは第１のＲＮＡ成分であり、第２のヘアピンは第２のＲＮＡ成分である。これらの実施形態では、第１の３’リボヌクレオチド及び第２の５’リボヌクレオチド、または第２の３’リボヌクレオチド及び第１の５’リボヌクレオチドのいずれか（両方ではない）が共有結合されている。この実施形態では、他の５’／３’リボヌクレオチドは、ニック（すなわち、５’／３’リボヌクレオチド間にホスホジエステル結合が存在しないｄｓＲＮＡ分子内の不連続性）によって分離され得る。このタイプの配置の一実施形態を、図１Ｂに示す。別の実施形態では、それぞれの５’／３’リボヌクレオチドは、ループによって分離され得る。５’リーダー配列及び３’トレーラー配列の長さは、同じであっても異なっていてもよい。実施形態では、５’リーダーは、３’トレーラー配列よりも約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００長いリボヌクレオチドであってもよく、またはその逆であってもよい。
ＲＮＡ分子が二重ヘアピン構造を有する実施形態では、第２のヘアピン（第１のヘアピン構造に加えて）は、それぞれ、標的ＲＮＡ分子の領域またはその相補体と配列が実質的に同一であるセンスＲＮＡ配列及びアンチセンスＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、各ヘアピンは、同一の標的ＲＮＡ分子の領域と配列が実質的に同一である一連のリボヌクレオチドを有する。一実施形態では、各ヘアピンは、同一の標的ＲＮＡ分子の異なる領域と配列が実質的に同一である一連のリボヌクレオチドを有する。一実施形態では、各ヘアピンは、異なる標的ＲＮＡ分子の領域と配列が実質的に同一である一連のリボヌクレオチドを有し、すなわち、ＲＮＡ分子は、配列的に関連しない場合がある２つの標的ＲＮＡ分子の発現及び／または活性を低下させるために使用することができる。
ＲＮＡ分子の二重ヘアピン構造の各ヘアピンにおいて、５’〜３’の順での各ヘアピンにおけるセンスＲＮＡ配列及びアンチセンスＲＮＡ配列の順序は、独立して、センス、次いでアンチセンス、またはアンチセンス、次いでセンスのいずれかであり得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の二重ヘアピン構造におけるセンス配列及びアンチセンス配列の順序は、２つのセンス配列が連続している場合のアンチセンス−センス−センス−アンチセンス（図１Ａ）、または２つのアンチセンス配列が連続している場合のセンス−アンチセンス−アンチセンス−センス（図１Ｂ）のいずれかである。
一実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’から３’の順で、５’リーダー配列、第１のループ、センスＲＮＡ配列、第２のループ、及び３’トレーラー配列を含み得、５’及び３’リーダー配列は、センス鎖に共有結合してｄｓＲＮＡ配列を形成する。一実施形態では、５’リーダー配列及び３’トレーラー配列は、互いに共有結合していない。一実施形態では、５’リーダー配列及び３’トレーラー配列はニックにより分離されている。一実施形態では、５’リーダー配列及び３’トレーラー配列は、閉鎖構造を有するＲＮＡ分子を提供するために一緒にライゲートされる。別の実施形態では、５’リーダー配列及び３’トレーラー配列はループにより分離されている。
本開示の文脈において、「ループ」という用語は、本明細書に開示されたＲＮＡ分子における、一連の非相補性リボヌクレオチドによって形成されるループ構造を指すために使用される。ループは一般に、第１及び第２のＲＮＡ成分間の一連の塩基対に従うか、または第１及び第２のＲＮＡ成分の一方または両方においてセンスＲＮＡ配列とアンチセンスＲＮＡ配列とを結合する。実施形態では、ループリボヌクレオチドは全て非相補的であり、一般的には４〜１０のリボヌクレオチドの短いループについては非相補的である。他の実施形態では、ループの１つ以上内のいくつかのリボヌクレオチドは相補的であり、これらの塩基対がループ構造を形成できるようになる限り、ループ配列内で塩基対形成が可能である。例えば、ループリボヌクレオチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％が相補的である。ループの実施形態としては、ステムループまたはヘアピン、シュードノット及びテトラループが挙げられる。
一実施形態では、ＲＮＡ分子は、２つのループのみを含む。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０のループ、好ましくは最大で１０のループを含む。例えば、ＲＮＡ分子は、４つのループを含むことができる。
様々なサイズのループが、本開示によって企図されている。例えば、ループは、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のリボヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、ループは、１５、２０、２５または３０のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ループ配列の１つまたは全ては、２０ヌクレオチドよりも長い。他の実施形態では、ループはより大きく、例えば、５０、１００、１５０、２００または３００のリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、ループは１６０のリボヌクレオチドを含む。別の実施形態では、あまり好ましくないが、ループは、ループがセンス及びアンチセンスＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションを妨げないことを条件に、２００、５００、７００、または１，０００のリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、ループの各々は、同じ数のリボヌクレオチドを有する。例えば、ループは、長さが１００〜１，０００のリボヌクレオチドを有し得る。例えば、ループは、長さが６００〜１，０００のリボヌクレオチドを有し得る。例えば、ループは、４〜１，０００のリボヌクレオチドを有し得る。例えば、ループは、好ましくは、４〜５０のリボヌクレオチドを有する。別の実施形態では、ループは、異なる数のリボヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、１つ以上のループは、ＲＮＡ分子からスプライシングで切り出されることができるイントロンを構成する。一実施形態では、イントロンは植物遺伝子由来のものである。例示的なイントロンとしては、トウモロコシアルコール脱水素酵素１（Ａｄｈ１）のイントロン３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０４４２９３）、ダイズβ−コングリシニンαサブユニットのイントロン４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０５１８６５）；リブロース−１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ（ＲＢＣ）スモールサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０４３３３）のためのエンドウｒｂｃＳ−３Ａ遺伝子のイントロンのうちの１つが挙げられる。好適なイントロンの他の実施形態は、（ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｅｒ，１９９７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２０００）に記載されている。
様々な実施形態では、ループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０の連続した塩基対の末端にあってもよく、これらの塩基対は、標準塩基対であってもよく、または１つ以上の非標準塩基対を含んでもよい。他の実施形態では、あまり好ましくないが、特に脊椎動物細胞の場合、ループは、少なくとも２０、３０、５０、１００、２００、５００またはそれ以上の連続した塩基対の末端にあってもよい。
別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列と、それに対して完全に塩基対を形成するアンチセンスリボヌクレオチド配列とを含み、これらはそれぞれ、標的ＲＮＡ分子の領域と配列が同一である。例えば、ＲＮＡ分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のセンスリボヌクレオチド配列と、それに対して完全に塩基対を形成するアンチセンスリボヌクレオチド配列とを含み得、これらのセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の領域に対してそれぞれ独立して配列が同一である。この実施形態では、任意の１つ以上または全ての配列は、結合リボヌクレオチド配列（複数可）によって分離することができる。この実施形態では、任意の１つ以上または全ての配列は、ループによって分離できる。
一実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、同じ標的ＲＮＡ分子の異なる領域に対して配列が同一である。例えば、配列は、同一の標的分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６の領域と同一であってもよい。別の実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、配列が同一である。一実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、同一の標的ＲＮＡ分子の同一の領域と配列が同一である。別の実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、異なる標的ＲＮＡ分子と配列が同一である。実施形態では、配列は、異なる標的分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６の領域と同一であり得る。
別の実施形態では、２つ以上のセンスリボヌクレオチド配列は、介在するループ（スペーサー）配列を持たない。
一実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’末端、少なくとも２１ヌクレオチド長である少なくとも１つのセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２１の連続するヌクレオチドにわたって各センスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対形成したアンチセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２つのループ配列、及び３’末端を有する一本鎖のリボヌクレオチドを有する。この実施形態では、５’末端のリボヌクレオチド及び３’末端のリボヌクレオチドは、直接共有結合されるのではなく、むしろ、各塩基対と隣接して位置付けられる。
別の実施形態では、ＲＮＡ成分の連続した塩基対は、少なくとも１つのギャップによって離隔され得る。一実施形態では、「ギャップ」は、不対のリボヌクレオチドによってもたらされる。別の実施形態では、「ギャップ」は、非ライゲーションの５’リーダー配列及び／または３’トレーラー配列によってもたらされる。この実施形態では、ギャップは、「非ライゲートギャップ」と呼ばれ得る。ミスマッチ及び非ライゲートギャップ（複数可）は、ＲＮＡ分子の様々な位置（複数可）に配置され得る。実施形態では、非ライゲートギャップは、アンチセンス配列の直後にあってもよい。別の実施形態では、非ライゲートギャップは、ＲＮＡ分子のループに近接していてもよい。別の実施形態では、非ライゲートギャップは、少なくとも２つのループの間でほぼ等距離に位置付けられる。
実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡの一本鎖から産生される。一実施形態では、一本鎖は、環状に閉じられておらず、例えば、非ライゲートギャップを含む。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、環状に閉鎖している分子である。閉鎖分子は、非ライゲートギャップを含む上述のＲＮＡ分子を、例えばＲＮＡリガーゼでライゲートすることにより生成できる。
別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’−または３’−またはその両方の伸長配列を含む。例えば、ＲＮＡ分子は、第１の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列を含み得る。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列を含み得る。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、第１の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列及び第２の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列を含む。
別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列を含み得る。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、第１の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列を含み得る。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、第２の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列及び第１の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列を含む。
別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、以下のうちの１つ以上を含み得る：
−第１の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列；
−第２の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列；
−第１の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列及び第２の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列；
−第２の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列；
−第１の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列；
−第２の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列及び第１の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列。
ＲＮＡ分子をコードする核酸
当業者は、前述の説明から、本開示が本明細書に開示されるＲＮＡ分子をコードする単離した核酸及びその成分部分も提供することを理解するであろう。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９のうちのいずれか１つ以上に記載の配列を含む核酸である。核酸は、宿主細胞での発現後に部分的に精製され得る。「部分的に精製された」という用語は、脂質、核酸、他のペプチド、及び宿主細胞において関連する他の汚染分子から通常分離されているＲＮＡ分子を指すために使用される。好ましくは、部分的に精製されたポリヌクレオチドは、それと関連する他の成分を、少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
別の例では、本開示によるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。「異種ポリヌクレオチド」という用語は、当技術分野において十分に理解されており、細胞に内因性ではないポリヌクレオチド、または天然配列が変化した天然ポリヌクレオチド、または組換えＤＮＡ技術による細胞の操作の結果としてその発現が定量的に変化した天然ポリペプチドを指す。
別の例では、本開示によるポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。例えば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡプリンティング及びオリゴヌクレオチド合成などの既存の核酸配列を必要としない技術を使用して生成され得る。別の例では、ポリヌクレオチドはゼノ核酸から生成される。
一例では、好ましくは５’伸長配列内または少なくとも１つのループ配列内のイントロンを含むＲＮＡ前駆体分子をコードする本明細書に開示されるポリヌクレオチドであって、イントロンは、宿主細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリヌクレオチドの転写中にスプライシングで切り出されることができる。別の例では、ループ配列は、２、３、４、５、またはそれ以上のイントロンを含む。本開示はまた、プロモーターに作動可能に連結された本開示の単離した核酸を含むＤＮＡ構築物などの発現構築物を提供する。一例では、そのような単離した核酸及び／または発現構築物は、細胞または非ヒト生物において提供される。一例では、単離した核酸は、細胞または非ヒト生物のゲノムに安定して組み込まれる。適切な発現構築物、プロモーター、及びそれを含む細胞の様々な例を以下で説明する。
本開示によるＲＮＡ分子の合成は、当技術分野で知られる様々な方法を使用して達成することができる。実施例セクションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の例を提供する。この例では、本明細書に開示されるＲＮＡ分子を含む構築物は、３’末端で制限され、沈殿、精製、及び定量化される。ＲＮＡ合成は、ＨＴ１１５エレクトロコンピテントセルの形質転換及びＴ７、ＩＰＴＧシステムを使用したＲＮＡ合成の誘導後に、細菌培養液中で行うことができる。
組換えベクター
本発明の一実施形態は、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、該ＲＮＡ分子を宿主細胞に送達することができる組換えベクターを含む。組換えベクターには発現ベクターが含まれる。組換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、本明細書で定義されるＲＮＡ分子に隣接して天然に見出されない、好ましくは異なる種に由来するポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、典型的には、ウイルスに由来するウイルスベクター、またはプラスミドである。
本開示によるＲＮＡ分子の発現を送達及び媒介するために、様々なウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターの選択は、一般に、送達の標的となる細胞または組織、ベクターの形質導入効率、及び病原性などの様々なパラメーターによって異なる。一例では、ウイルスベクターは、宿主細胞内クロマチンに組み込まれる（例えば、レンチウイルスなど）。別の例では、ウイルスベクターは、主に染色体外エピソームとして細胞核に存続する（例えば、アデノウイルス）。これらのタイプのウイルスベクターの例には、オンコレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びレトロウイルスが挙げられる。
プラスミドベクターには通常、原核細胞における発現カセットの選択、増幅、及び形質転換を容易にする追加の核酸配列が含まれる（例えば、ｐＵＣ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、または１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターなど）。追加の核酸配列には、ベクターの自己複製を提供する複製起点、選択マーカー遺伝子（好ましくは抗生物質または除草剤耐性をコードする）、核酸配列または核酸構築物にコードされる遺伝子を挿入するための複数部位を提供する固有の複数のクローニング部位、ならびに原核細胞及び真核細胞（特に植物）の形質転換を促進する配列を含む。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間の機能的関係を指す。典型的には、転写制御エレメント（プロモーター）と転写された配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、それが適切な細胞におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、本明細書で定義されるＲＮＡ分子のコード配列に作動可能に連結されている。一般的に、転写された配列に作動可能に連結されたプロモーター転写制御エレメントは、転写された配列に物理的に連続している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写制御エレメントは、物理的に連続している必要はない、または転写が増強されるコード配列に近接して配置する必要はない。
複数のプロモーターが存在する場合、各プロモーターは独立して同じでも異なっていてもよい。
形質転換体の同定を容易にするために、組換えベクターは、望ましくは、選択マーカー遺伝子またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」とは、マーカー遺伝子を発現する細胞に明確な表現型を付与する遺伝子を意味し、したがって、そのような形質転換細胞を、マーカーを持たない細胞と区別することができる。選択マーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質）に対する耐性に基づいて「選択」することができる特性を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通じて、すなわち「スクリーニング」により同定可能な特性を与える（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、または非形質転換細胞には存在しない他の酵素活性）。植物形質転換体の選択のための例示的な選択マーカーには、これらに限定されないが、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子、カナマイシン、パロモマイシンに対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、例えば、ＥＰ２５６２２３に記載のグルタチオン由来除草剤に対する耐性を付与するラット肝臓からのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、過剰発現時に、例えばＷＯ８７／０５３２７に記載のホスフィノスリシンなどのグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する耐性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子、例えば、ＥＰ２７５９５７に記載の選択剤ホスフィノスリシンへの耐性を付与すＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）に記載のＮ−ホスホノメチルグリシンに対する耐性を付与する５−エノールシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子、例えば、ＷＯ９１／０２０７１に記載のビアラホスに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を付与するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ由来のｂｘｎなどのニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、イミダゾリノン、スルホニル尿素、または他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を付与する変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（ＥＰ１５４，２０４）、５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異型アントラニル酸シンターゼ遺伝子、または除草剤に対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が挙げられる。
好ましくは、組換えベクターは、植物細胞などの細胞のゲノムに安定して組み込まれる。したがって、組換えベクターは、ベクターをゲノムに、または細胞の染色体に組み込むことを可能にする適切なエレメントを含み得る。
発現ベクター
本明細書において使用される場合、「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換することができ、本明細書で定義されるＲＮＡ分子の発現をもたらすことができるＤＮＡベクターである。本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点などの調節配列、及び宿主細胞と適合可能であり、本開示によるＲＮＡ分子の発現を制御する他の調節配列を含む。特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びリプレッサー配列などの転写開始を制御するものである。使用される調節配列の選択は、対象となる植物及び／または標的器官または組織などの標的生物に依存する。そのような調節配列は、植物または植物ウイルスなどの任意の真核生物から得てもよく、または化学的に合成されてもよい。
植物細胞の安定したトランスフェクションまたはトランスジェニック植物の樹立に適した例示的なベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５，ｓｕｐｐ．１９８７，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下にある１つ以上のクローン化された植物遺伝子及び優性選択マーカーを含む。そのような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導的もしくは構成的、環境的もしくは発生的に調節される、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、及び／またはポリアデニル化シグナルを含むことができる。
本発明のベクターはまた、無細胞発現系において本明細書において定義されるＲＮＡ分子を産生するために使用され得、そのような系は当該分野で周知である。
一例では、本開示によるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞においてＲＮＡ分子の発現を配向することができるプロモーターに作動可能に連結される。一例では、プロモーターはｉｎ ｖｉｔｒｏで機能する。一例では、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。例えば、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり得る。別の例では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであり得る。しかしながら、プロモーターの選択は、対象となる植物、昆虫及び／または標的器官または組織などの標的生物に依存し得る。例示的な哺乳動物プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、ＣａＭＫＩＩａ、ＣＡＬ１、１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、及びＵ６を含む。例示的な昆虫プロモーターは、Ａｃ５及び多面体を含む。植物細胞において活性である多くの構成的プロモーターについても記載される。植物における構成的発現に適したプロモーターには、これらに限定されないが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、リブロース−１，５−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）からの光誘導性プロモーター、イネ細胞質トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼ、及びオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、及びクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターを含む。これらのプロモーターは、植物で発現したＤＮＡベクターを作成するために使用されており、例えば、ＷＯ８４／０２９１３を参照のこと。これらのプロモーターは全て、植物で発現可能な様々な種類の組換えＤＮＡベクターを作成するために使用されている。
葉、種子、根または茎などの植物のソース組織（ｓｏｕｃｅ ｔｉｓｓｕｅ）における発現のために、本発明において利用されるプロモーターは、これらの特定の組織において比較的高い発現を有することが好ましい。このために、組織または細胞特異的な、または発現が増強された遺伝子の多くのプロモーターから選択してもよい。文献で報告されているそのようなプロモーターの例には、エンドウの葉緑体グルタミンシンセターゼＧＳ２プロモーター、コムギの葉緑体フルクトース−１，６−ビホスファターゼプロモーター、ジャガイモの核光合成ＳＴ−ＬＳ１プロモーター、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのセリン／スレオニンキナーゼプロモーター及びグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが挙げられる。また、イースタンラーチ（Ｌａｒｉｘ ｌａｒｉｃｉｎａ）由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、マツ由来のＣａｂ遺伝子、Ｃａｂ６のプロモーター、コムギ由来のＣａｂ−１遺伝子のプロモーター、ホウレンソウ由来のＣａｂ−１遺伝子のプロモーター、イネ由来のＣａｂ １Ｒ遺伝子のプロモーター、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来のピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、タバコＬｈｃｂ１＊２遺伝子のプロモーター、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｓｕｃ２ スクロース−Ｈ３０シンポータープロモーター、及び、ホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質遺伝子のプロモーター（ＰｓａＤ、ＰｓａＦ、ＰｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ＡｔｐＣ、ＡｔｐＤ、Ｃａｂ、ＲｂｃＳ）は、光合成的に活性な組織において活性であると報告されている。ホワイト・マスタード（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ）由来のＬｈｃＢ遺伝子及びＰｓｂＰ遺伝子のプロモーターなど、クロロフィルα／β結合タンパク質の他のプロモーターも本発明で利用してもよい。
（１）熱、（２）光（例えば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、トウモロコシＲｂｃＳプロモーター）、（３）アブシジン酸などのホルモン、（４）創傷（例えば、ＷｕｎＩ）、または（５）化学物質、例えば、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（ＷＯ９７／０６２６９）によって調節されるプロモーターを含む、環境、ホルモン、化学、及び／または発生シグナルに応答して調節される様々な植物遺伝子プロモーターもまた、植物細胞におけるＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現に使用することができ、または（６）臓器特異的プロモーターを使用することも有利であり得る。
本明細書において使用される場合、「植物貯蔵器官特異的プロモーター」という用語は、他の植物組織と比較した場合に、植物の貯蔵器官における遺伝子転写を優先的に誘導するプロモーターを指す。ジャガイモ植物の塊茎、トマトの果実、またはダイズ、キャノーラ、綿、Ｚｅａ ｍａｙ、コムギ、イネ、及びオオムギの種子などの植物のシンク組織での発現のために、本発明において利用されるプロモーターは、これらの特定の組織において比較的高い発現を有することが好ましい。β−コングリシニンのプロモーター、またはナピン、ゼイン、リニン、及びファゼオリンプロモーターなどの他の種子特異的プロモーターを使用することができる。根特異的プロモーターを使用してもよい。そのようなプロモーターの例は、酸性キチナーゼ遺伝子のプロモーターである。根組織における発現は、同定されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメインを利用することによっても達成可能であった。
特に好ましい実施形態では、プロモーターは、脂質生合成が行われる組織及び器官での発現を誘導する。そのようなプロモーターは、種子中の脂質組成を改変するための適切な時期に種子発育において作用し得る。種子特異的発現に好ましいプロモーターは、１）脂質の生合成、ならびにデサチュラーゼ及びエロンガーゼなどの種子の蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子由来のプロモーター、２）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーター、及び３）炭水化物類の生合成及び種子の蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子の由来のプロモーター、を含む。適切な種子特異的プロモーターは、セイヨウアブラナナピン遺伝子プロモーター（ＵＳ５，６０８，１５２）、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓオレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓファゼオリンプロモーター（ＵＳ５，５０４，２００）、Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｂｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）、またはレグミンＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、及びトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネなどの単子葉植物において種子特異的発現をもたらすプロモーターである。適切な注目すべきプロモーターは、オオムギｌｐｔ２もしくはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（ＷＯ ９５／１５３８９及びＷＯ ９５／２３２３０）、またはＷＯ ９９／１６８９０に記載のプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、ソルガムカシリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子由来のプロモーター）である。他のプロモーターは、Ｂｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．（２００４）、ＵＳ ２００７０１９２９０２及びＵＳ ２００３０１５９１７３に記載のものを含む。一実施形態では、種子特異的プロモーターは、子葉（複数可）または胚乳などの種子の定義された部分において優先的に発現する。子葉特異的プロモーターの例には、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、エンドウ豆のレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、及び豆のフィトヘマグルチニンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）が含まれるが、これらに限定されない。胚乳特異的プロモーターの例には、トウモロコシゼイン−１プロモーター（Ｃｈｉｋｗａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、イネグルテリン−１プロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）、オオムギＤ−ホルデインプロモーター（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）、及びコムギＨＭＷグルテニンプロモーター（Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、種子特異的プロモーターは、胚において及び／または種子が発芽した後に発現されないか、または低レベルでのみ発現される。
別の実施形態では、植物貯蔵器官特異的プロモーターは果実特異的プロモーターである。例には、トマトのポリガラクツロナーゼ、Ｅ８及びＰｄｓプロモーター、ならびにリンゴのＡＣＣオキシダーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない（総説については、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，２００４を参照のこと）。好ましい実施形態では、プロモーターは、果実の皮または果実内の種子と比較して、果実の可食部、例えば果実の髄における発現を優先的に誘導する。
一実施形態では、誘導性プロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｌｃ系である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｌｃ系の代わりに使用できる誘導性発現系の例は、Ｐａｄｉｄａｍ（２００３）及びＣｏｒｒａｄｏ ａｎｄ Ｋａｒａｌｉ（２００９）の総説に記載されている。別の実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、トウモロコシｌｎ２−１またはｌｎ２−２プロモーターなどのより安全な誘導性プロモーターであり（Ｈｅｒｓｈｅｙ ａｎｄ Ｓｔｏｎｅｒ，１９９１）、より安全な誘導性プロモーターは、トウモロコシＧＳＴ−２７プロモーター（Ｊｅｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、またはダイズＧＨ２／４プロモーター（Ｕｌｍａｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９５）である。
別の実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の老化誘導性プロモーターＳＡＧ（老化関連遺伝子）１２及びＳＡＧ１３（Ｇａｎ，１９９５；Ｇａｎ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ，１９９５）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＬＳＣ５４（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，１９９４）などの老化誘導性プロモーターである。そのようなプロモーターは、植物組織、特に葉の老化の発生時頃に発現の増加を示す。
栄養組織での発現には、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーターなどの葉特異的プロモーターを使用することができる。例えば、トマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２、及びＲＢＣＳ３Ａ遺伝子は、葉及び光育苗において発現する（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）により記載された、葉身及び葉鞘の葉肉細胞においてほぼ排他的に高レベルで発現するリブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターを使用することができる。別の葉に特異的なプロモーターは、集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーターである（Ｓｈｉｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７を参照のこと）。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）により記載のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）は、葉特異的である。Ａｔｍｙｂ５プロモーターは、若いロゼット及び茎生葉の縁にある発達中の葉のトライコーム、托葉、及び表皮細胞において、ならびに未熟な種子中に発現している。Ｂｕｓｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）によってトウモロコシで同定された葉のプロモーターを使用することもできる。
場合により、例えば、ＬＥＣ２またはＢＢＭが組換え発現される場合、導入遺伝子が高レベルで発現されないことが望ましい場合がある。そのような状況で使用することができるプロモーターの例は、種子特異的発現パターンを保持するが、発現レベルが低下した短縮型ナピンＡプロモーターである（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
５’非翻訳リーダー配列は、本開示のＲＮＡ分子の異種遺伝子配列を発現するように選択されたプロモーターに由来され得、または生成される酵素のコード領域に対して異種であってもよく、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるために、必要に応じて特異的に改変され得る。導入遺伝子の発現の最適化の総説については、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照のこと。５’非翻訳領域は、植物ウイルスＲＮＡ（特に、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、適切な真核生物遺伝子、植物遺伝子（コムギ及びトウモロコシのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列からも得ることができる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を有する５’非翻訳配列に由来する構築物に限定されない。リーダー配列はまた、関連しないプロモーターまたはコード配列から誘導され得る。本発明の文脈において有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（ＵＳ５，３６２，８６５及びＵＳ５，８５９，３４７）及びＴＭＶオメガエレメントを含む。
転写の終結は、対象となるＲＮＡ分子に発現ベクターにおいて作動可能に連結された３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、アデニル酸ヌクレオチドをＲＮＡの３’末端に付加させる植物内で機能するポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞で発現する様々な遺伝子から得ることができる。ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ豆小サブユニットＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子の３’非翻訳領域は、この能力において一般的に使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む３’転写された非翻訳領域もまた好適である。
移入核酸
移入核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用され得、１つ、好ましくは２つの境界配列及び１つ以上の目的のＲＮＡ分子を含む。移入核酸は、選択マーカーをコードしても、しなくてもよい。好ましくは、移入核酸は、細菌内のバイナリーベクターの一部を形成し、該バイナリーベクターは、細菌内でのベクターの複製、バイナリーベクターを含む細菌細胞の選択、または維持を可能にするエレメントをさらに含む。真核細胞に移入すると、バイナリーベクターの移入核酸成分は、真核細胞のゲノムへの組み込みが可能であり、一過性発現実験では、細胞内での発現のみが可能である。
本明細書において使用される場合、「染色体外移入核酸」という用語は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種などの細菌から植物の葉細胞などの真核細胞に移入することができる核酸分子を指す。染色体外移入核酸は、移入され、その後、その境界内に含まれるヌクレオチド配列がレシピエント細胞のゲノムに組み込まれることが可能なエレメントとして周知の遺伝的エレメントである。この点において、移入核酸は、典型的には２つの「境界」配列に隣接しているが、場合によっては、第１の端の単一の境界を使用することができ、移入核酸の第２の端は移入プロセスでランダムに生成される。対象となるＲＮＡ分子は、典型的には、移入核酸の左境界様配列と右境界様配列との間に配置される。移入核酸内に含まれるＲＮＡ分子は、その発現、すなわちＲＮＡ分子の転写及び／または翻訳を促進する様々な異なるプロモーター及びターミネーター調節エレメントに作動可能に連結され得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来の移入ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）、及びそれらの人工バリアント／変異体は、移入核酸のおそらく最も特徴的な例である。別の例は、植物由来のＴ−ＤＮＡ境界様配列を含むＰ−ＤＮＡ（「植物−ＤＮＡ」）である。
本明細書において使用される場合、「Ｔ−ＤＮＡ」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ＲｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡ、または植物細胞へのＤＮＡの移入のために機能するそれらのバリアントを指す。Ｔ−ＤＮＡは、右及び左の両方の境界配列を含むＴ−ＤＮＡ全体を含み得るが、移入のためにシスに必要な最小限の配列、すなわち右のＴ−ＤＮＡ境界配列のみを含む必要がある。本発明のＴ−ＤＮＡは、右境界配列と左境界配列（存在する場合）との間のどこか、対象となるＲＮＡ分子に挿入されている。Ｔ−ＤＮＡをｖｉｒ遺伝子などの植物細胞に移入するためにトランスで必要な因子をコードする配列は、Ｔ−ＤＮＡに挿入され得るか、Ｔ−ＤＮＡと同じレプリコンに存在し得るか、または好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の互換性のあるレプリコンのトランス中にある。そのような「バイナリーベクター系」は、当該技術分野において周知である。本明細書において使用される場合、「Ｐ−ＤＮＡ」は、植物ゲノムまたはその人工バリアント／変異体から単離した移入核酸を指し、各末端または一端のみにＴ−ＤＮＡ境界様配列を含む。
本明細書において使用される場合、移入核酸の「境界」配列は、植物または細菌などの選択された生物から単離することができ、またはその人工バリアント／変異体であることができる。境界配列は、それが連結されているＲＮＡ分子の移入を促進及び容易にし、レシピエント細胞ゲノムへの組み込みを容易にし得る。一実施形態では、境界配列は１０〜８０ｂｐ長である。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来のＴ−ＤＮＡの境界配列は、当該技術分野において周知であり、Ｌａｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ．（２００８）に記載されているものが挙げられる。
元来、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種だけが植物細胞への遺伝子移入に使用されてきた一方、現在、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種と同様の方法で作用する同定／発達した多数の系が存在する。最近、いくつかの非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種が遺伝子移入にコンピテントとなるように遺伝子改変された（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これらにはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ種ＮＧＲ２３４，Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ及びＭｅｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉが含まれる。
細菌から真核生物宿主への真核生物発現プラスミドの直接移入は、数十年前に哺乳動物細胞と、プラスミドを保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのプロトプラストとの融合によって初めて達成された（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，１９８０）。それ以来、哺乳動物細胞に遺伝子を送達することができる細菌の数は着実に増加しており（Ｗｅｉｓｓ，２００３）、４つのグループによって個別に発見された（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｄａｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
本明細書において使用される場合、「トランスフェクション」、「形質転換」という用語及びその変形形態は、一般的に互換的に使用される。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞は、目的のＲＮＡ分子（複数可）を導入するように操作され得るか、またはそれらに由来する子孫細胞であり得る。
組換え細胞
本発明はまた、本明細書で定義される１つ以上のＲＮＡ分子またはベクターで形質転換された宿主細胞である、例えば組換え細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞、またはそれらの組み合わせなどの組換え細胞を提供する。本発明の好適な細胞は、本開示によるＲＮＡ分子または組換えベクターで形質転換され得る任意の細胞を含む。一例では、形質転換された宿主細胞は死んでいる。
組換え細胞は、培養中の細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞、または例えば植物などの生物、または例えば種子もしくは葉などの器官中の細胞であり得る。好ましくは、細胞は植物中にあり、より好ましくは、植物の種子中にある。一実施形態では、組換え細胞は非ヒト細胞である。したがって、一例では、本開示は、本明細書に開示されるＲＮＡ分子の１つ以上またはその全てを含む非ヒト生物に関する。
一例において、細胞は昆虫細胞である。一例において、昆虫細胞はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａに由来する。
適切な宿主細胞の別の例は、エレクトロコンピテントＨＴ１１５細胞である。
ＲＮＡ分子（複数可）が導入される宿主細胞は、非形質転換細胞（複数可）または少なくとも１つの核酸で既に形質転換されている細胞のいずれかであり得る。そのような核酸は、脂質合成に関連する場合もあれば、関連しない場合もある。本発明の宿主細胞は、本明細書に定義されるＲＮＡ分子（複数可）を内因的に（すなわち天然に）発現することができ、その場合、それに由来する組換え細胞は、ＲＮＡ分子（複数可）を産生する能力が増強されているか、または本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡ分子（複数可）で形質転換された後にのみ、該ＲＮＡ分子を生成することができる。一例では、細胞は、脂質を産生するために使用することができる細胞である。一実施形態では、本発明の組換え細胞は、ＴＡＧのような非極性脂質を産生する能力が増強されている。
本開示の宿主細胞は、本明細書に記載される少なくとも１つのＲＮＡ分子を発現することができる任意の細胞であり得、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生虫、節足動物、動物及び植物細胞を含む。宿主細胞の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、及びＶｅｒｏ細胞が挙げられる。宿主細胞のさらなる例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２誘導体を含むＥ．Ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、弱毒株を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、及び非腫瘍形成性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２４６）が挙げられる。追加の適切な哺乳動物細胞宿主には、他の腎臓細胞株、他の線維芽細胞株（例えば、ヒト、マウスまたはニワトリ胚線維芽細胞株）、骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞及び／またはＨｅＬａ細胞が挙げられる。
好ましい実施形態では、植物細胞は種子細胞、特に種子の子葉または胚乳中の細胞である。一実施形態では、細胞は動物細胞である。動物細胞は、例えば、非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、または魚もしくは甲殻類などの水生動物の細胞、無脊椎動物、昆虫などの任意の種類の動物であってよい。本発明の宿主細胞として有用な藻類細胞の例は、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ種、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種、及びＶｏｌｖｏｘ種が挙げられる。
トランスジェニック植物
本発明はまた、本明細書で定義される１つ以上の外因性ＲＮＡ分子、本開示による細胞、本開示によるベクター、またはそれらの組み合わせを含む植物を提供する。名詞として使用される「植物」という用語は、植物全体を指し、「その一部」という用語は、植物器官（例えば、葉、茎、根、花、果実）、単細胞（例えば、花粉）、種子、胚、胚乳、胚盤または種皮などの種子部分、維管束組織などの植物組織、植物細胞及びそれらの子孫を指す。本明細書において使用される場合、植物部分は植物細胞を含む。
本明細書において使用される場合、植物に対する改変の文脈における「植物内（ｉｎ ａ ｐｌａｎｔ）」及び「植物内（ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ）」という用語は、改変が植物全体で起こった場合を含む、植物の少なくとも一部で改変が起こったことを意味し、植物の全ての部分ではなく、１つ以上の部分のみで改変が発生する場合を除外しない。例えば、組織特異的プロモーターは、植物の特定の部分でのみ発現する場合があるが、「植物内」で発現すると言われている。同様に、「植物における１つ以上の解糖及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチド」は、増加した発現が植物の少なくとも一部において生じることを意味する。
本明細書において使用される場合、「植物」という用語は、最も広い意味で使用されており、植物界のあらゆる生物を含む。紅藻及び褐藻、そして緑藻も含まれる。これらに限定されないが、顕花植物、草、作物、または穀物（例えば、油糧種子、トウモロコシ、ダイズなど）、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）または飼料（ｆｏｒａｇｅ）、果実または野菜の植物、ハーブ植物、木本植物または木の任意の種が含まれる。植物を任意の特定の構造に限定することは意図していない。また、単細胞植物（例えば、微細藻類）も指す。植物に関して「その一部」という用語は、植物細胞及びその子孫、複数の植物細胞、植物の発育の任意の段階で存在する構造、または植物組織を指す。このような構造には、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子、種皮、胚が含まれるが、これらに限定されない。「植物組織」という用語は、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子に存在するものを含む、植物の分化及び未分化組織、例えば、胚組織、内胚乳、表皮組織（例えば、表皮、周皮）、維管束組織（例えば、木部、師部）、または基底組織（柔細胞、厚角細胞、及び／または厚膜細胞を含む）、及び培養中の細胞（例えば、単一細胞、プロトプラスト、カルス、胚など）を含む。植物組織は、ｉｎ ｐｌａｎｔａ、器官培養、組織培養、または細胞培養にあってもよい。
異なる量の１８：３及び１６：３脂肪酸が、異なる植物種の糖脂質内にあることが見出されている。これは、３つの二重結合を有する脂肪酸が通常、常にＣ１８原子長である１８：３植物と、Ｃ１６脂肪酸及びＣ１８脂肪酸の両方を含む１６：３植物とを区別するために使用される。１８：３葉緑体では、ホスファチデートのジアシルグリセロールへの変換、及びジアシグリセロールのモノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤ）への変換を触媒する酵素活性は、１６：３葉緑体においてよりも著しく活性が低い。１８：３植物の葉では、葉緑体はストロマでステアロイル−ＡＣＰ２を合成し、飽和炭化水素鎖に最初の二重結合を導入し、チオエステルを加水分解する。放出されたオレイン酸は、葉緑体包膜にわたって、細胞の真核部分の膜、おそらく小胞体に輸送され、そこでＰＣに組み込まれる。ＰＣ結合オレオイル基は、これらの膜で不飽和化され、その後葉緑体に戻る。ＭＧＤ結合アシル基は、第３の二重結合を導入して２つのリノレノイル残基を有するＭＧＤを生成するための基質である。このガラクト脂質は、例えばＡｓｔｅｒａｃｅａｅ及びＦａｂａｃｅａｅなどの１８：３植物に特徴的である。例えば、Ａｐｉａｃｅａｅ及びＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅのメンバーに代表される１６：３植物の光合成的に活性な細胞では、ＭＧＤを有するチラコイドを提供するために２つの経路が並行して作動する。協調的な「真核性」配列は、「原核性」経路によって様々な程度まで追加される。その反応は葉緑体に限定されており、ＭＧＤにエステル化されると、アシル基の典型的な配置及びその完全な不飽和化が生じる。原核性ＤＡＧ骨格は、Ｃ１８：脂肪酸が除外される位置Ｃ−２でＣ１６：０及びその不飽和化生成物を保持する。Ｃ−１位はＣ１８脂肪酸によって占められており、わずかにＣ１６グループによって占められている。藍藻由来の脂質のＤＡＧ骨格と、１６：３植物の葉緑体確認済経路（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ−ｃｏｎｆｍｅｄ ｐａｔｈｗａｙ）によって合成されたものとの類似性は、系統関係を示唆し、原核性という用語を正当化する。
本明細書において使用される場合、「栄養組織」または「栄養植物部分」という用語は、植物の有性生殖のための器官以外の任意の植物組織、器官または部分である。植物の有性生殖のための器官は、具体的には種子を運ぶ器官、花、花粉、果実、及び種子である。栄養組織及び部分には、少なくとも植物の葉、茎（抽だい部分及び分げつ部分を含むが、頭部を除く）、塊茎及び根が含まれるが、花、花粉、種皮、胚及び胚乳を含む種子、中果皮組織を含む果実、種子を有するさや及び種子を有する穂（ｓｅｅｄ−ｂｅａｒｉｎｇ ｈｅａｄｓ）を除く。一実施形態では、植物の栄養部分は着生植物部分である。別のまたはさらなる実施形態では、栄養植物部分は、葉または茎などの緑色部分である。
「トランスジェニック植物」またはその変形形態は、同じ種、亜種または品種の野生型植物には見られない導入遺伝子を含む植物を指す。本発明の文脈で定義されるトランスジェニック植物は、組換え技術を使用して遺伝子改変されて、所望の植物またはその一部において本明細書で定義される少なくとも１つのポリペプチドの産生を引き起こす植物及びそれらの子孫を含む。トランスジェニック植物部分には対応する意味がある。
「種子」及び「穀粒」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「穀粒」は、採取された穀粒、またはまだ植物上にあるが収穫の準備ができている穀粒などの成熟した穀粒を指すが、文脈に応じて、吸収または発芽後の穀粒を指すこともできる。成熟した穀粒は通常、含水率が約１８％未満である。好ましい実施形態では、穀粒の含水率は、一般に貯蔵に安全とみなされるレベルであり、好ましくは５％〜１５％、６％〜８％、８％〜１０％、または１０％〜１５％である。本明細書で使用される「発育中の種子」は、典型的には受精または開花後の植物の生殖構造に見られる成熟前の種子を指すが、植物から単離される成熟前のそのような種子を指すこともできる。成熟した種子は通常、含水率が約１２％未満である。
本明細書において使用される場合、「植物貯蔵器官」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質の形態でエネルギーを貯蔵することに特化した植物の一部を指す。植物貯蔵器官の例は、種子、果実、塊根、及び塊茎である。本発明の好ましい植物貯蔵器官は種子である。
本明細書において使用される場合、「表現型的に正常」という用語は、未改変の植物またはその一部と比較して、成長及び繁殖する能力が著しく低下していない、遺伝子組換え植物またはその一部、例えばトランスジェニック植物、または本発明の種子、塊茎もしくは果実などの貯蔵器官を指す。好ましくは、バイオマス、成長速度、発芽速度、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、及び／または産生される生存可能な種子の数は、同一の条件下で成長させた場合、上記組換えポリヌクレオチドを欠く植物の９０％以上である。この用語は、野生型植物とは異なり得るが、例えば子葉（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｌｅａｖｅ）のバレリーナ表現型（ｂａｌｌｅｒｉｎａ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）などの商用目的の植物の有用性に影響を及ぼさない植物の特徴を包含しない。一実施形態では、表現型が正常である遺伝子組換え植物またはその一部は、植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたサイレンシングサプレッサーをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、上記ポリヌクレオチドを含まない対応する植物またはその一部と本質的に同じ成長または繁殖する能力を有する。
本発明の実施において使用するために提供または企図される植物には、単子葉植物及び双子葉植物の両方が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の植物は作物（例えば、穀物及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、イネ、ソルガム、キビ、キャッサバ、オオムギ）、またはダイズ、マメ、もしくはエンドウマメなどのマメ科植物である。植物は、食用の根、塊茎、葉、茎、花または果実の産生のために栽培され得る。植物は、栄養部分が食物として使用される野菜植物であり得る。本発明の植物は、Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ（マカウバヤシ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ラッカセイ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ムルムル）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（トゥクマン）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ（Ｉｎｄａｉａ−ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ（アメリカアブラヤシ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ（ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ（ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ（ババス）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（エンバク）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）などのＢｒａｓｓｉｃａ種、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（アマナズナ）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ（ヘンプ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ペキー）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ（ココナッツ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（アビシニアンケール）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アフリカヤシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）などのＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ種、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（ナンヨウアブラギリ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ（アララナッツツリー（ａｒａｒａ ｎｕｔ−ｔｒｅｅ））、Ｌｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌｅｍｎａ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（イボウキクサ（ｓｗｏｌｌｅｎ ｄｕｃｋｗｅｅｄ））、Ｌｅｍｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｕｔａ、Ｌｅｍｎａ ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ、Ｌｅｍｎａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌｅｍｎａ ｔｅｎｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌｅｍｎａ ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｌｅｍｎａ ｙｕｎｇｅｎｓｉｓなどのＬｅｍｎａ種（ウキクサ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（オオミテングヤシ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ（イナジャヤシ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ及びＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓなどのＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ種、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａなどのＮｉｃｏｔｉａｎａ種（タバコ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ（ｂａｃａｂａ−ｄｏ−ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ（ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ（ｂａｃａｂａ−ｄｅ−ｌｅｑｕｅ）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ及びＯｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）などのＯｒｙｚａ種（イネ）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ（ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ（アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ（クロヨナ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ（クプアス）などのＳｏｒｇｈｕｍ種、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ種、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ブラジルハリヤシ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍなどのＴｒｉｔｉｃｕｍ種（コムギ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、ａｌｆａｌｆａ（ムラサキウマゴヤシ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒａｌｅ）、サツマイモ（Ｌｏｐｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ種）、パイナップル（Ａｎａｎａ ｃｏｍｏｓｕｓ）、ミカンの木（Ｃｉｔｒｕｓ種）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｅｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）及びアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）であり得る。例えば、本開示の植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａであり得る。
他の好ましい植物には、上記のものに加えて、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉ、Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ、Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｂｕｃｈｌｏｅ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ、Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｃｒｙｐｔａｎｄｒｕｓなどのＣ４草、Ｅｌｙｍｕｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、ｔｈｅ ｌｅｇｕｍｅｓ Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｃａｐｉｔａｔａ、及びＰｅｔａｌｏｓｔｅｍｕｍ ｖｉｌｌｏｓｕｍ、ｆｏｒｂ Ａｓｔｅｒ ａｚｕｒｅｕｓなどのＣ３草、ならびにＱｕｅｒｃｕｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓ及びＱ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａなどの木本植物が挙げられる。他の好ましい植物には、Ｃ３草が挙げられる。
好ましい実施形態では、植物は被子植物である。
一実施形態では、植物は、油糧種子植物、好ましくは油糧種子作物である。本明細書において使用される場合、「油糧種子植物」は、植物の種子由来の脂質の商業的生産に使用される植物種である。油糧種子植物は、例えば、アブラナ（キャノーラなど）、トウモロコシ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、ソルガム、アマ（アマニ）、またはテンサイであり得る。さらに、油糧種子植物は、他のＢｒａｓｓｉｃａ、ワタ、ラッカセイ、ケシ、ルタバガ、マスタード、トウゴマ、ゴマ、ベニバナ、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ、またはナッツ産生植物であり得る。植物は、オリーブ、アブラヤシ、またはココナッツなどの果実内で高レベルの脂質を産生し得る。本発明を適用することができる園芸植物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリー、もしくはカリフラワーを含む野菜Ｂｒａｓｓｉｃａである。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、イチゴ、トマト、またはコショウに適用され得る。
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物は、導入されたあらゆる遺伝子（導入遺伝子）がホモ接合性であるため、その子孫は所望の表現型で分離されない。トランスジェニック植物はまた、導入された導入遺伝子（複数可）についてヘテロ接合性であり得、好ましくは、例えばハイブリッド種子から成長したＦ１子孫における、導入遺伝子について均一にヘテロ接合性であり得る。そのような植物は、当技術分野で周知のハイブリッド強勢などの利点をもたらし得る。
形質転換
本明細書に開示されるＲＮＡ分子は、上記宿主細胞及び／または植物などの非ヒト生物に安定的に導入され得る。誤解を避けるために記すと、本開示の例は、本明細書に開示されるＲＮＡ分子で安定して形質転換された上記植物を包含する。本明細書において使用される場合、「安定して形質転換する」、「安定して形質転換された」という用語及びその変形形態は、ＲＮＡ分子またはそれをコードする核酸が、細胞のゲノムに組み込まれ、それらの存在を積極的に選別する必要なしに、細胞分裂中に子孫細胞に移入されることを指す。安定した形質転換体、またはその子孫は、染色体ＤＮＡ上のサザンブロット、またはゲノムＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの当技術分野において公知の任意の手段によって同定でき、それらの選別を可能にする。
トランスジェニック植物は、Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）、及びＣｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｋｌｅｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（２００４）に一般的に記載のような当技術分野で既知の技術を使用して産生することができる。
一実施形態では、本開示によるＲＮＡ分子を植物またはその一部に局所的に適用することにより、植物を形質転換することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、適切な担体を含む製剤として提供され得、植物またはその一部の表面に噴霧、散布、または他の方法で適用され得る。したがって、例では、本開示の方法は、本明細書に開示されるＲＮＡ分子を植物に導入することを含み、この方法は、ＲＮＡ分子を含む組成物を植物またはその一部に局所的に適用することを含む。
一過性の発現または植物細胞ゲノムのＤＮＡの安定した組み込みのために、植物組織全体、植物器官、または組織培養の外植片の細胞にＤＮＡを導入することができるため、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介移入は、植物細胞に遺伝子を導入するための応用範囲の広い系である。例えば、フローラルディップ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）法を使用してもよい。ＤＮＡを植物細胞に導入するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介植物組み込みベクターの使用は、当該技術分野において周知である。移入されるＤＮＡの領域は境界配列によって定義され、介在ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は通常植物ゲノムに挿入される。遺伝子移入の容易かつ明確な性質から、これは最適な方法である。
使用できる加速方法には、例えば、マイクロプロジェクタイルボンバードメントなどが挙げられる。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の一例は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントである。この方法は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）によって総説されている。核酸でコーティングされ得る非生物学的粒子（マイクロプロジェクタイル）は、推進力によって、例えば未熟胚の細胞に送達され得る。例示的な粒子には、タングステン、金、白金などからなるものが含まれる。
別の方法では、色素体が安定して形質転換され得る。高等植物における色素体形質転換について開示された方法は、選択マーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達、及び相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化を含む（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２４７９、及びＷＯ９９／０５２６５）。他の細胞形質転換法も使用することができ、花粉への直接ＤＮＡ移入、植物の生殖器官へのＤＮＡの直接注入、または未熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注入後の乾燥胚の再水和による、植物へのＤＮＡの導入が含まれるが、これらに限定されない。
単一植物プロトプラスト形質転換体から、または様々な形質転換外植片からの植物の再生、発達、及び栽培は、当該技術分野において周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（１９８８））。この再生及び成長プロセスには、通常、形質転換細胞を選別するステップが含まれ、それらの個別化された細胞を、通常の胚発生期から発根した幼植物期まで培養する。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生される。得られたトランスジェニック発根シュートをその後、土壌などの適切な植物成長培地に植える。
外来の外因性遺伝子を含む植物の発生または再生は、当該技術分野において周知である。好ましくは、再生された植物は、自家受粉して、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供する。さもないと、再生植物から得られた花粉は、農学的に重要な系統の種子栽培植物と交配される。逆に、これらの重要な系統の植物からの花粉は、再生植物を受粉するために使用される。所望のポリヌクレオチドを含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して栽培される。
トランスジェニック細胞及び植物における導入遺伝子の存在を確認するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を、当業者に知られている方法を使用して行うことができる。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質に応じて、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット、及び酵素アッセイなどを含む、様々な方法のいずれかで検出することができる。トランスジェニック植物が得られたら、それらを成長させて、所望の表現型を有する植物組織または部分を産生し得る。植物組織または植物部分は、採取される、及び／または種子が回収され得る。種子は、所望の特性を有する組織または部分を有するさらなる植物を成長させるための供給源として役立ち得る。好ましくは、栄養植物部分は、非極性脂質の収量が最も高い時に採取される。一実施形態では、栄養植物部分は、開花時頃、または開花開始後に採取される。好ましくは、植物部分は、老化が始まる頃（通常、葉の黄変及び乾燥によって示される）に採取される。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたは他の形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は、通常、１つの染色体上に単一の遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物は、追加された遺伝子（複数可）についてヘミ接合性であると称される場合もある。より好ましいのは、追加された遺伝子（複数可）についてホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの追加された遺伝子を含むトランスジェニック植物である（染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に１つの遺伝子がある）。ホモ接合トランスジェニック植物は、ヘミ接合トランスジェニック植物を自家受精させ、生成された種子の一部を発芽させ、得られた植物を目的の遺伝子について分析することによって得ることができる。
また、独立して分離している２つの外因性遺伝子または遺伝子座を含む２つの異なるトランスジェニック植物を交雑（交配）して、遺伝子または遺伝子座の両方のセットを含む子孫を生成することもできることが理解される。適切なＦ１子孫の自殖は、外因性遺伝子または遺伝子座の両方についてホモ接合性である植物を産生することができる。親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も、栄養繁殖と同様に企図されている。同様に、トランスジェニック植物は、変異遺伝子、及び同定された導入遺伝子及び遺伝子改変の両方を含む子孫などの遺伝子改変を含む第２の植物と交配することができる。様々な特性及び作物に一般的に使用されている他の交配方法の説明は、Ｆｅｈｒ、Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７）に見出され得る。
製剤
本開示によるＲＮＡ分子は、様々な製剤として提供することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、固体、軟膏、ゲル、クリーム、粉末、ペースト、懸濁液、コロイド、泡またはエアロゾルの形態であり得る。固体形態は、水分散性（「湿潤性」）であり得る、粉剤、散剤、顆粒、ペレット剤、丸剤、パステル剤、錠剤、充填フィルム（種子コーティングを含む）などを含み得る。一例において、組成物は濃縮物の形態である。
一例では、ＲＮＡ分子は局所製剤として提供されてもよい。一例では、製剤は、製剤中及び／またはｉｎ−ｖｉｖｏでＲＮＡ分子を安定化させる。例えば、ＲＮＡ分子は脂質製剤で提供されてもよい。例えば、ＲＮＡ分子はリポソームで提供されてもよい。一例では、製剤はトランスフェクション促進剤を含む。
本明細書で使用される「トランスフェクション促進剤」という用語は、これらに限定されないが、植物細胞、昆虫細胞または真菌細胞などの細胞への取り込みを増加させるためにＲＮＡ分子に添加される組成物を指す。細胞をトランスフェクションするのに適した、当技術分野で知られている任意のトランスフェクション促進剤を使用することができる。例としては、カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２．３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチロキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、リポスパミン、特に、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミン−イウムトリフルオロ−アセテート）及びＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）−プロピルアミド、ならびにジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、例えば、これらに限定されないが、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）及びＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）のうちの１つ以上などが挙げられる。カチオン性脂質は、任意に、非カチオン性脂質、特に中性脂質、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、またはコレステロールなどの脂質と組み合わせる。好適な市販のトランスフェクション試薬の非限定的な例としては、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
一例では、ＲＮＡ分子は、フィールドへの適用に適した製剤に組み込むことができる。一例では、フィールドは植物を含む。好適な植物には、作物（例えば、穀類及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、ソルガム、ダイズキビ、キャッサバ、オオムギ、もしくはエンドウマネ）、またはマメ科植物が含まれる。植物は、食用の根、塊茎、葉、茎、花または果実の産生のために栽培され得る。一例では、作物は穀物植物である。穀物植物の例には、コムギ、オオムギ、ソルガムオート、及びライムギが含まれるが、これらに限定されない。これらの例では、ＲＮＡ分子は、任意の適切な方法で、植物または植物の任意の部分へ投与するために製剤化され得る。例えば、組成物は、植物の葉、茎、根、果実野菜、穀物及び／または豆類への投与のために製剤化され得る。一例において、ＲＮＡ分子は植物の葉への投与用に製剤化されており、植物の葉に噴霧可能である。
所望の製剤に応じて、本明細書に記載されるＲＮＡ分子は、様々な他の薬剤を用いて製剤化され得る。例示的な薬剤は、懸濁剤、凝集剤、基剤、緩衝剤、苦味剤、香料、保存剤、噴射剤、チキソトロープ剤、凍結防止剤、及び着色剤のうちの１つ以上を含む。
他の例では、ＲＮＡ分子製剤は、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、殺虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）、殺菌剤、抗生物質、防虫剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または殺線虫剤を含むことができる。
別の例では、ＲＮＡ分子を医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、本明細書に記載されるＲＮＡ分子及び薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語には、薬学的投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、経皮（局所）、経粘膜、経口及び直腸投与が挙げられる。
一実施形態では、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、リポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、例えば、ＵＳ４，５２２，８１１に記載の当業者に公知である方法にしたがって調製することができる。
本開示によるＲＮＡ分子は、キットまたはパックで提供され得る。例えば、本明細書に開示されるＲＮＡ分子は、上記細胞または生物を産生するかまたは状態を治療するための書面による指示と共に適切な容器にパッケージされ得る。
非ヒト生物の防除方法
一例では、本開示によるＲＮＡ分子は、昆虫などの非ヒト生物を防除するために使用することができる。そのような使用は、様々な方法を使用して、本開示によるＲＮＡ分子を投与することを含む。一例では、本開示によるＲＮＡ分子は、昆虫による摂取のための昆虫の餌として提供され得る。別の例では、ＲＮＡ分子は必要に応じて昆虫に噴霧することができる。別の例では、ＲＮＡ分子を植物または作物に噴霧して、該植物または作物を昆虫から保護することができる。例示的な作物には、ワタ、トウモロコシ、トマト、ヒヨコマメ、キマメ、アルファルファ、イネ、ソルガム及びササゲが含まれる。
一例では、ＲＮＡ分子は昆虫の行動を変化させるために提供することができる。別の例では、ＲＮＡ分子は昆虫を殺すために提供することができる。別の例では、ＲＮＡ分子は、昆虫の繁殖力を低下させるために提供することができる。例示的な昆虫標的には、家庭用昆虫が挙げられる。他の例示的な昆虫標的には、アブラムシなどの吸汁性昆虫（例えば、Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ ｄｉｒｈｏｄｕｍ、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ、Ａｐｈｉｓ ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ａｐｈｉｓ ｆａｂａｅ）が挙げられる。さらなる例示的な昆虫標的には、クモ類、蚊、外寄生生物、ハエ、ハダニ、アザミウマ、マダニ、ワクモ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、カブトムシ、ハサミムシ、蚊及びノミが挙げられる。他の例示的な昆虫標的には農業害虫が挙げられる。例としては、カメムシ及びアブラムシなどの樹液摂取生物（ｓａｐ ｆｅｅｄｅｒ）、キャタピラー、カブトムシ、いも虫などの咀嚼性昆虫、アザミウマ及びナメクジなどのラスピング昆虫（ｒａｓｐｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ）、ガ、ミバエなどのハエ、ナガシンクイ、ゾウムシ及びコクガなどの穀物害虫、などが挙げられる。
一実施形態では、昆虫は吸汁性昆虫である。この例では、ＲＮＡ分子はＭｐＣ００２及び／またはＭｐＲａｃｋ−１に対してアンチセンス活性を持つことができる。一実施形態では、吸汁性昆虫はアブラムシである。別の実施形態では、アブラムシはＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅである。
一実施形態では、昆虫標的は、アリ（例えば、Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ ｈｕｍｉｌｅ）、オオタバコガ（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）もしくはオオタバコガ（ｃｏｒｎ ｅａｒ ｗｏｒｍ）（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、またはクロバエ（例えば、Ｌｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａ）である。一実施形態では、標的昆虫はＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａであり、ＲＮＡ分子はＡＢＣトランスポーターホワイト遺伝子（ＡＢＣホワイト）に対するアンチセンス活性を有する。別の実施形態では、標的昆虫はＬｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ ｈｕｍｉｌｅであり、ＲＮＡ分子はフェロモン生合成活性化ニューロペプチド（ＰＢＡＮ）に対するアンチセンス活性を有する。別の実施形態では、標的昆虫はＬｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａであり、ＲＮＡ分子は、Ｖ型プロトンＡＴＰａｓｅ触媒サブユニットＡ、ＲＮＡｓｅ １／２、キチンシンターゼ、エクジソン受容体、及びγ−チューブリン１／１様からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子に対してアンチセンス活性を有する。
上記の実施形態では、本明細書に開示される組成物及びＲＮＡ分子は、ディスペンサーで提供されてもよい。一例では、ディスペンサーはトラップまたはルアーである。一実施形態では、トラップ及び／またはルアーは、本明細書に開示されるＲＮＡ分子（複数可）を含む餌を含む。
一実施形態では、本開示は、昆虫の行動を制御する方法を包含し、該方法は、本明細書に開示されているＲＮＡ分子を昆虫に噴霧、散布または他の方法で適用することを含む。本実施形態では、ＲＮＡ分子は、噴霧、散布、またはその他の方法で昆虫に直接適用できる。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、昆虫が発生する前に、植物または作物に噴霧、散布、またはその他の方法で適用できる。
本発明の一実施形態では、昆虫またはクモは、以下の目：Ａｃａｒｉ、Ａｒａｃｈｎｉｄａ、Ａｎｏｐｌｕｒａ、Ｂｌａｔｔｏｄｅａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｌｕｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ、Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ、Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｏｄｅａ、Ｈｅｍ ｉｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ、Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｏｄｏｎａｔａ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ、Ｐｈａｓｍｉｄａ、Ｐｈｉｔｈｉｒａｐｔｅｒａ、Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ、Ｐｒｏｔｕｒａ、Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｓｉｐｈｕｎｃｕｌａｔａ、Ｔｈｙｓａｎｕｒａ、Ｓｔｅｒｎｏｒｒｈｙｎｃｈａ、Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ、Ｚｏｒａｐｔｅｒａ及びＺｙｇｅｎｔｏｍａに属し得る。
本発明の好ましいが非限定的な実施形態では、昆虫またはクモは、以下からなる群から選択される：（１）Ａｃａｒｉ：Ｉｘｏｄｉｄａ（マダニ）を含むダニ、（２）Ａｒａｃｈｎｉｄａ：Ａｒａｎｅａｅ（クモ）及びＯｐｉｌｉｏｎｅｓ（メクラグモ）、例えば、Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ（クロゴケグモ）及びＬｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓｅ（イトグモ）、（３）Ａｎｏｐｌｕｒａ：Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ（ヒトジラミ）などのシラミ、（４）Ｂｌａｔｔｏｄｅａ：チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属のワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）など、Ｂｌａｔｔａ属のトウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）など、Ｓｕｐｅｌｌａ属のチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）など。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。（５）Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：カブトムシ、例えば、ヒラタキクイムシ科（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ科）；Ｄｅｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ種（ブラック・ターペンチン・ビートル、サザン・パイン・ビートル、ＩＰＳエンクレイブ・ビートル）；カツオブシムシ（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ種、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ種）；オールド・ハウス・ボウラー（Ｏｌｄ Ｈｏｕｓｅ Ｂｏｒｅｒ）（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ科：Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ）；Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ；Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ種（コクヌストモドキ）；Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｇｒａｎａｒｉｕｍ（ヒメアカカツオブシムシ）；Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓａｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ（ノコギリヒラタムシ）など（チャタテムシ）（６）Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ：ハサミムシ科（７）Ｄｉｐｔｅｒａ：蚊（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）及びハエ（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）、例えば、Ａｎｏｐｈｅｌｉｎａｅ、例えばＡｎｏｐｈｅｌｅｓ種及びＣｕｌｉｃｉｎａｅ、例えばＡｅｄｅｓ ｆｕｌｖｕｓ；Ｔａｂａｎｉｄａｅ、例えばＴａｂａｎｕｓ ｐｕｎｃｔｉｆｅｒ（ウシアブ．）、Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ（ツェツェバエ）、チョウバエ（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）及びＣａｌｙｐｔｒａｔａｅ、例えばＭｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）、ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ科）など。（８）Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ：ムシ、例えばＣｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ（トコジラミ）（９）Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ：アリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ）を含むハチ（Ａｐｏｃｒｉｔａ）、ミツバチ（Ａｐｏｉｄｅａ）：Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ）、Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ）、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種（オオアリ）、Ｉａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（スモール・ブラック・アント）、ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ）、Ｍｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（赤アリ）、Ｆｏｒｍｉｃａ種（ヤマアリ）、Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｌｉｎｅｏｌａｔａ（アクロバット・アント）、Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ）、Ｐｈｅｉｄｏｌｅ種（兵アリ、Ｄａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ベルベットアリ）など。（１０）Ｉｓｏｐｔｅｒａ：シロアリ、例えば、Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ（フロリダ・ダークウィング・イエシロアリ）、イースタン・イエシロアリ（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）、Ｒ．ｈｅｓｐｅｒｕｓ（ウェスタン・イエシロアリ）、Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（フォルモサン・イエシロアリ）、Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ）、Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｃｏｎｎｅｘｕｓ（フォレストツリー・シロアリ）及びＴｅｒｍｉｔｉｄａｅ（１１）Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ：ガ、例えば、Ｔｉｎｅｉｄａｅ＆Ｏｅｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ、例えばＴｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）、及びＰｙｒａｌｉｄａｅ、例えばＰｙｒａｌｉｓ ｆａｒｉｎａｌｉｓ（カシノシマメイガ）など（１２）Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ：ヒラタチャタテ（Ｐｓｏｃｉｄｓ）（１３）Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ：ｆｌｅａｓ、例えばＰｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ（１４）Ｓｔｅｒｎｏｒｒｈｙｎｃｈａ：アブラムシ（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ）（１５）Ｚｙｇｅｎｔｏｍａ：シミ、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ及びＬｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ。
他の標的昆虫またはクモには、家庭用昆虫、外寄生生物、及び公衆衛生及び衛生に関連する昆虫及び／またはクモが含まれ、例えば、例としては、これらに限定されないが、ハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、ワクモ、アリ（例えば、ＰＢＡＮを標的とすることによる）、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、カブトムシ、ハサミムシ、蚊、及びノミが挙げられる。より好ましい標的としては、ゴキブリ（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）例えば、これらに限定されないがＢｌａｔｅｌｌａ種（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ種（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、Ｂｌａｔｔａ種（例えば、Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））及びＳｕｐｅｌｌａ種（例えば、Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）；アリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ）、例えば、これらに限定されないがＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種（例えば、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ種（例えば、Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種（例えば、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種（オオアリ））、ｌａｓｉｕｓ種（例えば、ｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（スモール・ブラック・アント））、Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ種（例えば、Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、Ｍｙｒｍｉｃａ種（例えば、Ｍｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（赤アリ））、Ｆｏｒｍｉｃａ種（ヤマアリ）、Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ種（例えば、Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｌｉｎｅｏｌａｔａ（アクロバット・アント））、Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ種（例えば、Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、Ｐｈｅｉｄｏｌｅ種（兵アリ）及びＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ種（例えば、Ｄａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ベルベットアリ））；シロアリ（Ｉｓｏｐｔｅｒａ及び／またはＴｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、例えば、これらに限定されないがＡｍｉｔｅｒｍｅｓ種（例えば、Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ（フロリダ・ダークウィング・イエシロアリ））、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ種（例えば、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ（イースタン・イエシロアリ）、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ（ウェスタン・イエシロアリ））、Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ種（例えば、Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（フォルモサン・イエシロアリ））、Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ種（例えば、Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ種（例えば、Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｃｏｎｎｅｘｕｓ（フォレストツリー・シロアリ））がある。
一実施形態では、標的ＲＮＡは、昆虫のアセト乳酸シンターゼをコードする。
本発明のＲＮＡ分子は、植物において送達及び／または発現される場合、例えば、農業形質、昆虫耐性（例えば、ＭｐＣ００２、ＭｐＲａｃｋ−１、及びＡＢＣトランスポーター遺伝子などの遺伝子を標的とすることによる）、耐病性（ＬａｎＲまたはＭＬＯなどの遺伝子を標的とすることによる）、除草剤耐性、無菌性、穀物特性などに影響を与える広範囲の所望の特性を有することができる。標的ＲＮＡ分子は、油、デンプン、炭水化物、栄養素などの代謝に関与し得る、またはタンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、組換え頻度（ＤＤＭ１及びＦＡＮＣＭなどの遺伝子を標的とすることにより）、ワックス、油（ＴＯＲなどの遺伝子を標的とすることにより）、デンプン、砂糖、炭水化物、香り、臭気、毒素、カロテノイド、ホルモン（ＥＩＮ２、ＮＣＥＤ１、及びＮＣＥＤ２などの遺伝子を標的とすることにより）、ポリマー、フラボノイド（カルコンシンターゼなどの遺伝子を標的とすることにより）、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、糖タンパク質、糖脂質などの合成に関与し得る。
特定の例では、植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ、例えばセイヨウアブラナまたはヒマワリ、ベニバナ、アマ、ワタ、ダイズ、またはトウモロコシなどの植物での油産生のための酵素、ジャガイモ、トウモロコシ、及び穀物、例えばコムギオオムギまたはイネなどの植物でのデンプン合成に関与する酵素、天然薬物、例えば医薬もしくは獣医学的産物を合成する酵素、またはそれら自身であるタンパク質の増加したレベルを産生する。
別の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、Ａｌｔｅｍａｒｉａ種；Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌａｅ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ；Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ（実施例１７に記載のＲＮＡ分子を使用してＭｌｏ遺伝子を標的とすることにより）、Ｂｏｌｅｔｕｓ ｇｒａｎｕｌａｔｕｓ；Ｂｏｔｒｉｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ；Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｆａｂａｅ；Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ；Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ；Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ ｒｉｂｉｃｏｌａ；Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｓｃｅｎｓ；Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ；Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓｕｓ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ；Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ；Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ；Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｊｕｎｉｐｅｒｉ−ｖｉｒｇｉｎｉａｎａｅ；Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ；Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ；Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ ａｌｆａｌｆａｅ；Ｐｈｙｔｏｐｔｈｅｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ（マラセチア・フルフル）；Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ；Ｐｕｃｃｉｎｉａ種；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｓｅｐｔｏｒｉａ ａｐｉｉｃｏｌａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ；Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ；Ｕｓｔｉｌａｇｏ種；Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ；及びＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅからなる群から選択される真菌病原体による感染の予防的または治療的処置に関する。
例示的な治療すべき状態
本開示によるＲＮＡ分子は、様々な状態の方法で使用され得る。いくつかの例では、本開示は、本明細書に開示されるＲＮＡ分子を投与することを含む、がんの治療方法に関する。「がん」という用語は、典型的には無秩序な細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理状態を指すか、またはそれを説明する。がんの例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ系腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例には、これらに限定されないが、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌及び胃腸間質癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫、及びＢ細胞性リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、及び母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メーグス症候群、脳、及び頭頸部癌、及び関連する転移が挙げられる。したがって、例では、本開示は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、脳癌、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌または血液ベースの癌を治療する方法に関する。
他の例では、本明細書に記載の方法は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、またはＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄまたは関連遺伝子の変異に関連する癌を治療するために使用される。他の例では、本明細書に記載の方法は、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、及び関連遺伝子など、ＤＮＡミスマッチ修復に関連する遺伝子の変異に関連する癌を治療するために使用される。他の例では、本明細書に記載の方法は、ＢＲＣＡ１、ＭＬＨ１、またはＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、またはＲＡＤ５１ＤなどのサイレンシングされたＤＮＡ修復遺伝子で癌を治療するために使用される。
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法は、損傷したＤＮＡ修復プロセスで細胞を殺すために使用される。例えば、ＤＮＡ修復が損なわれた細胞は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ合成、または相同組換えに関与する遺伝子を異常に発現する可能性がある。例示的な遺伝子としては、ＸＲＣＣ１、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ−１）、ＡＤＰＲＴＬ２、（ＰＡＲＰ−２）、ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＢＥＴＡ、ＣＴＰＳ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＦＡＮＣＤ２、ＰＭＳ２、ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＲＰＡ、ＲＰＡｌ、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３、ＸＰＤ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＦ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣＲ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２，ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＵ、ＮＢ５１、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＡＴＭ、ＡＴＲ ＣＰＩＫ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＲＡＤ１、及びＲＡＤ９が挙げられる。一例では、本明細書に記載の方法は、変異型腫瘍抑制遺伝子を有する細胞を殺すために使用される。例えば、細胞は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２に１つ以上の変異を有することができる。
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法は、ウイルスにより形質転換された細胞を治療するために使用される。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法は、潜在性ウイルスで形質転換された細胞を殺すために使用される。潜在性ウイルスの例としては、ＣＭＶ、ＥＢＶ、単純ヘルペスウイルス（１型及び２型）、及び水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法は、がん、免疫不全、肝炎、脳炎、肺炎または呼吸器疾患を引き起こすウイルスによる活動性ウイルス感染を治療するために使用される。例示的なウイルスには、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスが挙げられる。
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法は、ジカウイルス、コロラドダニ熱（コルチウイルス、ＲＮＡウイルスによって引き起こされる）、西ナイル熱（脳炎、中東及びアフリカで主に発生するフラビウイルスによって引き起こされる）、黄熱病、狂犬病（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科の神経向性ウイルスの多数の異なる株によって発生）、ウイルス性肝炎、胃腸炎（ウイルス）−ノーウォーク及びノーウォーク様ウイルスによって引き起こされる急性ウイルス性胃腸炎、ロタウイルス、カリシウイルス、及びアストロウイルス、ポリオ、頻繁な抗原変異が可能なオルソミクソウイルスによって引き起こされるインフルエンザ（インフルエンザ）、麻疹（はしか）、パラミクソウイルス科、流行性耳下腺炎、ウイルス性肺炎を含む呼吸器症候群、及び急性呼吸器ウイルスと総称される様々なウイルスによって引き起こされる急性閉塞性喉頭炎を含む急性呼吸器症候群、及び呼吸器合胞体ウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患を治療するために使用される。
実施例１．材料及び方法
遺伝的構築物の合成
典型的なｌｅｄＲＮＡ構築物を設計するために、約１００〜１０００ヌクレオチド長、典型的には４００〜６００ヌクレオチドの標的ＲＮＡの領域が同定された。一例において、配列の５’側半分及び約１３０ｎｔの隣接領域、ならびに同様に３’側半分及び１３０ｎｔの隣接領域は、プロモーターに対してアンチセンス方向に配向された。これらの配列は、４００〜６００ヌクレオチドのセンス標的配列によって中断された（図１Ａ）。得られた構築物の５’末端の前にはＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどのプロモーターがあり、３’末端は制限酵素切断部位を含むように改変されているため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を停止することができる。
細菌細胞などの細胞での転写のため、プロモーター及びターミネーター配列は、例えば誘導性プロモーターを使用して、導入遺伝子としての発現を促進するために組み込まれた。二本鎖領域及びループ配列の長さは変えることができる。構築物は、標準的なクローニング方法を使用して作成されたか、商用サービスプロバイダーに注文した。
ＲＮＡの合成
３’末端でＤＮＡを直線化するために制限酵素で消化した後、ＲＮＡポリメラーゼを使用した転写により、単一のニック及び末端ループを有する中央のステムまたは二本鎖領域を含む分子である中央の標的配列にｌｅｄＲＮＡｉ転写物の５’及び３’アームをアニーリングした。中心配列は、プロモーターに対してセンス方向またはアンチセンス方向に配向することができる（それぞれ図１Ａ、１Ｂ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成では、適切な制限酵素を使用して、構築物のＤＮＡを３’制限部位で消化し、沈殿、精製、及び定量した。製造元の指示にしたがって、ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ合成を達成した。ｌｅｄＲＮＡは、ＤＥＰＣ処理水を使用してアニーリング緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、微量のＲＮＡｓｅを不活性化した。この方法により生成されたＲＮＡの収量及び完全性は、それぞれナノドロップ分析及びゲル電気泳動によって決定された（図２）。
ｌｅｄＲＮＡの合成は、構築物をＥ．ｃｏｌｉ株ＨＴ１１５に導入することにより細菌細胞で達成された。形質転換細胞培養液をＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）で誘導して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現させ、ｌｅｄＲＮＡ構築物の転写をもたらした。細菌細胞からのＲＮＡ抽出及び精製は、基本的にＴｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記載のように実施した。
Ｃｙ３標識によるＲＮＡ転写の場合、リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）ミックスは、それぞれ１０ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、１．６２５ｍＭ ＵＴＰ、及び８．７４ｍＭ Ｃｙ３−ＵＴＰを含んだ。転写反応物を３７℃で２．５時間インキュベートした。転写反応物（１６０μｌ）をエッペンドルフチューブに移し、１７．７μｌのｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ緩衝液及び１μｌのｔｕｒｂｏ ＤＮＡを加え、３７℃で１０分間インキュベートしてＤＮＡを消化した。次に、１７．７μｌのＴｕｒｂｏ ＤＮＡｓｅ不活性化溶液を加え、混合し、室温で５分間インキュベートした。混合物を２分間遠心分離し、上清を新しいＲＮＡｓｅ不含のエッペンドルフチューブに移した。１．５μｌの各転写反応物の試料をゲル上で電気泳動し、ＲＮＡ産物の品質を試験した。一般的に、構築物に応じて、サイズが５００ｂｐ〜１０００ｂｐの１本のＲＮＡバンドが観察された。ＲＮＡを各チューブ：８８．５μｌ ７．５Ｍ酢酸アンモニウム及び６６５μｌ 冷１００％エタノールに加えることにより沈殿させた。チューブを数時間または一晩−２０℃に冷却し、次に、４℃で３０分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、ＲＮＡのペレットを−２０℃で１ｍｌ ７０％エタノール（ヌクレアーゼフリー水で作成）で洗浄し、遠心分離した。ペレットを乾燥させ、精製ＲＮＡを５０μｌの１ｘＲＮＡｉアニーリング緩衝液に再懸濁した。ＲＮＡ濃度はナノドロップ法を使用して測定し、使用するまで−８０℃で保存した。
実施例２．ｌｅｄＲＮＡの設計
図１Ａに概略的に示すように、典型的なｌｅｄＲＮＡ分子は、共有結合し、標的ＲＮＡと同一性を有する２つの隣接するセンス配列とみなすことができるセンス配列、センス配列に相補的であり、２つの領域に分割されたアンチセンス配列、及びアンチセンス配列からセンスを分離する２つのループを含む。したがって、この形態のｌｅｄＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物は、５’から３’の順に、ｌｅｄＲＮＡコード領域の転写のためのプロモーター、標的ＲＮＡの５’末端に向かう領域と相補性を有する第１のアンチセンス領域、第１のループ配列、センス配列、第２のループ配列、次に、標的ＲＮＡの３’末端に向かって領域と相補性を有する第２のアンチセンス領域、及び最後に転写を停止する手段を含む。この配置では、２つのアンチセンス配列は、センス配列及びループ配列に隣接した。転写されると、アンチセンス配列の２つの領域はセンス配列とアニーリングし、２つの隣接ループを有するｄｓＲＮＡステムを形成する。
ｌｅｄＲＮＡの形態とは別であるが関連する形態では、センス配列は２つの領域に分割されるが、２つのアンチセンス領域は単一の配列のままである（図１Ｂ）。したがって、この第２の形態のｌｅｄＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物は、５’から３’の順に、ｌｅｄＲＮＡコード領域の転写のためのプロモーター、標的ＲＮＡの３’末端に向かう領域と同一性を有する第１のセンス領域、第１のループ配列、アンチセンス配列、第２のループ配列、次いで、標的ＲＮＡの５’末端に向かう同一性を有する第２のセンス領域、及び最後に転写を停止する手段を含む。この配置では、２つのセンス配列は、アンチセンス配列及びループ配列に隣接した。
理論によって制限されることを望むものではないが、両端に閉ループがあるため、これらのｌｅｄＲＮＡ構造は、一本鎖センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとの間に形成され、ループを持たないオープンエンドのｄｓＲＮＡよりもエキソヌクレアーゼに対する耐性が高く、単一ループのみのヘアピンＲＮＡと比較しても同様である。加えて、本発明者らは、ｄｓＲＮＡステムの両端のループがＤｉｃｅｒが両端に効率的にアクセスすることを可能にし、それによりｄｓＲＮＡのｓＲＮＡへのプロセシング及びサイレンシング効率を高めると考えた。
第１の例として、ＧＦＰまたはＧＵＳをコードするｌｅｄＲＮＡ標的遺伝子を形成するために、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の遺伝的構築物を作成した。ｌｅｄＧＦＰ構築物は、次の領域を次の順番に含んだ：ＧＦＰコード配列（ＣＤＳ）（配列番号７）のヌクレオチド３５８〜１３１に対応するアンチセンス配列の前半、ＧＦＰ ＣＤＳのヌクレオチド１３０〜１に対応する第１のアンチセンスループ、ＧＦＰ ＣＤＳのヌクレオチド１３１〜５９１に対応するセンス配列、ＧＦＰ ＣＤＳのヌクレオチド７３１〜５９２に対応する第２のアンチセンスループ、及びＧＦＰ ＣＤＳのヌクレオチド５９１〜３５９に対応するアンチセンス配列の後半。
ｌｅｄＧＵＳ構築物は、次の領域を次の順番に含んだ：ＧＵＳ ＣＤＳ（配列番号８）のヌクレオチド６０９〜３５７に対応するアンチセンス配列の前半、ＧＵＳ ＣＤＳのヌクレオチド３５６〜１９７に対応する第１のアンチセンスループ、ＧＵＳ ＣＤＳのヌクレオチド３５７〜８６０に対応するセンス配列、ＧＵＳ ＣＤＳのヌクレオチド１０２９〜８６１に対応する第２のアンチセンスループ、及びＧＵＳ ＣＤＳのヌクレオチド８６１〜６１０に対応するアンチセンス配列の後半。
別個の鎖センス／アンチセンスＧＵＳ ｄｓＲＮＡ（従来のｄｓＲＮＡ）を作成するために、ＧＵＳ ＣＤＳのヌクレオチド３５７〜８６０に対応する同じ標的配列を、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターのＴ７とＳＰ６プロモーターとの間にライゲーションした。センス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼで別々に転写し、転写物を混合して該混合物を加熱してＲＮＡ鎖を変性させた後、アニーリング緩衝液でアニーリングした。
実施例３．ｌｅｄＲＮＡの安定性
ｌｅｄＲＮＡがｄｓＲＮＡ構造を形成する能力を、オープンエンドのｄｓＲＮＡ（すなわち、ループがなく、別個の一本鎖センス及びアンチセンスＲＮＡのアニーリングによって形成される）及び長いｈｐＲＮＡと比較した。ｌｅｄＲＮＡ、長いｈｐＲＮＡ、及びセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの混合物は、沸騰により変性し、アニーリング緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ８．０、及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）中でアニーリングし、その後、非変性条件下で１．０％アガロースゲルで電気泳動を実施した。
図２に示すように、ＧＵＳ ｌｅｄＲＮＡとＧＦＰ ｌｅｄＲＮＡの両方が、二本鎖分子に期待される移動度の支配的なＲＮＡバンドを与え、予測されたｌｅｄＲＮＡ構造の形成を示している。これは、ｄｓＲＮＡの弱いバンドのみを示したセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡの混合物とは対照的であり、ほとんどのセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが互いに即座にアニーリングしてｄｓＲＮＡを形成しなかったことを示す。ヘアピンＲＮＡ試料は２つの顕著なバンドを示し、転写物の一部のみが予測されたヘアピンＲＮＡ構造を形成したことを示す。したがって、ｌｅｄＲＮＡは、予測されたｄｓＲＮＡ構造を形成するのに最も効率的であった。
ｌｅｄＲＮＡが葉の表面にとどまって広がる能力もｄｓＲＮＡと比較した。ＧＵＳ ｌｅｄＲＮＡ（ｌｅｄＧＵＳ）をタバコの葉の表面の下部に適用すると、２４時間後に未処理の葉の上部で容易に検出できた（図３）。しかしながら、別の鎖ＧＵＳ ｄｓＲＮＡ（ｄｓＧＵＳ）は、未処理の葉の上部では検出できなかった（図３）。この結果は、ｌｅｄＲＮＡがｄｓＲＮＡよりも分解に耐性があり、したがって植物の葉組織内に広がることができることを示す。
実施例４．局所送達によるｌｅｄＲＮＡの試験
局所送達後にＲＮＡｉを誘導するｌｅｄＲＮＡの能力を、ＧＦＰまたはＧＵＳレポーター遺伝子を発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物でそれぞれ試験した。ＧＦＰ及びＧＵＳ標的配列ならびにｌｅｄＲＮＡをコードする構築物の配列は、それぞれ配列番号７、８、４及び５に示されている。コードされたＲＮＡ分子のリボヌクレオチド配列は、配列番号１（ＧＦＰ ｌｅｄＲＮＡ）及び２（ＧＵＳ ｌｅｄＲＮＡ）として提供されている。
葉表面へのｌｅｄＲＮＡの再現性のある均一な適用を促進するために、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＳｉｌｗｅｔ ７７（０．０５％）中の７５〜１００μｇ／ｍｌの濃度のｌｅｄＲＮＡを、柔らかいペイントブラシを使用して葉の向軸面に適用した。ｌｅｄＲＮＡ適用後６時間と３日で、葉の試料を、標的遺伝子サイレンシングの分析のために採取した。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉のＧＦＰに対するｌｅｄＲＮＡの適用、及びＮ．ｔａｂａｃｕｍの葉のＧＵＳに対するｌｅｄＲＮＡの適用は、治療後６時間のｍＲＮＡ（ＧＦＰ）またはタンパク質活性（ＧＵＳ）レベルにおいて各標的遺伝子活性の２０〜４０％及び４０〜５０％の明確な減少をもたらした。しかしながら、この実験では、減少は処理後３日目には持続しなかった。発明者らは、３日目での観察結果は、ｄｓＲＮＡ処理またはｌｅｄＲＮＡの散逸量に対する導入遺伝子のいくつかの非特異的応答によるものである可能性が高いと考えた。しかしながら、別の実験では、ＧＵＳサイレンシングは、ｌｅｄＲＮＡ処理の２４時間後に、処理した葉領域と遠位の未処理葉領域の両方で検出された（図４）。
実施例５．内因性標的遺伝子のｌｅｄＲＮＡ誘導サイレンシング
さらなる例では、ｌｅｄＲＮＡは、内因性遺伝子、すなわちＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＦＡＤ２．１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的とするように設計した。標的ＦＡＤ２．１ ｍＲＮＡの配列及びｌｅｄＦＡＤ２．１をコードする構築物の配列は、それぞれ配列番号９及び６に示されている。コードされたＲＮＡ分子のリボヌクレオチド配列は、配列番号３（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＦＡＤ２．１ ｌｅｄＲＮＡ）として提供されている。
ＦＡＤ２．１ ｌｅｄＲＮＡ構築物は、ＦＡＤ２．１ ＣＤＳ（Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０９４１７ｇ０１００８．１）のヌクレオチド６７８〜３７９に対応するアンチセンス配列の前半、ＦＡＤ２．１ ＣＤＳの３７８〜２４２ｎｔに対応する第１のアンチセンスループ、３７９〜９７９ｎｔの対応するセンス配列、１１１５〜９８０ｎｔに対応する第２のアンチセンスループ、及びＦＡＤ２．１ ＣＤＳの９７９〜６７９ｎｔに対応するアンチセンス配列の後半で構成された。
前述の例のｌｅｄＧＵＳ ＲＮＡを陰性対照として並行して使用した。最初の実験では、標的遺伝子サイレンシングを、ＦＡＤ２．１ ｍＲＮＡのレベルとＣ１８：１脂肪酸の蓄積のレベルの両方についてアッセイした（図５）。関連する遺伝子、ＦＡＤ２．２の活性レベルもアッセイした。各試料について、約３μｇの全ＲＮＡをＤＮａｓｅ処理し、オリゴｄＴプライマーを使用して５０℃で５０分間逆転写した。反応を８５℃で５分間停止し、水で１２０μｌに希釈した。ローター遺伝子ＰＣＲ装置を使用して、５μｌの各試料を３回ずつ、ハウスキーピング遺伝子アクチンを参照して、遺伝子特異的プライマーを使用してＦＡＤ ２．１及びＦＡＤ ２．２ ｍＲＮＡの相対的発現について分析した。その後の実験では、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、局所的に適用されたｌｅｄＦＡＤ２．１ ＲＮＡによるＦＡＤ２．１遺伝子のサイレンシングを確認した（図６）。
ＦＡＤ２．１ ｍＲＮＡは大幅に減少し、２、４、及び１０時間目ではｌｅｄＲＮＡで処理した葉組織においてかろうじて検出可能なレベルになった（図５）。この実験では、６時間目でＦＡＤ２．１ ｍＲＮＡのレベルがそれほど低下しなかった理由は不明でった。図６に示した繰り返し実験では、強力なＦＡＤ２．１下方制御が６時間目と２４時間目の両方で、特に２４時間目で発生した。ＦＡＤ２．１と配列相同性を有する関連するＦＡＤ２．２遺伝子もまた、ｌｅｄＲＮＡによって２及び４時間目で下方制御を示した（図５）。
ＦＡＤ２．１及びＦＡＤ２．２はオレイン酸をリノール酸に不飽和化する脂肪酸Δ１２デサチュラーゼをコードするため、これらの脂肪酸レベルは、ｌｅｄＲＮＡで処理した葉組織においてアッセイした。２、４、及び６時間目でｌｅｄＲＮＡ処理の葉組織でオレイン酸（１８：１）の蓄積が明らかに増加したが、これは、ＦＡＤ２酵素の量の減少を示している（図５）。したがって、ｑＲＴ−ＰＣＲと脂肪酸組成アッセイの両方で、ｌｅｄＲＮＡがＦＡＤ２．１遺伝子のサイレンシングを誘導することが示された。
実施例６．Ｇ：Ｕ塩基対またはミスマッチヌクレオチドを含むヘアピンＲＮＡの設計及び試験
ＧＵＳ ＲＮＡを標的とする改変ヘアピンＲＮＡ
酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子などのレポーター遺伝子は、植物細胞を含む真核細胞における遺伝子サイレンシング効率の測定に使用可能なシンプルかつ便利なアッセイシステムを提供する（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。したがって、発明者らは、ヘアピンＲＮＡを細胞に提供するための遺伝子送達アプローチを使用して、標的遺伝子としてのＧＵＳ遺伝子の発現を低減するそれらの能力についていくつかの改変ヘアピンＲＮＡを設計、製造及び試験し、改変ヘアピンを従来のヘアピンＲＮＡと比較した。実験で対照として使用された従来のヘアピンＲＮＡは、２００の連続する塩基対長の二本鎖領域を持ち、全ての塩基対は標準的な塩基対、すなわちＧ：Ｕ塩基対を持たないＧ：Ｃ及びＡ：Ｕ塩基対であり、改変ヘアピンＲＮＡと同じＧＵＳ ｍＲＮＡ分子の２００ｎｔ領域を標的とする二本鎖領域に非塩基対形成ヌクレオチド（ミスマッチ）を持たない。二本鎖領域を形成したセンス配列及びアンチセンス配列は、ＰＤＫイントロンを含むスペーサー配列によって共有結合され（Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）、一次転写物からイントロンをスプライシングした後、３９または４５ヌクレオチド長（使用するクローニング戦略に依存する）のＲＮＡループをもたらした。アンチセンス配列に使用されるＤＮＡ断片は、発現カセットに簡単にクローニングするために、５’末端にＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限部位が隣接し、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ制限部位が隣接しており、各センス配列はＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ制限部位が隣接している。各ヘアピンＲＮＡの２００ｂｐ ｄｓＲＮＡ領域には、対照ヘアピン及び改変ヘアピンの両方で、タンパク質コーディング領域内の野生型ＧＵＳ配列に完全に相補的な２００ヌクレオチドのアンチセンス配列が含まれていた。配列番号１０のヌクレオチド１３〜２１２に対応するこのアンチセンス配列は、ＧＵＳオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド８０４〜１００３（配列番号８として提供されるｃＤＮＡ配列）の相補体であった。したがって、ＧＵＳ標的ｍＲＮＡは１９００ｎｔ長を超えていた。センス及びアンチセンス配列の２００ヌクレオチド長は、合成オリゴヌクレオチドを使用したＤＮＡ断片の合成に適度に便利であるように十分に短いが、Ｄｉｃｅｒによる処理で複数のｓＲＮＡ分子を提供するのに十分な長さとして選択された。ＯＲＦの一部であるため、この配列には潜在的なスプライス部位または転写終結部位が含まれる可能性はほとんどなかった。
遺伝的構築物の調製
２００ｂｐのＧＵＳ ＯＲＦ配列を、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーペアＧＵＳ−ＷＴ−Ｆ（配列番号５２）及びＧＵＳ−ＷＴ−Ｒ（配列番号５３）を使用してそれぞれＰＣＲ増幅し、これらの制限酵素部位をＧＵＳ配列の５’及び３’に導入した。増幅した断片をベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙに挿入し、正しいヌクレオチド配列をシークエンシングにより確認した。ＧＵＳ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化により切り取り、ｐＫａｎｎｉｂａｌのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，２００５）、これは作動可能に連結されたＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーター（Ｇｒａｖｅ，１９９２）及びｏｃｓ遺伝子ポリアデニル化／転写ターミネーター（Ｏｃｓ−Ｔ）に対してアンチセンス方向でＧＵＳ配列を挿入したものである。得られたベクターはｐＭＢＷ６０６と呼ばれ、５’から３’の順に、３５Ｓ：：ＰＤＫイントロン：：アンチセンスＧＵＳ：：Ｏｃｓ−Ｔ発現カセットを含んだ。このベクターは、４つのｈｐＲＮＡ構築物を組み立てるための基本ベクターとして使用した中間ベクターであった。
標準的な塩基対のみを有するｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物
実験で対照として使用される、標準的な塩基対のみを有するヘアピンＲＮＡ分子をコードするｈｐＧＵＳ［ｗｔ］と呼ばれるベクターを調製するために、２００ｂｐのＧＵＳ ＰＣＲ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙプラスミドからＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで切り取り、ｐＭＢＷ６０６の３５ＳプロモーターとＰＤＫイントロンとの間のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ部位に挿入した。これにより、３５Ｓ：：センスＧＵＳ［ｗｔ］：：ＰＤＫイントロン：：アンチセンスＧＵＳ：：ＯＣＳ−Ｔ発現カセットを含む、ｐＭＢＷ６０７と呼ばれるベクターを生成した。このカセットをＮｏｔＩでの消化により切り取り、ｐＡＲＴ２７のＮｏｔＩ部位に挿入して（Ｇｌｅａｖｅ，１９９２）、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］と呼ばれるベクターを作成し、ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とする標準塩基対形成ヘアピンＲＮＡをコードした。
２００ｎｔのセンス配列及びアンチセンス配列のハイブリダイゼーションによって自己アニーリングすると、このヘアピンは、ＧＵＳ配列に対応する２００の連続する塩基対の二本鎖領域を得た。発現カセットのセンス配列及びアンチセンス配列は、ＧＵＳセンス配列と比較して、それぞれ５’及び３’末端に存在するＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に隣接している。転写されると、これらの部位に対応するヌクレオチドはハイブリダイズすることもでき、二本鎖領域を両端で６ｂｐ伸長した。発現カセットの転写及び一次転写産物からのＰＤＫイントロンのスプライシング後、Ｄｉｃｅｒまたは他のＲＮＡｓｅによるプロセシングの前のヘアピンＲＮＡ構造は、３９ヌクレオチドのループ構造を有すると予測された。そのループを含むヘアピンＲＮＡ構造のヌクレオチド配列は、配列番号１５として提供されており、フォールディングの自由エネルギーは−４７１．７３ｋｃａｌ／ｍｏｌと予測された。したがって、これはエネルギー的に安定したヘアピン構造であった。自由エネルギーは、ＰＤＫイントロン配列からスプライシングで切り出された後のヌクレオチド配列に基づいて、「ＲＮＡｆｏｌｄ」（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用して計算した。
３５Ｓプロモーター及びＯＣＳ−Ｔターミネーターを有する発現カセットから転写すると、得られたヘアピンＲＮＡは、５’末端に８ヌクレオチドが付加され、３’末端にポリＡテールは付加せずに３’末端に約１７８ヌクレオチドが付加された、より大きなＲＮＡ分子に埋め込まれた。同じプロモーター−ターミネーター設計が改変ヘアピンＲＮＡに使用されたため、これらの分子も、５’及び３’末端にこれらの伸長があった。したがって、ＰＤＨイントロンのスプライシング後のヘアピンＲＮＡ分子の長さは約６３０ヌクレオチドであった。
Ｇ：Ｕ塩基対を含むｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物
同じ２００ヌクレオチドのセンス配列を含むが、対応する野生型ＧＵＳ領域の５２のシチジンヌクレオチド（Ｃ）が全てチミジンヌクレオチド（Ｔ）で置換されたＤＮＡ断片は、重複するオリゴヌクレオチドＧＵＳ−ＧＵ−Ｆ（配列番号５４）及びＧＵＳ−ＧＵ−Ｒ（配列番号５５）をアニーリングし、高忠実度のＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号Ｍ０３２３）を使用して３’末端のＰＣＲ伸長をすることによって組み立てた。増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入し、正しいヌクレオチド配列（配列番号１１）をシークエンシングにより確認した。次に、改変された配列を含むＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩでの消化により切り出し、基本ベクターｐＭＢＷ６０６のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ部位に挿入した。これにより、発現カセット３５Ｓ：：センスＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］：：ＰＤＫイントロン：：アンチセンスＧＵＳ：：ＯＣＳ−Ｔを含む、ｐＭＢＷ６０８と呼ばれる構築物を生成した。この発現カセットをＮｏｔＩ消化により切り出し、ｐＡＲＴ２７のＮｏｔＩ部位に挿入して、Ｇ：Ｕ塩基対形成したヘアピンＲＮＡ分子をコードするｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］と呼ばれるベクターを作成した。
このカセットは、ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とするヘアピンＲＮＡをコードし、２００ｎｔのセンス配列及びアンチセンス配列のハイブリダイゼーションによって自己アニーリングすると、５２のＧ：Ｕ塩基対（ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］のＧ：Ｃ塩基対の代わりに）及び１４８の標準塩基対を有した、すなわち、二本鎖領域のヌクレオチドの２６％がＧ：Ｕ塩基対に関与していた。ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］の１４８の標準塩基対は、対応する位置に、４９のＵ：Ａ塩基対、４５のＡ：Ｕ塩基対、及び５４のＧ：Ｃ塩基対を含む、対照のヘアピンＲＮＡと同じである。二本鎖領域における連続する標準的な塩基対の最も長いストレッチは、９塩基対であった。それにより、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］のアンチセンスヌクレオチド配列は、長さ（２００ｎｔ）及び配列が、対照ヘアピンＲＮＡ ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］のアンチセンス配列と同じであった。発現カセットの転写及び一次転写産物からのＰＤＫイントロンのスプライシング後、Ｄｉｃｅｒまたは他のＲＮＡｓｅによるプロセシングの前のヘアピンＲＮＡ構造は、４５ヌクレオチドのループ構造を有すると予測された。そのループを含むヘアピン構造のヌクレオチド配列は、配列番号１６として提供されており、そのフォールディングの自由エネルギーは−３３１．７３ｋｃａｌ／ｍｏｌと予測された。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］については、これは、したがって、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］のＧ：Ｃ塩基対よりも個別にさらに弱い５２のＧ：Ｕ塩基対にもかかわらず、エネルギー的に安定したヘアピン構造であった。
改変されたＧＵＳセンス配列（配列番号１１のヌクレオチド９〜２０８）とＧＵＳ標的遺伝子の対応する領域（配列番号１４）とのアラインメントを図７に示す。
４番目のヌクレオチド毎にミスマッチしたヌクレオチドを含むｈｐＧＵＳ［１：４］構築物
同じ２００ｂｐセンス配列を含むが、対応する野生型ＧＵＳ配列の４番目のヌクレオチド毎に置換されたＤＮＡ断片を設計し、組み立てた。４ヌクレオチドの各ブロックの各４番目のヌクレオチド（４、８、１２、１６、２０などの位置にあるヌクレオチド）を、Ｃ’をＧ’に、Ｇ’をＣ’に、Ａ’をＴ’に、Ｔ’をＡ’に変えることにより置換し、他のヌクレオチドは変更せずに残した。これらの置換は全てトランスバージョン置換であり、トランジッション置換よりも得られるヘアピンＲＮＡ構造に対する不安定化効果が大きいと予想された。ＤＮＡ断片は、重複するオリゴヌクレオチドＧＵＳ−４Ｍ−Ｆ（配列番号５６）及びＧＵＳ−４Ｍ−Ｒ（配列番号５７）をアニーリングし、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑポリメラーゼを使用して３’末端のＰＣＲ伸長をすることによって組み立てた。増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入し、正しいヌクレオチド配列（配列番号１２）をシークエンシングにより確認した。次に、改変された配列を含むＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩでの消化により切り出し、基本ベクターｐＭＢＷ６０６のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ部位に挿入した。これにより、発現カセット３５Ｓ：：センスＧＵＳ［１：４］：：ＰＤＫイントロン：：アンチセンスＧＵＳ：：ＯＣＳ−Ｔを含む、ｐＭＢＷ６０９と呼ばれる構築物を生成した。この発現カセットをＮｏｔＩ消化により切り出し、ｐＡＲＴ２７のＮｏｔＩ部位に挿入して、１：４のミスマッチヘアピンＲＮＡ分子をコードするｈｐＧＵＳ［１：４］と呼ばれるベクターを作成した。
このカセットは、ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とするヘアピンＲＮＡをコードし、センス配列及びアンチセンス配列のハイブリダイゼーションによって自己アニーリングすると、２００ｎｔのアンチセンス配列の５０ヌクレオチドのミスマッチ（２００位にヌクレオチドのミスマッチを含む）があった。ヘアピンＲＮＡの二本鎖領域は、２００位を除いて、１９９ｎｔのセンス及びアンチセンス配列長にわたって１５０の標準塩基対及び４９のミスマッチヌクレオチドペアがあった、すなわち、二本鎖領域のヌクレオチドの２４．６％がミスマッチである（塩基対には関与していない）と予測された。発現カセットの転写及び一次転写産物からのＰＤＫイントロンのスプライシング後、Ｄｉｃｅｒまたは他のＲＮＡｓｅによるプロセシングの前のヘアピンＲＮＡ構造は、４５ヌクレオチドのループ構造を有すると予測された。そのループを含むヘアピン構造のヌクレオチド配列は、配列番号１７として提供されており、そのフォールディングの自由エネルギーは−２１４．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌと予測された。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］については、これは、したがって、ミスマッチしたヌクレオチドにもかかわらず、エネルギー的に安定したヘアピン構造であった。
改変されたＧＵＳセンス配列（配列番号１２のヌクレオチド９〜２０８）とＧＵＳ標的遺伝子の対応する領域（配列番号１４）とのアラインメントを図８に示す。
１０ヌクレオチドのうちヌクレオチド９及び１０がミスマッチであるｈｐＧＵＳ［２：１０］構築物
同じ２００ｂｐセンス配列を含むが、対応する野生型ＧＵＳ配列の９番目及び１０番目のヌクレオチド毎に置換されたＤＮＡ断片を設計し、組み立てた。１０ヌクレオチドの各ブロックの各９番目及び１０番目のヌクレオチド（９、１０、１９、２０、２９、３０位などにあるヌクレオチド）を、ＣをＧに、ＧをＣに、ＡをＴに、ＴをＡに変えることにより置換し、他のヌクレオチドは変更せずに残した。ＤＮＡ断片は、重複するオリゴヌクレオチドＧＵＳ−１０Ｍ−Ｆ（配列番号５８）及びＧＵＳ−１０Ｍ−Ｒ（配列番号５９）をアニーリングし、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑポリメラーゼを使用して３’末端のＰＣＲ伸長をすることによって組み立てた。増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙに挿入し、正しいヌクレオチド配列（配列番号１３）をシークエンシングにより確認した。次に、改変された配列を含むＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩでの消化により切り出し、基本ベクターｐＭＢＷ６０６のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ部位に挿入した。これにより、発現カセット３５Ｓ：：センスＧＵＳ［２：１０］：：ＰＤＫイントロン：：アンチセンスＧＵＳ：：ＯＣＳ−Ｔを含む、ｐＭＢＷ６１０と呼ばれる構築物を生成した。この発現カセットをＮｏｔＩ消化により切り出し、ｐＡＲＴ２７のＮｏｔＩ部位に挿入して、２：１０ミスマッチしたヘアピンＲＮＡ分子をコードするｈｐＧＵＳ［２：１０］と呼ばれるベクターを作成した。
このカセットは、ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とするヘアピンＲＮＡをコードし、センス及びアンチセンス配列のハイブリダイゼーションによって自己アニーリングすると、２００ｎｔのアンチセンス配列の５０ヌクレオチドのミスマッチ（１９９及び２００位にヌクレオチドのミスマッチを含む）があった。ヘアピンＲＮＡの二本鎖領域は、１９９及び２００位を除いて、１９８ｎｔのセンス及びアンチセンス配列長にわたって１６０の標準塩基対及び１９のジヌクレオチドミスマッチがあった、すなわち、二本鎖領域のヌクレオチドの１９．２％がミスマッチである（塩基対には関与していない）と予測された。ｈｐＧＵＳ［２：１０］の１６０の塩基対は、対応する位置に、４１のＵ：Ａ塩基対、３４のＡ：Ｕ塩基対、４２のＧ：Ｃ及び４３のＣ：Ｇ塩基対を含む、対照のヘアピンＲＮＡと同じである。発現カセットの転写及び一次転写産物からのＰＤＫイントロンのスプライシング後、Ｄｉｃｅｒまたは他のＲＮＡｓｅによるプロセシングの前のヘアピンＲＮＡ構造は、４５ヌクレオチドのループ構造を有すると予測された。そのループを含むヘアピン構造のヌクレオチド配列は、配列番号１８として提供されており、そのフォールディングの自由エネルギーは−３０２．７８ｋｃａｌ／ｍｏｌと予測された。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］については、これは、したがって、ヘアピン構造のステムからのバルジと予測されたミスマッチしたヌクレオチドにもかかわらず、エネルギー的に安定したヘアピン構造であった。
改変されたＧＵＳセンス配列（配列番号１３のヌクレオチド９〜２０８）とＧＵＳ標的遺伝子の対応する領域（配列番号１４）とのアラインメントを図９に示す。
対照及び改変ヘアピンＲＮＡの発現のための４つの遺伝的構築物は、図１０にて概略的に示される。
実施例７．トランスジェニック植物の改変ヘアピンＲＮＡの試験
ＧＵＳ標的遺伝子で形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）種の植物を使用して、上記の４つのヘアピンＲＮＡ構築物の有効性を試験した。具体的には、標的植物は、図１１に概略的に示されているベクターｐＷＢＰＰＧＨからのＧＵＳ導入遺伝子のシングルコピー挿入をそれぞれ含む、２つのホモ接合性の独立したトランスジェニック系統ＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４由来のものであった。ｐＷＢＰＰＧＨのＴ−ＤＮＡのＧＵＳ遺伝子には、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ Ｌ．ｃｖ．Ａｕｔｕｍｎ Ｇｏｌｄ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗａｎｇ，１９９４）の師部タンパク質２（ＰＰ２）遺伝子の１．３ｋｂ長プロモーターに作動可能に連結されたＧＵＳコード領域（配列番号８のヌクレオチド７〜１８１２）があった。構築物ｐＷＢＰＰＧＨは、ＰＰ２プロモーターと５’ＵＴＲ及びＰＰ２タンパク質コード領域の５４ヌクレオチドを切り出し、ラムダゲノムクローンＣＰＰ１．３からＰＰ２の最初の１８アミノ酸をコードし（Ｗａｎｇ，１９９４）、この断片を、ＧＵＳの３番目のアミノ酸をコードするヌクレオチドで始まるＧＵＳコード配列と融合させ、ＧＵＳ活性を有するＮ末端融合ポリペプチドを生成することにより、作成した。ｐＰＰ２：：ＧＵＳ：Ｎｏｓ−ＴカセットをｐＷＢＶｅｃ２ａに挿入して（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）ｐＷＢＰＰＧＨを生成し、これは、ハイグロマイシン耐性で選別された、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したリーフディスク形質転換（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を使用して、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８の植物を形質転換するために使用された。２つのトランスジェニック系統ＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４のホモ接合性子孫植物におけるＧＵＳ活性は類似していた。両方のトランスジェニック植物におけるＧＵＳ発現は師部に限定されず、植物のほとんどの組織に存在した。したがって、これらの植物におけるＰＰ２プロモーターからのＧＵＳ発現は構成的であるように思われた。ＰＰ２−ＧＵＳ植物を試験植物として選択した理由は２つある：ｉ）ＰＰ２−ＧＵＳ植物は、３５Ｓ−ＧＵＳ植物とほぼ同じように構成的に高レベルのＧＵＳ発現を示し、ｉｉ）ＰＰ２プロモーターは、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子の発現を駆動するために使用される３５Ｓプロモーターとは異なる配列を有するＣｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏに由来する内因性ＰＰ２遺伝子プロモーターであり、入ってくる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）３５Ｓプロモーターによる転写共抑制を受けなかった。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介リーフディスク法（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を使用して、選択剤として５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを使用して、４つ全てのヘアピンＲＮＡ構築物（例６）を使用してＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４植物を形質転換した。ｐＷＢＰＰＧＨのＴ−ＤＮＡを導入するために使用された以前に使用されたハイグロマイシンとは異なる薬剤であるカナマイシンを用いたこの選択系は、形質転換植物のみを生じ、非形質転換植物は再生されなかったことが観察された。ｈｐＧＵＳ構築物由来のＴ−ＤＮＡを含む再生されたトランスジェニック植物は、温室で成長させるために土壌に移し、ＧＵＳ活性をアッセイする前に約４週間維持した。アッセイすると、トランスジェニック植物は健康かつ活発に成長しており、外観は形質転換されていない対照植物及び親のＰＰＧＨ１１及びＰＰＧＨ２４植物と同一であった。合計で、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］をコードするＴ−ＤＮＡで形質転換された５９のトランスジェニック植物が得られ、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］をコードするＴ−ＤＮＡで形質転換された７４の植物が得られ、ｈｐＧＵＳ［１：４］をコードするＴ−ＤＮＡで形質転換された３３の植物が得られ、ｈｐＧＵＳ［２：１０］をコードするＴ−ＤＮＡで形質転換された４１の植物が得られた。
ＧＵＳ発現レベルは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）に記載されている改変された速度論的方法にしたがって、蛍光４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）アッセイを使用して測定した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。植物は、各植物の３つの異なる葉から直径約１ｃｍの葉の試料を採取し、十分に大きくなった、健康で緑色の葉を選択することによって評価した。試験植物が対照植物と同じ成長及び発達段階にあるように注意した。各アッセイでは、葉の試料毎に抽出された５μｇのタンパク質を使用し、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）に記載されているようにＭＵＧの切断率を測定した。
代表的なデータを、それぞれ独立したトランスジェニック植物のＧＵＳ活性（アッセイのＭＵＧ単位）を示す図１２に示す。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物のデータは、一部の植物が強力なサイレンシングと、少なくとも９０％の活性の低下及び他の弱いサイレンシングを示したため、この状況では、植物を２つのカテゴリーに分類し、異なる構築物を比較するための活性レベルとして、対照植物と比較して１０％のＧＵＳ活性を選択した。
標準塩基対形成ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］をコードする遺伝的構築物は、試験した５９のトランスジェニック植物のうち３２（５４．２％）において、強力なサイレンシングのベンチマークとして１０％の活性レベルを使用して、強力なＧＵＳサイレンシングを誘発した。他の２７の植物は全てＧＵＳ活性の低下を示したが、対照植物と比較して１０％超の酵素活性を保持していたため、この状況では弱いサイレンシングを示すと考えられた。この構築物を備えたトランスジェニック植物は、ＧＵＳ遺伝子サイレンシングの幅広い程度を示し（図１２）、従来のヘアピン設計に典型的であった１％未満〜約８０％の活性が残っている（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
対照的に、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物は、独立したトランスジェニック系統全体で一貫した均一なサイレンシングを誘発し、試験した７４の植物のうち７１（９５．９％）が強力なＧＵＳサイレンシングを示した。再び異なる点として、試験した３３のｈｐＧＵＳ［１：４］植物は全て、ＧＵＳ活性レベルの低下を示し、対照植物と比較して８（２４％）だけが１０％未満のＧＵＳ活性を示し、他の２５は弱いサイレンシングを有すると分類された。これらの結果は、この構築物がトランスジェニック系統全体でより弱いがより均一なレベルのＧＵＳ下方制御を誘発したことを示した。ｈｐＧＵＳ［２：１０］構築物は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物と同様に機能し、一部の系統で良好なレベルのサイレンシングを誘発し（４１のうちの２８、すなわち６８．３％）、残りの１３の植物ではＧＵＳサイレンシングをほとんどまたは全く行わなかった。
サイレンシングした系統（残りの活性が１０％未満）のみを比較に使用し、平均ＧＵＳ活性を計算した場合、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物が最も高い平均サイレンシングの程度を示し、順にｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物とｈｐＧＵＳ［２：１０］植物が続いた（図１３）。ｈｐＧＵＳ［１：４］植物は、ＧＵＳ活性の最小の平均低下を示した。ＧＵＳサイレンシングの程度は、４つの異なるｈｐＲＮＡ構築物に由来する予測したｈｐＲＮＡ構造の熱力学的安定性との良好な相関関係を示した（例６）。
子孫植物において違いが持続するかどうかを試験するため、ホモ接合性であった標的ＧＵＳ遺伝子とｈｐＧＵＳ導入遺伝子（半接合性）の両方を含む代表的なトランスジェニック植物を自家受精させた。ｈｐＧＵＳ系統からカナマイシン耐性の子孫植物を選択したため、ｈｐＧＵＳ導入遺伝子を欠くヌル分離個体を除去した。これにより、ｈｐＧＵＳ導入遺伝子が、全ての子孫にホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかの状態で存在することが保証された。子孫植物をＧＵＳ活性についてアッセイし、代表的なデータを図１４に示す。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］導入遺伝子を含む子孫は、明らかに２つのカテゴリーに分類される、すなわち、強力なＧＵＳサイレンシングを持つものと、弱いサイレンシングを示すまたはサイレンシングを示さないものである。これらの分類は、前世代の表現型とよく相関しており、標的遺伝子のサイレンシングの程度が遺伝性であることを示す。試験したｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］系統の全ての植物は一貫して強いサイレンシングを示したが、ｈｐＧＵＳ［１：４］系統の植物は一貫して弱いサイレンシングを示した。本発明者らは、親世代で観察された表現型が一般に子孫植物で維持されていると結論付けた。
形質転換植物のサザンブロットハイブリダイゼーション実験
ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物によって生成された多数の独立したトランスジェニック植物で観察された強力な遺伝子サイレンシングの均一性は、顕著なだけでなく、驚くべき予期せぬものであった。本発明者らは、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡによって引き起こされる影響以外の何らかの説明がサイレンシングの均一性を引き起こしていたかどうかを確立しようとした。複数のトランスジェニック植物が意図した独立した形質転換事象から生じたかどうかを試験するために、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物を含む１８の代表的なトランスジェニック植物から単離したＤＮＡに対してサザンブロットハイブリダイゼーション実験を行った。ＤＮＡは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）によって記載されたホットフェノール法を使用して葉の組織から分離した。サザンブロットハイブリダイゼーションでは、各植物試料由来の約１０μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化し、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲルでゲル電気泳動により分離し、キャピラリー法を使用してＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレンにブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。メンブレンをＯＣＳ−Ｔターミネーター領域の３２Ｐ標識ＤＮＡ断片と４２℃で一晩ハイブリダイズした。このプローブは、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］導入遺伝子にハイブリダイズしたが、ＯＣＳ−Ｔターミネーター配列を持たないＧＵＳ標的遺伝子にはハイブリダイズしなかったため、選択した。メンブレンを高ストリンジェンシーで洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒで可視化されたプローブを保持した。
ハイブリダイズしたブロットのオートラジオグラフを図１５に示す。各レーンは、１つから５つまたは６つのハイブリダイズするバンドを示した。２つのレーンが同じパターンを示すことはなかった、すなわちオートラジオグラフは、１６の代表的なｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物がそれぞれ、ハイブリダイズした異なるパターンのＨｉｎｄＩＩＩ断片を持ち、したがって異なる導入遺伝子挿入に由来することを示した。本発明者らは、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］系統で観察された均一なＧＵＳサイレンシングは植物における同様の導入遺伝子挿入パターンによるものではなく、サイレンシングの均一性はｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡの構造によって引き起こされたと結論付けた。発明者らはまた、強力な遺伝子サイレンシングを得るためにｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］導入遺伝子の複数のコピーは必要ではなく、導入遺伝子の単一のコピーで十分である、と結論付けた。
形質転換植物のノーザンブロットハイブリダイゼーション実験
ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡがトランスジェニック植物の対照ヘアピンＲＮＡと同じ方法でプロセシングされたかどうかを判断するために、ノーザンブロットハイブリダイゼーション実験をトランスジェニック植物の葉から単離したＲＮＡで実行した。ノーザンブロット実験を実施して、ヘアピンＲＮＡのＤｉｃｅｒプロセシングから生じたより短いＲＮＡ（ｓＲＮＡ、約２１〜２４ヌクレオチド長）を検出した。実験は、（センス）ｍＲＮＡとして発現されたＧＵＳ標的遺伝子も含むトランスジェニックｈｐＧＵＳ［ｗｔ］及びｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物から単離した短鎖ＲＮＡで行われた。各構築物について９つの植物をｓＲＮＡ分析のために選択した。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］トランスジェニック集団の場合、弱いＧＵＳサイレンシングを示す植物と、強いＧＵＳサイレンシングを示す植物も含まれる。短鎖ＲＮＡ試料は、ホットフェノール法を使用して単離し（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ノーザンブロットハイブリダイゼーションをＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）にしたがって、変性条件下で行われたＲＮＡ試料のゲル電気泳動と共に行った。使用したプローブは、配列番号８のヌクレオチド８０４〜１００３に対応するセンス配列またはアンチセンス配列のいずれかに対応する３２Ｐ標識ＲＮＡであった。
アンチセンスプローブとハイブリダイズして（上のパネル）ヘアピンＲＮＡに由来するセンスｓＲＮＡ分子を検出するか、またはセンスプローブとハイブリダイズしてアンチセンスｓＲＮＡを検出する（下のパネル）ノーザンブロットのオートラジオグラフを図１６に示す。下部に、ｈｐＧＵＳ構築物を欠く対照植物と比較したＧＵＳ発現レベルの定性的スコアを図で示す。他の実験で既知の長さのＲＮＡと比較したｓＲＮＡの移動度に基づいて、約２０〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを観察した。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］系統は、ｓＲＮＡの蓄積量に様々な変動を示した。これは、センスｓＲＮＡ及びアンチセンスｓＲＮＡの両方で観察されたが、アンチセンスｓＲＮＡバンドは、センスバンドほど明確ではなかった。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物には、２００ｎｔの標的領域に対応するセンス配列とアンチセンス配列の両方を発現するｈｐＧＵＳ導入遺伝子と、完全長センス遺伝子を発現するＧＵＳ標的遺伝子の両方が含まれていたため、センスｓＲＮＡは、ヘアピンＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡから生成された可能性があった。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物では、ｓＲＮＡのレベルとＧＵＳサイレンシングの程度の間に負の相関があるように見えた。例えば、レーン４及び５に示されている２つの植物は、比較的多くのｓＲＮＡを蓄積したが、中程度のＧＵＳ下方制御のみを示した。対照的に、レーン７及び８に示されている２つの植物は、強力なＧＵＳサイレンシングを表したが、蓄積したｓＲＮＡは比較的低レベルであった。
ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物とは対照的に、かつｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物によるサイレンシングの比較的均一な範囲と一致して、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物は、系統全体に均一量のアンチセンスｓＲＮＡを蓄積した。さらに、ＧＵＳサイレンシングの程度は、アンチセンスｓＲＮＡの量と良い相関を示すように見えた。これらの植物ではセンスｓＲＮＡはほとんど検出されなかった。このことは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションで使用されるＲＮＡプローブが野生型ＧＵＳ配列から転写されていたため、全てのＣヌクレオチドがＵヌクレオチドで置き換えられたｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］由来のセンスｓＲＮＡに対するより低レベルの相補性を持っており、これはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションのみを可能とすることが予想された。しかしながら、この実験では、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡがプロセシングされてより少ないセンスｓＲＮＡが生成されたり、またはより速く分解される可能性は排除されなかった。
ノーザンブロットハイブリダイゼーション実験を繰り返し、今回は、センスプローブのみを使用してアンチセンスｓＲＮＡを検出した。オートラジオグラフを図１７に示す。もう一度、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物からのアンチセンスｓＲＮＡの生成は、ＧＵＳ活性と負の相関を示した（図１７の上のパネル）。強力にサイレンシングされた植物は、高レベルのアンチセンスｓＲＮＡを生成した（レーン１、３、５、８、及び１０）が、サイレンシングが弱いか、または全くない植物は、この実験でハイブリダイゼーションシグナルを生成しなかった（レーン２、４、６、７、及び９）。非常に明確に対照的に、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］を発現する植物は、はるかに少ないが一貫した量のアンチセンスｓＲＮＡを生成した。ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］を発現する強力にサイレンシングされた植物は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］を発現する強力にサイレンシングされた植物よりもはるかに低いレベルのｓＲＮＡを蓄積したという観察は興味深く、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］が植物において異なるメカニズムによってプロセシングされているが、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物と同じくらい効果的であったことを発明者らに示唆した。この実験でのさらなる観察により、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物の比較的弱い２つのアンチセンスバンドは、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］のアンチセンスｓＲＮＡバンドで観察された２番目と４番目のバンドと同じ移動度を有するように見えるという手掛かりがもたらされた。これは、以下に述べるさらなる実験で確認された。本発明者らは、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］からのｓＲＮＡの４つのバンドが２４、２２、２１及び２０ｍｅｒを表し、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡが主に２２及び２０ｍｅｒのアンチセンスｓＲＮＡを生成するようにプロセシングされたと仮定した。
上記データからの重要で明確な結論は、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡ分子が１つ以上のＤｉｃｅｒ酵素によってプロセシングされてｓＲＮＡを生成した、特に、アルゴノートなどの様々なタンパク質の存在下でＲＮＡ干渉のメディエーターであると考えられているアンチセンスｓＲＮＡを生成したということであった。観察されたアンチセンスｓＲＮＡの生成は、センスｓＲＮＡも生成されたことを意味したが、実験では、センスｓＲＮＡの分解／不安定性、または使用したプローブとのハイブリダイゼーションが不十分なことによるセンスｓＲＮＡの検出不良を区別しなかった。これらの実験から、発明者らはまた、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］とｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡ分子のプロセシングにおいて明確な違いがあると結論付けた。これは、分子が１つ以上のＤｉｃｅｒによって異なって認識されたことを示している。
実施例８．改変ヘアピンＲＮＡを発現するトランスジェニック植物由来のｓＲＮＡの分析
別のノーザンブロットハイブリダイゼーション実験を行って、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物からアンチセンスｓＲＮＡを検出し、そのサイズをｈｐＧＵＳ［ｗｔ］から生成されたものと比較した。オートラジオグラフを図１８に示す。今回は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］の主要な２つのバンドと比較した、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］の２つのアンチセンスｓＲＮＡバンドのサイズの違いがより明確であった。これは、図１８の隣接するレーン９及び１０のバンドの移動度を比較すると最もよくわかる。この結果は、２つのヘアピンＲＮＡが、植物の１つ以上のＤｉｃｅｒによって別々にプロセシングされたことを確認した。
これをさらに調査するには、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］及びｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］からの短鎖ＲＮＡ集団を、植物から単離した、リンカー増幅可能なｓＲＮＡの合計のディープシークエンシングによって分析した。ヘアピンＲＮＡの二本鎖領域にマッピングされたｓＲＮＡの頻度を決定した。このようなｓＲＮＡの長さの分布もまた決定した。結果は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物と比較して、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物から２２ｍｅｒアンチセンスＲＮＡの頻度が増加したことを示した。長さが２２ｎｔのｓＲＮＡの割合の増加は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］と比較して、Ｄｉｃｅｒ−２によるｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ヘアピンの処理のシフトを示した。
実施例９．植物の導入遺伝子のＤＮＡメチル化分析
ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］によって付与されたＧＵＳサイレンシングの範囲の変動性に関する観察と、アンチセンス２４ｍｅｒ ｓＲＮＡがｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物で検出されたが、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物では検出されなかったことは、植物の２つの集団が、標的ＧＵＳ遺伝子のＤＮＡメチル化のレベルにおいて異なっていたかどうかという疑問を本発明者らに投げかけた。配列特異的な２４ｍｅｒ ｓＲＮＡは、植物の逆方向反復構造のＤＮＡメチル化の促進に関与していると考えられている（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。したがって、本発明者らは、ｈｐＧＵＳ植物におけるＧＵＳ導入遺伝子、特にヘアピンをコードする遺伝子（サイレンシング遺伝子）の３５Ｓプロモーター領域のＤＮＡメチル化のレベルを試験した。
これを行うために、ＤＮＡメチル化依存性エンドヌクレアーゼＭｃｒＢＣを使用した。ＭｃｒＢＣは、メチルシトシン（ｍＣ）塩基を含むＤＮＡを二本鎖ＤＮＡの一方または両方の鎖で切断する市販のエンドヌクレアーゼである（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＭｃｒＢＣは、５’（ＧまたはＡ）ｍＣ ３’、好ましくはＧｍＣの形の２つのハーフ部位で構成されるＤＮＡ上の部位を認識する。これらのハーフ部位は数百塩基対離れている可能性があるが、最適な間隔は５５〜約１００ｂｐである。両方の鎖にそのような連結されたＧｍＣジヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡは、最良の基質として機能する。ＭｃｒＢＣ活性は、メチル化されたＧＣジヌクレオチドの一方または両方に依存する。植物ＤＮＡは、ＣＧ、ＣＨＧ、またはＣＨＨ配列（ＨはＡ、Ｃ、またはＴを表す）のＣでメチル化できるため（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、ＭｃｒＢＣを使用したＤＮＡの消化と、それに続く遺伝子特異的配列のＰＣＲ増幅は、植物ゲノムの特定のＤＮＡ配列におけるｍＣの有無を検出するために使用することができる。このアッセイでは、メチル化されたＭｃｒＢＣ消化ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により、メチル化されていないＤＮＡと比較して増幅産物の量が減少するが、ＤＮＡがメチル化されていない場合、未処理のＤＮＡと同じ量のＰＣＲ産物が得られる。
ゲノムＤＮＡは、標的ＧＵＳ遺伝子に加えて、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］、またはｈｐＧＵＳ［１：４］構築物を含む植物から標準的な方法で単離した（Ｄｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９８８）。精製されたＤＮＡ試料は、エンドヌクレアーゼ活性に必要なＭｇ２＋イオン及びＧＴＰの存在を含む、製造元の指示にしたがってＭｃｒＢＣ（カタログ番号Ｍ０２７２；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で処理した。要約すると、約１μｇのゲノムＤＮＡを３０μｌの反応容量でＭｃｒＢＣで一晩消化した。消化したＤＮＡ試料を１００μｌに希釈し、目的の領域を以下のようにＰＣＲ増幅した。
処理したＤＮＡ試料は、以下のプライマーを使用したＰＣＲ反応に使用した。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］の３５Ｓ−ＧＵＳジャンクション配列の場合：フォワードプライマー（３５Ｓ−Ｆ３）、５’−ＴＧＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号６０）；リバースプライマー（ＧＵＳｗｔ−Ｒ２）、５’−ＣＡＲＲＡＡＣＴＲＴＴＣＲＣＣＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６１）。ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］の３５Ｓ−ＧＵＳジャンクション配列の場合：フォワードプライマー（ＧＵＳｇｕ−Ｒ２）、５’−ＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６２）、リバースプライマー（ＧＵＳ４ｍ−Ｒ２）、ＣＡＣＲＡＡＲＴＲＴＡＣＲＣＲＣＴＴＲＡＣ（配列番号６３）。両方の構築物の３５Ｓプロモーター配列の場合：フォワードプライマー（３５Ｓ−Ｆ２）、５’−ＧＡＧＧＡＴＣＴＡＡＣＡＧＡＡＣＴＣＧＣ−３’（配列番号６４）、リバースプライマー（３５Ｓ−Ｒ１）、５’−ＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号６５）。いずれの場合も、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴである。ＰＣＲ反応は、以下のサイクリング条件：９４℃で１分間、９４℃で３０秒間、５５℃で４５秒間アニーリング、６８℃で１分間伸長、及び６８℃で５分間の最終伸長の３５サイクルで実施した。ＰＣＲ増幅産物は電気泳動し、バンドの強度を定量化した。
代表的な結果を図１９及び２０に示す。転写開始部位を含む３５Ｓプロモーター配列の２００ｂｐを含む３５Ｓ−ＧＵＳジャンクション領域では、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物のほとんどが有意なレベルのＤＮＡメチル化を示した。ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物の集団の中で、ＧＵＳ活性のレベルが高い、すなわちサイレンシングが少ない個々の植物は、プロモーター−ＧＵＳセンスジャンクション領域のメチル化が多いように見えた。結果は、３５Ｓプロモーター領域でも同様であった。対照的に、ほとんどのｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＧＵＳ［１：４］植物は、３５Ｓ−ＧＵＳジャンクションで弱いＤＮＡメチル化を示した。本発明者らは、この近位プロモーター配列が導入遺伝子の発現に重要であり、この領域でのメチル化は導入遺伝子の転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）を介してサイレンシング構築物の発現を低下させる可能性が高いと考えた。これは「自己サイレンシング」と称される。
実施例６〜９に関する一般的な考察
導入遺伝子における逆方向反復ＤＮＡ構造の破壊はその安定性を高める
ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］及びｈｐＧＵＳ［２：１０］トランスジェニック植物の両方の集団は、標的遺伝子のサイレンシング範囲に広い範囲を示した。対照的に、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＧＵＳ［１：４］植物を含む集団は両方とも、多くの独立した系統で比較的均一なＧＵＳサイレンシングを示し、前者の構築物では強力なサイレンシングが観察され、後者の構築物では遺伝子活性において比較的弱いが大幅な低下が観察された。［Ｇ：Ｕ］及び［１：４］構築物からのヘアピンＲＮＡでは、センス配列及びアンチセンス配列のヌクレオチドの約２５％は、Ｇ：Ｕ塩基対、または２００ヌクレオチドのセンス／アンチセンス配列全体に均一に分布した配列ミスマッチに関与していた。センス配列とアンチセンス配列との間の配列の相違のため、センスとアンチセンス「アーム」間のＤＮＡ構築物のミスマッチ、または逆方向反復構造は、その逆方向反復ＤＮＡ構造を大幅に乱すと考えられた。反復的なＤＮＡ構造は、様々な生物においてＤＮＡメチル化及びサイレンシングを誘導する可能性がある（Ｈｓｉｅｈ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，２０００）。ｈｐＧＵＳ［２：１０］構築物には、センス領域とアンチセンス領域との間のミスマッチも含まれていたが、センス配列とアンチセンス配列との間の２ｂｐのミスマッチのそれぞれには、８ｂｐの連続するマッチが隣接しており、［Ｇ：Ｕ］及び［１：４］導入遺伝子においてと同じ程度に、ミスマッチが逆方向反復ＤＮＡ構造を破壊していない可能性がある。したがって、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＲＮＡ［１：４］によって誘導されるＧＵＳサイレンシングの均一性は、少なくとも部分的には、メチル化が少なくなり、これにより減少した２つの導入遺伝子の自己サイレンシングをもたらす逆方向反復ＤＮＡ構造の破壊が原因である可能性がある。センスＤＮＡ領域とアンチセンスＤＮＡ領域との間のミスマッチのもう１つの利点は、細菌が完全な逆方向反復を削除または再配置する傾向があるため、Ｅ．ｃｏｌｉ内で逆方向反復のクローニングが促進されたことである。
ｈｐＲＮＡの熱力学的安定性は、標的遺伝子サイレンシングの程度にとって重要である
強力にサイレンシングされたトランスジェニック系統のみを比較した場合、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物が、標的遺伝子の下方制御の範囲が最も大きく、順にｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］、ｈｐＧＵＳ［２：１０］、及びｈｐＧＵＳ［１：４］が続いた。ＲＮＡＦｏｌｄ分析では、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］ヘアピンＲＮＡ構造の自由エネルギーが最も低く、すなわち安定性が最も高く、次いでｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］、ｈｐＧＵＳ［２：１０］、及びｈｐＧＵＳ［１：４］ヘアピンが続くことが予測された。本発明者らは、ヘアピンＲＮＡ構造がより安定であるほど、それが誘導できる標的遺伝子サイレンシングの程度が大きくなると考えた。これはまた、短いものよりも長い二本鎖ＲＮＡ構造に有利であった。安定した二本鎖ＲＮＡの形成は、効率的なＤｉｃｅｒプロセシングに必要であると考えられていた。本明細書で説明する実験の結果は、ｈｐＧＵＳ［１：４］などのほぼ単純なミスマッチヌクレオチドを含む構築物よりもＧ：Ｕ塩基対形成構築物の別の重要な利点を示す：両方のタイプの構築物が自己サイレンシングを低減する逆方向反復ＤＮＡ構造を破壊したが、ＲＮＡレベルでは、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡは、ＧとＵが塩基対形成する能力により、より安定であった。二本鎖ＲＮＡ構造にＧ：Ｕ塩基対及びいくつかのミスマッチヌクレオチドを有するが、ミスマッチよりもＧ：Ｕ塩基対に関連するヌクレオチドが、少なくとも２、３、４、または５倍比較してより多いものを含む、２種類の修飾の組み合わせも有益であると考えられる。
ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡはＤｉｃｅｒによって効率的にプロセシングされた
これらの実験で明らかとされた重要な問題の１つは、ミスマッチまたはＧ：Ｕの塩基対形成ｈｐＲＮＡがＤｉｃｅｒによって短鎖ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）にプロセシングできるかどうかであった。ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物における、ならびに１：４及び２：１０のミスマッチｈｐＲＮＡ植物における強力なサイレンシングは、これらのヘアピンＲＮＡ構造がＤｉｃｅｒによってプロセシングされたことを意味した。このことは、アンチセンスｓＲＮＡを容易に検出したｓＲＮＡノーザンブロットハイブリダイゼーションによって［Ｇ：Ｕ］分子で確認された。さらに、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物におけるＧＵＳサイレンシングの程度は、蓄積されたアンチセンスｓＲＮＡの量と良い相関を示した。それぞれから選択した２つの系統（ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］においては１つのみ）の短鎖ＲＮＡディープシークエンシング分析により、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物などのｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］植物が、豊富なｓＲＮＡを生成したのに対し、ｈｐＧＵＳ［１：４］植物もｓＲＮＡを生成したが、量ははるかに少なくなっていることが確認された（図２１）。ｈｐＧＵＳ［１：４］植物由来の低レベルのｓＲＮＡは、ＧＵＳサイレンシングの効率が比較的低いことと一致しており、ｈｐＧＵＳ［１：４］ＲＮＡのｄｓＲＮＡステムの熱力学的安定性が低いと、Ｄｉｃｅｒプロセシング効率が低下することが示唆された。ＧＵＳサイレンシングの程度は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物のｓＲＮＡレベルとの相関性が比較的低く、一部の強力にサイレンシングされた系統には比較的少量のｓＲＮＡが含まれていることが確認された。このことは、一部のｈｐＧＵＳ［ｗｔ］系統でのＧＵＳサイレンシングが、少なくとも部分的に、ｓＲＮＡによるＰＴＧＳではなく転写サイレンシングによるものであることを示唆している。本発明者らは、プロモーター領域などの遺伝子配列のメチル化を含む、ヘアピンをコードする遺伝子の自己サイレンシングが、改変ヘアピンＲＮＡ構築物、特にＧ：Ｕ構築物を使用することにより軽減されることを認識した。
Ｇ：Ｕ及び１：４ ｈｐＲＮＡ導入遺伝子は、近位３５Ｓプロモーター領域でＤＮＡメチル化の低下を示した
ＭｃｒＢＣ消化ＰＣＲ分析により、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＧＵＳ［１：４］トランスジェニック集団では、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］集団と比較して、転写開始点（ＴＳＳ）の近くの２４０ｂｐ ３５Ｓ配列のＤＮＡメチル化レベルが低下していることが示された。この結果は、センス配列における（ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］での）ＣからＴへの改変または（ｈｐＧＵＳ［１：４］での）２５％のヌクレオチドのミスマッチによる、完全な逆方向反復構造の破壊は、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子の転写自己サイレンシングを最小化していることを発明者らに示した。これは、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］集団と比較した、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＧＵＳ［１：４］集団で観察されたＧＵＳ遺伝子サイレンシングの均一性と一致していた。発明者らは、少なくともセンス配列のシトシンヌクレオチドの数が少ない、または欠けており、したがって、プロモーターに広がる可能性のあったＤＮＡメチル化を誘導しなかったために、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物は、ｈｐＧＵＳ［１：４］構築物よりもプロモーターのメチル化の低下、及び転写自己サイレンシングに理想的であったことを認識した。
実施例１０．内因性遺伝子を標的とするＧ：Ｕ塩基対を含むヘアピンＲＮＡの設計及び試験
ＥＩＮ２及びＣＨＳ ＲＮＡを標的とする改変ヘアピンＲＮＡ
Ｇ：Ｕ改変ヘアピンＲＮＡは、上記の従来のヘアピンＲＮＡと比較して、標的遺伝子のより一貫した均一なサイレンシングを誘導するようであったため、本発明者らは、改良された設計が内因性遺伝子の発現も減少させるかどうかを試験しようとした。したがって、発明者らは、ＥＩＮ２またはＣＨＳ遺伝子のいずれか、またはその両方を標的とする、いくつかの［Ｇ：Ｕ］改変ヘアピンＲＮＡ構築物を設計、製造、及び試験し、これらは、サイレンシングを試みる標的遺伝子の例として選択されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの内因性遺伝子であった。ＥＩＮ２遺伝子（配列番号１９）は、植物のシグナル伝達分子であるエチレンによって制御されるシグナル伝達経路の中心的因子、すなわち調節タンパク質であるエチレン非感受性タンパク質２（ＥＩＮ２）をコードし、ＣＨＳ遺伝子（配列番号２０）は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの種皮におけるアントシアニン産生に関与する酵素カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）をコードする。ＥＩＮ２及びＣＨＳ遺伝子の両方を同時に標的とする別のＧ：Ｕ改変構築物を生成し、ＥＩＮ２及びＣＨＳ配列は転写的に融合して単一のヘアピンＲＮＡを生成した。さらに、ＥＩＮ２、ＣＨＳ、またはＥＩＮ２及びＣＨＳの両方を標的とする３つの追加の構築物が作成され、ＧＵＳを標的とする改変ヘアピンに対して行われるようなセンス配列においてだけではなく、センス配列及びアンチセンス配列の両方において、シチジン塩基がチミジン塩基で置換された（本明細書ではＧ：Ｕ／Ｕ：Ｇ構築物と表記される）。改変ヘアピンＲＮＡ構築物は、細胞にヘアピンＲＮＡを提供するための遺伝子送達アプローチを使用して、内因性ＥＩＮ２遺伝子またはＥＩＮ２及びＣＨＳ遺伝子の発現を低下させる能力について試験した。実験で対照として使用された従来のヘアピンＲＮＡは、ＥＩＮ２またはＣＨＳ ｍＲＮＡを単独で標的とするために２００塩基対長の二本鎖ＲＮＡ領域、または単一のヘアピン分子として一緒に融合されたＥＩＮ２及びＣＨＳ遺伝子のそれぞれから２００塩基対を含むキメラ二本鎖ＲＮＡ領域を有した。融合ＲＮＡでは、ＥＩＮ２二本鎖部分は、ヘアピンのループに隣接しており、ＣＨＳ領域はループより遠位にあった。対照ヘアピンＲＮＡの二本鎖領域の塩基対は全て、標準的な塩基対であった。
構築物の調製
野生型ＥＩＮ２（配列番号１９）及びＣＨＳ ｃＤＮＡ（配列番号２０）の２００ｂｐ領域にわたるＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーペアＥＩＮ２ｗｔ−Ｆ（配列番号６６）及びＥＩＮ２ｗｔ−Ｒ（配列番号６７）またはＣＨＳｗｔ−Ｆ（配列番号６８）及びＣＨＳｗｔ−Ｒ（配列番号６９）をそれぞれ使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｏｌ−０ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。断片は、ＧＵＳヘアピン構築物と同様にｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙに挿入された（実施例６）。２００ｂｐ改変センスＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］（配列番号２２）及びＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］（配列番号２４）断片または２００ｂｐ改変アンチセンスＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］（配列番号２５）及び改変アンチセンスＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］（配列番号２６）断片（それぞれ制限酵素部位が隣接）を含むＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドのそれぞれのペア、ＥＩＮ２ｇｕ−Ｆ＋ＥＩＮ２ｇｕ−Ｒ、ＣＨＳｇｕ−Ｆ＋ＣＨＳｇｕ−Ｒ、ａｓＥＩＮ２ｇｕ−Ｆ＋ａｓＥＩＮ２ｇｕ−Ｒ、及びａｓＣＨＳｇｕ−Ｆ＋ａｓＣＨＳｇｕ−Ｒ（配列番号７０〜７７）のアニーリング、続いてＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑポリメラーゼを用いた３’末端のＰＣＲ伸長によって組み立てられた。全てのＧ：Ｕ改変ＰＣＲ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター、及びシークエンシングにより確認された目的のヌクレオチド配列にクローニングした。ＣＨＳ［ｗｔ］：：ＥＩＮ２［ｗｔ］、ＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］、及びａｓＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］：：ａｓＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］融合断片は、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドの共通ＸｂａＩ部位にある適切なＣＨＳ及びＥＩＮ２ ＤＮＡ断片をライゲーションすることによって調製した。
３５Ｓ：：センス断片：：ＰＤＫイントロン：：アンチセンス断片：：ＯＣＳ−Ｔカセットは、ｈｐＧＵＳ構築物と類似の方法で調製した。基本的に、アンチセンス断片は、それぞれのｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドから、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化して切り出し、ＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にあるｐＫａｎｎｉｂａｌに挿入し、３５Ｓプロモーターに対してアンチセンス方向になるようにした。次に、センス断片を、ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩを使用してそれぞれのｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドから切り出し、適切なアンチセンス含有クローンの同じ部位に挿入した。次に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドの全てのカセットをＮｏｔＩで切り出し、ｐＡＲＴ２７に挿入して、植物の形質転換用の最終的なバイナリーベクターを形成した。
改変されたセンス［Ｇ：Ｕ］及びアンチセンス［Ｇ：Ｕ］ヌクレオチド配列と、対応する野生型配列とのアラインメントは、置換ヌクレオチドの位置を示し、図２２〜２５に示されている。ヘアピンＲＮＡの発現カセットの設計は図２６に模式的に示す。
ヘアピンＲＮＡの形成の予測自由エネルギーは、ＦＯＬＤプログラムを使用して推定した。これらは（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）として計算された：ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］、−４５３．５；ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］、−３２８．１；ｈｐＣＨＳ［ｗｔ］、−５０７．７；ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］−３２８．５；ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ ／Ｕ：Ｇ］、−１７３．５；ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｙ／Ｕ：Ｇ］、−１８６．０；ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［ｗｔ］、−９１６．４；ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］、−６３０．９；ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ）、−３３３．８。
植物の形質転換
ＥＩＮ２、ＣＨＳ及びキメラＥＩＮ２／ＣＨＳ構築物は全て、フローラルディップ法を使用してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのレースＣｏｌ−０植物を形質転換するために使用した（Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ，１９９８）。トランスジェニック植物を選択するため、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに浸した花から採取した種子を塩素ガスで殺菌し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＭＳ培地にプレーティングした。複数のトランスジェニック系統が９つの構築物全てについて得られた（表１）。これらの一次形質転換体（Ｔ１世代）を土壌に移し、自家受精させ、成熟するまで育てた。これらの植物から採取した種子（Ｔ２種子）を使用して、Ｔ２植物を樹立し、導入遺伝子がホモ接合であった系統をスクリーニングした。これらは、ＥＩＮ２及びＣＨＳサイレンシングの分析に使用した。
Figure 2021533812
ＥＩＮ２サイレンシングの範囲の分析
ＥＩＮ２は、エチレン知覚に関与する受容体タンパク質をコードするＡ．ｔｈａｌｉａｎａの遺伝子である。この遺伝子は、種子の発芽直後の実生と、その後の植物の成長及び発育において発現する。ＥＩＮ２変異実生は、植物のエチレン合成の中間体である１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）の存在下、暗闇で発芽すると、同質遺伝子型の野生型の実生と比べて胚軸伸長を示す。したがって、トランスジェニック植物におけるＥＩＮ２遺伝子発現及びサイレンシングの程度は、完全な暗闇で５０μｇ／ＬのＡＣＣを含むＭＳ培地で種子を発芽させ、野生型の実生と比較して胚軸長を測定することにより評価した。胚軸長は、測定が容易な表現型であり、ＥＩＮ２遺伝子発現の減少の程度を示す優れた指標であり、ＥＩＮ２サイレンシングの様々なレベルを示す。ＥＩＮ２遺伝子発現がサイレンシングされた植物は、野生型実生（短い胚軸）とヌル変異実生（長い胚軸）の間の範囲のどこかで、ＥＩＮ２サイレンシングのレベルに応じて様々な程度の胚軸伸長を伴うことが予測された。ランダムに選択された、各構築物について独立して形質転換された２０の植物の種子をアッセイした。ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構築物を含む２０のうちの１つの植物からの種子は発芽しなかった。胚軸長のデータを図２７に示す。
ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］系統は、ＥＩＮ２サイレンシングの程度においてかなりの範囲を示し、７つの系統（図２７の植物系統２、５、９、１０、１２、１４、１６）は野生型と比較して低レベルのサイレンシングまたは同じ胚軸長を明確に示し、他の１３系統は中程度から強いＥＩＮ２サイレンシングを伴った。胚軸長の違いによって示されるように、各独立系統内の個々の植物は、ＥＩＮ２サイレンシングの程度において範囲を示す傾向があった。対照的に、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構築物を含む２つの系統（図２７の植物系統５、１８）のみが弱いＥＩＮ２サイレンシングを示し、残りの１８は均一で強力なＥＩＮ２サイレンシングを示した。加えて、１８系統のそれぞれの個々の植物は、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］構築物で形質転換された植物と比較して、比較的均一なＥＩＮ２サイレンシングを持っているように見えた。本発明者らは、Ｇ：Ｕ改変ヘアピンＲＮＡ構築物は、内因性ＲＮＡの同じ領域を標的とする従来のヘアピンＲＮＡよりも均一で予測可能である、内因性遺伝子のより一貫した、変動の少ない遺伝子サイレンシングを与えることができたと結論付けた。
トランスジェニックｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］集団も、ＥＩＮ２サイレンシングの程度と導入遺伝子のコピー数との関係が異なっていた。導入遺伝子のコピー数は、子孫植物におけるカナマイシン耐性マーカー遺伝子の分離比によって示され、耐性の実生：感受性の実生の３：１の比率は単一の遺伝子座の挿入を示すが、はるかに高い比率は多遺伝子座の導入遺伝子の挿入を示していた。ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］構築物で形質転換されたいくつかの複数コピー数系統は、低レベルのＥＩＮ２サイレンシングを示したが、これは、単一及び複数コピー遺伝子座系統の両方が強力なＥＩＮ２サイレンシングを示したｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統の場合は違った。
ＥＩＮ２遺伝子は、ＣＨＳ：：ＥＩＮ２融合ヘアピンＲＮＡで形質転換された実生でもサイレンシングされた。単一のｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構成を含む植物と同様に、ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］実生は、ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［ｗｔ］実生よりも、独立した系統全体でより均一なＥＩＮ２サイレンシングを明らかに示した。独立した系統内の個々の植物間のサイレンシングも、ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［ｗｔ］系統よりもｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統の方が均一であるようであった。同時に、ＥＩＮ２サイレンシングの程度は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］及びｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］で形質転換された植物間の比較と同様に、ｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］植物よりも、高度にサイレンシングされたｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［ｗｔ］植物の方がわずかに強かった。サイレンシングの程度を比較すると、融合構築物は単一のｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構築物よりも強いＥＩＮ２サイレンシングを誘導しないことが示されたが、実際、融合Ｇ：Ｕヘアピン構築物は、単一の遺伝子標的ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構築物よりもわずかに弱いＥＩＮ２サイレンシングを誘導するようであった。
Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ構築物で形質転換された植物を調べたところ、センス配列及びアンチセンス配列の両方のシチジン（Ｃ）ヌクレオチドがチミジン（Ｔ）ヌクレオチドに改変された場合、野生型植物と比較して、胚軸長がほとんどまたは全く増加しないことが、分析された２０の独立系統全てで観察された。これは、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］及びｈｐＣＨＳ：：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］構築物の両方で観察された。これらの結果は、おそらくヘアピンＲＮＡの塩基対形成が不安定化しすぎたため、約４６％の置換を有するＧ：Ｕ／Ｕ：Ｇ塩基対ヘアピンＲＮＡ構築物が標的遺伝子サイレンシングの誘導に効果的でなかったことを本発明者らに示した。本発明者らは、２つの考えられる理由がこの効果の無さに寄与した可能性があると考えた。まず、ヘアピンＲＮＡのＥＩＮ２二本鎖領域には、センス配列とアンチセンス配列との間に２００の潜在的な塩基対のうち９２のＧ：Ｕ塩基対があった。第２に、野生型センス配列の相補体と改変アンチセンス配列のアラインメントは、アンチセンス配列の４９ＣからＴへの置換が、ＥＩＮ２ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス配列の有効性を低下させた可能性があることを示した。本発明者らは、この実験から、少なくともＥＩＮ２標的遺伝子に関して、ヘアピンＲＮＡにおいて許容され得、サイレンシングの十分な有効性をなお維持し得るヌクレオチド置換の数には上限があったと結論付けた。例えば、９２／２００＝４６％の置換は、おそらく高すぎる割合であった。
ＣＨＳサイレンシングの範囲の分析
トランスジェニック植物は、組織培養培地でｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた、植物全体から抽出されたＲＮＡの定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってＣＨＳ遺伝子発現のレベルをアッセイした。ＣＨＳ ｍＲＮＡに使用したプライマーは、フォワードプライマー（ＣＨＳ−２００−Ｆ２）、５’−ＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＴＡ−３’（配列番号７８）、リバースプライマー（ＣＨＳ−２００−Ｒ２）５’−ＣＣＴＴＡＧＣＧＡＴＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡ−３’（配列番号７９）であった。標準として使用された参照遺伝子アクチン２に使用したプライマーは、フォワードプライマー（アクチン２−Ｆｏｒ）５’−ＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＧＣＡ−３’（配列番号８０）及びリバースプライマー（アクチン２−Ｒｅｖ）５’−ＧＡＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号８１）であった。
データは、アクチン２遺伝子の参照ｍＲＮＡと比較して、植物に蓄積されたＣＨＳ ｍＲＮＡのレベルが５０〜９６％の範囲で減少したことを示した（図２８）。
完全にＣＨＳ活性が欠如しているＡ．ｔｈａｌｉａｎａ種子は、野生型種子の茶色に比べて薄い種皮色をしている。したがって、トランスジェニック植物の種子を、種皮色について視覚的に調べた。それらの植物の葉におけるＣＨＳ ｍＲＮＡの減少にもかかわらず、他の植物ではなく、いくつかの植物由来の種子において種皮色の明らかな減少が観察された。しかしながら、種皮色の表現型は、植物の成長の間、発育中の種皮においてＣＨＳ活性がほぼ完全に消滅した場合にのみ示されたと考えられた。さらに、３５Ｓプロモーターは、発育中の種皮において、ヌル変異体で見られた薄い種子の表現型をもたらすＣＨＳ活性の低下レベルを提供するのに、十分に活性でなかった。視覚的な種皮色の表現型の改善は、種子の種皮においてより活性なプロモーターを使用することによって得ることができた。
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ内のＰＤＳ遺伝子の発現の減少
別のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ遺伝子を例示的な標的遺伝子として選択した。すなわち、カロテノイド生合成中にフィトエンのゼータ−カロテンへの脱飽和を触媒する酵素フィトエン脱飽和酵素をコードするフィトエン脱飽和酵素（ＰＤＳ）遺伝子である。ＰＤＳをサイレンシングすることで、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のフォトブリーチングが生じ、これにより、目視で容易に観察できるようになることが予想された。そのため、Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡ構築物を作成し、４５０ヌクレオチドのＰＤＳ ｍＲＮＡ配列を標的とした従来のｈｐＲＮＡ構築物との比較試験を行った。４５０ヌクレオチドのＰＤＳ配列は、チミジン（Ｔ）で置換された８２のシトシン（Ｃ）を含み、その結果、ｈｐＲＮＡ ｈｐＰＤＳ［Ｇ：Ｕ］のｄｓＲＮＡ領域内の１８．２％の塩基対がＧ：Ｕの塩基対であった。ｈｐＰＤＳ［Ｇ：Ｕ］をコードする遺伝子構築物と、ｈｐＰＤＳ［ＷＴ］をコードする対照遺伝子構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＣｏｌ−０生態型に導入した。
ｈｐＰＤＳ［ＷＴ］及びｈｐＰＤＳ［Ｇ：Ｕ］構築物について、それぞれ１００及び１７２のトランスジェニック系統を同定した。印象的なことに、これらの系統は全て、カナマイシン耐性の選択的培地上に出現した若いＴ１実子の子葉類内にフォトブリーチを示し、植物の成長のこの初期段階では、２つのトランスジェニック集団の間に明らかな違いはなかった。これらのことから、２つの構築物は子葉類においてＰＤＳサイレンシングを誘導するのに等しく有効であることが示唆された。しかし、Ｔ１植物のいくつかは、もはやフォトブリーチされず、緑色または淡い緑色に見える真葉を発達させたことから、ＰＤＳサイレンシングが真葉で放出されるか、または弱められることが示された。緑色の真葉を示すトランスジェニック系統の割合は、ｈｐＰＤＳ［ＷＴ］集団の方がｈｐＰＤＳ［Ｇ：Ｕ］集団よりもはるかに高かった。トランスジェニック植物は、強ＰＤＳサイレンシング（植物全体が強いフォトブリーチングを起こす）、中等度ＰＤＳサイレンシング（葉が淡い緑色または斑点状になる）、及び弱ＰＤＳサイレンシング（葉が完全に緑色または弱く斑点状になる）に基づいて３つの異なるカテゴリーに分類した。弱いＰＤＳサイレンシングを有する植物の割合は、ｈｐＰＤＳ［ＷＴ］系統では４３％であったのに対し、ｈｐＰＤＳ［Ｇ：Ｕ］系統では７％であった。実際、弱サイレンシング群の全てのｐＰＤＳ［Ｇ：Ｕ］系統は、弱サイレンシングされたｈｐＰＤＳ［ＷＴ］植物のほとんどが完全に緑色の葉を持っていたのとは対照的に、真葉に軽度の斑点が示されていた。これらの結果は、Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡ構築物が、従来の（完全に標準的に塩基対形成された）ｈｐＰＤＳ構築物よりも、独立したトランスジェニック集団全体でより均一なＰＤＳサイレンシングを与えたことを示しており、これは上述のＧＵＳ及びＥＩＮ２サイレンシングアッセイの結果と一致していた。さらに重要なことは、ＰＤＳサイレンシングの結果は、これまで注目されていなかった植物におけるｈｐＲＮＡ導入遺伝子誘導遺伝子サイレンシングの発生の多様性を示しており、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子サイレンシングは、真葉よりも子葉においてより効率的かつ安定であることが示唆した。独立した系統での均一の遺伝子サイレンシングに従って、ＰＤＳサイレンシングの結果から、Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡ導入遺伝子は、従来のｈｐＲＮＡ構築物よりも発生的に安定であり、より安定で長期的なサイレンシングがもたらされることが示唆された。
実施例１１．ヘアピンＲＮＡ構築物由来のｓＲＮＡの分析
ＲＮＡ試料でノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施して、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］植物からアンチセンスｓＲＮＡを検出し、その量及びサイズをｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］から生成されたｓＲＮＡと比較した。プローブは、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］構築物の２００ヌクレオチドセンス配列に対応する３２Ｐ標識ＲＮＡプローブであり、短い（２０〜２４ヌクレオチド）配列の検出を可能にするために、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを実施した。プローブしたノーザンブロットのオートラジオグラフを図２９に示す。この実験は、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］ヘアピンＲＮＡがｓＲＮＡにプロセシングされ、蓄積レベルが、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］系統のものと比較して分析された９つの独立して形質転換されたｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］植物にわたって比較的均一であったことを示した。ＧＵＳヘアピンＲＮＡの類似実験と同様に、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］の主要な２つのバンドと比較した、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の２つのアンチセンスｓＲＮＡバンドの移動度の違いが非常に明確であった。これは、図２８の隣接するレーン１０及び１１のバンドの移動度を比較すると最もよくわかる。
これをさらに調査するために、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］からの短鎖ＲＮＡ集団を、植物全体から単離した総ｓＲＮＡ集団のディープシークエンシングによって分析した。ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の二本鎖領域にマッピングされた各集団の比率を決定した。各集団の約１６００万リードから、約５０，０００のｓＲＮＡがｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］二本鎖領域にマッピングされたのに対し、約７００のみがｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］にマッピングされた。これは、［Ｇ：Ｕ］ヘアピンから生成されるｓＲＮＡがはるかに少ないことを示している。ＥＩＮ２特異的２２ｍｅｒの割合の増加も観察された。
図２９は、従来の（完全に標準的に塩基対形成された）系統とＧ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡ系統の両方が、２つのドミナントサイズ画分のｓｉＲＮＡを蓄積していることを示したものである。これまでの報告と一致するように、従来のｈｐＲＮＡ系統由来のドミナントｓｉＲＮＡは、２１及び２４ｎｔのｓＲＮＡサイズマーカーと同様に移行した。しかし、両方のＧ：Ｕ改変導入遺伝子の２つのドミナントｓｉＲＮＡバンドは、ゲル上でわずかに速く移動しており、このことから、これらのバンドが、従来のｈｐＲＮＡ導入遺伝子のバンドよりもサイズが小さいか、あるいは末端の化学修飾が異なるかのいずれかであることが示唆された。
２種類の異なる構築物の間でｓｉＲＮＡのサイズプロファイルが異なる可能性があるかを調べるために、１つのｈｐＧＵＳ［ＷＴ］系統及びｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］、ｈｐＥＩＮ２［ＷＴ］、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の各２つの系統から短鎖ＲＮＡを単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを用いてシークエンシングした結果、各サンプルについて約１，６００万のｓＲＮＡリードが得られた。強くサイレンシングされた２つのｈｐＧＵＳ［１：４］系統からのサンプルもまたシークエンシングした。ヘアピンＲＮＡの二本鎖領域及びイントロンスペーサー領域にマッピングされたｓＲＮＡの数を決定し、標的ＧＵＳ ｍＲＮＡ及びＥＮＩ２ ｍＲＮＡの上流領域及び下流領域にもｓｉＲＮＡをマッピングして、移行性ｓｉＲＮＡを検出した。シークエンシングデータから、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］系統はｈｐＧＵＳ［ＷＴ］系統と同様に豊富にｓｉＲＮＡを生成するが、一方でｈｐＧＵＳ［１：４］系統も同様にはるかに少ない存在量のｓｉＲＮＡを生成するがことが確認された。ｈｐＧＵＳ［１：４］系統由来のｓｉＲＮＡが低レベルであることは、ｈｐＧＵＳ［１：４］によるＧＵＳサイレンシングの効率が相対的に低いことと一致しており、ｈｐＧＵＳ［１：４］ＲＮＡ中のｄｓＲＮＡステムの熱力学的安定性が低いことにより、従来のヘアピンと比較してＤｉｃｅｒプロセシング効率が低下したことを示唆した。ノーザンブロットで示されたアンチセンスｓｉＲＮＡの移動度の明らかなシフトにもかかわらず、従来のｈｐＲＮＡ系統とミスマッチされたｈｐＲＮＡ系統の間では、ｓｉＲＮＡのサイズ分布に明確な違いはなく、全てのサンプルが２１ｎｔのｓＲＮＡをドミナントサイズクラスとして示した。２２ｎｔアンチセンスｓｉＲＮＡの比例した存在量には、従来のｈｐＧＵＳ系統：ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］とミスマッチのｈｐＧＵＳ系統：ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］との間に、わずかな差があり、ｈｐＧＵＳ［１：４］系統は、ｈｐＧＵＳ［ＷＴ］系統よりも２２−ｎｔサイズクラスの割合が高かったことが示された。従来のｈｐＲＮＡ系統及びミスマッチｈｐＲＮＡ系統の両方とも、シークエンシングデータの明確な特徴は、全てのサンプルにおいて、２４−ｎｔ ｓｉＲＮＡは２１−ｎｔ ｓｉＲＮＡよりもはるかに少ない存在量を示しており、すなわち、センス２４−ｎｔ ｓｉＲＮＡでは約３〜２１倍、アンチセンス２４−ｎｔ ｓｉＲＮＡでは約４〜３５倍少なかった。これは、２つのドミナントサイズクラスでは、相対的に等しい量を示したノーザンブロットの結果とは著しく異なっていた。また、興味深いことに、ｈｐＥＩＮ２［ＷＴ］−７及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］−１４／１５サンプルは、ノーザンブロットで同様のアンチセンスｓｉＲＮＡの存在量を示したが、シークエンシングデータでは、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統は、ｈｐＥＩＮ２［ＷＴ］−７系統（１３４，１１２リード）よりもはるかに少ない総２０〜２４ｎｔのアンチセンスｓｉＲＮＡリード数（１７，２９０及び２９，２１１）が得られたことに留意されたい。
ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］系統及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統の両方について、ほとんど全てのセンスｓｉＲＮＡがｈｐＲＮＡのＧ：Ｕ改変センス配列とマッチしたのに対し、アンチセンスｓｉＲＮＡのほとんどは野生型のアンチセンス配列を持っていた。このことは、これらのセンスｓｉＲＮＡ及びアンチセンスｓｉＲＮＡのほとんどが、一次転写産物であるｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］から直接プロセシングされたものであるが、ｈｐＲＮＡまたは標的ＲＮＡ転写産物からのＲＤＲ介在性増幅によるものではないことを示しており、そうでなければ同じ鋳型配列のセンスｓｉＲＮＡ及びアンチセンスｓｉＲＮＡの両方を生成する。これと一致するように、ごく少数の２０〜２４ｎｔのｓＲＮＡリード（移行性ｓｉＲＮＡ）が、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子のループ領域（ＰＤＫイントロン）またはＧＵＳもしくはＥＩＮ２ ｍＲＮＡの標的化されていない下流領域から検出された。しかしながら、２つのｈｐＧＵＳ［１：４］系統は、野生型センスｓｉＲＮＡが比較的高い割合であることを示しており、これは、これらの２つの系統における強いＧＵＳサイレンシングが、ｈｐＧＵＳ［１：４］集団にとっては比較的まれなケースであり、ＲＤＲ増幅が関与している可能性があることを示唆している。実際に、ｈｐＧＵＳ［１：４］系統では、ｄｓＲＮＡステムからよりもｈｐＲＮＡ標的領域の下流の標的遺伝子配列からより多くの量のｓｉＲＮＡが検出されており、このことは、これらの系統において移行性サイレンシングが存在していることを示唆するものであった。
これらをまとめると、ｓＲＮＡシークエンシングデータは、従来のｈｐＲＮＡ系統及びミスマッチｈｐＲＮＡ系統由来のｓｉＲＮＡは、２２−ｎｔサイズクラスを除いて、類似のサイズプロファイルを有していることを示しており、このことは、ノーザンブロットによって検出された移動の差は、５’または３’化学修飾が異なることによるものであることが示唆された。ノーザンブロット結果とシークエンシングデータとの間のｓＲＮＡの相対存在量（例えば、ｈｐＥＩＮ２［ＷＴ］対ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］由来のｓｉＲＮＡ、２１−ｎｔ対２４−ｎｔ）が不一致であることは、異なるｓｉＲＮＡの集団及びサイズクラスが、ｓＲＮＡライブラリー調製時に異なるクローニング効率を持つ可能性があることを示唆している。
植物のｓＲＮＡは、３’末端ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル基を持つことが知られており、これがｓＲＮＡを安定化させると考えられている。この３’メチル化は、以前に、３’アダプターライゲーションがｓＲＮＡのクローニング効率を低下させることを阻害するが、防ぐことはできないことが示された（Ｅｂｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ ２００５）。したがって、ｈｐＲＮＡ［ＷＴ］及びｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］由来のｓｉＲＮＡは、β−脱離アッセイにおいて、過ヨウ素酸ナトリウムと一緒であった。この処理は、ｈｐＲＮＡ［ＷＴ］及びｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］由来のｓｉＲＮＡのいずれにおいてもゲル移動度のシフトを起こさなかったことから、両方のｓｉＲＮＡ集団は３’末端でメチル化されており、ｈｐＲＮＡ［ＷＴ］及びｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］由来のｓｉＲＮＡの間で３’化学修飾に差がないことが示された。
標準的なｓＲＮＡシークエンシングプロトコルは、５’アダプターライゲーションが可能になる５’一リン酸を有するｓＲＮＡに基づいている（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＤｉｃｅｒでプロセシングされたｓＲＮＡは、５’一リン酸を有すると仮定されていたが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは多くのｓｉＲＮＡが５’末端に二リン酸または三リン酸を有することが判明しており、これはｓＲＮＡのゲル移動度を変化させ、標準的なｓＲＮＡクローニング手順ではｓＲＮＡの５’アダプターライゲーションを妨ぐ（Ｐａｋ ａｎｄ Ｆｉｒｅ ２００７）。植物のｓＲＮＡにも５’リン酸化の差があるかは不明であった。このため、ｈｐＲＮＡ［ＷＴ］及びｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］由来のｓｉＲＮＡの５’リン酸化状態を、全ＲＮＡをアルカリホスファターゼで処理した後、ノーザンブロットハイブリダイゼーションで調べた。この処理により、全てのｈｐＲＮＡ由来のｓＲＮＡのゲル移動度が低下し、これにより５’リン酸化が存在することが示された。しかし、ｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］由来のｓｉＲＮＡは、ホスファターゼ処理後、ｈｐＲＮＡ［ＷＴ］由来のｓｉＲＮＡよりも移動度のシフトが大きく、その結果、脱リン酸化されたｓｉＲＮＡの２つの群がゲル上の同じ位置で移動することが示された。２１及び２４−ｎｔ ｓＲＮＡサイズマーカーは、ポリヌクレオチドキナーゼ反応を用いて、５’末端に３２Ｐで放射性標識されたため、一リン酸化された５’末端を有するはずである。このことから、サイズマーカーと同じ位置で移動するｈｐＲＮＡ［ＷＴ］由来のｓｉＲＮＡは、一リン酸化ｓｉＲＮＡである可能性が高いのに対し、移動が速いｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］由来ｓｉＲＮＡは５’末端に１つ超のリン酸を有することが示唆された。このように、植物細胞内で従来型及びＧ：Ｕ改変型ｈｐＲＮＡ導入遺伝子から生成されたｓｉＲＮＡは、異なるリン酸化を受けていることが結論付けられた。
実施例１２．ＥＩＮ２サイレンシング植物のＤＮＡメチル化分析
ＧＵＳ及びＥＩＮ２の両方のサイレンシング結果は、改変されていないセンス配列を有するｈｐＲＮＡ構築物が、Ｇ：Ｕ塩基対を提供する改変されたセンス配列を有する構築物と比較して、非常に多様なレベルの標的遺伝子サイレンシングを誘発することを示した。上記のように、ｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］構築物のプロモーター領域は、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］構築物と比較してメチル化が少ないようであった。ＤＮＡメチル化を試験し、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］トランスジェニック植物を比較するため、各集団の１２の植物を、３５Ｓプロモーター及び３５ＳプロモーターセンスＥＩＮ２ジャンクション領域でのＤＮＡメチル化について、ＭｃｒＢＣ法を使用して分析した。３５Ｓプロモーター領域に使用されたプライマーは、フォワードプライマー（Ｔｏｐ−３５Ｓ−Ｆ２）、５’−ＡＧＡＡＡＡＴＹＴＴＹＧＴＹＡＡＹＡＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号８２）、リバースプライマー（Ｔｏｐ−３５Ｓ−Ｒ２）、５’−ＴＣＡＲＴＲＲＡＲＡＴＲＴＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣ−３’（配列番号８３）であった。３５ＳプロモーターセンスＥＩＮ２ジャンクション領域に使用されたプライマーは、フォワードプライマー（Ｌｉｎｋ−３５Ｓ−Ｆ２）、５’−ＹＹＡＴＹＡＴＴＧＹＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号８４）及びリバースプライマー（Ｌｉｎｋ−ＥＩＮ２−Ｒ２）、５’−ＴＡＡＴＴＲＣＣＡＣＣＡＡＲＴＣＡＴＡＣＣＣ−３’（配列番号８５）であった。これらのプライマー配列のそれぞれにおいて、Ｙ＝ＣまたはＴ及びＲ＝ＡまたはＧである。
ＤＮＡメチル化の程度の定量は、リアルタイムＰＣＲアッセイを実施することにより決定した。各植物について、商：ゲノムＤＮＡをＭｃｒＢＣで処理した後のＤＮＡ断片の増幅率／ゲノムＤＮＡをＭｃｒＢＣで処理しないＤＮＡ断片の増幅率、を計算した。
ほとんど全てのｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］植物は、３５Ｓプロモーター、特に３５Ｓ−ＥＩＮ２ジャンクションで有意なレベルのＤＮＡメチル化を示したが、他のものよりも多いものもあった。図３０及び３１に示すように、レーン１、４、７、９、１１、及び１２に表されている植物系統は全て、長い胚軸長で示されるように、強力なＥＩＮ２サイレンシングを示した。対照的に、レーン２、３、５、６、８、及び１０で表される他の６つの系統は、比較的弱いＥＩＮ２サイレンシングを示し、胚軸が短かった。これらの弱くサイレンシングされた系統は、ゲノムＤＮＡがＭｃｒＢＣで事前に消化された場合、ＰＣＲバンドの強度の大幅な低下により示されるようにプロモーター及びジャンクション配列でより多くのＤＮＡメチル化を示した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイにより、これらの観察結果を確認した（図３１）。試験した１２系統全てが、３５Ｓプロモーター領域と３５Ｓセンスジャンクション領域（「ジャンクション」）の両方で、ある程度のＤＮＡメチル化を示した。最大のメチル化の程度、すなわちｑＰＣＲアッセイでの最小の商は、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］系統２、３、５、６、８及び１０で、胚軸長によって測定されるサイレンシングの減少の程度と完全に相関した。これらの結果は、一部のｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］系統でのＥＩＮ２サイレンシングの減少がプロモーターのメチル化の増加と関連していることを確認した。ＥＩＮ２に対してサイレンシングされたｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］植物系統でさえ、特に３５Ｓ−センスＥＩＮ２ジャンクション断片領域に、かなりのレベルのＤＮＡメチル化がまだあった。プロモーターがメチル化される場合、これは転写のサイレンシングを引き起こすと考えられる。本明細書において構築物をサイレンシングする場合、それは「自己サイレンシング」の形態である。
ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］系統とは対照的に、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統は、３５Ｓプロモーター及び３５Ｓ−ＥＩＮ２ジャンクションの両方でＤＮＡメチル化が少ないことを示した。実際、図３０のレーン１、２、３、及び７（図３１のレーン１３、１４、１５、及び２０）に対応するこれらの１２ Ｇ：Ｕ系統の４つは、ＭｃｒＢＣ処理試料と未処理試料との間のＰＣＲバンドの強度が等しいことから示されるように、明らかなＤＮＡメチル化がなかった。これらの増幅がｑＰＣＲによって定量化された場合、１２系統のうち６系統は、ＭｃｒＢＣ処理による断片の減少がほとんどまたは全くないこと、したがってＤＮＡメチル化がほとんどまたは全くないことを示した−図３１の下のパネルの１３、１４、１５、１８、１９、及び２０系統を参照のこと。これらの結果は、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］構築物による比較的均一なＥＩＮ２サイレンシングが、少なくとも一部の系統では、ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］と比較して大幅にプロモーターのメチル化が少ないために転写の自己サイレンシングが少なかったことを示した。
これらの結果は、バイサルファイトシークエンシングによるトランスジェニック植物系統からのゲノムＤＮＡの分析によってさらに確認された。このアッセイは、バイサルファイトによるＤＮＡの処理が、ＤＮＡの非メチル化シトシン塩基をウラシル（Ｕ）に変換したが、５−メチルシトシン塩基（ｍＣ）は影響を受けないという事実を利用した。バイサルファイト処理後、目的のＤＮＡの定義されたセグメントは、処理されたＤＮＡのセンス鎖のみが増幅されるようにＰＣＲ反応において増幅された。次に、ＰＣＲ産物をバルクシークエンシングにかけ、ＤＮＡのセグメント内の個々のシトシン塩基のメチル化の位置及び範囲を明らかにした。したがって、このアッセイにより、ＤＮＡのセグメントのメチル化状態に関する単一ヌクレオチドの解像度の情報が得られた。
ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］のそれぞれについてＥＩＮ２サイレンシングの最も強力なレベルを示す３つの植物系統を、バイサルファイトシークエンシングによって分析した。これらは図３１のｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］の系統１、７、及び９ならびにｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の系統１３、１５、及び１８に対応する。これらの植物系統は、最長の胚軸長を示したため、各構築物の２０系統の中でＤＮＡメチル化のレベルが最も低いと予想された。ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］及びｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］について、結果をそれぞれ図３２及び３３に示した。比較すると、３５Ｓプロモーター領域の多数のシトシン及びｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］植物のＥＩＮ２センス領域が広範囲にメチル化されていることは明らかであった。明らかに対照的に、３つのｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］植物系統は、３５Ｓプロモーター領域において、はるかに低いレベルのシトシンメチル化を示した。
実施例１３．ｈｐＧＵＳ［１：４］構築物のプロモーターにおけるＤＮＡメチル化レベル
ｈｐＧＵＳ［１：４］植物から単離したゲノムＤＮＡを、上記のＭｃｒＢＣ及びバイサルファイト法を使用してＤＮＡメチル化について分析した際、ｈｐＧＵＳ［ｗｔ］植物と比較して、３５Ｓプロモーター及び３５Ｓプロモーター−ＧＵＳセンス配列領域においてシトシン塩基のメチル化が少なかったことが同様に観察された。
実施例１０〜１３に関する一般的な考察
Ｇ：Ｕ塩基対を有する二本鎖ＲＮＡは、従来のｄｓＲＮＡよりも均一な遺伝子サイレンシングを誘導する
ＧＵＳ構築物と同様に、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＣＨＳ：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］の両方は、従来のヘアピンＲＮＡをコードするそれぞれのｈｐＲＮＡ［ｗｔ］構築物より一貫した均一なＥＩＮ２サイレンシングを誘導した。均一性は、多くの独立したトランスジェニック系統全体で発生しただけでなく、それぞれ同じトランスジェニック挿入を有するトランスジェニック系統内のシブリング植物全体でも発生した。均一性に加えて、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］によって誘導されたＥＩＮ２サイレンシングの程度は、強力にサイレンシングされたｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］系統の程度に近かった。ＣＨＳ遺伝子サイレンシングの分析では、ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］構築物がＣＨＳ ｍＲＮＡレベルを５０〜９７％低減するのに効果的であったことが示されたが、減少した種皮色においてはっきり目に見える表現型を示す植物はほとんどなかった。種皮の色でより目に見える表現型が見られないことについての考えられる説明は、低レベルのＣＨＳ活性でさえ、フラボノイド色素を生成するには十分であり得るということであった。その他の考えられる説明としては、３５Ｓプロモーターが発達中の種皮で表現型を生成するのに十分に活性ではなかった、またはｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］構築物配列が６５のシトシン置換（３２．５％）を含んでいたのに対し、ＥＩＮ２配列は４３（２１．５％）、ＧＵＳ配列は５２（２６％）であったことである。さらに、ＣＨＳ配列のこれらのシトシン塩基の多くは、２つまたは３つの連続するシトシンのセットで発生するため、これらの全てを置換する必要はない。センス鎖の全てのシトシンが置換されると、これにより、ｈｐＣＨＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡの方がｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］及びｈｐＧＵＳ［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡよりも多くのＧ：Ｕ塩基対が生成された（おそらく最適数以上）。これを確認するため、別のセットのＣＨＳ構築物は、約５％、１０％、１５％、２０％または２５％のシトシン塩基が置換された一連のシトシン置換を含む配列を使用して作成された。これらの構築物は試験され、最適レベルが決定される。
ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統は、より均一なレベルのｓｉＲＮＡを発現する
比較的均一なＥＩＮ２遺伝子サイレンシングと一致して、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統は、独立した系統間でより均一なレベルでｓＲＮＡを蓄積した。これにより、［Ｇ：Ｕ］改変ｈｐＲＮＡがＤｉｃｅｒにより効率的にプロセシングされ、効果的な標的遺伝子サイレンシングを誘導することができるという結果がｈｐＧＵＳ構築物と共に確かめられた。
融合構築物は遺伝子サイレンシングもまたもたらす
実験にＣＨＳ：ＥＩＮ２融合構築物を含む目的は、単一のヘアピンをコードする構築物で２つの標的遺伝子をサイレンシングできるかどうかを試験することであった。ＧＵＳ実験は、自由エネルギー、したがってヘアピンＲＮＡの安定性が、標的遺伝子のサイレンシングの程度と正の相関があることを示唆した。結果は、ＣＨＳ：ＥＩＮ２融合構築物が両方の遺伝子のサイレンシングを引き起こすことを示した（ＣＨＳの場合、少なくともｍＲＮＡレベルで）。
２つのｈｐＲＮＡ構築物、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］及びｈｐＣＨＳ：ＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ／Ｕ：Ｇ］は、センス配列とアンチセンス配列の両方がＣからＴに改変され、その結果、塩基対の４６％が標準的な塩基対からＧ：Ｕ塩基対に変換され、ほとんどのトランスジェニック植物でＥＩＮ２サイレンシングが弱いか全く誘導されなかった。考えられる説明には、ｉ）過剰なＧ：Ｕ塩基対により非効率なＤｉｃｅｒプロセシングが生じたこと、及びｉｉ）過剰なＧ：Ｕ塩基対を含む標的ｍＲＮＡに結合するｓＲＮＡが、効率的なｍＲＮＡ切断を誘導しなかったこと、またはこれらの要因の組み合わせが挙げられる。
Ｇ：Ｕ塩基対形成構築物による標的遺伝子サイレンシングの均一性の向上は、プロモーターのメチル化の低下に関連する
ＭｃｒＢＣ消化ＰＣＲ及びバイサルファイトシークエンシングの両方を使用したＤＮＡメチル化分析は、全てのｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］植物系統がプロモーター領域でＤＮＡメチル化され、メチル化の程度がＥＩＮ２サイレンシングのレベルと負に相関することを示した。ＭｃｒＢＣ消化ＰＣＲによって判断された３つの最もメチル化されていない系統でさえ、メチル化されている全てのシトシンと比較して、３５Ｓプロモーターで約４０％のＤＮＡメチル化レベルを示した。広範囲に及ぶプロモーターのメチル化は、隣接するプロモーター領域に広がるＥＩＮ２リピート配列でのｓＲＮＡによるＤＮＡメチル化が原因であると考えられた。ｈｐＲＮＡ［ｗｔ］植物系統とは対照的に、多くのｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］系統はプロモーターのメチル化をほとんどまたは全く示さず、分析されたほとんどの植物はメチル化されたシトシンが少ないことを示した。ｈｐＧＵＳ系統について説明したように、いくつかの要因：ｉ）センス配列のＣ塩基をＴ塩基に変更することにより逆方向反復ＤＮＡ構造が破壊されること、及びｉｉ）センスＥＩＮ２配列にシトシンが欠けていたためｓＲＮＡによるＤＮＡメチル化によりメチル化できなかったこと、及びｉｉｉ）Ｇ：Ｕ塩基対によるｄｓＲＮＡ領域の構造の変化により２４ｍｅｒ ＲＮＡの生成レベルが低下し、一部のＤｉｃｅｒによる認識が変化し、Ｄｉｃｅｒ３及び／またはＤｉｃｅｒ４の活性が低下し、Ｄｉｃｅｒ２の活性が比較的多くなること、がメチル化の減少に寄与している可能性がある。したがって、ｈｐＥＩＮ２［Ｇ：Ｕ］導入遺伝子は、通常の非ＲＮＡｉ導入遺伝子（過剰発現導入遺伝子など）のように動作する可能性があり、一部の系統で観察されたプロモーターのメチル化は、ｈｐＲＮＡ導入遺伝子の固有の逆方向反復ＤＮＡ構造ではなく、Ｔ−ＤＮＡ挿入パターンによるものであった。
実施例１４．別の内因性遺伝子の発現を低下させるための改変ヘアピン
ヘアピンＲＮＡまたはｌｅｄＲＮＡのいずれかのために、他の内因性遺伝子を標的とする、改変サイレンシングＲＮＡを生成するための遺伝的構築物を設計及び合成した。これらには以下が含まれる。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子は、ＤＥＡＤ／ＤＥＡＨボックスＲＮＡヘリカーゼタンパク質、アクセッション番号、ＮＭ＿００１３３３１６２及びＸＭ＿０１８６５９３５８である、ファンコニ貧血相補群Ｍ（ＦＡＮＣＭ）タンパク質をコードする。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ遺伝子に対応するｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３１に提供され、Ｂ．ｎａｐｕｓの場合は、配列番号３２に提供される。
遺伝的構築物は、ＣからＴへの置換を有する、または有さないヘアピンＲＮＡと、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡを発現するように設計及び作成された。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子の標的領域を選択した：配列番号３１のヌクレオチド６７５〜１１７４（５００ヌクレオチド）。Ｂ．ｎａｐｕｓ遺伝子の標的領域を選択した：配列番号３２のヌクレオチド８９６〜１３９５（５００ｂｐ）。野生型センス配列または改変された（Ｇ：Ｕ）センス配列を使用して、ヘアピンＲＮＡをコードする構築物を設計し、組み立てた。ｈｐＦＡＮＣＭ−Ａｔ［ｗｔ］、ｈｐＦＡＮＣＭ−Ａｔ［Ｇ：Ｕ］、ｈｐＦＡＮＣＭ−Ｂｎ［ｗｔ］、及びｈｐＦＡＮＣＭ−Ｂｎ［Ｇ：Ｕ］構築物のヌクレオチド配列は、配列番号３３〜３６に提供されている。Ｇ：Ｕ構築物を作成するために、センス配列の全てのシトシン塩基をチミン塩基で置換した−Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ構築物において１０２／５００（２０．４％のＧ：Ｕ塩基対を提供）、及びＢ．ｎａｐｕｓ構築物において１０９／５００（２１．８％のＧ：Ｕ塩基対）。Ｂ．ｎａｐｕｓ Ｇ：Ｕ改変ヘアピンの二本鎖領域における連続する標準的な塩基対の最長ストレッチは１７塩基対であり、２番目に長いものは１６の連続する塩基対であった。
Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子は、ＤＮＡのシトシン塩基をメチル化するメチルトランスフェラーゼをコードする（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３７におけるＢ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子に対応する。
遺伝的構築物は、ＣからＴへの置換を有する、または有さないヘアピンＲＮＡと、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡを発現するように設計及び作成された。Ｂ．ｎａｐｕｓ遺伝子の２つの連続しない標的領域：配列番号３７のヌクレオチド５０４〜８１５及び１８８５〜２０７４を選択し、直接結合してキメラセンス配列を作成した。したがって、センス配列の全長は５０２ヌクレオチドであった。野生型センス配列または改変された（Ｇ：Ｕ）センス配列を使用して、ヘアピンＲＮＡをコードする構築物を設計し、組み立てた。ｈｐＤＤＭ１−Ｂｎ［ｗｔ］及びｈｐＤＤＭ１−Ｂｎ［Ｇ：Ｕ］構築物のヌクレオチド配列は、配列番号３８〜３９に提供されている。Ｇ：Ｕ構築物を作成するために、センス配列のシトシンをチミンで置換した−Ｂ．ｎａｐｕｓ構築物の１０６／５０２（２１．１％のＧ：Ｕ塩基対）。Ｇ：Ｕ改変ヘアピンの二本鎖領域における連続する標準的な塩基対の最長ストレッチは２０塩基対であり、２番目に長いものは１５の連続する塩基対であった。
内因性遺伝子を標的とする別の構築物については、３５０ヌクレオチドのセンス配列の１０４のＣの中から、センス配列において９５のＣからＴの置換を有するヘアピンＲＮＡを発現するように遺伝的構築物が設計され、ヘアピンＲＮＡの二本鎖領域において９５／３５０＝２７．１％のＧ：Ｕ塩基対がもたらされた。すなわち、センス配列の全てのＣがＴに置換されたわけではなかった。特に、センス配列において３つ、４つ、または５つの連続する一連のＣが発生した場合、３つのＣのうちの１つもしくは２つのみ、または４つのＣのうちの２つもしくは３つのみ、または５つの連続するＣのうちの２つ、３つ、もしくは４つのみがＴに置換された。これは、二本鎖ＲＮＡ領域におけるＧ：Ｕ塩基対のより均一な分布をもたらした。二本鎖領域における連続する標準的な塩基対の最も長いストレッチは１５塩基対であり、２番目に長いものは１３の連続する塩基対であった。
４、５、６、または７ヌクレオチドの全てのブロックの１つまたは２つの塩基対が、ＣからＴまたはＡからＧへの置換で改変された別の構築物が設計された。野生型センス配列がＴまたはＧからなる８ヌクレオチド以上のストレッチを有する場合、センス鎖において１つ以上のヌクレオチドを置換して、そのブロック内にミスマッチしたヌクレオチドを作成するか、またはアンチセンス鎖においてＣからＴもしくはＡからＧへの置換を行って、構築物から転写した得られたヘアピンＲＮＡの二本鎖領域において８以上の連続する標準的な塩基対の二本鎖ストレッチを回避した。
実施例１５．動物細胞における遺伝子発現を減少させるための改変ヘアピン
Ｇ：Ｕ塩基対形態の、ｌｅｄＲＮＡ形態の、または２つの改変を組み合わせた、動物細胞の改変されたサイレンシングＲＮＡを試験するために、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子を、以下の実験でモデル標的遺伝子として使用した。ＥＧＦＰのコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号４０に示されている。配列番号４０のヌクレオチド１３１〜５９１に対応する４６０ヌクレオチドの標的領域を選択した。
ｈｐＥＧＦＰ［ｗｔ］と表記された遺伝的構築物が設計及び作成され、発現のためのプロモーターに対して、５’から３’の順に、ＥＧＦＰコード領域の対応する領域（ヌクレオチド１３１〜５９０）に完全に相補的である４６０ヌクレオチドのアンチセンスＥＧＦＰ配列、（ＧＵＳ ＯＲＦのヌクレオチド８０２〜１０４２に対応する）ＧＵＳコード領域に部分的に由来する３１２ヌクレオチドのループ配列、及びＥＧＦＰコード領域のヌクレオチド１３１〜５９０と配列が同一である４６０ヌクレオチドのセンスＥＧＦＰ配列、を含むヘアピンＲＮＡを発現した。ヘアピンＲＮＡ ｈｐＥＧＦＰ［ｗｔ］（配列番号４１）をコードするＤＮＡの配列は、ベクターｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）へのクローニングのために、５’末端にＮｈｅＩ制限酵素部位と３’末端にＳａｌＩ部位を含んだ。このベクターは、哺乳動物細胞のトランスフェクション実験に適しており、強力なＣＭＶプロモーター／エンハンサーからの発現をもたらした。構築物はまた、ＮｈｅＩ部位とアンチセンス配列の始まりの間に挿入されたＴ７プロモーター配列を有し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してヘアピンＲＮＡを生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写をもたらした。ヘアピンコードカセットは、発現ベクターｐＣＩのＮｈｅＩからＳａｌＩの部位に挿入され、それによりＲＮＡコード領域は、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０後期ポリアデニル化／転写終結領域に作動可能に連結された。
センス配列において１５７ＣからＴへの置換を有し、アンチセンス配列において置換を有さない、対応するヘアピン構築物が設計及び作成され、ｈｐＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］（配列番号４２）と表記した。ＥＧＦＰコード領域の標的領域はヌクレオチド１３１〜５９０であった。ＣからＴへの置換の割合、したがってヘアピンＲＮＡのステムのＧ：Ｕ塩基対の割合は１５７／４６０＝３４．１％であった。センス及びアンチセンス配列は、４６０ヌクレオチドで長さが同一であった。遺伝子サイレンシングの分野では、インターフェロン活性化を含む細胞応答を活性化する可能性があるため、長い二本鎖ＲＮＡは一般に回避されている。
ｌｅｄＥＧＦＰ［ｗｔ］と表記されたｌｅｄＲＮＡ構築物が設計及び作成され、発現のためのプロモーターに対して、５’から３’の順に、ＥＧＦＰコード配列のヌクレオチド１３１〜３５８に完全に相補的である２２８ヌクレオチドのアンチセンスＥＧＦＰ配列、１５０ヌクレオチドのループ配列、ＥＧＦＰコード領域（配列番号４０）のヌクレオチド１３１〜５９０と配列が同一である４６０ヌクレオチドのセンスＥＧＦＰ配列、１４４ヌクレオチドのループ配列、ならびにＮｈｅＩ及びＳａｌＩ制限部位が隣接するＥＧＦＰコード配列（配列番号４３）のヌクレオチド３５９〜５９０に完全に相補的である２３２ヌクレオチドのアンチセンス配列、を含むｌｅｄＲＮＡを発現した。したがって、コードされたｌｅｄＲＮＡは、図１Ａに示すタイプのものであった。ｌｅｄＲＮＡ構造は、１つのセンス配列と２つのアンチセンス配列間の塩基対形成によって自己アニーリングすると、２つのアンチセンス配列は互いに直接共有結合していないが、ヌクレオチド３５８及び３５９に対応する末端間に「ギャップ」または「ニック」を有する、ＥＧＦＰ標的領域に対応する４６０塩基対の二本鎖領域を持っていた。ｌｅｄＲＮＡ構造は、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０後期ポリアデニル化／転写終結領域の配列から得られる５’及び３’領域を含む、より大きなＲＮＡ転写物に埋め込まれた。
センス配列において１６２のＣからＴへの置換を有し、アンチセンス配列において置換を有さない、対応するｌｅｄＲＮＡ構築物も設計及び作成され、ｌｅｄＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］（配列番号４４）と表記した。いずれの場合にも、ＥＧＦＰコード領域の標的領域は、ＡＴＧ開始コドンで始まるタンパク質コード領域（配列番号４０）に対するヌクレオチド１３１〜５９０であった。ｌｅｄＲＮＡのステムにおけるＣからＴへの置換の割合、したがってＧ：Ｕ塩基対は１６２／４６０＝３５．２％であった。
ｈｐＥＧＦＰ［ｗｔ］、ｈｐＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］、ｌｅｄＥＧＦＰ［ｗｔ］、及びｌｅｄＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］サイレンシングＲＮＡをコードするプラスミドを、細胞へのベクターのトランスフェクションにより、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、及びＶＥＲＯ細胞における遺伝子サイレンシング活性について試験した。試験プラスミドとＧＦＰ発現プラスミドの同時トランスフェクションによりアッセイを行った。全てのアッセイは３回実施した。ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）を、ウェルあたり１×１０５細胞の密度で２４ウェルプレートに播種した。ＣＨＯ細胞はＭＥＭα改変（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）において増殖させ、ＨｅＬａ及びＶＥＲＯ細胞はＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）において増殖させた。両方の基本培地には、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．０１％ペニシリン、及び０．０１％ストレプトマイシンを追加した。細胞は３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ウェルあたり１μｇのプラスミドＤＮＡを、またはＥＧＦＰサイレンシングの対照としてｓｉＲＮＡを、細胞にトランスフェクトした。簡単に言えば、試験ｓｉＲＮＡまたはプラスミドをＧＦＰレポータープラスミド（ｐＧＦＰ Ｎ１）と組み合わせ、１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と混合し、両方を５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で希釈して、室温で２０分間インキュベートした。次に、複合物を細胞に加え、４時間インキュベートした。細胞培地を交換し、細胞を７２時間インキュベートした。次に、細胞をフローサイトメトリーにかけ、ＧＦＰサイレンシングを測定した。簡単に言えば、分析する細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳＡで洗浄し、２００μＬの０．０１％アジ化ナトリウム及び２％ＦＣＳを含むＰＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターを使用して分析した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してデータ分析を行い、レポーター及び非関連（負の対照）ｓｈＲＮＡを持つ対照細胞の割合として平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した。
ｓｉ２２と呼ばれる抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡはＱｉａｇｅｎ（ＵＳＡ）から入手した。ｓｉ２２の抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ配列は、センス５’−ｇｃａａｇｃｕｇａｃｃｃｕｇａａｇｕｕｃａｕ−３’（配列番号８６）及びアンチセンス５’−ｇａａｃｕｕｃａｇｇｇｕｃａｇｃｕｕｇｃｃｇ−３’（配列番号８７）であった。ｐｓｈＧＦＰと呼ばれた陽性対照の遺伝的構築物は、マウスＵ６配列を鋳型として使用して、ワンステップＰＣＲ反応によって作成された。フォワードプライマーは５’−ＴＴＴＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧ−３’（配列番号８８）で、リバースプライマーは５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号８９）であった。完全長発現カセットを含む増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙにライゲートした。非関連のｓｈＲＮＡ対照プラスミドも、同じＰＣＲ法によって構築した。その構築では、フォワードプライマーは５’−ＴＴＴＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧ−３’（配列番号９０）で、リバースプライマーは５’−ｃｔｃｇａｇｔｔｃｃａａａａａａａｔａａｇｔｃｇｃａｇｃａｇｔａｃａａｔｃｔｃｔｔｇａａｔｔｇｔａｃｔｇｃｔｇｃｇａｃｔｔａｔｇａａｔａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｃｔｇａｇ−３’（配列番号９１）であった。
１つの実験から得られたデータを図３４に示す。ＥＧＦＰ活性の明らかな減少（ＲＮＡサイレンシング）が、関連しないｓｈＲＮＡ対照と比較した場合、ｓｉ２２及びｐｓｈＧＦＰ陽性対照の両方のＶＥＲＯ及びＣＨＯ細胞の両方で観察された。これらの陽性対照は、十分に検証された小ｄｓＲＮＡ分子（ｓｉ２２）であるか、哺乳動物細胞で非常に強力なサイレンシング活性を有することが知られているｓｈＲＮＡ（ｐｓｈＧＦＰ）をコードした。対照ＲＮＡ分子は、２０の連続する塩基対及び２１の連続する塩基対の二本鎖領域をそれぞれ有し、標準的な塩基対のみを使用し、二本鎖領域にミスマッチしたヌクレオチドがなく、哺乳動物細胞に一般的に使用される２０〜３０塩基対長の範囲内である。対照的に、ｈｐＲＮＡ及びｌｅｄＲＮＡ構築物は、長いｄｓＲＮＡ領域を持つ分子を発現する。４つ全ての構築物は、両方の細胞型でＥＧＦＰ発現をかなりの程度、特異的にサイレンシングすることが観察された（図３４）。Ｇ：Ｕ置換を含むことで、ＣＨＯ細胞の両方の構築物のサイレンシングに顕著な改善が見られた。ＶＥＲＯ細胞では、サイレンシングの顕著な改善は、ｌｅｄＥＧＦＰ［ｗｔ］と比較してｌｅｄＥＧＦＰ［Ｇ：Ｕ］構築物でのみ観察された。
ＨｅＬａ（ヒト）細胞を使用し、トランスフェクションの４８時間後にＥＧＦＰ活性をアッセイする第２の実験では、同様の結果が得られた（図３５）。
従来の２０〜３０ｂｐのサイズ範囲よりも長い二本鎖領域がある場合、ｈｐＲＮＡ及びｌｅｄＲＮＡエフェクター分子を使用して、哺乳動物細胞において遺伝子サイレンシングが観察されたことに注意することは重要である。また、ヌクレオチドを置換してＧ：Ｕ塩基対を作成するように改変すると、これらの長いｄｓＲＮＡ分子の遺伝子サイレンシング効果が大幅に向上することも明らかであった。この効果は、これらの構造が真核細胞で観察される内因性ｐｒｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体により類似しており、これによりＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）エフェクタータンパク質にロードするための長いｄｓＲＮＡのプロセシングを改善するためであり得る。
実施例１６．植物のＤＤＭ１及びＦＡＮＣＭ遺伝子を標的とするＲＮＡ構築物
本発明者らは、植物における望ましい性能特性について、新規の遺伝的プロファイル及び多様性（遺伝的獲得量）を生成及び探索することができる速度を高める方法を検討した。検討された１つの方法は、植物の有性生殖中に発生する組換え速度を高める方法を見つけることであった。植物育種家は、組換え事象を利用して、様々な遺伝的（対立遺伝子）の組み合わせを作成し、それらを介して、パフォーマンスの向上に関連する望ましい遺伝的プロファイルを検索することができる。しかしながら、各育種段階での組換え事象の数は、探索され得る可能性のある遺伝的プロファイルの数に比べて非常に少ない。加えて、これらの事象がゲノム内で発生する場所を制御する要素はよく理解されていない。したがって、発明者らは、トランスジェニックアプローチを介して外因的にまたは内因的に送達されたｌｅｄＲＮＡを使用して、植物における組換え速度を変更して遺伝的多様性の急速な増加を可能にし、育種集団内でより速い遺伝的獲得を可能にすることができるかどうかを検討した。
植物のエピゲノムは、ＤＮＡの様々な化学修飾と、ゲノムを編成、パッケージング、及び安定化する関連タンパク質の影響を受ける。これらの修飾はまた、組換えの強力な阻害因子となるタイトなゲノムパッケージングと合わせて、組換えが起こる場所を調節する（Ｙｅｌｉｎａ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ｍｅｌａｍｅｄ−Ｂｅｓｓｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＤＥＣＲＥＡＳＥＤ ＤＮＡ ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ １（ＤＤＭ１）は、ＤＮＡのメチル化及びゲノムパッケージングを調節する酵素である。この遺伝子の変異は、組換え事象の位置を変える可能性がある（Ｙｅｌｉｎａ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ｍｅｌａｍｅｄ−Ｂｅｓｓｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
減数分裂中の組換え事象は厳密に制御されており、各染色体で発生する事象は１〜２のみで、分裂中期１での適切な染色体分離を保証する。組換え事象は、酵素ＳＰＯ１１を介してＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）によって開始される（Ｗｉｊｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ，２００８）。これは染色体に沿って何百ものＤＳＢをもたらす。これらのＤＳＢのいくつかはクロスオーバーを引き起こすが、大部分は、組換え事象が発生する前に、ＤＮＡ修復酵素によって修復される。さらに、ＤＳＢのクロスオーバーへの発達を阻害する多くの負のレギュレーターが存在する。発明者らが企図した最初のアプローチでは、比較としてｌｅｄＲＮＡ分子または従来のヘアピンＲＮＡ分子をコードする遺伝的構築物をＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物に導入し、ファンコニ貧血相補群Ｍ（ＦＡＮＣＭ）などの組換え速度に影響を与える可能性のあるタンパク質因子をコードする遺伝子を標的とした。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＤＤＭ１遺伝子のヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＡＦ１４３９４０から提供された（Ｊｅｄｄｅｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＤＤＭ１遺伝子発現の減少は、ＤＮＡメチル化を減少させ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるクロスオーバー事象の数及び位置を増加させることが示されている（Ｍｅｌａｍｅｄ−Ｂｅｓｓｕｄｏ ａｎｄ Ｌｅｖｙ，２０１２）。
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは異質四倍体種であり、Ａ及びＣサブゲノムのそれぞれに２つのＤＤＭ１遺伝子があり、染色体Ａ７、Ａ９、Ｃ７、及びＣ９に、合計４つのＤＤＭ１遺伝子を持っている。これらの遺伝子は、ＢｎａＡ０７ｇ３７４３０Ｄ−１、ＢｎａＣ０７ｇ１６５５０Ｄ−１、ＢｎａＡ０９ｇ５２６１０Ｄ−１、及びＢｎａＣ０９ｇ０７８１０Ｄ−１と呼ばれる。Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子ＢｎａＡ０７ｇ３７４３０Ｄ−１のヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＸＲ＿００１２７８５２７（配列番号９３）によって提供される。配列番号９３のヌクレオチド６５０〜９５９及び２０２９〜２２１８に対応する、４つの遺伝子の５００ヌクレオチド領域を標的とするヘアピンＲＮＡ構築物が設計及び作成された。ｈｐＲＮＡ及びｌｅｄＲＮＡ構築物の設計に使用されたヌクレオチド領域は、遺伝子間の配列保存に基づいて、Ｂ．ｎａｐｕｓに存在するＢｎａＡ０７ｇ３７４３０Ｄ−１、ＢｎａＣ０７ｇ１６５５０Ｄ−１、ＢｎａＡ０９ｇ５２６１０Ｄ−１、及びＢｎａＣ０９ｇ０７８１０Ｄ−１の４つ全てのＤＤＭ１遺伝子を標的にした。ｈｐＲＮＡ構築物の要素の順序は、Ｈｅｌｌｓｇａｔｅベクター−アンチセンス配列−転写ターミネーター／ポリアデニル化領域からのイントロンを含むプロモーター−センス配列−ループ配列であった。ｈｐＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号９４として提供されている。
センス配列の９７のシトシンヌクレオチド（Ｃ）がチミジンヌクレオチド（Ｔ）で置き換えられたことを除いて、同じ５００ヌクレオチド領域を標的とし、同じ構造を有するヘアピンＲＮＡをコードする第２のヘアピンＲＮＡ構築物を作成した。キメラＤＮＡが転写され、Ｇ：Ｕ置換ｈｐＲＮＡが自己アニーリングされた場合、これにより、Ｇ：Ｕ塩基対で塩基対形成されるｄｓＲＮＡ領域のヌクレオチドの９７／５００＝１９．４％が提供された。Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号９５として提供される。さらに、Ｂ．ｎａｐｕｓのＤＤＭ１遺伝子の同じ領域を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするキメラＤＮＡを作成した。ｌｅｄＲＮＡをコードするこのキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号９６として提供される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるＲＮＡの産生のため、ＤＮＡ調製物は、コード領域の直後に切断される制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断され、ＲＮＡポリメラーゼＴ７でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写され、ＲＮＡを精製後、水性緩衝液で濃縮した。ＬｅｄＲＮＡは、Ｂ．ｎａｐｕｓ（キャノーラ）子葉の内因性ＤＤＭ１転写物の標的に使用した。組織培養培地で無菌的に生育した５日齢の実生の子葉を慎重に切除し、１１３μｇのｌｅｄＲＮＡまたは対照として１００μｌの水性緩衝液を加えた、２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む２ｍｌ ＭＳ液体培地を含むペトリ皿に置いた。処理に使用したＭＳ液体培地は、界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔｔ−７７（６０ｍｌに０．５μｌ）を含んだ。ペトリ皿を穏やかに振とうさせながらシェーカー上でインキュベートし、子葉がｌｅｄＲＮＡを含む溶液に浸るようにした。ｌｅｄＲＮＡの適用後５時間及び７時間で試料を採取した。並列実験では、子葉の上面を１０μｇのｌｅｄＲＮＡまたは緩衝液でコーティングし、ウェットティッシュペーパーでインキュベートした。ｌｅｄＲＮＡ適用の７時間後に試料を回収した。
さらに、Ｂ．ｎａｐｕｓの生殖組織のＤＤＭ１内因性転写物を標的とするために、キャノーラの花芽は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍａｆｅｃｉａｎｓ株ＡＧＬ１細胞懸濁液、すなわち生きているＡＧＬ１細胞のアリコートの存在下または非存在下でｌｅｄＲＮＡに曝露した。ＡＧＬ１細胞を含むか、または含まない水性緩衝液は、それぞれの対照として機能した。ＡＧＬ１は、２５ｍｇ／ｍｌのリファンピシンを含む１０ｍｌのＬＢ液体培地で、２８℃で２日間増殖させた。３０００Ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞を採取した。細胞ペレットを洗浄し、細胞を２ｍｌの液体ＭＳ培地に再懸濁した。花芽を、５０ｍｌのＭＳ液体培地で０．５μｌのＳｉｌｗｅｔｔ−７７を含む２ｍｌのＭＳ液体培地を含むペトリ皿で、６２μｇのｌｅｄＲＮＡまたは６２μｇ＋５０μｌのＡＧＬ１培養液と共にインキュベートした。対照として、５０μｌの緩衝液または５０μｌの緩衝液＋５０μｌのＡＧＬ１培養液を使用した。試料をシェーカーで穏やかに振とうさせながら７時間インキュベートした。３つの生物学的反復を各処理に使用した。
処理及び対照の子葉及び花芽を滅菌蒸留水で２回洗浄し、ティッシュペーパーを使用して表面の水を取り除き、液体窒素で瞬間凍結した。ＲＮＡを処理組織及び対照組織から分離し、ＤＮａｓｅで処理してゲノムＤＮＡを除去し、定量化した。第一鎖ｃＤＮＡは、ｌｅｄＲＮＡ処理した試料とそれぞれの対照から等量のトータルＲＮＡを使用して合成した。ＤＤＭ１の発現は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して分析した。
ｌｅｄＲＮＡで浸漬させた処理した子葉では、ＤＤＭ１転写物量は５時間で約８３〜８６％減少したが、対照と比較して７時間で９１％さらに減少した。同様に、ｌｅｄＲＮＡでコーティングされた子葉では、対照と比較してＤＤＭ１ ｍＲＮＡレベルが約７８〜８５％減少したことが観察された。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の非存在下での対照と比較して、ｌｅｄＲＮＡで処理された花芽では、ＤＤＭ１ ｍＲＮＡ量の違いは検出されなかった。しかしながら、ＤＤＭ１転写物レベルの約６０〜７５％の減少が、それぞれの対照と比較してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの存在下でｌｅｄＲＮＡで処理された花芽で観察された。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まない対照を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞自体がＤＤＭ１転写物の減少を引き起こさなかったことを示すＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む対照と比較した場合、ＤＤＭ１転写物レベルに有意差は検出されなかった。総合すれば、これらの結果は、生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞が花芽へのｌｅｄＲＮＡの侵入を促進するように見える一方で、ｌｅｄＲＮＡが子葉及び花芽の両方において内因性のＤＤＭ１転写物レベルを低下させることができることを示した。ｌｅｄＲＮＡのそのようなアクセシビリティは、花芽の外層の貫通、遠心分離または真空浸潤、またはそのような方法の組み合わせなどの物理的手段によっても達成され得る。
ｚｉｐ４変異体などの特定のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ変異体は減数分裂のクロスオーバーを欠いているため、染色体相同体の誤分離を引き起こし、これにより繁殖力を低下させ、短い長角果（果実）を野生型のものから視覚的に識別することができる。ＦＡＮＣＭ遺伝子発現を低下させることにより、ｚｉｐ４変異体の表現型を逆転させることができる。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ遺伝子のヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１３３３１６２（配列番号９７）によって提供された。配列番号９７のヌクレオチド８５３〜１３５２に対応する遺伝子の５００ヌクレオチド領域を標的とするヘアピンＲＮＡ構築物が設計及び作成された。構築物の要素の順序は、Ｈｅｌｌｓｇａｔｅベクター−アンチセンス配列−転写ターミネーター／ポリアデニル化領域からのイントロンを含むプロモーター−センス配列−ループ配列であった。ｈｐＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号９８として提供されている。センス配列の１０２のシトシンヌクレオチド（Ｃ）がチミジンヌクレオチド（Ｔ）で置き換えられたことを除いて、同じ５００ヌクレオチド領域を標的とする類似のヘアピンＲＮＡをコードする第２のヘアピンＲＮＡ構築物を作成した。キメラＤＮＡが転写され、得られたＧ：Ｕ置換ｈｐＲＮＡが自己アニーリングされた場合、これにより、Ｇ：Ｕ塩基対で塩基対形成されるｄｓＲＮＡ領域のヌクレオチドの１０２／５００＝２０．４％が提供された。Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号９９として提供される。さらに、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＮＣＭ遺伝子の同じ領域を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするキメラＤＮＡを作成した。ｌｅｄＲＮＡをコードするこのキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１００として提供される。
Ｂ．ｎａｐｕｓは、ＢｎａＡ０５ｇ１８１８０Ｄ−１及びＢｎａＣ０５ｇ２７７６０Ｄ−１と呼ばれる、そのＡ及びＣサブゲノムのそれぞれに１つのＦＡＮＣＭ遺伝子を有する。Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子のうちの１つのヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＸＭ＿０２２７１９４８６．１；配列番号１０１で提供される。配列番号１０１のヌクレオチド２８４７〜３３４９に対応する遺伝子の５０３ヌクレオチド領域を標的とするヘアピンＲＮＡをコードするキメラＤＮＡが設計及び作成された。構築物の要素の順序は、Ｈｅｌｌｓｇａｔｅベクター−アンチセンス配列−転写ターミネーター／ポリアデニル化領域からのイントロンを含むプロモーター−センス配列−ループ配列であった。ｈｐＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１０２として提供されている。センス配列の１０７のシトシンヌクレオチド（Ｃ）がチミジンヌクレオチド（Ｔ）で置き換えられたことを除いて、同じ５０３ヌクレオチド領域を標的とする類似のヘアピンＲＮＡをコードする第２のヘアピンＲＮＡ構築物を作成した。キメラＤＮＡが転写され、Ｇ：Ｕ置換ｈｐＲＮＡが自己アニーリングされた場合、これにより、Ｇ：Ｕ塩基対で塩基対形成されるｄｓＲＮＡ領域のヌクレオチドの１０７／５００＝２１．４％が提供された。Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡをコードするキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１０３として提供される。さらに、Ｂ．ｎａｐｕｓのＦＡＮＣＭ遺伝子の同じ領域を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするキメラＤＮＡを作成した。ｌｅｄＲＮＡをコードするこのキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１０４として提供される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるＲＮＡの産生のため、ＤＮＡ調製物は、コード領域の直後に切断される制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断され、ＲＮＡポリメラーゼＴ７でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写され、ＲＮＡを精製後、水性緩衝液で濃縮した。ＬｅｄＲＮＡをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉａｎｓ ＡＧＬ１と共に使用して、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｚｉｐ４変異体の減数分裂前の芽のＦＡＮＣＭ転写物を標的とした。ｚｉｐ４変異体の長角果は、クロスオーバーの形成が弱まるため、野生型の長角果に比べて短く、視覚的に容易に観察でき、繁殖力が低下した。ｚｉｐ４変異体においてＦＡＮＣＭを抑制すると、繁殖力が回復し、長角果の長さが回復することが示されている。
減数分裂前の芽を含むＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ｚｉｐ４花序を、ＡＧＬ１または対照としてＡＧＬ１を含む緩衝液と共に、それぞれ界面活性剤、この場合はＳｉｌｗｅｔｔ−７７の存在下でＦＡＮＣＭを標的とするｌｅｄＲＮＡと接触させた。種子の調節が完了したら、減数分裂前の芽から発達した長角果を切り出し、種子数を決定した。ｌｅｄＲＮＡ処理された試料の１５長角果の中で、２つの長角果は１０個の種子を出し、１つの長角果は９個の種子を持っていたが、対照長角果の種子の数は３〜６個であった。これらの結果は、観察された種子数の増加はｌｅｄＲＮＡによるＦＡＮＣＭ転写レベルの抑制によるものであり、それにより減数分裂のクロスオーバー数が増加し、繁殖力が増加したことを示している。
実施例１７．真菌症に対する耐性のためのＲＮＡ構築物
オオムギ及びコムギのＭｌｏ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
穀物植物の真菌症であるうどんこ病は、オオムギのＢｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ及び関連するコムギのＢｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉの子嚢菌門によって引き起こされる。Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓは、真菌が植物から栄養素を獲得するために真菌と宿主細胞の間の密接な相互作用を含む、繁殖のために植物宿主を必要とするＥｒｙｓｉｐｈａｌｅｓ目の必須の生体栄養性真菌病原体である（Ｇｌａｗｅ，２００８）。真菌は、真菌子嚢胞子または分生子が表面に接触した後、葉、葉鞘または葉耳の表皮層に最初に感染する。葉は感染後しばらくの間、緑で活動的なままであり、その後、粉末状の菌糸塊が成長し、葉は徐々に白化し、枯れる。病気が進行するにつれて、真菌の菌糸体は、菌類の性的子実体である小さな黒い点が点在することがあり得る。うどんこ病は世界中に広がっており、涼しく湿った気候で最も有害である。この病気は、主に穂数を減らし、穀粒のサイズ及び重量を低減させることによって、穀物の収量に影響を与える。現在、病害防除は、条件が冷たく湿っている場合に頻繁に適用する必要があり、費用がかかる殺菌剤を作物に散布することによるか、または耐性品種を栽培することによるものである。さらに、オーストラリアでは、コムギのうどんこ病に殺菌剤耐性が現れている。
オオムギ及びコムギのＭｌｏ遺伝子は、未知のメカニズムによってＢ．ｇｒａｍｉｎｉｓへの感受性を付与するＭｌｏポリペプチドをコードする。植物に固有のＭｌｏ遺伝子ファミリーによってコードされる複数の密接に関連するＭＬＯタンパク質がある。各遺伝子は、原形質膜に局在した未知の生化学的活性の７回膜貫通ドメインタンパク質をコードする。重要なことに、ファミリー内の特定のＭｌｏ遺伝子のみが、うどんこ病感受性遺伝子として機能することができ、これらはＭｌｏタンパク質の細胞質Ｃ末端ドメイン内に保存されたモチーフを持つポリペプチドをコードする。Ｍｌｏポリペプチドが、うどんこ病感受性因子として作用するメカニズムは不明である。おそらくコムギの倍数体の性質のため、天然コムギｍｌｏ変異体の発生は報告されていない。しかしながら、人工的に生成されたｍｌｏ変異体は、疾患に対してある程度の耐性を示すが、多くの場合、穀物収量または葉の早期老化の大幅な低下を示す（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ａｃｅｖｅｄｏ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
六倍体コムギは、それぞれ染色体５ＡＬ、４ＢＬ、及び４ＤＬにあるＴａＭｌｏ−Ａ１、ＴａＭｌｏ−Ｂ１、及びＴａＭｌｏ−Ｄ１と呼ばれるＭｌｏ遺伝子の３つのホモログを有する（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）。遺伝子に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＴａＭｌｏ−Ａ１、ＡＦ３６１９３３及びＡＸ０６３２９８、ＴａＭｌｏ−Ｂ１、ＡＦ３６１９３２、ＡＸ０６３２９４及びＡＦ３８４１４５、及びＴａＭｌｏ−Ｄ１、ＡＸ０６３２９６として入手可能である。Ａ、Ｂ及びＤゲノム上の遺伝子のヌクレオチド配列及びコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ約９５〜９７％及び９８％同一である。３つの遺伝子は全て植物の葉で発現し、植物が成長及び成熟するにつれて発現レベルが上昇する。したがって、本発明者らは、遺伝子間の配列同一性の程度を利用し、高度の配列保存を有する遺伝子領域を標的とする、３つ全ての遺伝子の発現を低減できるｌｅｄＲＮＡ構築物を設計及び作成した。
ＴａＭｌｏ−Ａ１、ＴａＭｌｏ−Ｂ１、及びＴａＭｌｏ−Ｄ１遺伝子の３つ全てを標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡを作成した。遺伝的構築物は、上記のｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はアンチセンス配列であり、連続配列はセンス配列である（図１Ａ）。
配列番号１３６の１４０３〜１５６９と融合したヌクレオチド９１６〜１２４８に対応する、ＴａＭｌｏ標的遺伝子の５００ｂｐヌクレオチド配列を選択した。各ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域の長さは５００ｂｐであった；ｄｓＲＮＡ領域のセンス配列は、途切れのない連続する配列であり、例えば、配列番号１３６の１４０３〜１５６９と融合したヌクレオチド９１６〜１２４８に対応した。ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３７として提供される。
ｌｅｄＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製され、精製して緩衝液に再懸濁した。Ｚａｄｏｋｓ ２３の成長期にあるコムギ植物の葉のゾーンにペイントブラシを使用して、葉あたり１０μｇのｌｅｄＲＮＡを適用した。対照として、いくつかの葉は緩衝液のみを用いてモック処理した。処理した葉試料及び対照の葉試料を採取し、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡのＱＰＣＲアッセイは、３つのＴａＭｌｏ ｍＲＮＡの組み合わせであるＴａＭｌｏ ｍＲＮＡレベルが９５．７％減少したことを示した。Ｚ７３の成長期にある植物もまた処理し、分析した。該植物は、対照の葉試料と比較して、ＱＰＣＲによるＴａＭｌｏ遺伝子発現の９１％の減少を示した。処理した葉の領域で観察されたＴａＭｌｏ遺伝子発現の減少は、処理したゾーンに特有であった−葉の遠位の未処理部分では、ＴａＭｌｏ ｍＲＮＡレベルの減少はなかった。
オオムギｍｌｏ変異体では、様々な疾患防御関連遺伝子の発現が増加することが観察された。したがって、ｌｅｄＲＮＡで処理したコムギの葉を、ＰＲ４、ＰＲ１０、β−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ、胚芽（ｇｅｒｍｉｎ）及びＡＤＰリボシル化因子をコードする防御関連遺伝子のレベルについてＱＰＣＲによりアッセイした。これらの遺伝子のいずれも、対照の葉領域と比較して、処理された葉領域における発現レベルが著しく変化しなかった。
ｌｅｄＲＮＡがＭｌｏ遺伝子発現を減少させることにより耐病性を増加させる能力を試験するために、うどんこ病菌の胞子を葉の処理済みゾーン及び未処理ゾーンに適用した。葉をコムギ植物から切り離し、以前と同様にｌｅｄＲＮＡで処理し、培地（水１リットルあたり５０ｍｇのベンズイミダゾール及び１０ｇの寒天）で維持し、葉が光の下で老化するのを防いだ。２４時間後、葉にうどんこ病菌の胞子を接種し、病気の進行を５〜２４日間追跡した。処理した葉は、白化ゾーンに囲まれた広範囲の菌糸成長を示したｌｅｄＲＮＡを受け取っていないため、対照葉と比較して、真菌の菌糸成長はほとんどまたは全くなく、葉の白化は見られなかった。
さらなる実験では、より低レベルのｌｅｄＲＮＡを適用して、効果的な最小レベルのｌｅｄＲＮＡを特定した。ＲＮＡを２００ｎｇ／μｌ（葉全体で２μｇ）の低濃度で適用した場合、本製剤ではうどんこ病の病変が有意に抑制されたことが示され、抑制ＲＮＡの量を大幅に減らしても真菌の生育及び発育の抑制をもたすことが示唆された。さらに、ｌｅｄＲＮＡ処理の１、２、４、７、及び１４日後に葉に接種し、保護効果がどのくらい続くかを確認した。内因性遺伝子の効果的なサイレンシングは、治療後２４時間後の最初の時点から、内因性遺伝子が依然として９１％の発現低下を示した治療後１４日後の最後の時点までの時間経過を通して観察された。また、植物全体にｌｅｄＲＮＡ調製物を噴霧し、真菌症剤を接種した後、耐病性について試験を行った。
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＶｖＭＬＯ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ及びＶｉｔｉｓ ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａのＭＬＯ遺伝子は、子嚢菌門Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒによって引き起こされる真菌病うどんこ病に対して感受性を付与するＭＬＯポリペプチドをコードする。Ｅ．ｎｅｃａｔｏｒは、真菌が植物から栄養素を獲得するために真菌と宿主細胞の間の密接な相互作用を含む、繁殖のために植物宿主を必要とする必須の生体栄養性真菌病原体である。複数の密接に関連するＭＬＯタンパク質は遺伝子ファミリーによってコードされており、それらは全て植物に固有であり、原形質膜に局在する未知の生化学的活性の７回膜貫通ドメインタンパク質をコードする。重要なことに、ファミリー内の特定のＭＬＯ遺伝子のみが、うどんこ病感受性遺伝子として機能することができ、これらはＭＬＯタンパク質の細胞質Ｃ末端ドメイン内に保存されたモチーフを持つポリペプチドをコードする。ＭＬＯポリペプチドが、うどんこ病感受性因子として作用するメカニズムは不明である。
Ｖｉｔｉｓ種の３つの異なるが関連するＭＬＯ遺伝子、すなわちＶｖＭＬＯ３、ＶｖＭＬＯ４、及びＶｖＭＬＯ１７（Ｆｅｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．による命名法、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，３５：１２５５−１２６６）を標的とするＬｅｄＲＮＡ構築物を、次のように設計及び作成した。例えば、最初のものは、配列番号１３８のヌクレオチド２９７〜１１５６に対応するＶｖＭＬＯ３標的遺伝子の８６０ヌクレオチド配列を選択した。ＶｖＭＬＯ３、ＶｖＭＬＯ４、及びＶｖＭＬＯ１７遺伝子を標的とする３つのｌｅｄＲＮＡ構築物をコードするキメラＤＮＡを作成した。遺伝的構築物は、上記のｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はアンチセンス配列であり、連続配列はセンス配列である（図１Ａ）。各ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域の長さは６００ｂｐであった；ｄｓＲＮＡ領域のセンス配列は、途切れのない連続する配列であり、例えば、配列番号１３８のヌクレオチド４２７〜１１５６に対応した。ｌｅｄＲＮＡの１つをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３９として提供される。
ｌｅｄＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製され、別々に、または３つ全ての混合物として、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ植物、品種Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎの葉に適用される。続いて、うどんこ病菌の胞子を葉の処理済みゾーン及び未処理ゾーンに適用する。定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、標的ｍＲＮＡのレベルの低下が観察された。疾患の進行は経時的に追跡する。ＶｖＭｌｏ３、ＶｖＭｌｏ４またはＶｖＭｌｏ１１を標的とした１μｇ／ｍｌのｌｅｄＲＮＡ溶液を適用することにより、ＶｖＭｌｏ４の大幅な下方制御が観察された。
真菌遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
エルゴステロールの合成ならびに真菌の生存及び増殖に必要な遺伝子である真菌病原体Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉのＣｙｐ５１遺伝子のコード領域に対してＬｅｄＲＮＡ構築物を設計した。遺伝的構築物は、上記のｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はアンチセンス配列であり、連続配列はセンス配列である（図１Ａ）。単一のｌｅｄＲＮＡ構築物は、Ｒ．ｓｏｌａｎｉの２つの遺伝子を標的とするように設計されており、ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は各遺伝子から３５０ｂｐを含み、ｄｓＲＮＡ領域内のセンス配列は、例えば、配列番号１４０のヌクレオチド８８４〜１２３３及び配列番号１４１のヌクレオチド１７４〜５２３に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡの１つをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１４２として提供される。ｌｅｄＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製し、Ｒ． ｓｏｌａｎｉ菌糸体を接種した培養物１００μｌあたり５μｇの濃度で培地に適用した。真菌の成長は、０時の時点及び翌週の各日に、培養物の光学密度を６００ｎｍで読み取ることにより測定した。ｌｅｄＲｓＣｙｐ５１を含む培養物におけるＲ．ｓｏｌａｎｉの増殖は、Ｒ．ｓｏｌａｎｉに対応する標的が存在しないＲＮＡ緩衝液または対照のｌｅｄＧＦＰのいずれかを含む対照培養物よりも有意に少なかった。
また、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ単離株９４．４８のＣｅｓＡ３セルロース合成酵素遺伝子のコード領域に対してｌｅｄＲＮＡコード構築物を設計し、作成した。遺伝的構築物は、上記のｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はアンチセンス配列であり、連続配列はセンス配列である（図１Ａ）。ｌｅｄＲＮＡ構築物は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉのＣｅｓＡ３遺伝子を標的とするように設計され、ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は、遺伝子のコード領域から５００ｂｐを含み、ｄｓＲＮＡ領域内のセンス配列は、例えば、配列番号１４３のヌクレオチド８８４〜１２３３に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡの１つをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１４４として提供される。ｌｅｄＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、１００μｌの培養物あたり３μｇの割合で培地に適用した。ＰｃＣｅｓＡ３を標的とするｌｅｄＲＮＡを用いた培養物では、モック処理（ＲＮＡ緩衝液のみ）またはｌｅｄＧＦＰ処理した培養物と比較して、方向性のある菌糸の成長が大幅に喪失することが観察された。方向性のある成長の喪失及びその結果として生じる非晶質で球根状の成長パターンは、細胞壁の生合成が中断された細胞を連想させ、したがって、ＰｃＣｅｓＡ３遺伝子のサイレンシングと一致していた。
実施例１８．植物の他の遺伝子を標的とするＲＮＡ構築物
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＴｏｒ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
ラパマイシンの標的（ＴＯＲ）遺伝子は、真核細胞の多くの細胞機能を制御する、例えば、様々なホルモン、ストレス、及び栄養素の利用可能性に反応するセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードする。それは、成長のために細胞資源を最適化するために翻訳機構を調節するマスターレギュレーターとして知られている（Ａｂｒａｈａｍ，２００２）。少なくとも動物及び酵母ではＴＯＲポリペプチドは、抗真菌剤ラパマイシンによって不活性化されるため、ラパマイシンの標的（Ｔａｒｇｅｔ ｏｆ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）と表記される。植物では、ＴＯＲのホモ接合性変異体の致死率によって示されるように（Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＴＯＲは発育中の種子の胚発生に不可欠であり、成長の手がかりを細胞代謝へ結びつけるのに関与している。ＴＯＲ遺伝子発現の下方制御は、脂肪酸合成を増加させ、植物組織の脂質含有量を増加させると考えられていた。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＴＯＲ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ構築物、ｃＤＮＡタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号１０５として提供され、分割配列がセンス配列であり、連続する配列がアンチセンス配列であるｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して設計及び作成した（図１Ｂ）。標的領域は、配列番号１０５のヌクレオチド２５９５〜３１９７に対応する６０３ヌクレオチド長であった。ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は６０３ｂｐ長であった；ｄｓＲＮＡ領域のアンチセンス配列は、配列番号１０５のヌクレオチド２５９５〜３１９７の相補鎖に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１０６として提供される。ｌｅｄＲＮＡ構築物をコードする遺伝的構築物のＤＮＡ調製物を、コード領域の直後にＤＮＡを切断した制限酵素ＭｌｙＩで切断し、ＲＮＡポリメラーゼＳＰ６でｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ＲＮＡを精製後、水性緩衝液に濃縮した。ｌｅｄＲＮＡの試料をＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の上面に適用した。２日後と４日後に、処理した葉試料を採取し、乾燥し、総脂肪酸含有量を定量的ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で測定した。ＴＯＲ ｌｅｄＲＮＡで処理した葉の試料は、総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量が、対照（未処理）試料で観察された２．５〜３．０％（ＴＦＡの重量／乾燥重量）から、ｌｅｄＲＮＡ処理試料で３．５〜４．０％に増加を示した。これは、対照と比較してＴＦＡ含有量が１７％〜６０％増加したことを表し、ｌｅｄＲＮＡ処理した組織ではＴＯＲ遺伝子発現が減少していたことを示す。
Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅのＡＬＳ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子は、植物及び微生物に見られる酵素（ＥＣ ２．２．１．６）をコードし、分岐鎖アミノ酸であるロイシン、バリン、及びイソロイシンの合成の最初のステップを触媒する。ＡＬＳ酵素は、ピルビン酸からアセト乳酸への変換を触媒し、さらに他の酵素によって分岐鎖アミノ酸に変換される。ＡＬＳの阻害剤は、除草剤、例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシベンゾエート、及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン類などの除草剤として使用される。
ｌｅｄＲＮＡが植物へのＲＮＡの外因性送達によってＡＬＳ遺伝子発現を減少させることができるかどうかを試験するため、オオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅのＡＬＳ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードする遺伝的構築物を設計及び作成した。Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅ ＡＬＳ遺伝子配列は、本明細書において配列番号１０７（アクセッション番号ＬＴ６０１５８９）として提供される。遺伝的構築物は、ｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はセンス配列であり、連続配列はアンチセンス配列である（図１Ｂ）。標的領域は、配列番号１０７のヌクレオチド１３３３〜１９３８に対応する６０６ヌクレオチド長であった。ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は６０６ｂｐ長であった；ｄｓＲＮＡ領域のアンチセンス配列は、配列番号１０７のヌクレオチド１３３３〜１９３８の相補鎖に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１０８として提供される。コード領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にあった。
ｌｅｄＲＮＡをコードする遺伝的構築物は、制限酵素ＭｌｙＩで消化され、これはｌｅｄＲＮＡコード領域の下流を切断し、転写キットの指示にしたがってＲＮＡポリメラーゼＳＰ６でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された。ＲＮＡをオオムギ植物の葉の上面に適用した。ＲＮＡを処理した葉の試料から抽出した（２４時間後）。定量的逆転写ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）アッセイを、ＲＮＡ試料で実行した。アッセイは、ＡＬＳ ｍＲＮＡのレベルがｌｅｄＲＮＡ処理組織で減少したことを示した。（処理済み及び未処理の植物の合計ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理し、定量し、プライマーＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣを使用して２μｇ逆転写した。ｃＤＮＡは、フォワードプライマーＴＡＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＣ及びリバースプライマーＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣを使用した定量ＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＡＬＳ ｍＲＮＡ発現は、Ｈｏｒｅｎｄｅｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ単離Ｈ１リコピンシクラーゼ遺伝子に対して標準化した。ＡＬＳの発現は、ＬＥＤ処理植物で８２％減少した。
コムギ及びオオムギのＮＣＥＤ１及びＮＣＥＤ２遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
植物では、植物ホルモンのアブシシン酸（ＡＢＡ）は、カロテノイド前駆体から合成され、合成経路の最初の関与段階は、９−ｃｉｓキサントフィルをキサントキシンに切断する酵素９−ｃｉｓエポキシ−カロテノイドジオキシゲナーゼ（ＮＣＥＤ）によって触媒される（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ホルモンＡＢＡは種子の休眠を促進することが知られており（Ｍｉｌｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ストレス応答などの他のプロセスにも関与している。ＮＣＥＤ遺伝子の発現が増加すると、ＡＢＡ濃度が増加し、これにより休眠が促進されると考えられていた。コムギ及びオオムギなどの穀物には、ＮＣＥＤ１及びＮＣＥＤ２と呼ばれる２つのＮＣＥＤアイソザイムがあり、別々の相同遺伝子によってコードされる。
ＡＢＡの破壊に関しては、酵素ＡＢＡ−８−ヒドロキシラーゼ（ＡＢＡ８ＯＨ−２、ＣＹＰ７０７Ａ２としても知られている）が、ＡＢＡを異化作用のステップとしてヒドロキシル化し、休眠及び種子発芽を破壊する。
オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅのＨｖＮＣＥＤ１（アクセッション番号ＡＫ３６１９９９、配列番号１０９）またはＨｖＮＣＥＤ２（アクセッション番号ＡＢ２３９２９８；配列番号１１０）をコードする遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ構築物と、コムギの対応する相同遺伝子は、オオムギ及びコムギ植物のトランスジェニック発現のために設計されている。これらの構築物は、コムギならびにオオムギのＮＣＥＤ１及びＮＣＥＤ２遺伝子の高度に保存された領域を使用し、コムギ及びオオムギのヌクレオチド配列は、保存領域において約９７％同一である。遺伝的構築物は、上記のｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はアンチセンス配列であり、連続配列はセンス配列である（図１Ａ）。標的領域は、配列番号１０９のヌクレオチド４３５〜１０３５に対応する６０２ヌクレオチド長であった。ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は６０２ｂｐ長であった；ｄｓＲＮＡ領域のセンス配列は、配列番号１１０のヌクレオチド４３５〜１０３５に対応する途切れのない連続する配列であった。ＮＣＥＤ１及びＮＣＥＤ２ ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１１１及び１１２として提供される。
同様に、コムギＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ及びオオムギＨ．ｖｕｌｇａｒｅのＡＢＡ−ＯＨ−２遺伝子（アクセッション番号ＤＱ１４５９３３、配列番号１１３）を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物を作成した。標的領域は、配列番号１１３のヌクレオチド６３９〜１２３８に対応する６００ヌクレオチド長であった。ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は６００ｂｐ長であった；ｄｓＲＮＡ領域のセンス配列は、配列番号１１３のヌクレオチド６３９〜１２３８に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡをコードするこのキメラＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１１４として提供される。
ｌｅｄＲＮＡをコードするキメラＤＮＡを、種子の発生において含まれるほとんどの組織において構成的に発現するＵｂｉ遺伝子プロモーターの制御下で発現ベクターに挿入した。発現カセットを切り出し、バイナリーベクターに挿入した。これらは、形質転換コムギ植物を産生するために使用した。
トランスジェニックコムギ植物を成熟するまで育て、それらから種を得、ＮＣＥＤまたはＡＢＡ−ＯＨ−２遺伝子の発現低下及び遺伝子発現低下に対応する穀物休眠への影響を分析した。変化した休眠の範囲における表現型の範囲を予測した。変化した表現型の範囲を調整するため、二本鎖ＲＮＡ領域にＧ：Ｕ塩基対を有するｌｅｄＲＮＡの発現、特に、二本鎖領域のヌクレオチドの総数の割合として、ｌｅｄＲＮＡの二本鎖領域のヌクレオチドの１５〜２５％がＧ：Ｕ塩基対に関与しているｌｅｄＲＮＡの発現のために、改変された遺伝的構築物を生成した。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＥＩＮ２遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
実施例１０で説明したように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＥＩＮ２遺伝子は、エチレン知覚に関与する受容体タンパク質をコードする。ＥＩＮ２変異実生は、ＡＣＣで発芽すると、野生型実生と比較して胚軸の伸長を示す。遺伝子は、種子の発芽後すぐに実生に発現するため、トランスジェニック手段によるｌｅｄＲＮＡの送達は、事前形成されたＲＮＡの外因性送達と比較して、ＥＩＮ２の下方制御の程度を試験するための最も適切なアプローチと考えられた。
標的遺伝子ｍＲＮＡの４００ヌクレオチド領域を標的として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＥＩＮ２遺伝子（配列番号１１５）を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物を設計した。構築物は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ植物においてｌｅｄＲＮＡを発現させるために、３５Ｓプロモーターを含むベクターにｌｅｄＲＮＡをコードする配列（配列番号１１６）を挿入することにより作成される。トランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物を産生し、ＱＰＣＲによるＥＩＮ２遺伝子の発現の減少及びＡＣＣの存在下での胚軸長アッセイについて試験した。ＥＩＮ２発現レベルの低下及び胚軸長の増加は、一部のトランスジェニック系統の植物において観察される。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＣＨＳ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
植物のカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子は、フラボノイド生合成で最初に関与する酵素である、ナリンゲニンカルコンへの４−クマロイル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの変換を触媒する酵素をコードする。フラバノイドは、主に植物に見られる有機化合物の一種で、防御メカニズム及びストレス耐性に関与している。
標的遺伝子ｍＲＮＡの３３８ヌクレオチド領域を標的として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＣＨＳ遺伝子（配列番号１１７）を標的とするｌｅｄＲＮＡ構築物を設計した。構築物は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ植物においてｌｅｄＲＮＡを発現させるために、３５Ｓプロモーターを含むベクターにｌｅｄＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号１１８）を挿入することにより作成される。トランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物は、バイナリーベクターの遺伝的構築物による形質転換によって産生され、ＱＰＣＲによるＣＨＳ遺伝子の発現の減少及びフラボノイドの産生の減少について試験した。ＣＨＳ発現レベルの低下及びフラボノイドのレベルの低下は、一部のトランスジェニック系統の植物、例えばトランスジェニック種子の種皮で観察された。
Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓのＬａｎＲ遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
狭葉ルピナス、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．，のＬａｎＲ遺伝子は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）により引き起こされるウイルス性疾患に対する耐性を付与する、タバコＮ遺伝子に関連するポリペプチドをコードする。
Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓのＬａｎＲ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ分子を生成するためのキメラＤＮＡ（アクセッション番号ＸＭ＿０１９６０４３４７、配列番号１１９）を設計及び作成した。遺伝的構築物は、上記のｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はアンチセンス配列であり、連続配列はセンス配列である（図１Ａ）。ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１２０として提供される。ｌｅｄＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により産生、精製、及び濃縮され、ＲＮＡのアリコートがＬａｎＲ遺伝子を含むＬ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ植物の葉に適用された。ウイルスの試料を処理した植物及び未処理の植物に適用し、疾患の症状を数日後に比較した。
ＶＲＮ２遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡｉによるコムギの春化応答性の付与
コムギＺＣＣＴ１遺伝子のホモログであるＴＧＡＣｖ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３７４４１６＿５ＡＬ、ＴＧＡＣｖ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３２０６４２＿４ＢＬ、及びＴＧＡＣｖ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３４２６０１＿４ＤＬで同定されたコムギＶＲＮ２Ａ、ＶＲＮ２Ｂ、ＶＲＮ２Ｄ候補遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ５８４８１．１）は、ｌｅｄＲＮＡｉ構築物の設計の標的として同定した。ＶＲＮ２Ｂ遺伝子の３０９ｂｐ領域を、ＬｅｄＴａＶＲＮ２と指定されたｌｅｄＲＮＡｉ構築物のｄｓＲＮＡ領域に使用した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりｌｅｄ ＲＮＡｉを作成し、水で希釈した。この溶液を用いて、４℃で３日間、発芽用のコムギ粒を浸漬した。春化感受性コムギ品種ＣＳＩＲＯ Ｗ７の種子を使用した。処理した種子を土壌に植え付け、得られた植物の生育から花の発育への移行を経時的に観察した。根からの出穂で示される開花時期及び開花時期の主茎の葉数を記録した。ＬｅｄＴａＶＲＮ２を用いてインキュベートした種子由来の植物は、緩衝液のみまたは非特異的ｄｓＲＮＡ対照を用いてインキュベートした種子由来の植物よりも、平均して少なくとも１７日早く開花した。さらに、ＬｅｄＴａＶＲＮ２をインキュベートした種子由来の植物は、開花時の主茎の葉の数が平均２．３枚少なく、葉の生産に専念する節数が少なく、花／穀粒に専念する節数が多いことが示された。
実施例１９．昆虫遺伝子を標的とするＲＮＡ構築物
導入
アブラムシは吸汁性昆虫であり、植物の樹液を摂取することにより植物に直接的に、場合によっては植物に病気を引き起こす様々なウイルスの伝播を介して間接的に、相当な、時に深刻な損傷を与えた。Ｂｔ毒素は、場合によっては、咀嚼性昆虫から作物を保護するのに効果的であったが、一般に、吸汁性昆虫には効果がない。耐性遺伝子を含む植物栽培品種を使用することは、アブラムシを防除する効果的な方法であり得る。しかし、ほとんどの耐性遺伝子は特定のアブラムシ種またはバイオタイプに非常に特異的であり、遺伝的またはエピジェネティックな変化を通じて新しいバイオタイプが急速に進化するため、抵抗力が頻繁に克服される。さらに、耐性遺伝子は、多くの作物では利用できないか、または広範な宿主種に寄生するモモアカアブラムシなどの特定の万能アブラムシ種には存在しない可能性がある。現在、アブラムシは主に殺虫剤の頻繁な散布によって防除されており、これによりアブラムシに殺虫剤耐性が生じている。例えば、オーストラリアでは、モモアカアブラムシに対して有効な殺虫剤作用機序群は１つだけであるが、これは他の全ての登録された殺虫剤に対する耐性が獲得されたためである。
ＲＮＡｉを介した遺伝子サイレンシングは、いくつかの研究でいくつかのアブラムシ種の研究ツールとして有用であることが示されている（総説については、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６を参照のこと）が、アブラムシの攻撃から植物を効果的に保護することは示されていない。それらの研究では、アブラムシの成長及び発生、寄生、または摂取プロセスに関与する主要な遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、アブラムシへの直接注入またはｄｓＲＮＡを含む人工飼料のアブラムシへの給餌によって送達した。
吸汁性昆虫を防除するための本明細書に記載のｌｅｄＲＮＡ分子などの改変ＲＮＡｉ分子の可能性を試験するため、発明者らは、いくつかの理由から、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）を吸汁性昆虫のモデルとして選択した。第１に、モモアカアブラムシは多食性の昆虫であり、世界中の主要な穀物及び園芸作物を含む幅広い宿主植物種に寄生している。第２に、モモアカアブラムシは、いくつかのキャノーラ栽培地域で多大な被害を与えているビート西部萎黄ウイルスなどのいくつかの壊滅的なウイルスの伝播の原因である。この研究では、最初に２つのアブラムシ遺伝子を下方制御の標的遺伝子として選択し、１つはキーエフェクタータンパク質（Ｃ００２）をコードし、もう１つは活性化プロテインキナーゼＣ（Ｒａｃｋ−１）の受容体をコードした。Ｃ００２タンパク質は、アブラムシの宿主植物での摂餌に不可欠なアブラムシ唾液腺タンパク質である（Ｍｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。Ｒａｃｋ１は、主にシグナル伝達カスケードに関与する酵素である活性化プロテインキナーゼＣに結合する細胞内受容体である（ＭｃＣａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｅｄｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＭｐＣ００２は主にアブラムシの唾液腺で発現し、ＭｐＲａｃｋ１は主に腸で発現する。以前の研究では、直接注入または人工飼料給餌によるＲＮＡｉの使用は、試験したいくつかのアブラムシ種の死をもたらした（Ｐｉｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐｉｔｉｎｏ ａｎｄ Ｈｏｇｅｎｈｏｕｔ，２０１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
材料及び方法：アブラムシの培養及び植物材料
モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）を、西オーストラリアで捕獲した。各実験の前に、アブラムシを、昆虫室の周辺光の下でラディッシュ植物（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）上で飼育した。アブラムシは、細かいペイントブラシで実験用人工飼料ケージに移した。
アブラムシが摂取するための人工飼料の成分は、Ｄａｄｄ ａｎｄ Ｍｉｔｔｌｅｒ（１９６６）に記載されているものと同じであった。アブラムシ人工飼料に使用した装置は、直径１ｃｍ、高さ１ｃｍのプラスチック製チューブを使用した。ｌｅｄＲＮＡを含有または非含有の１００μｌの人工アブラムシ飼料を、パラフィルムの２つの層の間に封入して、飼料袋を作った。その袋の上に、アブラムシが動き回って、引き伸ばされたパラフィルムの最上層にスタイレットを刺すことにより餌を摂取するための部屋を用意した。細かいペイントブラシを使用して、８匹の１齢または２齢の幼虫をアブラムシの部屋に静かに移した。実験は２０℃の生育箱で実施した。
１回の実験で使用されたタバコ及びダイコンの葉は、２２℃で１６時間の明／８時間の暗サイクルの下、土壌で育てられた植物から採取した。切除したダイコンの葉を用いた実験では、茎の断片（長さ約２ｃｍ）に付着した小さいダイコンの葉（２〜４ｃｍ２）を切除した。葉の鮮度を維持するために、直径５ｃｍのペトリ皿内の水１００ｍｌあたり１．５ｇのバクト寒天及び１．１６ｇのアクアゾルを含む培地に茎を挿入した。アブラムシを微細ペイントブラシにより葉に移した。葉及びアブラムシを入れたペトリ皿は、２０℃で明（１６時間）／暗（８時間）のサイクルで生育箱内で保管した。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、標準的な方法を用いて、１つ以上のＴ７プロモーター及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写により調製した。
ＭｐＣ００２及びＭｐＲａｃｋ−１遺伝子及びＬｅｄＲＮＡ構築物
標的遺伝子として試験したモモアカアブラムシＭｐＣ００２及びＭｐＲａｃｋ−１遺伝子は、Ｐｉｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１；２０１２）に記載のものと同じであった。両方の遺伝子のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｗｅｂサイト、ＭｐＣ００２（＞ＭＹＺＰＥ１３１６４＿０＿ｖ１．０＿００００２４９９０．１｜８９４ｎｔ）及びＭｐＲａｃｋ−１（＞ＭＹＺＰＥ１３１６４＿０＿ｖ１．０＿０００１９８３１０．１｜９６０ｎｔ）から得られた。２つの遺伝子のｃＤＮＡ配列は、配列番号１２３及び１２４として本明細書に提供されている。ＬｅｄＲＮＡ構築物は、以前の実施例で説明したのと同じ方法で設計した。ｌｅｄＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列は、配列番号１２５及び１２６として本明細書に提供され、ｌｅｄＲＮＡを合成するための転写テンプレートとして使用された。ＭｐＣ００２及びＭｐＲａｃｋ−１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ分子をコードするベクターＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写用のプラスミドＤＮＡを調製するためにＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに、ｉｎ ｖｉｖｏ（細菌内）転写用にＥ．ｃｏｌｉ株ＨＴ１１５に導入した。
アブラムシのパフォーマンスの低下に対するｌｅｄＲＮＡ分子の有効性
ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡがアブラムシのパフォーマンスに影響したかどうかを調べるため、各ｌｅｄＲＮＡを、実施例１に記載されているように人工飼料手段を介してアブラムシに送達した。各実験では、１０回の生物学的反復を設定し、各生物学的反復には、８匹の１〜２齢のモモアカアブラムシの幼虫がいた。各実験の対照は、同等の濃度の関連しないｌｅｄＲＮＡ、すなわちｌｅｄＧＦＰを使用した。
各ｌｅｄＲＮＡ分子の濃度が５０ｎｇ／μｌと低い場合、ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１ ｌｅｄＲＮＡのいずれかを含む人工飼料を摂取した後のアブラムシの生存は、対照ｌｅｄＧＦＰと有意差がなかった。しかしながら、ＭｐＣ００２遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡは、モモアカアブラムシの繁殖率を大幅に低下させた（Ｐ＜０．０５）（図３７Ａ）。成虫アブラムシ１匹あたりに生まれる幼虫の平均数は、対照ｌｅｄＲＮＡを含む対照食餌を維持した成虫から生まれる幼虫の数と比較して、約７５％減少した。２００ｎｇ／μｌの高濃度では、ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１のいずれかを標的とするｌｅｄＲＮＡは、成虫のアブラムシの死亡率を増加させた（図３７Ｂ）。ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１ ｌｅｄＲＮＡを含む食餌でのアブラムシの生存率の低下もまた２４時間後に観察され、実験の５日間にわたって継続した。結果は、必須のアブラムシ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡの使用がアブラムシの死を引き起こし、アブラムシの繁殖を減らすことができることを示した。各ｌｅｄＲＮＡの有効性は、標的遺伝子の同じ領域を標的とする別々にアニーリングされたセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖で構成される二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡｉ）と比較した。
アブラムシによるｌｅｄＲＮＡ分子の取り込み
アブラムシ内のｌｅｄＲＮＡの取り込み及び分布を追跡するため、ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡを、実施例１に記載されているように、合成プロセス中にＣｙ３（シアニン色素標識ヌクレオチド三リン酸）で標識した。Ｃｙ３標識は、従来のｄｓＲＮＡ分子の生物学的機能に影響を及ぼさないことが報告されているため、蛍光による検出用の標識として使用することができる。標識されたｌｅｄＲＮＡを摂取したアブラムシは、Ｌｅｉｃａ ＥＬ ６０００マイクロシステム機器を使用して共焦点顕微鏡を使用して検査した。ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１を標的とするＣｙ３標識ｌｅｄＲＮＡは、アブラムシの腸で人工飼料を摂食してから数時間以内に検出でき、その後、生殖システム、及び摂取していた成虫の子孫である新生幼虫でも検出できた。結果は、消化器系の機能または生殖に重要なアブラムシ遺伝子が摂取を通じてｌｅｄＲＮＡ分子の効果的な標的になり得ることを示した。
ＬｅｄＲＮＡの安定性
食餌中及び摂取させたアブラムシから回収されたｌｅｄＲＮＡの安定性を調べるため、標識されたｌｅｄＲＮＡ分子を含む食餌を摂取させた後、人工飼料及びアブラムシの甘露からＲＮＡを回収した。ＲＮＡ試料をゲル上で電気泳動し、蛍光検出により調べた。摂取前のｌｅｄＭｐＣ００２ ＲＮＡは、アガロースゲル上で約７００ｂｐの単一の産物を明確に示した。人工飼料から回収されたＲＮＡは、１００〜７００ｂｐサイズのＲＮＡのスメアを示し、これは、２５日間室温で食餌に曝露した後に、ある程度の分解を示すが、それでもほとんど無傷である。アブラムシの甘露から回収したＲＮＡは、３５０〜７００ｂｐの範囲でＲＮＡの蛍光を示したため、やはりほとんど無傷であった。一部のｌｅｄＲＮＡの分解にもかかわらず、ｌｅｄＲＮＡ分子の大部分は、人工飼料及びアブラムシの甘露でも、かなりの時間無傷のままでいることができた。ｌｅｄＲＮＡ分子のこの安定性の程度は、外因的に適用された時にｌｅｄＲＮＡが活性であり、活性を保持することを可能にするはずである。
植物の葉による標識ｌｅｄＲＮＡの吸収
Ｃｙ３標識ｌｅｄＭｐＣ００２ ＲＮＡを、葉の組織に浸透できたかどうかを確認するために、タバコの葉の上面にペイントした。Ｃｙ３標識ｌｅｄＭｐＣ００２（１μｇ／μｌ濃度）の１０マイクロリットルを直径２ｃｍの円にペイントし、適用した領域に黒いマーカーペンで印を付けた。Ｌｅｉｃａ ＥＬ ６０００マイクロシステム機器を使用して、５２５ｎｍの励起での葉の蛍光画像を５時間にわたって取得して、ペイントされた組織をペイントされていない組織と比較した。Ｃｙ３標識は、適用後１時間以内に葉肉組織で明確に検出できたため、葉の表面のワックス状のキューティクル層を明確に貫通していた。蛍光レベルは２時間で増加し、５時間の時点まで維持された。ｌｅｄＲＮＡ分子が細胞に入ったのか、細胞の核に入ったのかは明らかではなかった。しかしながら、吸汁性昆虫は植物の葉及び茎の師部要素から特に摂取するため、アブラムシ遺伝子のサイレンシングには植物細胞へのＲＮＡ伝達は必要なかった。実験は、ｌｅｄＲＮＡ分子が局所適用を通じて植物組織で見つかることを示した。
アブラムシによる局所的ＬｅｄＲＮＡの取り込み
アブラムシが植物から局所的に適用されたｌｅｄＲＮＡを取り込むことができるかを確認するために、Ｃｙ３標識ｌｅｄＧＦＰ ＲＮＡをダイコンの葉に塗布した。各Ｃｙ３標識ｌｅｄＧＦＰ（１０μｇ／μｌ濃度）の１０マイクロリットルを、切除した小さいダイコンの葉（約２ｃｍ２）に塗布した。対照葉には、等量の標識されていないｌｅｄＧＦＰを塗布した。標識したダイコンの葉及び対照のダイコンの葉には、様々な生育段階にある８匹のアブラムシをそれぞれ寄生させた。葉及びアブラムシの蛍光の画像は、タバコの葉について上記の方法で撮影した。対照葉及びアブラムシでは検出可能な蛍光はなかったが、Ｃｙ３標識ｌｅｄＧＦＰを塗布した葉では高い蛍光を示した。アブラムシは、Ｃｙ３標識ｌｅｄＲＮＡを含む葉を摂食後２４時間以内に、全身に強い蛍光を示したが、他の身体部位よりも腸及び脚でより顕著であった。この実験では、アブラムシが植物から局所適用することによりｌｅｄＲＮＡ分子を取り込むことができたことが示された。
追加のアブラムシのＲＮＡｉ標的遺伝子のスクリーニング
より多くのアブラムシ標的遺伝子を同定するために、合計１６のアブラムシ遺伝子をＲＮＡｉ標的としての適合性を評価した。選択した候補遺伝子は、アブラムシの発生、生殖、摂食または解毒に関与していた。標的遺伝子のｍＲＮＡの領域に対応するセンス配列及びとアンチセンス配列を含むことによって各遺伝子を標的とする従来のｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡｉ）を、アブラムシ人工飼料に飼料１μｌあたり２μｇのＲＮＡ濃度で補充した。アブラムシの生存率及び生殖率への影響は、アブラムシＲＮＡｉ標的遺伝子の適合性を判定するために使用した。調査した１６の遺伝子のうち、９の遺伝子がアブラムシの生存率及び／または生殖率の低下を示した。ＭｐＣ００２及びＭｐＲａｃｋ−１に加えて、他の適切な標的遺伝子は、以下のポリペプチドをコードする遺伝子、及びそれらがアブラムシにおいて有する機能の種類であった：チューブリン（アクセッション番号ＸＭ＿０２２３２１９００．１、細胞構造）、インスリン関連ペプチド（ＸＭ＿０２２３１３１９６．１、胚発生）、Ｖ型ＡＴＰａｓｅ Ｅサブユニット（ＸＭ＿０２２３１２２４８．１、エネルギー代謝）、ギャップハンチバック（ＸＭ＿０２２３１３８１９．１、成育及び発育）、脱皮（ｅｃｄｙｓｉｓ）誘発ホルモン（ＸＭ＿０２２３２３１００．１、発育−脱皮（ｍｏｕｌｔｉｎｇ））、短い神経ペプチドＦ（ＸＭ＿０２２３１４０６８．１、神経系）及びロイコキニン（ＸＭ＿０２２３０８２８６．１、水分バランス及び食物摂取量）。ほとんどの遺伝子について、ＲＮＡｉの影響は、生存率よりもアブラムシの生殖に頑強に、より強く現れたと考えられた、すなわち生殖への効果が大きかった。
外因性ＲＮＡｉのアブラムシに対する継代効果
ＲＮＡｉ効果がどのくらい持続し得るかを調べるために、２齢期または３齢期の発育段階のアブラムシに、ＭｐＣ００２、ＭｐＲａｃｋ−１、ＭｐＧｈｂを標的としたｄｓＲＮＡｉを補充したか、または対照ｄｓＧＦＰを補充した人工飼料を１０日間摂食させた。その後、生存しているアブラムシを、ＲＮＡを適用することなく、切除したダイコンの葉に移した。３つの遺伝子全てについて、６日までは、生存しているアブラムシあたりの幼虫の生産数は、対照のｄｓＧＦＰ ＲＮＡ分子または水を餌としたアブラムシの数よりも有意に少なかった。ＭｐＣ００２及びＭｐＲａｃｋ−１ ｄｓＲＮＡについては、ダイコン葉での低い生殖率を少なくとも９日間維持した。ｄｓＲＮＡｉがその後の世代に影響を及ぼすかを調べるために、３日以内にダイコン葉上で生まれたアブラムシのうち、ＲＮＡを含む餌を直接摂食しなかったものを新鮮な切除したダイコンの葉上で除去し、その生存率及び生産率を１５日間モニターした。生存率に有意差はなかったが、ＭｐＣ００２、ＭｐＲａｃｋ−１またはＭｐＧｈ ｄｓＲＮＡを添加した飼料を摂食した母アブラムシから生まれたアブラムシは、いずれも対照ｄｓＧＦＰまたは水を添加した飼料を摂食した母アブラムシと比較して、有意に少ない数のアブラムシを産生した。その結果、親アブラムシにｄｓＲＮＡ分子を給餌したことによる効果は、子孫アブラムシでも持続することが明らかになった。
結論
本研究の目的は、世界中で問題となっている吸汁性害虫の主要な群であるアブラムシの防除のために、ｌｅｄＲＮＡ設計を使用して外因性ＲＮＡｉの適用を試験すること、及び好適な標的遺伝子を同定することであった。アブラムシは外因性ＲＮＡのプロセシングを行うためのＲＮＡｉ機構を持っていることが知られている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本明細書において、ＭｐＣ００２またはＭｐＲａｃｋ−１遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ分子を含む人工飼料による経口送達は、アブラムシの死亡率を引き起こし、アブラムシの生殖を減らすことができた。分子は、２つの異なる標的遺伝子（１つはエフェクタータンパク質Ｃ００２をコードし、もう１つは活性化タンパク質キナーゼ（Ｒａｃｋ−１）の受容体であり、これらは、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）の摂食及び発達に不可欠である）に対して試験した。５０ｎｇ／μｌの低濃度で人工飼料に添加すると、これらの遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡ分子は、アブラムシの生殖を有意に減少させた。２００ｎｇ／μｌの高濃度では、ｌｅｄＲＮＡはアブラムシの死亡率も増加させた。ｌｅｄＲＮＡの取り込みがＣｙ３標識を使用して調査された場合、ｌｅｄＲＮＡ分子は、人工飼料を摂取してから数時間以内にアブラムシの腸で、続いて生殖システムで、さらには摂取させた成虫の子孫である新生幼虫でも観察された。従来のｄｓＲＮＡを用いた結果で示されたように、アブラムシの生殖に対するｌｅｄＲＮＡの効果は少なくとも２世代にわたって持続する可能性がある。
また、ｌｅｄＲＮＡ分子は、人工飼料において少なくとも３週間半にわたってほぼ無傷のままであることが示された。ほぼ無傷のｌｅｄＲＮＡ分子は、アブラムシからの排泄物であるアブラムシ甘露にも見られた。標識ｌｅｄＲＮＡを植物の葉に適用した場合、アブラムシが摂取する師部に入る可能性があり、アブラムシ内で検出された。これらの結果を合わせると、アブラムシ及び他の吸汁性昆虫の防除に実用的なアプローチを提供する、食餌を通じた外因性送達によるものを含めて、アブラムシ及び他の吸汁性昆虫の防除に使用されるｌｅｄＲＮＡの強い可能性が示された。これらのＲＮＡ分子は、アブラムシ及び他の吸汁性昆虫を防除するために、師部組織でのＲＮＡの合成を促進するプロモーターを使用して、トランスジェニック植物で発現させることもできる。さらに、分子のｄｓＲＮＡ領域内に１０〜３０％のＧ：Ｕ塩基対を含むｌｅｄＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］またはヘアピン［Ｇ：Ｕ］ＲＮＡを使用することで、これらの分子をコードする導入遺伝子の自己サイレンシングが減少することにより、これらのｄｓＲＮＡ分子の蓄積レベルが増加することに基づいて、さらに優れた防除がもたらされることが期待されている。
実施例２０．他の昆虫遺伝子を標的とするＲＮＡ構築物
害虫の遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の害虫であり、オオタバコガ（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）またはオオタバコガ（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）としても知られている。Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａの幼虫は、多くの重要な栽培作物を含む広範囲の植物を摂取し、年間数十億ドル相当のかなりの作物被害を引き起こす。幼虫は多食性で全世界的な害虫であり、綿、トウモロコシ、トマト、ヒヨコマメ、キマメ、アルファルファ、イネ、ソルガム、及びササゲなどの幅広い植物種を摂取することができる。
Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａ ＡＢＣトランスポーターホワイト遺伝子（ＡＢＣホワイト）は、昆虫の幼虫のｌｅｄＲＮＡ及びｌｅｄＲＮＡ（Ｇ：Ｕ）構築物を試験するために、容易に検出される表現型を持つ標的遺伝子として選択された。ＡＢＣトランスポーターは、ＡＴＰ結合カセットトランスポータースーパーファミリーに属している−例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａゲノムにおいて５４種類のＡＢＣトランスポーター遺伝子が同定された。ＡＢＣトランスポーターは、膜にわたって広範な分子のいずれか１つ以上を運ぶ膜結合タンパク質をコードする。タンパク質は、ＡＴＰ加水分解によって放出されたエネルギーを使用して、分子を膜全体に輸送する。一部のＡＢＣトランスポーターは、オオタバコガ、Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａにおける植物の二次代謝物質の分解に関与した（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＡＢＣホワイトタンパク質は、オモクローム及びプテリジン経路の前駆体を目の色素顆粒に輸送し、ノックアウト変異体は白い目を示す。
ＡＢＣホワイト遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１２７（アクセッション番号ＫＵ７５４４７６）として提供されている。ｌｅｄＲＮＡが幼虫の食餌でＲＮＡの外因性送達によってＡＢＣホワイト遺伝子発現を減少させることができるかどうかを試験するために、遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードする遺伝的構築物を、設計及び作成した。遺伝的構築物は、ｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はセンス配列であり、連続配列はアンチセンス配列である（図１Ｂ）。標的領域は、配列番号１２７のヌクレオチド４９６〜１０９７に対応する６０３ヌクレオチド長であった。ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は６０３ｂｐ長であった；ｄｓＲＮＡ領域のアンチセンス配列は、配列番号１２７のヌクレオチド４９６〜１０９７の相補鎖に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１２８として提供される。コード領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にあった。
ｌｅｄＲＮＡをコードする遺伝的構築物は、制限酵素ＳｎａＢＩで消化され、これはｌｅｄＲＮＡコード領域の下流を切断し、転写キットの指示にしたがってＲＮＡポリメラーゼＴ７でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された。ＲＮＡを人工飼料に添加し、Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａ幼虫に提供した。
二本鎖ステムにＧ：Ｕ塩基対を有する対応するｌｅｄＲＮＡ構築物を作成し、標準的な塩基対形成したｌｅｄＲＮＡと比較した。
アリの遺伝子を標的とするＬｅｄＲＮＡ
一般にアルゼンチンアリとして知られているＬｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ ｈｕｍｉｌｅは、いくつかの大陸に広く蔓延している害虫である。フェロモン生合成活性化ニューロペプチド（ＰＢＡＮ）ニューロペプチド様（ＬＯＣ１０５６７３２２４）をコードするＬ．ｈｕｍｉｌｅ遺伝子が、フェロモンによる昆虫間のコミュニケーションに関与する標的遺伝子として選択された。
ＰＢＡＮ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１２９（アクセッション番号ＸＭ＿０１２３６８７１０）として提供されている。ｌｅｄＲＮＡが餌の形で食餌中のＲＮＡを外因的に送達することによりＰＢＡＮ遺伝子発現を低下させることができるかどうかを試験するために、遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードする遺伝的構築物を、設計及び作成した。遺伝的構築物は、ｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はセンス配列であり、連続配列はアンチセンス配列である（図１Ｂ）。標的領域は、配列番号１２９のヌクレオチド１３６〜６７５に対応する５４０ヌクレオチド長であった。ｌｅｄＲＮＡのｄｓＲＮＡ領域は５４０ｂｐ長であった；ｄｓＲＮＡ領域のアンチセンス配列は、配列番号１２９のヌクレオチド１３６〜６７５の相補鎖に対応する途切れのない連続する配列であった。ｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３０として提供される。コード領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にあった。
ｌｅｄＲＮＡをコードする遺伝的構築物は、制限酵素ＳｎａＢＩで消化され、これはｌｅｄＲＮＡコード領域の下流を切断し、転写キットの指示にしたがってＲＮＡポリメラーゼＴ７でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された。ＲＮＡはトウモロコシ粉にコーティングされ、Ｌ．ｈｕｍｉｌｅアリに経口投与した。
Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａのＬｅｄＲＮＡ標的遺伝子
Ｌｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａは、オーストラリアのヒツジキンバエとしてより一般的に知られている害虫である。それは、クロバエ科、Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅに属し、Ｄｉｐｔｅｒａ昆虫目のメンバーである。ｌｅｄＲＮＡ構築物で試験するために５つの標的遺伝子、すなわち、Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａの、Ｖ型プロトンＡＴＰａｓｅ触媒サブユニットＡ（アクセッション番号ＸＭ＿０２３４４３５４７）、ＲＮＡｓｅ １／２（アクセッション番号ＸＭ＿０２３４４８０１５）、キチンシンターゼ（アクセッション番号ＸＭ＿０２３４４９５５７）、エクジソン受容体（ＥｃＲ；アクセッション番号Ｕ７５３５５）、及びγ−チューブリン１／１様（アクセッション番号ＸＭ＿０２３４４９７１７）をコードする遺伝子を選択した。各遺伝的構築物は、ｌｅｄＲＮＡの設計原理を使用して作成され、分割配列はセンス配列であり、隣接配列はアンチセンス配列である（図１Ｂ）。いずれの場合にも、標的領域は約６００ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡ領域のアンチセンス配列は途切れのない連続する配列であった。ＡＴＰａｓｅ−Ａ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３１として提供される。ＲＮＡｓｅ １／２遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３２として提供される。キチンシンターゼ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３３として提供される。ＥｃＲ遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３４として提供される。γ−チューブリン１／１様遺伝子を標的とするｌｅｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号１３５として提供される。各構築物において、コード領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にあった。
実施例２１．安定に形質転換された植物では、導入遺伝子誘導ｌｅｄＲＮＡが、高レベルで蓄積する。
ＧＵＳレポーター遺伝子またはＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＩＮ２遺伝子からのｍＲＮＡを標的とするｌｅｄＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ断片を合成し、ｐＡＲＴ７にクローニングして、植物細胞での発現のためのｐ３５Ｓ：ｌｅｄＲＮＡ：Ｏｃｓ３’ポリアデニル化領域／ターミネーター発現カセットを形成した。次いで、この断片をＮｏｔＩにより切除し、ｐＡＲＴ２７のＮｏｔＩ部位に挿入して、植物形質転換のためのｌｅｄＧＵＳベクター及びｌｅｄＥＩＮ２ベクターを形成した。ｌｅｄＧＵＳ構築物と、５６３ｂｐ ｄｓＲＮＡステム及び１１１３ｎｔループを有する長鎖ｈｐＲＮＡを生成するように設計された既存のｈｐＧＵＳ構築物とを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法により、ＧＵＳ発現Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＰＧＨ２４に別々に導入した。強いＧＵＳサイレンシングを示すか、またはＧＵＳ活性のほとんどまたは全く見かけ上の減少を示さない独立した形質転換体からのＲＮＡサンプルを、ノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイで使用して、導入遺伝子にコードされたｈｐＧＵＳまたはｌｅｄＧＵＳ ＲＮＡを検出した。図３８に示すように、強いＧＵＳサイレンシングを示すｈｐＧＵＳ−形質転換植物（図３８中「−」で示される）よりも、ｌｅｄＧＵＳ−形質転換植物の方がはるかに強いハイブリダイジングシグナルが検出された。実際、ｈｐＧＵＳ ＲＮＡサンプルのハイブリダイジングシグナルのほとんどは、対照である非形質転換植物（ＷＴ）からのＲＮＡについても観察された非特異的バックグラウンドシグナルであった。いくつかの強いハイブリダイジングバンドがｌｅｄＧＵＳ系統で観察されたが、これはおそらく完全長のｌｅｄＲＮＡが部分的にプロセシングされたためである。
ｌｅｄＧＵＳをコードする遺伝子構築物のヌクレオチド配列を配列番号５に示す。ヌクレオチド１〜１７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成用のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応し、ヌクレオチド１８〜２７０は、ＧＵＳアンチセンス配列の５’ハーフに対応し、ヌクレオチド２７１〜４３０は、ループ１配列に対応し、ヌクレオチド４３１〜９３３は、ＧＵＳセンス配列に対応し、ヌクレオチド９３４〜１０９３は、ループ２配列に対応し、ヌクレオチド１０９４〜１３４３は、ＧＵＳアンチセンス配列の３’ハーフに対応している。
同様の方式で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換により、Ｃｏｌ−０生態型のＡ．ｔｈａｌｌｉｎａの植物にｌｅｄＥＩＮ２構築物及びｈｐＥＩＮ２構築物を別々に導入した。ｈｐＥＩＮ２［ｗｔ］ＲＮＡをコードするｈｐＥＩＮ２構築物は、前記のとおりであり、ＰＤＫイントロンによって分離された逆方向反復構成の２００ｂｐのセンス及びアンチセンスＥＩＮ２配列を含んでいた。ｌｅｄＥＩＮ２をコードする遺伝子構築物のヌクレオチド配列を配列番号１１６に示す。ヌクレオチド３７〜２２５は、ＥＩＮ２アンチセンス配列の５’ハーフに対応し、ヌクレオチド２２６〜３７３は、ループ１配列に対応し、ヌクレオチド３７４〜７７３は、ＥＩＮ２センス配列に対応し、ヌクレオチド７７４〜８９３は、ループ２配列に対応し、ヌクレオチド８９４〜１０８５は、ＥＩＮ２アンチセンス配列の３’ハーフに対応する。ヌクレオチド３７〜２２５（アンチセンス）はヌクレオチド３７４〜５７３（センス）に相補的であり、ヌクレオチド８９４〜１０８５（アンチセンス）はヌクレオチド５７４〜７７３（センス）に相補的である。
一次独立形質転換体からのＲＮＡサンプルをノーザンブロットハイブリダイゼーション解析に使用した。図３９に示すように、ｌｅｄＥＩＮ２植物は、より大きなＲＮＡ分子に対してｈｐＥＩＮ２植物よりも強いハイブリダイジングシグナルを示した（図３９、上段パネル）ことから、ｌｅｄＥＩＮ２由来ＲＮＡがｈｐＥＩＮ２由来ＲＮＡよりも多いレベルで蓄積されていることが示された。２０〜２５ヌクレオチドサイズの範囲のプロセシングされたＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）については、ｌｅｄＥＩＮ２植物ではｈｐＥＩＮ２植物よりもｓｉＲＮＡが多くの存在量で検出され（図３９、下段パネル）、ｓｉＲＮＡの量は、ＲＮＡ分子の量が多いことと十分に相関していた。これらの結果から、導入遺伝子由来のｌｅｄＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによってある程度まではｓｉＲＮＡにプロセシングされるが、完全にはプロセシングされていないことが示された。また、ｌｅｄＲＮＡ導入遺伝子は、対応するｈｐＲＮＡ導入遺伝子よりも多くのｓｉＲＮＡを生成することが示された。
これらの結果からは、ｌｅｄＲＮＡ構築物は、植物細胞内で発現させた場合、プロセシングされていない及びプロセシングされた転写物の蓄積レベルが、対応するｈｐＲＮＡ構築物よりも多いことが示された。これは、ｌｅｄＲＮＡ分子の安定性が上昇していることを示していると考えられていた。
実施例２２．ヘアピンＲＮＡは、植物の環状ＲＮＡの効率的な前駆体である。
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、共有結合している閉鎖円であり、自由な５’及び３’末端を持たないか、または３’領域としてポリアデニル化配列を有する。ｃｉｒｃＲＮＡは一般的に非コーディングであり、ポリペプチドをコードしないため、翻訳されない。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡｓｅによる消化、特にＲＮａｓｅ Ｒなどのエキソヌクレアーゼに対して比較的耐性がある。ウイルスもしくはウイロイド起源のｃｉｒｃＲＮＡ、またはウイルスに関連したサテライトＲＮＡとしてのｃｉｒｃＲＮＡは、長く、動物及び植物で観察されている。例えば、植物のサブウイルスＲＮＡ病原体であるポテトスピンドルチューバーウイロイドは、サイズ約３６０ｎｔの環状ＲＮＡゲノムを持っている。植物では、そのようなサテライトＲＮＡは、多くの場合、ヘルパーウイルスの存在下で複製され得る。対照的に、ウイロイドは、その複製のために内因性植物ＲＮＡポリメラーゼを含む宿主機能に完全に依存している。
現在、ＲＮＡディープシークエンシング技術と特別に設計されたバイオインフォマティクスツールを用いて、植物及び動物のゲノムから多数のｃｉｒＲＮＡが同定されているところである。これまでに、組織特異的発現パターンまたは生物学的及び非生物学的ストレス応答性発現パターンを示す傾向があるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ、イネ、ダイズなどの植物において、推定上のｃｉｒｃＲＮＡが数千個同定されているが、植物におけるｃｉｒｃＲＮＡの生物学的機能（複数可）は依然として実証されていない。多くの推定上の植物ｃｉｒｃＲＮＡの組織特異的またはストレス応答性の発現パターンから、これらのｃｉｒｃＲＮＡが植物の発育及び防御応答において潜在的な役割を有し得ることが示唆されているが、このことは依然として実証されていない。
ｃｉｒｃＲＮＡの生物発生に関するコンセンサスの見解は、イントロンのバックスプライシング、すなわちスプライシング機構がｐｒｅ−ｍＲＮＡを「バックスプライシング」し、スプライシングされたエクソンを共有結合させることによって形成されるというものである。このように、内因性イントロンスプライシング機構は、現在のｃｉｒｃＲＮＡの生物発生モデルには不可欠である。この生物発生モデルは、主に哺乳類系における研究に基づいており、エクソン型ｃｉｒｃＲＮＡの大部分は、コンセンサスＧＴ／ＡＧイントロン境界ジヌクレオチドを含む標準イントロンスプライシングシグナルを含むことが示されている。動物では、エキソン型ｃｉｒｃＲＮＡに隣接するイントロン領域には、多くの場合、トランスポーズ可能なエレメント配列の短い逆方向反復が含まれており、このことから、相補的なイントロン配列がｃｉｒｃＲＮＡの形成を促進することが示唆されることになる。実際に、動物においてｃｉｒｃＲＮＡを発現させるためのベクター系は、相補的なＴＥ反復を含むスプライス可能なイントロンを有する天然に存在するエキソン−イントロン配列に基づいて開発が行われている。しかし、このような隣接イントロン配列を有する同定されたエキソン型ｃｉｒｃＲＮＡの割合は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでの０．３％からイネでの６．２％であり、その範囲は非常に低く、植物では、ｃｉｒｃＲＮＡの形成における相補的隣接配列の役割は依然として不明である。
長鎖ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）導入遺伝子は、植物において遺伝子のサイレンシングまたはＲＮＡ干渉を誘導するために広く使用されている（Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ｈｐＲＮＡ導入遺伝子構築物は、典型的には、プロモーター配列を参照して相補的なセンス配列及びアンチセンス配列を有する逆方向反復と、センス配列とアンチセンス配列を分離して連結するためのスペーサー配列とで構成される。スペーサーはまた、ベクター構築時に細菌細胞内のＤＮＡプラスミド中の逆方向反復構造を安定化させる。その結果、典型的なｈｐＲＮＡ導入遺伝子からのＲＮＡ転写産物は、塩基対形成したセンス配列とアンチセンス配列の二本鎖（ｄｓ）ステムとスペーサー配列に対応する「ループ」を持つステムループ構造を形成することが予想される。そうしたＲＮＡ転写物は、センス領域とアンチセンス領域が塩基対形成によってアニーリングし、分子のｄｓＲＮＡ領域またはステム領域を形成する能力を持つことから、自己相補的ＲＮＡとも呼ばれている。
長鎖ｈｐＲＮＡのループ断片は植物細胞内に蓄積し、ＲＮａｓｅ Ｒに耐性がある
５６３ｂｐのセンス配列及びアンチセンス配列ならびに１１１３ｂｐのスペーサーを有する、ＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とする長鎖ｈｐＲＮＡをコードする導入遺伝子を作成した（図４０、ＧＵＳｈｐ１１００）。９３ｂｐのセンス配列及びアンチセンス配列ならびに９３ｂｐのスペーサーを有する、同じＧＵＳ ｍＲＮＡを標的とするより小さいｈｐＲＮＡをコードする第２の導入遺伝子も作成した（ＧＵＳｈｐ９３−１）。構築物は両方とも、ヘアピンＲＮＡの一過性発現のためにＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞に別々に導入させ、また、安定的に統合された遺伝性の導入遺伝子として発現させるためにＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物を形質転換するために使用された。以前に報告されたように、両方の構築物とも、植物細胞に導入して発現させると、ループ配列に対して予想されるサイズの異なるＲＮＡ断片を生成した（図４１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。本研究では、本発明者らは、ループ配列が環状ＲＮＡに変換されているかを調べることにした。
より短いｈｐＲＮＡ（ＧＵＳｈｐ９３−２）を発現させるために、３５ＳプロモーターではなくＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＵ６プロモーターを有する第３の構築物を作成した。また、スペーサー配列としてＰＤＫイントロンを含む第４のＧＵＳ ｈｐＲＮＡ構築物も作成した（図４０のＧＵＳｈｐＰＤＫ）。その構築物は、ヘアピンＲＮＡをコードし、そこでは、イントロンは、はるかに短いループ配列を残して、転写後にスプライシングで切り出されると予想されていた。また、これらの構築物もＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に導入し、ループ配列が検出できるかどうか、及び環状ＲＮＡを形成しているかを調べた。これらの構築物内のｄｓＲＮＡステム及びループ配列は、全てＧＵＳコード配列に由来し、既知のイントロン配列はいずれも導入されなかった。構築物は、標的ＧＵＳ発現構築物の存在下または非存在下のいずれかで、導入遺伝子の発現を増加させるためのウイルス抑制タンパク質（ＶＳＰ）としてキュウリモザイクウイルス２ｂタンパク質をコードし発現する遺伝子構築物と共に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介浸潤を用いてＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に別々に導入した。ループ断片の蓄積及びサイズをノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイを用いて解析した。代表的なノーザンブロットのオートラジオグラフを図４２に示す。
図４２に示すように、以前に報告されたとおり、ＧＵＳｈｐ１１００の長鎖ループ断片は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ浸潤サンプルにおいて容易に検出された（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このループ断片が円形であるかを試験するために、ＲＮＡサンプルをＲＮａｓｅ Ｒで処理し、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。ＲＮａｓｅ Ｒ処理は、総量２０μｌのＲＮａｓｅ Ｒ緩衝液及び水と混合した１０μｇの全ＲＮＡ（または５０ｎｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物）を使用した。混合物を沸騰水で３分間加熱し、氷上で急冷し、０．５μｌのＲＮａｓｅ Ｒを添加し、チューブを３７℃で１０分間インキュベートした。酵素を失活させ、エタノールで沈殿させることによって残留ＲＮＡを回収した。ゲル中の臭化エチジウム染色された物質の劇的な減少によって示されるように、ＲＮａｓｅ Ｒ処理により、ＲＮＡのほとんどが分解された（図４２、下段パネル）。ＲＮａｓｅ Ｒ処理の全てのアッセイで、いくつかのリボソームＲＮＡ断片がゲル中に残存しているのが目視で確認され、これは、いくつかのＲＮＡ種のＲＮａｓｅ Ｒに対する部分的な耐性を示している。ＲＮａｓｅ Ｒで処理したサンプルでは、全ＲＮＡが枯渇していたにもかかわらず、約１１００ｎｔのループ断片では、未処理のサンプルと比較して、減少量はわずかに約２４％であり、依然として豊富であった。このことは、ループ断片がＲＮａｓｅ Ｒの消化に対して比較的耐性があり、したがって円形の構造であることを示した。未処理サンプルと比較してループＲＮＡの減少量が２４％であったのは、市販で得られたＲＮａｓｅ Ｒ酵素中のエンドヌクレアーゼ活性の残留量、またはエタノール沈殿ステップ中のＲＮａｓｅ Ｒ消化後のＲＮＡ回収量の減少のいずれかに起因するものであった。
ＲＮａｓｅ Ｒ処理アッセイを、直鎖ＲＮＡ対照としてループ配列に対応する５０ｎｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを封入して繰り返した。さらに、より厳密にＲＮａｓｅ Ｒ耐性を試験するために、ｈｐＧＵＳ１１００浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＲＮＡのサンプルのＲＮａｓｅ Ｒ処理を２ラウンド行った。ＧＵＳｈｐ１１００浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のループ断片の７６％が１回のＲＮａｓｅ Ｒ処理後も残存していたのに対し、直鎖ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写物は、残存しているのはわずかに約８．５％であることが観察された。２倍のＲＮａｓｅ Ｒ処理では、ループ由来の物質をさらに減少させたが、除去することはなかった。また、ループ配列に対応するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａサンプルのＲＮＡバンドは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写物よりもゲルブロット上に多く現れることも指摘されており、これは、環状ＲＮＡは、同じヌクレオチド数の直鎖ＲＮＡ分子よりもゲル電気泳動中では、ゆっくりと移動することが報告されていることと一致した。これらの実験から、約１１００ヌクレオチドのループ配列が円形であることが結論付けられた。
また、ＧＵＳｈｐ９３−１及びＧＵＳｈｐＰＤＫ浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＲＮＡサンプルのノーザンブロットハイブリダイゼーション解析では、ループ配列の長さに対応するサイズのＲＮＡ分子が検出された。ＧＵＳｈｐ９３−１及びＧＵＳｈｐ９３−２構築物については、３５Ｓプロモーター駆動のＧＵＳｈｐ９３−１よりもＵ６プロモーター指令のＧＵＳｈｐ９３−２の方がより多くのループ断片が得られ、このことから、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞ではＵ６プロモーターの方が３５Ｓプロモーターよりも強い転写活性を持っているか、または分子が何らかの形でより安定していることが示唆された。
ＧＵＳｈｐＰＤＫ構築物は、０．７６ｋｂのサイズのスプライス可能なＰＤＫイントロンを含むスペーサー配列を有しており、したがって、この構築物からの一次転写物は、約０．８ｋｂのループが含まれていた。ノーザンブロットを処理してＧＵＳプローブを除去し、ＰＤＫイントロン配列に対する全長アンチセンスプローブで再プローブした。ＰＤＫプローブは未知のＲＮＡ種と強くハイブリダイズし、全てのレーンで強いバンドとして観察された。ＲＮａｓｅ Ａ処理では、この非特異的バンドを減少させたが、完全に除去することはできなかった。それにもかかわらず、ＧＵＳｈｐＰＤＫ浸潤ＲＮＡサンプルでは、予想されるサイズのＰＤＫイントロン特異的なバンドが検出されたが、その断片の存在量は比較的弱く、これは、イントロン配列が、ＧＵＳｈｐＰＤＫ一次転写物の大部分からスプライシングで切り出されたと考えられる。ＰＤＫループ断片が円形であるかを調べるために、ＧＵＳｈｐＰＤＫ浸潤したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＲＮＡをＲＮａｓｅ Ｒで処理した。非特異的ハイブリダイジングバンドは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理によってほぼ完全に除去された。それとは対照的に、ＰＤＫイントロンバンドは、非特異的バンドからのシグナルが強いため、未処理サンプルとの存在量の比較は容易ではなかったが、ＲＮａｓｅ Ｒ処理後に容易に検出された。まとめると、これらの結果は、ｈｐＲＮＡ転写物が環状ＲＮＡ形成の有効な前駆体であることを示しており、環状ＲＮＡが全ループ配列に対応することが示唆された。
ＲＮａｓｅ Ｒ耐性ループ断片は、安定的に形質転換したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物にも蓄積する
ｈｐＧＵＳ３４７及び２つのｈｐＧＦＰ構築物（図４０）を用いて、生態型Ｃｏｌ−０のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ植物、及び各構築物について選択した導入遺伝子を発現する２つの植物を形質転換した。ｈｐＧＵＳ３４７構築物を、ｍｉＲＮＡスポンジ機能の試験を行うために、ｍｉＲ１６５／１６６結合部位を含むように設計されたｈｐＧＦＰ構築物の対照として、この実験で使用した（実施例２４で論じた）。Ｔ２世代のトランスジェニック植物を、ｈｐＧＵＳ３４７構築物から産生されるＲＮＡ分子の蓄積、特にループ配列の検出、及びそれらが円形であるかについて分析した。ｈｐＧＵＳ３４７転写物のループに対応するバンドが、２つのｈｐＧＵＳ３４７系統からのＲＮａｓｅ Ｒ処理ＲＮＡサンプル及び未処理ＲＮＡサンプルの両方で検出された。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ組織からのＲＮＡサンプルについては、ＲＮａｓｅ Ｒ処理したサンプルでは、未処理のサンプルに比べてバンド強度がわずかに低下しているように見えたが、ＲＮＡシグナルの大部分は保持されていた。ｃｉｒｃＲＮＡを検出するように設計されたプライマーを用いたＲＴ−ｑＰＣＲ解析により、ＲＮａｓｅ Ｒ処理したｈｐＧＵＳ３４７サンプルにおいて、未処理サンプルと比較して、ｃｉｒｃＲＮＡの存在が確認され、かつ存在量がわずかに減少していた。これらの結果から、ヘアピンＲＮＡを産生するために発現させた安定に統合されたｈｐＲＮＡ導入遺伝子は、ループ配列からもｃｉｒｃＲＮＡを生成していることが明らかになった。
ｄｓＲＮＡのステムループジャンクションでｈｐＲＮＡ転写物のループを切除し、環状ＲＮＡを形成した
ループ配列由来のＲＮＡ分子の環状性をさらに確認し、それらのジャンクション配列の特徴を明らかにするために、ループ配列を、ＧＵＳｈｐ１１００、ＧＵＳｈｐ９３、及びＧＵＳｈｐＰＤＫ浸潤サンプルから、推定上のジャンクション配列を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。その後、ＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングし、シークエンシングし、ジャンクションのヌクレオチド配列を確認した。ループの切除及び環状ＲＮＡが結合しているヌクレオチド位置は、若干変動があり、５’部位がｄｓＲＮＡステムの３’末端内にあり、３’部位がループの３’末端付近にあったが、５’部位は、ｄｓＲＮＡステムの３’末端から１０ヌクレオチドのところにあるＧヌクレオチドに対して、明確な選好性を示した。ＰＤＫイントロン環状ＲＮＡの切除部位及び接合部位は、ＧＵＳｈｐ１１００及びＧＵＳｈｐ９３ＲＮＡからのものと同じパターンをたどっており、標準イントロンスプライシング部位の外側にあることがわかった。環状ＲＮＡの形成は、イントロンスプライシングとは独立してステムループ構造によって決定されることが結論付けられた。また、少なくともこの実施例では、ヘアピンＲＮＡは、ｄｓＲＮＡステムの３’末端内の５’切断及びループ配列の３’末端付近の３’切断によってループ配列が放出され、環状化されるようにプロセシングされ、切除された配列の５’末端と３’末端との間に共有結合が形成されていることが結論付けられた。
実施例２３．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現したｈｐＲＮＡは、プロセシングにより環状ＲＮＡにならなかった
酵母種であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは真核生物であり、他の全ての真核生物と同様にイントロンスプライシング機構を持っている。現在の環状ＲＮＡ形成のコンセンサスモデルがイントロンスプライシングに基づいていることから、本発明者らは、植物細胞において形成されるのと同様に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてもｈｐＲＮＡが環状ＲＮＡを形成できるかを調査した。ｈｐＲＮＡを発現させるための構築物を生成するために、ＧＵＳｈｐ１１００の逆方向反復領域を植物発現ベクターから切除し、酵母ＡＤＨ１プロモーターの制御下で酵母発現ベクターに挿入し（図４３）、その結果得られた遺伝子構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞に導入した。図４３に示すように、３つの独立したトランスジェニック酵母株のそれぞれから抽出したＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション解析では、ＧＵＳｈｐ１１００転写物に対応する１つの高分子量バンドを検出した。このことから、ＧＵＳｈｐ１１００転写物はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではプロセシングされずに完全長のままであることが示唆された。このことを確認するために、ＲＮａｓｅ Ｒ処理に対する応答性についてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ＧＵＳｈｐ１１００転写物及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ発現ＧＵＳｈｐ１１００転写物を比較した。図４４に示すように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理に非常に感度の高い高分子量バンドを示し、したがって、円形ではなかった。すなわち、酵母ＲＮＡサンプルは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞で生成されたような、ループ配列に由来する環状分子を示さなかった。その結果、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現したＧＵＳｈｐ１１００転写物は、プロセシングされずに完全長のままであることが示された。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＮＡバンドのサイズは、ゲル電気泳動によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＵＳｈｐ１１００転写物よりも大きく見えたが、これはおそらく、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ＲＮＡには存在するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物には存在しない５’及び３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列によるものである。このように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてイントロンスプライシング機構が存在することは、植物細胞で起こるようなｈｐＲＮＡループのプロセシング及び環状ＲＮＡの形成を可能にするには十分ではなかった。
同様の方式で、遺伝子構築物ＧＵＳｈｐ３４７をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入して発現させた。ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析を再度行ったところ、ｈｐＲＮＡは完全長であると思われ、少なくともループ配列またはｄｓＲＮＡ領域の切断を伴わず、明らかにプロセシングが行われていなかったことが示された。
本発明者らは、Ｄｉｃｅｒ酵素を持たない酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びその関連する出芽酵母（Ｄｒｉｎｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）が、本明細書に記載されている改変ＲＮＡ分子を含む全長ヘアピン及びｌｅｄＲＮＡを産生するための生物として有利であると結論付けた。そのような全長ＲＮＡは、プロセシングを受けていないｄｓＲＮＡが望まれる場合、例えば昆虫への局所適用による遺伝子活性のサイレンシングのために有用である。
実施例２４．ｈｐＲＮＡループは、ｍｉＲＮＡの機能を抑制するための効果的な「スポンジ」として機能し得る
動物におけるいくつかの環状ＲＮＡは、特定のｍｉＲＮＡに相補的である複数の配列を含み、それによってそれらのｍｉＲＮＡの結合部位として作用することが判明しており、ｍｉＲＮＡの「スポンジ」と呼ばれている。本発明者らは、長鎖ｈｐＲＮＡ構築物から産生された環状ＲＮＡが、植物細胞においてｍｉＲＮＡスポンジとして機能し得るかを試験した。２つのＧＦＰ ｈｐＲＮＡ構築物を設計し（図４０）、これは、１つは、２つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｉＲ１６５／１６６結合部位を有するように配列を改変したことを除いて、同じＧＵＳ配列由来のスペーサーを有していた。その構築物ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］は、全てのシトシンヌクレオチドがチミンに置換された改変センス配列を有する第２（対照）構築物ＧＦＰｈｐ［ＷＴ］と同じアンチセンス配列を持つ逆方向反復配列を持つものとした。したがって、ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］からの転写物は、塩基対の約２５％がＧ：Ｕ塩基対であることを除いて、ＧＦＰ配列に対応するｄｓＲＮＡ領域を形成するであろう。他方の構築物、ＧＦＰｈｐ［ＷＴ］は、ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］のヘアピンと同じ長さの完全に標準的な塩基対形成されたｄｓＲＮＡステムを有するヘアピンＲＮＡをコードしており、対照として使用した（図４０）。ｍｉＲ１６５／１６６結合部位を持たないスペーサーを含むＧＵＳ ｈｐＲＮＡ構築物ＧＵＳｈｐ３４７を第２対照として含有した。
これらの構築物を用いてＡ．ｔｈａｌｉａｎａを別々に形質転換し、３つの構築物のそれぞれについてトランスジェニック植物を得た。形質転換された植物を、ｍｉＲ１６５／１６６の減少に関連した表現型について目視で調べたところ、葉が折り畳まれて「トランペット」となっている特徴的なものが含まれていた。予想したとおり、ＧＵＳｈｐ３４７形質転換植物は、ｍｉＲ１６５／１６６の抑制に関連する表現型を示さなかった。同様に、ＧＦＰｈｐ［ＷＴ］形質転換植物では、明らかな表現型は観察されなかった。対照的に、ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］植物の大部分は、トランペット表現型を含むｍｉＲ１６５／１６６の抑制を想起させる様々なレベルの表現型を示した。
ノーザンブロットハイブリダイゼーションを、軽度、中等度、及び強度から重度の範囲の表現型を有するＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］形質転換植物から抽出したＲＮＡに対して実施し、ｈｐＲＮＡ発現の蓄積を調べた。使用したプローブは、ＧＵＳ ｍＲＮＡに対応する全長アンチセンスＲＮＡであった。このプローブは、ＧＵＳｈｐ３４７転写物のセンス及び隣接ループと相補的である８２２ｂｐの連続配列を有していた。このプローブは、２つのｍｉＲＮＡ結合配列に隣接している長さ４９、１０９ｂｐ及び７０ｂｐの３つの非連続領域において、ＧＵＳ由来の配列として合計２２８ｂｐのループ領域を有するＧＦＰｈｐ転写物との配列相補性が低かった。図４５Ｂに示すように、ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］植物では、ＧＦＰ ｈｐＲＮＡ分子の存在量が非常に多く検出され、ノーザンブロットで検出されたＲＮＡ分子の量は、表現型の重症度と正の相関を示した。ＧＦＰｈｐ［ＷＴ］植物は、ノーザンブロット解析でのみ検出可能である低レベルのｈｐＲＮＡ分子の蓄積を示したが、これは、Ｇ：Ｕ改変ｈｐＲＮＡ導入遺伝子と比較して、従来のｈｐＲＮＡ導入遺伝子の転写レベルが比較的低いことと一致する。すなわち、上記実施例に示すように、ｈｐＲＮＡ［Ｇ：Ｕ］導入遺伝子は、対応するｈｐＲＮＡ［ＷＴ］導入遺伝子と比較して、自己サイレンシングが行われることが少なかった。
ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて、ループ配列に由来する環状ＲＮＡ分子の蓄積を定量した。その結果、多量のｃｉｒｃＲＮＡがＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］トランスジェニック植物に存在し、これは完全長のｈｐＲＮＡ蓄積のレベルと相関していることが示された（図４５Ｃ）。２０〜２５ｎｔのサイズ範囲の短鎖ＲＮＡを検出するためのノーザンブロットハイブリダイゼーション解析では、ＧＦＰｈｐ［Ｇ：Ｕ］植物においてｍｉＲ１６５／１６６の下方制御が確認された。減少の程度は、ｈｐＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡの量及び表現型の重症度と相関していた。ＲＴ−ｑＰＣＲを用いてｍｉＲ１６５／１６６標的遺伝子の発現を解析したところ、ｍｉＲ１６５／１６６による標的遺伝子の抑制が、強いｍｉＲ１６５／１６６の下方制御及び重度の表現型を示す植物において解除されることが示された。まとめると、これらの結果から、ｈｐＲＮＡループは植物でのｍｉＲＮＡ機能を抑制するための特異的なｍｉＲＮＡスポンジとして使用可能であることが示された。
また、本発明者らは、植物細胞内で安定分子として高レベルで産生される環状ＲＮＡを、ポリペプチドを高レベルで生成するための手段として翻訳するために利用することを想起した。キャップ非依存制翻訳を開始するには、理想的には、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）が使用される。多数のＩＲＥＳ配列が同定されている。
広く記載された本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されているように、多数の変形及び／または修正が本発明になされ得ることは、当業者には理解されるであろう。したがって、本実施形態は、全ての点で例示的であり、制限的ではないと考えられる。
本出願は、２０１８年８月３日に出願されたＡＵ２０１８９０２８４０、２０１８年８月８日に出願されたＡＵ２０１８９０２８９６、２０１８年９月１７日に出願されたＰＣＴ／ＡＵ２０１８／０５１０１５、及び２０１９年３月２０日に出願されたＡＵ２０１９９００９４１の優先権を主張し、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で論じられ及び／または参照された全ての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれる文書、行為、材料、デバイス、物品などに関するいかなる議論も、本発明の文脈を提供することのみを目的とするものである。これらの事項のいずれかまたは全てが先行技術の基盤の一部を形成していること、または本願の各請求項の優先日以前に存在していた本発明に関連する分野における共通の一般的な知識であったことを認めるものではない。
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Claims (77)

  1. 長さが少なくとも２０の連続するヌクレオチドである第１のセンスリボヌクレオチド配列と、長さが少なくとも２０の連続するヌクレオチドである第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列と、を含み、これにより、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズして、ｄｓＲＮＡ領域を形成することができる、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を含むキメラリボ核酸（ＲＮＡ）分子であって、
    ｉ）前記第１のセンスリボヌクレオチド配列は、５’から３’の順で共有結合し、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、
    ｉｉ）前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、５’から３’の順で共有結合し、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、
    ｉｉｉ）前記第１の５’リボヌクレオチドが前記第２の３’リボヌクレオチドと塩基対形成して前記ｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対を形成し、
    ｉｖ）前記第２の５’リボヌクレオチドが前記第１の３’リボヌクレオチドと塩基対形成して前記ｄｓＲＮＡ領域の末端塩基対を形成し、
    ｖ）前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の前記リボヌクレオチドの約５％〜約４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、
    ｖｉ）前記ｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する標準的な塩基対を含まず、
    ｖｉｉ）前記ＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断されて、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができ、
    ｖｉｉｉ）前記ＲＮＡ分子、または少なくともいくつかの前記ａｓＲＮＡ分子、またはその両方が、前記真核細胞内の標的ＲＮＡ分子の発現または活性を低下させることができ、
    ｉｘ）前記ＲＮＡ分子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは細胞内、またはその両方において転写により酵素的に作成されることができる、前記キメラリボ核酸（ＲＮＡ）分子。
  2. 前記第１のセンスリボヌクレオチド配列が、長さが少なくとも４のヌクレオチド、または４〜１，０００のリボヌクレオチド、または４〜２００のリボヌクレオチド、または４〜５０のリボヌクレオチド、または少なくとも１０のヌクレオチド、または１０〜１，０００のリボヌクレオチド、または１０〜２００のリボヌクレオチド、または１０〜５０リボヌクレオチドのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって、前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列に共有結合されており、これにより、前記第１の結合リボヌクレオチド配列が、前記第２の３’リボヌクレオチド及び前記第１の５’リボヌクレオチドのいずれか、または好ましくは、前記第１の３’リボヌクレオチド及び前記第２の５’リボヌクレオチドに共有結合され、このため、前記配列は、ＲＮＡの単一の連続鎖内に含まれる、請求項１に記載のキメラＲＮＡ分子。
  3. 前記ＲＮＡ分子の前記ループ配列が、前記真核細胞に内在するＲＮＡ分子に相補的な１つ以上の結合配列を含み、及び／または前記ＲＮＡ分子の前記ループ配列が、ポリペプチドまたは機能性ポリヌクレオチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項２に記載のキメラＲＮＡ分子。
  4. 前記ｄｓＲＮＡの前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の前記リボヌクレオチドの約５％〜約４０％が、全体で、非標準塩基対、好ましくはＧ：Ｕ塩基対で塩基対形成されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  5. 前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、前記標的ＲＮＡの領域に完全に相補的であり、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列は、前記標的ＲＮＡの前記領域のＣヌクレオチドをＵヌクレオチドで置換することにより、前記標的ＲＮＡの前記領域とは配列が異なる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  6. 第２のセンスリボヌクレオチド配列を含み、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結されており、これにより、前記第１の結合リボヌクレオチド配列は、前記第１の３’リボヌクレオチド及び前記第２の５’リボヌクレオチドに共有結合され、また、前記ＲＮＡ分子は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、前記第２の３’リボヌクレオチド及び前記第２のセンスリボヌクレオチド配列に共有結合された第２の結合リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  7. 第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含み、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結されており、これにより、前記第１の結合リボヌクレオチド配列は、前記第２の３’リボヌクレオチド及び前記第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、また、前記ＲＮＡ分子は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、前記第２の３’リボヌクレオチド及び前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列に共有結合された第２の結合リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  8. 第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子であって、前記第２のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズして第２のｄｓＲＮＡ領域を形成することができ、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結され、それによって前記第１の結合リボヌクレオチド配列が、前記第１の３’リボヌクレオチド及び前記第２の５’リボヌクレオチドに共有結合され、前記ＲＮＡ分子が、任意に、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、前記第２の３’リボヌクレオチド及び前記第２のセンスリボヌクレオチド配列に共有結合されているか、または前記第２のセンスリボヌクレオチド配列と前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する第２の結合リボヌクレオチド配列を含む、前記キメラＲＮＡ分子。
  9. 第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子であって、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含む第１の結合リボヌクレオチド配列によって連結され、それにより、前記第１の結合リボヌクレオチド配列は、前記第２の３’リボヌクレオチド及び前記第１の５’リボヌクレオチドに共有結合され、前記ＲＮＡ分子は、少なくとも４のヌクレオチドの長さのループ配列を含み、前記第１の３’リボヌクレオチド及び前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列に共有結合されているか、または前記第２のセンスリボヌクレオチド配列と前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する第２の結合リボヌクレオチド配列をさらに含む、前記キメラＲＮＡ分子。
  10. 前記第２のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、それぞれ、長さが少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  11. 前記第１及び前記第２のセンスリボヌクレオチド配列は、前記標的ＲＮＡ分子とは配列的に関連しないか、もしくは前記標的ＲＮＡ分子とは配列的に関連する介在リボヌクレオチド配列によって共有結合されているか、または前記第１及び前記第２のセンスリボヌクレオチド配列は、介在リボヌクレオチド配列なく共有結合されている、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  12. 前記第１及び前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡ分子の相補体とは配列的に関連しないか、もしくは標的ＲＮＡ分子の相補体とは配列的に関連する介在リボヌクレオチド配列によって共有結合されているか、または前記第１及び前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、介在リボヌクレオチド配列なく共有結合されている、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  13. 前記第２のセンスリボヌクレオチド配列及び第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列の前記リボヌクレオチドの５％〜４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、好ましくはＧ：Ｕ塩基対で塩基対が形成され、前記第２のｄｓＲＮＡ領域は、２０の連続する標準塩基対を含まない、請求項６〜１２のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子であって、前記ＲＮＡ分子は、真核生物細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングすることができ、それにより、前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断されて、２０〜２４のリボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができる、前記キメラＲＮＡ分子。
  14. 各結合リボヌクレオチド配列は、独立して、長さが４〜約２０００ヌクレオチド、好ましくは長さが４〜約１２００ヌクレオチド、より好ましくは長さが４〜約２００ヌクレオチド、最も好ましくは長さが４〜約５０ヌクレオチドである、請求項６〜１３のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  15. ５’リーダー配列もしくは３’トレーラー配列、またはその両方をさらに含む、請求項６〜１４のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  16. 第１のＲＮＡ成分と、前記第１のＲＮＡ成分に共有結合した第２のＲＮＡ成分とを含むキメラＲＮＡ分子であって、
    前記第１のＲＮＡ成分は、互いにハイブリダイズして第１の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成することができる第１のセンスリボヌクレオチド配列及び第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列、ならびに前記第１のセンスリボヌクレオチド配列と前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する少なくとも４のヌクレオチドの第１の介在リボヌクレオチド配列を含む、前記第１のｄｓＲＮＡ領域を含み、
    前記第２のＲＮＡ成分は、第２のセンスリボヌクレオチド配列、第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列、及び前記第２のセンスリボヌクレオチド配列と前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とを共有結合する少なくとも４のリボヌクレオチドの第２の介在リボヌクレオチド配列を含み、前記第２のセンスリボヌクレオチド配列は、前記ＲＮＡ分子内の前記第２のアンチセンスリボヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
    前記第１のＲＮＡ成分において、
    ｉ）前記第１のセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第１の５’リボヌクレオチド、第１のＲＮＡ配列、及び第１の３’リボヌクレオチドからなり、
    ｉｉ）前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、５’から３’の順に共有結合した少なくとも２０の連続するリボヌクレオチド、第２の５’リボヌクレオチド、第２のＲＮＡ配列、及び第２の３’リボヌクレオチドからなり、
    ｉｉｉ）前記第１の５’リボヌクレオチドが、前記第２の３’リボヌクレオチドと塩基対形成し、
    ｉｖ）前記第２の５’リボヌクレオチドが、前記第１の３’リボヌクレオチドと塩基対形成し、
    ｖ）前記第１のセンスリボヌクレオチド配列及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の前記リボヌクレオチドの５％〜４０％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されず、
    ｖｉ）前記第１のｄｓＲＮＡ領域が２０の連続する標準的な塩基対を含まず、
    前記キメラＲＮＡ分子は、真核細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ、それにより前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が切断され、２０〜２４リボヌクレオチド長の短鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）分子を生成することができ、
    （ａ）前記キメラＲＮＡ分子もしくは少なくともいくつかの前記ａｓＲＮＡ分子、またはその両方が、前記真核細胞内の標的ＲＮＡ分子の発現または活性を低下させることができるか、
    （ｂ）前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列が、前記標的ＲＮＡ分子の前記相補体の領域に対して配列が少なくとも５０％同一である、好ましくは、配列が少なくとも９０％または１００％同一である少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドの配列を含むか、または
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方である、前記キメラＲＮＡ分子。
  17. 前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列の前記少なくとも２０の連続するリボヌクレオチドは、全て、前記標的ＲＮＡ分子の第１の領域のヌクレオチドと塩基対形成することができる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  18. 前記ＲＮＡ分子は、２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列、及び前記アンチセンスリボヌクレオチド配列と塩基対形成するセンスリボヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス配列は、それぞれ標的ＲＮＡ分子の領域に相補的であるか、好ましくは完全に相補的である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  19. 前記２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、前記同じ標的ＲＮＡ分子の異なる領域と相補的である、請求項１８に記載のキメラＲＮＡ分子。
  20. 前記２つ以上のアンチセンスリボヌクレオチド配列は、異なる標的ＲＮＡ分子の領域と相補的である、請求項１８に記載のキメラＲＮＡ分子。
  21. ５’末端、少なくとも２１ヌクレオチド長であるセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２１の連続するヌクレオチドにわたって前記センスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対形成されているアンチセンスリボヌクレオチド配列、介在ループ配列、及び３’末端を有するヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）構造を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  22. ５’末端、少なくとも２１ヌクレオチド長である少なくとも１つのセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２１の連続するヌクレオチドにわたって各センスリボヌクレオチド配列と完全に塩基対形成したアンチセンスリボヌクレオチド配列、少なくとも２つのループ配列、及び３’末端を有する一本鎖のリボヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  23. 前記センスリボヌクレオチド配列及び前記アンチセンスリボヌクレオチド配列の前記リボヌクレオチドの約１５％〜約３０％、または約１６％〜約２５％が、全体で、非標準塩基対で塩基対形成されるか、または塩基対形成されないかのいずれかであり、好ましくは非標準塩基対で塩基対形成され、より好ましくは、Ｇ：Ｕ塩基対で塩基対形成される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  24. 前記非標準塩基対の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％がＧ：Ｕ塩基対である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  25. 前記ｄｓＲＮＡ領域内の前記リボヌクレオチドの２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満が塩基対形成されない、またはその全てが塩基対形成されない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  26. 前記ｄｓＲＮＡ領域の４分の１〜６分の１のリボヌクレオチドが、非標準塩基対形成されるか、または塩基対形成されない、好ましくは、Ｇ：Ｕ塩基対を形成する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  27. 前記ｄｓＲＮＡ領域は、８つの連続する標準的な塩基対を含まない、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  28. 前記ｄｓＲＮＡ領域は、少なくとも８つの連続する標準的な塩基対を含み、好ましくは、少なくとも８以上１２以下の連続する標準的な塩基対を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  29. 前記ｄｓＲＮＡ領域中または各ｄｓＲＮＡ領域中の前記リボヌクレオチドの全てが、標準的な塩基対または非標準塩基対と塩基対形成する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  30. 前記センスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド、または前記アンチセンスリボヌクレオチド配列の１つ以上のリボヌクレオチド、またはその両方が、塩基対形成をしない、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  31. 前記アンチセンスＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ分子の領域の前記相補体に対して配列が、１００％未満同一、または約８０％〜９９．９％同一、または約９０％〜９８％同一、または約９５％〜９８％同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  32. 前記アンチセンスＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ分子の領域に対して配列が、１００％同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  33. 前記センスもしくは前記アンチセンスリボヌクレオチド配列、好ましくはその両方が、少なくとも５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、または約１００〜約１，０００、または２０〜約１０００ヌクレオチド長、または２０〜約５００のヌクレオチド長である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  34. 前記センスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチドの数が、前記アンチセンスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチドの数の約９０％〜約１１０％である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  35. 前記センスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチド数が、前記アンチセンスリボヌクレオチド配列中のリボヌクレオチド数と同じである、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  36. 前記キメラＲＮＡ分子が、前記第１の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列もしくは前記第２の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列、またはその両方をさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  37. 前記キメラＲＮＡ分子が、前記第２の５’リボヌクレオチドに共有結合した５’伸長配列もしくは前記第１の３’リボヌクレオチドに共有結合した３’伸長配列、またはその両方をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  38. 同じであるか、異なっている２つ以上ｄｓＲＮＡ領域を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  39. 真核細胞に発現するとき、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有する類似のＲＮＡ分子のプロセシングと比較すると、長さが２２及び／または２０リボヌクレオチドであるより大きいａｓＲＮＡ分子が形成される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
  40. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子をコードする単離及び／または外因性ポリヌクレオチド。
  41. ＤＮＡ構築物である、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 宿主細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの前記ＲＮＡ分子の発現を指示することができるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４０または請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで機能するプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 好ましくは５’伸長配列または少なくとも１つのループ配列のイントロンを含むＲＮＡ前駆体分子をコードする請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、前記イントロンが、宿主細胞中またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの前記ポリヌクレオチドの転写中にスプライシングで切り出されることができる、前記ポリヌクレオチド。
  45. 請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  46. ウイルスベクターである、請求項４５に記載のベクター。
  47. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４５もしくは請求項４６のベクターのうちの１つ以上もしくは全てを含む宿主細胞。
  48. 細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、植物細胞または動物細胞、好ましくは植物細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
  49. 死んでいる及び／または生殖不能である、請求項４７または請求項４８に記載の宿主細胞。
  50. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子をコードし、及び／またはそれを含み、前記ポリヌクレオチドの前記プロモーター領域が、標準的な塩基対と完全に塩基対形成した対応するｄｓＲＮＡ領域を有するＲＮＡ分子をコードしている対応するポリヌクレオチドの前記プロモーターと比較した場合、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満など、より低いレベルのメチル化を有する、請求項４２もしくは請求項４３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  51. 好ましくは植物細胞または真菌細胞であり、前記キメラＲＮＡ分子もしくは前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方を含み、前記キメラＲＮＡ分子は、５’から３’の順で、前記第１のセンスリボヌクレオチド配列、ループ配列を含む前記第１の結合リボヌクレオチド配列、及び前記第１のアンチセンスリボヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載の宿主細胞。
  52. 真核生物細胞であり、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピーを含み、
    ｉ）前記真核細胞における前記標的ＲＮＡ分子の前記発現または活性の低下のレベルが、前記細胞が前記ポリヌクレオチドの単一コピーを有する場合の前記標的ＲＮＡ分子の前記発現または活性の低下のレベルとほぼ同じか、またはそれよりも大きい、及び／または
    ｉｉ）前記真核生物細胞における前記標的ＲＮＡ分子の前記発現または活性の減少のレベルが、標準的な塩基対と完全に塩基対形成する対応するｄｓＲＮＡ領域を有するＲＮＡ分子を含む対応する細胞と比較した場合に低い、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  53. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、または請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞のうちの１つ以上または全てを含む非ヒト生物。
  54. 請求項４０〜４４または５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト生物、好ましくは植物または真菌である、請求項５３に記載の非ヒト生物。
  55. 前記ポリヌクレオチドが、前記生物のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項５４に記載の非ヒト生物。
  56. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、請求項４０〜４４または５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞または無細胞発現系で発現させることを含む、前記方法。
  57. 前記ＲＮＡ分子を少なくとも部分的に精製することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 請求項５４または請求項５５に記載の非ヒト生物を生成する方法であって、請求項４０〜４４または請求項５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、細胞のゲノムに安定的に組み込まれるように前記細胞に導入することと、前記細胞から前記非ヒト生物を生成することと、を含む、方法。
  59. 請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞の抽出物であって、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、または請求項４０〜４４または５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含む、前記抽出物。
  60. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項５９に記載の抽出物、及び１つ以上の適切な担体のうちの１つ以上を含む、組成物。
  61. 医薬組成物である、請求項６０に記載の組成物。
  62. フィールドで生育する植物への適用に適している、請求項６０に記載の組成物。
  63. 前記キメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成されるＲＮＡ分子、及びポリヌクレオチドのうちの１つ以上の安定性を増強する、及び／または前記ＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子もしくは前記ポリヌクレオチドが生物の細胞により取り込まれるのを助ける、少なくとも１つの化合物をさらに含む、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 前記化合物がトランスフェクション促進剤である、請求項６３に記載の組成物。
  65. 細胞または生物における標的ＲＮＡ分子のレベル及び／または活性を低下または下方制御する方法であって、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物のうちの１つ以上を前記細胞または生物に送達することを含む、前記方法。
  66. 前記キメラＲＮＡ分子もしくは前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方を、前記細胞もしくは生物、好ましくは植物細胞、植物、真菌もしくは昆虫に、前記細胞もしくは生物への局所適用によって接触させるか、または前記生物のための飼料中に提供する、請求項６５に記載の方法。
  67. 害虫もしくは病原体による非ヒト生物への損傷を減少させる方法であって、前記方法は、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物のうちの１つ以上を、前記害虫または病原体に送達すること、または前記害虫または病原体に接触させることを含む、方法。
  68. 非ヒト生物を防除する方法であって、前記非ヒト生物に、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物のうちの１つ以上を送達することを含み、前記ＲＮＡ分子、短鎖ＲＮＡ分子が、前記非ヒト生物に有害な影響を与える、前記方法。
  69. 前記非ヒト生物が節足動物または植物である、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の非ヒト生物が植物であり、前記節足動物が前記植物またはその一部を摂食する、請求項６９に記載の方法。
  71. 対象の疾患を予防または治療する方法であって、前記方法は、前記対象に請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物のうちの１つ以上を投与することを含み、前記キメラＲＮＡ分子もしくは前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方が、前記疾患の少なくとも１つの症状に対して有益な影響を与える、前記方法。
  72. 前記キメラＲＮＡ分子、ポリヌクレオチド、ベクターまたは組成物が、局所的、経口的または注射的に投与される、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記対象が脊椎動物である、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. 前記脊椎動物が、ヒトなどの哺乳動物である、請求項７３に記載の方法。
  75. 対象の疾患の予防または治療に使用するための、前記キメラＲＮＡ分子もしくは前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方が、前記疾患の少なくとも１つの症状に対して有益な影響を与える、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
  76. 対象の疾患を予防または治療するための医薬品を製造するための、前記キメラＲＮＡ分子もしくは前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、またはその両方が、前記疾患の少なくとも１つの症状に対して有益な影響を与える、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  77. 請求項１〜３９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子、前記キメラＲＮＡ分子のプロセシングにより生成される短鎖ＲＮＡ分子、請求項４０〜４４もしくは５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５もしくは請求項４６に記載のベクター、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項５９に記載の抽出物、または請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の組成物のうちの１つ以上を含む、キット。
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