BR112021001978A2

BR112021001978A2 - molécula de ácido ribonucleico quimérico, polinucleotídeo isolado e/ou exógeno, vetor, célula hospedeira, organismo não humano, método para produzir uma molécula de ácido ribonucleico quimérico, extrato de uma célula hospedeira, composição, método para reduzir ou infrarregular o nível e/ou atividade de uma molécula de rna alvo em uma célula ou um organismo, método para reduzir danos causados por uma praga ou patógeno a um organismo não humano, método para controlar um organismo não humano, método para evitar ou tratar uma doença em um sujeito, uso de uma molécula de ácido ribonucleico quimérico e kit

Info

Publication number: BR112021001978A2
Application number: BR112021001978-2A
Authority: BR
Inventors: Neil Andrew SMITH; Robert De Feyter; Ming Bo WANG; Daai ZHANG; Timothy James Doran; Mark Tizard; Annapurna Devi ALLU; Ian Kevin GREAVES; Lingling Gao; Jonathan Paul ANDERSON
Original assignee: Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-05-04
Also published as: CA3108536A1; PH12021500009A1; EP3830268A4; KR20210054518A; EP3830268A1; AU2019313162B2; MX2021001360A; IL280562A; ZA202101256B; US20210269800A1; WO2020024019A1; JP2021533812A; CN112888785A; SG11202101059WA; AU2019313162A1

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO E/OU EXÓGENO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, ORGANISMO NÃO HUMANO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO, EXTRATO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA REDUZIR OU INFRARREGULAR O NÍVEL E/OU ATIVIDADE DE UMA MOLÉCULA DE RNA ALVO EM UMA CÉLULA OU UM ORGANISMO, MÉTODO PARA REDUZIR DANOS CAUSADOS POR UMA PRAGA OU PATÓGENO A UM ORGANISMO NÃO HUMANO, MÉTODO PARA CONTROLAR UM ORGANISMO NÃO HUMANO, MÉTODO PARA EVITAR OU TRATAR UMA DOENÇA EM UM SUJEITO,USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICOE KIT. A presente invenção se refere a novas estruturas de RNA de filamento duplo (dsRNA) e seu uso no silenciamento de gene.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO E/OU EXÓGENO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, ORGANISMO NÃO HUMANO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO, EXTRATO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA REDUZIR OU INFRARREGULAR O NÍVEL E/OU ATIVIDADE DE UMA MOLÉCULA DE RNA ALVO EM UMA CÉLULA OU UM ORGANISMO, MÉTODO PARA REDUZIR DANOS CAUSADOS POR UMA PRAGA OU PATÓGENO A UM ORGANISMO NÃO HUMANO, MÉTODO PARA CONTROLAR UM ORGANISMO NÃO HUMANO, MÉTODO PARA EVITAR OU TRATAR UMA DOENÇA EM UM SUJEITO, USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO E KIT CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a novas estruturas de RNA de filamento duplo (dsRNA) e seu uso no silenciamento de gene.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O silenciamento de RNA é um mecanismo de silenciamento de genes conservados evolutivamente em eucariotas que é induzido por RNA de filamento duplo (dsRNA), que pode ter uma forma designada de RNA estruturado em grampo (hpRNA). Na via de silenciamento de RNA básico, o dsRNA é processado por proteínas Dicer em pequenas duplas de RNA curtas de 20 a 25 nucleotídeos (nt), das quais um filamento é ligado às proteínas Argonauta (AGO) para formar um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Esse complexo de silenciamento usa o RNA pequeno como um guia para encontrar e se ligar ao RNA de filamento único complementar, em que a proteína AGO cliva o RNA resultando em sua degradação.

[0003] Em plantas, existem múltiplas vias de silenciamento de RNA, incluindo microRNA (miRNA), RNA interferente pequeno de ação trans (tasiRNA), siRNA associado à repetição (rasiRNA) e vias de siRNA (exosiRNA) exogênicas (vírus e transgene). miRNAs são RNAs pequenos de 20 a 24 nt processados no núcleo por semelhante a Dicer 1 (DCL1) a partir de RNAs precursores de ansa pedunculada curta que são transcritos por RNA polimerase II de genes MIR. tasiRNAs são siRNAs faseados primariamente de 21 nt de tamanho derivados do processamento de DCL4 de dsRNA longo sintetizado por RNA polimerase 6 dependente de RNA (RDR6) a partir do fragmento de RNA TAS clivado por miRNA.

Os rasiRNAs de 24 nt são processados por DCL3, e o dsRNA precursor é gerado pela função combinada de RNA polimerase IV (PolIV) dependente de DNA específica de planta e RDR2 a partir de DNA repetitivo no genoma.

A via de exosiRNA se sobrepõe às vias de tasiRNA e rasiRNA e tanto DCL4 quanto DCL3 estão envolvidas no processamento de exosiRNA.

Além de DCL1, DCL3 e DCL4, a planta modelo Arabidopsis thaliana e outras plantas superiores codificam DCL2 ou equivalente, que gera siRNAs de 22 nt incluindo exosiRNAs de 22 nt e desempenha um papel chave no silenciamento de genes sistêmico e transitivo em plantas.

Todos esses RNAs pequenos de plantas são metilados no grupo 2'-hidroxila do nucleotídeo terminal 3' por Intensificador HUA 1 (HEN1), e acredita-se que essa 2'-O- metilação do terminal 3' estabilize os RNAs pequenos em células vegetais. miRNAs, tasiRNAs e exosiRNAs são funcionalmente semelhantes a RNAs pequenos em células animais que são envolvidos no silenciamento de genes pós-transcricional ou degradação específica de sequência de RNA em animais.

Os rasiRNAs, no entanto, são exclusivos das plantas e funcionam para direcionar a metilação de novo da citosina no DNA cognato, um mecanismo de silenciamento do gene transcricional conhecido como metilação de DNA dirigida por RNA (RdDM).

[0004] O silenciamento de RNA induzido por dsRNA foi amplamente explorado para reduzir a atividade do gene em vários sistemas eucarióticos, e várias tecnologias de silenciamento de genes foram desenvolvidas. Diferentes organismos são frequentemente receptivos a diferentes abordagens de silenciamento de genes. Por exemplo, dsRNA longo (pelo menos 100 pares de base de comprimento) é menos adequado para induzir o silenciamento de RNA em células de mamíferos devido a respostas de interferon induzidas por dsRNA e, portanto, dsRNAs mais curtos (menos de 30 pares de base) são geralmente usados em células de mamíferos, enquanto que em plantas RNA em grampo (hpRNA) com uma haste longa de dsRNA é altamente eficaz. Nas plantas, as diferentes vias de silenciamento de RNA levaram a diferentes tecnologias de silenciamento de genes, tais como miRNA artificial, tasiRNA artificial e tecnologias de silenciamento de gene induzido por vírus. No entanto, as aplicações bem-sucedidas de silenciamento de RNA em plantas foram alcançadas até agora principalmente pelo uso de transgenes de hpRNA longos. Um construto de transgene de hpRNA consiste tipicamente em uma repetição invertida composta de sequências de senso e antissentido totalmente complementares de uma sequência de gene alvo (que quando transcrita forma a haste de dsRNA de hpRNA) separada por uma sequência espaçadora (que forma o laço de hpRNA), que é inserido entre um promotor e um terminador de transcrição para expressão em células vegetais. A sequência espaçadora funciona para estabilizar o DNA de repetição invertida em bactérias durante a preparação do construto. A haste de dsRNA do transcrito de hpRNA resultante é processada por proteínas DCL em siRNAs que direcionam o silenciamento do gene alvo. Os transgenes de hpRNA têm sido amplamente usados para diminuir a expressão gênica, modificar as vias metabólicas e aumentar a resistência a doenças e pragas em plantas para o melhoramento da cultura, e muitas aplicações bem-sucedidas da tecnologia no melhoramento da cultura foram relatadas (Guo et al., 2016; Kim et al., 2019).

[0005] Estudos recentes sugeriram, no entanto, que os transgenes de hpRNA estão sujeitos à repressão transcricional autoinduzida que compromete a estabilidade e eficácia do silenciamento do gene alvo. Embora todos os transgenes estejam potencialmente sujeitos a silenciamento transcricional dependente de posição ou número de cópias, os transgenes hpRNA são únicos uma vez que os mesmos geram siRNAs que podem direcionar a metilação do DNA para sua própria sequência através da via RdDM, e isso tem o potencial de causar autossilenciamento transcricional.

[0006] Enquanto o silenciamento de gene induzido por dsRNA se provou ser uma ferramenta valiosa na alteração do fenótipo de um organismo, existe uma necessidade por moléculas de dsRNA alternativas, de preferência, aprimoradas que possam ser usadas para RNAi.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0007] Os inventores conceberam novos designs de construtos genéticos para a produzir moléculas de RNA que incluem uma ou mais regiões de RNA de filamento duplo que compreendem mútiplos nucleotídeos emparelhados em base não canonicamente ou nucleotídeos não emparelhados em base, ou ambos, incluindo formas que têm duas ou mais sequências de loop, aqui denominado dsRNA de extremidade em laço (ledRNA).

Essas moléculas de RNA têm uma ou mais das seguintes características; as mesmas são facilmente sintetizadas, as mesmas se acumulam em níveis mais elevados nas células após a transcrição dos construtos genéticos que codificam as mesmas, as mesmas formam mais prontamente uma estrutura de dsRNA e induzem silenciamento eficiente de moléculas de RNA alvo em células eucariotas, e as mesmas podem formar moléculas de RNA circulares mediante processamento em células vegetais. As moléculas de RNA também são eficazes quando aplicadas topicamente em plantas ou na alimentação de animais, tais como insetos.

[0008] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) quimérica, que compreende uma região de RNA de filamento duplo (dsRNA) que compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de senso de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de senso e as primeiras sequências de ribonucleotídeos antissentido são capazes de hibridizar entre si para formar a região de dsRNA, em que

[0009] i) a primeira sequência de ribonucleotídeos de senso consiste em, covalentemente ligada na ordem 5’ a 3’, um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3',

[0010] ii) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em, covalentemente ligada na ordem 5’ a 3’, um segundo ribonucleotídeo 5’, uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3',

[0011] iii) os primeiros pares de base de ribonucleotídeo 5’ com o segundo ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA,

[0012] iv) os segundos pares de base de ribonucleotídeo 5’ com o primeiro ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA,

[0013] v) entre cerca de 5% e cerca de 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de senso e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, são emparelhados em base em um par de base não canônico ou não são emparelhados em base,

[0014] vi) a região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos,

[0015] vii) a molécula de RNA é capaz de ser processada em uma célula eucariota ou in vitro, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas curtas de RNA antissentido (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento,

[0016] viii) a molécula de RNA ou pelo menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, são capazes de reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA alvo na célula eucariota, e

[0017] ix) a molécula de RNA é capaz de ser produzida enzimaticamente por transcrição in vitro ou em uma célula, ou ambos.

[0018] Em uma modalidade preferencial do primeiro aspecto, a primeira sequência de ribonucleotídeos de senso é ligada covalentemente à primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos, ou entre 4 e 1.000 ribonucleotídeos, ou entre 4 e 200 ribonucleotídeos, ou entre 4 e 50 ribonucleotídeos, ou pelo menos 10 nucleotídeos, ou entre 10 e 1.000 ribonucleotídeos, ou entre 10 e 200 ribonucleotídeos, ou entre 10 e 50 ribonucleotídeos de comprimento, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3’ e ao segundo ribonucleotídeo 5' ou ao segundo ribonucleotídeo 3’ e ao primeiro ribonucleotídeo 5', de modo que as sequências estejam compreendidas em um filamento único contíguo de RNA. Em outra modalidade, a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3’ e ao primeiro ribonucleotídeo 5' ou, de preferência, ao primeiro ribonucleotídeo 3’ e ao segundo ribonucleotídeo 5', de modo que as sequências estejam compreendidas em um filamento único contíguo de RNA.

[0019] Em sua forma mais simples, essa molécula de RNA é conhecida como RNA em grampo (hpRNA). Em uma modalidade mais preferencial, entre cerca de 5% e cerca de 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de senso e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido do dsRNA, no total, são emparelhados em base em pares de base não canônicos, de preferência pares de base G:U. Ou seja, todos os ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de senso são emparelhados em base a ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em pares de base canônicos ou pares de base não canônicos, em que a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos que incluem alguns pares de base não canônicos. A região de dsRNA, portanto, não compreende 20 pares de base canônicos contíguos. Em uma modalidade mais preferencial do hpRNA da invenção, a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é totalmente complementar a uma região do RNA alvo. Nessa modalidade, a primeira sequência de ribonucleotídeos de senso é diferente em sequência da região do RNA alvo pela substituição de nucleotídeos C na região do RNA alvo por nucleotídeos U no hpRNA. Tais moléculas são exemplificadas nos RNAs em grampo que compreendem pares de base G:U nos Exemplos 6 a 11. Em modalidades preferenciais, o comprimento da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é de 20 a cerca de 1.000 nucleotídeos, ou 20 a cerca de 500 nucleotídeos, ou outros comprimentos como descrito no presente documento. Mais preferencialmente, o hpRNA é produzido em, ou introduzido em, uma célula vegetal ou uma célula fúngica. Nessas modalidades, o RNA alvo pode ser um transcrito de um gene endógeno na célula, ou de um patógeno de planta, ou de uma praga, tal como uma praga de insetos.

[0020] Em uma modalidade mais preferencial, a molécula de RNA compreende que uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido sejam ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, em que a primeira a sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3’ e ao segundo ribonucleotídeo 5', e a molécula de RNA compreende adicionalmente uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3’ e a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, formando assim uma estrutura ledRNA. Em uma modalidade preferencial alternativa, a molécula de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3’ e o primeiro ribonucleotídeo 5', e a molécula de RNA compreende adicionalmente uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3’ e à segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, formando assim uma estrutura ledRNA.

[0021] Em modalidade preferencial adicional, a molécula de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e as segundas sequências de ribonucleotídeo antissentido têm capacidade para hibridizar uma à outra para formar uma segunda região de dsRNA, e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3’ e ao segundo ribonucleotídeo 5', e a molécula de RNA, adicional ou opcionalmente, compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3’ e à segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido ou que liga covalentemente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, formando assim uma estrutura ledRNA.

Em uma modalidade preferencial adicional, a molécula de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3’ e ao primeiro ribonucleotídeo 5', e a molécula de RNA, adicional ou opcionalmente, compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3’ e à segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido ou que liga covalentemente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, formando assim uma estrutura ledRNA.

Em modalidades mais preferenciais, a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, se presentes na molécula de RNA, compreendem, cada uma, pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento.

Nessas modalidades, a primeira e a segunda sequências de ribonucleotídeos de sentido podem ser ligadas covalentemente por uma sequência de ribonucleotídeos interveniente que não é relacionada em sequência a uma molécula de RNA alvo ou que é relacionada em sequência a uma molécula de RNA alvo, ou a primeira e segunda sequências de ribonucleotídeos de sentido são ligadas covalentemente sem uma sequência de ribonucleotídeos interveniente.

A primeira e a segunda sequências de ribonucleotídeos de sentido podem formar uma região de ribonucleotídeos de sentido contígua que tem pelo menos 50% de identidade na sequência com uma molécula de RNA alvo.

Em modalidades adicionais, a primeira e a segunda sequências de ribonucleotídeos antissentido podem ser ligadas covalentemente por uma sequência de ribonucleotídeos interveniente que não é relacionada em sequência ao complemento de uma molécula de RNA alvo, ou que é relacionada em sequência ao complemento de uma molécula de RNA, ou a primeira e a segunda sequências de ribonucleotídeos antissentido são ligadas covalentemente sem uma sequência de ribonucleotídeos interveniente.

A primeira e a segunda sequências de ribonucleotídeo antissentido podem formar uma região de ribonucleotídeo antissentido contígua que tem pelo menos 50% de identidade na sequência com o complemento de uma molécula de RNA alvo.

Nessas modalidades, a molécula de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido que hibridizam por emparelhamento em base, de preferência entre 5%

e 40% dos ribonucleotídeos da segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e da segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, são emparelhados em base em um par de base não canônico ou não são emparelhados em base, de preferência, emparelhados em base em pares de base G:U, em que a segunda região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos e em que a molécula de RNA é capaz de ser processada em uma célula eucariota ou in vitro em que a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido (asRNA) curtas de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento.

[0022] Em uma modalidade mais preferencial, considerando a molécula de RNA como um todo e cada região de dsRNA dentro da molécula de RNA, entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos de cada sequência de ribonucleotídeos de sentido e sua sequência de ribonucleotídeos antissentido correspondente que hibridiza por emparelhamento em base, no total, são emparelhados em base em um par de base não canônico ou não são emparelhados em base, a molécula de RNA como um todo não compreende 20 pares de base canônicos contíguos em qualquer uma de suas regiões de dsRNA, e a molécula de RNA é capaz de ser processada em uma célula eucariota ou in vitro em que cada sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curtas (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento.

[0023] Em modalidades preferenciais, cada sequência de ribonucleotídeos de ligação tem independentemente entre 4 e cerca de 2.000 nucleotídeos de comprimento, de preferência entre 4 e cerca de 1.200 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente entre 4 e cerca de 200 nucleotídeos de comprimento e com máxima preferência entre 4 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende adicionalmente uma sequência dianteira de 5’ ou uma sequência traseira de 3’ ou ambas.

[0024] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) quimérico, que compreende uma região de RNA de filamento duplo (dsRNA) que compreende uma sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que têm capacidade para hibridizar entre si para formar a região dsRNA, em que

[0025] i) a sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em, ligada covalentemente na ordem 5’ a 3’, um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3',

[0026] ii) a sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em, ligada covalentemente na ordem 5’ a 3’, um segundo ribonucleotídeo 5’, uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3',

[0027] iii) os primeiros pares de base de ribonucleotídeo 5’ com o segundo ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA,

[0028] iv) os segundos pares de base de ribonucleotídeo 5’ com o primeiro ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA,

[0029] v) entre cerca de 5% e cerca de 40% dos ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de sentido e da sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, são emparelhados em base em um par de base não canônico ou não são emparelhados em base,

[0030] vi) a região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos,

[0031] vii) a molécula de RNA é capaz de ser processada em uma célula eucariota ou in vitro, em que a sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curtas (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento,

[0032] viii) a molécula de RNA ou pelo menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, têm capacidade para reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA alvo na célula eucariota, e

[0033] ix) a molécula de RNA é capaz de ser produzida enzimaticamente por transcrição in vitro ou em uma célula, ou ambos.

[0034] Como o especialista deve estar ciente, cada uma das modalidades relacionadas ao primeiro aspecto, diferente de quando o comprimento de uma sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma sequência de ribonucleotídeos antissentido são menores do que 20 nucleotídeos contíguos, se aplica ao segundo aspecto.

[0035] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que compreende um primeiro componente de RNA, um segundo componente de RNA que é ligado de modo covalente ao primeiro componente de RNA e, opcionalmente, um ou mais ou todos dentre (i) uma sequência de ribonucleotídeos de ligação que liga de modo covalente o primeiro e segundo componentes de RNA, (ii) uma sequência dianteira de 5' e (iii) uma sequência traseira de 3',

[0036] em que o primeiro componente de RNA consiste em, na ordem 5' a 3', um primeiro ribonucleotídeo 5', uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', em que os primeiro ribonucleotídeos 5' e 3' realizam emparelhamento de base um com o outro na molécula de RNA, em que a primeira sequência de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, uma primeira sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido hibridizam com a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido na molécula de RNA, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido tem capacidade para hibridizar a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo,

[0037] em que o segundo componente de RNA é ligado de modo covalente, por meio da sequência de ribonucleotídeo de ligação se presente ou diretamente se a sequência de ribonucleotídeo de ligação não estiver presente, ao primeiro ribonucleotídeo 5' ou ao primeiro ribonucleotídeo 3',

[0038] em que o segundo componente de RNA consiste em, na ordem 5' a 3', um segundo ribonucleotídeo 5', uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucletídeo 3', em que os segundos ribonucleotídeos 5' e 3' realizam emparelhamento de base um com o outro na molécula de RNA, em que a segunda sequência de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma segunda sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma segunda sequência de ribonucletídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido hibridizam com a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido na molécula de RNA,

[0039] em que a sequência dianteira de 5', se presente, consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 5' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3' ou ao segundo ribonucleotídeo 5' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5', e

[0040] em que a sequência traseira de 3', se presente, consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucletídeo 3' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3' ou ao primeiro ribonucleotídeo 3' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5'.

[0041] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de RNA que compreende um primeiro componente de RNA, um segundo componente de RNA que é ligado de modo covalente ao primeiro componente de RNA e, opcionalmente, um ou mais ou todos dentre (i) uma sequência de ribonucleotídeo de ligação que liga de modo covalente o primeiro e segundo componentes de RNA, (ii) uma sequência dianteira de 5' e (iii) uma sequência traseira de 3',

[0042] em que o primeiro componente de RNA consiste em, na ordem 5' a 3', um primeiro ribonucleotídeo 5', uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', em que os primeiros ribonucleotídeos 5' e 3' realizam emparelhamento de base, em que a primeira sequência de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma primeira sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consistem, cada uma, em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos pelos quais os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido realizam, completamente, emparelhamento de base com os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido ou os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são idênticos em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo ou seu complemento, respectivamente, ou ambos,

[0043] em que o segundo componente de RNA é covalentemente ligado, por meio da sequência de ribonucleotídeos de ligação, se presente, ao primeiro ribonucleotídeo 5' ou ao primeiro ribonucleotídeo 3',

[0044] em que o segundo componente de RNA consiste em, na ordem 5' a 3', um segundo ribonucleotídeo 5', uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucletídeo 3', em que os segundos ribonucleotídeos 5’ e 3’ realizam emparelhamento de base, em que a segunda sequência de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma segunda sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma segunda sequência de ribonucletídeos antissentido, em que uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido realiza emparelhamento de base com a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido,

[0045] em que a sequência dianteira de 5', se presente, consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 5' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3' ou ao segundo ribonucleotídeo 5' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5', e

[0046] em que a sequência traseira de 3', se presente, consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucletídeo 3' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3' ou ao primeiro ribonucleotídeo 3' se o segundo componente de RNA for ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5'.

[0047] Em modalidades preferenciais dos aspectos acima, a molécula de RNA da invenção é uma molécula de RNA quimérica.

[0048] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de RNA quimérica que compreende um primeiro componente de RNA e um segundo componente de RNA que é ligado de modo covalente ao primeiro componente de RNA,

[0049] em que o primeiro componente de RNA compreende uma primeira região de RNA de filamento duplo (dsRNA), que compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido que têm capacidade para hibridizar entre si a fim de formar a primeira região de dsRNA, e uma primeira sequência de ribonucleotídeos interveniente de pelo menos 4 nucleotídeos que liga de modo covalente a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido,

[0050] em que o segundo componente de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma segunda sequência de ribonucletídeos antissentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos interveniente de pelo menos 4 ribonucleotídeos que liga de modo covalente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido hibridiza com a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido na molécula de RNA,

[0051] em que no primeiro componente de RNA,

[0052] i) a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5' a 3', um primeiro ribonucleotídeo 5', uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3',

[0053] ii) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5' a 3', a segundo ribonucleotídeo 5', uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucletídeo 3',

[0054] iii) o primeiro ribonucleotídeo 5' realiza emparelhamento de base com o segundo ribonucletídeo 3',

[0055] iv) o segundo ribonucleotídeo 5' realiza emparelhamento de base com o primeiro ribonucleotídeo 3',

[0056] v) entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, têm emparelhamento de base em um par de base não canônico ou não têm emparelhamento de base, e

[0057] vi) a primeira região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos,

[0058] em que a molécula de RNA quimérica tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curto (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento, e em que

[0059] (a) a molécula de RNA quimérica ou pelo menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, têm capacidade para reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA alvo na célula eucariota, ou

[0060] (b) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido compreende uma sequência de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos que são pelo menos 50% idênticos em sequência, de preferência pelo menos 90% ou 100% idênticos em sequência, a uma região do complemento da molécula de RNA alvo, ou

[0061] (c) ambos (a) e (b).

[0062] Em uma modalidade em que a molécula de RNA tem um primeiro componente de RNA, o primeiro ribonucleotídeo 5’ e o primeiro ribonucleotídeo 3' do primeiro componente de RNA formam um par de base entre si. O par de base é definido no presente documento como o terminal de emparelhamento de base da região de dsRNA formado por auto-hibridização do primeiro componente de RNA. Na modalidade em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5' sem quaisquer nucleotídeos intervenientes e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 3' sem quaisquer nucleotídeos intervenientes, o primeiro ribonucleotídeo 5' é diretamente ligado a uma dentre a sequência de sentido e a sequência antissentido e o primeiro ribonucleotídeo 3’ é ligado diretamente à outra dentre a sequência de sentido e a sequência antissentido.

[0063] Em uma modalidade preferencial, os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido têm, todos, a capacidade para realizar emparelhamento de base a nucleotídeos da primeira região da molécula de RNA alvo. Nesse contexto, o emparelhamento em base pode ser canônico ou não canônico, por exemplo, com pelo menos alguns pares de base G:U. Independentemente para cada par de base G:U, o G pode estar na primeira região da molécula de RNA alvo ou de preferência na primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido. Alternativamente, nem todos os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos do primeiro formam par de base com a sequência de ribonucleotídeos antissentido dos nucleotídeos da primeira região da molécula de RNA alvo. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 dos pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido não são emparelhados em base com a primeira região da molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5' sem quaisquer nucleotídeos intervenientes, ou a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3' sem quaisquer nucleotídeos intervenientes,

ou ambos.

[0064] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de RNA compreende uma ou mais sequências de ribonucleotídeos de ligação, em que a sequência de ribonucleotídeos de ligação está relacionada em sequência á molécula de RNA alvo, idêntica pelo menos em parte a uma região da molécula de RNA alvo ou ao seu complemento. Em uma modalidade preferencial, a sequência de ribonucleotídeos de ligação juntamente com sequências de sentido no primeiro e segundo componentes de RNA fazem parte de uma sequência de sentido contígua, ou juntamente com sequências antissentido no primeiro e segundo componentes de RNA fazem parte de uma sequência antissentido contígua. Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende a sequência de ribonucleotídeos de ligação, em que a sequência de ribonucleotídeos de ligação é menor do que 20 ribonucleotídeos. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação hibridiza à molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação é idêntica a uma porção do complemento da molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem entre 1 e 10 ribonucleotídeos.

[0065] Nas modalidades dos aspectos acima, a molécula de RNA compreende uma ou mais ou todas dentre (i) uma sequência de ribonucleotídeos de ligação que liga de modo covalente o primeiro e segundo componentes de RNA, (ii) uma sequência de extensão de 5' e (iii) a sequência de extensão de 3', em que a sequência de extensão de 5', se presente, consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada de modo covalente ao primeiro componente de RNA ou ao segundo componente de RNA, e em que a sequência de extensão de 3', se presente, consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada de modo covalente ao segundo componente de RNA ou ao primeiro componente de RNA, respectivamente. Em uma modalidade, o primeiro componente de RNA e o segundo componente de RNA são covalentemente ligados por meio de uma sequência de ribonucleotídeos de ligação. Em uma modalidade alternativa, o primeiro componente de RNA e o segundo componente de RNA são ligados diretamente, sem qualquer sequência de ribonucleotídeos de ligação presente.

[0066] Nas modalidades do primeiro a quinto aspectos, a molécula de RNA compreende duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido que são, cada uma, idênticas em sequência a uma região de uma molécula de RNA alvo, e a molécula de RNA compreende uma ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido com emparelhamento de base às sequências de ribonucleotídeos de sentido, em que a um ou mais sequências antissentido são complementares, de preferência completamente complementares, às regiões da molécula alvo. Em uma modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido são idênticas em sequência a diferentes regiões da mesma molécula de RNA alvo, que pode, ou não, ser contígua na molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido são idênticas em sequência a uma região de moléculas de RNA alvo diferentes. Em uma modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido não têm sequências de laço intervenientes, isto é, as mesmas são contíguas em relação à molécula de RNA alvo.

[0067] Nas modalidades preferenciais do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA compreende duas ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido, e sequências de ribonucleotídeos de sentido com emparelhamento de base à mesma, cujas sequências antissentido são, cada uma, complementares, de preferência totalmente complementares, a uma região de uma molécula de RNA alvo. As regiões da molécula de RNA alvo às quais as mesmas são complementares podem, ou não, ser contíguas na molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido são complementares a diferentes regiões da mesma molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, a segunda dentre as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido é complementar a uma região de uma molécula de RNA alvo diferente da primeira dentre as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido. Em uma modalidade preferencial, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido não têm sequências de laço intervenientes, isto é, as mesmas são contíguas em relação ao complemento da molécula de RNA alvo. Em uma modalidade preferencial, uma ou ambas dentre as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos antissentido e sequências de ribonucleotídeos de sentido realizam emparelhamento de base ao longo de seu comprimento completo através de pares de base canônicos, ou através de alguns pares de base canônicos e alguns pares de base não canônicos, de preferência pares de base G:U.

[0068] Em uma modalidade preferencial do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA é um filamento único de ribonucleotídeos. Na forma mais simples, a molécula de RNA compreende uma estrutura de RNA em grampo (hpRNA) que tem uma extremidade 5’, uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento, uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que é totalmente emparelhada em base com a sequência de ribonucleotídeos de sentido sobre pelo menos 21 nucleotídeos contíguos, uma sequência de laço interveniente e uma extremidade 3’. A molécula de RNA pode compreender uma sequência dianteira de 5’ e/ou uma sequência traseira de 3’. Em outra forma, a molécula de RNA compreende um filamento único de ribonucleotídeos que tem uma extremidade 5', pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento, uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que tem completo emparelhamento de base com cada sequência de ribonucleotídeos de sentido por pelo menos 21 nucleotídeos contíguos, pelo menos duas sequências de laço e uma extremidade 3'. A ordem 5' a 3' pode ser a sequência de ribonucleotídeos de sentido e, então, a sequência de ribonucleotídeos antissentido ou vice-versa. Em uma modalidade, o ribonucleotídeo na extremidade 5' e o ribonucleotídeo na extremidade 3' são adjacentes, cada um emparelhado em base e não são ligados de modo diretamente covalente, consultar, por exemplo, a Figura 1.

[0069] Em outra modalidade do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido que hibridiza a uma primeira região de um RNA alvo, uma segunda sequência de ribonucletídeos antissentido que hibridiza a uma segunda região de um RNA alvo, sendo que a segunda região do RNA alvo é diferente à primeira região da RNA alvo, e a molécula de RNA que compreende apenas uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 50% de identidade de sequência com o RNA alvo, em que as duas sequências antissentido não são contíguas na molécula de RNA. Em uma modalidade, a primeira e segunda regiões do RNA alvo são contíguas no RNA alvo. Alternativamente, as mesmas não são contíguas.

[0070] Em outra modalidade do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido que é pelo menos 60% idêntica a uma primeira região de um RNA alvo, uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido que é pelo menos 60% idêntica a uma segunda região de um RNA alvo, sendo que a segunda região do RNA alvo é diferente da primeira região do RNA alvo, e a molécula de RNA que compreende apenas uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que hibridiza ao RNA alvo, em que as duas sequências de sentido não são contíguas na moléculas de RNA. Em uma modalidade, a primeira e segunda regiões do RNA alvo são contíguas na molécula de RNA alvo. Alternativamente, as mesmas não são contíguas. Nas modalidades preferenciais, a primeira e segunda sequências de ribonucleotídeos de sentido são, cada uma, independentemente, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%), pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à respectiva região de RNA alvo, isto é, a primeira sequência de sentido pode ser pelo menos 70% idêntica à sua região alvo e a segunda sequência pelo menos 80% idêntica à sua sequência alvo, etc.

[0071] Em uma modalidade preferencial do primeiro a quarto aspectos, a molécula de RNA é um único filamento de ribonucleotídeos que tem uma extremidade 5', pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento, uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que tem emparelhamento de base completo com cada sequência de ribonucleotídeos de sentido por meio de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos, pelo menos duas sequências de laço e uma extremidade 3'. Em uma modalidade mais preferencial, o emparelhamento de base na molécula de RNA é compreendido em uma região de filamento duplo que tem pelo menos 21 pares de base contíguos de comprimento que incluem alguns pares de base não canônicos, com máxima preferência alguns pares de base G:U, sendo que a região de filamento duplo compreende a pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento.

[0072] Nas modalidades preferenciais do terceiro e quarto aspectos, o segundo componente de RNA é caracterizado pelo fato de que:

[0073] i) a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5' a 3', o segundo ribonucleotídeo 5', uma terceira sequência de RNA e um terceiro ribonucleotídeo 3',

[0074] ii) a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5' a 3', um terceiro ribonucleotídeo 5', uma quarta sequência de RNA e o segundo ribonucletídeo 3',

[0075] iii) o segundo ribonucleotídeo 5' realiza emparelhamento de base com o segundo ribonucletídeo 3',

[0076] iv) o terceiro ribonucleotídeo 3' realiza emparelhamento de base com o terceiro ribonucleotídeo 5',

[0077] em que a molécula de RNA quimérica tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pela qual a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curto (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento. Com máxima preferência, as moléculas de asRNA produzidas a partir da segunda sequência antissentido têm capacidade para reduzir a expressão do RNA alvo, sem ou em combinação com as RNAs produzidas a partir da primeira sequência antissentido do primeiro componente de RNA.

[0078] Em uma modalidade preferencial do quinto aspecto, o segundo componente de RNA é caracterizado pelo fato de que:

[0079] i) a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5' a 3', um terceiro ribonucleotídeo 5', uma terceira sequência de RNA e um terceiro ribonucleotídeo 3',

[0080] ii) a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5' a 3', um quarto ribonucleotídeo 5', uma quarta sequência de RNA e o quarto ribonucletídeo 3',

[0081] iii) o terceiro ribonucleotídeo 5' realiza emparelhamento de base com o segundo ribonucletídeo 3',

[0082] iv) o terceiro ribonucleotídeo 3' realiza emparelhamento de base com o terceiro ribonucleotídeo 5',

[0083] em que a molécula de RNA quimérica tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro de modo que a segunda sequência de ribonucletídeos antissentido seja clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curto (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento.

[0084] Em cada uma das modalidades preferenciais acima, é mais preferencial que entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido e/ou da segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e da segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, e/ou cada sequência de ribonucleotídeos de sentido e sua sequência de ribonucleotídeos antissentido correspondente que hibridiza, no total, sejam emparelhados em base em um par de base não canônico ou não sejam emparelhados em base e/ou a região de dsRNA formada entre as sequências de sentido e antissentido complementares não compreenda 20 pares de base canônicos contíguos.

Mais preferencialmente, cerca de 12%, cerca de 15%, cerca de 18%, cerca de 21%, cerca de 24%, cerca de 27%, cerca de 30%, entre 10% e 30%, ou entre 15% e 30%, ou ainda mais preferencialmente entre 16% e 25%, dos ribonucleotídeos de uma sequência de ribonucleotídeos de sentido e sua sequência de ribonucleotídeos antissentido correspondente, de preferência para cada região de dsRNA na molécula de RNA, no total, são emparelhados em base em um par de base não canônico ou não são emparelhados em base.

Ainda mais preferencialmente, cerca de 12%, cerca de 15%, cerca de 18%, cerca de 21%, cerca de 24%, cerca de 27%, cerca de 30%, entre 10% e 30%, ou entre 15% e 30%, ou ainda mais preferencialmente entre 16% e 25%, dos ribonucleotídeos da região (ou regiões) de dsRNA na molécula de RNA, no total, são emparelhados em base em pares de base não canônicos e todos os outros ribonucleotídeos da região (ou regiões) de dsRNA na molécula de RNA são emparelhados em base em pares de base canônicos.

Nas modalidades preferenciais, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100% dos pares de base não canônicos na primeira ou segunda região de dsRNA, ou todas as regiões de dsRNA, no total, são pares de base G:U. Com máxima preferência, nessas modalidades,

[0085] (a) a molécula de RNA quimérica ou pelo menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambos, têm capacidade para reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA alvo em uma célula eucariota, ou

[0086] (b) a primeira e a segunda sequências de ribonucleotídeos antissentido, de preferência cada sequência de ribonucleotídeos antissentido na molécula de RNA, compreende uma sequência de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos que é pelo menos 50% idêntica em sequência a uma região do complemento da molécula de RNA alvo, de preferência pelo menos 60% idêntica, com mais preferência pelo menos 70% idêntica, com ainda mais preferência pelo menos 80%) idêntica, com máxima preferência pelo menos 90% idêntica ou 100% idêntica à região do complemento da molécula de RNA alvo, ou ambos (a) e (b).

[0087] Em uma modalidade do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA compreende uma sequência dianteira de 5' ou sequência de extensão de 5'. Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência traseira de 3' ou sequência de extensão de 3'. Em uma modalidade preferencial, a molécula de RNA compreende tanto a sequência dianteira/extensão de 5' quanto a sequência traseira/extensão de 3'.

[0088] Em uma modalidade do primeiro ao quinto aspectos, cada ribonucleotídeo da molécula de RNA é covalentemente ligado a dois outros nucleotídeos, isto é, é um círculo covalentemente fechado. Alternativamente, a molécula de RNA pode ser representada como um formato de haltere (Figura 1), mas tem uma lacuna ou corte em uma parte da estrutura de filamento duplo.

[0089] Em uma modalidade do primeiro ao quinto aspectos, pelo menos uma ou todas as sequências de laço da molécula de RNA são maiores do que 20 nucleotídeos. Em uma modalidade preferencial, pelo menos um dos laços da molécula de RNA tem entre 4 e 1.200 ribonucleotídeos de comprimento, ou entre 4 e 1.000 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade mais preferencial, todos os laços têm entre 4 e

1.000 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade mais preferencial, pelo menos um dos laços da molécula de RNA tem entre 4 e 200 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade ainda mais preferencial, todos os laços têm entre 4 e 200 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade ainda mais preferencial, pelo menos um dos laços da molécula de RNA tem entre 4 e 50 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade com máxima preferência, todos os laços têm entre 4 e 50 ribonucleotídeos de comprimento. Em modalidades, o comprimento mínimo do laço é de 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotídeos ou 50 nucleotídeos. Em uma modalidade, a célula eucariota é uma célula de animal vertebrado ou uma célula vegetal, e cada laço da molécula de RNA é independentemente entre 20 e 50 ribonucleotídeos, ou entre 20 e 40 ribonucleotídeos ou entre 20 e 30 ribonucleotídeos de comprimento.

[0090] Em uma modalidade preferencial, pelo menos uma sequência de laço na molécula de RNA compreende uma ou mais sequências de ligação que são complementares a uma molécula de RNA que é endógena à célula eucariota, tal como,

por exemplo, um miRNA ou outro RNA regulador na célula eucariota. Como seria prontamente entendido, essa característica pode estar em combinação com qualquer uma das características de comprimento de laço, emparelhamento em base não canônico e qualquer uma das outras características descritas acima para a molécula de RNA. Em uma modalidade, pelo menos uma sequência de laço compreende múltiplas sequências de ligação para um miRNA, ou sequências de ligação para múltiplos miRNAs, ou ambos. Em uma modalidade, pelo menos uma sequência de laço na molécula de RNA compreende uma fase de leitura aberta que codifica um polipeptídeo ou um polinucleotídeo funcional. A fase de leitura aberta é, de preferência, ligada operacionalmente a uma sequência de iniciação de tradução, pelo que a fase de leitura aberta é capaz de ser traduzida em uma célula eucariota de interesse. Por exemplo, a sequência de iniciação da tradução compreende, ou é compreendida em um local de entrada de ribossomo interno (IRES). O IRES é de preferência um IRES eucariota. O polipeptídeo traduzido tem de preferência 50 a 400 resíduos de aminoácidos de comprimento, ou 50 a 300 ou 50 a 250, ou 50 a 150 resíduos de aminoácidos de comprimento. Tais moléculas de RNA, quando produzidas em uma célula vegetal, têm capacidade para ser processadas para formar moléculas de RNA circulares que compreendem a maior parte ou a totalidade da sequência de laço e que têm capacidade para ser traduzidas para fornecer níveis altos do polipeptídeo.

[0091] Nas modalidades do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA não tem nenhuma, ou uma, ou duas ou mais protuberâncias em uma região de filamento duplo. Neste contexto, uma protuberância é um nucleotídeo, ou duas ou mais nucleotídeos contíguos, na sequência de ribonucleotídeos de sentido ou antissentido que não tem emparelhamento de base na região de dsRNA e não tem um nucleotídeo incompatível na posição correspondente na sequência complementar na região de dsRNA. A região de dsRNA da molécula de RNA pode compreender uma sequência de mais que 2 ou 3 nucleotídeos dentro da sequência de sentido ou antissentido, ou ambos, que cria laços a partir da região de dsRNA quando a estrutura de dsRNA se forma. A sequência que cria laços pode, por si só, formar algum emparelhamento de base interno, por exemplo, por, por si só, formar uma estrutura em ansa pedunculada.

[0092] Nas modalidades do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA não tem nenhuma, ou uma, ou duas ou mais protuberâncias em uma região de filamento duplo. Neste contexto, uma protuberância é um nucleotídeo, ou duas ou mais nucleotídeos contíguos, na sequência de ribonucleotídeos de sentido ou antissentido que não tem emparelhamento de base na região de dsRNA e não tem um nucleotídeo incompatível na posição correspondente na sequência complementar na região de dsRNA. A região de dsRNA da molécula de RNA pode compreender uma sequência de mais que 2 ou 3 nucleotídeos dentro da sequência de sentido ou antissentido, ou ambos, que cria laços a partir da região de dsRNA quando a estrutura de dsRNA se forma. A sequência que cria laços pode, por si só, formar algum emparelhamento de base interno, por exemplo, por, por si só, formar uma estrutura em ansa pedunculada.

[0093] Em uma modalidade, a molécula de RNA tem três, quatro ou mais laços. Em uma modalidade preferencial, a molécula de RNA tem apenas dois laços. Em uma modalidade, a primeira região de filamento duplo, ou a primeira e segunda regiões de dsRNA, ou cada região de dsRNA, da molécula de RNA compreende um, ou dois, ou mais nucleotídeos que não têm emparelhamento de base na região de filamento duplo, ou independentemente até 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% dos nucleotídeos na região de filamento duplo que não têm emparelhamento de base.

[0094] Em modalidades preferenciais do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA alvo ou a molécula de RNA da invenção, ou ambas, estão em uma célula eucariota. Por exemplo, a célula eucariota pode ser uma célula vegetal, célula animal ou célula fúngica. Em uma modalidade, a célula eucariota é uma célula fúngica, tal como, por exemplo, uma célula de um patógeno fúngico de uma ou mais espécies de plantas, por exemplo, uma espécie Fusarium, uma espécie Verticillium ou um fungo que causa oídio. Em uma modalidade, a célula eucariota é uma célula de artrópode, tal como, por exemplo, uma célula de inseto. Um inseto preferencial é um inseto sugador de seiva, tal como um afídeo. Por exemplo, o inseto pode ser um inseto Lepidóptero, um inseto Coleóptero ou um inseto Díptero. Em uma modalidade, a molécula de RNA da invenção é produzida em uma célula, tal como, por exemplo, uma célula bacteriana ou outra célula microbiana, que é diferente da célula que compreende o RNA alvo. Em uma modalidade preferencial, a célula microbiana é uma célula em que a molécula de RNA é produzida por transcrição de um construto genético que codifica a molécula de RNA, em que a molécula de RNA é substancial, ou de preferência predominantemente, não processada na célula microbiana por clivagem dentro de uma ou mais sequências de laço, uma ou mais regiões de dsRNA, ou ambas. Por exemplo, a célula microbiana é uma célula de levedura ou outra célula fúngica que não tem uma enzima Dicer. Uma célula muito preferencial para a produção da molécula de RNA é uma célula de Saccharomyces cerevisiae. A célula microbiana pode estar viva ou pode ter sido morta por algum tratamento, tal como tratamento térmico, ou pode estar na forma de um pó seco. De modo semelhante, em uma modalidade a molécula de RNA da invenção é produzida em uma célula eucariota que não compreende o RNA alvo quando a molécula de RNA da invenção for produzida, mas a célula eucariota que compreende a molécula de RNA da invenção e/ou seus produtos de DNA processados, pode se tornar um hospedeiro para o RNA alvo, por exemplo, se o RNA alvo for um RNA viral ou outro RNA introduzido. Essas células podem ser protegidas profilaticamente contra o RNA viral ou outro RNA introduzido.

[0095] Nas modalidades preferenciais do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA tem capacidade para ser produzida enzimaticamente por transcrição in vitro ou em uma célula, ou ambos. Em uma modalidade, uma molécula de RNA da presente invenção é expressa em uma célula, isto é, produzida na célula por transcrição a partir de um ou mais ácidos nucleicos que codificam a molécula de RNA. O um ou mais ácidos nucleicos que codificam a molécula de RNA é, de preferência, uma molécula de DNA, que pode estar presente em um vetor na célula ou integrada no genoma da célula, o genoma nuclear da célula ou no DNA de plastídeo da célula. O um ou mais ácidos nucleicos que codificam a molécula de RNA também pode consistir em uma molécula de RNA como um vetor viral.

[0096] Consequentemente, em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula que compreende uma molécula de RNA descrita no presente documento. Em uma modalidade preferencial, a presente invenção fornece uma molécula de RNA descrita no presente documento que foi expressa em uma célula e que foi isolada e/ou purificada da célula. A presente invenção fornece, portanto, uma preparação de moléculas de RNA isoladas de acordo com um ou mais do primeiro ao quinto aspectos e qualquer uma das modalidades descritas nesse contexto, que é adequada para administração a uma célula que compreende o RNA alvo ou que potencialmente compreende o RNA alvo.

[0097] Em uma modalidade, um ou mais dos RNAs alvo codifica uma proteína. Alternativamente, um ou mais dos RNAs alvo não codificam uma proteína, como um rRNA, tRNA, snoRNA ou miRNA.

[0098] Nas modalidades do primeiro a quinto aspectos, cerca de 12%, cerca de 15%, cerca de 18%, cerca de 21%), cerca de 24%, ou entre cerca de 15% e cerca de 30%, ou de preferência entre cerca de 16% e cerca de 25%, dos ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de sentido e sua sequência de ribonucleotídeos antissentido correspondente, no total, que formam uma região de dsRNA têm emparelhamento de base em um par de base não canônico ou não têm emparelhamento de base. Em uma modalidade preferencial, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100% dos pares de base não canônicos em uma região de dsRNA, ou em todas as regiões de dsRNA na molécula de RNA, são pares de base G:U. O nucleotídeo G em cada par de base G:U pode, independentemente, estar na sequência de ribonucleotídeos de sentido ou de preferência na sequência de ribonucleotídeos antissentido. Em relação aos nucleotídeos G nos pares de base

G:U de uma região de dsRNA, de preferência pelo menos 50% estão na sequência de ribonucleotídeos antissentido, com mais preferência pelo menos 60% ou 70%, com ainda mais preferência pelo menos 80%) ou 90%, e com máxima preferência pelo menos 95% das mesmas estão na sequência de ribonucleotídeos antissentido na região de dsRNA.

Esta particularidade pode se aplicar independentemente a uma ou mais ou a todas as regiões de dsRNA na molécula de RNA.

Em uma modalidade, menos que 25%, menos que 20%, menos que 15%, menos que 10%, de preferência menos que 5%, com mais preferência menos que 1% ou com máxima preferência nenhuma, do ribonucleotídeos na região de dsRNA, ou em todas as regiões de dsRNA na molécula de RNA no total, não têm emparelhamento de base.

Em uma modalidade preferencial, cada uma em quatro a cada uma em seis ribonucleotídeos na região de dsRNA, ou nas regiões de dsRNA no total, formam um par de base não canônico ou não têm emparelhamento de base dentro da molécula de RNA.

Em uma modalidade preferencial, a região de dsRNA, ou nas regiões de dsRNA no total, não compreendem 10 ou 9 ou, de preferência, 8 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade alternativa, a região de dsRNA compreende pelo menos 8 pares de base canônicos contíguos, por exemplo, 8 a 12 ou 8 a 14 ou 8 a 10 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade preferencial, todos os ribonucleotídeos na região de dsRNA, ou em todas as regiões de dsRNA na molécula de RNA, têm emparelhamento de base com um par de base canônico ou um par de base não canônico.

Em uma modalidade, um ou mais ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de sentido ou um ou mais ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos antissentido, ou ambos, não têm emparelhamento de base.

Em uma modalidade, um ou mais ribonucleotídeos de cada sequência de ribonucleotídeos de sentido e um ou mais ribonucleotídeos de cada sequência de ribonucleotídeos antissentido não têm emparelhamento de base na molécula de RNA da invenção.

[0099] Em uma modalidade, uma ou mais ou todas as sequências de ribonucleotídeos antissentido da molécula de RNA são menos do que 100% idênticas, ou entre cerca de 80% e 99,9% idênticas, ou entre cerca de 90% e 98% idênticas, ou entre cerca de 95% e 98% idênticas, de preferência entre 98% e 99,9% idênticas, em sequência ao complemento de uma região da molécula de RNA alvo ou a duas dessas regiões, que podem, ou não, ser contíguas na molécula de RNA alvo. Em uma modalidade preferencial, uma ou mais das sequências de RNA antissentido é 100% idêntica em sequência a uma região do complemento da molécula de RNA alvo, por exemplo, a uma região que compreende 21, 23, 25, 27, 30 ou 32 nucleotídeos contíguos. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de sentido ou antissentido, de preferência ambas, é pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1.000, ou cerca de 100 a cerca de 1.000, nucleotídeos contíguos de comprimento. Os comprimentos de pelo menos 100 nucleotídeos são preferenciais quando se usa a molécula de RNA em células de planta ou células fúngicas, ou para células de animais não vertebrados. Os comprimentos para a sequência de ribonucleotídeos de sentido e antissentido no dsRNA de 50 nucleotídeos ou menos, por exemplo, 31 a 50 nucleotídeos, são preferenciais quando se usa a molécula de RNA em células de animais vertebrados. No entanto, as moléculas de RNA com mais de 50 pares de base em uma região de dsRNA, por exemplo, até 100 ou mesmo 200 pares de base, podem ser usadas em células de animais vertebrados, desde que as regiões de dsRNA tenham 10 a 30% dos pares de base de nucleotídeos em pares de base G:U na região dsRNA. Em uma modalidade, o número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos de sentido está entre cerca de 90% e cerca de 110%, de preferência entre 95% e 105%, com mais preferência entre 98% e 102%, com ainda mais preferência entre 99% e 101%, do número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos antissentido correspondente à qual a mesma hibridiza. Em uma modalidade mais preferencial, o número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos de sentido é o mesmo que o número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos antissentido correspondente. Essas particularidades podem ser aplicadas a cada região de dsRNA na molécula de RNA.

[0100] Nas modalidades do primeiro ao quinto aspectos, o primeiro ribonucleotídeo 3' e o segundo ribonucleotídeo 5' na molécula de RNA são covalentemente unidos por uma sequência de laço que consiste em pelo menos 4 ribonucleotídeos, ou entre 4 e 1.000 ribonucleotídeos, ou de preferência entre 4 e 200 ribonucleotídeos, com mais preferência entre 4 e 50 ribonucleotídeos. Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende adicionalmente uma sequência de extensão de 5' que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 5' ou uma sequência de extensão de 3’ que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3’, ou ambos. Em uma modalidade, a molécula de RNA quimérico compreende adicionalmente uma sequência de extensão de 5' que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 5' ou uma sequência de extensão de 3’ que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 3’, ou ambos. Nessa modalidade, a molécula de RNA compreende dois filamentos separados de RNA que hibridizam para formar a molécula de RNA, embora possa ter sido produzida por transcrição de uma molécula de ácido nucleico como uma única transcrição de RNA e subsequentemente ter sido processada para compreender dois filamentos de RNA.

[0101] O comprimento geral da molécula de RNA da invenção, produzido como um único filamento de RNA, após a emendas de quaisquer íntrons, mas antes de qualquer processamento da molécula de RNA pelas enzimas Dicer ou outras RNAses, está tipicamente entre 50 e 2000 ribonucleotídeos, de preferência entre 60 ou 70 e 2.000 ribonucleotídeos, com mais preferência entre 80 ou 90 e 2.000 ribonucleotídeos, com ainda mais preferência entre 100 ou 110 e 2.000 ribonucleotídeos. Nas modalidades preferenciais, o comprimento mínimo da molécula de RNA é 120, 130, 140, 150, 160, 180, ou 200 nucleotídeos, e o comprimento máximo é 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.200, 1.400, 1.500 ou 2.000 ribonucleotídeos. Cada combinação desses comprimentos mencionados mínimos e máximos é contemplada. A produção das moléculas de RNA desses comprimentos pela transcrição in vitro ou nas células como células bacterianas ou outras células microbianas, de preferência células S. cerevisae ou na célula eucariota em que a molécula de RNA alvo deve ser infrarregulada, é prontamente alcançada.

[0102] Em uma modalidade do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA quimérica compreende duas ou mais regiões de dsRNA que são iguais em sequência ou de preferência diferentes.

[0103] Nas modalidades preferenciais do primeiro ao quinto aspectos, a molécula de RNA é expressa em uma célula eucariota, isto é, produzida pela transcrição na célula. Nessas modalidades, uma maior proporção de moléculas de dsRNA é formada pelo processamento da molécula de RNA que tem 22 e/ou 20 ribonucleotídeos de comprimento quando comparadas ao processamento de uma molécula de RNA análoga que tem uma região de dsRNA correspondente que é completamente emparelhado em base com pares de base canônicos. Isto é, as moléculas de RNA dessas modalidades são mais prontamente processadas para fornecer RNAs antissentido curtos de 22 e/ou 20 ribonucleotídeos do que a molécula de RNA análoga cuja região de dsRNA tem emparelhamento de base completo com pares de base canônicos, como uma proporção do número total de asRNAs de 20 a 24 nucleotídeos produzidos a partir da molécula de RNA. Expresso de forma diferente, uma proporção menor de moléculas de dsRNA é formada pelo processamento da molécula de RNA que tem 23 e/ou 21 ribonucleotídeos de comprimento quando comparada ao processamento de uma molécula de RNA análoga que tem uma região de dsRNA correspondente que é totalmente emparelhada em base com pares de base canônicos. Ou seja, as moléculas de RNA dessas modalidades são menos prontamente processadas para fornecer RNAs antissentido curtos de 23 e/ou 21 ribonucleotídeos do que a molécula de RNA análoga cuja região de dsRNA é totalmente emparelhada em base com pares de base canônicos, como uma proporção do número total de 20 a 24 nucleotídeos de asRNAs produzidos a partir da molécula de RNA. De preferência, pelo menos 50% dos transcritos de RNA produzidos na célula por transcrição do construto genético não são processados por Dicer. Em uma modalidade, quando a molécula de RNA é expressa em uma célula eucariota, isto é, produzida por transcrição na célula, uma proporção maior das moléculas de RNA antissentido curtas que são formadas pelo processamento da molécula de RNA têm mais de um fosfato ligado covalentemente ao terminal 5’ quando comparado ao processamento de uma molécula de RNA análoga que tem uma região de dsRNA correspondente que é totalmente emparelhada em base com pares de base canônicos. Ou seja, uma proporção maior das moléculas de RNA antissentido curtas tem uma carga alterada que pode ser observada como uma mudança de mobilidade das moléculas em experimentos de eletroforese em gel.

[0104] Em uma modalidade, a molécula de RNA da invenção compreende uma combinação de duas ou mais particularidades de uma molécula de RNA descrita no presente documento.

[0105] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA descrita no presente documento, de preferência uma molécula de RNA quimérica descrita no presente documento. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é um construto de DNA que pode ser integrado em uma molécula de DNA maior como um cromossomo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é ligado operacionalmente a um promotor com capacidade para direcionar a expressão da molécula de RNA em uma célula hospedeira. A célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana como E. coli, uma célula fúngica como uma célula de levedura, por exemplo, S. cerevisae ou uma célula eucariota como uma célula de planta ou uma célula de animal. Em uma modalidade, o promotor é heterólogo em relação ao polinucleotídeo. O polinucleotídeo que codifica a molécula de RNA pode ser um polinucleotídeo quimérico ou recombinante, ou um polinucleotídeo isolado e/ou exógeno. Em uma modalidade, o promotor pode funcionar in vitro, por exemplo, um promotor de bacteriófago como um promotor de RNA polimerase T7 ou promotor de RNA polimerase SP6. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de RNA polimerase III como um promotor U6 ou um promotor HI. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de RNA polimerase II, que pode ser um promotor constitutivo, um promotor específico para tecido, um promotor regulado pelo desenvolvimento ou um promotor induzível. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codifica uma molécula precursora de RNA que compreende um íntron em pelo menos uma sequência de laço que tem capacidade para ser emendada durante ou após a transcrição do polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um vetor que compreende um polinucleotídeo descrito no presente documento. Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de plasmídeo como um vetor binário adequado para uso com Agrobacterium tumefaciens.

[0106] Em uma modalidade, o polinucleotídeo é um DNA quimérico que compreende, em ordem, um promotor capaz de iniciar a transcrição da molécula de RNA em uma célula hospedeira, ligado operacionalmente a uma sequência de DNA que codifica a molécula de RNA, de preferência um hpRNA, e uma terminação de transcrição e/ou região de poliadenilação. Em uma modalidade preferencial, a molécula de RNA compreende uma estrutura de RNA em grampo que compreende uma sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma sequência de laço e uma sequência de ribonucleotídeos antissentido, mais de preferência em que as sequências de ribonucleotídeo de sentido e antissentido emparelham em base para formar uma região de dsRNA em que entre cerca de 5% e cerca de 40% dos ribonucleotídeos na região de dsRNA são emparelhados em base em pares de base não canônicos, de preferência pares de base G:U. Em modalidades preferenciais, a célula hospedeira é uma célula vegetal ou uma célula fúngica.

[0107] Em uma modalidade em que o polinucleotídeo ou vetor da invenção é uma célula hospedeira eucariota, de preferência em uma planta ou em uma célula fúngica, a região de promotor do polinucleotídeo ou vetor, que é ligada de modo operacional à região que codifica uma molécula de RNA da invenção, tem um nível inferior de metilação quando comparado ao promotor de um polinucleotídeo correspondente ou vetor que codifica uma molécula de RNA que tem uma região de dsRNA correspondente que tem emparelhamento de base completo com pares de base canônicos. Em uma modalidade, o nível inferior de metilação é menos que 50%, menos que 40%, menos que 30%) ou menos que 20%, quando comparado ao promotor do polinucleotídeo correspondente ou vetor. Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende pelo menos duas cópias do polinucleotídeo ou vetor que codifica uma molécula de RNA da invenção. Nessa modalidade:

[0108] i) o nível de redução na expressão e/ou atividade da molécula de RNA alvo na célula eucariota é pelo menos a mesma em relação a uma célula eucariota correspondente que tem uma única cópia do polinucleotídeo ou vetor, e/ou

[0109] ii) o nível de redução na expressão e/ou atividade da molécula de RNA alvo na célula eucariota é menor quando comparada a uma célula correspondente que compreende uma molécula de RNA que tem uma região de dsRNA correspondente que tem emparelhamento de base completo com pares de base canônicos.

[0110] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende uma molécula de RNA descrita no presente documento, moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérica, um polinucleotídeo descrito no presente documento ou um vetor que compreende a mesma. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula não humana como célula bacteriana, uma célula fúngica, por exemplo, uma célula de levedura, como uma célula de S. cerevisiae, uma célula de planta ou uma célula de animal não humana, de preferência uma célula vegetal. Em uma modalidade, a célula é uma célula não humana ou uma célula humana em cultura celular. Em uma modalidade, a célula é uma célula eucariota como uma célula além de uma célula de animal. Em uma modalidade, a célula é uma célula microbiana como uma célula procariota. Em uma modalidade, a célula hospedeira está viva. Em uma modalidade alternativa, a célula hospedeira está morta e/ou incapaz de reprodução. A célula hospedeira pode ser a célula na qual a molécula de RNA foi produzida por transcrição e/ou processamento, ou a célula pode ser uma célula diferente da célula na qual a molécula de RNA foi produzida por transcrição e/ou processamento, como uma célula que compreende a molécula de RNA alvo.

[0111] Em uma modalidade, a célula hospedeira de preferência uma célula vegetal ou uma célula fúngica, que compreende a molécula de RNA quimérica ou moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérica, ou ambas, em que a molécula de RNA quimérico compreende, em ordem 5’ a 3', a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido, a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido.

[0112] Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula eucariota e que compreende pelo menos duas cópias do polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, e em que

[0113] i) o nível de redução na expressão ou atividade da molécula de RNA alvo na célula eucariota é aproximadamente o mesmo ou maior do que o nível de redução na expressão ou atividade da molécula de RNA alvo se a célula tivesse uma cópia única do polinucleotídeo e/ou

[0114] ii) o nível de redução na expressão ou atividade da molécula de RNA alvo na célula eucariota é menor quando comparado a uma célula correspondente que compreende uma molécula de RNA que tem uma região de dsRNA correspondente que é totalmente emparelhada em base com pares de bases canônicos.

[0115] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um organismo não humano, de preferência um animal ou planta, que compreendem uma molécula de RNA da invenção, de preferência uma molécula de RNA quimérica descrita no presente documento ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérica ou um polinucleotídeo ou vetor da invenção que compreende o mesmo ou uma célula hospedeira que compreende o mesmo. Em uma modalidade, o organismo não humano, de preferência uma planta ou fungo, é transgênico na medida em que compreende um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é integrado de modo estável no genoma do organismo não humano. A invenção também inclui partes de animais e plantas e produtos obtidos a partir das mesmas, que compreendem a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas por processamento da molécula de RNA quimérica, ou ambos, e/ou o polinucleotídeo ou vetor da invenção, por exemplo, para sementes, culturas, produtos colhidos e produtos pós-colheita produzidos a partir dos mesmos.

[0116] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma molécula de RNA da invenção, sendo que o método compreende expressar o polinucleotídeo da invenção em uma célula hospedeira ou sistema de expressão livre de célula. De preferência, o polinucleotídeo é uma molécula de DNA quimérica que codifica a molécula de RNA. Nessa modalidade, o método pode compreender adicionalmente pelo menos parcialmente purificar a molécula de RNA, ou não.

[0117] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma célula ou organismo não humano, de preferência uma célula de planta, planta ou fungo, sendo que o método compreende introduzir uma polinucleotídeo ou vetor ou molécula de RNA da invenção em uma célula, de preferência uma célula animal, uma célula de planta ou fungo, de preferência de modo que o polinucleotídeo ou vetor ou parte do mesmo que codifica a molécula de RNA é integrado de modo estável no genoma da célula. Em uma modalidade, a célula é uma célula animal, por exemplo, uma célula humana, que pode ser uma célula animal em cultura. Em uma modalidade, o organismo não humano é gerado a partir da célula ou uma célula de progênie, por exemplo, regenerando-se uma planta transgênica e, opcionalmente, produzindo plantas descendentes a partir da mesma.

Em uma modalidade, o organismo não humano é gerado introduzindo-se a célula ou um ou mais células de progênie em um organismo não humano.

Alternativamente à integração estável do polinucleotídeo ou vetor no genoma da célula, o polinucleotídeo ou vetor pode ser introduzido na célula sem integração do polinucleotídeo ou vetor no genoma, por exemplo, para produzir a molécula de RNA transitoriamente na célula ou organismo.

Em uma modalidade, o organismo não humano, por exemplo, um animal ou uma planta, é resistente a uma praga ou patógeno, por exemplo, uma praga ou patógeno animal, uma praga ou patógeno de planta, de preferência uma praga de inseto ou patógeno fúngico.

Em uma modalidade, o método compreende uma etapa de teste de um ou mais organismos não humanos, de preferência plantas, que compreendem o polinucleotídeo ou vetor ou molécula de RNA da invenção quanto à resistência à praga ou patógeno.

Os organismos não humanos, por exemplo, as plantas que são testadas podem ser progênies do organismo não humano, de preferência a planta, na qual o polinucleotídeo ou vetor ou molécula de RNA da invenção foi introduzido pela primeira vez e, portanto, o método pode compreender uma etapa de obtenção de tal progênie.

O método pode compreender adicionalmente uma etapa de identificação e/ou seleção do organismo não humano, por exemplo, um animal ou uma planta, que é resistente a uma praga ou patógeno.

Por exemplo, múltiplos organismos não humanos, por exemplo, animais ou plantas, cada um dos quais compreende o polinucleotídeo ou vetor ou molécula de RNA da invenção podem ser testados para identificar qual é resistente à praga ou patógeno, e a progênie obtida a partir do organismo não humano, animal ou planta identificado.

[0118] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um extrato de uma célula hospedeira ou organismo ou parte do mesmo da invenção, em que o extrato compreende uma molécula de RNA da invenção, moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambos, e/ou o polinucleotídeo ou vetor da invenção. Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição que compreende um ou mais de uma molécula de RNA da invenção, moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzido pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambos, uma polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, ou um extrato produzido por um método da invenção, e uma ou mais portadoras adequadas. Em uma modalidade, a composição é uma composição farmacêutica, como uma composição adequada para administração a um humano ou outro animal. A composição farmacêutica pode ser adequada para profilaxia ou tratamento de uma doença, ou para aplicação tópica como uma aplicação cosmética. Em uma modalidade, a composição é adequada para aplicação a uma planta, de preferência uma planta ou população de plantas em um campo, por exemplo, como pulverização tópica, ou a um inseto ou população de insetos. Em uma modalidade, a composição é adequada para aplicação a uma safra, por exemplo, aspergindo- se em plantas de safra em um campo.

[0119] Em uma modalidade, o extrato ou uma composição que compreende a molécula de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas processando-se da molécula de RNA quimérico, ou ambos, compreende adicionalmente pelo menos um composto que acentua a estabilidade da molécula de RNA, ou o polinucleotídeo e/ou vetor, pelo qual o pelo menos um composto assiste na molécula de RNA, sendo que o polinucleotídeo ou vetor é tomado por uma célula, como, por exemplo, uma célula de um organismo. Em uma modalidade, o composto é um agente de promoção de transfecção, por exemplo, um composto que contém lipídio.

[0120] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para reduzir ou infrarregular o nível e/ou atividade de uma molécula de RNA alvo em uma célula ou um organismo, por exemplo, em uma parte do mesmo, sendo que o método compreende entregar à célula ou organismo uma ou mais moléculas de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambos, um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção, ou uma composição da invenção. Nesse contexto, a entrega pode ser através da alimentação, contato, exposição, transformação ou de outra forma introduzir a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas, ou uma mistura das mesmas, ou o polinucleotídeo ou vetor da invenção na célula ou organismo. A introdução pode ser melhorada pelo uso de um agente que aumenta a absorção das moléculas de RNA, polinucleotídeos ou vetores da invenção, por exemplo, com o auxílio de agentes promotores de transfecção, polipeptídeos de ligação a DNA ou RNA, ou pode ser feita sem adicionar tais agentes, por exemplo, plantando sementes que são transgênicas para um polinucleotídeo ou vetor da invenção e permitindo que a semente cresça em uma planta transgênica que expressa as moléculas de RNA da invenção. Em uma modalidade, a molécula de RNA alvo codifica uma proteína. Em uma modalidade, o método reduz o nível e/ou atividade de mais que uma molécula de RNA alvo, as moléculas de RNA alvo sendo diferentes, por exemplo, dois ou mais RNAs alvo são reduzidos no nível e/ou atividade que estão relacionadas em sequência como de uma família de gene. Assim, em uma modalidade, a molécula de RNA quimérico ou moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, são colocadas em contato com a célula ou organismo, de preferência uma célula vegetal, planta, fungo ou inseto, por aplicação tópica na célula ou organismo, ou fornecidas em um alimento para o organismo.

[0121] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para controlar um organismo não humano, por exemplo, uma praga ou patógeno animal ou uma praga ou patógeno vegetal, sendo que o método compreende entregar ao organismo não humano uma ou mais moléculas de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambos, ou uma polinucleotídeo ou vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, um extrato produzido por um método da invenção, ou uma composição da invenção, em que a molécula de RNA e/ou moléculas de RNA pequenas tem um efeito prejudicial no organismo não humano. Em uma modalidade, o organismo não humano é um artrópode, como, por exemplo, um inseto, ou uma planta como, por exemplo, uma erva. Em uma modalidade, o organismo não humano é uma planta, e o inseto come a planta ou uma porção da mesma, pela qual o inseto é controlado. O controle pode compreender redução da sobrevivência da praga ou patógeno, ou redução da aptidão ou reprodução da praga ou patógeno, ou ambos. O controle pode abranger sobrevivência e/ou reprodução reduzida da progênie da praga ou patógeno no qual as moléculas de RNA foram introduzidas pela primeira vez.

[0122] Outro aspecto da invenção se refere a um método de redução de danos causados por uma praga ou patógeno a um organismo não humano, por exemplo, um animal ou planta, que compreende entregar à praga ou patógeno, ou colocar a praga ou patógeno em contato com, uma ou mais molécula (ou moléculas) de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, um polinucleotídeo ou vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, um extrato produzido por um método da invenção ou uma composição da invenção. Em uma modalidade, o método compreende semear sementes que são transgênicas para um polinucleotídeo da invenção, em que as plantas resultantes expressam o transgene para produzir moléculas de RNA da invenção, reduzindo assim os danos causados por uma praga ou patógeno. A invenção, portanto, fornece a um agricultor um meio para controlar uma praga ou patógeno de animais ou plantas. A invenção se estende às células e organismos, por exemplo, animais ou plantas, ou partes dos mesmos, que compreendem a molécula de RNA, polinucleotídeo ou vetor da invenção que foram fornecidos à célula ou organismo, e à praga ou patógeno que compreende a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas por processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambos, ou o polinucleotídeo ou vetor da invenção. A praga ou o patógeno pode estar vivo ou morto. A presente invenção também se refere a células de ou organismos descendentes que compreendem a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas ou ambas.

[0123] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para evitar ou tratar uma doença em um sujeito, sendo que o método compreende administrar ao sujeito uma ou mais moléculas de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas (20 a 24 nt de comprimento) produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambos, uma polinucleotídeo ou vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, um extrato produzido por um método da invenção, ou uma composição da invenção, em que a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas, ou ambas, tem um efeito benéfico em pelo menos um sintoma da doença. Em uma modalidade, a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas, polinucleotídeo, vetor ou composição são administrados tópica, oralmente ou injetados. Em uma modalidade, o sujeito é um animal vertebrado. Em uma modalidade, o animal vertebrado é um mamífero como um humano, um animal de criação como gado ou ovelhas, ou pássaros como galinhas e outras aves domésticas.

[0124] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de RNA da invenção, um polinucleotídeo ou vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, um extrato produzido por um método da invenção, ou uma composição da invenção para utilização na prevenção ou tratamento de uma doença em um sujeito, em que a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas, ou ambas, tem um efeito benéfico sobre pelo menos um sintoma da doença. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um uso de uma molécula de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas produzidas a partir da mesma, um polinucleotídeo ou vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, um extrato produzido por um método da invenção, ou uma composição da invenção para a fabricação de um medicamento para evitar ou tratar uma doença em um sujeito, em que a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas produzidas a partir da mesma, ou ambas, têm um efeito benéfico sobre pelo menos um sintoma da doença.

[0125] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende uma ou mais moléculas de RNA da invenção ou moléculas de RNA pequenas produzidas a partir do mesmo, um polinucleotídeo ou vetor da invenção, uma célula hospedeira da invenção, um extrato produzido por um método da invenção ou uma composição da invenção. O kit pode adicionalmente compreender instruções para o uso do kit.

[0126] Embora mais amplamente utilizado em sistemas de expressão transgênica, conforme discutido no presente documento, há também aplicações de tecnologia de dsRNA que dependem da necessidade de produção em grande escala de moléculas de dsRNA, como pulverizar uma cultura para controlar doenças e/ou pragas. Os presentes inventores identificaram S. cerevisiae como um organismo adequado para uso em processos de produção em grande escala porque as moléculas de dsRNA expressas no mesmo não são clivadas. Assim, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um processo para a produção de moléculas de dsRNA, sendo que o processo compreende

[0127] a) cultivar S. cerevisiae que expressa um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ou mais moléculas de dsRNA, e

[0128] b) colher S. cerevisiae que produzas moléculas de dsRNA, ou as moléculas de dsRNA do S. cerevisiae,

[0129] em que as S. cerevisiae são cultivadas em um volume de pelo menos 1 litro.

[0130] O dsRNA pode ter qualquer estrutura, como um shRNA, um miRNA ou um dsRNA da invenção.

[0131] Em uma modalidade, os S. cerevisiae são cultivados em um volume de pelo menos 10 litros, pelo menos 100 litros, pelo menos 1.000 litros, pelo menos 10.000 litros ou pelo menos 100.000 litros.

[0132] Em uma modalidade, o processo produz pelo menos 0,1, pelo menos 0,5 ou pelo menos 1 g/litro de uma molécula de RNA da invenção.

[0133] O S. cerevisiae produzido com o uso do processo, ou moléculas de dsRNA isoladas a partir do mesmo (em um estado purificado ou parcialmente purificado (como um extrato)) podem ser usados em métodos descritos no presente documento, tais como, porém, sem limitação, um método para reduzir ou infrarregular o nível e/ou atividade de uma molécula de RNA alvo em uma célula ou um organismo, um método que reduz danos causados por uma praga ou patógeno a um organismo não humano, um método de controlar um organismo não humano ou um método de prevenir ou tratar uma doença em um sujeito.

[0134] Qualquer modalidade no presente documento será tomada para aplicar mutatis mutandis a qualquer outra modalidade, salvo especificamente declarado de outro modo.

[0135] A presente invenção não é limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas no presente documento, que se destinam apenas para o propósito de exemplificação. Os produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente abrangidos no escopo da invenção, como descrito no presente documento.

[0136] Por todo este relatório descritivo, salvo especificamente declarado de outro modo ou o contexto queira o contrário, referência a uma única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria serão tomados de modo abranger uma e uma pluralidade (isto é,

um ou mais) daquelas etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupo de composições de matéria.

[0137] A invenção é, doravante, descrita por meio dos seguintes Exemplos não limitadores e com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS

[0138] Figura 1. Designs esquemáticos de duas moléculas de ledRNA. (A) Essa molécula de ledRNA compreende uma sequência de sentido que pode ser considerada por consistir em duas sequências de sentido adjacentes, covalentemente ligadas sem uma sequência espaçadora interveniente e que tem identidade ao RNA alvo, uma sequência antissentido que é complementar à sequência de sentido e que é dividida em duas regiões, uma região 5' e uma região 3’, e dois laços que separam o sentido das sequências antissentido. (B) Essa molécula de ledRNA compreende uma sequência antissentido que pode ser considerada por consistir em duas sequências antissentido adjacentes, covalentemente ligadas sem uma sequência espaçadora interveniente e que tem identidade ao complemento de um RNA alvo, uma sequência de sentido que é complementar à sequência antissentido e que é dividida em duas regiões, e dois laços que separam o sentido das sequências antissentido. A molécula de RNA produzida por transcrição, por exemplo, por transcrição in vitro de um promotor como um promotor T7 ou Sp6, autoanelamentos por emparelhamento de base entre as sequências de sentido e antissentido complementares para formar uma região de filamento duplo com um laço em cada extremidade e tendo um "corte" na sequência de sentido ou antissentido. As sequências adicionais podem ser ligadas às extremidades 5’ e/ou 3' como extensões de 5' ou 3’.

[0139] Figura 2. ledRNA é mais eficaz na formação de dsRNA do que anelamento de sentido/antissentido ou RNA com estrutura em grampo. As representações esquemáticas de três formas de moléculas de RNA de filamento duplo são mostradas: A, dsRNA convencional formado pelo anelamento de dois filamentos separados; B, um RNA com estrutura em grampo que tem uma extensão de 5'- e uma 3'; e C, molécula de ledRNA. O painel inferior mostra uma fotografia após uma eletroforese em gel dos transcritos de RNA para os três tipos de moléculas de RNA direcionados a um gene GUS ou um gene GFP.

[0140] Figura 3. Hibridização de tecidos distais tratados (A e B) e não tratados (C e D) mostra que ledRNA é mais more estável do que dsRNA e se espalha através do tecido de folha de tabaco. Nos tecidos distais (C e D, painel superior) o sinal de dsRNA não poderia ser detectado, em contraste aos sinais de ledRNA fortes.

[0141] Figura 4. Tratamento de ledRNA induziu a infrarregulação de GUS tanto na área tratada (1) quanto na área não tratada acima (3).

[0142] Figura 5. ledRNA induz o silenciamento do gene FAD2.1 em folhas de N. benthamiana.

[0143] Figura 6. A hibridização com Northern blot confirma a forte infrarregulação de mRNA FAD2.1 pelo tratamento com ledFAD2.1 em 6 e 24 horas.

[0144] Figura 7. Alinhamento das sequências de nucleotídeo de uma região do gene alvo GUS (SEQ ID NO:14) e a sequência de sentido do construto de hpGUS[G:U] (nucleotídeos 9 a 208 de SEQ ID NO:11). 52 nucleotídeos de citidina (C) foram substituídos por nucleotídeos de timidina (T). OS nucleotídeos conservados são asteriscados, C's substituídos não são asteriscados.

[0145] Figura 8. Alinhamento das sequências de nucleotídeo de uma região do gene alvo GUS (SEQ ID NO:14) e da sequência de sentido do construto de hpGUS[l :4] (nucleotídeos 9 a 208 do SEQ ID NO:12). Cada 4o nucleotídeo em hpGUS[l :4] foi substituído em relação à sequência de sentido do tipo selvagem correspondente, pela qual para cada 4o nucleotídeo, C foi alterado para G, G foi alterado para C, A foi alterado para T e T foi alterado para A. Os nucleotídeos conservados são asteriscados, G's e C's substituídos não são asteriscados, A's e T's substituídos são mostrados com ponto e vírgula.

[0146] Figura 9. Alinhamento das sequências de nucleotídeo de uma região do gene alvo GUS (SEQ ID NO:14) e a sequência de sentido do construto de hpGUS[2: 10] (nucleotídeos 9 a 208 do SEQ ID NO:13). Cada 9o e 10o nucleotídeo em cada bloco de 10 nucleotídeos em hpGUS[2: 10] foi substituído em relação à sequência de sentido do tipo selvagem correspondente, pela qual para cada 9o e 10o nucleotídeo, C foi alterado para G, G foi alterado para C, A foi alterado para T e T foi alterado para A. Os nucleotídeos conservados são asteriscados, G's e C's substituídos não são asteriscados, A's e T's substituídos são mostrados com ponto e vírgula.

[0147] Figura 10. Diagrama esquemático que mostra estruturas dos construtos genéticos que codificam RNAs com estrutura em grampo modificados direcionados a mRNA de GUS.

[0148] Figura 11. Diagrama esquemático de vetor pWBPPGH usado para transformar plantas de tabaco, fornecendo um gene alvo GUS. O T-DNA se estende da margem direita (RB) até a margem esquerda (LB) do vetor. O gene marcador selecionável no T-DNA é o gene 35S- HPT-tml' que codifica resistência a higrimicina.

[0149] Figura 12. A atividade de GUS em plantas transformadas com construtos que codificam RNAs com estrutura em grampo modificados para reduzir a expressão de um gene alvo GUS. Sem hp: controlar plantas PPGH11 e PPGH24 sem construtos de hpGUS. O número de plantas que mostra menos que 10% de atividade de GUS em comparação às plantas PPGH11 ou PPGH24 de controle correspondentes e a percentagem dessas plantas em relação ao número de plantas testadas são dadas em colchetes.

[0150] Figura 13. (A) Atividade de GUS média de todas as plantas transgênicas: 59 plantas para hpGUS[wt], 74 para hpGUS[G:U], 33 para hpGUS[1:4] e 41 para hpGUS[2: 10]. (B) Atividade de GUS média para todas as plantas silenciadas (32 para hpGUS[wt], 71 para hpGUS[G:U], 33 para hpGUS[1:4] e 28 para hpGUS[2: 10].

[0151] Figura 14. Atividade de GUS para plantas de progênie transgênica que contêm hpGUS[wt], hpGUS[G:U] ou hpGUS[l:4].

[0152] Figura 15. Autorradiografia de um Southern blot de DNA das 16 plantas transformadas com o construto hpGUS[G:U]. DNAs foram digeridos com Hindlll antes da eletroforese em gel e sondados com uma sonda OCS-T. Faixa 1: marcadores de tamanho (lambda DNA digerido por Hindlll); Faixas 2 e 3, DNA das plantas parentais PPGH11 e PPGH24; Faixas 4 a 19: DNAs de 16 plantas transgênicas diferentes.

[0153] Figura 16. Autorradiograma de um experimento de hibridização com Northern blot para detectar sRNAs de sentido (painel superior) e antissentido (painel inferior) derivados de RNAs com estrutura em grampo expressa em plantas transgênicas de tabaco. Faixas 1 e 2 continham RNA obtido das plantas parentais PPGH11 e PPGH24 que carecem dos construtos hpGUS. Faixas 3 a 11 continham RNA das plantas com hpGUS[wt] e faixas 12 a 20 continham RNA das plantas com hpGUS[G:U].

[0154] Figura 17. Autorradiografia de uma hibridização com Northern blot para detectar sRNAs antissentido das plantas transgênicas. Faixas 1 a 10 foram das plantas com hpGUS[wt], faixas 11 a 19 foram das plantas com hpGUS[G:U]. Os sRNAs antissentido têm mobilidade correspondente a 20 a 24nt de comprimento. O blot foi ressondado com antissentido para RNA U6 como um controle de carregamento de faixa.

[0155] Figura 18. Autorradiografia de uma hibridização com Northern blot repetida para detectar sRNAs antissentido das plantas transgênicas

[0156] Figura 19. Análise de metilação de DNA da região de junção do promotor 35S e região de GUS de sentido em construtos hpGUS em plantas transgênicas. Os fragmentos de junção foram ampliados com PCR com (+) ou sem (-) antes do tratamento da planta DNA com a enzima McrBC.

[0157] Figura 20. Análise de metilação de DNA da região de promotor 35S em construtos hpGUS em plantas transgênicas. Os fragmentos 35S foram ampliados com PCR com (+) ou sem (-) antes do tratamento da planta DNA com a enzima McrBC.

[0158] Figura 21. Distribuição de tamanho e abundância do RNA processado. (A) construtos EIN2. (B) construtos GUS.

[0159] Figura 22. Alinhamento da sequência de sentido (sequência superior, nucleotídeos 17 a 216 do SEQ ID

NO:22) do construto hpEIN2[G:U] e a sequência de nucleotídeos (sequência inferior, SEQ ID NO:27) de uma região do cDNA correspondente ao gene alvo EIN2 de A. thaliana. A sequência de sentido foi feita substituindo-se 43 nucleotídeos de citidina (C) na sequência do tipo selvagem com nucleotídeos de timidina (T). OS nucleotídeos conservados são asteriscados, C's substituídos não são asteriscados.

[0160] Figura 23. Alinhamento da sequência de sentido (sequência superior, nucleotídeos 13 a 212 do SEQ ID NO:24) do construto hpCHS[G:U] com a sequência de nucleotídeos de uma região do cDNA correspondente ao gene alvo CHS de A. thaliana (SEQ ID NO:28, sequência inferior). A sequência de sentido foi feita substituindo-se 65 nucleotídeos de citidina (C) na sequência do tipo selvagem com nucleotídeos de timidina (T). OS nucleotídeos conservados são asteriscados, C's substituídos não são asteriscados.

[0161] Figura 24. Alinhamento da sequência antissentido (sequência superior, nucleotídeos 8 a 207 do SEQ ID NO:25) do construto hpEIN2[G:U/U:G] e a sequência de nucleotídeos (sequência inferior, SEQ ID NO:29) de uma região do complemento do gene alvo EIN2 de A. thaliana EIN2. A sequência de antissentido foi feita substituindo-se 49 nucleotídeos de citidina (C) na sequência do tipo selvagem com nucleotídeos de timidina (T). OS nucleotídeos conservados são asteriscados, C's substituídos não são asteriscados.

[0162] Figura 25. Alinhamento da sequência antissentido (sequência superior, nucleotídeos 13 a 212 do SEQ ID NO:26) do construto hpCHS[G:U/U:G] e a sequência de nucleotídeos (sequência inferior, SEQ ID NO:30) de uma região do complemento do gene alvo CHS de A. thaliana. A sequência de antissentido foi feita substituindo-se 49 nucleotídeos de citidina (C) na sequência do tipo selvagem com nucleotídeos de timidina (T). OS nucleotídeos conservados são asteriscados, C's substituídos não são asteriscados.

[0163] Figura 26. Diagramas esquemáticos dos construtos de hpRNA etileno insensível 2 (EIN2) e chalcona sintase (CHS). 35S: promotor 35S de CaMV; regiões de EIN2 e CHS são mostradas como sequência do tipo selvagem (wt) ou a sequência modificada G:U (G:U). As setas indicam a orientação dos fragmentos de DNA - setas da direita para a esquerda indicam as sequências antissentido. Os sítios de enzima de restrição também são mostrados.

[0164] Figura 27. Os comprimentos de hipocótilo das espermatófitas A. thaliana transgênicas no ensaio de EIN2, contendo o hpEIN2[wt] ou hpEIN2[G:U]

[0165] Figura 28. qRT-PCR para mRNA de CHS em A. thaliana transgênica para os construtos hpCHS[wt] ou hpCHS[G:U], normalizado aos níveis de RNA Actin2. Col-0 é a A. thaliana do tipo selvagem (não transgênica).

[0166] Figura 29. Autorradiografia da hibridização com Northern blot de RNA das plantas transformadas com hpEIN2[wt] ou hpEIN2[G:U]. Painel superior mostra o comprimento de hipocótilo para as linhas. A Autorradiografia mostra Northern blot sondada com uma sonda de sentido de EIN2 para detectar sRNAs antissentido. O mesmo blot foi sondado novamente com uma sonda de RNA U6 como um controle de carregamento (RNA U6).

[0167] Figura 30. Análise de metilação de DNA do promotor 35S e sequências de EIN2 de sentido 35S no DNA genômico das plantas A. thaliana transgênicas.

[0168] Figura 31. Níveis de metilação de DNA no promotor e região 5' dos construtos de RNA com estrutura em grampo.

[0169] Figura 32. Promotor 35S nas linhas menos metiladas da população de hpEIN2[wt] ainda mostra metilação significativa.

[0170] Figura 33. Promotor 35S nas linhas G:U hpEIN2 mostra apenas pouca metilação (<10%).

[0171] Figura 34. ledRNA e hpRNA com silenciamento de gene com G:U em células CHO e Vero em 72 horas.

[0172] Figura 35. Plasmídeos de haltere testados em células Hela em 48 horas.

[0173] Figura 36. Exemplos de modificações possíveis das moléculas de dsRNA.

[0174] Figura 37. Desempenho de afídio reduzido após alimentação da dieta artificial suplementada com ledRNA para infrarregular a expressão dos genes MpC002 ou genes MpRack-1 em afídio de pêssego verde. Painel superior (A): o número médio de ninfas por afídio adulto após um período de dez dias com 100 μl de ledRNA de 50 ng/μl. Painel Inferior (B): porcentagem de afídios que sobrevivem ao longo de um custo de tempo de cinco dias após alimentar 100 μl que contém 200 ng/μl de ledRNA de MpC002, MpRack-1 ou o ledGFP de controle.

[0175] Figura 38. Hibridização de Northern blot para detectar RNA de ledGUS e hpGUS usando transcrito de GUS de sentido de comprimento total como sonda. “+” Na parte inferior indica expressão de GUS alta; “-” indica expressão GUS baixa/nenhuma, ou seja, silenciamento forte de GUS.

[0176] Figura 39. Hibridização de Northern blot para detectar RNA de hpEIN2 e ledEIN2 longos (painel superior) e siRNAs derivados dos dois construtos (painel inferior).

[0177] Figura 40. Representação esquemática de estruturas de ansa pedunculada de transcritos expressos a partir de construtos de hpRNA de GUS. Os transcritos têm sequências de sentido e antissentido complementares que emparelham em base para formar hastes de dsRNA específicas para a sequência de GUS, com os comprimentos indicados em pares de base (bp) para as hastes e o número de nucleotídeos (nt) nos laços. Os construtos de hpRNA GFP transcritos codificados que formaram uma haste de dsRNA específica de GFP com emparelhamento em base completamente canônico (GFPhp [WT] ou uma haste de dsRNA com cerca de 25% de pares de base como pares de base G:U (GFPhp [G:U], com um laço derivado de uma região da sequência de codificação de GUS. As sequências de laço para os transcritos de GFPhp compreendiam, cada uma, duas sequências que eram complementares a miR165/miR166 e, portanto, fornecem locais de ligação para esses miRNAs.

[0178] Figura 41. Análise de hibridização de Northern blot que mostra que os transgenes que codificam hpRNAs geram fragmentos distintos da sequência do laço quando expressos em células vegetais. (A) Expressão do gene alvo GUS (GUS) e do transgene de hpRNA longo GUShp1100 com uma sequência espaçador/laço de 1.100 nt. Um construto que codifica o supressor de silenciamento de RNA do vírus do mosaico do pepino 2b (CMV2b) foi incluído para melhorar a expressão do transgene. (B) Análise de Northern blot que mostra RNA da expressão de dois transgenes de hpRNA curtos GUShp93-1 e GUShp93-2 em plantas de A. thaliana transformadas de forma estável. As amostras de RNA foram tratadas (+) ou não tratadas (-) com

RNAse I. Ambos os blots de RNA foram hibridizados com sondas de RNA antissentido específicas ao laço.

[0179] Figura 42. O laço de GUShp1100 se acumulou em níveis elevados nas células de N. benthamiana e foi resistente à digestão com RNase R.

[0180] Figura 43. S. cerevisiae transgênica que expressa um construto GUShp1100 mostrou uma única espécie molecular de RNA que corresponde ao transcrito de RNA em grampo de comprimento total. O painel inferior mostra a hibridização de Northern blot de amostras de RNA de S. cerevisiae transgênica.

[0181] Figura 44. O transcrito GUShp1100 expresso em S. cerevisiae permanece de comprimento total e não forma RNA de laço circular. As primeiras quatro linhas usaram transcritos in vitro de comprimento total ou da haste do dsRNA de GUShp1100, suplementados com RNA total isolado de folhas de N. benthamiana de tipo selvagem.

[0182] Figura 45. Os laços de hpRNA podem ser usados como um repressor específico de sequência eficaz de miRNAs. (A) O construto GFPhp [G:U] induziu fenótipos de supressão de miR165/166 forte em plantas de Arabidopsis transgênicas. (B) Hibridização de Northern blot para determinar a abundância de transcrito GFPhp no RNA de plantas de Arabidopsis transgênicas. (C) Análise RT-qPCR de RNA circular do laço de GFPhp.

CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0183] SEQ ID NO:1 - Sequência de ribonucleotídeos de ledRNA GFP.

[0184] SEQ ID NO:2 - Sequência de ribonucleotídeos de ledRNA GUS.

[0185] SEQ ID NO:3 - Sequência de ribonucleotídeos de ledRNA FAD2.1 de N. benthamiana.

[0186] SEQ ID NO:4 - Sequência de nucleotídeos que codifica ledRNA GFP.

[0187] SEQ ID NO:5 - Sequência de nucleotídeos que codifica ledRNA GUS.

[0188] SEQ ID NO:6 - Sequência de nucleotídeos que codifica ledRNA FAD2.1 de N. benthamiana.

[0189] SEQ ID NO:7 - Sequência de nucleotídeos que codifica GFP.

[0190] SEQ ID NO:8 - Sequência de nucleotídeos que codifica GUS.

[0191] SEQ ID NO:9 - Sequência de nucleotídeos que codifica FAD2.1 de N. benthamiana.

[0192] SEQ ID NO:10 - Sequência de nucleotídeos usada para fornecer a região de sentido de GUS para construtos que codificam moléculas de RNA com estrutura em grampo direcionado ao mRNA de GUS.

[0193] SEQ ID NO:11 - Sequência de nucleotídeos usada para fornecer a região de sentido de GUS para o construto que codifica a molécula de RNA com estrutura em grampo hpGUS[G:U].

[0194] SEQ ID NO:12 - Sequência de nucleotídeos usada para fornecer a região de sentido de GUS para construtos que codificam a molécula de RNA com estrutura em grampo hpGUS[l :4].

[0195] SEQ ID NO:13 - Sequência de nucleotídeos usada para fornecer a região de sentido de GUS para construtos que codificam a molécula de RNA com estrutura em grampo hpGUS[2: 10].

[0196] SEQ ID NO:14 - Sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 781 a 1020 da região de codificação de proteína do gene GUS.

[0197] SEQ ID NO:15 - Sequência de ribonucleotídeos da estrutura de grampo (incluindo seu laço) do RNA com hpGUS[wt].

[0198] SEQ ID NO:16 - Ribonucleotídeo da estrutura de grampo (incluindo seu laço) do RNA com hpGUS[G:U].

[0199] SEQ ID NO:17 - Ribonucleotídeo da estrutura de grampo (incluindo seu laço) do RNA hpGUS[l:4].

[0200] SEQ ID NO:18 - Ribonucleotídeo da estrutura de grampo (incluindo seu laço) da RNA com hpGUS[2:10].

[0201] SEQ ID NO:19 - Sequência de nucleotídeos do cDNA que corresponde ao gene EIN2 de A. thaliana, No de Acesso NM_120406.

[0202] SEQ ID NO:20 - Sequência de nucleotídeos do cDNA que corresponde ao gene CHS de A. thaliana, No de Acesso NM_121396, 1703nt.

[0203] SEQ ID NO:21 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende uma sequência de sentido de 200 nt do cDNA que corresponde ao gene EIN2 de A. thaliana flanqueada pelos sítios de enzima de restrição.

[0204] SEQ ID NO:22 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende a sequência de sentido de 200 nt de EIN2 como para SEQ ID NO:21 exceto que 43 C's foram substituídos por T's, usados na construção de hpEIN2[G:U].

[0205] SEQ ID NO:23 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende uma sequência de sentido de 200 nt do cDNA que corresponde ao gene CHS de A. thaliana flanqueado pelos sítios de enzima de restrição.

[0206] SEQ ID NO:24 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende a sequência de sentido de 200 nt de CHS como para SEQ ID NO:23 exceto que 65 C's foram substituídos por T's, usados na construção de hpCHS[G:U].

[0207] SEQ ID NO:25 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende a sequência antissentido de EIN2 de 200 nt com 50 C's substituídos por T's, usados na construção hpEIN2[G:U/U:G].

[0208] SEQ ID NO:26 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende a sequência antissentido de CHS de 200 nt com 49 C's substituídos por T's, usados na construção hpCHS[G:U/U:G].

[0209] SEQ ID NO:27 - Sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 601 a 900 do cDNA que corresponde ao gene EIN2 de A. thaliana (No de Acesso NM_120406).

[0210] SEQ ID NO:28 - Sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 813 a 1112 do cDNA que corresponde ao gene CHS de A. thaliana (No de Acesso NM_121396).

[0211] SEQ ID NO:29 - Sequência de nucleotídeos do complemento de nucleotídeos 652 a 891 do cDNA que corresponde ao gene EIN2 de A. thaliana (No de Acesso NM_120406).

[0212] SEQ ID NO:30 - Sequência de nucleotídeos do complemento de nucleotídeos 804 a 1103 do cDNA que corresponde ao gene CHS de A. thaliana.

[0213] SEQ ID NO:31 - região de codificação de proteína FANCM I do cDNA de Arabidopsis thaliana, No de Acesso NM_001333162. Nucleotídeos 675 a 1174 de região alvo (500 nucleotídeos)

[0214] SEQ ID NO:32 - região de codificação de proteína FANCM I de um cDNA de Brassica napus. Nucleotídeos 896 a 1395 de região alvo (500 bp)

[0215] SEQ ID NO:33 - Sequência de nucleotídeos que codifica hpFANCM-At[wt] direcionado à região de codificação de proteína FANCM I de A. thaliana. sequência de sentido de FANCM, nucleotídeos 38 a 537; sequência de laço, nucleotídeos 538 a 1306; sequência antissentido de FANCM, nucleotídeos 1307 a 1806.

[0216] SEQ ID NO:34 - Sequência de nucleotídeos que codifica hpFANCM-At[G:U] direcionado à região de codificação de proteína FANCM I de A. thaliana. Sequência de sentido de FANCM, nucleotídeos 38 a 537; sequência de laço, nucleotídeos 538 a 1306; sequência antissentido de FANCM, nucleotídeos 1307 a 1806.

[0217] SEQ ID NO:35 - Sequência de nucleotídeos que codifica hpFANCM-Bn[wt] direcionado à região de codificação de proteína FANCM I de B. napus. Sequência de sentido de FANCM, nucleotídeos 34 a 533; sequência de laço, nucleotídeos 534 a 1300; sequência antissentido de FANCM, nucleotídeos 1301 a 1800.

[0218] SEQ ID NO:36 - Sequência de nucleotídeos que codifica hpFANCM-Bn[G:U] direcionado à região de codificação de proteína FANCM I de B. napus. Sequência de sentido de FANCM, nucleotídeos 34 a 533; sequência de laço, nucleotídeos 534 a 1300; sequência antissentido de FANCM, nucleotídeos 1301 a 1800.

[0219] SEQ ID NO:37 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene DDM1 de B. napus; No de Acesso XR_001278527.

[0220] SEQ ID NO:38 - Sequência de nucleotídeos de DNA que codifica hpDDMl-Bn[wt] direcionado à região de codificação de proteína de DDM1 de B. napus.

[0221] SEQ ID NO:39 - Sequência de nucleotídeos que codifica hpDDMl-Bn[G:U] direcionado à região de codificação de proteína de DDM1 de B. napus. Sequência de sentido de DDM1, nucleotídeos 35 a 536; sequência de laço, nucleotídeos 537 a 1304; Sequência antissentido de DDM1, nucleotídeos 1305 a 1805.

[0222] SEQ ID NO:40 - cDNA EGFP.

[0223] SEQ ID NO:41 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de hpEGFP[wt], com a ordem antissentido/laço/sentido em relação ao promotor.

[0224] SEQ ID NO:42 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de hpEGFP[G:U] que tem 157 substituições de C a T na sequência de sentido de EGFP.

[0225] SEQ ID NO:43 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de ledEGFP[wt] que não tem substituições de C a T na sequência de sentido de EGFP.

[0226] SEQ ID NO:44 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de ledEGFP[G:U] que tem 162 substituições de C a T na sequência de sentido de EGFP.

[0227] SEQ ID NO:45 - Sequência de nucleotídeos usados para fornecer a região de sentido de GUS para o construto que codifica a molécula de RNA com estrutura em grampo hpGUS[G:U] sem sítios de enzima de restrição de flanqueamento.

[0228] SEQ ID NO:46 - Sequência de nucleotídeos usada para fornecer a região de sentido de GUS para construtos que codificam a molécula de RNA com estrutura em grampo hpGUS[l :4] sem sítios de enzima de restrição de flanqueamento.

[0229] SEQ ID NO:47 - Sequência de nucleotídeos usada para fornecer a região de sentido de GUS para construtos que codificam a molécula de RNA com estrutura em grampo hpGUS[2: 10] sem sítios de enzima de restrição de flanqueamento.

[0230] SEQ ID NO:48 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende a sequência de sentido de 200 nt de EIN2 como para SEQ ID NO:21 exceto que 43 C's foram substituídos por T's, usados na construção de hpEIN2[G:U] sem sequências de flanqueamento.

[0231] SEQ ID NO:49 - Sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA que compreende a sequência de sentido de 200 nt de CHS como para SEQ ID NO:23 exceto que 65 C's foram substituídos por T's, usados na construção de hpCHS[G:U] sem sequências de flanqueamento.

[0232] SEQ ID NO:50 - Sequência de nucleotídeos de a fragmento de DNA que compreende a sequência antissentido de EIN2 de 200 nt com 50 C's substituídos por T's, usados na construção de hpEIN2[G:U/U:G] sem sequências de flanqueamento.

[0233] SEQ ID NO:51 - Sequência de nucleotídeos de a fragmento de DNA que compreende a sequência antissentido de CHS de 200 nt com 49 C's substituídos por T's, usados na construção de hpCHS[G:U/U:G] sem sequências de flanqueamento.

[0234] SEQ ID NO:52 - Iniciador de oligonucleotídeo usado para ampliar a sequência de sentido de GUS de 200 bp (GUS-WT-F)

[0235] SEQ ID NO:53 - Iniciador de oligonucleotídeo usado para ampliar a sequência de sentido de

GUS de 200 bp (GUS-WT-R)

[0236] SEQ ID NO:54 - Iniciador de oligonucleotídeo (avanço) usado para produzir o fragmento de hpGUS[G:U] com cada C substituído por T (GUS-GU-F)

[0237] SEQ ID NO:55 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpGUS[G:U] com cada C substituído por T (GUS-GU-R)

[0238] SEQ ID NO:56 - Iniciador de oligonucleotídeo (direto) usado para produzir o fragmento de hpGUS[1:4] com cada 4o nucleotídeo substituído (GUS-4M-F)

[0239] SEQ ID NO:57 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpGUS[1:4] com cada 4o nucleotídeo substituído (GUS-4M-R)

[0240] SEQ ID NO:58 - Iniciador de oligonucleotídeo (avanço) usado para produzir o fragmento de hpGUS[2: 10] com cada 9o e 10o nucleotídeo substituído (GUS- 10M-F)

[0241] SEQ ID NO:59 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpGUS[2: 10] com cada 9o e 10o nucleotídeo substituído (GUS- 10M-R)

[0242] SEQ ID NO:60 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (35S-F3)

[0243] SEQ ID NO:61 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (GUSwt-R2)

[0244] SEQ ID NO:62 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (GUSgu-R2)

[0245] SEQ ID NO:63 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (GUS4m-R2)

[0246] SEQ ID NO:64 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (35S-F2)

[0247] SEQ ID NO:65 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (35S-R1)

[0248] SEQ ID NO:66 - Iniciador de oligonucleotídeo usado para ampliar a sequência de sentido EIN2 de 200 bp do tipo selvagem (EIN2wt-F)

[0249] SEQ ID NO:67 - Iniciador de oligonucleotídeo usado para ampliar a sequência de sentido EIN2 de 200 bp do tipo selvagem (EIN2wt-R)

[0250] SEQ ID NO:68 - Iniciador de oligonucleotídeo usado para ampliar a sequência de sentido CHS de 200 bp do tipo selvagem (CHSwt-F)

[0251] SEQ ID NO:69 - Iniciador de oligonucleotídeo usado para ampliar a sequência de sentido CHS de 200 bp do tipo selvagem (CHSwt-R)

[0252] SEQ ID NO:70 - Iniciador de oligonucleotídeo (avanço) usado para produzir o fragmento de hpEIN2[G:U], com cada C substituído por T (EIN2gu-F)

[0253] SEQ ID NO:71 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpEIN2[G:U], com cada C substituído por T (EIN2gu-R)

[0254] SEQ ID NO:72 - Iniciador de oligonucleotídeo (direto) usado para produzir o fragmento de hpCHS[G:U], com cada C substituído por T (CHSgu-F)

[0255] SEQ ID NO:73 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpCHS[G:U], com cada C substituído por T (CHSgu-R)

[0256] SEQ ID NO:74 - Iniciador de oligonucleotídeo (avanço) usado para produzir o fragmento de hpEIN2[G:U/U:G], com cada C substituído por T (asEIN2gu-F)

[0257] SEQ ID NO:75 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpEIN2[G:U/U:G] com cada C substituído por T (asEIN2gu-R)

[0258] SEQ ID NO:76 - Iniciador de oligonucleotídeo (avanço) usado para produzir o fragmento de hpCHS[G:U/U:G], com cada C substituído por T (asCHSgu-F)

[0259] SEQ ID NO:77 - Iniciador de oligonucleotídeo (reverso) usado para produzir o fragmento de hpCHS[G:U/U:G], com cada C substituído por T (asCHSgu-R)

[0260] SEQ ID NO:78 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (CHS-200-F2)

[0261] SEQ ID NO:79 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (CHS-200-R2)

[0262] SEQ ID NO:80 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (Actin2-For)

[0263] SEQ ID NO:81 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (Actin2-Rev)

[0264] SEQ ID NO:82 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (Top-35S-F2)

[0265] SEQ ID NO:83 - Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (Top-35S-R2)

[0266] SEQ ID NO:84 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador direto (Link-35S-F2)

[0267] SEQ ID NO:85 Sequência de nucleotídeos que codifica iniciador reverso (Link-EIN2-R2)

[0268] SEQ ID NO:86 Sequência de ribonucleotídeos de si22 de sentido

[0269] SEQ ID NO:87 Sequência de ribonucleotídeos de si22 antissentido

[0270] SEQ ID NO:88 - Sequência de ribonucleotídeos de iniciador direto

[0271] SEQ ID NO:89 Sequência de ribonucleotídeos de iniciador reverso

[0272] SEQ ID NO:90 Sequência de ribonucleotídeos de iniciador direto

[0273] SEQ ID NO:91 Sequência de ribonucleotídeos de iniciador reverso

[0274] SEQ ID NO:92 Possíveis modificações de moléculas de dsRNA

[0275] SEQ ID NO:93 - Sequência de nucleotídeos de um cDNA que corresponde ao gene DDM1 de Brassica napus (No de Acesso XR_001278527).

[0276] SEQ ID NO:94 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de RNAi com estrutura em grampo (hpRNA) direcionado a um gene DDM1 de B. napus.

[0277] SEQ ID NO:95 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de RNAi com estrutura em grampo (hpRNA) com pares de base G:U, direcionado a um gene DDM1 de B. napus.

[0278] SEQ ID NO:96 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA, direcionado a um gene DDM1 de B. napus.

[0279] SEQ ID NO:97 - Sequência de nucleotídeos de cDNA que corresponde ao gene FANCM de A. thaliana (No de Acesso NM_001333162).

[0280] SEQ ID NO:98 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de RNAi com estrutura em grampo (hpRNA) direcionado a um gene FANCM de A. thaliana.

[0281] SEQ ID NO:99 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de RNAi com estrutura em grampo (hpRNA) com pares de base G:U, direcionado a um gene FANCM de A. thaliana.

[0282] SEQ ID NO:100 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA, direcionado a um gene FANCM de A. thaliana.

[0283] SEQ ID NO:101 - Sequência de nucleotídeos de cDNA que corresponde ao gene FANCM de B. napus (No de Acesso XM_022719486.1).

[0284] SEQ ID NO:102 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de RNAi com estrutura em grampo (hpRNA) direcionado a um gene FANCM de B. napus.

[0285] SEQ ID NO:103 - Sequência de nucleotídeos de a DNA quimérico que codifica um construto de RNAi com estrutura em grampo (hpRNA) com pares de base G:U, direcionado a um gene FANCM de B. napus.

[0286] SEQ ID NO:104 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA, direcionado a um gene FANCM de B. napus.

[0287] SEQ ID NO:105 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene TOR de Nicotiana benthamiana.

[0288] SEQ ID NO:106 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene TOR de N. benthamiana.

[0289] SEQ ID NO:107 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene de acetolactato sintase (ALS) de cevada, Hordeum vulgare (No de Acesso LT601589).

[0290] SEQ ID NO:108 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um ledRNA direcionado ao gene ALS de cevada (H. vulgare).

[0291] SEQ ID NO:109 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene HvNCEDl de cevada Hordeum vulgare (No de Acesso AK361999).

[0292] SEQ ID NO:110 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene HvNCED2 de cevada Hordeum vulgare (No de Acesso DQ145931).

[0293] SEQ ID NO:111 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado aos genes NCED1 de cevada Hordeum vulgare e trigo Triticum aestivum.

[0294] SEQ ID NO:112 - Sequência de nucleotídeos de a DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado aos genes NCED2 de cevada Hordeum vulgare e trigo Triticum aestivum.

[0295] SEQ ID NO:113 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína de um cDNA que corresponde ao gene de cevada que codifica ΑΒΑ-ΟΗ-2 (No de Acesso DQ145933).

[0296] SEQ ID NO:114 - Sequência de nucleotídeos de a DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado aos genes ΑΒΑ-ΟΗ-2 de cevada Hordeum vulgare e trigo Triticum aestivum.

[0297] SEQ ID NO:115 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína de um cDNA que corresponde ao gene de A. thaliana que codifica EIN2 (At5g03280).

[0298] SEQ ID NO:116 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado ao gene EIN2 de A. thaliana.

[0299] SEQ ID NO:117 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína de um cDNA que corresponde ao gene de A. thaliana que codifica CHS (No de Acesso NM_121396).

[0300] SEQ ID NO:118 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado ao gene CHS de A. thaliana.

[0301] SEQ ID NO:119 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína de um cDNA que corresponde ao gene similar a L. angustifolius N (No de Acesso XM_019604347).

[0302] SEQ ID NO:120 - Sequência de nucleotídeos de a DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado ao gene similar a L. angustifolius N.

[0303] SEQ ID NO:121 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína de um cDNA que corresponde a um gene MLO de Vitis pseudoreticulata (No de Acesso KR362912).

[0304] SEQ ID NO:122 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um primeiro construto de ledRNA direcionado a um gene MLO de Vitis.

[0305] SEQ ID NO:123 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene MpC002 de Myzus persicae.

[0306] SEQ ID NO:124 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína do cDNA que corresponde ao gene MpRack-1 de Myzus persicae.

[0307] SEQ ID NO:125 - Sequência de nucleotídeos do construto quimérico que codifica o ledRNA direcionado ao gene C002 de M.persicae.

[0308] SEQ ID NO:126 - Sequência de nucleotídeos do construto quimérico que codifica o ledRNA direcionado ao gene Rack-1 de M.persicae.

[0309] SEQ ID NO:127 - Sequência de nucleotídeos do cDNA que corresponde ao gene ABCwhite de Helicoverpa armigera.

[0310] SEQ ID NO:128 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene branco de transportador ABC de Helicoverpa armigera.

[0311] SEQ ID NO:129 - Sequência de nucleotídeos do cDNA que corresponde ao Linepithema humile do tipo PABN similares a neuropeptídeos (XM_012368710).

[0312] SEQ ID NO:130 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene PBAN em formigas argentinas (No de Acesso XM_012368710).

[0313] SEQ ID NO:131 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene que codifica subunidade A catalítica de ATPase de próton do tipo V (No de Acesso XM_023443547) de L. cuprina.

[0314] SEQ ID NO:132 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene que codifica RNAse 1/2 de L. cuprina.

[0315] SEQ ID NO:133 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene que codifica quitina sintase de L. cuprina.

[0316] SEQ ID NO:134 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene que codifica receptor de ecdisona (EcR) de L. cuprina.

[0317] SEQ ID NO:135 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene que codifica gama-tubulina similar a 1/1 de L. cuprina.

[0318] SEQ ID NO:136 - gene alvo TaMlo (AF384144).

[0319] SEQ ID NO:137 - Sequência de nucleotídeos de a DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA direcionado a um gene que codifica TaMlo.

[0320] SEQ ID NO:138 - Sequência de nucleotídeos da região de codificação de proteína de um cDNA que corresponde a um gene MLO de Vitis pseudoreticulata (No de Acesso KR362912).

[0321] SEQ ID NO:139 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um primeiro construto de ledRNA direcionado a um gene MLO de Vitis.

[0322] SEQ ID NO:140 - Homólogo Cyp51 1 (No de Acesso KK764651.1, locus RSAG8_00934).

[0323] SEQ ID NO:141 - Homólogo Cyp51 2 (No. de Acesso KK764892.1, número de locus RSAG8_12664).

[0324] SEQ ID NO:142 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto ledRNA direcionado a um gene que codifica Cyp51.

[0325] SEQ ID NO:143 - Gene alvo CesA3 (No de

Acesso JN561774.1).

[0326] SEQ ID NO:144 - Sequência de nucleotídeos de um DNA quimérico que codifica um construto ledRNA direcionado a um gene que codifica CesA3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO TÉCNICAS GERAIS E DEFINIÇÕES

[0327] Salvo definido especificamente de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento será tomado para ter o mesmo significado como comumente compreendido por um de habilidade comum na técnica (por exemplo, em cultura celular, genética molecular, silenciamento de gene, química de proteína e bioquímica).

[0328] Salvo indicado de outro modo, a proteína recombinante, cultura celular, e técnicas imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecido àqueles versados na técnica. Essas técnicas são descritas e explicadas por toda a literatura em fontes como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D M. Glover e B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), e F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente).

[0329] O termo "elemento regulador antissentido" ou "sequência de ácidos ribonucleicos antissentido" ou "sequência de RNA antissentido" conforme usado no presente documento significa uma sequência de RNA que é pelo menos parcialmente complementares a pelo menos uma parte de uma molécula de RNA alvo à qual hibridiza. Em determinadas modalidades, uma sequência de RNA antissentido modula (aumenta ou diminui) a expressão ou quantidade de uma molécula de RNA alvo ou sua atividade, por exemplo, através da redução de tradução da molécula de RNA alvo. Em determinadas modalidades, uma sequência de RNA antissentido altera a emenda de um pré- mRNA alvo que resulta em uma variante de emenda diferente. Os componentes exemplificativos de sequências antissentido incluem, sem limitação, oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos de oligonucleotídeo, mimética de oligonucleotídeo e combinações quiméricas dessas.

[0330] O termo "atividade antissentido" é usado no contexto da presente revelação para se referir a qualquer atividade detectável e/ou mensurável atribuível à hibridização de uma sequência de RNA antissentido a sua molécula de RNA alvo. Essa detecção e/ou medição pode ser direta ou indireta. Em um exemplo, a atividade antissentido é avaliada detectando- se e/ou medindo-se a quantidade de transcrito de molécula de RNA alvo. A atividade antissentido também pode ser detectada como uma mudança em um fenótipo associado à molécula de RNA alvo. Como usado no presente documento, o termo "molécula de RNA alvo" se refere a um transcrito de gene que é modulado por uma sequência de RNA antissentido de acordo com a presente revelação. Consequentemente, "molécula de RNA alvo" pode ser qualquer molécula de RNA cuja expressão ou atividade tem capacidade para ser modulada por uma sequência de RNA antissentido. As moléculas de RNA alvo exemplificativas incluem, sem limitação, RNA (incluindo, sem limitação, pré- mRNA e mRNA ou porções dos mesmos) transcritos de DNA que codifica uma proteína alvo, rRNA, tRNA, RNA nuclear pequeno e miRNA, incluindo suas formas de precursor. O RNA alvo pode ser o RNA genômico de um patógeno ou praga como um vírus, ou uma molécula de RNA derivada a partir do mesmo como uma forma replicativa de um patógeno viral, ou transcrito do mesmo. Por exemplo, a molécula de RNA alvo pode ser um RNA de um gene endógeno (ou mRNA transcrito a partir do gene) ou um gene que é introduzido ou pode ser introduzido na célula eucariota cuja expressão é associada a um fenótipo particular, traço, distúrbio ou estado de doença, ou uma molécula de ácido nucleico de um agente infeccioso. Em um exemplo, a molécula de RNA alvo está em uma célula eucariota. Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo codifica uma proteína. Neste contexto, a atividade antissentido pode ser avaliada detectando-se e/ou medindo-se a quantidade de proteína alvo, por exemplo, através de sua atividade como atividade enzimática, ou uma função além de como uma enzima, ou através de um fenótipo associado à sua função. Conforme usado no presente documento, o termo "proteína alvo" se refere a uma proteína que é modulada por uma sequência de RNA antissentido de acordo com a presente revelação.

[0331] Em determinadas modalidades, a atividade antissentido é avaliada detectando-se e/ou medindo-se a quantidade de moléculas de RNA alvo e/ou moléculas de RNA alvo clivadas e/ou alternativamente moléculas de RNA alvo emendadas.

[0332] A atividade antissentido pode ser detectada ou medida usando-se vários métodos. Por exemplo, a atividade antissentido pode ser detectada ou avaliada comparando-se a atividade em uma amostra de particular e comparando a atividade àquela de uma amostra de controle.

[0333] O termo "direcionamento" é usado no contexto da presente revelação para se referir à associação de uma sequência de RNA antissentido a uma molécula de RNA alvo particular ou uma região particular de nucleotídeos dentro de uma molécula de RNA alvo. Em um exemplo, uma sequência de RNA antissentido de acordo com a presente revelação compartilha complementaridade com pelo menos uma região de uma molécula de RNA alvo. Neste contexto, o termo "complementaridade" se refere a uma sequência de ribonucleotídeos que tem capacidade para emparelhamento de base com uma sequência de ribonucleotídeos em uma molécula de RNA alvo, através de ligação de hidrogênio entre bases nos ribonucleotídeos. Por exemplo, em RNA, adenina (A) é complementar a uracila (U) e guanina (G) a citosina (C).

[0334] Em determinadas modalidades, " base complementar" se refere a um ribonucleotídeo de uma sequência de RNA antissentido que tem capacidade para emparelhamento de base com um ribonucleotídeo de uma sequência de RNA de sentido em uma molécula de RNA da invenção ou de sua molécula de RNA alvo. Por exemplo, se um ribonucleotídeo em uma determinada posição de uma sequência de RNA antissentido tem capacidade para ligação de hidrogênio com um ribonucleotídeo em uma determinada posição de uma molécula de RNA alvo, então a posição de ligação de hidrogênio entre a sequência de RNA antissentido e a molécula de RNA alvo é considerada como complementar àquele ribonucleotídeo. Em contrapartida, o termo

"não complementar" se refere a um par de ribonucleotídeos que não formam ligações de hidrogênio um com o outro ou, de outro modo, suporta hibridização.

O termo "complementar" também pode ser usado para se referir à capacidade de uma sequência de RNA antissentido para hibridizar a outro ácido nucleico através de complementaridade.

Em determinadas modalidades, uma sequência de RNA e seu alvo são complementares entre si quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula é ocupado por ribonucleotídeos que podem se liga entre si para permitir a associação estável entre a sequência de RNA antissentido e uma sequência de RNA de sentido na molécula de RNA da invenção e/ou a molécula de RNA alvo.

Um indivíduo versado na técnica reconhece que a inclusão de incompatibilidades é possível sem eliminar a capacidade da sequência de RNA antissentido e alvo para permanecer em associação.

Portanto, são descritas no presente documento sequências de RNA antissentido que podem compreender até cerca de 20% nucleotídeos que são incompatíveis (isto é, não são complementares aos nucleotídeos correspondentes do alvo). De preferência, os compostos antissentido contêm não mais que cerca de 15%, com mais preferência não mais que cerca de 10%, com máxima preferência não mais que 5%) ou nenhuma incompatibilidade.

Os ribonucleotídeos restantes são complementares ou, de outro modo, não perturbam a hibridização (por exemplo, pares G:U ou A:G) entre a sequência de RNA antissentido e a sequência de RNA de sentido ou a molécula de RNA alvo.

Um indivíduo de habilidade comum na técnica reconheceria as sequências de RNA antissentido descritas no presente documento são pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%,

pelo menos 98%), pelo menos 99% ou 100% (completamente) complementares a pelo menos uma região de uma molécula de RNA alvo.

[0335] Conforme usado no presente documento, a "molécula de RNA quimérica" se refere a qualquer molécula de RNA que não é encontrado naturalmente em natureza. Em um exemplo, moléculas de RNA quiméricas revelada no presente documento foram modificadas para criar incompatibilidades na região (ou regiões) de dsRNA. Por exemplo, as moléculas de RNA quiméricas podem ser modificadas para converter cistosinas em uracilas. Em um exemplo, as moléculas de RNA quiméricas foram modificadas por meio de tratamento com bissulfeto por um tempo e sob condições suficientes para converter cistosinas não metiladas em uracilas.

[0336] Um indivíduo versado na técnica entenderia que várias combinações de ribonucleotídeo podem realizar emparelhamento de base. Ambos os emparelhamentos de base canônicos e não canônicos são contemplados pela presente revelação. Em um exemplo, um emparelhamento de base pode compreender A:T ou G:C em uma molécula de DNA ou U:A ou G:C em uma molécula de RNA. Em outro exemplo, um emparelhamento de base pode compreender A:G ou G:T ou U:G.

[0337] O termo "emparelhamento de base canônico" conforme usado na presente revelação significa emparelhamento de base entre dois nucleotídeos que são A:T ou G:C para desoxirribonucleotídeos ou A:U ou G:C para ribonucleotídeos.

[0338] O termo "emparelhamento de base não canônico" conforme usado na presente revelação significa uma interação entre as bases de dois nucleotídeos além dos emparelhamentos de base canônicos, no contexto de dois DNA ou duas sequências de RNA. Por exemplo, emparelhamento de base não canônico inclui emparelhamento entre G e U (G:U) ou entre A e G (A:G). Os exemplos de emparelhamento de base não canônico incluem purina - purina ou pirimidina - pirimidina. Mais comumente no contexto desta revelação, o emparelhamento de base não canônico é G:U. Outros exemplos de emparelhamentos de base não canônicos, menos preferenciais, são A:C, G:T, G:G e A:A.

[0339] A presente revelação se refere a componentes de RNA que "hibridiza" através de uma série de ribonucleotídeos. Aqueles indivíduos versados na técnica entenderão que os termos como "hibridizar" e "hibridizando" são usados para descrever moléculas que se anelam com base em sequências de ácido nucleico complementares. Essas moléculas não precisam ser 100% complementares a fim de hibridizar (isto é, os mesmos não precisam "realizar emparelhamento de base completo"). Por exemplo, pode haver um ou mais incompatibilidades em complementaridade de sequência. Em um exemplo, os componentes de RNA definidos no presente documento hibridizam sob condições de hibridização estringentes. O termo "condições de hibridização estringentes" se refere a parâmetros com os quais a técnica é familiar, incluindo a variação da temperatura de hibridização com comprimento de uma molécula de RNA. Os parâmetros de hibridização de ribonucleotídeo podem ser encontrados em referências que compilam esses métodos, Sambrook, et al. (supra), e Ausubel, et al. (supra). Por exemplo, as condições de hibridização estringentes, conforme usado no presente documento, podem se referir à hibridização a 65 ºC no tampão de hibridização (3,5xSSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% polivinil pirrolidona, 0,02%

de Albumina de Soro Bovino (BSA), NaH2P04 a 2,5 mM (pH7), 0,5% de SDS, EDTA a 2 mM), seguido por uma ou mais lavagens em 0,2.xSSC, 0,01% de BSA a 50 ºC. Os componentes de RNA mais curtos como sequências de RNA de 20 a 24 nucleotídeos de comprimento hibridizam sob condições de estringência inferiores. O termo "condições de hibridização de estringência baixa" se refere a parâmetros com os quais a técnica é familiar, incluindo a variação da temperatura de hibridização com comprimento de uma molécula de RNA. Por exemplo, as condições de hibridização de estringência baixa, conforme usado no presente documento, podem se referir à hibridização a 42 ºC no tampão de hibridização (3,5xSSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% polivinil pirrolidona, 0,02% de Albumina de Soro Bovino (BSA), NaH2P04 a 2,5 mM (pH7), 0,5% de SDS, EDTA a 2 mM), seguido por uma ou mais lavagens em 0,2.xSSC, 0,01% de BSA a 30 ºC.

[0340] A presente invenção também abrange componentes de RNA quem "realizam emparelhamento de base completo" através de ribonucleotídeos contíguos. O termo "realizar emparelhamento de base completo" é usado no contexto da presente revelação para se referir a uma série de emparelhamentos de base de ribonucleotídeo contíguos. Uma série com emparelhamento de base completo de ribonucleotídeos contíguos não compreende lacunas ou nucleotídeos sem emparelhamento de base dentro da série. O termo "contíguo" é usado para se referir a uma série de ribonucleotídeos. Os ribonucleotídeos que compreendem uma série contígua ser]ao unidos por uma série contígua de ligações de fosfodiéster, sendo que cada ribonucleotídeo é diretamente ligado ao próximo.

[0341] As moléculas de RNA da presente invenção compreendem uma sequência de sentido e uma sequência antissentido correspondente. A relação entre essas sequências é definida no presente documento. A relação de sequência e atividade da sequência antissentido em relação a uma molécula de RNA alvo também é definida no presente documento.

[0342] O termo " ligado covalentemente " é usado no contexto da presente revelação para se referir à conexão entre o primeiro e segundo componentes de RNA ou quaisquer sequências de RNA ou ribonucleotídeos. Como um indivíduo versado na técnica entenderia, uma conexão ou ligação covalente é uma ligação química que envolve o compartilhamento de pares de elétron entre átomos. Em um exemplo, o primeiro e segundo componentes de RNA ou a sequência de RNA de sentido e a sequência de RNA antissentido são covalentemente ligados como parte de um único filamento de RNA que pode dobrar-se sobre si mesmo através de autocomplementaridade. Nesse exemplo, os componentes são covalentemente ligados através de um ou mais ribonucleotídeos por ligações de fosfodiéster.

[0343] No contexto da presente revelação, o termo "hibridização" significa o emparelhamento de polinucleotídeos complementares através do emparelhamento de base de bases complementares. Embora não seja limitado a um mecanismo particular, o mecanismo mais comum de emparelhamento envolve a ligação de hidrogênio, que pode ser a ligação de hidrogênio de Watson-Crick, entre complementares ribonucleotídeos.

[0344] Conforme usado no presente documento, a frase "a molécula de RNA tem um efeito prejudicial no organismo não humano" ou frases semelhantes significam que a molécula de RNA alvo da molécula está presente no organismo não humano e a exposição de células que expressam a molécula de RNA alvo à molécula de RNA alvo resulta em níveis reduzidos e/ou atividade da molécula de RNA alvo quando comparada às mesmas células que carecem da molécula de RNA. Em uma modalidade, a molécula de RNA alvo codifica uma proteína importante para o crescimento, reprodução ou sobrevivência. Como um exemplo, se o organismo não humano for uma safra praga ou patógeno, ou uma praga ou patógeno de um animal, a molécula de RNA pode ter um efeito prejudicial sobre alimentação pela praga ou patógeno, apoptose celular, desenvolvimento e diferenciação de célula, capacidade ou desejo por reprodução sexual, formação de músculos, espasmos musculares, contração muscular, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, transporte e regulação de íon, manutenção da potencial membrana celular, biossíntese de aminoácido, degradação de aminoácido, formação de esperma, síntese de feromônio, detecção de feromônio, formação de antenas, formação de asa, formação de perna, formação de ovos, maturação de larvas, formação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, transição de estágio larval, pupação, surgimento da pupação, divisão celular, metabolismo de energia, respiração, metabolismo de quitina, formação de estrutura citoesqueletal. Em outro exemplo, o organismo não humano é uma erva e a molécula de RNA tem um efeito prejudicial sobre a biossíntese de aminoácido, fotossíntese, síntese de ácido graxo, integridade de membrana celular, síntese de pigmento ou crescimento.

[0345] Conforme usado no presente documento, a frase "a molécula de RNA tem um efeito benéfico sobre pelo menos um sintoma da doença" ou frases semelhantes significa que o RNA alvo da molécula está presente no sujeito e exposição de células que expressam o RNA alvo à molécula de RNA resulta em níveis e/ou atividade reduzida do RNA alvo quando comparada às mesmas células que carecem da molécula de RNA. Em uma modalidade, o RNA alvo codifica uma proteína que tem um papel na presença da doença. Em uma modalidade, a doença é câncer ou doença cancerosa, uma doença infecciosa, uma doença cardiovascular, uma doença neurológica, uma doença de príon, uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença pulmonar, uma doença renal, doença de fígado, doença mitocondrial, doença de endócrino, doenças e afecções relacionadas a reprodução, e qualquer outras indicações que possam responder ao nível de um produto gênico expresso em uma célula ou organismo.

[0346] As moléculas de RNA de acordo com a presente revelação e composições que compreendem as mesmas podem ser administradas a um sujeito. Os termos como “sujeito", "paciente" ou “indivíduo" são termos que podem, no contexto, ser usados de modo intercambiável na presente revelação. Em um exemplo, o sujeito é um mamífero. O mamífero pode ser um animal de estimação como um cachorro ou gato, ou um animal de criação como um cavalo ou vaca. Em um exemplo, o sujeito é um humano. Por exemplo, o sujeito pode ser um adulto. Em outro exemplo, o sujeito pode ser uma criança. Em outro exemplo, o sujeito pode ser um adolescente. Em outro exemplo, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação e composições que compreendem as mesmas podem ser administradas a um inseto. Em outro exemplo, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação e composições que compreendem as mesmas podem ser administradas a uma planta. Em outro exemplo, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação e composições que compreendem as mesmas podem ser administradas a uma população ou célula fúngica.

[0347] Conforme usado no presente documento, "resistente" ou variações do mesmo são termos relativos em que a presença da molécula de RNA aumenta em resistência, por exemplo, uma reprodução reduzida da praga ou do patógeno ou um nível reduzido de danos ao organismo.

[0348] Conforme usado no presente documento, o termo "não relacionado em sequência a um alvo" se refere a moléculas com menos de 50% de identidade ao longo do comprimento total da sequência de RNA interveniente. Por outro lado, o termo "relacionado em sequência a um alvo" se refere a moléculas com 50% ou mais de identidade ao longo do comprimento total da sequência de RNA interveniente.

[0349] O termo "e/ou", por exemplo, "X e/ou Y" deverá ser compreendido por significar "X e Y" ou "X ou Y" e deverá ser tomado por fornecer suporte explícito para ambos os significados ou para qualquer significado.

[0350] Conforme usado no presente documento, o termo cerca de, salvo declarado em contrário, se refere a +/- 20%, com mais preferência +/- 10%, do valor designado.

[0351] Por todo este relatório descritivo a palavra "compreender", ou variações como "compreende" ou "que compreende", será compreendida por implicar a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa declarada, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

EMPARELHAMENTO DE BASE NÃO CANÔNICO

[0352] Em uma modalidade, as moléculas de RNA da presente invenção compreendem uma sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que têm capacidade para hibridizar entre si para formar uma região de RNA de filamento duplo (rs) com alguns emparelhamentos de base não canônicos, isto é, com uma combinação de emparelhamento de base canônico e não canônico. Em uma modalidade, as moléculas de RNA da presente invenção compreendem duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido que têm, cada uma, capacidade para hibridizar a regiões de uma (contígua) sequência de ribonucleotídeos antissentido para formar uma região de dsRNA com algum emparelhamento de base não canônico. Consultar, por exemplo, a Figura IB. Em uma modalidade, as moléculas de RNA da presente invenção compreendem duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido e antissentido que têm, cada uma, capacidade para hibridizar a regiões de uma (contígua) sequência de ribonucleotídeos de sentido para formar uma região de dsRNA com algum emparelhamento de base não canônico. Consultar, por exemplo, a Figura 1A. Em uma modalidade, as moléculas de RNA da presente invenção compreendem duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido e antissentido e duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido em que cada sequência de ribonucleotídeos antissentido tem capacidade para hibridizar a uma sequência de ribonucleotídeos antissentido para formar duas ou mais regiões de dsRNA, em que uma ou ambas compreendem alguns emparelhamentos de base não canônicos.

[0353] Nas seguintes modalidades, o comprimento completo da região de dsRNA (isto é, a região de dsRNA total) da molécula de RNA da invenção é considerada como o contexto para a particularidade se houver apenas uma região de dsRNA

(contígua), ou para cada uma das regiões de dsRNA da molécula de RNA se houver duas ou mais regiões de dsRNA na molécula de RNA.

Em uma modalidade, pelo menos 5% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 6% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 7% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 8% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 9% ou 10% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 11% ou 12% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 15% ou cerca de 15% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 20% ou cerca de 20% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 25% ou cerca de 25% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, pelo menos 30% ou cerca de 30% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em cada uma dessas modalidades, é preferível que um máximo de 40% dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com mais preferência um máximo de 35% dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência um máximo de 30% dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, menos preferencial, cerca de 35% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, ainda menos preferencial, cerca de 40% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em cada uma das modalidades acima, a região de dsRNA pode compreender, ou não, um ou mais ribonucleotídeos sem emparelhamento de base, na sequência de sentido ou na sequência antissentido, ou ambas.

[0354] Em uma modalidade, entre 10% e 40% dos pares de base em uma região de dsRNA da molécula de RNA da invenção são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 10% e 35% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 10% e 30% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 10% e 25% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 10% e 20% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 10% e 15% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 15% e 30% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 15% e 25% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 15% e 20% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 5% e 30% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 5% e 25% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 5% e 20% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 5% e 15% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, entre 5% e 10% dos pares de base em uma região de dsRNA são pares de base não canônicos. Em cada uma das modalidades acima, a região de dsRNA pode compreender, ou não, um ou mais ribonucleotídeos sem emparelhamento de base, na sequência de sentido ou na sequência antissentido, ou ambas.

[0355] Em uma modalidade, a região de dsRNA da molécula de RNA da invenção compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos um par de base dos 20 pares de base contíguos é um par de base não canônico. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 2 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 3 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 4 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 5 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 6 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 7 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 8 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos, em que pelo menos 9 pares de base dos 20 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em cada uma dessas modalidades, é preferível que um máximo de 10 dos 20 pares de base contíguos na região de dsRNA sejam pares de base não canônicos, com mais preferência um máximo de 9 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência um máximo de 8 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência a máximo de 7 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, e com máxima preferência um máximo de 6 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos. De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos são pares de base G:U. De preferência, as particularidades das modalidades acima se aplicam a cada um dos 20 pares de base contíguos que estão presentes na molécula de RNA da invenção.

[0356] Em uma modalidade, a região de dsRNA da molécula de RNA da invenção compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos um par de base dos 21 pares de base contíguos é um par de base não canônico. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 2 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 3 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 4 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 5 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 6 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 7 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 8 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 21 pares de base contíguos, em que pelo menos 9 pares de base dos 21 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em cada uma dessas modalidades, é preferível que um máximo de 10 dos 21 pares de base contíguos na região de dsRNA sejam pares de base não canônicos, com mais preferência um máximo de 9 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência um máximo de 8 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência a máximo de 7 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, e com máxima preferência um máximo de 6 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos.

De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos são pares de base G:U.

De preferência, as particularidades das modalidades acima se aplicam a cada um dos 21 pares de base contíguos que estão presentes na molécula de RNA da invenção.

[0357] Em uma modalidade, a região de dsRNA da molécula de RNA da invenção compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos um par de base dos 22 pares de base contíguos é um par de base não canônico. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 2 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 3 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 4 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 5 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 6 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 7 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 8 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 22 pares de base contíguos, em que pelo menos 9 pares de base dos 22 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em cada uma dessas modalidades, é preferível que um máximo de 10 dos 22 pares de base contíguos na região de dsRNA sejam pares de base não canônicos, com mais preferência um máximo de 9 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência um máximo de 8 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência a máximo de 7 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, e com máxima preferência um máximo de 6 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos. De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos são pares de base G:U. De preferência, as particularidades das modalidades acima se aplicam a cada um dos 22 pares de base contíguos que estão presentes na molécula de RNA da invenção.

[0358] Em uma modalidade, a região de dsRNA da molécula de RNA da invenção compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos um par de base dos 23 pares de base contíguos é um par de base não canônico. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 2 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 3 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 4 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 5 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 6 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 7 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 8 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 23 pares de base contíguos, em que pelo menos 9 pares de base dos 23 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em cada uma dessas modalidades, é preferível que um máximo de 10 dos 23 pares de base contíguos na região de dsRNA sejam pares de base não canônicos, com mais preferência um máximo de 9 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência um máximo de 8 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência a máximo de 7 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, e com máxima preferência um máximo de 6 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos.

De preferência, as particularidades das modalidades acima se aplicam a cada um dos 23 pares de base contíguos que estão presentes na molécula de RNA da invenção.

[0359] Em uma modalidade, a região de dsRNA da molécula de RNA da invenção compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos um par de base dos 24 pares de base contíguos é um par de base não canônico.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 2 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 3 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 4 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 5 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 6 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 7 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 8 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 24 pares de base contíguos, em que pelo menos 9 pares de base dos 24 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em cada uma dessas modalidades, é preferível que um máximo de 10 dos 24 pares de base contíguos na região de dsRNA sejam pares de base não canônicos, com mais preferência um máximo de 9 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência um máximo de 8 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, com ainda mais preferência a máximo de 7 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos, e com máxima preferência um máximo de 6 dos pares de base na região de dsRNA são pares de base não canônicos. De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos são pares de base G:U. De preferência, as particularidades das modalidades acima se aplicam a cada um dos 24 pares de base contíguos que estão presentes na molécula de RNA da invenção.

[0360] Nas seguintes modalidades, o comprimento completo da região de dsRNA (isto é, a região de dsRNA total) da molécula de RNA da invenção é considerada como o contexto para a particularidade se houver apenas uma região de dsRNA (contígua), ou para cada uma das regiões de dsRNA da molécula de RNA se houver duas ou mais regiões de dsRNA na molécula de RNA. Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos, isto é, cada sub-região de 20 pares de base contíguos inclui pelo menos um par de base não canônico, de preferência pelo menos um par de base G:U. Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 19 pares de base canônicos contíguos. Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 18 pares de base canônicos contíguos. Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 17 pares de base canônicos contíguos. Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 16 pares de base canônicos contíguos. Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 15 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 14 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 13 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 12 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 11 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 10 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 9 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 8 pares de base canônicos contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA não compreende 7 pares de base canônicos contíguos.

Nas modalidades acima, é preferível que a sub-região mais longa de emparelhamento de base canônico contíguo na região de dsRNA da molécula de RNA, ou cada região de dsRNA na molécula de RNA, consiste em 5, 6 ou 7 pares de base canônicos contíguos, isto é, para os comprimentos mais curtos mencionados.

Cada uma das particularidades das modalidades acima é, de preferência, combinada na molécula de RNA com as seguintes particularidades.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 10 e 19 ou 20 pares de base contíguos.

Em uma modalidade preferencial, a região de dsRNA compreende entre 12 e 19 ou 20 pares de base contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 14 e 19 ou 20 pares de base contíguos.

Nessas modalidades, a região de dsRNA compreende 15 pares de base contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 16, 17, 18 ou 19 pares de base contíguos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 20 pares de base contíguos.

De preferência, nas modalidades acima,

os pares de base contíguos compreendem pelo menos um par de base não canônico que compreende pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os dos pares de base não canônicos na região de pares de base contíguos são pares de base G:U.

[0361] Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende uma sub-região de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos, isto é, pelo menos um, de preferência um ou dois (não mais que 2), pares de base não canônicos adjacentes a cada extremidade dos 4 pares de base canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 3 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 4 ou 5 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 6 ou 7 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 11 a 10 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 8 a 15 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 50 sub- regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 40 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 30 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 20 sub-regiões cada uma de 4 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos que flanqueiam os pares de base canônicos contíguos nas sub-regiões são pares de base G:U. Nas variações das modalidades acima, um ou ambos dos pares de base de flanqueamento não canônicos são substituídos por um ribonucleotídeo sem emparelhamento de base na sequência de sentido, na sequência antissentido ou em ambas sequências, para algumas ou todas as sub-regiões. É prontamente compreendido que, nas modalidades acima, o número máximo de sub-regiões é determinado pelo comprimento da região de dsRNA na molécula de RNA.

[0362] Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende uma sub-região de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 3 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 4 ou 5 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 6 ou 7 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 11 a 10 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 8 a 15 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 50 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 50 sub- regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 30 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 20 sub-regiões cada uma de 5 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos que flanqueiam os pares de base canônicos contíguos nas sub-regiões são pares de base G:U. Nas variações das modalidades acima, um ou ambos dos pares de base de flanqueamento não canônicos são substituídos por um ribonucleotídeo sem emparelhamento de base na sequência de sentido, na sequência antissentido ou em ambas sequências, para algumas ou todas as sub-regiões. É prontamente compreendido que, nas modalidades acima, o número máximo de sub-regiões é determinado pelo comprimento da região de dsRNA na molécula de RNA.

[0363] Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende uma sub-região de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos. Em uma modalidade,

a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 3 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 4 ou 5 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 6 ou 7 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 11 a 10 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 8 a 16 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 60 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 60 sub- regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 30 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 20 sub-regiões cada uma de 6 pares de base canônicos flanqueados por pares de base não canônicos.

De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos que flanqueiam os pares de base canônicos contíguos nas sub-regiões são pares de base G:U.

Nas variações das modalidades acima, um ou ambos dos pares de base de flanqueamento não canônicos são substituídos por um ribonucleotídeo sem emparelhamento de base na sequência de sentido, na sequência antissentido ou em ambas sequências, para algumas ou todas as sub-regiões. É prontamente compreendido que, nas modalidades acima, o número máximo de sub-regiões é determinado pelo comprimento da região de dsRNA na molécula de RNA.

[0364] Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende uma sub-região de 10 pares de base contíguos em que 2-4 dos pares de base são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 6 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 5 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 2 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 10 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende 4 sub-regiões cada uma de 15 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 15 pares de base contíguos são pares de base não canônicos. Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 50 sub- regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 40 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 30 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, a região de dsRNA compreende entre 2 e 20 sub-regiões cada uma de 10 pares de base contíguos em que 2 a 4 dos 10 pares de base contíguos são pares de base não canônicos.

Em uma modalidade, os pares de bases não canônicos em uma (contígua) ou mais, ou todas as regiões de dsRNA da molécula de RNA não são adjacentes a um par não de base.

Em outra modalidade, os pares de base não canônicos são pelo menos 2 pares de bases contíguos de um par não de base.

Em outra modalidade, os pares de base não canônicos são pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais pares de bases contíguas de um par não de base.

Em uma modalidade, os pares de base não canônicos em uma (contígua) ou mais, ou todas as regiões de dsRNA da molécula de RNA não são adjacentes a uma sequência de laço.

Em outra modalidade, os pares de base não canônicos são pelo menos 2 pares de bases contíguos de uma sequência de laço.

Em outra modalidade, os pares de base não canônicos são pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais pares de bases contíguos de uma sequência de laço.

De preferência, nas modalidades acima, os pares de base não canônicos compreendem pelo menos um par de base G:U, com mais preferência todos os pares de base não canônicos nas sub-regiões são pares de base G:U.

Nas variações das modalidades acima, um ou mais dos 2-4 ou 2-6 pares de base não canônicos são substituídos por um ribonucleotídeo sem emparelhamento de base na sequência de sentido, na sequência antissentido ou em ambas sequências, para algumas ou todas as sub-regiões. É prontamente compreendido que, nas modalidades acima, o número máximo de sub-regiões é determinado pelo comprimento da região de dsRNA na molécula de RNA.

[0365] Em uma modalidade, a razão entre pares de base canônicos e não canônicos na região de dsRNA está entre 2,5: 1 e 3,5: 1, por exemplo cerca de 3: 1. Em uma modalidade, a razão entre pares de base canônicos e não canônicos na região de dsRNA está entre 3,5: 1 e 4,5: 1, por exemplo cerca de 4:

1. Em uma modalidade, a razão entre pares de base canônicos e não canônicos na região de dsRNA está entre 4,5: 1 e 5,5: 1, por exemplo cerca de 5: 1. Em uma modalidade, a razão entre pares de base canônicos e não canônicos na região de dsRNA está entre 5,5: 1 e 6,5: 1, por exemplo cerca de 6: 1. As regiões de dsRNA diferentes na molécula de RNA podem ter diferentes razões.

[0366] Nas modalidades acima, os pares de base não canônicos na região de dsRNA(s) da molécula de RNA são, de preferência, todos pares de base G:U. Em uma modalidade, pelo menos 99% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em uma modalidade, pelo menos 98% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em uma modalidade, pelo menos 97% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em uma modalidade, pelo menos 95% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em uma modalidade, pelo menos 90% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em uma modalidade, entre 90 e 95% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Por exemplo, se houver 10 pares de base não canônicos, pelo menos 9 (90%) são pares de base G:U.

[0367] Em outra modalidade, entre 3% e 50% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em outra modalidade, entre 5% e 30% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em outra modalidade, entre 10% e 30% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U. Em outra modalidade, entre 15% e 20% dos pares de base não canônicos são pares de base G:U.

[0368] Em um exemplo das modalidades acima, existem pelo menos 3 pares de bases G:U em uma (contígua) ou mais, ou em todas as regiões de dsRNA da molécula de RNA. Em outro exemplo, existem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 pares de bases G:U. Em outro exemplo, existem pelo menos entre 3 e 10 pares de bases G:U. Em outro exemplo, existem pelo menos entre 5 e 10 pares de bases G:U.

[0369] A região de dsRNA que compreende emparelhamento de base não canônico(s) compreende uma sequência antissentido de 20 nucleotídeos contíguos que atuam como um elemento regulador antissentido. Em uma modalidade, o elemento regulador antissentido é pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95% ou com máxima preferência 100% complementar a uma molécula de RNA alvo em uma célula eucariota. Em uma modalidade, uma região de dsRNA compreende 2, 3, 4, ou 5 elementos reguladores antissentido que são complementares à mesma molécula de RNA alvo (isto é, a diferentes regiões da mesma molécula de RNA alvo) ou são complementares a moléculas de RNA alvo diferentes.

[0370] Em uma modalidade, um ou mais ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de sentido ou um ou mais ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos antissentido, ou ambos, não têm emparelhamento de base na região de dsRNA quando as sequências de sentido e antissentido hibridizam. Nessa modalidade, a região de dsRNA não inclui qualquer sequência de laço que une covalentemente as sequências de sentido e antissentido. Um ou mais ribonucleotídeos de uma região de dsRNA ou sub-região pode não ter emparelhamento de base. Consequentemente, nessa modalidade, o filamento de sentido da região de dsRNA não realiza, completamente, emparelhamento de base com seu filamento antissentido correspondente.

[0371] Em uma modalidade, a molécula de RNA quimérico não compreende um par de base não canônico na base de um laço da molécula. Em outra modalidade, um, dois, três, quatro, cinco ou mais ou todos os pares de base não canônicos são flanqueados por pares de base canônicos.

[0372] Em uma modalidade, a molécula de RNA quimérico compreende pelo menos um local de clivagem de DCL-1 da planta.

[0373] Em uma modalidade, a molécula de RNA alvo não é uma molécula de RNA viral.

[0374] Em uma incorporação, a molécula de RNA alvo não é uma molécula de RNA do vírus do mosaico da mandioca da África do Sul.

[0375] Em uma modalidade, a molécula de RNA quimérico compreende pelo menos um par não de base, ou extensão de pares não de base, flanqueado por pares de base canônicos, pares de base não canônicos ou um par de base canônico e um par de base não canônico. Por exemplo, essa pode ser uma protuberância, conforme descrito no presente documento.

[0376] Em uma modalidade, a molécula de RNA quimérico não compreende uma região de filamento duplo com mais de 11 pares de base canônicos.

[0377] Ademais, em uma modalidade e opcionalmente em combinação com qualquer uma das particularidades das modalidades acima, o número total de ribonucleotídeos na sequência (ou sequências) de sentido e o número total de ribonucleotídeos na sequência (ou sequências) de antissentido pode não ser idêntica, embora de preferência as mesmas sejam idênticas. Em uma modalidade, o número total de ribonucleotídeos na sequência (ou sequências) de ribonucleotídeos de sentido da região de dsRNA está entre 90% e 110% do número total de ribonucleotídeos na sequência (ou sequências) de ribonucleotídeos antissentido. Em uma modalidade, o número total de ribonucleotídeos na sequência (ou sequências) de ribonucleotídeos de sentido está entre 95% e 105% do número total de ribonucleotídeos na sequência (ou sequências) de ribonucleotídeos antissentido. Em uma modalidade, as moléculas de RNA quiméricas da presente revelação podem compreender um ou mais elementos estruturais protuberâncias internas ou terminais ou laços. Várias modalidades de protuberâncias e laços são discutidas acima. Em uma modalidade, regiões de dsRNA são separadas por um elemento estrutural como uma protuberância ou laço. Em uma modalidade, regiões de dsRNA são separadas por uma sequência interveniente (espaçador). Alguns dos ribonucleotídeos do espaçador sequência podem ter emparelhamento de base a outros ribonucleotídeos na molécula de RNA, por exemplo, a outros ribonucleotídeos dentro do espaçador sequência, ou os mesmos podem ter emparelhamento de base na molécula de RNA, ou alguns de cada. Em uma modalidade, as regiões de dsRNA são ligadas a um laço de terminal. Em uma modalidade, as regiões de dsRNA são flanqueadas por laços de terminal.

[0378] Em uma modalidade, em que a região de dsRNA da molécula de RNA da invenção tem pelo menos 3 pares de base não canônicos em qualquer sub-região de 5 pares de base contíguos, os pares de base não canônicos não são contíguos, mas são separados por um ou mais pares de base canônicos, isto é, a região de dsRNA não tem 3 ou mais pares de base não canônicos contínuos. Em uma modalidade, a região de dsRNA não tem 4 ou mais pares de base não canônicos contíguos. Por exemplo, em uma modalidade, a região de dsRNA compreende pelo menos 3 pares de base não canônicos em uma sub-região de 10 pares de base, em que cada par de base não canônico é separado por 4 pares de base canônicos.

[0379] Em uma modalidade, uma molécula de RNA da invenção compreende mais que uma região de dsRNA. Por exemplo, a molécula de RNA compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais regiões de dsRNA. Nesse exemplo, um ou mais ou todas as regiões de dsRNA pode compreender propriedades exemplificadas acima como emparelhamento de base não canônico e/ou número de elementos reguladores antissentido.

ATIVIDADE DE SILENCIAMENTO

[0380] As moléculas de RNA da presente revelação têm atividade antissentido na medida em que as mesmas compreendem uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que é essencialmente complementar a uma região de uma molécula de RNA alvo. Por exemplo, a sequência de ribonucleotídeos é essencialmente complementar a uma região de uma molécula de RNA alvo em uma célula eucariota. Em um exemplo, a molécula de RNA alvo pode estar em uma célula bacteriana, célula fúngica,

célula de planta, célula de inseto ou célula de animal. Esses componentes das moléculas de RNA definidas no presente documento podem ser referidos como um "elemento regulador antissentido". "Essencialmente complementar" significa que a sequência de ribonucleotídeos de sentido pode ter inserções, deleções e mutações pontuais de indivíduo em comparação com o complemento da molécula de RNA alvo na célula eucariota. De preferência, a homologia é pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 90%), de preferência pelo menos 95%, com máxima preferência 100%>, entre a sequência de ribonucleotídeos de sentido com atividade antissentido e a molécula de RNA alvo. Por exemplo, a sequência de ribonucleotídeos de sentido pode compreender cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19 ou mais nucleotídeos contíguos que são idênticos em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo em uma célula eucariota. Em outro exemplo, a sequência de ribonucleotídeos de sentido pode compreender cerca de 20 nucleotídeos contíguos que são idênticos em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo em uma célula eucariota.

[0381] "Atividade antissentido” é usada no contexto da presente revelação para se referir a um elemento regulador antissentido de uma molécula de RNA definida no presente documento que modula (aumenta ou diminui) a expressão de uma molécula de RNA alvo.

[0382] Em vários exemplos, os elementos reguladores antissentido de acordo com a presente revelação pode compreender uma pluralidade de subunidades monoméricas ligadas juntas por grupos de ligação. Os exemplos include iniciadores, sondas, compostos antissentido, antissentido oligonucleotídeos, oligonucleotídeos de sequência guia externa (EGS), emendadores alternativos, gapmers, siRNAs e microRNAs. Como tais, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem compreender elementos reguladores antissentido com estruturas de grampo, ramificadas, circulares, de filamento duplo ou filamento único. Em um exemplo, a sequência antissentido pode conter elementos estruturais como protuberâncias internas ou terminais ou laços.

[0383] Em um exemplo, moléculas de RNA da presente revelação compreendem componentes oligoméricos quiméricos como oligonucleotídeos quiméricos. Por exemplo, uma molécula de RNA pode compreender nucleotídeos diferentemente modificados, oligonucleotídeos antissentido de estrutura principal mista ou uma combinação dos mesmos. Em um exemplo, compostos oligoméricos quiméricos podem compreender pelo menos uma região modificada de modo a conferir maior resistência à degradação de nuclease, admissão celular maior e/ou afinidade de ligação maior para a molécula de RNA alvo.

[0384] Os elementos reguladores antissentido podem ter uma variedade de comprimentos. Através de vários exemplos, a presente revelação fornece elementos reguladores antissentido que consistem em bases ligadas X-Y, em que X e Y são, cada uma, independentemente selecionados de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, e 50 (desde que X<Y). Por exemplo, em determinadas modalidades, a presente revelação fornece elementos reguladores antissentido que compreendem: 8- 9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 8-21, 8-22, 8-23, 8-24, 8-25, 8-26, 8-27, 8-28, 8-29, 8-

30, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9- 19, 9-20, 9-21, 9-22, 9-23, 9-24, 9-25, 9-26, 9-27, 9-28, 9- 29, 9-30, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10- 18, 10-19, 10-20, 10-21, 10-22, 10-23, 10-24, 10-25, 10-26, 10-27, 10-28, 10-29, 10-30, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 11-21, 11-22, 11-23, 11-24, 11-25, 11-26, 11-27, 11-28, 11-29, 11-30, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 12-21, 12-22, 12-23, 12-24, 12-25, 12-26, 12-27, 12-28, 12-29, 12-30, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 13-21, 13-22, 13-23, 13-24, 13-25, 13-26, 13-27, 13-28, 13-29, 13-30, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 14-21, 14-22, 14-23, 14-24, 14-25, 14-26, 14-27, 14-28, 14-29, 14-30, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 15-21, 15-22, 15-23, 15-24, 15-25, 15-26, 15-27, 15-28, 15-29, 15-30, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 16-21, 16-22, 16-23, 16-24, 16-25, 16-26, 16-27, 16-28, 16-29, 16-30, 17-18, 17-19, 17-20, 17-21, 17-22, 17-23, 17-24, 17-25, 17-26, 17-27, 17-28, 17-29, 17-30, 18-19, 18-20, 18-21, 18-22, 18-23, 18-24, 18-25, 18-26, 18-27, 18-28, 18-29, 18-30, 19-20, 19-21, 19-22, 19-23, 19-24, 19-25, 19-26, 19-29, 19-28, 19-29, 19-30, 20-21, 20-22, 20-23, 20-24, 20-25, 20-26, 20-27, 20-28, 20-29, 20-30, 21-22, 21-23, 21-24, 21-25, 21-26, 21-27, 21-28, 21-29, 21-30, 22-23, 22-24, 22-25, 22-26, 22-27, 22-28, 22-29, 22-30, 23-24, 23-25, 23-26, 23-27, 23-28, 23-29, 23-30, 24-25, 24-26, 24-27, 24-28, 24-29, 24-30, 25-26, 25-27, 25-28, 25-29, 25-30, 26-27, 26-28, 26-29, 26-30, 27-28, 27-29, 27-30, 28-29, 28-30, ou 29-30 bases ligadas.

[0385] As moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem compreender múltiplos elementos reguladores antissentido. Por exemplo, as moléculas de RNA podem compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4,

pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 elementos reguladores antissentido. Em um exemplo, os elementos reguladores antissentido são iguais. Nesse exemplo, a molécula de RNA pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 cópias de um elemento regulador antissentido. Em outro exemplo, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem compreender diferentes elementos reguladores antissentido. Por exemplo, os elementos reguladores antissentido podem ser fornecidos direcionado a múltiplos genes em um caminho como biossíntese de lipídio. Nesse exemplo, a molécula de RNA pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 elementos reguladores antissentido diferentes.

[0386] Os elementos reguladores antissentido de acordo com a presente revelação podem modular (aumenta ou diminuir) expressão ou quantidade de várias moléculas de RNA alvo. Em um exemplo, a molécula de RNA alvo é um gene de biossíntese de ácido graxo. Os exemplos desses genes incluem genes que codificam acetil transacilases, proteínas de transporte de acila ("proteínas carreadora de acila"), desaturases como estearil desaturases ou D12-desaturases microssômicas, em particular genes Fad2-1, malonil transacilase, -cetoacil-ACP sintetases, 3-ceto-ACP redutases, enoil-ACP hidrases, tioesterases como acil-ACP tioesterases, enoil- ACP redutases. Em um exemplo, a molécula de RNA alvo é gene FAD2 (por exemplo, aqueles descritos por No de Aceso de Genbank: AF 124360 (Brassica carinata), AF042841 (Brassica rapa), L26296 (Arabidopsis thaliana), A65102 (Corylus avellana)). Por exemplo, a molécula de RNA alvo pode ser o gene FAD2.1. Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo pode ser o gene FAD2.2. Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo pode ser os genes FAD2.1 e FAD2.2. Os exemplos de outros genes envolvidos na modificação de composição de lipídio que pode ser uma molécula de RNA alvo são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Shure et al., 1983; Preiss et al., 1987; Gupta et al., 1988; Olive et al., 1989; Bhattacharyya et al., 1990; Dunwell, 2000; Brar et al., 1996; Kishore e Somerville, 1993; documentos US 5.530.192 e WO 94/18337).

[0387] Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo é um gene de artrópode como uma transcrição de gene de inseto. Os exemplos desses genes incluem genes de quitina sintase, como CHS1 e/ou CHS2 ou outros genes que controlam a atividade de inseto, comportamento, reprodução, crescimento e/ou desenvolvimento. Vários genes essenciais de uma variedade de patógenos são conhecidos àqueles indivíduos versados na técnica (por exemplo, genes de resistência a nematódeo são resumidos nos documentos WO 93/10251, WO 94/17194).

[0388] Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo está associada a uma doença. Por exemplo, a molécula de RNA alvo pode ser um oncogene ou transcrito de gene supressor de tumor. Os oncogenes exemplificativos incluem ABLl, BCLl, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, EBRB2, FGR, FOS, FYN, HRAS, JTJN, LCK, LYN, MYB, MYC, NRAS, RET ou SRC. Os genes supressores de tumor exemplificativos incluem BRCA1 ou BRCA2; moléculas de adesão; ciclina quinases e seus inibidores.

[0389] Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo está associada ao atraso de maturação de fruta. A maturação de fruta atrasada pode ser alcançada, por exemplo, reduzindo-se a expressão de gene dos genes selecionados a partir do grupo que consiste em poligalacturonases, pectina esterases, P-(l- 4)glucanases (celulases), β-galactanases (β-galactosidases), ou genes de biossíntese de etileno, como 1-aminociclopropano- l-carboxilato sintase, genes de biossíntese de carotenoide como, por exemplo, genes de biossíntese de prefitoeno ou fitoeno, por exemplo, fitoeno desaturases.

[0390] Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo está associada ao atraso de sintomas de senescência. As moléculas de RNA alvo adequadas incluem cinamoil-CoA:NADPH redutases ou desidrogenases de álcool cinamílico. As moléculas de RNA alvo adicionais são descritas (no documento WO 1995/07993).

[0391] Em outro exemplo, a molécula de RNA alvo está associada à modificação do teor de fibra em alimentos, de preferência em sementes. Por exemplo, a molécula de RNA pode reduzir a expressão de ácido cofeico O-metiltransferase ou de desidrogenases de álcool cinamílico. MOLÉCULA DE ledRNA

[0392] Em certas modalidades, as moléculas de RNA da presente invenção compreendem um primeiro componente de RNA que é ligado covalentemente a um segundo componente de RNA. Em modalidades preferenciais, a molécula de RNA se auto-hibridiza ou dobra para formar uma estrutura "haltere" ou ledRNA, por exemplo, consultar a Figura 1. Em uma modalidade, a molécula compreende adicionalmente um ou mais dos seguintes:

[0393] - uma sequência de ribonucleotídeos de ligação que liga covalentemente o primeiro e o segundo componentes de RNA;

[0394] - uma sequência dianteira de 5’; e,

[0395] - uma sequência de traseira de 3’.

[0396] Em uma modalidade, o primeiro componente de RNA consiste em, na ordem de 5’ a 3’, um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', em que os primeiros ribonucleotídeos 5’ e 3' emparelham em base entre si na molécula de RNA, em que a primeira sequência de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, uma primeira sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido hibridiza com a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido na molécula de RNA, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é capaz de hibridar com uma primeira região de uma molécula de RNA alvo.

[0397] Em outra modalidade, o primeiro componente de RNA consiste em, na ordem de 5’ a 3’, um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', em que os primeiros ribonucleotídeos 5’ e 3’ emparelham em base entre si em a molécula de RNA, em que a primeira sequência de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, uma primeira sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido emparelha em base totalmente com a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido na molécula de RNA, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é idêntica em sequência ao complemento de uma primeira região de uma molécula de RNA alvo. Um exemplo desse primeiro componente de RNA dessas duas modalidades é mostrado esquematicamente na metade esquerda da Figura 1A ou na metade direita da Figura 1B.

[0398] Em outra modalidade, o primeiro componente de RNA consiste em um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', em que os primeiros ribonucleotídeos 5’ e 3’ emparelham em base entre si no primeiro componente de RNA, em que a primeira sequência de RNA compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma primeira sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido cada uma tem pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos de modo que pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido emparelha em base totalmente com os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido são substancialmente idênticos em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo.

[0399] Nessas modalidades, o par de base formado entre o primeiro ribonucleotídeo 5’ e o primeiro ribonucleotídeo 3' é considerado como o par de base terminal da região de dsRNA formada por auto-hibridização do primeiro componente de RNA, ou seja, o mesmo define a extremidade da região de dsRNA.

[0400] Em uma modalidade, a primeira sequência de sentido tem identidade de sequência substancial com uma região do RNA alvo, cuja identidade pode ser com uma sequência de menos de 20 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, ou pelo menos 19 ribonucleotídeos contíguos, de preferência pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira região de uma molécula de RNA alvo são pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98% ou 99% idênticos na sequência. Em outra modalidade, os pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira região de uma molécula de RNA alvo são 100% idênticos. Em uma modalidade, os primeiros 3, primeiros 4, primeiros 5, primeiros 6 ou primeiros 7 ribonucleotídeos da extremidade 5’ da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido são 100% idênticos à região da molécula de RNA alvo, com os ribonucleotídeos restantes sendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idênticos à molécula de RNA alvo.

[0401] Em uma modalidade, os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira região de uma molécula de RNA alvo são pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos. Novamente, nessa modalidade, os primeiros 3, primeiros 4, primeiros 5, primeiros 6 ou primeiros 7 ribonucleotídeos podem ser 100% idênticos à região da molécula de RNA alvo, com os ribonucleotídeos restantes sendo pelo menos 60%, pelo menos 65 %, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos à molécula de RNA alvo. Em outra modalidade, os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira região de uma molécula de RNA alvo são 100% idênticos.

[0402] Em uma modalidade, a primeira sequência antissentido tem identidade de sequência substancial com o complemento de uma região do RNA alvo, cuja identidade pode ser com uma sequência de menos de 20 nucleotídeos de comprimento do complemento. Em uma modalidade, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, ou pelo menos 19 ribonucleotídeos contíguos, de preferência pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos, da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido e o complemento de uma primeira região de um RNA alvo molécula são pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97 %, pelo menos 98% ou 99% idêntico na sequência. Em outra modalidade, os pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido e o complemento da primeira região da molécula de RNA alvo são 100% idênticos. Em uma modalidade, os primeiros 3, primeiros 4, primeiros 5, primeiros 6 ou 7 primeiros ribonucleotídeos da extremidade 5’ da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são 100% idênticos ao complemento da região da molécula de RNA alvo, com o ribonucleotídeos restantes sendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idênticos ao complemento da molécula de RNA alvo.

[0403] Em uma modalidade, os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido e o complemento de uma primeira região da molécula de RNA alvo são pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos. Novamente, nessa modalidade, os primeiros 3, primeiros 4, primeiros 5, primeiros 6 ou primeiros 7 ribonucleotídeos são 100% idênticos ao complemento da região da molécula de RNA alvo, com os ribonucleotídeos restantes sendo pelo menos 60%, em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idênticos ao complemento da molécula de RNA alvo. Em outra modalidade, os pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido e uma primeira região de uma molécula de RNA alvo são 100% idênticos.

[0404] Em outra modalidade, o segundo componente de RNA consiste em, na ordem de 5’ a 3’, um segundo ribonucleotídeo 5’, uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3', em que os segundos ribonucleotídeos 5’ e 3’ se emparelham em base, em que a segunda sequência de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma segunda sequência de laço de pelo menos 4 ribonucleotídeos e uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido emparelha em base com a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido. Nessa modalidade, o par de base formado entre o segundo ribonucleotídeo 5’ e o segundo ribonucleotídeo 3' é considerado como o par de base terminal da região de dsRNA formada por auto-hibridização do segundo componente de RNA.

[0405] Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência dianteira de 5’, ou sequência de extensão de 5’, que pode surgir como um resultado da transcrição de um promotor no construto genético, do local de início da transcrição até o começo do polinucleotídeo que codifica o restante da molécula de RNA. É preferencial que essa sequência dianteira de 5’ ou sequência de extensão de 5’ seja relativamente curta em comparação com o restante da molécula, e a mesma pode ser removida da molécula de RNA pós- transcrição, para concretização por tratamento com RNAse. A sequência dianteira de 5’ ou a sequência de extensão de 5’ pode ser em sua maior parte não emparelhada em base ou a mesma pode conter uma ou mais estruturas ansa pedunculadas. Nessa modalidade, a sequência dianteira de 5’ pode consistir em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5' se o segundo componente de RNA estiver ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3’ ou ao segundo ribonucleotídeo 5' se o segundo componente de RNA estiver ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5’. Em uma modalidade, a sequência dianteira de 5’ tem pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 100, pelo menos 200 ribonucleotídeos de comprimento, de preferência com um comprimento máximo de 250 ribonucleotídeos. Em outra modalidade, a sequência dianteira de 5’ tem pelo menos 50 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência dianteira de 5’ pode atuar como uma sequência de extensão para amplificação da molécula de RNA por meio de uma reação de amplificação adequada. Para incorporação, a sequência de extensão pode facilitar a amplificação através de polimerase.

[0406] Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência traseira de 3’ ou sequência de extensão de 3’ que pode surgir como um resultado da continuação da transcrição até uma terminação da transcrição ou sinal de poliadenilação no construto que codifica a molécula de RNA. A sequência traseira de 3’ ou a sequência de extensão de 3’ pode compreender uma cauda poliA. É preferencial que essa sequência traseira de 3’ ou sequência de extensão de 3’ seja relativamente curta em comparação com o restante da molécula, e possa ser removida da molécula de RNA após a transcrição, para incorporação por tratamento com RNAse. A sequência traseira de 3’ ou a sequência de extensão de 3’ pode ser em sua maior parte sem emparelhamento em base, ou a mesma pode conter uma ou mais estruturas ansa pedunculadas. Nessa modalidade, a sequência traseira de 3’ pode consistir em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3' se o segundo componente de RNA estiver ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3’ ou ao primeiro ribonucleotídeo 3' se o segundo componente de RNA estiver ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5’. Em uma modalidade, a sequência dianteira 3’ tem pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 100, pelo menos 200 ribonucleotídeos de comprimento, de preferência com um comprimento máximo de 250 ribonucleotídeos. Em outra modalidade, a sequência dianteira 3’ tem pelo menos 50 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência traseira de 3’ pode atuar como uma sequência de extensão para amplificação da molécula de RNA por meio de uma reação de amplificação adequada. Para incorporação, a sequência de extensão pode facilitar a amplificação através de polimerase.

[0407] Em uma modalidade, todos, exceto dois dos ribonucleotídeos são ligados covalentemente a dois outros nucleotídeos, isto é, a molécula de RNA consiste em apenas um filamento de RNA que tem regiões autocomplementares e, portanto, tem apenas um nucleotídeo terminal 5’ e um nucleotídeo terminal 3'. Em outra modalidade, todos, exceto quatro dos ribonucleotídeos são ligados covalentemente a dois outros nucleotídeos, isto é, a molécula de RNA consiste em dois filamentos de RNA que têm regiões complementares que hibridizam e, portanto, tem apenas dois nucleotídeos terminais 5’ e dois nucleotídeos terminais 3'. Em outra modalidade, cada ribonucleotídeo é ligada covalentemente a dois outros nucleotídeos, isto é, a molécula de RNA é circular, bem como tem regiões autocomplementares e, portanto, não tem nucleotídeo terminal 5’ e não tem nucleotídeo terminal 3'.

[0408] Em uma modalidade, a região de filamento duplo da molécula de RNA pode compreender uma ou mais protuberâncias resultantes de nucleotídeos não emparelhados na sequência de RNA de sentido ou na sequência de RNA antissentido, ou ambas. Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende uma série de protuberâncias. Para a modalidade, a região de filamento duplo da molécula de RNA pode ter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais protuberâncias. Cada protuberância pode ser, independentemente, um, dois ou mais nucleotídeos não emparelhados, até 10 nucleotídeos. As sequências mais longas podem formar laço fora das sequências de sentido ou antissentido na região de dsRNA, que podem emparelhar em base internamente ou permanecer não emparelhadas. Em outra modalidade, a região de filamento duplo da molécula de RNA não compreende uma protuberância, isto é, é totalmente emparelhada por base ao longo de todo o comprimento da região de dsRNA.

[0409] Em outra modalidade, a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5’ sem quaisquer nucleotídeos intervenientes, ou a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3' sem quaisquer nucleotídeos intervenientes, ou ambos. Em outra modalidade, há pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10 nucleotídeos intervenientes. Entende-se que tais nucleotídeos intervenientes não são relacionados em sequência à molécula de RNA alvo, mas podem auxiliar na estabilização do emparelhamento em base de sequências de sentido e antissentido adjacentes.

[0410] Em outra modalidade, os 20 nucleotídeos consecutivos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido são ligados covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo

5’ sem quaisquer nucleotídeos intervenientes, e os 20 nucleotídeos consecutivos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligados covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3' sem quaisquer nucleotídeos intervenientes. Em outra modalidade, há pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10 nucleotídeos intervenientes. Os nucleotídeos intervenientes podem ser emparelhados em base como parte da região de filamento duplo da molécula de RNA, mas não são relacionados em sequência ao RNA alvo. Os mesmos podem ajudar a fornecer estabilidade aumentada para a região de filamento duplo ou manter juntas duas extremidades da molécula de RNA e não deixar uma extremidade 5’ ou 3' não emparelhada em base, ou ambos.

[0411] Em uma modalidade, o primeiro e segundo componentes de RNA referenciados acima compreendem uma sequência de ribonucleotídeos de ligação. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação atua como um espaçador entre a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido que é substancialmente idêntica em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo e os outros componentes da molécula. Por exemplo, a sequência de ribonucleotídeos de ligação pode atuar como um espaçador entre essa região e um laço. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende múltiplas sequências de ribonucleotídeos de sentido que são substancialmente idênticas em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo e uma sequência de ribonucleotídeos de ligação que atua como um espaçador entre essas sequências. Em uma modalidade, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10 sequências de ribonucleotídeos que são substancialmente idênticas em sequência a uma primeira região de uma molécula de RNA alvo são fornecidas na molécula de RNA, cada uma sendo separada da outra (ou outras) por uma sequência de ribonucleotídeos de ligação.

[0412] Em uma modalidade, as moléculas de RNA referenciadas acima compreendem uma sequência dianteira de 5’. Em uma modalidade, a sequência dianteira de 5’ consiste em uma sequência de ribonucleotídeos que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5', se o segundo componente de RNA estiver ligado ao primeiro ribonucleotídeo 3’, ou ao segundo ribonucleotídeo 5', se o segundo componente de RNA estiver ligado ao primeiro ribonucleotídeo 5’. Em uma modalidade, a molécula de RNA tem uma extremidade 5’ ou 3' modificada, para incorporação por fixação de um grupo lipídico, como colesterol, ou uma vitamina, como biotina, ou um polipeptídeo. Tais modificações podem auxiliar na absorção da molécula de RNA na célula eucariota em que o RNA deve funcionar.

[0413] Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem menos de 100 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem menos de 50 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem menos de 20 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem menos de 10 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem menos de 5 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem entre 1 e 100 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem entre 1 e 50 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem entre 1 e 20 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem entre 1 e 10 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, a sequência de ribonucleotídeos de ligação tem entre 1 e 5 ribonucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, os ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de ligação não são emparelhados em base. Em uma modalidade preferencial, os ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de ligação são todos emparelhados em base ou todos, exceto 1, 2 ou 3 dos ribonucleotídeos são emparelhados em base.

[0414] Em uma modalidade, o primeiro ou segundo componente de RNA compreende uma estrutura em grampo. Em uma modalidade preferencial, o primeiro e o segundo componentes de RNA compreendem, cada um, uma estrutura em grampo. Nessas modalidades, a estrutura em grampo pode ser uma ansa pedunculada. Consequentemente, em uma modalidade, a molécula de RNA pode compreender primeiro e segundo componentes de RNA, cada um dos quais compreende uma estrutura em grampo, em que os grampos são ligados covalentemente por uma sequência de ligação. Consultar, por exemplo, a Figura 1. Em uma modalidade, a sequência de ligação é um ou mais ácido ribonucleico (ou ácidos ribonucleicos) não emparelhado. Em uma modalidade, a sequência de ligação é entre 1 e 10 ribonucleotídeos não emparelhados.

[0415] Em uma modalidade, a molécula de RNA tem uma estrutura em grampo duplo, ou seja, uma "estrutura ledRNA" ou "estrutura em haltere". Nessa modalidade, o primeiro grampo é o primeiro componente de RNA e o segundo grampo é o segundo componente de RNA. Nessas modalidades, o primeiro ribonucleotídeo 3’ e o segundo ribonucleotídeo 5', ou o segundo ribonucleotídeo 3’ e o primeiro ribonucleotídeo 5', mas não ambos, são unidos covalentemente. Nessa modalidade, os outros ribonucleotídeos 5’/3' podem ser separados por um entalhe (ou seja, uma descontinuidade na molécula de dsRNA em que não há ligação fosfodiéster entre os ribonucleotídeos 5’/3'. Uma modalidade desse tipo de disposição é mostrada na Figura 1B. Em outra modalidade, os respectivos ribonucleotídeos 5’/3' podem ser separados por um laço. Os comprimentos das sequências dianteira de 5’ e traseira de 3' podem ser iguais ou diferentes. Para a modalidade, a dianteira de 5’ pode ser cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ribonucleotídeos mais longa do que a sequência traseira de 3’ ou vice-versa.

[0416] Em modalidades em que a molécula de RNA tem uma estrutura em grampo duplo, o segundo grampo (além da primeira estrutura em grampo) compreende uma sequência de RNA de sentido e uma sequência de RNA antissentido que são substancialmente idênticas em sequência a uma região de uma molécula de RNA alvo ou seu complemento, respectivamente. Em uma modalidade, cada grampo tem uma série de ribonucleotídeos que são substancialmente idênticos em sequência a uma região da mesma molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, cada grampo tem uma série de ribonucleotídeos que são substancialmente idênticos em sequência a regiões diferentes da mesma molécula de RNA alvo. Em uma modalidade, cada grampo tem uma série de ribonucleotídeos que são substancialmente idênticos em sequência a uma região de moléculas de RNA alvo diferentes, isto é, a molécula de RNA pode ser usada para reduzir a expressão e/ou atividade de duas moléculas de RNA alvo que podem ser não relacionadas em sequência.

[0417] Em cada grampo da estrutura em grampo duplo da molécula de RNA, a ordem das sequências de RNA de sentido e antissentido em cada grampo, na ordem de 5’ a 3’, pode ser independentemente sentido e depois antissentido, ou antissentido e depois sentido. Em modalidades preferenciais, a ordem das sequências de sentido e antissentido na estrutura em grampo duplo da molécula de RNA é antissentido-sentido- sentido-antissentido, em que as duas sequências de sentido são contíguas (Figura 1A), ou sentido-antissentido-antissentido- sentido em que as duas sequências antissentido são contíguas (Figura 1B).

[0418] Em uma modalidade, a molécula de RNA pode compreender, na ordem de 5’ a 3’, uma sequência dianteira de 5’, um primeiro laço, uma sequência de RNA de sentido, um segundo laço e uma sequência traseira de 3’, em que as sequências dianteiras 5’ e 3' se ligam covalentemente ao filamento de sentido para formar uma sequência de dsRNA. Em uma modalidade, as sequências dianteira de 5’ e traseira de 3' não são ligadas covalentemente uma à outra. Em uma modalidade, as sequências dianteira de 5’ e traseira de 3’são separadas por um entalhe. Em uma modalidade, as sequências dianteira de 5’ e traseira de 3’ são ligadas juntas para fornecer uma molécula de RNA com uma estrutura fechada. Em outra modalidade, as sequências dianteira de 5’ e traseira de 3' são separadas por um laço.

[0419] O termo "laço" é usado no contexto da presente revelação para se referir a uma estrutura de laço em uma molécula de RNA revelada no presente documento que é formada por uma série de ribonucleotídeos não complementares. Os laços geralmente seguem uma série de pares de base entre o primeiro e o segundo componentes de RNA ou juntam uma sequência de RNA de sentido e uma sequência de RNA antissentido em um do primeiro e segundo componentes de RNA, ou ambos. Em uma modalidade, todos os ribonucleotídeos de laço são não complementares, geralmente para laços mais curtos de 4 a 10 ribonucleotídeos. Em outras modalidades, alguns ribonucleotídeos em um ou mais dos laços são complementares e capazes de emparelhamento em base dentro da sequência do laço, desde que esses emparelhamentos em base permitam a formação de uma estrutura de laço. Por exemplo, pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 15% dos ribonucleotídeos de laço sejam complementares. As modalidades de laços incluem ansa pedunculada ou grampos, pseudonós e tetralaços.

[0420] Em uma modalidade, a molécula de RNA compreende apenas dois laços. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 laços, de preferência até um máximo de 10 laços. Por exemplo, a molécula de RNA pode compreender 4 laços.

[0421] Laços de vários tamanhos são contemplados pela presente revelação. Por exemplo, os laços podem compreender 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ribonucleotídeos. Em outras modalidades, os laços compreendem 15, 20, 25 ou 30 nucleotídeos. Em uma modalidade, uma ou todas as sequências de laço têm mais de 20 nucleotídeos. Em outras modalidades, os laços são maiores, por exemplo, compreendem 50, 100, 150, 200 ou 300 ribonucleotídeos. Em uma modalidade, os laços compreendem 160 ribonucleotídeos. Em outra modalidade, menos preferencial, os laços compreendem 200, 500, 700 ou 1.000 ribonucleotídeos, desde que os laços não interfiram com a hibridização das sequências de RNA de sentido e antissentido. Em uma modalidade, cada um dos laços tem o mesmo número de ribonucleotídeos. Por exemplo, os laços podem ter entre 100 e

1.000 ribonucleotídeos de comprimento. Por exemplo, os laços podem ter entre 600 e 1.000 ribonucleotídeos de comprimento. Por exemplo, os laços podem ter entre 4 e 1.000 ribonucleotídeos. Por exemplo, os laços têm de preferência entre 4 e 50 ribonucleotídeos. Em outra modalidade, os laços compreendem diferentes números de ribonucleotídeos.

[0422] Em outra modalidade, um ou mais laços compreendem um íntron que pode ser separado da molécula de RNA. Em uma modalidade, o íntron é de um gene de planta. Os íntrons exemplificativos incluem o íntron 3 da álcool desidrogenase 1 de milho (Adh1) (GenBank:AF044293), o íntron 4 da subunidade alfa da beta-conglicinina de soja (GenBank:AB051865); um dos íntrons do gene rbcS-3A da ervilha para a subunidade pequena da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase (RBC) (GenBank:X04333). Outras modalidades de íntrons adequados são discutidas em (McCullough e Schuler, 1997; Smith et al., 2000).

[0423] Em várias modalidades, um laço pode estar na extremidade de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 pares de base consecutivos, que podem ser pares de base canônicos ou podem incluir um ou mais pares de base não canônicos. Em outras modalidades, menos preferenciais, particularmente para células de animais vertebrados, um laço pode estar na extremidade de pelo menos 20, 30, 50, 100, 200, 500 ou mais pares de base consecutivos.

[0424] Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido e sequências de ribonucleotídeos antissentido totalmente emparelhadas em base com as mesmas, que são idênticas em sequência a uma região de uma molécula de RNA alvo. Por exemplo, a molécula de RNA pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido e sequências de ribonucleotídeos antissentido totalmente emparelhadas em base com as mesmas, em que as sequências de ribonucleotídeos de sentido são, cada uma, independentemente idênticas em sequência a uma região de uma molécula de RNA alvo. Nessa modalidade, qualquer uma ou mais ou todas as sequências podem ser separadas por uma sequência (ou sequências) de ribonucleotídeo de ligação. Nessa modalidade, qualquer uma ou mais ou todas as sequências podem ser separadas por um laço.

[0425] Em uma modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido são idênticas em sequência a diferentes regiões da mesma molécula de RNA alvo. Por exemplo, as sequências podem ser idênticas a pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 regiões da mesma molécula alvo. Em outra modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido são idênticas em sequência. Em uma modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido são idênticas em sequência à mesma região da mesma molécula de RNA alvo. Em outra modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido são idênticas em sequência a diferentes moléculas de RNA alvo. Para a modalidade, as sequências podem ser idênticas a pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 regiões de moléculas alvo diferentes.

[0426] Em outra modalidade, as duas ou mais sequências de ribonucleotídeos de sentido não têm sequências de laço (espaçadoras) intervenientes.

[0427] Em uma modalidade, a molécula de RNA tem um filamento único de ribonucleotídeos que tem uma extremidade 5’, pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 21 nucleotídeos de comprimento, uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que é totalmente emparelhada com cada sequência de ribonucleotídeos de sentido ao longo de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos, pelo menos duas sequências de laço e uma extremidade 3’. Nessa modalidade, o ribonucleotídeo na extremidade 5’ e o ribonucleotídeo na extremidade 3' não são diretamente ligados de forma covalente, mas em vez disso, posicionados adjacentes a cada par de bases.

[0428] Em outra modalidade, pares de base consecutivos de componentes de RNA são espaçados por pelo menos uma lacuna. Em uma modalidade, a "lacuna" é fornecida por um ribonucleotídeo não emparelhado. Em outra modalidade, a "lacuna" é fornecida pela sequência dianteira de 5’ e/ou sequência traseira de 3’ não ligada. Nessa modalidade, a lacuna pode ser denominada como uma "lacuna não ligada". As incompatibilidades e lacunas não ligadas podem estar localizadas em várias posições da molécula de RNA. Para a modalidade, uma lacuna não ligada pode seguir imediatamente uma sequência antissentido. Em outra modalidade, uma lacuna não ligada pode estar perto de um laço da molécula de RNA. Em outra modalidade, uma lacuna não ligada é posicionada aproximadamente equidistante entre pelo menos dois laços.

[0429] Em uma modalidade, a molécula de RNA é produzida a partir de um filamento único de RNA. Em uma modalidade, o filamento único não é fechado circularmente, por exemplo, compreende uma lacuna não ligada. Em outra modalidade, a molécula de RNA é uma molécula fechada circularmente. As moléculas fechadas podem ser produzidas ligando-se uma molécula de RNA referenciada acima que compreende uma lacuna não ligada, por exemplo, com uma RNA ligase.

[0430] Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência de extensão de 5’ou de 3', ou ambas. Por exemplo, a molécula de RNA pode compreender uma sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5'. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3'. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5' e uma sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3'.

[0431] Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 5'. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3'. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 5' e uma sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3'.

[0432] Em outra modalidade, a molécula de RNA pode compreender um ou mais dos seguintes:

[0433] - sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5';

[0434] - sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3';

[0435] - sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 5' e uma sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 3';

[0436] - sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 5';

[0437] - sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3';

[0438] - uma sequência de extensão de 5’ que é ligada covalentemente ao segundo ribonucleotídeo 5' e uma sequência de extensão de 3’ que é ligada covalentemente ao primeiro ribonucleotídeo 3'.

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM MOLÉCULAS DE RNA

[0439] Um indivíduo versado na técnica entenderá a partir da descrição anterior que a presente revelação também fornece um ácido nucleico isolado que codifica moléculas de RNA reveladas no presente documento e as partes de componente das mesmas. Por exemplo, um ácido nucleico que compreende uma sequência apresentada em qualquer um ou mais do SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9. O ácido nucleico pode ser parcialmente purificado após a expressão em uma célula hospedeira. O termo "parcialmente purificado " é usado para se referir a uma molécula de RNA que foi, geralmente, separada dos lipídios, ácidos nucleicos, outros peptídeos, e outras moléculas contaminantes com as quais está associada em uma célula hospedeira. De preferência, o polinucleotídeo parcialmente purificado é pelo menos 60% livre, com mais preferência pelo menos 75% livre, e com mais preferência pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais está associado.

[0440] Em outro exemplo, um polinucleotídeo de acordo com a presente revelação é um polinucleotídeo heterólogo. O termo "polinucleotídeo heterólogo" é bem compreendido na técnica e se refere a um polinucleotídeo que não é endógeno a uma célula, ou é um polinucleotídeo nativo em que a sequência nativa foi alterada, ou um polipeptídeo nativo cuja expressão é quantitativamente alterada como resultado de uma manipulação da célula pelas técnicas de DNA recombinante.

[0441] Em outro exemplo, um polinucleotídeo de acordo com a presente revelação é um polinucleotídeo sintético. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser produzido usando-se técnicas que não exigem sequências de ácido nucleicos pré- existentes como impressão de DNA e síntese de oligonucleotídeo. Em outro exemplo, o polinucleotídeo é produzido a partir de xeno ácidos nucleicos.

[0442] Em um exemplo, um polinucleotídeo revelado no presente documento que codifica uma molécula precursora de RNA que compreende um íntron, de preferência em uma sequência de extensão de 5’ ou em pelo menos uma sequência de laço, em que o íntron tem capacidade para ser emendado durante a transcrição do polinucleotídeo em uma célula hospedeira ou in vitro. Em outro exemplo, a sequência de laço compreende dois, três, quatro, cinco ou mais íntrons. A presente revelação também fornece um construto de expressão como um construto de DNA que compreende um ácido nucleico isolado da revelação ligado de modo operacional a um promotor. Em um exemplo, esses ácidos nucleicos isolados e/ou construtos de expressão são fornecidos em uma célula ou organismo não humano. Em um exemplo, os ácidos nucleicos isolados são integrados de modo estável no genoma da célula ou organismo não humano. Vários exemplos de construtos de expressão adequados, promotores e células que compreendem os mesmos são discutidos abaixo.

[0443] Síntese de moléculas de RNA de acordo com a presente revelação pode ser alcançada usando-se vários métodos conhecidos na técnica. A seção de exemplos fornece um exemplo de síntese in vitro. Nesse exemplo, os construtos que compreendem as moléculas de RNA reveladas no presente documento são restringidos na extremidade 3<λ>, precipitados, purificados e quantificados. A síntese de RNA pode ser alcançada em cultura bacteriana após a transformação de células eletro-competentes HT115 e indução de síntese de RNA usando- se o sistema T7, IPTG.

VETORES RECOMBINANTES

[0444] Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante, que compreende pelo menos uma molécula de RNA definida no presente documento e tem capacidade para entregar a molécula de RNA em uma célula hospedeira. Os vetores recombinantes incluem vetores de expressão. Os vetores recombinantes contêm sequências de polinucleotídeos heterólogos, isto é, sequências de polinucleotídeos que não são encontradas naturalmente adjacentes a uma molécula de RNA definida no presente documento, que de preferência, são derivadas de uma espécie diferente. O vetor pode ser RNA ou DNA, e tipicamente é um vetor viral, derivados de um vírus, ou um plasmídeo.

[0445] Vários vetores virais podem ser usados para entregar e medir a expressão de uma molécula de RNA de acordo com a presente revelação. A escolha de vetor viral dependerá geralmente de vários parâmetros, como a célula ou tecido direcionado para entrega, eficiência de transdução do vetor e patogenicidade. Em um exemplo, o vetor viral integra na cromatina celular de hospedeiro (por exemplo lentivírus). Em outro exemplo, o vetor viral persiste no núcleo da célula predominantemente como um epissomo extracromossômico (por exemplo, adenovírus). Os exemplos desses tipos de vetores virais incluem oncoretrovírus, lentivírus, vírus adenoassociado, adenovírus, vírus da herpes e retrovírus.

[0446] Os vetores de plasmídeo incluem tipicamente sequências de ácidos nucleicos adicionais que proporcionam fácil seleção, amplificação e transformação do cassete de expressão em células procariotas, por exemplo, vetores derivados de pUC, vetores derivados de pGEM ou vetores binários que contêm uma ou mais regiões de T-DNA. As sequências de ácidos nucleicos adicionais incluem origens de replicação para proporcionar a replicação autônoma do vetor, genes de marcador selecionável, de preferência, que codifica resistência a herbicida ou antibiótico, múltiplos sítios de clonagem únicos proporcionando múltiplos sítios para inserir sequências de ácidos nucleicos ou genes codificados no construto de ácido nucleico, e sequências que aperfeiçoam a transformação de células eucariotas e procariotas (especialmente planta).

[0447] "Ligado de modo operacional" conforme usado no presente documento, se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucleico (por exemplo, DNA). Tipicamente, se refere à relação funcional de um elemento regulador transcricional (promotor) para uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor é ligado de modo operacional a uma sequência de codificação de uma molécula de RNA definida no presente documento, se estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula adequada. Em geral, os elementos reguladores transcricionais de promotor que são ligados de modo operacional a uma sequência transcrita são fisicamente contíguos à sequência transcrita, isto é, os mesmos são cis-acting. Entretanto, alguns elementos reguladores transcricionais como aperfeiçoadores não precisam ser fisicamente contíguos ou localizados próximos às sequências de codificação cuja transcrição os mesmos aperfeiçoam.

[0448] Quando houve múltiplos promotores presentes, cada promotor pode, independentemente, ser igual ou diferente.

[0449] Para facilitar a identificação de transformantes, o vetor recombinante compreende desejavelmente um gene marcador selecionável ou testável. O termo "gene marcador" significa um gene que confere um fenótipo distinto a células que expressam o gene marcador e, portanto, permite que essas células transformadas sejam distinguidas das células que não têm o marcador. Um gene marcador selecionável confere um traço para o qual um pode "selecionar" com base na resistência a um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, antibiótico). Um marcador de gene testável (ou gene repórter) confere um traço que um pode identificar através de observação ou teste, isto é, por "triagem” (por exemplo, β-glucuronidase, luciferase, GFP ou outra atividade enzimática não presente nas células não transformadas). Os marcadores selecionáveis exemplificativos para seleção de transformantes de planta incluem, sem limitação, um gene hyg que codifica resistência a higromicina B; uma gene neomicina fosfotransferase (nptlf) que confere resistência a canamicina, paromomicina; um gene glutationa-S-transferase de fígado de rato que confere resistência a glutationa derivada de herbicidas como, por exemplo, descrito no documento EP 256223; um gene glutamina sintetase que confere, mediante sobre-expressão, resistência a inibidores de glutamina sintetase como fosfinotricina como, por exemplo, descrito no documento WO 87/05327; um gene acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes que confere resistência ao agente seletivo fosfinotricina como, por exemplo, descrito no documento EP 275957; um gene que codifica uma 5-enolchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) que confere tolerância a N-fosfonometilglicina como, por exemplo, descrito por Hinchee et al. (1988); um gene bar que confere resistência contra bialafos como, por exemplo, descrito no documento W091/02071; um gene nitrilase como bxn da Klebsiella ozaenae que confere resistência a bromoxinil (Stalker et al., 1988); um gene diidrofolato redutase (DHFR) que confere resistência a metotrexato (Thillet et al., 1988); um gene acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfonilureia, ou outros produtos químicos inibidores de ALS (EP 154,204); um gene antranilato sintase mutante que confere resistência a 5-metil triptofano; ou um gene dalapon de-halogenase que confere resistência ao herbicida.

[0450] De preferência, o vetor recombinante é estavelmente incorporado no genoma da célula como a célula de planta. Consequentemente, o vetor recombinante pode compreender elementos adequados que permitem que o vetor seja incorporado no genoma, ou em um cromossomo da célula.

VETOR DE EXPRESSÃO

[0451] Conforme usado no presente documento, um “vetor de expressão" é um vetor de DNA que tem capacidade para transformar uma célula hospedeira e de efetuar a expressão de uma molécula de RNA definida no presente documento. Os vetores de expressão da presente invenção contêm sequências reguladoras como sequências de controle de transcrição, sequências de controle de tradução, origens de replicação, e outras sequências reguladoras que são compatíveis com a célula hospedeira e que controlam a expressão da molécula de RNA de acordo com a presente revelação. Em particular, os vetores de expressão da presente invenção incluem sequências de controle de transcrição. As sequências de controle de transcrição são sequências que controlam a iniciação, alongamento e terminação de transcrição. As sequências de controle de transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam a iniciação de transcrição como sequências de promotor, acentuador, operador e repressor. A escolha das sequências reguladoras usadas depende do organismo alvo como uma planta e/ou órgão alvo ou tecido de interesse. Essas sequências reguladoras podem ser obtidas a partir de qualquer organismo eucariota como plantas ou vírus de planta, ou podem ser sintetizadas quimicamente.

[0452] Os vetores exemplificativos adequados para transfecção de células de planta ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos em, por exemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, e Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vetores de expressão de planta incluem, por exemplo, um ou mais genes de planta clonados sob o controle transcricional de sequências reguladoras 5' e 3’ e um marcador selecionável dominante. Esses vetores de expressão de planta também podem conter uma região reguladora de promotor (por exemplo, uma região reguladora que controla expressão específica para célula ou tecido, ambiental ou desenvolvimentalmente reguladas constitutiva ou induzível), um sítio inicial de iniciação de transcrição, um sítio de ligação de ribossomo, um sítio de terminação de transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação.

[0453] Os vetores da invenção também podem ser usados para produzir moléculas de RNA definidas no presente documento em um sistema de expressão livre de célula, esses sistemas são bem conhecidos na técnica.

[0454] Em um exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA de acordo com a presente revelação é ligado de modo operacional a um promotor com capacidade para direcionar a expressão da molécula de RNA em uma célula hospedeira. Em um exemplo, o promotor funciona in vitro. Em um exemplo, o promotor é um promotor de RNA polimerase. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor de RNA polimerase III. Em outro exemplo, o promotor pode ser um promotor de RNA polimerase II. Entretanto, a escolha de promotor pode depender do organismo alvo como uma planta, inseto e/ou órgão alvo ou tecido de interesse. Os promotores de mamíferos exemplificativos incluem CMV, EFla, SV40, PGKl, Ubc, beta actina humana, CAG, TRE, UAS, CaMKIIa, CAL1, 10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, HI e U6. Os promotores de inseto incluem Ac5 e poliédron. Vários promotores constitutivos que estão ativos em células de planta também foram descritos. Os promotores adequados para expressão constitutiva em plantas incluem, sem limitação, o promotor de vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) 35s, o promotor do vírus do mosaico da betônica aquática (figwort) (FMV) 35S, o promotor induzível por luz da subunidade pequena (SSU) da ribulose-l,5-bis- fosfato carboxilase, o promotor de triofosfato isomerase citosólico de arroz, o promotor de adenina fosforibosiltransferase de Arabidopsis, o promotor de gene actina 1 de arroz, os promotores de manopina sintase e octopina sintase, o promotor de Adh, o promotor de sacarose sintase, o promotor de complexo de gene R, e o promotor de gene de proteína de ligação de clorofila α/β. Esses promotores foram usados para criar vetores de DNA que foram expressos em plantas, consultar, por exemplo, WO 84/02913. Todos esses promotores foram usados para criar vários tipos de vetores de DNA recombinantes expressáveis em planta.

[0455] Para o propósito da expressão em tecidos- fonte da planta como a folha, semente, raiz ou caule, é preferível que os promotores utilizados na presente invenção tenham expressão relativamente alta nesses tecidos específicos. Para essa finalidade, um pode escolhe dentre vários promotores para genes com expressão acentuada ou específica para célula ou tecido. Os exemplos desses promotores relatados na literatura incluem, o promotor de cloroplasto glutamina sintetase GS2 da ervilha, o promotor de cloroplasto frutose-1,6-bifosfatase do trigo, o promotor fotossintético nuclear ST-LS1 da batata, o promotor de serina/treonina quinase e o promotor de glicoamilase (CHS) da Arabidopsis thaliana. Também é relatado que é ativo em tecidos fotossinteticamente ativos o promotor de ribulose-l, 5-bifosfato carboxilase do larício oriental (Larix laricina), o promotor do gene Cab, Cab6, do pinheiro, o promotor do gene Cab-1 do trigo , o promotor do gene Cab-1 do espinafre, o promotor do gene Cab 1R do arroz, o piruvato, promotor do ortofosfato dicinase (PPDK) de Zea mays, o promotor do gene Lhcbl * 2 do tabaco, o promotor simulador de sacarose-H30 Suc2 e o promotor para os genes da proteína da membrana tilacoide do espinafre (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS). Outros promotores para as proteínas de ligação à clorofila α/β também podem ser utilizados na presente invenção, como os promotores do gene LhcB e do gene PsbP da mostarda branca (Sinapis alba).

[0456] Uma variedade de promotores de genes de plantas que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento, também pode ser usada para a expressão de genes de proteínas de ligação a RNA em células vegetais, incluindo promotores regulados por (1) calor ( 2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A de ervilha, promotor RbcS de maíz), (3) hormônios como ácido abscísico, (4) ferimento (por exemplo, Wunl) ou (5) produtos químicos como jasmonato de metila, ácido salicílico, hormônios de esteroide, álcool, agentes de proteção (documento WO 97/06269) ou também pode ser vantajoso empregar (6) promotores específicos para órgãos.

[0457] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor específico para órgão de armazenamento de plantas" se refere a um promotor que preferencialmente, quando comparado a outros tecidos vegetais, direciona a transcrição de genes em um órgão de armazenamento de uma planta. Para fins de expressão no tecido não fotossintético da planta, como o tubérculo da batata, o fruto do tomate ou a semente de soja, canola, algodão, Zea mays, trigo, arroz e cevada, é preferível que o os promotores utilizados na presente invenção tenham expressão relativamente alta nesses tecidos específicos. O promotor para β-congelinina ou outros promotores específicos para sementes, tais como os promotores de napina, zeína, linina e faseolina. Os promotores específicos para raiz também podem ser usados. Um exemplo desse promotor é o promotor do gene da quitinase ácida. A expressão no tecido da raiz também pode ser realizada utilizando os subdomínios específicos da raiz do promotor CaMV 35S que foram identificados.

[0458] Em uma modalidade particularmente preferencial, o promotor direciona a expressão em tecidos e órgãos nos quais a biossíntese lipídica ocorre. Tais promotores podem atuar no desenvolvimento de sementes em um momento adequado para modificar a composição lipídica nas sementes. Os promotores preferenciais para expressão específica para semente incluem: 1) promotores de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese e acumulação lipídica em sementes como dessaturases e elongases, 2) promotores de genes que codificam proteínas de armazenamento de sementes e 3) promotores de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese e acumulação de carboidratos nas sementes. Os promotores específicos para sementes adequados são, o promotor do gene da colza napina (documento US 5.608, 152), o promotor Vicia faba USP (Baumlein et al., 1991), o promotor oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), o promotor de faseolina Phaseolus vulgaris (documento US 5.504.200), o promotor Brassica Bce4 (documento WO 91/13980) ou o promotor de leguminosa B4 (Baumlein et al., 1992) e promotores que levam à expressão específica para sementes em monocotiledôneas como maíz, cevada, trigo, centeio, arroz e similares.

Os promotores notáveis que são adequados são o promotor do gene lpt2 ou lpt1 da cevada (documentos WO 95/15389 e WO 95/23230), ou os promotores descritos no documento WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína da cevada, o gene da glutelina de arroz, o gene da orizina do arroz, o gene da prolamina do arroz, o gene da gliadina do trigo, o gene da glutelina do trigo, o gene da zeína do maíz, o gene da glutelina de aveia, o gene da sorgo- casirina, o gene da secina de centeio). Outros promotores incluem os descritos por Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), documentos US 20070192902 e US 20030159173. Em uma modalidade, o promotor específico para semente é expresso preferencialmente em partes definidas da semente, como o cotilédone (s) ou o endosperma.

Exemplos de promotores específicos para cotilédones incluem, entre outros, o promotor FP1 (Ellerstrom et al., 1996), o promotor de legumina da ervilha (Perrin et al., 2000) e o promotor de fito-hemaglutnina de feijão (Perrin et al., 2000 ) Exemplos de promotores específicos para o endosperma incluem, entre outros, o promotor zein-1 do maíz (Chikwamba et al., 2003), o promotor glutelina- 1 do arroz (Yang et al., 2003), o promotor D-hordeína da cevada (Horvath et al., 2000) e promotores de glutenina HMW de trigo

(Alvarez et al., 2000). Em uma modalidade adicional, o promotor específico para semente não é expresso, ou é expresso apenas em um nível baixo, no embrião e/ou após a semente germinar.

[0459] Em outra modalidade, o promotor específico de órgão de armazenamento de plantas é um promotor específico de frutas. Os exemplos incluem, entre outros, os promotores de poligalacturonase de tomate, E8 e Pds, bem como o promotor de ACC oxidase de maçã (para revisão, consultar Potenza et al., 2004). Em uma modalidade preferencial, o promotor direciona preferencialmente a expressão nas partes comestíveis da fruta, por exemplo, a medula da fruta, em relação à pele da fruta ou às sementes dentro da fruta.

[0460] Em uma modalidade, o promotor induzível é o sistema Aspergillus nidulans ale. Exemplos de sistemas de expressão induzíveis que podem ser usados no lugar do sistema Aspergillus nidulans ale são descritos em uma revisão de Padidam (2003) e Corrado e Karali (2009). Em outra modalidade, o promotor induzível é um promotor indutor de agente de segurança, como, por exemplo, o promotor maíz ln2-l ou ln2-2 (Hershey e Stoner, 1991), o promotor induzível de segurança é o promotor GST-27 de maíz (Jepson et al. al., 1994) ou o promotor GH2/4 de soja (Ulmasov et al., 1995).

[0461] Em outra modalidade, o promotor induzível é um promotor induzível por senescência, como, por exemplo, promotor induzível por senescência SAG (gene associado a senescência) 12 e SAG 13 de Arabidopsis (Gan, 1995; Gan e Amasino, 1995) e LSC54 de Brassica napus (Buchanan-Wollaston, 1994). Tais promotores mostram expressão aumentada aproximadamente no início da senescência dos tecidos vegetais, em particular as folhas.

[0462] Para expressão em folhas de tecido vegetativo, promotores específicos, como os promotores de ribulose-bifosfato carboxilase (RBCS), podem ser usados. Por exemplo, os genes RBCSl, RBCS2 e RBCS3A do tomate são expressos em folhas e mudas cultivadas em luz (Meier et al., 1997). Os promotores de bifosfato carboxilase de ribulose expressos quase exclusivamente em células mesofilas em lâminas e invólucros foliares em altos níveis, descritos por Matsuoka et al. (1994), podem ser usados. Outro promotor específico para folha é o promotor do gene da proteína de ligação à clorofila α/β de colheita leve (consultar Shiina et al., 1997). O promotor de gene relacionado ao Arabidopsis thaliana myb (Atmyb5) descrito por Li et al. (1996), é específico para folha. O promotor Atmyb5 é expresso no desenvolvimento de tricomas foliares, estípulas e células epidérmicas nas margens de folhas jovens de roseta e caulina e em sementes imaturas. Um promotor de folhas identificado no maíz por Busk et al. (1997) também pode ser usado.

[0463] Em alguns casos, por exemplo, quando LEC2 ou BBM é expresso de forma recombinante, pode ser desejável que o transgene não seja expresso em níveis altos. Um exemplo de um promotor que pode ser usado em tais circunstâncias é um promotor de napina A truncado que retém o padrão de expressão específico para semente, mas com um nível de expressão reduzido (Tan et al., 2011).

[0464] A sequência dianteira não traduzida 5’ pode ser derivada do promotor selecionado para expressar a sequência genética heteróloga de uma molécula de RNA da presente revelação ou pode ser heteróloga em relação à região de codificação da enzima a ser produzida e pode ser modificado especificamente, se desejado, de modo a aumentar a tradução do mRNA. Para uma revisão da otimização da expressão de transgenes, consultar Koziel et al. (1996). As regiões não traduzidas 5’ também podem ser obtidas a partir de RNAs virais de plantas (vírus do mosaico do tabaco, vírus etch do tabaco, vírus do mosaico anão do maíz, vírus do mosaico da alfafa, entre outros) a partir de genes eucariotas adequados, genes de plantas (líder do gene da proteína de ligação à clorofila α/β de trigo e maíz) ou de uma sequência genética sintética. A presente invenção não está limitada a construtos em que a região não traduzida é derivada da sequência não traduzida 5 'que acompanha a sequência promotora. A sequência dianteira também pode ser derivada de um promotor ou sequência de codificação não relacionado. As sequências dianteiras úteis no contexto da presente invenção compreendem o líder Hsp70 do maíz (US 5.362.865 e US 5.859.347) e o elemento ômega TMV.

[0465] A terminação da transcrição é realizada por uma sequência de DNA não traduzida de 3‘ operativamente ligada no vetor de expressão à molécula de RNA de interesse. A região não traduzida 3' de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona nas plantas para causar a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3' do RNA. A região não traduzida de 3’ pode ser obtida a partir de vários genes que são expressos em células vegetais. A região não traduzida da nopalina sintase 3', a região não traduzida 3' do gene Rubisco da subunidade pequena de ervilha, a região não traduzida 3’ do gene da proteína de armazenamento de sementes de soja 7S são comumente usadas nessa capacidade. As regiões não traduzidas e transcritas em 3’ que contêm o sinal de poliadenilato dos genes do plasmídeo indutor de tumor de Agrobactéria (Ti) também são adequadas.

ÁCIDOS NUCLEICOS DE TRANSFERÊNCIA

[0466] Os ácidos nucleicos de transferência podem ser utilizados para entregar um polinucleotídeo exógeno a uma célula e compreende uma, preferencialmente duas, sequências de margem e uma ou mais moléculas de RNA de interesse. O ácido nucleico de transferência pode ou não codificar um marcador selecionável. De preferência, o ácido nucleico de transferência faz parte de um vetor binário em uma bactéria, onde o vetor binário compreende ainda elementos que permitem a replicação do vetor na bactéria, seleção ou manutenção de células bacterianas contendo o vetor binário. Mediante a transferência para uma célula eucariota, o componente de ácido nucleico de transferência do vetor binário tem capacidade para integração no genoma da célula eucariota ou, para experimentos de expressão transitória, apenas de expressão na célula.

[0467] Conforme usado no presente documento, o termo "ácido nucleico de transferência extracromossômica" se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para ser transferida de uma bactéria como Agrobactéria sp., para uma célula eucariota, como uma célula da folha da planta. Um ácido nucleico de transferência extracromossômico é um elemento genético que é bem conhecido como um elemento capaz de ser transferido, com a subsequente integração de uma sequência de nucleotídeos contida dentro de suas margens no genoma da célula receptora. A este respeito, um ácido nucleico de transferência é flanqueado, tipicamente, por duas sequências "de margem", embora em alguns casos uma única margem em uma extremidade possa ser usada e a segunda extremidade do ácido nucleico transferido seja gerada aleatoriamente no processo de transferência. Uma molécula de RNA de interesse é tipicamente posicionada entre a sequência semelhante à margem esquerda e a sequência semelhante à margem direita de um ácido nucleico de transferência. A molécula de RNA contida no ácido nucleico de transferência pode estar operacionalmente ligada a uma variedade de diferentes elementos reguladores de promotor e terminador que facilitam sua expressão, isto é, transcrição e/ou tradução da molécula de RNA. Os DNAs de transferência (T- DNAs) de Agrobactéria sp. tais como Agrobactéria tumefaciens ou Agrobactéria rhizogenes, e variantes/mutantes artificiais são provavelmente os exemplos mais bem caracterizados de ácidos nucleicos de transferência. Outro exemplo é o P-DNA ("DNA de planta") que compreende sequências similares a margem de T-DNA de plantas.

[0468] Conforme usado no presente documento, "T- DNA" se refere a um T-DNA de um plasmídeo Agrobactéria tumefaciens Ti ou de um plasmídeo Agrobactéria rhizogenes Ri, ou variantes do mesmo que funcionam para a transferência de DNA em células vegetais. O T-DNA pode compreender um T-DNA inteiro, incluindo as sequências de margem direita e esquerda, mas precisa compreender apenas as sequências mínimas necessárias em cis para transferência, ou seja, a sequência de margem de T-DNA correta. Os T-DNA da invenção têm, inseridos nos mesmos, em qualquer lugar entre as sequências de margem direita e esquerda (se presentes), a molécula de RNA de interesse. As sequências que codificam os fatores necessários em trans para a transferência do T-DNA para uma célula vegetal, como os genes vir, podem ser inseridas no T-DNA ou estar presentes no mesmo replicão que o T-DNA, ou preferencialmente trans em um replicão compatível no hospedeiro Agrobactéria.

Tais "sistemas de vetores binários" são bem conhecidos na técnica. Conforme usado no presente documento, "P-DNA" se refere a um ácido nucleico de transferência isolado de um genoma vegetal, ou variantes/mutantes criados pelo homem, e compreende em cada extremidade, ou em apenas uma extremidade, uma sequência semelhante a margem de T-DNA.

[0469] Conforme usado no presente documento, uma sequência de “margem" de um ácido nucleico de transferência pode ser isolada de um organismo selecionado, como uma planta ou bactéria, ou ser uma variante/mutante feita pelo homem. A sequência de fronteira promove e facilita a transferência da molécula de RNA à qual está ligada e pode facilitar sua integração no genoma da célula receptora. Em uma modalidade, uma sequência de margem tem entre 10 a 80 bp de comprimento. As sequências de fronteira do T-DNA de Agrobactéria sp. são bem conhecidas na técnica e incluem os descritos em Lacroix et al. (2008).

[0470] Enquanto tradicionalmente apenas Agrobactéria sp. Foi usada para transferir genes para células vegetais, existe agora um grande número de sistemas identificados/desenvolvidos que atuam de maneira semelhante à Agrobactéria sp. Várias espécies não-Agrobactéria foram recentemente modificadas geneticamente para serem competentes na transferência de genes (Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005). Estas incluem Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti e Mezorhizobium loti.

[0471] A transferência direta de plasmídeos de expressão eucariotas de bactérias para hospedeiros eucariotas foi alcançada várias décadas atrás pela fusão de células de mamíferos e protoplastos de Escherichia coli portadora de plasmídeo (Schaffner, 1980). Desde então, o número de bactérias capazes de entregar genes nas células de mamíferos tem aumentado constantemente (Weiss, 2003), sendo descoberto por quatro grupos independentemente (Sizemore et al. 1995; Courvalin et al., 1995; Powell et al., 1996; Darji et al., 1997).

[0472] Conforme usado no presente documento, os termos "transfecção", "transformação" e variações dos mesmos são geralmente utilizadas de forma intercambiável. As células "transfectadas" ou "transformadas" podem ter sido manipuladas para introduzir a(s) molécula(s) de RNA de interesse, ou podem ser células descendentes derivadas das mesmas.

CÉLULAS RECOMBINANTES

[0473] A invenção também fornece uma célula recombinante, por exemplo, uma célula bacteriana recombinante, célula fúngica, célula vegetal, célula de inseto ou célula animal, que é uma célula hospedeira transformada com uma ou mais moléculas ou vetores de RNA aqui definidos ou combinação das mesmas. As células adequadas da invenção incluem qualquer célula que possa ser transformada com uma molécula de RNA ou vetor recombinante de acordo com a presente revelação. Em um exemplo, a célula hospedeira transformada está morta.

[0474] A célula recombinante pode ser uma célula em cultura, uma célula in vitro ou em um organismo como, por exemplo, uma planta ou em um órgão como, por exemplo, uma semente ou uma folha. Preferencialmente, a célula está em uma planta, mais preferencialmente na semente de uma planta. Em uma modalidade, a célula recombinante é uma célula não humana. Por conseguinte, em um exemplo, a presente revelação se refere a um organismo não humano que compreende uma ou mais ou todas as moléculas de RNA aqui no presente documento.

[0475] Em um exemplo, as células são células de insetos. Em um exemplo, as células de insetos são derivadas de Trichoplusia.

[0476] Outro exemplo de uma célula hospedeira adequada é uma célula HT115 eletro competente.

[0477] As células hospedeiras nas quais as moléculas de RNA são introduzidas podem ser células não transformadas ou células que já são transformadas com pelo menos um ácido nucleico. Tais ácidos nucleicos podem estar relacionados à síntese lipídica, ou não relacionados. As células hospedeiras da presente invenção podem ser endógenas (isto é, naturalmente) capazes de expressar molécula(s) de RNA definidas no presente documento, caso em que a célula recombinante daí derivada tem uma capacidade aprimorada para produzir a(s) molécula(s) de RNA, ou pode ser capaz de produzir a(s) referida(s) molécula(s) de RNA somente após ser transformado com pelo menos uma molécula de RNA aqui definida. Em um exemplo, a célula é uma célula que tem capacidade para ser usada para produzir lipídios. Em uma modalidade, uma célula recombinante da invenção tem uma capacidade aprimorada para produzir lipídios não polares, como TAG.

[0478] As células hospedeiras da presente revelação podem ser qualquer célula capaz de expressar pelo menos uma molécula de RNA descrita no presente documento e incluem células bacterianas, fúngicas (incluindo leveduras), parasitas, artrópodes, animais e vegetais. Exemplos de células hospedeiras incluem Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Micobactérias, Trichoplusia, Agrobactéria, células BHK (rim de hamster filhote), células MDCK, células CRFK, células CV-1, COS (por exemplo, COS-7) células e células Vero. Outros exemplos de células hospedeiras são E. coli, incluindo derivados de E. coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium, incluindo estirpes atenuados; Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; e células G8 de mioblastos de ratos não tumorigênicos (por exemplo, ATCC CRL 1246). Hospedeiros de células adicionais de mamíferos apropriados incluem outras linhagens celulares de rim, outras linhagens celulares de fibroblastos (por exemplo, linhagens celulares de fibroblastos de embriões humanos, murinos ou de galinha), linhagens celulares de mieloma, células de ovário de hamster chinês, células NIH/3T3 de camundongo, células LMTK e/ou HeLa células.

[0479] Em uma modalidade preferencial, a célula vegetal é uma célula de semente, em particular, uma célula num cotilédone ou endosperma de uma semente. Em uma modalidade, a célula é uma célula de animal. A célula animal pode ser de qualquer tipo de animal, como, por exemplo, uma célula animal não humana, uma célula de vertebrado não humano, uma célula de mamífero não humana ou células de animais aquáticos, como peixes ou crustáceos, invertebrados, insetos, etc. Exemplos de células de algas úteis como células hospedeiras da presente invenção incluem, por exemplo, Chlamydomonas sp. (por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp., Chlorella sp., Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. e Volvox sp.

PLANTAS TRANSGÊNICAS

[0480] A invenção também fornece uma planta que compreende uma ou mais moléculas de RNA exógenas aqui definidas, uma célula de acordo com a presente revelação, um vetor de acordo com a presente revelação ou uma combinação das mesmas. O termo "planta", quando usado como substantivo, se refere a plantas inteiras, enquanto o termo "parte da mesma” se refere a órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, flores, frutas), células únicas (por exemplo, pólen), semente, partes de semente como embrião, endosperma, escutelo ou revestimento de sementes, tecido vegetal como tecido vascular, células vegetais e descendência do mesmo. Conforme usado no presente documento, as partes da planta compreendem células vegetais.

[0481] Conforme usado no presente documento, os termos "em uma planta" e "na planta" no contexto de uma modificação na planta significa que a modificação ocorreu em pelo menos uma parte da planta, incluindo o local em que a modificação ocorreu em toda a planta, e não exclui o local em que a modificação ocorre em apenas uma ou mais partes, mas não em todas as partes da instalação. Por exemplo, é dito que um promotor específico para tecido é expresso "em uma planta", mesmo que possa ser expresso apenas em determinadas partes da planta. Analogamente, “um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta" significa que o aumento da expressão ocorre em pelo menos uma parte da planta.

[0482] Conforme usado no presente documento, o termo "planta" é usado no sentido mais amplo, incluindo qualquer organismo do Reino Plantae. Também inclui algas vermelhas e marrons, bem como algas verdes. Inclui, mas não está limitado a qualquer espécie de planta com flores, grama, safra ou cereal (por exemplo, oleaginosas, maíz, soja), forragem, planta de frutas ou vegetais, planta de ervas,

plantas lenhosas ou árvores. Não se destina a limitar uma planta a nenhuma estrutura específica. Também se refere a uma planta unicelular (por exemplo, microalga). O termo "parte do mesmo em referência a uma planta se refere a uma célula vegetal e sua progênie, uma pluralidade de células vegetais, uma estrutura que está presente em qualquer estágio do desenvolvimento da planta ou um tecido vegetal. Tais estruturas incluem, sem limitação, folhas, caules, flores, frutas, nozes, raízes, sementes, revestimento de sementes, embriões. O termo "tecido vegetal" inclui tecidos diferenciados e indiferenciados de plantas, incluindo aqueles presentes em folhas, caules, flores, frutas, nozes, raízes, sementes, por exemplo, tecido embrionário, endosperma, tecido dérmico (por exemplo, epiderme, periderme), tecido vascular (por exemplo, xilema, floema) ou tecido do solo (que compreende células do parênquima, colênquima e/ou esclerênquima), bem como células em cultura (por exemplo, células únicas, protoplastos, calos, embriões, etc.). O tecido vegetal pode estar em planta, em cultura de órgãos, cultura de tecidos ou cultura de células.

[0483] Diferentes quantidades de ácidos graxos 18:3 e 16:3 são encontradas nos glicolipídios de diferentes espécies vegetais. Isso é usado para distinguir entre plantas 18:3 cujos ácidos graxos com três ligações duplas geralmente têm sempre átomos Cis e as plantas 16:3 que contêm ácidos graxos Ci6 e Cis. Nos cloroplastos 18:3, as atividades enzimáticas que catalisam a conversão de fosfatidato em diacilglicerol e diaciglicerol em monogalactosil diacilglicerol (MGD) são significativamente menos ativas do que nos cloroplastos 16:3. Nas folhas de plantas 18:3, os cloroplastos sintetizam estearoil-ACP2 no estroma, introduzem a primeira ligação dupla na cadeia de hidrocarbonetos saturados e, então, hidrolisam o tioéster. O oleato liberado é exportado através dos envelopes de cloroplasto para as membranas da parte eucariota da célula, provavelmente o retículo endoplasmático, em que é incorporado ao PC. Grupos oleoila ligados a PC são dessaturados nessas membranas e subsequentemente voltam ao cloroplasto. Os grupos acila ligados a MGD são substratos para a introdução da terceira ligação dupla para render MGD com dois resíduos de linoleoil. Este galactolipídeo é característico de plantas 18:3, como Asteraceae e Fabaceae, por exemplo. Nas células fotossinteticamente ativas de plantas 16:3 que são representadas, por exemplo, por membros de Apiaceae e Brassicaceae, duas vias operam em paralelo para fornecer tilacoides com MGD. A sequência cooperativa 'eucariota' é complementada em várias extensões por uma via ‘procariota'. Suas reações são confinadas ao cloroplasto e resultam em um arranjo típico de grupos acila, bem como em sua completa dessaturação, uma vez que são esterificados para MGD. As estruturas principais de DAG procariotas transportam C16:0 e seus produtos de dessaturação em C-2, posição da qual os ácidos graxos C18: são excluídos. A posição C-1 é ocupada pelos ácidos graxos C18 e, em pequena medida, pelos grupos C16. A semelhança nas estruturas principais de DAG dos lipídios das algas verde-azuladas com as sintetizadas pela via coloroplasto-confirmada em plantas 16:3 sugere uma relação filogenética e justifica o termo procariota.

[0484] Conforme usado no presente documento, o termo "tecido vegetativo" ou "parte vegetativa da planta" é qualquer tecido vegetal, órgão ou parte diferente de órgãos para reprodução sexual de plantas. Os órgãos de reprodução sexual das plantas são especificamente órgãos que portam sementes, flores, pólen, frutos e sementes. Os tecidos e partes vegetais incluem pelo menos folhas de plantas, caules (incluindo parafusos e perfilhos, mas excluindo as cabeças), tubérculos e raízes, mas excluem flores, pólen, sementes, incluindo o revestimento das sementes, embrião e endosperma, frutas incluindo tecido de mesocarpo, vagens que portam sementes e cabeças que portam sementes. Em uma modalidade, a parte vegetativa da planta é uma parte aérea da planta. Em outra ou modalidade adicional, a parte da planta vegetativa é uma parte verde, como uma folha ou caule.

[0485] Uma "planta transgênica" ou suas variações se refere a uma planta que contém um transgene não encontrado em uma planta de tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. As plantas transgênicas como definidas no contexto da presente invenção incluem plantas e sua progênie que foram geneticamente modificadas usando técnicas recombinantes para causar a produção de pelo menos um polipeptídeo aqui definido na planta ou parte desejada. Partes de plantas transgênicas têm um significado correspondente.

[0486] Os termos "semente" e "grão" são aqui utilizados de modo intercambiável. "Grão" se refere a grãos maduros, como grãos colhidos ou ainda em uma planta, mas prontos para a colheita, mas também pode se referir a grãos após a embebição ou germinação, de acordo com o contexto. Grãos maduros geralmente têm um teor de umidade inferior a cerca de 18%. Em uma modalidade preferencial, o teor de umidade do grão está em um nível que é geralmente considerado seguro para armazenamento, preferencialmente entre 5% e 15%, entre 6% e 8%, entre 8% e 10% ou entre 10% e 15%. "Semente em desenvolvimento", como aqui utilizado, se refere a uma semente antes da maturidade, tipicamente encontrada nas estruturas reprodutivas da planta após fertilização ou antese, mas também pode se referir a essas sementes antes da maturidade que são isoladas de uma planta. As sementes maduras geralmente apresentam um teor de umidade menor do que cerca de 12%.

[0487] Conforme usado no presente documento, o termo "órgão de armazenamento de plantas" se refere a uma parte de uma planta especializada para armazenar energia na forma de, por exemplo, proteínas, carboidratos, lipídios. Exemplos de órgãos de armazenamento de plantas são sementes, frutas, raízes tuberosas e tubérculos. Um órgão de armazenamento de plantas preferencial da invenção é a semente.

[0488] Conforme usado no presente documento, o termo "fenotipicamente normal" se refere a uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma, por exemplo, uma planta transgênica ou um órgão de armazenamento, como uma semente, tubérculo ou fruto da invenção que não possui uma capacidade significativamente reduzida de crescer e se reproduzir quando comparado a uma planta não modificada ou parte da mesma. De preferência, a biomassa, a taxa de crescimento, a taxa de germinação, o tamanho do órgão de armazenamento, o tamanho das sementes e/ou o número de sementes viáveis produzidas não é inferior a 90% do de uma planta sem o referido polinucleotídeo recombinante quando cultivado sob condições idênticas. Este termo não abrange características da planta que podem ser diferentes da planta de tipo selvagem, mas que não afetam a utilidade da planta para fins comerciais, como, por exemplo, um fenótipo de bailarina de folhas de mudas. Em uma modalidade, a planta geneticamente modificada ou parte da mesma que é fenotipicamente normal compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica um supressor de silenciamento operacionalmente ligado a um promotor específico de órgão de armazenamento de plantas e tem uma capacidade de crescer ou reproduzir o que é essencialmente o mesmo que uma planta correspondente ou parte do mesmo que não compreende o referido polinucleotídeo.

[0489] As plantas fornecidas ou contempladas para utilização na prática da presente invenção incluem monocotiledôneas e dicotiledôneas. Em modalidades preferenciais, as plantas da presente invenção são plantas de safra (por exemplo, cereais e leguminosas, maíz, trigo, batata, arroz, sorgo, milhete, mandioca, cevada) ou leguminosas como soja, feijão ou ervilha. As plantas podem ser cultivadas para a produção de raízes, tubérculos, folhas, caules, flores ou frutos comestíveis. As plantas podem ser vegetais cujas partes vegetativas são usadas como alimento. As plantas da invenção podem ser: Acrocomia aculeata (macaúba), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (amendoim), Astrocaryum murumuru (murumuru), Astrocaryum vulgare (tucuma), Attalea geraensis (Indaia- rateiro), Attalea humilis (dendê americano), Attalea oleifera () Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babaçu), Avena sativa (aveia), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Brassica sp. como Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (canola), Camelina sativa (falso linho), Cannabis sativa (cânhamo), Carthamus tinctorius (açafrão), Caryocar brasiliense (pequi), Cocos nucifera (coco), Crambe abyssinica (Couve abissínio), Cucumis melo (melão), Elaeis guineensis (palmeira africana), Glycine max (soja), Gossypium hirsutum (algodão), Helianthus sp. como

Helianthus annuus (girassol), Hordeum vulgare (cevada), Jatropha curcas (porca física), Joannesia princeps (arara), Lemna sp. (lentilha), como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentilha inchada), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna trifera, Lemna trifera, Lemna , Lemna yungensis, Licania rigida (oiticica), Linum usitatissimum (linho), Lupinus angustifolius (tremoço), Mauritia flexuosa (palma de buriti), Maximiliana maripa (palma de inaja), Miscanthus sp. como Miscanthus x giganteus e Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco), como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba- de-azeite), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), Oryza sp. (arroz) como Oryza sativa e Oryza glaberrima, Panicum virgatum (switchgrass), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana (abacate), Pongamia pinnata (faia indiana), Populus trichocarpa, Ricinus communis (mamona), Saccharum sp. (cana), Sesamum indicum (gergelim), Solanum tuberosum (batata), Sorghum sp. como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (palma da mão brasileira), Triticum sp. (trigo), como Triticum aestivum, Zea mays (milho), alfafa (Medicago sativa), centeio (Secale cerale), batata doce (Lopmoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), abacaxi (Anana comosus) ), cítrico (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia senensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifer) indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia intergrifolia) e amêndoa

(Prunus amygdalus). Por exemplo, as plantas da revelação podem ser Nicotiana benthamiana.

[0490] Outras plantas preferenciais incluem gramíneas C4, como, além das mencionadas acima, Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus; Gramíneas C3, como Elymus canadensis, as leguminosas Lespedeza capitata e Petalostemum villosum, o forb Aster azureus; e plantas lenhosas como Quercus ellipsoidalis e Q. macrocarpa. Outras plantas preferenciais incluem gramíneas C3.

[0491] Em uma modalidade preferencial, a planta é um angiosperma.

[0492] Em uma modalidade, a planta é uma planta de oleaginosas, de preferência uma planta de oleaginosas. Conforme usado no presente documento, uma "planta oleaginosa" é uma espécie de planta usada para a produção comercial de lipídios a partir das sementes da planta. A planta de oleaginosas pode ser, por exemplo, colza (como canola), maíz, girassol, cártamo, soja, sorgo, linho (linhaça) ou beterraba sacarina. Além disso, a planta oleaginosa pode ser outras Brassicas, algodão, amendoim, papoula, rutabaga, mostarda, mamona, gergelim, gergelim, cártamo, Jatropha curcas ou plantas produtoras de nozes. A planta pode produzir altos níveis de lipídios em seus frutos, como azeite, azeite de dendê ou coco. As plantas hortícolas às quais a presente invenção pode ser aplicada são alface, endívia ou Brassicas vegetais, incluindo repolho, brócolis ou couve-flor. A presente invenção pode ser aplicada em tabaco, cucurbitáceas, cenoura, morango, tomate ou pimenta.

[0493] Em uma modalidade preferencial, a planta transgênica é homozigota para todo e qualquer gene que foi introduzido (transgene), de modo que sua progênie não se separe para o fenótipo desejado. A planta transgênica também pode ser heterozigota para o(s) transgene(s) introduzido(s), preferencialmente uniformemente heterozigota para o transgene, como por exemplo, na progênie Fl que foram cultivadas a partir de sementes híbridas. Tais plantas podem fornecer vantagens como vigor híbrido, bem conhecido na técnica.

TRANSFORMAÇÃO

[0494] As moléculas de RNA reveladas no presente documento podem ser introduzidas de maneira estável nas células hospedeiras acima mencionadas e/ou organismos não humanos, como plantas. Para evitar dúvidas, um exemplo da presente revelação abrange uma planta acima mencionada transformada de forma estável com uma molécula de RNA revelada no presente documento. Conforme usado no presente documento, os termos "transformação estável", "transformação estável" e variações da mesma referem-se à integração da molécula de RNA ou de um ácido nucleico que codifica o mesmo no genoma da célula, de forma que eles sejam transferidos para as células descendentes durante a divisão celular sem a necessidade de selecionar positivamente a presença deles. Os transformantes estáveis, ou sua progênie, podem ser identificados por qualquer meio conhecido na técnica, como Southern blots no DNA cromossômico, ou hibridização in situ do DNA genômico, permitindo sua seleção.

[0495] As plantas transgênicas podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na técnica, como as geralmente descritas em Slater et al., Plant Biotechnology -

The Genip Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003) e Christou e Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

[0496] Em uma modalidade, as plantas podem ser transformadas aplicando topicamente uma molécula de RNA de acordo com a presente revelação à planta ou a uma parte da mesma. Por exemplo, a molécula de RNA pode ser fornecida como uma formulação com um veículo adequado e aspergida, pulverizada ou aplicada de outro modo à superfície de uma planta ou parte da mesma. Por conseguinte, em um exemplo, os métodos da presente revelação englobam a introdução de uma molécula de RNA revelada no presente documento a uma planta, sendo que o método compreende aplicar topicamente uma composição que compreende a molécula de RNA à planta ou a uma parte da mesma.

[0497] A transferência mediada por Agrobactéria é um sistema amplamente aplicável para a introdução de genes nas células vegetais, porque o DNA pode ser introduzido nas células em tecidos vegetais inteiros, órgãos vegetais ou explantes na cultura de tecidos, seja para expressão transitória ou para integração estável do DNA no genoma de células vegetais. Por exemplo, os métodos de imersão floral (em planta) podem ser usados. A utilização de vetores de integração de plantas mediados por Agrobactéria para introduzir DNA nas células vegetais é bem conhecida na técnica. A região do DNA a ser transferida é definida pelas sequências de margem e o DNA intermediário (T-DNA) é geralmente inserido no genoma da planta. É o método de escolha devido à natureza fácil e definida da transferência de genes.

[0498] Os métodos de aceleração que podem ser utilizados incluem, por exemplo, bombardeio de microprojéteis e similares. Um exemplo de um método para fornecer moléculas de ácido nucleico transformador para células vegetais é o bombardeio de microprojéteis. Este método foi revisto por Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas não biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidas com ácidos nucleicos e entregues nas células, por exemplo, embriões imaturos, por uma força propulsora. Partículas exemplificativas incluem aquelas compreendidas de tungstênio, ouro, platina e similares.

[0499] Em outro método, os plastídios podem ser transformados de maneira estável. Os métodos revelados para transformação de plastídio em plantas superiores incluem a entrega de DNA por pistola de partículas contendo um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma do plastídio por meio de recombinação homóloga (documentos US 5.451.513, US

5.545.818, US 5.877.402, US 5.932479 e WO 99/05265 ) Outros métodos de transformação celular também podem ser usados e incluem, entre outros, a introdução de DNA nas plantas pela transferência direta de DNA para o pólen, pela injeção direta de DNA nos órgãos reprodutivos de uma planta ou pela injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos, seguido pela reidratação de embriões dessecados.

[0500] A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de uma única planta ou de vários explantes transformados é bem conhecida na arte (Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Califórnia, (1988)). Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas,

cultivando essas células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embrionário através do estágio de plântula enraizada. Embriões e sementes transgênicos são igualmente regenerados. Os rebentos enraizados transgênicos resultantes são depois plantados em um meio de crescimento de plantas apropriado, como o solo.

[0501] O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o gene exógeno estranho é bem conhecido na técnica. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado a plantas cultivadas com sementes de linhagens agronomicamente importantes. Em contrapartida, o pólen das plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar as plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polinucleotídeo desejado é cultivada usando métodos bem conhecidos por indivíduos versados na técnica.

[0502] Para confirmar a presença dos transgenes em células e plantas transgênicas, uma amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou análise de Southern blot pode ser realizada usando métodos conhecidos por indivíduos versados na técnica. Os produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados de várias maneiras, dependendo da natureza do produto, e incluem hibridização por Northern blot, Western blot e ensaio enzimático. Uma vez que as plantas transgênicas foram obtidas, as mesmas podem ser cultivadas para produzir tecidos ou partes de plantas com o fenótipo desejado. O tecido ou partes de plantas podem ser colhidos e/ou as sementes coletadas. A semente pode servir como fonte para o cultivo de plantas adicionais com tecidos ou partes com as características desejadas. De preferência, as partes vegetativas das plantas são colhidas quando o rendimento de lipídios não polares é mais alto. Em uma modalidade, as partes vegetativas da planta são colhidas aproximadamente no momento da floração ou após o início da floração. De preferência, as partes da planta são colhidas aproximadamente quando a senescência começa, geralmente indicada por amarelecimento e secagem das folhas.

[0503] As plantas transgênicas formadas usando Agrobactéria ou outros métodos de transformação geralmente contêm um único locus genético em um cromossomo. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo hemozigotas para o gene (ou genes) adicionado. Mais preferencial é uma planta transgênica homozigota para o gene (ou genes) adicionado, isto é, uma planta transgênica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo local em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida autofertilizando uma planta transgênica hemizigota, germinando parte da semente produzida e analisando as plantas resultantes para o gene de interesse.

[0504] Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes que contêm dois genes exógenos independentemente segregantes ou loci também podem ser cruzadas (acopladas) para produzir descendentes que contêm ambos os conjuntos de genes ou loci. A identificação da progênie Fl apropriada pode produzir plantas homozigotas para genes ou locais exógenos. O retrocruzamento para uma planta parental e o cruzamento com uma planta não transgênica também são contemplados, assim como a propagação vegetativa. Da mesma forma, uma planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda planta que compreende uma modificação genética, como um gene e progênie mutante contendo o transgene e a modificação genética identificada. Descrições de outros métodos de criação que são comumente usados para diferentes traços e culturas podem ser encontradas em Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

FORMULAÇÕES

[0505] As moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem ser fornecidas como várias formulações. Por exemplo, as moléculas de RNA podem estar na forma de um sólido, pomada, gel, creme, pó, pasta, suspensão, coloide, espuma ou aerossol. As formas sólidas podem incluir pós, pós, grânulos, péletes, pílulas, pastilhas, comprimidos, filmes cheios (incluindo revestimentos de sementes) e similares, que podem ser dispersáveis em água ("molháveis"). Em um exemplo, a composição está na forma de um concentrado.

[0506] Em um exemplo, as moléculas de RNA podem ser fornecidas como uma formulação tópica. Em um exemplo, a formulação estabiliza a molécula de RNA na formulação e/ou in vivo. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser fornecidas em uma formulação lipídica. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser fornecidas em lipossomas. Em um exemplo, a formulação compreende um agente promotor de transfecção.

[0507] O termo "agente promotor de transfecção", Conforme usado no presente documento, se refere a uma composição adicionada à molécula de RNA para aumentar a absorção em uma célula, incluindo, porém, sem limitação, uma célula vegetal, uma célula de inseto ou uma célula fúngica. Pode ser utilizado qualquer agente promotor de transfecção conhecido na técnica como adequado para a transfecção de células. Exemplos incluem lipídios catiônicos, como um ou mais de DOTMA (cloreto de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N- trimetil amônio), DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-3- (trimetilamônio)propano), DMRIE (brometo de 1,2- dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amônio), DDAB (brometo de dimetil dioctadecil amônio), liposperminas, especificamente DOSPA (trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N- [2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanamina) e DOSPER (1,3-dioleoiloxi-2-(6carboxi-espermil)-propil-amida, e as di e tetra-alquil-tetra-metil esperminas, incluindo, porém, sem limitação, TMTPS (tetrametiltetrapalmitoil espermina), TMTOS (tetrametiltetraoleil espermina), TMTLS (tetrametiltetralauril espermina), TMTMS (tetrametiltetraomiristil espermina) e TMDOS (tetrametildioleil espermina). Lipídios catiônicos são opcionalmente combinados com lipídios não catiônicos, particularmente lipídios neutros, por exemplo lipídios tais como DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina), DPhPE (difitanoilfosfatidiletanolamina) ou colesterol. Exemplos não limitantes de reagentes de transfecção disponíveis comercialmente adequados incluem Lipofectamine (Life Technologies) e Lipofectamine 2000 (Life Technologies).

[0508] Em um exemplo, as moléculas de RNA podem ser incorporadas em formulações adequadas para aplicação em um campo. Em um exemplo, o campo compreende plantas. Plantas adequadas incluem plantas de safra (por exemplo, cereais e leguminosas, maíz, trigo, batata, tapioca, arroz, sorgo, milhete de soja, mandioca, cevada ou ervilha) ou leguminosas. As plantas podem ser cultivadas para a produção de raízes,

tubérculos, folhas, caules, flores ou frutos comestíveis. Em um exemplo, a planta de safra é uma planta de cereal. Exemplos de plantas de cereais incluem, entre outros, trigo, cevada, aveia de sorgo e centeio. Nestes exemplos, a molécula de RNA pode ser formulada para administração à planta, ou a qualquer parte da planta, de qualquer maneira adequada. Por exemplo, a composição pode ser formulada para administração nas folhas, caule, raízes, vegetais de frutas, grãos e/ou feijões da planta. Em um exemplo, a molécula de RNA é formulada para administração nas folhas da planta e é aspergível nas folhas da planta.

[0509] Dependendo da formulação desejada, as moléculas de RNA descritas no presente documento podem ser formuladas com uma variedade de outros agentes. Os agentes exemplificativos compreendem um ou mais agentes de suspensão, agentes de aglomeração, bases, tampões, agentes amargantes, fragrâncias, conservantes, propulsores, agentes tixotrópicos, agentes anticongelantes e agentes corantes.

[0510] Em outros exemplos, as formulações de moléculas de RNA podem compreender um inseticida, um pesticida, um fungicida, um antibiótico, um repelente de insetos, um agente antiparasitário, um agente antiviral ou um nematicida.

[0511] Em outro exemplo, moléculas de RNA podem ser incorporadas em composições farmacêuticas. Tais composições incluiriam tipicamente uma molécula de RNA descrita no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizada, a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[0512] Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com sua rota de administração pretendida. Exemplos de rotas de administração incluem administração parentérica, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, inalatória, transdérmica (tópica), transmucosa, transmucosa, oral e retal.

[0513] Em uma modalidade, os compostos ativos são preparados com carreadores que protegerão o composto contra a rápida eliminação do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como acetato de etileno vinila, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Por exemplo, as suspensões lipossômicas também podem ser usadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles indivíduos versados na técnica, por exemplo, como descrito em US 4.522.811.

[0514] As moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem ser fornecidas em um kit ou embalagem. Por exemplo, as moléculas de RNA reveladas no presente documento podem ser embaladas em um recipiente adequado com instruções escritas para produzir uma célula ou organismo acima referido ou tratar uma afecção.

MÉTODOS DE CONTROLE DE ORGANISMOS NÃO HUMANOS

[0515] Em um exemplo, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem ser usadas para controlar organismos não humanos, como insetos. Tais usos envolvem a administração de moléculas de RNA de acordo com a presente revelação usando vários métodos. Em um exemplo, as moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem ser fornecidas como isca para insetos para ingestão por insetos. Em outro exemplo, as moléculas de RNA podem ser aspergidas em insetos, conforme necessário. Em outro exemplo, as moléculas de RNA podem ser aspergidas sobre uma planta ou safra para proteger a dita planta ou safra dos insetos. As safras exemplificativas incluem algodão, maíz, tomate, grão de bico, ervilha de pombo, alfafa, arroz, sorgo e feijão-caupi.

[0516] Em um exemplo, as moléculas de RNA podem ser fornecidas para modificar o comportamento dos insetos. Em outro exemplo, as moléculas de RNA podem ser fornecidas para matar insetos. Em outro exemplo, as moléculas de RNA podem ser fornecidas para reduzir a fertilidade do inseto. Os insetos alvo exemplificativos incluem insetos domésticos. Outros alvos de insetos exemplificativos incluem insetos sugadores de seiva, como afídeos (por exemplo, Myzus persicae, Metopolophium dirhodum, Rhopalosiphum padi, Aphis glycines, Aphis fabae). Outros alvos exemplificativos de insetos incluem aracnídeos, mosquitos, ecoparasitas, moscas, ácaros, tripes, carrapatos, ácaro vermelho de aves domésticas, formigas, baratas, cupins, grilos, incluindo grilos domésticos, peixinho de prata, piolhos, besouros, tesourinhas, mosquitos e pulgas. Outros insetos alvo exemplificativos incluem pragas agrícolas. Os exemplos incluem alimentadores de seiva, como percevejos e afídeos, insetos mastigadores, como lagartas, besouros, vermes, insetos rastejantes, como tripes e lesmas, mariposas, moscas, como mosca da fruta, pragas de grão como furadores de grão, gorgulhos e mariposa.

[0517] Em uma modalidade, o inseto é um inseto sugador de seiva. Neste exemplo, a molécula de RNA pode ter atividade antissentido para MpC002 e/ou MpRack-1. Em uma modalidade, o inseto sugador de seiva é um afídeo. Em outra modalidade, o afídeo é Myzus persicae.

[0518] Em uma modalidade, o inseto alvo é uma formiga (por exemplo, Linepithema humile), uma lagarta de algodão ou uma minhoca da espiga (Helicoverpa armigera) ou uma mosca-varejeira (por exemplo, Lucilia cuprina). Em uma modalidade, o inseto alvo é Helicoverpa armigera e a molécula de RNA possui atividade antissentido para o gene branco do transportador ABC (branco ABC). Em outra modalidade, o inseto alvo é Linepithema humile e a molécula de RNA possui atividade antissentido para o neuropeptídio ativador da biossíntese de feromônios (PBAN). Em outra modalidade, o inseto alvo é Lucilia cuprina e a molécula de RNA possui atividade antissentido para um ou mais genes que codificam proteínas selecionadas do grupo que consiste na subunidade catalítica A de ATPase de prótons do tipo V, RNAse 1/2, quitina sintase, receptor de ecdisona e gama-tubulina semelhante a 1/1.

[0519] Na modalidade acima, as composições e moléculas de RNA reveladas no presente documento podem ser fornecidas em um distribuidor. Em um exemplo, o distribuidor é uma armadilha ou uma isca. Em uma modalidade, a armadilha e/ou isca compreende uma isca que compreende uma molécula (ou moléculas) de RNA revelada no presente documento.

[0520] Em uma modalidade, a presente revelação abrange métodos de controle do comportamento de insetos, sendo que o método compreende a aspersão, a pulverização de pó ou a aplicação de moléculas de RNA reveladas no presente documento aos insetos. Nesta modalidade, as moléculas de RNA podem ser aspergidas, pulverizadas ou de outro modo aplicadas diretamente aos insetos. Em outra modalidade, as moléculas de RNA podem ser aspergidas, pulverizadas ou de outro modo aplicadas a plantas ou culturas antes da infestação por insetos.

[0521] Em uma modalidade da invenção, o inseto ou aracnídeo pode pertencer às seguintes ordens: Ácaros, Aracnídeos, Anoplura, Blattodea, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hem iptera, Heteroptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallopata, Odoptera, Odoptera Phithiraptera, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Sternorrhyncha, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera, Zoraptera e Zygentoma.

[0522] Em modalidades preferenciais, mas não limitadoras, da invenção o inseto ou aracnídeo é escolhido do grupo que consiste em: (1) Acari: ácaros, incluindo Ixodida (carrapatos) (2) Arachnida: Araneae (aranhas) e Opiliones (ceifeiro), exemplos incluem: Latrodectus mactans (viúva negra) e Loxosceles recluse (Aranha Reclusa Marrom) (3) Anoplura: piolhos, como Pediculus humanus (piolho do corpo humano) (4) Blattodea: baratas, incluindo barata alemã (Blatella germanica), do gênero Periplaneta, incluindo Barata americana (Periplaneta americana) e barata australiana (Periplaneta australiasiae), do gênero Blatta, incluindo barata Oriental (Blatta orientalis) e do gênero Supella, incluindo barata de faixa marrom (Supella longipalpa). Um alvo mais preferencial é a barata alemã (Blatella germanica). (5) Coleoptera: besouros, exemplos incluem: a família de besouro powderpost (família de Bostrichoidea); Dendroctonus spp. (Besouro Preto da Terebintina, Escaravelho do Sul, Besouro Gravador IPS); Besouros de Carpete (Anthrenus spp, Attagenus spp); besouro broca de casa velha (família de Cerambycidae: Hylotrupes bajulus); Anobium punctatum; Tribolium spp (besouro de farinha); Granário de Trogoderma (besouro Khapra); Oryzaephilus sarinamensis (besouro de grãos com dentes) etc. (traça) (6) Dermaptera: família de tesourinhas (7) Diptera: mosquitos (Culicidae) e moscas (Brachycera), são exemplos: Anophelinae como Anopheles spp. e Culicinae como Aedes fulvus; Tabanidae como Tabanus punctifer (mosca de cavalo), Glossina morsitans (mosca tsé-tsé), moscas de dreno (Psychodidae) e Calyptratae como Musca domestica (mosca doméstica), moscas de carne (família de Sarcophagi dae) etc. (8) Heterópteros: insetos , como Cimex lectularius (percevejo) (9) Hymenoptera: vespas (Apocrita), incluindo formigas (Formicoidea), abelhas (Apoidea): Solenopsis invicta (Formiga de fogo), Monomorium pharaonis (Formiga do faraó), Camponotus spp (formigas carpinteiras), Iasius niger (Formiga preta pequena), tetramorium caespitum (Formiga de pavimentação), Myrmica rubra (Formiga vermelha), Formica spp (formigas de madeira) , Crematogaster lineolata (Formiga Acrobata), Iridomyrmex humilis (Formiga Argentina), Pheidole spp. (Formigas-de- cabeça-grande, Dasymutilla occidentalis (formiga de veludo) etc. (10) Isoptera: cupins, exemplos incluem: Amitermes floridensis (cupim subterrâneo de asa escura da Flórida), cupim subterrâneo oriental (Reticulitermes flavipes), R. hesperus (cupim subterrâneo ocidental), Coptotermes formosanus (cupim subterrâneo formoso), Incisitermes minor (cupim de madeira seca ocidental), Neotermes connexus (Cupim de árvore de floresta) e Termitidae (11) Lepidoptera: mariposas, exemplos incluem: Tineidae e Oecophoridae, como Tineola bisselliella (traça comum) e Pyralidae, como Pyralis farinalis (mariposa da farinha) etc (12) Psocoptera: piolhos (Psocids) (13) Aphididae) (15) Zygentoma: peixinho de prata, exemplos são: Thermobia domestica e Lepisma saccharina

[0523] Outros insetos ou aracnídeos-alvo incluem insetos domésticos, ecoparasitas e insetos e/ou aracnídeos relevantes para a saúde e a higiene pública, como, a título de exemplo e sem limitação, moscas, ácaros, tripes, carrapatos, ácaros vermelhos, formigas ( como segmentar PBAN), baratas, cupins, grilos, incluindo grilos-de-casa, peixes prateados, piolhos, besouros, tesourinhas, mosquitos e pulgas. Os alvos mais preferidos são as baratas (Blattodea), tais como, sem limitação, Blatella spp. (por exemplo, Blatella germanica (barata alemã)), Periplaneta spp. (por exemplo, Periplaneta americana (barata americana) e Periplaneta australiasiae (barata australiana)), Blatta spp. (por exemplo, Blatta orientalis (barata oriental)) e Supella spp. (por exemplo, Supella longipalpa (barata de bandas marrons); formigas (Formicoidea), como Solenopsis spp. (por exemplo, Solenopsis invicta (Formiga de fogo vermelho)), Monomorium spp. (por exemplo, Monomorium pharaonis (Formiga Fara)), Camponotus spp. (por exemplo, Camponotus spp (formigas carpinteiras)), lasius spp. (por exemplo, Iasius niger (pequena formiga preta)), Tetramorium spp. (por exemplo, Tetramorium caespitum (formiga de pavimentação)), Myrmica spp. (por exemplo, Myrmica rubra (formiga vermelha) ), Formica spp (formigas de madeira),

Crematogaster spp. (Por exemplo, Crematogaster lineolata (Formiga Acrobata)), Iridomyrmex spp. (Por exemplo, Iridomyrmex humilis (formiga argentina)), Pheidole spp. (Formigas de cabeça grande) e Dasymutilla spp. Dasymutilla occidentalis (Formiga de veludo)); cupins (Isoptera e/ou Termitidae), tais como, mas não limitados a Amitermes spp. (Por exemplo, Amitermes floridensis (cupim subterrâneo de asa escura da Flórida)), Reticulitermes spp. (Por exemplo, Reticulitermes flavipes (cupim subterrâneo oriental)), Reticulitermes hesperus (Cupim subterrâneo ocidental)), Coptotermes spp. (por exemplo, Coptotermes formosanus (Cupim Subterrâneo Formoso)), Incisitermes spp. (por exemplo, Incisitermes minor (Cupim de Madeira Seca Ocidental)), Neotermes spp. (por exemplo, Neotermes connexus (Cupim de árvore de floresta)).

[0524] Em uma modalidade, o RNA alvo codifica uma acteolactato sintetase de inseto.

[0525] As moléculas de RNA da invenção, quando entregues e/ou expressas em uma planta, podem ter uma ampla gama de propriedades desejadas que influenciam, por exemplo, uma característica agronômica, resistência a insetos (como direcionado a genes como MpC002, MpRack-1 e um Gene transportador ABC), resistência a doenças (como direcionado a genes como LanR), resistência a herbicidas, esterilidade, características de grãos e similares. A molécula de RNA alvo pode estar envolvida no metabolismo de óleo, amido, carboidratos, nutrientes, etc., ou pode ser responsável pela síntese de proteínas, peptídeos, ácidos graxos, lipídios, frequência de recombinação (direcionado a genes como DDM1 e FANCM), ceras, óleos (direcionado a genes como TOR), amidos,

açúcares, carboidratos, sabores, odores, toxinas, carotenoides, hormônios (direcionado a genes como EIN2, NCED1 e NCED2), polímeros, flavonoides (direcionando um gene como como chalcona sintase), proteínas de armazenamento, ácidos fenólicos, alcaloides, ligninas, taninos, celuloses, glicoproteínas, glicolipídios, etc.

[0526] Em um exemplo particular, as plantas produzem níveis aumentados de enzimas para a produção de óleo em plantas como Brassicas, por exemplo colza ou girassol, açafrão, linho, algodão, soja ou maíz; enzimas envolvidas na síntese de amido em plantas como batata, maíz e cereais como cevada ou arroz; enzimas que sintetizam ou proteínas que são medicamentos naturais, tais como produtos farmacêuticos ou veterinários.

[0527] Em outra modalidade, uma molécula de RNA da presente invenção é direcionada ao tratamento profilático ou terapêutico da infecção por um patógeno fúngico selecionado do grupo que consiste em: Altemaria spp .; Armillaria mellae; Arthrobotrys oligosporus; Blumeria graminis (por determinação de genes Mlo utilizando uma molécula de RNA como descrito no Exemplo 17), Boletus granulatus; Botritis cinerea; Botrytis fabae; Candida albicans; Claviceps purpurea; Ribicola de Cronartium; Epicoccum purpurescens; Epidermophyton floccosum; Fomes annosus; Fusarium oxysporum; Gaeumannomyces graminis var. tritici; Glomerella cingulata; Gymnosporangium juniperi- virginianae; Microsporum canis; Monilinia fructicola; Physoderma alfafa; Phytopthera infestans; Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur); Polyporus sulphureus; Puccinia spp.; Saccharomyces cerevisiae; Septoria apiicola; Trichophyton rubrum; T. mentagrophytes; Ustilago spp.;

Venturia inaequalis e Verticillium dahliae.

AFECÇÕES EXEMPLIFICATIVAS A SEREM TRATADAS

[0528] As moléculas de RNA de acordo com a presente revelação podem ser usadas em métodos de várias condições. Em alguns exemplos, a presente revelação se refere a um método de tratamento de câncer, que compreende a administração de uma molécula de RNA revelada no presente documento. O termo "câncer" se refere ou descreve a afecção fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular não regulamentada. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou neoplasias linfoides. Exemplos mais específicos para tais cânceres incluem, entre outros, câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células epiteliais escamosas), câncer de pulmão, incluindo câncer de células pequenas, câncer de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal e câncer de estroma gastrointestinal, câncer de pâncreas, glioblastoma, câncer de colo de útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama , câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer renal ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, melanoma de espalhamento superficial, melanoma lentigo maligna, melanomas acral lentiginosos, melanomas nodulares, mieloma múltiplo e linfoma de células B (incluindo linfoma de não-Hodgkin folicular de baixo grau/ folicular (NHL); linfoma de células do manto; Linfoma relacionado a AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia de células cabeludas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema (como o associado a tumores cerebrais), síndrome de Meigs, cérebro, bem como câncer de cabeça e pescoço e metástases associadas. Por conseguinte, em um exemplo, a presente revelação se refere a um método de tratamento de câncer de mama, ovário, cólon, próstata, pulmão, cérebro, pele, fígado, estômago, câncer de pâncreas ou sangue.

[0529] Em outros exemplos, um método descrito no presente documento é usado para tratar cânceres que estão ligados a mutações nos genes BRCAl, BRCA2, PALB2, OR RAD51B, RAD51C, RAD51D ou relacionados. Em outros exemplos, um método descrito no presente documento é usado para tratar cânceres que estão ligados a mutações em genes associados ao reparo de incompatibilidade de DNA, como MSH2, MLHl, PMS2 e genes relacionados. Em outros exemplos, um método descrito no presente documento é usado para tratar cânceres com genes de reparo de DNA silenciados, como BRCAl, MLHl ou OR RAD51B, RAD51C ou RAD51D.

[0530] Em outros exemplos da revelação, um método descrito no presente documento é usado para matar células com processos de reparo de DNA prejudicados. Por exemplo, células com reparo de DNA prejudicado podem expressar aberrantemente um gene envolvido no reparo de DNA, síntese de DNA ou recombinação homóloga. Genes exemplificativos incluem XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2, (PARP-2), POLIMERASE BETA, CTPS,

MLHl, MSH2, FANCD2, PMS2, p53, p21, PTEN, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCAl, BRCA2, PALB2, RAD52, RAD54, RAD50, MREU, NB51, WRN, BLM, KU70, KU80, ATM, ATR CPIK1 FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RADl e RAD9. Em um exemplo, um método descrito no presente documento é usado para matar células com um gene supressor de tumor mutante. Por exemplo, as células podem ter uma ou mais mutações no BRCAl ou BRCA2.

[0531] Em outros exemplos da revelação, um método descrito no presente documento é usado para tratar células transformadas por vírus. Em outros exemplos da revelação, um método descrito no presente documento é usado para matar células transformadas com um vírus latente. Os vírus latentes exemplificativos incluem CMV, EBV, vírus simplex da Herpes (tipo 1 e 2) e vírus Varicella zoster. Em outros exemplos da revelação, um método descrito no presente documento é usado para tratar infecções virais ativas devido aos vírus que dão origem a câncer, imunodeficiência, hepatite, encefalite, pneumonite ou doença respiratória. Vírus exemplificativos incluem parvovírus, poxvírus, vírus do herpes.

[0532] Em outros exemplos da revelação, um método descrito no presente documento é usado para tratar o vírus zika, febre do carrapato do Colorado (causada por coltivírus, vírus de RNA), febre do Nilo Ocidental (encefalite, causada por um flavivírus que ocorre principalmente no Oriente Médio e na África) Febre Amarela, Raiva (causada por várias estirpes diferentes de vírus neurotrópicos da família Rhabdoviridae), hepatite viral, gastroenterite viral aguda causada por gastroenterite (viral) causada por vírus Norwalk e similar a

Norwalk, rotavírus, calicivírus e astrovírus, poliomielite, influenza (gripe), causada por ortomixovírus que podem sofrer variações antigênicas frequentes, sarampo (rubeola), paramyxoviridae, caxumba, síndromes respiratórias, incluindo pneumonia viral e síndromes respiratórias agudas, incluindo crupe causado por uma variedade de vírus chamados coletivamente de vírus respiratórios agudos, e doença respiratória causada pelo vírus sincicial respiratório.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. MATERIAIS E MÉTODOS

SÍNTESE DE CONSTRUTOS GENÉTICOS

[0533] Para projetar um construto típico de ledRNA, identificou-se uma região do RNA alvo com cerca de 100 a 1.000 nucleotídeos de comprimento, tipicamente 400 a 600 nucleotídeos. Em um exemplo, a metade 5’ da sequência e aproximadamente 130 nt da região flanqueadora e similarmente a metade 3' e 130 nt da região flanqueadora foram orientadas em uma orientação antissentido em relação a um promotor. Estas sequências foram interrompidas com a sequência alvo de detecção de nucleotídeos de 400-600 (Figura 1A). A extremidade 5’ do construto resultante foi precedida de um promotor tal como um promotor da RNA polimerase T7 ou SP6 e a extremidade 3' manipulada para incluir um sítio de clivagem da enzima de restrição para permitir o término da transcrição in vitro.

[0534] Para transcrição em células tais como células bacterianas, as sequências promotora e terminadora foram incorporadas para facilitar a expressão como um transgene, por exemplo, usando um promotor induzível. A região de filamento duplo e os comprimentos de sequência de laço podem ser variados. Os construtos foram feitos usando métodos de clonagem padrão ou encomendadas de fornecedores de serviços comerciais.

SÍNTESE DE RNA

[0535] Após digestão com enzima de restrição para linearizar o DNA na extremidade 3’, a transcrição usando RNA polimerase resultou nos braços 5' e 3’ do transcrito ledRNAi anelando à sequência alvo central, sendo que a molécula compreende uma haste central ou região de filamento duplo com um único corte e laços de terminal. A sequência central pode ser orientada na orientação de sentido ou antissentido em relação ao promotor (Figura 1A, 1B, respectivamente).

[0536] Para síntese in vitro, o DNA do construto foi digerido no sítio de restrição 3’ usando a enzima de restrição apropriada, precipitado, purificado e quantificado. A síntese de RNA foi alcançada usando RNA polimerase de acordo com as instruções do fabricante. O ledRNA foi ressuspenso em tampão de anelamento (Tris-HCL a 25 mM, pH 8,0, MgCh a 10 mM) usando água tratada com DEPC para inativar quaisquer vestígios de RNAse. O rendimento e a integridade do RNA produzido por esse método foram determinados por análise de nano-gota e eletroforese em gel (Figura 2), respectivamente.

[0537] A síntese de ledRNA foi alcançada em células bacterianas através da introdução dos construtos na estirpe HT115 de E. coli. As culturas celulares transformadas foram induzidas com IPTG (0,4 mM) para expressar a RNA polimerase T7, proporcionando a transcrição dos construtos de ledRNA. A extração de RNA das células bacterianas e a purificação foram realizadas essencialmente como descrito em Timmons et al. (2001).

[0538] Para a transcrição de RNA com marcação Cy3,

a mistura de ribonucleotídeo (rNTP) continha 10 mM cada de ATP, GTP, CTP, UTP a 1,625 mM e Cy3-UTP a 8,74 mM. As reações de transcrição foram incubadas a 37 ºC por 2,5 horas. As reações de transcrição (160 μl) foram transferidas para os tubos Eppendorf, foram adicionados 17,7 μl de tampão turbo DNase e 1 μl de DNA turbo e incubados a 37 ºC por 10 minutos para digerir o DNA. Em seguida, 17,7 μl de solução de inativação da Turbo DNAse foram adicionados, misturados e incubados à temperatura ambiente por 5 min. A mistura foi centrifugada por 2 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf sem RNAse. Amostras de 1,5 μl de cada reação de transcrição foram submetidas a eletroforese em géis para testar a qualidade do produto de RNA. Geralmente, uma banda de RNA foi observada com tamanho de 500 bp a 1.000 bp, dependendo do construto. O RNA foi precipitado adicionando a cada tubo: 88,5 μl de acetato de amônio a 7,5 M e 665 μl de etanol 100% frio. Os tubos foram resfriados até -20 ºC por várias horas ou durante a noite, depois centrifugados a 4 ºC por 30 minutos. O sobrenadante foi removido cuidadosamente e o sedimento de RNA foi lavado com 1 ml de etanol a 70% (produzido com água isenta de nuclease) a -20 ºC e centrifugado. O sedimento foi seco e o RNA purificado ressuspenso em 50 μl de tampão de anelamento de RNAi lx de. A concentração de RNA foi medida pelo método nano-gotas e armazenada a -80 ºC até ser utilizada. EXEMPLO 2. DESIGN DE LEDRNA

[0539] Como mostrado esquematicamente na Figura 1A, uma molécula típica de ledRNA compreende uma sequência de sentido que pode ser considerada como duas sequências de sentido adjacentes, ligadas covalentemente e tendo identidade com o RNA alvo, uma sequência antissentido que é complementar à sequência de sentido e que é dividida em duas regiões e dois laços que separam as sequências de sentido das antissentido. Um construto de DNA que codifica essa forma de ledRNA compreende, portanto, na ordem de 5’ a 3', um promotor para a transcrição da região de codificação do ledRNA, uma primeira região antissentido tendo complementaridade com uma região na extremidade 5’ do RNA alvo, uma primeira sequência de laços, uma sequência de sentido, uma segunda sequência de laço e, em seguida, a segunda região antissentido tendo complementaridade com uma região em direção à extremidade 3’ do RNA alvo e, finalmente um meio para terminar a transcrição. Nessa disposição, as duas sequências antissentido flanqueavam a sequência de sentido e as sequências de laços. Quando transcritas, as duas regiões da sequência antissentido se anelam com a sequência de sentido, formando uma haste de dsRNA com dois laços de flanqueamento.

[0540] Em outra forma de ledRNA, porém relacionada, a sequência de sentido é dividida em duas regiões, enquanto as duas regiões antissentido permanecem como uma única sequência (Figura IB). Um construto de DNA que codifica essa segunda forma de ledRNA, portanto, compreende, na ordem de 5’ a 3', um promotor para a transcrição da região de codificação do ledRNA, uma região de primeiro sentido com identidade com uma região na extremidade 3’ do RNA alvo, uma primeira sequência de laços, a sequência antissentido, uma segunda sequência de laços, então a segunda região de sentido tendo identidade na extremidade 5’ do RNA alvo e, finalmente, um meio para terminar a transcrição. Nessa disposição, as duas sequências de sentido flanqueavam a sequência antissentido e as sequências de laços.

[0541] Sem querer ser limitado pela teoria, devido aos laços fechados em cada extremidade, essas estruturas de ledRNA seriam mais resistentes a exonucleases do que um dsRNA aberto formado entre RNAs de sentido e antissentido de único filamento e não tendo laços, e também em comparação com um RNA com estrutura em grampo de cabelo que tem apenas um único laço. Além disso, os inventores conceberam que um laço em ambas as extremidades da haste do dsRNA permitiria ao Dicer acessar ambas as extremidades com eficiência, melhorando assim o processamento do dsRNA em sRNAs e a eficiência do silenciamento.

[0542] Como primeiro exemplo, foi feito um construto genético para a transcrição in vitro usando-se uma RNA polimerase T7 ou SP6 para formar ledRNAs direcionados a genes que codificam GFP ou GUS. O construto ledGFP compreendia as seguintes regiões em ordem: a primeira metade da sequência antissentido correspondia aos nucleotídeos 358 a 131 da sequência codificadora GFP (CDS) (SEQ ID NO:7), o primeiro laço antissentido correspondia aos nucleotídeos 130 a 1 da GFP CDS, a sequência de sentido correspondia aos nucleotídeos 131 a 591 do GFP CDS, o segundo laço antissentido correspondendo aos nucleotídeos 731 a 592 do GFP CDS e a segunda metade da sequência antissentido correspondia aos nucleotídeos 591 a 359 do GFP CDS.

[0543] O construto ledGUS compreendia as seguintes regiões em ordem: a primeira metade da sequência antissentido correspondia aos nucleotídeos 609 a 357 de GUS CDS (SEQ ID NO:8); o primeiro laço antissentido correspondia aos nucleotídeos 356 a 197 do GUS CDS, a sequência de sentido correspondia aos nucleotídeos 357 a 860 do GUS CDS, o segundo laço antissentido correspondia aos nucleotídeos 1029 a 861 do GUS CDS; e a segunda metade da sequência antissentido correspondia aos nucleotídeos 861 a 610 do GUS CDS.

[0544] Para fazer o dsRNA de GUS com sentido/antissentido separado (dsRNA convencional), a mesma sequência alvo correspondente aos nucleotídeos 357 a 860 de GUS CDS foi ligada entre os promotores T7 e SP6 no vetor pGEM- T Easy. Os filamentos sentido e antissentido foram transcritas separadamente com polimerases T7 ou SP6, respectivamente, e recozidas em tampão de anelamento após mistura dos transcritos e aquecimento da mistura para desnaturar os filamentos de RNA. EXEMPLO 3. ESTABILIDADE DE LEDRNAS

[0545] A capacidade do ledRNA de formar estruturas de dsRNA foi comparada com o dsRNA de extremidade aberta (ou seja, sem laços, formado pelo anelamento de RNA de sentido único e antissentido de cadeia simples) e hpRNA longo. O ledRNA, o hpRNA longo e a mistura de RNA sensível e antissentido, foram desnaturados por ebulição e deixados emparelhar em tampão de anelamento (Tris-HCL a 250 mM, pH 8,0 e MgO12 a 100 mM) e, em seguida, foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,0% sob condições não desnaturantes.

[0546] Como mostrado na Figura 2, o ledRNA de GUS e o ledRNA de GFP forneceram uma banda de RNA dominante da mobilidade esperada para uma molécula de filamento duplo, indicando a formação da estrutura prevista de ledRNA. Isso contrastava com a mistura de RNA com sentido e antissentido, que mostrava apenas uma banda fraca para um dsRNA, indicando que a maioria dos RNAs com sentido e antissentido não era prontamente recozida entre si para formar dsRNA. As amostras de RNA com estrutura de grampo deram duas bandas proeminentes, indicando que apenas parte da transcrição formava a estrutura de RNA em grampo prevista. Assim, o ledRNA foi o mais eficiente na formação da estrutura prevista de dsRNA.

[0547] A capacidade do ledRNA de permanecer e se espalhar na superfície da folha também foi comparada ao dsRNA. O ledRNA do GUS (ledGUS), quando aplicado na parte inferior da superfície da folha do tabaco, pode ser facilmente detectado na parte superior não tratada da folha após 24 horas (Figura 3). No entanto, o dsRNA GUS da cadeia separada (dsGUS) não pôde ser detectado na parte superior da folha não tratada (Figura 3). Esse resultado indica que o ledRNA é mais resistente à degradação que o dsRNA e, portanto, capaz de se espalhar dentro dos tecidos das folhas das plantas. EXEMPLO 4. TESTE DE LEDRNAS POR ADMINISTRAÇÃO TÓPICA

[0548] A capacidade dos ledRNAs de induzir RNAi após administração tópica foi testada em plantas de Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum que expressam um gene repórter GFP ou GUS, respectivamente. As sequências das sequências alvo GFP e GUS e dos construtos de codificação ledRNA são mostradas nas SEQ ID NOs: 7, 8, 4 e 5, respectivamente. A sequência ribonucleotídica das moléculas de RNA codificado é fornecida como SEQ ID NO's 1 (ledFN de GFP) e 2 (ledRNA de GUS).

[0549] Para facilitar a aplicação reproduzível e uniforme do ledRNA nas superfícies foliares, o ledRNA a uma concentração de 75 a 100 μg/ml, em Tris-HCL 25 mM, pH 8,0, MgCh 10 mM e Silwet 77 (0,05%), foi aplicado à superfície adaxial das folhas usando um pincel macio. Às 6 horas e 3 dias após a aplicação do ledRNA, foram colhidas amostras de folhas para a análise do silenciamento genético direcionado.

[0550] A aplicação de ledRNA contra GFP em folhas de N. benthamiana e contra GUS em folhas de N. tabacum resultou em reduções claras de 20 a 40% e 40 a 50%) da atividade gênica- alvo correspondente no mRNA (GFP) ou atividade proteica (GUS) 6 horas após o tratamento. No entanto, nesta experiência, a redução não persistiu 3 dias após o tratamento. Os inventores consideraram que a observação em 3 dias era provavelmente devida a algumas respostas não específicas de transgenes ao tratamento com dsRNA ou à quantidade dissipada de ledRNA. No entanto, em um experimento separado, o silenciamento de GUS foi detectado nas áreas foliares tratadas e distais não tratadas 24 horas após o tratamento com ledRNA (Figura 4). EXEMPLO 5. SILENCIAMENTO INDUZIDO POR LEDRNA DE UM

GENE ALVO ENDÓGENO

[0551] Em um outro exemplo, um ledRNA foi projetado para atingir um mRNA codificado por um gene endógeno, a saber o gene FAD2.1 de N. benthamiana. A sequência do mRNA FAD2.1 alvo e do construto de codificação ledFAD2.1 são mostradas nas SEQ ID NOs: 9 e 6, respectivamente. A sequência ribonucleotídica da molécula de RNA codificado é fornecida como SEQ ID NO:3 (ledRNA de N. benthamiana FAD2.1).

[0552] O construto de ledRNA de FAD2.1 foi composta pelo seguinte: a primeira metade da sequência antissentido correspondente aos nucleotídeos 678 a 379 de FAD2.1 CDS (Nibenl01 Scf09417gO 1008.1); o primeiro laço antissentido correspondente a nt. 378 a 242 do FAD2.1 CDS; a sequência de sentido correspondente a nt. 379 a 979; o segundo laço antissentido correspondente aos nt 1115 a 980; e a segunda metade da sequência antissentido correspondente aos nt 979 a nt 679 do FAD2.1 CDS.

[0553] O RNA ledGUS do exemplo anterior foi usado em paralelo como controle negativo. No primeiro experimento, o silenciamento do gene alvo foi testado para o nível de mRNA de FAD2.1 e para o IC de acumulação 8: 1 ácido graxo (Figura 5). O nível de atividade de um gene relacionado, FAD2.2, também foi analisado. Para cada amostra, aproximadamente 3 µg de RNA total foram tratados com DNase e transcritos reversamente a 50 ºC por 50 minutos, utilizando os iniciadores oligo dT. As reações foram encerradas a 85 ºC por 5 minutos e diluídas a 120 μl com água. Utilizando uma máquina de PCR de gene de rotor, 5μl de cada amostra, em triplicado, foram analisados quanto à expressão relativa de mRNA de FAD 2.1 e 2.2 de FAD usando iniciadores específicos para genes, com referência ao gene actina de manutenção da casa. Em uma experiência subsequente, a hibridização Northern Blot também foi utilizada para confirmar o silenciamento do gene FAD2.1 pelo RNA ledFAD2.1 aplicado topicamente (Figura 6).

[0554] O mRNA de FAD2.1 foi reduzido significativamente, para um nível quase imperceptível nos tecidos foliares tratados com o ledRNA nos momentos de 2, 4 e 10 horas (Figura 5). Nesta experiência, não ficou claro por que o nível de mRNA de FAD2.1 não foi reduzido tanto no período de 6 horas. Na experiência repetida mostrada na Figura 6, ocorreu uma forte regulação negativa de FAD2.1 às 6 e 24 horas, particularmente no período de 24 horas. O gene FAD2.2 relacionado, com homologia de sequência com FAD2.1, também mostrou regulação negativa nos momentos de 2 e 4 horas pelo ledRNA (Figura 5).

[0555] Uma vez que FAD2.1 e FAD2.2 codificam dessaturases de ácidos gordos A12 que dessaturam ácido oleico em ácido linoleico, os níveis destes ácidos gordos foram analisados em tecidos foliares tratados com os ledRNAs. Houve um claro aumento do ácido oleico (18: 1) acúmulo de tecidos foliares tratados com ledRNA nos períodos de 2, 4 e 6 horas, o que indica uma quantidade reduzida da enzima FAD2 (Figura 5). Assim, o qRT-PCR e o ensaio de composição de ácidos graxos mostraram que o ledRNA induziu o silenciamento do gene FAD2.1. EXEMPLO 6. PROJETO E TESTE DE RNAS EM GRAMPO QUE COMPREENDE PARES DE BASE G:U OU NUCLEOTÍDEOS INCOMPATÍVEIS

RNAS EM GRAMPO MODIFICADOS DIRECIONADO AO RNA GUS

[0556] Genes repórteres, como o gene que codifica a enzima B-glucuronidase (GUS), fornecem um sistema de ensaio simples e conveniente que pode ser usado para medir a eficiência do silenciamento de genes em uma célula eucariota, inclusive em células vegetais (Jefferson et al., 1987). Os inventores, portanto, projetaram, produziram e testaram alguns RNAs de grampo modificados quanto à sua capacidade de reduzir a expressão de um gene GUS como um gene alvo, usando uma abordagem entregue pelo gene para fornecer os RNAs de grampo para as células e compararam os ganchos de cabelo modificados a um RNA com estrutura de grampo convencional. O RNA com estrutura de grampo convencional usado como controle no experimento tinha uma região de filamento duplo de 200 pares de base contíguos de comprimento, em que todos os pares de base eram pares de base canônicos, ou seja, pares de base G:C e A: U sem pares de base G:U, e sem nucleotídeos não pares de base (incompatibilidades) na região de filamento duplo, direcionado à mesma região 200 nt da molécula de mRNA de GUS que os RNAs em grampo modificados. As sequências de sentido e antissentido que formaram a região de filamento duplo foram ligadas covalentemente por uma sequência espaçadora, incluindo um íntron PDK (Helliwell et al., 2005; Smith et al., 2000), fornecendo um laço de RNA de 39 ou 45 nucleotídeos. comprimento (dependendo da estratégia de clonagem usada) após a emenda do íntron a partir da transcrição primária. O fragmento de DNA utilizado para a sequência antissentido foi flanqueado pelos sítios de restrição XhoI-BamHI na extremidade 5' e os sítios de restrição Hindlll-Kpnl na extremidade 3' para fácil clonagem em um cassete de expressão, e cada sequência de sentido foi flanqueada pelos sítios de restrição Xhol e Kpnl. A região dsRNA de 200 bp de cada RNA com estrutura de grampo, tanto para o gancho de controle quanto os ganchos de cabelo modificados, incluiu uma sequência antissentido de 200 nucleotídeos que era totalmente complementar a uma sequência de GUS do tipo selvagem a partir da região de codificação da proteína. Esta sequência antissentido, correspondente aos nucleotídeos 13 a 212 da SEQ ID NO:10, foi o complemento dos nucleotídeos 804 a 1003 da estrutura de leitura aberta GUS (ORF) (sequência de cDNA fornecida como SEQ ID NO:8). O mRNA alvo do GUS tinha, portanto, mais de 1.900 nt de comprimento. O comprimento de 200 nucleotídeos para as sequências de sentido e antissentido foi escolhido como pequeno o suficiente para ser razoavelmente conveniente para a síntese dos fragmentos de DNA usando oligonucleotídeos sintéticos, mas também longo o suficiente para fornecer múltiplas moléculas de sRNA após o processamento por Dicer. Sendo parte de uma ORF, é improvável que a sequência contenha sítios de emenda crípticos ou sítios de terminação de transcrição.

PREPARAÇÃO DE CONSTRUTOS GENÉTICOS

[0557] A sequência GUS ORF de 200 bp foi amplificada por PCR usando o par de oligonucleotídeos GUS-WT- F (SEQ ID NO:52) e GUS-WT-R (SEQ ID NO:53), contendo sítios Xhol e BamHI ou sítios HmdIII e Kpnl, respectivamente, para introduzir esses sítios de enzimas de restrição 5’ e 3' da sequência GUS. O fragmento amplificado foi inserido no vetor pGEM-T Easy e a sequência de nucleotídeos correta foi confirmada por sequenciamento. O fragmento GUS foi excisado por digestão com BamHI e HmdIII e inserido no sítio BamHI/HindHI de pKannibal (Helliwell e Waterhouse, 2005), que inseriu a sequência GUS na orientação antissentido em relação ao promotor CaMV e35S operacionalmente ligado (Grave, 1992) e terminador de poliadenilação/transcrição do gene ocs (Ocs-T). O vetor resultante foi designado pMBW606 e continha, na ordem de 5’ a 3', um 35S:: Íntron PDK:: GUS antissentido:: Cassete de expressão Ocs-T. Este vetor foi o vetor intermediário usado como vetor base para a montagem de quatro construtos de hpRNA. CONSTRUTO HPGUS[WT] COM APENAS PARES DE BASE

CANÔNICOS

[0558] Para preparar o vetor designado hpGUS[wt] que codifica a molécula de RNA com estrutura de grampo usada como controle na experiência, tendo apenas pares de base canônicos, o fragmento de GUS PCR de 200 bp foi excisado do plasmídeo pGEM-T Easy com Xhol e Kpnl e inserido nos sítios XhoVKpnl entre o promotor 35S e o íntron PDK em pMBW606. Isso produziu o vetor designado pMBW607, contendo o 35S:: GUS[wt] de sentido:: Íntron PDK:: GUS antissentido:: Cassete de expressão OCS-T. Este cassete foi excisado por digestão com Noil e inserido no sítio Noil de pART27 (Gleave, 1992), resultando no vetor designado hpGUS[wt], codificando o RNA com estrutura de grampo com emparelhamento de base canônico, direcionado ao mRNA de GUS.

[0559] Quando autoanelado por hibridização das sequências de 200 nt de sentido e antissentido, esse grampo tinha uma região de filamento duplo de 200 pares de base consecutivos correspondentes às sequências de GUS. As sequências de sentido e antissentido no cassete de expressão foram flanqueadas pelos sítios de restrição BamHl e HmdIII presentes nas extremidades 5' e 3', respectivamente, em relação à sequência de sentido GUS. Quando transcritos, os nucleotídeos correspondentes a esses sítios também foram capazes de hibridizar, estendendo a região de filamento duplo por 6bp em cada extremidade. Após a transcrição do cassete de expressão e a emenda do íntron PDK a partir do transcrito primário, previu-se que a estrutura de RNA em grampo antes de qualquer processamento por Dicer ou outras RNAs tivesse uma estrutura em laço de 39 nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos da estrutura de RNA em grampo incluindo seu laço é fornecida como SEQ ID NO:15, e sua energia de dobragem livre foi estimada em -471,73 kcal/mol. Portanto, essa era uma estrutura em grampo energeticamente estável. A energia livre foi calculada utilizando "RNAfold" (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi) com base nas sequências de nucleotídeos após a separação da sequência de íntrons PDK.

[0560] Quando transcritos do cassete de expressão com o promotor 35S e o terminador OCS-T, os RNAs em grampo resultantes foram incorporados em uma molécula de RNA maior com 8 nucleotídeos adicionados à extremidade 5' e aproximadamente 178 nucleotídeos adicionados na extremidade 3', sem considerar a adição de qualquer cauda poli-A na extremidade 3'. Uma vez que o mesmo design de promotor- terminador foi utilizado para os RNAs em grampo modificados, essas moléculas também tinham essas extensões nas extremidades 5' e 3'. O comprimento das moléculas de RNA com estrutura de grampo após a emenda do íntron PDH era, portanto, de aproximadamente 630 nucleotídeos. CONSTRUTO HPGUS[G:U] QUE COMPREENDE PARES DE BASE G:U

[0561] Um fragmento de DNA que compreende a mesma sequência de 200 nucleotídeos, mas no qual todos os 52 nucleotídeos de citidina (C) da região GUS de tipo selvagem correspondente foram substituídos por nucleotídeos de timidina (T), foi montado anelando-se os oligonucleotídeos sobrepostos GUS-GU-F (SEQ ID NO:54) e GUS-GU-R (SEQ ID NO:55) e a extensão de PCR das extremidades 3' usando a polimerase LongAmp Taq de alta fidelidade (New England Biolabs, número de catálogo M0323). O fragmento de DNA amplificado foi inserido no vetor pGEM-T Easy e a sequência de nucleotídeos correta (SEQ ID NO:11) foi confirmada por sequenciamento. Um fragmento de DNA que compreende a sequência modificada foi então excisado por digestão com Xhol e Kpnl e inserido nos sítios XhoVKpnl do vetor base pMBW606. Isso produziu o construto designado pMBW608, contendo a expressão cassete 35S::GUS de sentido[G:U]:: Íntron PDK:: GUS antissentido:: OCS-T. Este cassete de expressão foi excisado com digestão de Noil e inserido no sítio Noil de pART27, resultando no vetor designado hpGUS [G:U], codificando a molécula de RNA com estrutura de grampo com emparelhamento de base em G:U.

[0562] Este cassete codificava um RNA com estrutura de grampo direcionado ao mRNA de GUS e que, quando autoanelado por hibridização das sequências de sentido e antissentido de 200 nt, possuía 52 pares de base G:U (em vez de pares de base G:C em hpGUS [wt]) e 148 pares de base canônicos , ou seja, 26% dos nucleotídeos da região de filamento duplo estavam envolvidos em pares de base G:U. Os 148 pares de base canônicos em hpGUS[G:U] eram os mesmos que no RNA com estrutura de grampo de controle, nas posições correspondentes, incluindo 49 pares de base U: A, 45 pares de base A: U e pares de base 54 G:C. Os trechos mais longos de emparelhamento de base canônico contíguo na região de filamento duplo foram 9 pares de base. A sequência de nucleotídeos antissentido de hpGUS[G:U] era, assim, idêntica em comprimento (200 nt) e sequência à sequência antissentido do hpGUS[wt]do RNA em grampo de controle. Após a transcrição do cassete de expressão e a emenda do íntron PDK a partir do transcrito primário, previu-se que a estrutura de RNA em grampo antes de qualquer processamento por Dicer ou outras RNAs tivesse uma estrutura em laço de 45 nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos da estrutura em grampo incluindo seu laço é fornecida como SEQ ID NO:16, e sua energia de dobragem livre foi estimada em -331,73 kcal/mol. Quanto ao hpGUS[wt], essa era, portanto, uma estrutura em grampo energeticamente estável, apesar dos pares de base de 52 G:U, que individualmente são muito mais fracos que os pares de base G:C em hpGUS[wt].

[0563] Um alinhamento da sequência de sentido GUS modificada (nucleotídeos 9 a 208 da SEQ ID NO:11) com a região correspondente do gene alvo de GUS (SEQ ID NO:14) é mostrado na Figura 7. CONSTRUTO HPGUS[1:4] QUE COMPREENDE NUCLEOTÍDEOS

INCOMPATÍVEIS A CADA QUARTO NUCLEOTÍDEO

[0564] Um fragmento de DNA que compreende a mesma sequência de sentido de 200 bp, mas na qual cada quarto nucleotídeo da sequência GUS do tipo selvagem correspondente foi substituído, foi projetado e montado. Cada quarto nucleotídeo em cada bloco de 4 nucleotídeos (nucleotídeos nas posições 4, 8, 12, 16, 20 etc.) foi substituído alterando C para G, G para C, A para T e T para A, deixando os outros nucleotídeos inalterados. Essas substituições eram todas substituições de transversão, que deveriam ter um efeito desestabilizador maior sobre a estrutura resultante de RNA em grampo do que as substituições de transição. O fragmento de DNA foi montado anelando-se os oligonucleotídeos sobrepostos GUS-4M-F (SEQ ID NO:56) e GUS-4M-R (SEQ ID NO:57) e a extensão de PCR das extremidades 3' usando a LongAmp Taq polimerase. O fragmento de DNA amplificado foi inserido no vetor pGEM-T Easy e a sequência de nucleotídeos correta (SEQ ID NO:12) foi confirmada por sequenciamento. Um fragmento de DNA que compreende a sequência modificada foi então excisado por digestão com Xhol e Kpnl e inserido nos sítios Xhol/Kpnl do vetor base pMBW606. Isso produziu o construto designado pMBW609, contendo o cassete de expressão 35S:: GUS[1:4] de sentido:: Íntron PDK:: GUS antissentido:: OCS-T. Este cassete de expressão foi excisado com digestão de Noil e inserido no sítio Noil de pART27, resultando no vetor designado hpGUS[1:4], codificando a molécula de RNA com estrutura de grampo 1:4 incompatível.

[0565] Este cassete codificava um RNA com estrutura de grampo direcionado ao mRNA de GUS e que, quando autoanelado por hibridização das sequências de sentido e antissentido, apresentava incompatibilidades para 50 nucleotídeos da sequência antissentido de 200 nt, incluindo a incompatibilidade para o nucleotídeo na posição 200. Excluindo a posição 200, a região de filamento duplo do RNA com estrutura de grampo tinha 150 pares de base canônicos e 49 pares de nucleotídeos incompatíveis em um comprimento de sequências de sentido e antissentido de 199nt, ou seja, previa-se que 24,6% dos nucleotídeos da região de filamento duplo eram incompatíveis (não envolvidos em pares de base). Após a transcrição do cassete de expressão e a emenda do íntron PDK a partir do transcrito primário, previu-se que a estrutura de RNA em grampo antes de qualquer processamento por Dicer ou outras RNAs tivesse uma estrutura em laço de 45 nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos da estrutura em grampo incluindo seu laço é fornecida como SEQ ID NO:17, e sua energia de dobragem livre foi estimada em -214,05 kcal/mol. Quanto ao hpGUS[wt], essa era, portanto, uma estrutura em grampo energeticamente estável, apesar dos nucleotídeos incompatíveis.

[0566] Um alinhamento da sequência de sentido GUS modificada (nucleotídeos 9 a 208 da SEQ ID NO:12) com a região correspondente do gene alvo de GUS (SEQ ID NO:14) é mostrado na Figura 8. CONSTRUTO HPGUS [2:10] NO QUAL OS NUCLEOTÍDEOS 9 E 10 DE 10 NUCLEOTÍDEOS ERAM INCOMPATÍVEIS

[0567] Um fragmento de DNA que compreende a mesma sequência de sentido de 200 bp, mas na qual todo nono e décimo nucleotídeo da sequência GUS do tipo selvagem correspondente foi substituído, foi projetado e montado. Cada 9o e 10o nucleotídeo em cada bloco de 10 nucleotídeos (nucleotídeos nas posições 9, 10, 19, 20, 29, 30 etc.) foi substituído pela mudança de C para G, G para C, A para T e T para A, deixando os outros nucleotídeos inalterados. O fragmento de DNA foi montado anelando-se os oligonucleotídeos sobrepostos GUS-10M- F (SEQ ID NO:58) e GUS-10M-R (SEQ ID NO:59) e a extensão de PCR das extremidades 3' usando a LongAmp Taq polimerase. O fragmento de DNA amplificado foi inserido no pGEM-T Easy e a sequência de nucleotídeos correta (SEQ ID NO:13) foi confirmada por sequenciação. Um fragmento de DNA que compreende a sequência modificada foi então excisado por digestão com Xhol e Kpnl e inserido nos sítios XhollKpnl do vetor base pMBW606. Isso produziu o construto designado pMBW610, contendo o cassete de expressão 35S:: GUS de sentido[2:10]:: Íntron PDK:: GUS antissentido:: OCS-T. Esse cassete de expressão foi excisado com digestão com Noil e inserido no sítio Notl do pART27, resultando no vetor designado hpGUS [2:10], codificando a molécula de RNA com estrutura de grampo 2:10 incompatível.

[0568] Este cassete codificava um RNA com estrutura de grampo direcionado ao mRNA de GUS que, quando autoanelado por hibridização das sequências de sentido e antissentido, apresentava incompatibilidades para 50 nucleotídeos da sequência antissentido de 200 nt, incluindo incompatibilidades para os nucleotídeos nas posições 199 e

200. Excluindo as posições 199 e 200, a região de filamento duplo do RNA com estrutura de grampo tinha 160 pares de base canônicos e 19 incompatibilidades de dinucleotídeos ao longo de um comprimento de sequências de sentido e antissentido de 198 nt, ou seja, previu-se que 19,2% dos nucleotídeos da região de filamento duplo eram incompatíveis (não envolvidos em pares de base). Os 160 pares de base em hpGUS[2:10] eram os mesmos do RNA com estrutura de grampo de controle, nas posições correspondentes, incluindo 41 pares de base U:A, 34 pares de base A:U, pares de base 42 G:C e 43 C:G. Após a transcrição do cassete de expressão e a emenda do íntron PDK a partir do transcrito primário, previu-se que a estrutura de RNA em grampo antes de qualquer processamento por Dicer ou outras RNAs tivesse uma estrutura em laço de 45 nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos da estrutura em grampo incluindo seu laço é fornecida como SEQ ID NO:18, e sua energia de dobragem livre foi estimada em -302,78 kcal/mol. Quanto ao hpGUS[wt], essa era, portanto, uma estrutura em grampo energeticamente estável, apesar dos nucleotídeos incompatíveis que se esperavam saltarem da haste da estrutura em grampo.

[0569] Um alinhamento da sequência de sentido GUS modificada (nucleotídeos 9 a 208 da SEQ ID NO:13) com a região correspondente do gene alvo de GUS (SEQ ID NO:14) é mostrado na Figura 9.

[0570] Os quatro construtos genéticos para expressão dos RNAs em grampo de controle e modificados são mostrados esquematicamente na Figura 10. EXEMPLO 7. TESTANDO OS RNAS DE GRAMPO MODIFICADOS EM

PLANTAS TRANSGÊNICAS

[0571] Plantas das espécies Nicotiana tabacum (tabaco) transformadas com um gene alvo GUS foram usadas para testar a eficácia dos quatro construtos de RNA com estrutura de grampo descritos acima. Especificamente, as plantas alvo eram de duas linhagens transgênicas independentes homozigotas, PPGH11 e PPGH24, cada uma contendo uma inserção de cópia única de um transgene GUS de um vetor pWBPPGH, que é mostrado esquematicamente na Figura 11. O gene GUS no DNA-T de pWBPPGH tinha uma região codificadora de GUS (nucleotídeos 7 a 1812 da SEQ ID NO:8) operacionalmente ligada a um promotor de 1,3 kb do gene da proteína do floema 2 (PP2) de Cucurbita pepo L. cv.

Autumn Gold (Wang et al., 1994; Wang, 1994). O construto pWBPPGH foi produzido excisando o promotor PP2 mais o UTR 5' e 54 nucleotídeos da região de codificação da proteína PP2, codificando os primeiros 18 aminoácidos do PP2, do clone genômico lambda CPP1.3 (Wang, 1994) e fundindo este fragmento com a sequência de codificação de GUS começando com os nucleotídeos que codificam o 3º aminoácido de GUS, gerando um polipeptídeo de fusão N-terminal com atividade de GUS.

O pPP2:: GUS: A cassete Nos-T foi inserida em pWBVec2a (Wang et al., 1998) para gerar pWBPPGH, que foi usado para transformar plantas de Nicotiana tabacum cv.

Wisconsin 38 usando transformação de disco foliar mediada por Agrobactéria tumefaciens (Ellis et al., 1987), selecionando resistência à higromicina.

As atividades de GUS em plantas de progênie homozigotos de duas linhagens transgênicas PPGHll e PPGH24 foram semelhantes.

A expressão de GUS em ambas as plantas transgênicas não se restringiu ao floema, mas esteve presente na maioria dos tecidos das plantas.

A expressão de GUS do promotor PP2 nestas plantas parecia, portanto, constitutiva.

Havia duas razões para escolher as plantas PP2-GUS como as plantas de teste: i) elas fornecem níveis constitutivamente altos de expressão de GUS aproximadamente o mesmo que para uma planta 35S-GUS; ii) o promotor PP2 é um promotor do gene PP2 endógeno derivado de Cucurbita pepo com uma sequência diferente do promotor 35S usado para conduzir a expressão dos transgenes de hpRNA, que, portanto, não estariam sujeitos a cossupressão transcricional pelo promotor 35S recebido.

[0572] os quatro construtos de RNA com estrutura de grampo (Exemplo 6) foram usadas para transformar plantas PPGH11 e PPGH24 usando o método de disco foliar mediado por Agrobactéria (Ellis et al., 1987), utilizando 50 mg/L de canamicina como agente seletivo. Observou-se que este sistema de seleção com canamicina, um agente diferente da higromicina usada anteriormente para introduzir o T-DNA do pWBPPGH, produzia apenas plantas transformadas, sem que as plantas não transformadas fossem regeneradas. Plantas transgênicas regeneradas contendo os T-DNAs dos construtos hpGUS foram transferidas para o solo para crescimento em casa de vegetação e mantidas por cerca de 4 semanas antes de avaliar a atividade de GUS. Quando analisadas, as plantas transgênicas estavam saudáveis e em crescimento ativo e na aparência eram idênticas às plantas de controle não transformadas e às plantas parentais de PPGHll e PPGH24. No total, foram obtidas 59 plantas transgênicas que foram transformadas com o T-DNA que codifica hpGUS [wt], 74 plantas foram obtidas que foram transformadas com o T-DNA que codifica hpGUS [G:U], 33 plantas foram obtidas que foram transformadas com foram obtidos o T-DNA que codifica hpGUS [l: 4] e 41 plantas que foram transformadas com o T-DNA que codifica hpGUS [2:10].

[0573] Os níveis de expressão de GUS foram medidos usando o ensaio fluorimétrico de 4-metilumbeliferil β-D- glucuronido (MUG) (Jefferson et al., 1987) seguindo o método cinético modificado descrito em Chen et al. (2005). As plantas foram testadas colhendo amostras de folhas com cerca de 1 cm de diâmetro de três folhas diferentes em cada planta, escolhendo folhas bem expandidas, saudáveis e verdes. Foi tomado cuidado para que as plantas de teste estivessem no mesmo estágio de crescimento e desenvolvimento que as plantas de controle. Cada ensaio utilizou 5 μg de proteína extraída por amostra de folha e mediu a taxa de clivagem da MUG como descrito em Chen et al. (2005).

[0574] Dados representativos são mostrados na Figura 12, mostrando a atividade GUS (unidades MUG no ensaio) para cada planta transgênica independente. Como os dados para o construto hpGUS [wt] mostraram que algumas plantas exibiram forte silenciamento com uma redução na atividade de pelo menos 90% e outras mais fracas, uma atividade de 10% GUS em relação às plantas de controle foi escolhida, neste contexto, como nível de atividade para classificar as plantas em duas categorias e comparar os diferentes construtos.

[0575] O construto genético que codifica o hpGUS canonicamente emparelhado com base induziu um forte silenciamento de GUS, usando o nível de atividade de 10% como referência para silenciamento forte, em 32 das 59 plantas transgênicas testadas (54,2%). As outras 27 plantas apresentaram atividade reduzida de GUS, mas retiveram mais de 10% da atividade enzimática em relação às plantas de controle e, portanto, foram consideradas exibindo silenciamento fraco nesse contexto. As plantas transgênicas com esse construto mostraram uma ampla gama na extensão do silenciamento do gene GUS (Figura 12), de menos de 1% a cerca de 80% da atividade restante, o que era típico para desenhos convencionais em grampo (Smith et al., 2000).

[0576] Em contraste claro, o construto hpGUS[G:U] induziu silenciamento consistente e uniforme nas linhagens transgênicas independentes, com 71 das 74 plantas (95,9%) testadas mostrando forte silenciamento GUS. Diferente novamente, todas as plantas de 33 hpGUS [l: 4] testadas apresentaram níveis reduzidos de atividade de GUS, com apenas 8 (24%) produzindo <10% da atividade de GUS em relação às plantas de controle e as outras 25 classificadas como tendo silenciamento mais fraco. Esses resultados indicaram que esse construto induziu níveis mais fracos, porém mais uniformes, de regulação negativa do GUS através das linhagens transgênicas. O hpGUS [2:10], o desempenho foi mais parecido com o hpGUS [wt], induzindo bons níveis de silenciamento em algumas linhagens (28 de 41, ou 68,3%) e produziu pouco ou nenhum silenciamento de GUS nas 13 plantas restantes.

[0577] Quando apenas as linhagens silenciadas (<10% da atividade restante) foram usadas para comparação e as atividades médias do GUS calculadas, as plantas hpGUS [wt] apresentaram a maior extensão média de silenciamento, seguida em ordem pelas plantas hpGUS[G:U] e hpGUS [2:10] plantas (Figura 13). As plantas hpGUS [l:4] apresentaram a menor redução média na atividade de GUS. A extensão do silenciamento por GUS mostrou uma boa correlação com a estabilidade termodinâmica das estruturas de hpRNA previstas derivadas dos quatro construtos diferentes de hpRNA (Exemplo 6).

[0578] Para testar se as diferenças persistiriam nas plantas descendentes, plantas transgênicas representativas contendo o gene GUS alvo, que era homozigoto, e o transgene hpGUS (hemizigótico) foram autofecundados. Plantas progênies resistentes à canamicina das linhagens hpGUS foram selecionadas, descartando quaisquer segregantes nulos sem os transgenes hpGUS. Isso garantiu que os transgenes hpGUS estivessem presentes em toda a progênie, tanto no estado homozigoto quanto no heterozigoto. As plantas descendentes foram testadas quanto à atividade de GUS e dados representativos são apresentados na Figura 14. A progênie que contém os transgenes hpGUS [wt] obviamente se enquadrava em duas categorias, a saber, aquelas que apresentavam forte silenciamento GUS e outras que apresentavam silenciamento fraco ou inexistente. Essas classes se correlacionaram bem com o fenótipo da geração anterior, mostrando que a extensão do silenciamento do gene alvo era hereditária. Todas as plantas nas linhagens hpGUS[G:U] testadas mostraram consistentemente silenciamento forte, enquanto as plantas nas linhagens hpGUS [l:4] apresentaram consistentemente silenciamento mais fraco. Os inventores concluíram que os fenótipos observados na geração dos pais eram geralmente mantidos nas plantas descendentes.

EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO DE SOUTHERN BLOT EM PLANTAS TRANSFORMADAS

[0579] A uniformidade do forte silenciamento genético observado no grande número de plantas transgênicas independentes geradas com o construto hpGUS[G:U] foi impressionante, além de surpreendente e inesperada. Os inventores procuraram estabelecer se alguma explicação diferente de um efeito causado pelo RNA hpGUS[G:U] estava causando a uniformidade do silenciamento. Para testar se as múltiplas plantas transgênicas surgiram a partir de eventos de transformação independentes, conforme o planejado, foram realizadas experiências de hibridização Southern blot em DNA isolado de 18 plantas transgênicas representativas contendo o construto hpGUS [G:U]. O DNA foi isolado a partir de tecidos foliares utilizando o método de fenol quente descrito por Wang et al. (2008). Para a hibridização Southern blot, aproximadamente 10 μg de DNA de cada amostra de planta foram digeridos com a enzima HmdIII, separados por eletroforese em gel em gel de agarose a 1% em tampão TBE e transferidos para membrana Hybond-N + usando o método capilar (Sambrook et al., 1989). A membrana foi hibridizada durante a noite a 42 ºC com um fragmento de DNA marcado com P32 da região terminadora OCS- T. Esta sonda foi escolhida porque hibridizou com o transgene hpGUS [G:U], mas não com o gene alvo GUS que não possuía uma sequência terminadora de OCS-T. A membrana foi lavada com alto rigor e a sonda retida visualizada com um Fosfolipador.

[0580] Uma Autorradiografia de uma mancha hibridizada é mostrada na Figura 15. Cada faixa mostrou de uma a cinco ou seis bandas de hibridização. Nenhuma das duas faixas mostrou o mesmo padrão, ou seja, a Autorradiografia mostrou que as 16 plantas hpGUS[G:U] representadas tinham padrões diferentes de fragmentos de HmdIII que hibridaram e, portanto, vieram de diferentes inserções de transgene. Os inventores concluíram que o silenciamento GUS uniforme observado para as linhagens hpGUS[G:U] não era devido a padrões de inserção de transgene semelhantes nas plantas e que a uniformidade do silenciamento foi causada pela estrutura do RNA hpGUS [G:U]. Os inventores também concluíram que várias cópias do transgene hpGUS[G:U] não eram necessárias para obter um forte silenciamento genético; uma única cópia do transgene foi suficiente.

EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO NORTHERN BLOT EM PLANTAS TRANSFORMADAS

[0581] Para determinar se o RNA do hpGUS[G:U] foi processado da mesma maneira que o RNA de grampo de controle nas plantas transgênicas, foram realizadas experiências de hibridização Northern blot em RNA isolado das folhas das plantas transgênicas. As experiências de Northern blot foram realizadas para detectar os RNAs mais curtos (sRNA, aproximadamente 21 a 24 nucleotídeos de comprimento) que resultaram do processamento Dicer dos RNAs em grampo. A experiência foi realizada em RNA pequeno isolado de plantas transgênicas hpGUS [wt] e hpGUS[G:U] que também contêm o gene alvo de GUS que foi expresso como um mRNA (sentido). Nove plantas para cada construto foram selecionadas para análise de sRNA. Para a população transgênica hpGUS [wt], foram incluídas plantas que apresentaram fraco silenciamento de GUS, bem como algumas que exibiam forte silenciamento de GUS. As pequenas amostras de RNA foram isoladas pelo método do fenol quente (Wang et al., 2008), e a hibridização Northern blot foi realizada de acordo com Wang et al. (2008), com eletroforese em gel das amostras de RNA realizadas em condições desnaturantes. As sondas utilizadas foram RNAs marcados com 32P correspondentes à sequência de sentido ou à sequência antissentido correspondente aos nucleotídeos 804 a 1003 da SEQ ID NO:8.

[0582] Uma Autorradiografia de um Northern blot, hibridizada com a sonda antissentido (painel superior) para detectar moléculas de sRNA dos sentidos derivadas dos RNAs em grampo ou hibridizada com a sonda de sentido para detectar os sRNAs antissentido (painel inferior), é mostrada na Figura 16. Na parte inferior, a Figura mostra uma pontuação qualitativa para o nível de expressão de GUS em relação às plantas de controle que não possuem os construtos hpGUS. Foi observada hibridização para pequenos RNAs de cerca de 20 a 25 nucleotídeos, com base na mobilidade dos sRNAs em comparação com os RNAs de comprimento conhecido em outras experiências.

As linhagens hpGUS [wt] mostraram uma variação na quantidade de acumulação de sRNA. Isso foi observado para os sRNAs sentido e antissentido, embora as bandas de sRNA antissentido não fossem tão claras quanto as bandas de sentido. Como as plantas hpGUS [wt] continham o transgene hpGUS, expressando sequências de sentido e antissentido correspondentes à região alvo de 200 nt e o gene alvo GUS que expressa o gene de sentido completo, os sRNAs sensoriais poderiam ter sido gerados a partir do grampo RNA ou o mRNA alvo. Pareceu haver correlação negativa entre o nível de sRNA e o grau de silenciamento por GUS nas plantas hpGUS [wt]. Por exemplo, as duas plantas representadas nas faixas 4 e 5 acumularam relativamente mais sRNA, mas mostraram apenas uma extensão moderada da regulação negativa do GUS. Em contraste, as duas plantas representadas nas pistas 7 e 8 tiveram um forte silenciamento de GUS, mas acumularam níveis relativamente baixos de sRNA.

[0583] Em contraste com as plantas hpGUS [wt] e consistente com a extensão relativamente uniforme do silenciamento pelo construto hpGUS [G:U], as plantas hpGUS[G:U] acumularam quantidades uniformes de sRNAs antissentido nas linhagens. Além disso, o grau de silenciamento por GUS parece mostrar boa correlação com a quantidade de sRNA antissentido. Quase nenhum sRNAs sentido foi detectado nessas plantas. Isso era esperado, uma vez que a sonda de RNA usada na hibridização Northern blot foi transcrita a partir da sequência GUS do tipo selvagem e, portanto, teve um nível mais baixo de complementaridade para detectar sRNAs de hpGUS [G:U], em que todos os nucleotídeos C foram substituídos por nucleotídeos U, permitindo apenas hibridização de menor rigor. No entanto, este experimento não excluiu a possibilidade de que o RNA do hpGUS[G:U] tenha sido processado para produzir menos sRNAs com sentido ou que eles sejam degradados mais rapidamente.

[0584] O experimento de hibridização Northern blot foi repetido, desta vez usando apenas uma sonda de detecção para detectar sRNAs antissentido; a Autorradiografia é mostrada na Figura 17. Mais uma vez, a produção de sRNAs antissentido a partir do construto hpGUS [wt] correlacionou- se negativamente com a atividade GUS (painel superior da Figura 17). As plantas que foram fortemente silenciadas produziram altos níveis de sRNAs antissentido (faixas 1, 3, 5, 8 e 10), enquanto as plantas que apresentaram apenas silenciamento fraco ou inexistente não produziram um sinal de hibridização nesta experiência (faixas 2, 4, 6, 7 e 9). Em contraste muito claro, as plantas que expressam hpGUS[G:U] produziram uma quantidade muito menor, mas consistente, de sRNAs antissentido. A observação de que as plantas fortemente silenciadas que expressam hpGUS[G:U] acumulavam níveis muito mais baixos de sRNAs do que as plantas fortemente silenciadas que expressam hpGUS [wt] era intrigante e sugeriu aos inventores que o hpGUS [wt] estava sendo processado por um mecanismo diferente nas plantas, mas ainda era tão eficaz quanto o construto hpGUS [wt]. Uma observação adicional neste experimento forneceu uma pista de que as duas bandas antissentido relativamente fracas para as plantas hpGUS[G:U] pareciam ter a mesma mobilidade que a segunda e a quarta bandas observadas para as bandas sRNA antissentido de hpGUS [wt]. Isso foi confirmado em outras experiências descritas abaixo. Os inventores postularam que as quatro bandas para os sRNAs de hpGUS [wt] representam 24-, 22-, 21- e 20-mers, e que o RNA hpGUS[G:U] foi processado principalmente para produzir 22- e 20-mers sRNAs antissentido.

[0585] Uma conclusão importante e definitiva dos dados descritos acima foi que a molécula de RNA hpGUS[G:U] foi processada por uma ou mais enzimas Dicer para produzir sRNAs, em particular a produção de sRNAs antissentido que são considerados mediadores da interferência de RNA em a presença de várias proteínas, como o Argonaute. A produção observada de sRNAs antissentido implicou que os sRNAs sensoriais também foram produzidos, mas as experiências não distinguiram entre degradação/instabilidade dos sRNAs sensoriais ou a falta de detecção de sRNAs sensoriais devido à hibridização insuficiente com a sonda utilizada. A partir dessas experiências, os inventores também concluíram que havia diferenças claras entre as moléculas de RNA hpGUS [wt] e hpGUS[G:U] em seu processamento. Isto indicou que as moléculas foram reconhecidas diferentemente por um ou mais Dicers. EXEMPLO 8. ANÁLISE DE SRNAS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS

QUE EXPRESSAM RNAS EM GRAMPO MODIFICADOS

[0586] Outro experimento de hibridização Northern blot foi realizado para detectar sRNAs antissentido de plantas hpGUS[G:U] e comparar seus tamanhos com os produzidos a partir de hpGUS [wt]. A Autorradiografia é mostrada na Figura 18. Desta vez, a diferença no tamanho das duas bandas de sRNA antissentido do hpGUS[G:U] em comparação com as duas principais bandas do hpGUS [wt] foi mais distinta. Isso foi melhor visto comparando a mobilidade das bandas nas faixas adjacentes 9 e 10 da Figura 18. Este resultado confirmou que os dois RNAs em gancho foram processados de maneira diferente por um ou mais Dicers nas plantas.

[0587] Para investigar melhor isso, as pequenas populações de RNA do hpGUS [wt] e hpGUS[G:U] foram analisadas por sequenciamento profundo dos sRNAs totais amplificáveis por ligante isolados das plantas. A frequência de sRNAs mapeados para as regiões de filamento duplo dos RNAs em grampo foi determinada. A distribuição de comprimento de tais sRNAs também foi determinada. Os resultados mostraram que houve um aumento na frequência de RNAs antissentido de 22 mer do construto hpGUS[G:U] em relação à construto hpGUS [wt]. O aumento na proporção de sRNAs de 22 nt de comprimento indicou uma mudança no processamento do grampo hpGUS[G:U] pelo Dicer-2 em relação ao hpGUS [wt]. EXEMPLO 9. ANÁLISE DE METILAÇÃO DO DNA DE TRANSGENES

EM PLANTAS

[0588] As observações sobre a variabilidade na extensão do silenciamento GUS conferida por hpGUS [wt] e que sRNAs antissentido de 24-mer foram detectados nas plantas hpGUS [wt], mas aparentemente não nas plantas hpGUS[G:U] levaram os inventores a questionar se as duas populações de plantas diferiram em seu nível de metilação do DNA do gene GUS alvo. Pensa-se que sRNAs de 24-meros específicos para sequência estão envolvidos na promoção da metilação de DNA de estruturas de repetição invertida em plantas (Dong et al., 2011). Os inventores testaram, portanto, os níveis de metilação do DNA do transgene GUS nas plantas hpGUS, em particular da região promotora 35S do gene que codifica o grampo (gene de silenciamento).

[0589] Para isso, foi utilizada a endonuclease dependente da metilação do DNA McrBC. McrBC é uma endonuclease comercialmente disponível que cliva DNA contendo bases de metilcitosina (mC) em uma ou em ambas as cadeias de DNA de cadeia dupla (Stewart et al., 2000). O McrBC reconhece sítios no DNA que consistem em dois meios-sítios da forma 5 '(G ou A) m C 3', preferencialmente G m C. Esses meios-sítios podem ser separados por várias centenas de pares de base, mas a separação ideal é de 55 a cerca de 100 bp. DNA de dupla cadeia simples tendo tais ligações dinucleidos GMC em ambas as cadeias servir como o melhor substrato. A atividade de McrBC depende de um ou de ambos os dinucleotídeos GC serem metilados. Como o DNA da planta pode ser metilado no C nas sequências CG, CHG ou CHH, onde H significa A, C ou T (Zhang et al., 2018), a digestão do DNA usando McrBC com subsequente amplificação por PCR de sequências específicas de genes pode ser usado para detectar a presença ou ausência de mC em sequências específicas de DNA em genomas vegetais. Neste ensaio, a amplificação por PCR do DNA genômico digerido com McrBC que é metilado produz quantidades reduzidas do produto de amplificação em comparação com o DNA que não é metilado, mas produz uma quantidade igual de produto de PCR como DNA não tratado se o DNA não for metilado.

[0590] O DNA genômico foi isolado por métodos padrão a partir de plantas contendo o construto hpGUS [wt], hpGUS[G:U] ou hpGUS [l: 4], além do gene GUS alvo (Draper e Scott, 1988). As amostras de DNA purificado foram tratadas com McrBC (Nº de catálogo M0272; New England Biolabs, Massachusetts) de acordo com as instruções do fabricante, incluindo a presença de íon Mg 2+ e GTP necessários para a atividade da endonuclease. Em resumo, aproximadamente 1 µg de DNA genômico foi digerido com McrBC durante a noite em um volume de reação de 30 µl. As amostras de DNA digerido foram diluídas para µl e as regiões de interesse foram amplificadas por PCR da seguinte forma.

[0591] As amostras de DNA tratadas foram usadas em reações de PCR usando os seguintes iniciadores. Para a sequência de junção 35S-GUS para hpGUS [wt]: Iniciador direto (35S-F3), 5 '-TGGCTCCT AC AAATGCC ATC-3' (SEQ ID NO:60); Iniciador reverso (GUSwt-R2), 5'-CARRAACTRTTCRCCCTTCAC-3' (SEQ ID NO:61). Para a sequência de junção 35S-GUS para hpGUS [G:U]: Iniciador direto (GUSgu-R2), 5'-C AAAAACT ATTC ACCCTTC AC-3' (SEQ ID NO:62); iniciador reverso (GUS4m-R2), CACRAARTRTACRCRCTTRAC (SEQ ID NO:63). Para a sequência do promotor 35S para ambas os construtos: Iniciador direto (35S- F2), 5 '-GAGGATCT AAC AGAACTCGC-3' (SEQ ID NO:64); iniciador reverso (35S-R1), 5 '-CTCTCC AAATGAAATGAACTTCC- 3' (SEQ ID NO:65). Em cada caso, as reações R = A ou G, Y = C ou T. PCR foram realizadas com as seguintes condições de ciclagem: 94 ºC por 1 minuto, 35 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 55 ºC de anelamento por 45 segundos, extensão de 68 ºC por 1 minuto e extensão final a 68 ºC por 5 minutos. Os produtos de amplificação por PCR foram submetidos a eletroforese e a intensidade das bandas quantificada.

[0592] Os resultados representativos são mostrados nas Figuras 19 e 20. Para a região de junção 35S-GUS que incluiu 200 bp da sequência promotora 35S incluindo o sítio de início da transcrição, a maioria das plantas hpGUS [wt] apresentou níveis significativos de metilação do DNA. Dentro da população de plantas hpGUS [wt], plantas individuais que mantiveram níveis mais altos de atividade de GUS, ou seja, menos silenciamento, pareciam ter mais metilação da região de junção de sentido promotor-GUS. Os resultados foram semelhantes para a região promotora 35S. Por outro lado, a maioria das plantas hpGUS[G:U] e hpGUS [l:4] apresentaram menor metilação do DNA na junção 35S-GUS. Os inventores consideraram que esta sequência promotora proximal era importante para a expressão do transgene e a metilação nessa região provavelmente reduziria a expressão do construto de silenciamento através do silenciamento de genes transcricionais (TGS) do transgene. Isso é chamado de "silenciamento automático". DISCUSSÃO GERAL EM RELAÇÃO AOS EXEMPLOS 6 A 9

PERTURBAÇÃO DA ESTRUTURA DE DNA REPETIDA INVERTIDA EM UM TRANSGENE ACENTUA SUA ESTABILIDADE

[0593] Ambas as populações de hpGUS [wt] e hpGUS [2: 10] plantas transgênicas mostraram uma ampla gama na extensão do silenciamento do gene alvo. Em contraste, ambas as populações contendo plantas hpGUS[G:U] e hpGUS [l:4] exibiram silenciamento GUS relativamente uniforme em muitas linhagens independentes, com forte silenciamento observado pelo construto anterior e redução relativamente mais fraca, mas ainda substancial, na atividade genética pelo último construto. Nos RNAs em grampo dos construtos [G:U] e [1:4], cerca de 25% dos nucleotídeos nas sequências de sentido e antissentido estavam envolvidos nos pares de base de G:U ou em uma incompatibilidade de sequência distribuída uniformemente pelas 200 sequências de sentido nucleotídico/antissentido. Devido à divergência de sequência entre as sequências de sentido e antissentido, as incompatibilidades nos construtos de DNA entre os "braços" de sentido e antissentido ou a estrutura de solicitação invertida foram consideradas como perturbadoras significativas dessa estrutura de DNA de repetição invertida. As estruturas repetitivas do DNA podem atrair a metilação e o silenciamento do DNA em vários organismos (Hsieh e Fire, 2000). O hpGUS [2:10] o construto também incluía incompatibilidades entre a região sensível e antissentido, mas cada uma das incompatibilidades de 2bp entre as sequências sensível e antissentido era flanqueada por correspondências consecutivas de 8bp, portanto, as incompatibilidades podem não ter perturbado a estrutura de DNA repetida invertida tanto quanto em os transgenes [G:U] e [1:4]. A uniformidade do silenciamento de GUS induzido pelo hpGUS[G:U] e hpRNA [l:4] pode, portanto, ter sido devido, pelo menos em parte, à interrupção da estrutura de DNA de repetição invertida que resultou em menos metilação e, portanto, reduziu o autossilenciamento dos dois transgenes. Outro benefício das incompatibilidades entre as regiões de DNA sensível e antissentido foi que a clonagem da repetição invertida em E. coli foi auxiliada, uma vez que as bactérias tendem a excluir ou reorganizar repetições invertidas perfeitas.

A ESTABILIDADE TERMODINÂMICA DO HPRNA É IMPORTANTE PARA O GRAU DE SILENCIAMENTO DO GENE ALVO

[0594] Quando apenas as linhagens transgênicas fortemente silenciadas foram comparadas, as plantas hpGUS [wt] apresentaram a maior extensão de regulação negativa do gene alvo, seguidas na ordem por hpGUS [G:U], hpGUS [2:10] e hpGUS [1:4]. A análise RNAFold previu que a estrutura de RNA em grampo hpGUS [wt] apresentava a menor energia livre, ou seja, a maior estabilidade, seguida por hpGUS [G:U], hpGUS [2:10] e grampos hpGUS [l: 4]. Os inventores consideraram que quanto mais estável a estrutura do RNA com estrutura de grampo, maior a extensão do silenciamento do gene alvo que ele poderia induzir. Isso também favoreceu estruturas de RNA de filamento duplo mais longas do que estruturas mais curtas. Pensa-se que era necessária a formação estável de RNA de filamento duplo para o processamento Dicer eficiente. Os resultados das experiências descritas aqui indicaram outra vantagem importante do construto com base em G:U sobre os construtos que compreendem principalmente nucleotídeos incompatíveis simples, como hpGUS [l:4]: enquanto ambos os tipos de construtos haviam interrompido estruturas de DNA repetidas invertidas, o que reduzia a auto- silenciando, no nível do RNA, o RNA do hpGUS[G:U] ficou mais estável devido à capacidade de G e U formarem pares de base. Uma combinação dos dois tipos de modificações também foi considerada benéfica, incluindo os pares de base G:U e alguns nucleotídeos incompatíveis na estrutura do RNA de filamento duplo, mas com relativamente mais nucleotídeos envolvidos nos pares de base G:U do que nas incompatibilidades, por um fator de pelo menos 2, 3, 4 ou até

5. O RNA DO HPGUS[G:U] FOI PROCESSADO COM EFICIÊNCIA

PELA DICER

[0595] Uma questão importante que foi respondida nessas experiências foi se o hpRNA incompatível ou com G:U emparelhado em base poderia ser processado pelo Dicer em pequenos RNAs (sRNAs). O forte silenciamento nas plantas hpGUS[G:U] e nas 1:4 e 2:10 plantas de hpRNA incompatíveis, implicavam que essas estruturas de RNA com estrutura de grampo eram processadas por Dicer. Isto foi confirmado para a molécula [G:U] por hibridização por sRNA Northern blot, que detectou prontamente sRNAs antissentido. Além disso, o grau de silenciamento de GUS nas plantas hpGUS[G:U] mostrou uma boa correlação com a quantidade de sRNAs antissentido que se acumularam. A análise de sequenciamento profundo do RNA de duas linhagens selecionadas de cada uma (apenas uma para hpGUS [wt]) confirmou que plantas hpGUS [G:U], como as plantas hpGUS [wt], geravam sRNAs abundantes, enquanto que o hpGUS [l:4] as plantas também geraram sRNAs, mas com uma abundância muito menor (Figura 21). O nível mais baixo de sRNAs das plantas hpGUS [l:4] foi consistente com a eficiência relativamente baixa do silenciamento GUS e sugeriu que a baixa estabilidade termodinâmica do dsRNA caule no RNA hpGUS [l:4] reduziu a eficiência do processamento de Dicer. Observou-se que a extensão do silenciamento por GUS mostrou correlação relativamente baixa com o nível de sRNA para o construto hpGUS [wt], com algumas linhagens fortemente silenciadas contendo quantidades relativamente baixas de sRNA. Isto sugeriu que o silenciamento por GUS em algumas das linhagens hpGUS [wt] se devia pelo menos em parte ao silenciamento transcricional em vez de PTGS direcionado por sRNA. Os inventores reconheceram que o autossilenciamento do gene que codifica grampo, que envolveu a metilação das sequências gênicas, como a região promotora, foi diminuído usando os construtos de RNA de grampo modificadas, particularmente o construto G:U. OG: OS TRANSGENES DE HPRNA U E 1: 4 APRESENTARAM METILAÇÃO REDUZIDA DO DNA NA REGIÃO PROMOTORA 35S PROXIMAL

[0596] A análise por digestão-PCR de McrBC mostrou que os níveis de metilação do DNA na sequência 35S de 240 bp perto do sítio de início da transcrição (TSS) foram reduzidos nas populações transgênicas hpGUS[G:U] e hpGUS [l:4] em relação ao hpGUS [wt] população. Esse resultado indicou aos inventores que a interrupção da estrutura de repetição invertida perfeita, devido às modificações de C para T (em hpGUS [G:U]) ou 25% de incompatibilidade de nucleotídeos (em hpGUS [l:4]), no sentido sequência, autossilenciamento transcricional minimizado dos transgenes de hpRNA. Isso foi consistente com a uniformidade do silenciamento do gene GUS observado nas populações hpGUS[G:U] e hpGUS [l:4] em relação à população hpGUS [wt]. Os inventores reconheceram que o construto hpGUS[G:U] era mais ideal do que o construto hpGUS [l:4] na redução da metilação do promotor e, portanto, no autossilenciamento transcricional, pelo menos porque possuía um número reduzido ou mesmo falta de nucleotídeos de citosina na sequência de sentido e, portanto, não atraiu a metilação do DNA que poderia se espalhar para o promotor. EXEMPLO 10. PROJETO E TESTE DE RNAS EM GRAMPO QUE COMPREENDE PARES DE BASE G:U DIRECIONADO AOS GENES ENDÓGENOS RNAS EM GRAMPO MODIFICADOS DIRECIONADO AOS RNAS EIN2

E CHS

[0597] Uma vez que o RNA com estrutura de grampo modificado G:U parecia induzir um silenciamento mais consistente e uniforme do gene alvo em comparação com o RNA com estrutura de grampo convencional, como descrito acima, os inventores queriam testar se o design aprimorado também reduziria a expressão de genes endógenos. Os inventores, portanto, projetaram, produziram e testaram vários construtos de RNA com estrutura de grampo modificadas por [G:U] direcionado aos genes EIN2 ou CHS, ou ambos, que eram genes endógenos em Arabidopsis thaliana, escolhidos como genes-alvo exemplificativos para tentativa de silenciamento. O gene EIN2 (SEQ ID NO:19) codifica a proteína 2 insensível ao etileno (EIN2), que é um fator central nas vias de sinalização reguladas pela molécula de sinalização da planta etileno, ou seja, uma proteína reguladora, e o gene CHS (SEQ ID NO:20) codifica a enzima calconetase (CHS) que está envolvido na produção de antocianina no revestimento de semente de A. thaliana. Outro construto modificado por G:U foi produzido, direcionado a simultaneamente os genes EIN2 e CHS, nos quais as sequências EIN2 e CHS foram fundidas transcricionalmente para produzir um único RNA com estrutura de grampo. Além disso, três construtos adicionais foram feitos direcionados a EIN2, CHS ou EIN2 e CHS, nos quais as bases citidina nas sequências de sentido e antissentido foram substituídas por bases timidina (aqui denominado construto G:U/U:G), em vez de apenas na sequência de sentido, como foi feito para os grampos modificados direcionados ao GUS. os construtos de RNA de grampo modificadas foram testadas quanto à sua capacidade de reduzir a expressão do gene EIN2 endógeno ou dos genes EIN2 e CHS usando uma abordagem entregue pelo gene para fornecer os RNAs de grampo para as células. Os RNAs em grampo convencionais usados como controles no experimento tinham uma região de RNA de filamento duplo de 200 pares de base para atingir os mRNAs de EIN2 ou CHS, isoladamente, ou uma região de RNA de filamento duplo quimérica que compreende 200 pares de base de cada um dos EIN2 e Genes CHS que foram fundidos como uma única molécula em grampo. No RNA fundido, a porção de filamento duplo de EIN2 era adjacente ao laço do grampo e a região de CHS era distal ao laço. Todos os pares de base na região de filamento duplo dos RNAs com estrutura de grampo de controle eram pares de base canônicos.

PREPARAÇÃO DO CONSTRUTO

[0598] Fragmentos de DNA que abrangem as regiões de 200 bp de EIN2 de tipo selvagem (SEQ ID NO:19) e os cDNAs de CHS (SEQ ID NO:20) foram amplificados por PCR a partir do cDNA de Arabidopsis thaliana Col-0 usando os pares de iniciador de oligonucleotídeo EIN2wt-F (SEQ ID NO:66) e EIN2wt-R (SEQ ID NO:67) ou CHSwt-F (SEQ ID NO:68) e CHSwt-R (SEQ ID NO:69), respectivamente. Os fragmentos foram inseridos no pGEMT-Easy como nos construtos em grampo GUS (Exemplo 6). Fragmentos de DNA que compreende os fragmentos EIN2 [G:U] de sentido modificados de 200 bp (SEQ ID NO:22) e fragmentos CHS [G:U] (SEQ ID NO:24) ou EIN2 antissentido modificado de 200 bp (SEQ ID NO:25) e fragmentos antissentido modificados CHS[G:U] (SEQ ID NO:26), cada um flanqueado por sítios de enzimas de restrição, foram montados por anelamento dos respectivos pares de oligonucleotídeos EIN2gu-F + EIN2gu-R, CHSgu -F + CHSgu-R, asEIN2gu-F + asEIN2gu-R e asCHSgu-F + asCHSgu-R (SEQ ID NOs: 70-77), seguidos por extensão de PCR das extremidades 3 ‘usando a polimerase LongAmp Taq. Todos os fragmentos de PCR modificados por G:U foram clonados no vetor pGEM-T Easy e as sequências de nucleotídeos pretendidas foram confirmadas por sequenciamento. O CHS [wt]:: EIN2 [wt], CHS [G:U]: EIN2 [G:U] e asCHS [G:U]: Os fragmentos de fusão: asEIN2 [G:U] foram preparados ligando os fragmentos de DNA CHS e EIN2 apropriados no sítio Xbal comum no plasmídeo pGEM-T Easy.

[0599] Os 35S:: fragmento de sentido:: Íntron PDK:: fragmento antissentido:: As cassetes OCS-T foram preparadas de maneira análoga à dos construtos hpGUS. Essencialmente, os fragmentos antissentido foram excisados dos respectivos plasmídeos pGEM-T Easy por digestão com HmdIII e BamHI, e inseridos no pKannibal entre os sítios BamHI e HmdIII, para que estivessem na orientação antissentido em relação ao promotor 35S. Os fragmentos sensoriais foram então excisados do respectivo plasmídeo pGEM-T Easy usando Xhol e Kpnl e inseridos nos mesmos sítios do clone antissentido apropriado. Todos os cassetes nos plasmídeos pGEM-T Easy foram excisadas com Noil e inseridas no pART27 para formar os vetores binários finais para a transformação da planta.

[0600] Os alinhamentos das sequências de nucleotídeos sentido [G:U] e antissentido [G:U] modificadas com as sequências correspondentes do tipo selvagem, mostrando as posições dos nucleotídeos substituídos, são mostrados nas Figuras 22 a 25. Os desenhos dos cassetes de expressão para os RNAs em grampo são mostrados esquematicamente na Figura 26.

[0601] A energia livre prevista de formação dos RNAs em grampo foi estimada usando o programa FOLD. Estes foram calculados como (kcal/mol): hpEIN2 [wt], -453,5; hpEIN2 [G:U], -328,1; hpCHS [wt], -507,7; hpCHS [G:U] -328,5; hpEIN2 [G:U/U:G], - 173,5; hpCHS [G: Y/U:G], -186,0; hpCHS:: EIN2 [wt], -916,4; hpCHS:: EIN2 [G:U], - 630,9; hpCHS:: EIN2 [G:U/U:G), -333,8.

TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA

[0602] Todos os construtos EIN2, CHS e EIN2/CHS quimérico foram usados para transformar plantas da raça Col-0 de Arabidopsis thaliana usando o método de imersão floral (Clough e Bent, 1998). Para selecionar as plantas transgênicas, as sementes coletadas das flores mergulhadas em Agrobacterium foram esterilizadas com cloro gasoso e plaqueadas em meio MS contendo 50 mg/l de canamicina. Múltiplas linhagens transgênicas foram obtidas para todos os nove construtos (Tabela 1). Esses transformantes primários (geração T1) foram transferidos para o solo, autofertilizados e cultivados até à maturidade. A semente coletada dessas plantas (semente T2) foi usada para estabelecer plantas T2 e triada para linhagens que fossem homozigotas para o transgene. Essas foram usadas para analisar o silenciamento de EIN2 e CHS. TABELA 1. SUMÁRIO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS OBTIDAS EM FUNDO COL-0 Número de linhagens Construto transgênicas obtidas hpEIN2[wt] 46 hpCHS[wt] 34 hpEIN2[G:U] 23 hpCHS[G:U] 32 hpEIN2[G:U/U:G] 52 hpCHS[G:U/U:G] 13 hpCHS::EIN2[wt] 28 hpCHS::EIN2[G:U] 26 hpCHS::EIN2[G:U/U:G] 20 ANÁLISE DA EXTENSÃO DO SILENCIAMENTO DE EIN2

[0603] O EIN2 é um gene em A. thaliana que codifica uma proteína receptora envolvida na percepção do etileno. O gene é expresso em mudas logo após a germinação das sementes, bem como posteriormente no crescimento e desenvolvimento das plantas. Plântulas mutantes EIN2 exibem alongamento de hipocótilo em relação a mudas isogênicas do tipo selvagem quando germinadas no escuro na presença de ácido 1-aminociclopropano-l-carboxílico (ACC), um intermediário na síntese de etileno nas plantas. A expressão do gene EIN2 e a extensão do silenciamento nas plantas transgênicas foram, portanto, analisadas germinando sementes em meio MS contendo 50 μg/l de ACC na escuridão total e medindo seu comprimento de hipocótilo, em comparação com as mudas do tipo selvagem. O comprimento do hipocótilo foi um fenótipo fácil de medir e foi um bom indicador da extensão da redução na expressão do gene EIN2, indicando diferentes níveis de silenciamento do EIN2. Esperava-se que plantas com expressão de gene EIN2 silenciada apresentassem vários graus de alongamento de hipocótilo, dependendo do nível de silenciamento de EIN2, algures no intervalo entre mudas do tipo selvagem (hipocótilos curtos) e mudas mutantes nulas (hipocótilos longos). Sementes de 20 plantas selecionadas aleatoriamente, transformadas independentemente para cada construto foram testadas. Sementes de uma planta das 20 que contêm o hpCHS: O construto: EIN2 [G:U] não germinou. Os dados para o comprimento do hipocótilo são mostrados na Figura 27.

[0604] As linhagens hpEIN2 [wt] mostraram uma faixa considerável na extensão do silenciamento de EIN2, com 7 linhagens (linhagens de plantas 2, 5, 9, 10, 12, 14, 16 na Figura 27) mostrando claramente baixos níveis de silenciamento ou o mesmo hipocótilo comprimento em relação ao tipo selvagem e as outras 13 linhagens com silenciamento EIN2 moderado a forte. As plantas individuais dentro de cada linha independente tendiam a exibir um intervalo na extensão do silenciamento de EIN2, como indicado por diferenças no comprimento do hipocótilo. Por outro lado, apenas duas linhagens (linhagens de plantas 5, 18 na Figura 27) que compreende o construto hpEIN2 [G:U] mostraram silenciamento fraco de EIN2, com as 18 restantes mostrando silenciamento uniforme e forte de EIN2. Além disso, plantas individuais dentro de cada uma das 18 linhagens pareciam ter um silenciamento EIN2 relativamente uniforme em comparação com as plantas transformadas com o construto hpEIN2 [wt]. Os inventores concluíram que o construto de RNA com estrutura de grampo modificado por G:U foi capaz de conferir um silenciamento de genes mais consistente e menos variável de um gene endógeno que era mais uniforme e mais previsível do que o RNA com estrutura de grampo convencional, direcionado à mesma região do RNA endógeno.

[0605] As populações transgênicas de hpEIN2 [wt] e hpEIN2 [G:U] também diferiram na relação entre a extensão do silenciamento de EIN2 e o número de cópias do transgene. O número de cópias do transgene foi indicado pelas razões de segregação para o gene marcador de resistência à canamicina em plantas progênies - a 3:1 proporção de plântulas resistentes: suscetíveis, indicando uma inserção de locus único, enquanto uma proporção muito mais alta indicava inserções de transgene de múltiplos locais. Várias linhagens de número de cópias múltiplas transformadas com o construto hpEIN2 [wt] mostraram baixos níveis de silenciamento de EIN2, mas esse não foi o caso das linhagens hpEIN2 [G:U] em que ambas as linhagens de loci, única e múltipla, apresentaram forte silenciamento EIN2.

[0606] O gene EIN2 também estava silenciando nas mudas transformadas com o CHS:: RNA com estrutura de grampo de fusão EIN2. Semelhante às plantas que contêm o único construto hpEIN2 [G:U], as mudas hpCHS:: EIN2 [G:U] mostraram claramente um silenciamento mais uniforme do EIN2 nas linhagens independentes do que o hpCHS:: Mudas de EIN2 [wt]. O silenciamento entre plantas individuais dentro de uma linha independente também parecia ser mais uniforme para o hpCHS:: Linhas EIN2 [G:U] que as hpCHS:: Linhas EIN2 [wt]. Ao mesmo tempo, a extensão do silenciamento de EIN2 foi um pouco mais forte para os hpCHS altamente silenciados:: Plantas EIN2 [wt] do que as hpCHS:: Plantas EIN2 [G:U], semelhante à comparação entre plantas transformadas com hpGUS [wt] e hpGUS [G:U]. A comparação da extensão do silenciamento indicou que os construtos de fusão não induziram um silenciamento EIN2 mais forte do que o único construto hpEIN2 [G:U]. construto hpEIN2 [G:U].

[0607] Quando as plantas transformadas com os construtos G:U/U:G foram examinadas, onde os nucleotídeos da citidina (C) das sequências de sentido e antissentido foram modificados para nucleotídeos da timidina (T), foi observado pouco ou nenhum aumento no comprimento do hipocótilo. todas as 20 linhagens independentes analisadas em comparação com plantas do tipo selvagem. Isso foi observado para os hpEIN2 [G:U/U:G] e hpCHS:: Construtos EIN2 [G:U/U:G]. Esses resultados indicaram aos inventores que os construtos de RNA com estrutura de grampo com base em G:U/U:G com cerca de 46% de substituições não eram eficazes na indução do silenciamento de genes alvo, talvez porque o emparelhamento de base dos RNAs em grampo havia sido desestabilizado demais. Os inventores consideraram que duas razões possíveis poderiam ter contribuído para a ineficácia. Em primeiro lugar, a região de filamento duplo EIN2 dos RNAs em grampo tinha 92 pares de base G:U dos 200 pares de base potenciais entre as sequências de sentido e antissentido. Em segundo lugar, o alinhamento da sequência antissentido modificada com o complemento da sequência de sentido selvagem mostrou que as substituições de 49 C para T na sequência antissentido podem ter reduzido a eficácia da sequência antissentido para atingir o mRNA de EIN2. Os inventores concluíram a partir desta experiência que, pelo menos para o gene alvo EIN2, havia um limite superior ao número de substituições de nucleotídeos que podiam ser toleradas no

RNA com estrutura de grampo e ainda mantinham eficácia suficiente para silenciar. Por exemplo, 92/200 = 46% de substituições provavelmente foram uma porcentagem muito alta.

ANÁLISE DA EXTENSÃO DO SILENCIAMENTO DE CHS

[0608] As plantas transgênicas foram analisadas quanto ao nível de expressão do gene CHS por PCR de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) em RNA extraído de plantas inteiras, cultivadas in vitro em meio de cultura de tecidos. Os iniciadores utilizados para o mRNA de CHS foram: iniciador direto (CHS-200-F2), 5 '-GAC ATGCCTGGTGCTGACT A-3' (SEQ ID NO:78); iniciador reverso (CHS-200-R2) 5 '-CCTT AGCGAT ACGGAGGAC A-3' (SEQ ID NO:79). Os iniciadores utilizados para o gene de referência Actin2 usado como padrão foram: Iniciador direto (Actin2-For) 5'-TCCCTCAGCACATTCCAGCA-3' (SEQ ID NO:80) e iniciador reverso (Actin2-Rev) 5'-GATCCCATTCATAAAACCCCAG-3' (SEQ ID NO:81).

[0609] Os dados mostraram que o nível de mRNA de CHS acumulado nas plantas em relação ao mRNA de referência para o gene Actin2 diminuiu na faixa de 50 a 96% (Figura 28).

[0610] As sementes de A. thaliana completamente sem atividade de CHS têm uma cor pálida do revestimento das sementes em comparação com a cor marrom das sementes do tipo selvagem. Portanto, as sementes das plantas transgênicas foram examinadas visualmente quanto à sua cor do revestimento de sementes. Uma redução óbvia da cor do revestimento das sementes foi observada em sementes de várias plantas, mas não em outras plantas, apesar da redução no mRNA de CHS nas folhas dessas plantas. Considerou-se, no entanto, que o fenótipo de cor do revestimento de sementes era exibido apenas quando a atividade de CHS era quase completamente abolida no revestimento de sementes em desenvolvimento durante o crescimento das plantas. Além disso, o promotor 35S pode não ter sido suficientemente ativo no revestimento de sementes em desenvolvimento para fornecer o nível de redução na atividade de CHS para fornecer o fenótipo de semente pálida observado em mutantes nulos. Melhoria no fenótipo visual da cor do revestimento da semente pode ser obtida usando um promotor que é mais ativo no revestimento da semente.

REDUÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE PDS EM ARABIDOPSIS THALIANA

[0611] Outro gene Arabidopsis foi selecionado como um gene alvo exemplificativo, ou seja, o gene fitoeno dessaturase (PDS) que codifica a enzima fitoeno dessaturase que catalisa a dessaturação de fitoeno para zeta-caroteno durante a biossíntese de carotenoides. Esperava-se que o silenciamento de PDS resultasse no fotobranqueamento de plantas de Arabidopsis, o que poderia ser facilmente observado visualmente. O construto de hpRNA modificado em por G:U foi, portanto, produzido e testado em comparação com um construto de hpRNA tradicional direcionado a uma sequência de mRNA de PDS de 450 nucleotídeos. A sequência de PDS de 450 nucleotídeos continha 82 citosinas (C) que foram substituídas por timidinas (T), resultando em 18,2% dos pares de base na região de dsRNA do hpPDS[G:U] de hpRNA serem pares de bases G:U. O construto genético que codifica hpPDS[G:U] e o construto genético de controle que codifica hpPDS[WT] foram introduzidos em ecótipo Col-0 de Arabidopsis thaliana usando transformação mediada por Agrobacterium.

[0612] Para os construtos hpPDS[WT] e hpPDS[G:U], 100 e 172 linhagens transgênicas foram identificadas,

respectivamente.

Surpreendentemente, todas essas linhagens mostraram fotobranqueamento nos cotilédones de mudas T1 jovens que emergiram em meio seletivo resistente à canamicina, sem nenhuma diferença óbvia entre as duas populações transgênicas nesse estágio inicial de crescimento da planta.

Essas indicaram que os dois construtos foram igualmente eficazes na indução de silenciamento de PDS em cotilédones.

No entanto, algumas das plantas T1 desenvolveram folhas verdadeiras que não eram mais fotobranqueadas e pareciam verdes ou verdes claras, indicando que o silenciamento de PDS foi liberado ou enfraquecido nas folhas verdadeiras.

A proporção de linhagens transgênicas mostrando folhas verdes verdadeiras foi muito maior para a população hpPDS[WT] do que para a população hpPDS[G:U]. As plantas transgênicas foram agrupadas em três categorias diferentes com base em silenciamento de PDS forte (fotobranqueamento forte em toda a planta), silenciamento de PDS moderado (folhas verdes claras ou manchadas) e silenciamento de PDS fraco (folhas totalmente verdes ou fracamente manchadas). A proporção de plantas com silenciamento de PDS fraco foi de 43% para as linhagens hpPDS[WT], em comparação com 7% para as linhagens hpPDS[G:U]. Na verdade, todas as linhagens hpPDS[G:U] do grupo de silenciamento fraco ainda exibiam manchas suaves nas folhas verdadeiras, em contraste com as plantas hpPDS[WT] fracamente silenciadas que, em sua maioria, tinham folhas totalmente verdes.

Esses resultados indicaram que o construto de hpRNA modificado com G:U proporcionou um silenciamento PDS mais uniforme através da população transgênica independente do que o construto hpPDS convencional (emparelhamento em base totalmente canônico), o que foi consistente com os resultados de ensaios de silenciamento de GUS e EIN2 descritos acima. Mais significativamente, os resultados do silenciamento de PDS indicaram uma variabilidade de desenvolvimento do silenciamento do gene induzido pelo transgene de hpRNA em plantas que não foi notado antes, e sugeriram que o silenciamento do transgene de hpRNA foi mais eficiente e estável nos cotilédones do que nas folhas verdadeiras. De acordo com o silenciamento uniforme de genes através das linhagens independentes, o resultado de silenciamento de PDS sugeriu que o transgene de hpRNA modificado por G:U era mais estável em termos de desenvolvimento do que o construto de hpRNA convencional, proporcionando silenciamento mais estável e duradouro. EXEMPLO 11. ANÁLISE DE SRNAS A PARTIR DE CONSTRUTOS

DE RNA COM ESTRUTURA DE GRAMPO

[0613] A hibridização de Northern blot foi realizada em amostras de RNA para detectar sRNAs antissentido de plantas hpEIN2 [G:U] e comparar sua quantidade e seus tamanhos aos sRNAs produzidos a partir de hpEIN2 [wt]. A sonda era uma sonda de RNA marcada com <32> P correspondente à sequência de detecção de 200 nucleotídeos no construto hpEIN2 [wt] e a hibridização foi realizada sob condições de baixo rigor para permitir a detecção de sequências mais curtas (20- 24 nucleotídeos). A Autorradiografia do Northern blot sondado é mostrada na Figura 29. Esta experiência mostrou que o RNA com estrutura em grampo em hpEIN2 [G:U] foi processado em sRNAs e o nível de acumulação foi relativamente uniforme nas 9 plantas hpEIN2 [G:U] transformadas independentemente analisadas em comparação com as das linhagens hpEIN2 [wt]. Semelhante ao experimento análogo para os RNAs em grampo GUS,

uma diferença na mobilidade das duas bandas de sRNA antissentido do hpEIN2 [G:U] em comparação com as duas principais bandas do hpEIN2 [wt] era bastante evidente. Isso foi mais bem visto ao comparar a mobilidade das bandas nas faixas adjacentes 10 e 11 da Figura 28.

[0614] Para investigar melhor isso, as pequenas populações de RNA do hpEIN2 [wt] e hpEIN2 [G:U] são analisadas por sequenciamento profundo das populações totais de sRNA isoladas de plantas inteiras. Foi determinada a proporção de cada população mapeada para as regiões de filamento duplo do hpEIN2 [wt] e hpEIN2 [G:U]. De cerca de 16 milhões de leituras em cada população, cerca de 50.000 sRNAs mapeados para a região de cadeia dupla hpEIN2 [wt], enquanto apenas cerca de 700 mapeados para hpEIN2 [G:U]. Isso indicou que muito menos sRNAs foram gerados a partir do grampo [G:U]. Também foi observado um aumento na proporção de 22 mers específicos para EIN2.

[0615] A Figura 29 mostrou que tanto as linhagens de hpRNA tradicionais (totalmente canonicamente pareados) quanto as modificadas com G:U acumularam duas frações de tamanho dominantes de siRNAs. Consistente com relatórios anteriores, os siRNAs dominantes das linhagens de hpRNA tradicionais migraram de forma semelhante aos marcadores de tamanho de sRNA de 21 e 24 nt. No entanto, as duas bandas de siRNA dominantes de ambos os transgenes modificados por G:U migraram ligeiramente mais rápido no gel, sugerindo que as mesmas tinham um tamanho menor ou modificações químicas de terminal diferentes daquelas dos transgenes hpRNA tradicionais.

[0616] Para investigar se o perfil de tamanho de siRNAs pode diferir entre os dois tipos diferentes de construtos, RNAs pequenos foram isolados de uma linhagem hpGUS[WT] e duas linhagens de cada um de hpGUS[G:U], hpEIN2[WT] e hpEIN2[G:U] e sequenciadas usando a plataforma Illumina, resultando em aproximadamente 16 milhões de leituras de sRNA para cada amostra.

Amostras de duas linhagens hpGUS[1:4] fortemente silenciadas também foram sequenciadas.

Foi determinado o número de sRNAs que mapearam para as regiões de filamento duplo e a região espaçadora do íntron dos RNAs em grampo.

Os siRNAs também foram mapeados para as regiões a montante e a jusante no mRNA de GUS alvo e no mRNA de ENI2 para detectar siRNAs transitivos.

Os dados de sequenciamento confirmaram que as linhagens hpGUS[G:U], como as linhagens hpGUS[WT], geraram siRNAs abundantes, enquanto que as linhagens hpGUS[1:4] também geraram siRNAs, mas com uma abundância muito menor.

Os níveis mais baixos de siRNAs das linhagens hpGUS[1:4] foram consistentes com a eficiência relativamente baixa de silenciamento de GUS por hpGUS[1:4] e sugeriram que a estabilidade termodinâmica baixa da haste de dsRNA em RNA de hpGUS[1:4] reduziu a eficiência de processamento Dicer em relação ao grampo tradicional.

Não houve diferença clara na distribuição de tamanho de siRNAs entre as linhagens de hpRNA tradicionais e incompatíveis, apesar da mudança clara na mobilidade de siRNAs antissentido mostrada no Northern blot, com todas as amostras mostrando o sRNA de 21 nt como a classe de tamanho dominante.

Houve algumas diferenças sutis na abundância proporcional dos siRNAs antissentido de 22 nt entre as linhagens de hpGUS tradicionais e incompatíveis: as linhagens hpGUS[G:U] e hpGUS[1:4] mostraram uma proporção mais alta da classe de tamanho de 22 nt do que a linhagem hpGUS[WT]. Uma característica distinta dos dados de sequenciamento para as linhagens de hpRNA tanto tradicionais quanto incompatíveis foi que os siRNAs de 24 nt mostraram abundância muito mais baixa do que os siRNAs de 21 nt em todas as amostras, ou seja, cerca de 3 a 21 vezes menos para os siRNAs de sentido de 24 nt e cerca de 4 a 35 vezes menos para os siRNAs antissentido de 24 nt. Isso diferiu marcadamente do Resultado de Northern blot que mostrou quantidades relativamente iguais das duas classes de tamanho dominantes. Também foi interessante notar que as amostras hpEIN2[WT]-7 e hpEIN2[G:U]-14/15 mostraram abundância semelhante de siRNAs antissentido no Northern blot, mas nos dados de sequenciamento as linhagens hpEIN2[G:U] proporcionaram números muito menores de leituras de siRNA antissentido de 20 a 24 nt totais (17.290 e 29.211) do que a linhagem hpEIN2[WT]-7 (134.112 leituras).

[0617] Para as linhagens tanto hpGUS[G:U] quanto hpEIN2[G:U], quase todos os siRNAs de sentido corresponderam à sequência de sentido modificada por G:U do hpRNA, enquanto que a maioria dos siRNAs antissentido tinha a sequência antissentido de tipo selvagem. Isso indicou que a grande maioria desses siRNAs de sentido e antissentido foram processados diretamente a partir dos transcritos de hpRNA [G:U] primários, mas não devido à amplificação mediada por RDR dos transcritos de hpRNA ou RNA alvo, que de outra forma gerariam siRNAs tanto de sentido quanto antissentido das mesmas sequências modelo. Consistente com isso, apenas um pequeno número de leituras de sRNA de 20 a 24 nt (siRNAs transitivos) foi detectado a partir da região do laço (íntron PDK) dos transgenes de hpRNA ou a região não direcionada a jusante do mRNA de GUS ou EIN2. No entanto, as duas linhagens de hpGUS[1:4] mostraram uma proporção relativamente alta de siRNAs de sentido do tipo selvagem, sugerindo que o silenciamento de GUS forte nessas duas linhagens, um caso relativamente raro para a população de hpGUS[1:4], pode envolver amplificação de RDR. De fato, uma quantidade maior de siRNAs foi detectada a partir da sequência do gene alvo a jusante da região alvo de hpRNA do que da haste de dsRNA nas linhagens hpGUS[1:4], indicando a presença de silenciamento transitivo nessas linhagens.

[0618] Tomados em conjunto, os dados de sequenciamento de sRNA indicaram que siRNAs das linhagens de hpRNA tradicionais e incompatíveis tinham um perfil de tamanho semelhante, com exceção da classe de tamanho de 22 nt, sugerindo que a migração diferencial detectada por Northern blot foi devido a modificações químicas em 5’ ou 3’. A discrepância na abundância relativa de sRNA (por exemplo, os siRNAs derivados de hpEIN2[WT] versus hpEIN2[G:U] e os de 21 nt versus os de 24 nt) entre o resultado de Northern blot e os dados de sequenciamento implica que os as populações de siRNA e classes de tamanho diferentes podem ter eficiências de clonagem diferentes durante a preparação da biblioteca de sRNA.

[0619] Os sRNAs de plantas são conhecidos por terem um grupo 2'-O-metila no nucleotídeo de terminal 3’ que se acredita que estabilize os sRNAs. Foi mostrado anteriormente que essa metilação de 3’ inibe, mas não impede, a ligação do adaptador 3' reduzindo a eficiência de clonagem de sRNA (Ebhardt et al 2005). Portanto, os siRNAs derivados de hpRNA[WT] e hpRNA[G:U] foram com periodato de sódio em ensaios de eliminação β. O tratamento não causou uma mudança na mobilidade em gel para os siRNAs derivados tanto de hpRNA[WT] quanto de hpRNA[G:U], indicando que ambas as populações de siRNA foram metiladas no terminal 3’ e não houve diferença na modificação química de 3' entre os siRNAs derivados de hpRNA[WT] e de hpRNA[G:U].

[0620] O protocolo de sequenciação de sRNA padrão é com base em sRNAs que têm monofosfato de 5’ permitindo a ligação do adaptador de 5' (Lau et al., 2001). Foi assumido que os sRNAs processados por Dicer têm monofosfato de 5’, mas em C. elegans foi constatado que muitos siRNAs possuem di ou trifosfato no terminal 5’, o que altera a mobilidade em gel de sRNAs e impede a ligação do adaptador de 5' de sRNA no procedimento de clonagem de sRNA padrão (Pak e Fire 2007). Era desconhecido se os RNAs das plantas também têm fosforilação de 5’ diferencial. O estado de fosforilação de 5’ dos siRNAs derivados de hpRNA[WT] e hpRNA[G:U] foi, portanto, examinado tratando-se o RNA total com fosfatase alcalina seguida por hibridização Northern blot. Esse tratamento reduziu a mobilidade em gel para todos os sRNAs derivados de hpRNA, indicando a presença de fosforilação de 5’. No entanto, os siRNAs derivados de hpRNA[G:U] mostraram maior mudança de mobilidade do que os siRNAs derivados de hpRNA[WT] após o tratamento com fosfatase, resultando em dois grupos de siRNAs desfosforilados que migram na mesma posição no gel. Os marcadores de tamanho de sRNA de 21 e 24 nt foram marcados radioativamente na extremidade 5’ com 32P usando a reação de polinucleotídeo quinase e, portanto, devem ter um terminal 5’ monofosforilado. Isso sugeriu que os siRNAs derivados de hpRNA[WT], que migram nas mesmas posições que os marcadores de tamanho, eram provavelmente siRNAs monofosforilados, enquanto que os siRNAs derivados de hpRNA[G:U], que migram mais rápido, têm mais de um fosfato no terminal 5’. Assim, concluiu-se que os siRNAs produzidos a partir dos transgenes hpRNA tradicionais e modificados por G:U em células vegetais foram fosforilados de forma diferente. EXEMPLO 12. ANÁLISE DE METILAÇÃO DO DNA DE PLANTAS SILENCIADAS EIN2

[0621] Os resultados do silenciamento GUS e EIN2 indicaram que os construtos de hpRNA com sequências de sentido não modificadas induziam níveis altamente variáveis de silenciamento de genes alvo em comparação com os construtos com sequências de sentido modificadas, proporcionando pares de base G:U. Como descrito acima, a região promotora do construto hpGUS[G:U] parecia ter menos metilação em comparação com o construto hpGUS [wt]. Para testar a metilação do DNA e comparar as plantas transgênicas hpEIN2 [wt] e hpEIN2 [G:U], 12 plantas de cada população foram analisadas quanto à metilação do DNA no promotor 35S e na região de junção EIN2 com sentido do promotor 35S usando o método McrBC . Os primers utilizados para a região do promotor 35S: Iniciador direto (Top-35S-F2), 5'- AGAAAATYTTYGTYAAYATGGTGG-3' (SEQ ID NO:82), iniciador reverso (Top-35S-R2), 5 '-TC ARTRRARATRTC AC ATC AATCC-3' (SEQ ID NO:83). Os primers usados para a região de junção EIN2 do sentido do promotor 35S: Iniciador direto (Link-35S-F2), 5 '- YYATYATTGYGATAAAGGAAAGG-3' (SEQ ID NO:84) e iniciador reverso (Link-EIN2-R2), 5 '-T AATTRCC ACC AARTC ATACCC-3' (SEQ ID NO:85). Em cada uma dessas sequências iniciadoras, Y = C ou T e R = A ou G.

[0622] A quantificação da extensão da metilação do DNA foi determinada através da realização de ensaios de PCR em tempo real. Para cada planta, o quociente foi calculado: taxa de amplificação do fragmento de DNA após tratamento do

DNA genômico com McrBC/taxa de amplificação do fragmento de DNA sem tratamento do DNA genômico com McrBC.

[0623] Quase todas as plantas de hpEIN2 [wt] apresentaram níveis significativos de metilação do DNA no promotor 35S, particularmente na junção 35 S-EIN2, mas alguns mais que outros. Como mostrado nas Figuras 30 e 31, as linhagens de plantas representadas nas faixas 1, 4, 7, 9, 1 1 e 12 mostraram forte silenciamento de EIN2, como mostrado pelos comprimentos mais longos do hipocótilo. Por outro lado, as outras seis linhagens representadas nas faixas 2, 3, 5, 6, 8 e 10 exibiram um silenciamento EIN2 relativamente fraco, resultando em hipocótilos mais curtos. Essas linhagens silenciadas mais fracas mostraram mais metilação do DNA nas sequências promotora e de junção, conforme indicado por uma intensidade da banda de PCR muito mais baixa quando o DNA genômico foi pré-digerido com McrBC. Os ensaios quantitativos de PCR em Tempo real (qPCR) confirmaram essas observações (Figura 31). Todas as 12 das linhagens testadas mostraram alguma extensão da metilação do DNA na região promotora 35S e na região de junção no sentido S-35 ("junção"). A maior extensão de metilação, isto é, o quociente mais baixo nos ensaios de qPCR, foi para as linhagens 2, 3, 5, 6, 8 e 10 da hpEIN2, correlacionando-se perfeitamente com a extensão reduzida do silenciamento, medida pelo comprimento do hipocótilo. Estes resultados confirmaram que o silenciamento reduzido de EIN2 em algumas das linhagens hpEIN2 [wt] estava associado ao aumento da metilação do promotor. Mesmo nas linhagens de plantas hpEIN2 [wt] que foram silenciadas por EIN2, ainda havia níveis consideráveis de metilação do DNA, particularmente da região do fragmento de junção EIN2 no sentido 35S. Quando os promotores são metilados, acredita-se que isso cause silenciamento transcricional. No caso de construtos de silenciamento, como aqui, esta é uma forma de "silenciamento automático".

[0624] Em contraste com as linhagens hpEIN2 [wt], as linhagens hpEIN2 [G:U] mostraram menos metilação do DNA no promotor 35S e na junção 35S-EIN2. De fato, quatro dessas linhagens de 12 G:U, correspondentes às pistas 1, 2, 3 e 7 na Figura 30 (pistas 13, 14, 15 e 20 na Figura 31), não tinham metilação óbvia de DNA, conforme indicado pela força igual de Bandas de PCR entre amostras tratadas com McrBC e não tratadas. Quando essas amplificações foram quantificadas por qPCR, seis das 12 linhagens mostraram pouca ou nenhuma redução no fragmento do tratamento McrBC e, portanto, pouca ou nenhuma metilação do DNA - ver painel inferior da Figura 31, linhagens 13, 14, 15, 18, 19 e 20. Estes resultados indicaram que o silenciamento relativamente uniforme de EIN2 pelo construto hpEIN2 [G:U], pelo menos em algumas linhagens, foi devido a uma menor metilação do promotor e, portanto, menos silenciamento transcricional em comparação com o hpEIN2 [wt].

[0625] Estas conclusões foram ainda confirmadas pela análise do DNA genômico das linhagens de plantas transgênicas com sequenciamento de bissulfeto. Este ensaio utilizou o fato de que o tratamento de DNA com bissulfeto converteu bases de citosina não metiladas no DNA em uracila (U), mas deixou as bases de 5 metilcitosina (mC) inalteradas. Após o tratamento com bissulfeto, o segmento definido de DNA de interesse foi amplificado nas reações de PCR de uma maneira pela qual apenas a cadeia de sentido do DNA tratado foi amplificada. O produto de PCR foi então sujeito a sequenciação em massa, revelando as posições e extensão da metilação de bases de citosina individuais no segmento de DNA. Portanto, o ensaio produziu informações de resolução de nucleotídeo único sobre o status de metilação de um segmento de DNA.

[0626] As três linhagens de plantas que mostram os níveis mais fortes de silenciamento de EIN2 para cada um dos hpEIN2 [wt] e hpEIN2 [G:U] foram analisadas por sequenciamento de bissulfeto, correspondendo às hpEIN2 [wt] linhagens 1, 7 e 9 e hpEIN2 [G:U] linhagens 13, 15 e 18 na Figura 31. Estas linhagens de plantas apresentaram os maiores comprimentos de hipocótilo e, portanto, esperava-se que tivessem os níveis mais baixos de metilação do DNA das 20 linhagens para cada construto. Os resultados são apresentados nas Figuras 32 e 33 para hpEIN2 [wt] e hpEIN2 [G:U], respectivamente. Quando comparado, ficou claro que numerosas citosinas na região promotora 35S e na região de sentido EIN2 nas plantas hpEIN2 [wt] foram extensivamente metiladas. Em claro contraste, as três linhagens de plantas hpEIN2 [G:U] apresentaram níveis muito mais baixos de metilação da citosina na região promotora 35S. EXEMPLO 13. NÍVEIS DE METILAÇÃO DO DNA NO PROMOTOR DO CONSTRUTO HPGUS [L: 41

[0627] Quando o DNA genômico isolado das plantas hpGUS [l: 4] foi analisado quanto à metilação do DNA usando os métodos McrBC e bissulfeto, conforme descrito acima, observou- se da mesma forma que havia menos metilação das bases da citosina no sentido do promotor 35S e do promotor 35S-GUS regiões de sequência relativas às plantas hpGUS [wt]. DISCUSSÃO GERAL RELATIVA AOS EXEMPLOS 10 A 13 O RNA DE FILAMENTO DUPLO COM PARES DE BASE G:U INDUZ

UM SILENCIAMENTO GENÉTICO MAIS UNIFORME QUE O DSRNA CONVENCIONAL

[0628] Como os construtos GUS, hpEIN2 [G:U] e hpCHS: EIN2 [G:U] induziram um silenciamento EIN2 mais consistente e uniforme do que o respectivo hpRNA [wt] que codifica um RNA com estrutura de grampo convencional. A uniformidade ocorreu não apenas através de muitas linhagens transgênicas independentes, mas também entre plantas irmãos dentro de uma linha transgênica, cada uma com a mesma inserção transgênica. Além da uniformidade, a extensão do silenciamento de EIN2 induzida por hpEIN2 [G:U] foi próxima à das linhagens hpEIN2 [wt] fortemente silenciadas. A análise do silenciamento do gene CHS indicou que o construto hpCHS [G:U] foi eficaz na redução dos níveis de mRNA de CHS em 50 a 97%, mas poucas plantas mostraram um fenótipo claramente visível na cor reduzida do revestimento de sementes. A provável explicação para a ausência de fenótipos mais visíveis na cor do revestimento das sementes foi que mesmo níveis baixos de atividade do CHS podem ser suficientes para produzir os pigmentos flavonoides. Outras explicações possíveis foram que o promotor 35S não era suficientemente ativo no revestimento de sementes em desenvolvimento para produzir o fenótipo, ou que a sequência de construto hpCHS [G:U] continha 65 substituições de citosina (32,5%), em comparação com apenas 43 (21,5%) para a sequência EIN2 e 52 (26%) para a sequência GUS. Além disso, muitas dessas bases de citosina na sequência CHS ocorreram em conjuntos de duas ou três citosinas consecutivas, de modo que nem todas precisam ser substituídas. Quando todas as citosinas no filamento de sentido foram substituídas, isso resultou em mais pares de base G:U no hpCHS [G:U] RNA do que nos RNAs hpEIN2 [G:U] e hpGUS [G:U], talvez mais do que ótimo. Para verificar isso, outro conjunto de construtos de CHS é feito usando uma sequência contendo uma gama de substituições de citosina, entre cerca de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de bases de citosina substituídas. Esses construtos são testados e um nível ideal determinado. AS LINHAGENS HPEIN2 [G:U] EXPRESSAM NÍVEIS MAIS

UNIFORMES DE RNASI

[0629] Consistente com o silenciamento do gene EIN2 relativamente uniforme, as linhagens hpEIN2 [G:U] acumularam sRNAs com um nível mais uniforme nas linhagens independentes. Isto confirmou a conclusão com os construtos de hpGUS que o hpRNA modificado por [G:U] foi processado eficientemente por Dicer e capaz de induzir silenciamento de gene alvo eficaz.

OS CONSTRUTOS DE FUSÃO TAMBÉM FORNECEM SILENCIAMENTO DE GENES

[0630] O objetivo de incluir os construtos de fusão CHS: EIN2 no experimento foi testar se dois genes-alvo poderiam ser silenciados com um único construto que codifica grampo. O experimento GUS sugeriu que a energia livre e, portanto, a estabilidade do RNA com estrutura de grampo se correlacionava positivamente com a extensão do silenciamento do gene alvo. Os resultados mostraram que o construto de fusão CHS: EIN2 resultou no silenciamento de ambos os genes - para CHS pelo menos no nível do mRNA.

[0631] Os dois construtos de hpRNA, hpEIN2 [G:U/U:G] e hpCHS: EIN2 [G:U/U:G], nas quais as sequências de sentido e antissentido foram modificadas de C para T, de modo que 46% dos pares de base foram convertidos de pares de base canônicos em pares de base G:U, induziu apenas silenciamento fraco ou inexistente de EIN2 na maioria das plantas transgênicas. As explicações possíveis incluem: i) havia muitos pares de base G:U que resultaram em processamento Dicer ineficiente; e ii) sRNAs que se ligam ao mRNA alvo, incluindo muitos pares de base G:U não induziram a clivagem eficiente do mRNA ou uma combinação de fatores.

A UNIFORMIDADE AUMENTADA NO SILENCIAMENTO DO GENE ALVO PELAS CONSTRUTOS COM BASE EM G:U ESTÁ ASSOCIADA À METILAÇÃO REDUZIDA DO PROMOTOR

[0632] A análise de metilação do DNA usando a PCR de digestão com McrBC e o sequenciamento de bissulfeto mostrou que todas as linhagens de plantas hpEIN2 [wt] mostraram metilação do DNA na região promotora, e o grau de metilação se correlacionou negativamente com o nível de silenciamento do EIN2. Até as três linhagens menos metiladas, a julgar pela PCR de digestão com McrBC, apresentaram níveis de metilação de DNA de 40% no promotor 35S, em relação a todas as citosinas sendo metiladas. Pensa-se que a metilação generalizada do promotor se deva à metilação do DNA dirigida por sRNA na sequência de repetição EIN2 que se espalhou para a região promotora adjacente. Em contraste com as linhagens de plantas de hpRNA [wt], várias linhagens de hpEIN2 [G:U] mostraram pouca ou nenhuma metilação do promotor e a maioria das plantas analisadas mostrou menos citosinas metiladas. Conforme discutido para as linhagens hpGUS, vários fatores podem contribuir para a metilação reduzida: i) a estrutura do DNA de repetição invertida foi interrompida alterando as bases C para bases T na sequência de sentido e ii) o sentido da sequência EIN2 não possuía citosinas, por isso não poderia ser metilado por metilação de DNA direcionada por sRNA; e iii) um nível reduzido de produção de RNAs de 24 meros devido à alteração na estrutura da região dsRNA com os pares de base G:U, resultando em alterações no reconhecimento por alguns Dicers e portanto, uma diminuição na atividade do Dicer 3 e/ou Dicer 4 e relativamente mais atividade do Dicer 2. Assim, o transgene hpEIN2 [G:U] pode se comportar como um transgene normal, não- RNAi (como um transgene de superexpressão) e a metilação do promotor observada em algumas das linhagens foi devida a padrões de inserção de T-DNA, e não à estrutura inerente de DNA de repetição invertida de um transgene de hpRNA. EXEMPLO 14. GRAMPOS MODIFICADOS PARA REDUZIR A

EXPRESSÃO DE OUTRO GENE ENDÓGENO

[0633] Construtos genéticas para produção de RNAs silenciadores modificados, tanto para RNAs em grampo quanto para ledRNAs, direcionado a outros genes endógenos, foram projetadas e sintetizadas. Estes incluíram o seguinte.

[0634] O gene FANCM em A. thaliana e em Brassica napus codifica uma proteína do Grupo M de Complementação de Anemia de Fanconi (FANCM), que é uma proteína helicase de RNA caixa DEAD/DEAH, números de acesso e NM_001333162 e XM_018659358. A sequência de nucleotídeos da região de codificação da proteína do cDNA correspondente ao gene FANCM de A. thaliana é fornecida no SEQ ID NO:31 e para B. napus na SEQ ID NO:32.

[0635] Construtos genéticos foram projetados e feitos para expressar RNAs em grampo com ou sem substituições de C para T e um ledRNA direcionado ao gene FANCM em A. thaliana e em Brassica napus. Uma região alvo no gene A. thaliana foi selecionada: nucleotídeos 675 a 1174 (500 nucleotídeos) da SEQ

ID NO:31. Uma região alvo no gene B. napus foi selecionada: nucleotídeos 896 a 1395 (500 bp) da SEQ ID NO:32. os construtos que codificam os RNAs em grampo, usando uma sequência de sentido selvagem ou uma sequência de sentido modificada (G:U), foram projetadas e montadas. Sequências nucleotídicas dos construtos hpFANCM-At [wt], hpFANCM-At [G:U], hpFANCM-Bn [wt] e hpFANCM-Bn [G:U] são fornecidas nas SEQ ID NOs: 33 a 36. Para fazer os construtos G:U, todas as bases de citosina nas sequências de sentido foram substituídas por bases de timina - 102/500 (fornecendo pares de base G:U de 20,4%) no construto A. thaliana e 109/500 (pares de base G:U de 21,8%) no construto B. napus. O trecho mais longo do emparelhamento de base canônico contíguo na região de filamento duplo do grampo modificado por B. napus G:U foi de 17 pares de base e o segundo maior de 16 pares de base contíguos.

[0636] O gene DDM1 em B. napus codifica uma metiltransferase que metila as bases da citosina no DNA (Zhang et al., 2018). A sequência de nucleotídeos da região de codificação da proteína do cDNA correspondente ao gene DDM1 de B. napus na SEQ ID NO:37.

[0637] Construtos genéticos foram projetados e feitos para expressar RNAs em grampo com ou sem substituições de C para T e um ledRNA direcionado ao gene DDM1 em Brassica napus. Foram selecionadas duas regiões alvo não contíguas do gene B. napus: nucleotídeos 504 a 815 e 1885 a 2074 da SEQ ID NO:37, e foram diretamente unidas para formar uma sequência de sentido quimérica. O comprimento total da sequência de sentido foi, portanto, de 502 nucleotídeos. os construtos que codificam os RNAs em grampo, usando uma sequência de sentido selvagem ou uma sequência de sentido modificada (G:U), foram projetadas e montadas. Sequências nucleotídicas dos construtos hpDDMl-Bn [wt] e hpDDMl-Bn [G:U] são fornecidas nas SEQ ID NOs: 38-39. Para fazer o construto G:U, as citosinas nas sequências de sentido foram substituídas por tiriminas - 106/502 (21,1% de pares de base G:U) no construto B. napus. O trecho mais longo do emparelhamento de base canônico contíguo na região de filamento duplo do grampo modificado por G:U foi de 20 pares de base e o segundo maior de 15 pares de base contíguos.

[0638] Para outro construto direcionado a um gene endógeno, um construto genético foi projetado para expressar um RNA com estrutura de grampo com substituições de 95 C a T na sequência de sentido, de 104 C na sequência dos 350 nucleotídeos, proporcionando 95/350 = 27,1% G: Pares de bases U na região de filamento duplo do RNA com estrutura de grampo. Ou seja, nem todos os C na sequência de sentido foram substituídos por T. Em particular, onde uma execução de 3, 4 ou 5 Cs contíguos ocorreu na sequência de sentido, apenas 1 ou 2 dos três Cs, ou apenas 2 ou 3 de quatro Cs, ou apenas 2, 3 ou 4 de 5 C's contíguos, foram substituídos por T's. Isso proporcionou uma distribuição mais uniforme dos pares de base G:U na região de RNA de filamento duplo. O trecho mais longo do emparelhamento de base canônico contíguo na região de filamento duplo foi de 15 pares de base e o segundo maior de 13 pares de base contíguos.

[0639] Um construto adicional foi projetado onde um ou dois pares de base em cada bloco de 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos foram modificados com substituições C a T ou A G. Onde a sequência de sentido do tipo selvagem tinha um trecho de 8 ou mais nucleotídeos consistindo de T ou G, um ou mais nucleotídeos foram substituídos no fio de sentido para criar um nucleotídeo incompatível dentro desse bloco ou uma substituição de C para T ou A para G foi feito na cadeia antissentido, de modo a evitar um trecho de cadeia dupla de 8 ou mais pares de base canônicos contíguos na região de cadeia dupla do RNA grampo resultante transcrito a partir do construto. EXEMPLO 15. GRAMPOS MODIFICADOS PARA REDUZIR A

EXPRESSÃO DE GENES EM CÉLULAS ANIMAIS

[0640] Para testar RNAs de silenciamento modificados em células animais, da forma de base G:U, da forma ledRNA ou da combinação das duas modificações, um gene que codifica uma proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) foi usado nas seguintes experiências como um gene-alvo modelo. A sequência de nucleotídeos da região de codificação para EGFP é mostrada na SEQ ID NO:40. Uma região alvo de 460 nucleotídeos foi selecionada, correspondendo aos nucleotídeos 131-591 da SEQ ID NO:40.

[0641] Um construto genético designado hpEGFP[wt] foi projetado e fabricado que expressava um RNA com estrutura de grampo que compreende, na ordem de 5 'a 3' em relação ao promotor de expressão, uma sequência antissentido de EGFP de 460 nucleotídeos que era totalmente complementar à região correspondente (nucleotídeos 131 a 590) da região de codificação de EGFP, uma sequência de laço de 312 nucleotídeos derivados em parte de uma região de codificação de GUS (correspondente aos nucleotídeos 802 a 1042 da ORG de GUS) e uma sequência de EGFP de sentido de 460 nucleotídeos que era idêntica em sequência aos nucleotídeos 131 a 590 da região codificadora de EGFP. A sequência do DNA que codifica o RNA com estrutura de grampo hpEGFP [wt] (SEQ ID NO:41) incluiu um sítio de enzima de restrição Nhel na extremidade 5' e um sítio de vela na extremidade 3' para fornecer clonagem no vetor pCI (Promega Corporação). Este vetor era adequado para experiências de transfecção de células de mamíferos e proporcionaria expressão do forte promotor/potenciador de CMV. O construto também tinha uma sequência promotora T7 inserida entre o sítio Nhel e o início da sequência antissentido para fornecer transcrição in vitro para produzir o RNA com estrutura de grampo usando a polimerase de RNA T7. A cassete de codificação em grampo foi inserida no sítio Nhel a Sail no vetor de expressão pCI, pelo que a região de codificação do ARN estava operacionalmente ligada ao promotor de CMV e à região de terminação de poliadenilação/transcrição tardia SV40.

[0642] Um construto em grampo correspondente que tinha substituições de 157 C para T na sequência de sentido e nenhuma substituição na sequência antissentido foi projetada e feita, designada hpEGFP [G:U] (SEQ ID NO:42). A região alvo na região codificadora de EGFP eram os nucleotídeos 131 a 590. A porcentagem de substituições C para T e, portanto, pares de base G:U no caule do RNA com estrutura de grampo foi de 157/460 = 34,1%. As sequências de sentido e antissentido eram idênticas em comprimento em 460 nucleotídeos. Na arte do silenciamento de genes, os RNAs longos de filamento duplo são geralmente evitados devido ao potencial de ativação da resposta celular, incluindo a ativação de interferon.

[0643] Um construto de ledRNA designada ledEGFP [wt] foi projetado e fabricado para expressar um ledRNA que compreende, na ordem de 5 'a 3' em relação ao promotor de expressão, uma sequência antissentido de EGFP de 228 nucleotídeos que era totalmente complementar aos nucleotídeos 131 a 358 de a sequência de codificação de EGFP, uma sequência de laço de 150 nucleotídeos, uma sequência de EGFP de sentido de 460 nucleotídeos que era idêntica em sequência aos nucleotídeos 131 a 590 da região de codificação de EGFP (SEQ ID NO:40), uma sequência de laço de 144 nucleotídeos e uma sequência antissentido de 232 nucleotídeos que era totalmente complementar aos nucleotídeos 359 a 590 da sequência de codificação de EGFP, flanqueada pelos sítios de restrição Nhel e Sail (SEQ ID NO:43). O ledRNA codificado era, portanto, do tipo mostrado na Figura 1 A. A estrutura do ledRNA, quando autoanelado por emparelhamento de base entre o sentido único e duas sequências antissentido, tinha uma região de cadeia dupla de 460 pares de base correspondentes à região alvo do EGFP, com as duas sequências antissentido não se uniram diretamente covalentemente uma à outra, mas com um "intervalo" ou "entalhe" entre as extremidades correspondentes aos nucleotídeos 358 e 359. A estrutura do ledRNA foi incorporada em um transcrito de RNA maior incluindo regiões 5' e 3' provenientes de sequências no promotor de CMV e nas regiões de terminação de poliadenilação/transcrição tardia de SV40.

[0644] Um construto de ledRNA correspondente que teve substituições de 162 C para T na sequência de sentido e nenhuma substituição na sequência antissentido também foi projetado e fabricado, designada ledEGFP [G:U] (SEQ ID NO:44). Em cada caso, a região alvo na região de codificação de EGFP eram os nucleotídeos 131 a 590 em relação à região de codificação de proteínas começando com o códon de início ATG (SEQ ID NO:40). A porcentagem de substituições C para T e, portanto, pares de base G:U na haste do ledRNA foi de 162/460

= 35,2%.

[0645] Os plasmídeos que codificam os RNAs de silenciamento hpEGFP [wt], hpEGFP [G:U], ledEGFP [wt] e ledEGFP [G:U] foram testados quanto à atividade de silenciamento de genes em células CHO, HeLa e VERO por transfecção dos vetores para as células. Os ensaios foram conduzidos por cotransfecção dos plasmídeos de teste com um plasmídeo que expressa GFP. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. Células CHO (células de ovário de hamster chinês) e células VERO (células de rim de macaco verde africano) foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 10 x 5 células por poço. As células CHO foram cultivadas na modificação MEMa (Sigma, EUA), e as células HeLa e VERO foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, EUA). Ambos os meios básicos foram suplementados com soro fetal bovino a 10%, glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, bicarbonato de sódio 1,5 g/L, penicilina 0,01% e estreptomicina 0,01%. As células foram cultivadas a 37 ºC com 5% de CO 2. As células foram então transfectadas com 1 µg por poço com DNA do plasmídeo, ou siRNA como controle para o silenciamento de EGFP, usando Lipofectamine 2000. Resumidamente, o siRNA de teste ou plasmídeo foi combinado com o plasmídeo repórter GFP (pGFP Nl) e depois misturado com 1 ml de Lipofectamine 2000, ambos diluídos em 50 ml de OPTI-MEM (Invitrogen, EUA) e incubados à temperatura ambiente por 20 minutos. O complexo foi então adicionado às células e incubado por 4 horas. O meio celular foi substituído e as células foram incubadas por 72 horas. As células foram depois submetidas a citometria de fluxo para medir o silenciamento de GFP. Resumidamente, as células a serem analisadas foram tripsinizadas, lavadas em PBSA, ressuspensas em 200 μl de azida de sódio a 0,01% e 2% de FCS em PBSA e analisadas usando um citômetro de fluxo FACScalibur (Becton Dickinson). A análise dos dados foi realizada usando o software CELLQuest (Becton Dickinson) e relatada como intensidade média de fluorescência (MFI) como uma porcentagem de células de controle com repórter e shRNA não relacionado (controle negativo).

[0646] O siRNA anti-GFP referido como si22 foi obtido de Qiagen (EUA). A sequência de siRNA anti-GFP de si22 era sentido 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3' (SEQ ID NO:86) e antissentido 5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG-3' (SEQ ID NO:87). Um construto genético de controle positivo designada como pshGFP foi criada por meio de uma reação de PCR em uma etapa usando a sequência U6 do mouse como modelo. O iniciador direto foi 5'-TTTTAGTATATGTGCTGCCG-3' (SEQ ID NO:88) e o iniciador reverso foi 5'-

CTCGAGTTCCAAAAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCTCTTGAAGATGAAC TTCAGGGTCAGCCAAACAAGGCTTTQCT NOA' (89). Um produto de amplificação que incluía a cassete de expressão completa foi ligado a pGEM-T Easy. Um plasmídeo de controle de shRNA não relacionado também foi construído pelo mesmo método de PCR. Para esse construto, o primer direto era 5'- TTTTAGTATATGTGCTGCCG -3' (SEQ ID NO:90) e o iniciador inverso era 5'- ctcgagttccaaaaaaataagtcgcagcagtacaatctcttgaattgtactgctgcgactt atgaataccgcttcctcctgag-3’ (SEQ ID NO:91).

[0647] Os dados resultantes de um experimento são mostrados na Figura 34. Foi observada uma clara redução na atividade de EGFP (silenciamento de RNA) nas células VERO e CHO para os controles positivos si22 e pshGFP quando comparados ao controle irrelevante do shRNA. Esses controles positivos foram uma molécula pequena de dsRNA bem validada (si22) ou codificaram um shRNA (pshGFP) que se sabia ter uma atividade silenciadora muito forte em células de mamíferos. As moléculas de RNA de controle têm regiões de filamento duplo de 20 pares de base contíguos e 21 pares de base contíguas, respectivamente, usando apenas pares de base canônicos e sem nucleotídeos incompatíveis nas regiões de filamento duplo e dentro da faixa de 20 a 30 pares de base geralmente utilizados para mamíferos células. Por outro lado, o hpRNA e o ledRNA constroem moléculas expressas com regiões dsRNA longas. Todos os construtos de quatro foram observados para silenciar especificamente a expressão de EGFP em extensões significativas nos dois tipos de células (Figura 34). A inclusão das substituições G:U deu uma melhoria acentuada no silenciamento de ambas os construtos nas células CHO. Nas células VERO, uma melhoria acentuada no silenciamento foi observada apenas com o construto ledEGFP [G:U] em relação ao ledEGFP [wt].

[0648] Em uma segunda experiência utilizando células HeLa (humanas) e analisando a atividade de EGFP às 48 horas após a transfecção, foram obtidos resultados semelhantes (Figura 35).

[0649] Foi significativo notar que o silenciamento genético foi observado em células de mamíferos usando as moléculas efetoras de hpRNA e ledRNA, uma vez que possuíam regiões de filamento duplo mais longas do que a faixa convencional de tamanho de 20 a 30 bp. Também ficou claro que a modificação para substituir nucleotídeos para criar os pares de base G:U aumentou significativamente o efeito de silenciamento genético dessas moléculas de dsRNA mais longas.

Esse efeito pode ser devido a essas estruturas que mais se assemelham aos priRNAs endógenos, precursores de miRNAs, observados em células eucariotas e, assim, melhorando o processamento do dsRNA mais longo para carregamento nas proteínas efetoras do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). EXEMPLO 16. CONSTRUTOS DE RNA DIRECIONADAS AOS GENES

DPMI E FANCM EM PLANTAS

[0650] Os inventores consideraram maneiras de aumentar a taxa pela qual novos perfis genéticos e diversidade (ganho genético) poderiam ser gerados e explorados para obter características desejáveis de desempenho nas plantas. Uma maneira que foi considerada foi encontrar uma maneira de aumentar a taxa de recombinação que ocorre durante a reprodução sexual de plantas. Criadores de plantas dependem de eventos de recombinação para criar diferentes combinações genéticas (alélicas) pelas quais eles podem procurar o perfil genético desejado associado a ganhos de desempenho. No entanto, o número de eventos de recombinação em cada etapa de criação é extremamente baixo em relação ao número de possíveis perfis genéticos que poderiam ser explorados. Além disso, os elementos que controlam onde esses eventos ocorrem no genoma não são bem compreendidos. Os inventores, portanto, consideraram se o ledRNA entregue exogenamente ou endogenamente por meio de uma abordagem transgênica poderia ser usado para modificar as taxas de recombinação nas plantas para permitir aumentos rápidos na diversidade genética e possibilitar um ganho genético mais rápido nas populações reprodutoras.

[0651] O epigenoma das plantas é influenciado por uma série de diferentes modificações químicas no DNA e proteínas associadas que organizam, empacotam e estabilizam o genoma. Essas modificações também regulam onde a recombinação ocorre, com o empacotamento apertado do genoma sendo um forte inibidor da recombinação (Yelina et al, 2012; Melamed-Bessudo et al., 2012). A METILAÇÃO DE DNA DIMINUÍDA 1 (DDM1) é uma enzima que regula a metilação do DNA e da embalagem do genoma. A mutação desse gene pode alterar a posição dos eventos de recombinação (Yelina et al, 2012; Melamed-Bessudo et al., 2012).

[0652] Os eventos de recombinação durante a meiose são fortemente regulados, com apenas 1 a 2 eventos ocorrendo em cada cromossomo para garantir segregação cromossômica adequada na metáfase 1. Eventos de recombinação são iniciados através de quebras de filamento duplo (DSB) do DNA através da enzima SPOll (Wijnker et al, 2008). Isso resulta em centenas de DSB ao longo do cromossomo. Enquanto alguns desses DSB resultam em crossovers, a maioria é reparada por enzimas de reparo do DNA, antes que um evento de recombinação possa ocorrer. Além disso, existem vários reguladores negativos que inibem o desenvolvimento de DSB em crossovers. Em uma abordagem inicial contemplada pelos inventores, os construtos genéticos que codificam moléculas de ledRNA ou moléculas convencionais de RNA com estrutura de grampo como comparação deveriam ser introduzidas nas plantas de A. thaliana, direcionado a um gene que codifica um fator de proteína que poderia impactar potencialmente as taxas de recombinação, como COMPLEMENTAÇÃO DE ANEMIA DE FANCONI GRUPO M (FANCM).

[0653] A sequência de nucleotídeos do gene DDM1 de A. thaliana foi fornecida por

[0654] Nº de acesso AF143940 (Jeddeloh et al., 1999). Foi demonstrado que a redução da expressão do gene DDM1 diminui a metilação do DNA e aumenta o número e a posição dos eventos cruzados em A. thaliana (Melamed-Bessudo e Levy, 2012).

[0655] Brassica napus é uma espécie alotetraploide e possui dois genes DDM1 em cada um dos subgenomas A e C, nos cromossomos A7, A9, C7 e C9, tendo, portanto, um total de quatro genes DDM1. Estes genes são designados BnaA07g37430D-l, BnaC07gl6550D-l, BnaA09g52610D-l e BnaC09g07810D-l. A sequência de nucleotídeos do gene DDM1 BnaA07g37430D-l de B. napus é fornecida pelo número de acesso XR_001278527 (SEQ ID NO:93). Um construto de RNA com estrutura de grampo foi projetado e fabricado direcionado a uma região de 500 nucleotídeos dos quatro genes, correspondendo aos nucleotídeos 650-959 e 2029-2218 da SEQ ID NO:93. A região nucleotídica usada para projetar os construtos de hpRNA e ledRNA direcionadas a todos os quatro genes DDM1 BnaA07g37430D- 1, BnaC07gl6550D-l, BnaA09g52610D-l e BnaC09g07810D-l presentes em B. napus, com base na conservação de sequência entre os genes. A ordem dos elementos no construto de hpRNA era a sequência do laço da sequência do sentido do promotor que compreende um íntron da região terminadora/poliadenilação da transcrição da sequência antissentido do vetor Hellsgate/poliadenilação. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o hpRNA é fornecida como SEQ ID NO:94.

[0656] Um segundo construto de RNA com estrutura de grampo foi feito codificando um RNA com estrutura de grampo direcionado à mesma região de 500 nucleotídeos e possuindo a mesma estrutura, exceto que 97 nucleotídeos de citosina (C) da sequência de sentido foram substituídos por nucleotídeos de timidina (T). Quando o DNA quimérico foi transcrito e o hpRNA substituído por G:U foi autoanelado, isso proporcionou 97/500 = 19,4% dos nucleotídeos na região dsRNA tendo um par de bases em um par de bases G:U. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o hpRNA modificado com G:U é fornecida como SEQ ID NO:95. Além disso, foi produzido um DNA quimérico que codifica um ledRNA direcionado para a mesma região do gene DDM1 de B. napus. A sequência de nucleotídeos desse DNA quimérico que codifica o ledRNA é fornecida como SEQ ID NO:96.

[0657] Para a produção dos RNAs por transcrição in vitro, as preparações de DNA foram clivadas com a enzima de restrição Hindi, que clivou imediatamente após a região de codificação, transcrita in vitro com RNA polimerase T7, o RNA purificado e depois concentrado em uma solução tampão aquosa. O LedRNA foi utilizado para direcionar os transcritos endógenos de DDM1 em cotilédones de B. napus (canola). Os cotilédones de mudas de cinco dias de idade cultivadas assepticamente em meio de cultura de tecidos foram cuidadosamente excisados e colocados em uma placa de Petri contendo 2 ml de meio líquido MS, que compreende 2% (p/v) de sacarose, com 113 μg de ledRNA ou 100 ul de solução tampão aquosa como um controle. O meio líquido MS utilizado para os tratamentos continha Silwett-77, um tensoativo (0,5 μl em 60 ml). As placas de Petri foram incubadas em um agitador com agitação suave, de modo que os cotilédones embebidos na solução contendo o ledRNA. As amostras foram colhidas 5 horas e 7 horas após a aplicação do ledRNA. Em um experimento paralelo, a superfície superior dos cotilédones foi revestida com 10 μg de ledRNA ou solução tampão e incubada em um papel de seda. As amostras foram coletadas 7 horas após a aplicação do ledRNA.

[0658] Além disso, para atingir os transcritos endógenos do DDM1 no tecido reprodutivo de B. napus, os botões florais da canola foram expostos ao ledRNA na presença ou na ausência de uma alíquota de uma suspensão de células AGL1 de estirpe de Agrobactéria tumafecians, ou seja, células AGL1 vivas. A solução tampão aquosa com ou sem as células AGL1 serviu como controle respectivo. O AGL1 foi cultivado em 10ml de meio líquido LB contendo 25 mg/ml de rifampicina por dois dias a 28 ºC. As células foram colhidas por centrifugação a

3.000 rpm por 5 minutos. O sedimento celular foi lavado e as células ressuspensas em 2 ml de meio líquido de MS. Os botões florais foram incubados em uma placa de Petri contendo 2 ml de meio líquido MS, incluindo 0, 5μl de Silwett-77 em 50 ml de meio líquido MS, com 62 μg de ledRNA ou 62 μg + 50 μl de cultura AGL1. Como controle, foram utilizados 50 μl de solução tampão ou 50 μl de solução tampão + 50 μl de cultura AGL1. As amostras foram incubadas em um agitador com agitação suave por 7 horas. Três réplicas biológicas foram usadas para cada um dos tratamentos.

[0659] Os cotilédones tratados e controle e os botões florais foram lavados duas vezes em água destilada estéril, a água de superfície foi removida usando um lenço de papel e congelada rapidamente com nitrogênio líquido. O RNA foi isolado dos tecidos tratados e de controle, tratados com DNase para remover o DNA genômico e quantificado. O cDNA do primeiro filamento foi sintetizado usando quantidades iguais de RNA total de amostras tratadas com ledRNA e seus respectivos controles. A expressão de DDM1 foi analisada usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR).

[0660] Nos cotilédones tratados que foram embebidos com o ledRNA, a abundância de transcrito de DDM1 diminuiu aproximadamente 83 a 86% às 5 horas, o que diminuiu ainda mais com uma redução de 91% às 7 horas em comparação com os controles. Da mesma forma, uma redução de aproximadamente 78 a 85% no nível de mRNA do DDM1 em comparação com o controle foi observada em cotilédones revestidos com ledRNA. Não foi detectada diferença na abundância de mRNA de DDM1 nos brotos florais tratados com ledRNA em comparação ao controle na ausência de células de Agrobactéria. No entanto, foi observada uma redução de aproximadamente 60 a 75%) nos níveis de transcrição de DDM1 em botões florais tratados com ledRNA na presença de Agrobactéria em comparação com seu respectivo controle. Não foi detectada diferença significativa nos níveis de transcrito de DDM1 quando o controle sem Agrobactéria foi comparado com o controle que possuía Agrobactéria, mostrando que as próprias células de Agrobactéria não estavam causando a diminuição do transcrito de DDM1. Tomados em conjunto, esses resultados indicaram que o ledRNA foi capaz de reduzir os níveis endógenos de transcrição de DDM1 nos cotilédones e nos botões florais, enquanto as células vivas de Agrobactéria pareciam facilitar a entrada do ledRNA nos botões florais. Essa acessibilidade do ledRNA também pode ser alcançada por meios físicos, como perfurar as camadas externas dos botões florais, centrifugação ou infiltração a vácuo, ou uma combinação desses métodos.

[0661] Certos mutantes de Arabidopsis thaliana, como os mutantes zip4, não possuem crossovers meióticos, causando segregação equivocada de homólogos cromossômicos e, portanto, reduzem a fertilidade e levam a síliquas (frutos) mais curtos que podem ser visualmente discriminados dos do tipo selvagem. O fenótipo nos mutantes zip4 pode ser revertido reduzindo a expressão do gene FANCM.

[0662] A sequência de nucleotídeos do gene FANCM de A. thaliana foi fornecida pelo número de acesso NM_001333162 (SEQ ID NO:97). Um construto de RNA com estrutura de grampo foi projetado e fabricado direcionado a uma região de 500 nucleotídeos do gene, correspondendo aos nucleotídeos 853 a 1352 da SEQ ID NO:97. A ordem dos elementos no construto era a sequência de laço de sequência de sentido do promotor que compreende um íntron da região terminadora/terminação de transcrição de sequência antissentido de vetor Hellsgate/poliadenilação. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o hpRNA é fornecida como SEQ ID NO:98. Foi realizada um segundo construto de RNA com estrutura de grampo que codifica um RNA com estrutura de grampo semelhante que tem como alvo a mesma região de 500 nucleotídeos, exceto que 102 nucleotídeos de citosina (C) da sequência de sentido foram substituídos por nucleotídeos de timidina (T). Quando o DNA quimérico foi transcrito e o hpRNA substituído por G:U resultante se autoanelou, isso proporcionou 102/500 = 20,4% dos nucleotídeos na região dsRNA sendo emparelhados em bases em um par de bases G:U. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o hpRNA modificado com G:U é fornecida como SEQ ID NO:99. Além disso, um DNA quimérico que codifica um ledRNA direcionado para a mesma região do gene FANCM de A. thaliana foi produzido. A sequência de nucleotídeos desse DNA quimérico que codifica o ledRNA é fornecida como SEQ ID NO:100.

[0663] B. napus possui um gene FANCM em cada um de seus subgenoma A e C, designado BnaA05gl8180D-l e BnaC05g27760D-l. A sequência de nucleotídeos de um dos genes

FANCM de B. napus é fornecida pelo número de acesso XM_022719486.1; SEQ ID NO:101). Um DNA quimérico que codifica o RNA com estrutura de grampo foi projetado e produzido direcionado a uma região de 503 nucleotídeos dos genes, correspondendo aos nucleotídeos 2847 a 3349 da SEQ ID NO:101. A ordem dos elementos no construto era a sequência de laço de sequência de sentido do promotor que compreende um íntron da região terminadora/poliadenilação da terminação de transcrição de sequência antissentido de vetor Hellsgate/poliadenilação. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o hpRNA é fornecida como SEQ ID NO:102. Um segundo construto de RNA com estrutura de grampo foi feito codificando um RNA com estrutura de grampo semelhante direcionado à mesma região de 503 nucleotídeos, exceto que 107 nucleotídeos de citosina (C) da sequência de sentido foram substituídos por nucleotídeos de timidina (T). Quando o DNA quimérico foi transcrito e o hpRNA substituído por G:U se autoanelou, isso proporcionou 107/500 = 21,4% dos nucleotídeos na região dsRNA sendo pares de base em um par de bases G:U. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o hpRNA modificado com G:U é fornecida como SEQ ID NO:103. Além disso, um DNA quimérico que codifica um ledRNA direcionado para a mesma região do gene FANCM de B. napus foi produzido. A sequência de nucleotídeos desse DNA quimérico que codifica o ledRNA é fornecida como SEQ ID NO:104.

[0664] Para a produção dos RNAs por transcrição in vitro, as preparações de DNA foram clivadas com a enzima de restrição Hindi, que clivou imediatamente após a região de codificação, transcrita in vitro com RNA polimerase T7, o RNA purificado e depois concentrado em uma solução tampão aquosa. O LedRNA foi usado em conjunto com Agrobactéria tumefacians

AGLl para direcionar os transcritos de FANCM em botões pré- meióticos de um mutante zip4 de A. thaliana. As síliquas do mutante zip4 eram mais curtas, facilmente observadas visualmente, em relação às síliquas de tipo selvagem devido à formação de entrecruzamento atenuado, causando assim fertilidade reduzida. Foi demonstrado que a repressão do FANCM no mutante zip4 restaura a fertilidade e restaura o comprimento da síliqua. As inflorescências de A. thaliana zip4 contendo os brotos pré-meióticos foram contatadas com ledRNA direcionado a FANCM juntamente com AGL1 ou solução tampão com AGL1 como controle, em cada caso na presença de um tensoativo, neste caso Silwett-77. Uma vez concluída a configuração das sementes, as síliquas desenvolvidas a partir de brotos pré-meióticos foram excisadas para determinar o número de sementes. Entre as 15 síliquas de amostras tratadas com ledRNA, duas síliquas exibiram 10 sementes, uma síliqua teve 9 sementes, enquanto o número de sementes nas síliquas controle variou de 3 a 6. Esses resultados indicaram que o aumento observado no número de sementes foi devido à repressão dos níveis de transcrição de FANCM pelo ledRNA, resultando em um aumento no número de cruzamentos meióticos e no aumento da fertilidade. EXEMPLO 17. CONSTRUTOS DE RNA PARA RESISTÊNCIA A

DOENÇAS FÚNGICAS LEDRNA DIRECIONADO A GENES MLO DE CEVADA E TRIGO

[0665] A doença fúngica das plantas de cereais, oídio, é causada pelo ascomiceto Blumeria graminis f. sp. hordei na cevada e a Blumeria graminis f. sp. tritici relacionada em trigo. B. graminis é um patógeno fúngico biotrófico obrigatório da ordem Erysiphales (Glawe, 2008) que requer um hospedeiro da planta para reprodução, envolvendo uma estreita interação entre as células do fungo e do hospedeiro para que o fungo adquira nutrientes da planta. O fungo infecta inicialmente a camada epidérmica de folhas, bainhas ou orelhas de folhas após o contato com a superfície dos ascósporos ou conídios fúngicos. As folhas permanecem verdes e ativas por algum tempo após a infecção, depois as massas miceliais em pó crescem e as folhas gradualmente se tornam cloróticas e morrem. À medida que a doença progride, o micélio fúngico pode ficar pontilhado com pequenos pontos pretos, que são os corpos de frutificação sexual do fungo. A doença do oídio tem uma distribuição mundial e é mais prejudicial em climas frios e úmidos. A doença impacta o rendimento de grãos principalmente pela redução do número de cabeças bem como pela redução de tamanho e peso do cerne. Atualmente, o controle da doença é por pulverização das culturas com fungicida, que precisa ser aplicado frequentemente quando as condições são frias e úmidas e caras, ou pelo cultivo de cultivares resistentes. Além disso, a resistência a fungicidas surgiu para o oídio em trigo na Austrália.

[0666] Os genes Mlo de cevada e trigo codificam polipeptídeos Mlo que conferem suscetibilidade a B. graminis por um mecanismo desconhecido. Existem várias proteínas MLO estreitamente relacionadas, codificadas por uma família de genes Mlo, que são únicas para as plantas. Cada gene codifica uma proteína de sete domínios transmembranares de atividade bioquímica desconhecida localizada na membrana plasmática. Significativamente, apenas genes Mlo específicos dentro da família são capazes de atuar como genes de suscetibilidade ao oídio e codificam polipeptídeos com motivos conservados no domínio C-terminal citoplasmático das proteínas Mlo. O mecanismo pelo qual os polipeptídeos Mlo atuam como fatores de suscetibilidade ao oídio é desconhecido. A ocorrência de mutantes naturais de mlo de trigo não foi relatada, presumivelmente por causa da natureza poliploide do trigo. No entanto, mlo-mutantes gerados artificialmente mostram alguma resistência à doença, mas geralmente exibem um rendimento substancialmente reduzido de grãos ou senescência prematura das folhas (Wang et al., 2014; Acevedo-Garcia et al., 2017).

[0667] O trigo hexaploide possui três homólogos dos genes Mlo, designados TaMlo-Al, TaMlo-Bl e TaMlo-Dl localizados nos cromossomos 5AL, 4BL e 4DL, respectivamente (Elliott et al., 2002). As sequências de nucleotídeos de cDNAs correspondentes aos genes estão disponíveis como números de acesso: TaMlo-Al, AF361933 e AX063298; TaMlo-Bl, AF361932, AX063294 e AF384145; e TaMlo-DL, AX063296. As sequências de nucleotídeos dos genes nos genomas A, B e D e as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados são aproximadamente 95-97% e 98% idênticas, respectivamente. Todos os três genes são expressos nas folhas das plantas, com os níveis de expressão aumentando à medida que as plantas crescem e amadurecem. Os inventores, portanto, projetaram e fizeram um construto de ledRNA que seria capaz de reduzir a expressão de todos os três genes, aproveitando o grau de identidade de sequência entre os genes e direcionado a uma região de gene com alto grau de conservação de sequência.

[0668] Foi feito um DNA quimérico que codifica um construto de ledRNA que visa todos os três genes TaMlo-Al, TaMlo-Bl e TaMlo-Dl. O construto genético foi feito usando os princípios de design dos ledRNAs descritos acima, com a sequência dividida sendo a sequência antissentido e a sequência contígua sendo a sequência de sentido (Figura 1 A).

[0669] Uma sequência de nucleotídeos de 500 bp de um gene alvo TaMlo foi selecionada, correspondendo aos nucleotídeos 916 a 1248 fundidos com 1403 a 1569 da SEQ ID NO:136. A região dsRNA de cada ledRNA tinha 500 bp de comprimento; a sequência de sentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta, por exemplo, correspondia aos nucleotídeos 916 a 1248 fundidos com 1403 a 1569 da SEQ ID NO:136. A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA é aqui fornecida como SEQ ID NO:137.

[0670] O ledRNA foi preparado por transcrição in vitro usando RNA polimerase T7, purificado e ressuspenso em tampão. 10μg de ledRNA por folha foram aplicados usando um pincel para uma zona de folhas em plantas de trigo no estágio de crescimento Zadoks 23. Como controle, algumas folhas foram tratadas com simulação usando apenas tampão. Amostras de folhas tratadas e controle foram colhidas e extraídas de RNA. Os ensaios de QPCR nos RNAs extraídos mostraram que os níveis de mRNA de TaMlo, sendo uma combinação dos três mRNAs de TaMlo, foram reduzidos em 95,7%). As plantas no estágio de crescimento Z73 também foram tratadas e testadas. Eles mostraram uma redução de 91% na expressão do gene TaMlo pelo QPCR em relação às amostras de folhas de controle. A redução na expressão do gene TaMlo observada nas áreas foliares tratadas foi específica das zonas tratadas - não houve redução nos níveis de mRNA do TaMlo em partes distais e não tratadas das folhas.

[0671] Nos mutantes mlo de cevada, observou-se um aumento na expressão de uma variedade de genes relacionados à defesa de doenças. Portanto, as folhas de trigo tratadas com ledRNA foram testadas pelo QPCR quanto aos níveis de genes relacionados à defesa que codificam PR4, PR10, β-1,3- glucanase, quitinase, germina e fator de ribosilação de ADP. Nenhum desses genes foi alterado significativamente no nível de expressão nas áreas foliares tratadas em relação às áreas foliares de controle.

[0672] Para testar a capacidade do ledRNA de aumentar a resistência a doenças, reduzindo a expressão do gene Mlo, esporos do fungo em pó foram aplicados nas zonas tratadas e não tratadas das folhas. As folhas foram destacadas das plantas de trigo, tratadas com o ledRNA como antes e mantidas em meio (50mg de Benzimidazol e 10g de ágar por litro de água) para evitar que as folhas se desprendessem sob luz. Vinte e quatro horas depois, as folhas foram inoculadas com esporos de oídio e a progressão da doença foi seguida por 5 a 24 dias. As folhas tratadas apresentaram pouco ou nenhum crescimento de micélio fúngico e nenhuma clorose foliar em relação às folhas controle, não tendo recebido o ledRNA, que mostrou extenso crescimento micelial cercado por zonas cloróticas.

[0673] Em outras experiências, níveis mais baixos do ledRNA foram aplicados para identificar o nível mínimo do ledRNA que era eficaz. A aplicação de RNA em concentrações tão baixas quanto 200 ng/μl (2 µg por folha no total) mostrou supressão significativa de lesões de oídio nas formulações atuais, sugerindo que a quantidade de RNA inibitório poderia ser substancialmente reduzida, embora ainda forneça a supressão do crescimento e desenvolvimento de fungos. Além disso, as folhas foram inoculadas 1, 2, 4, 7 e 14 dias após o tratamento com ledRNA para ver quanto tempo o efeito protetor permanecia. O silenciamento efetivo do gene endógeno foi observado ao longo do tempo desde o primeiro ponto no tempo 24 horas após o tratamento até o último ponto no tempo 14 dias após o tratamento, quando os genes endógenos ainda mostravam 91% de redução na expressão. Plantas inteiras também serão pulverizadas com preparações de ledRNA e testadas quanto à resistência a doenças após serem inoculadas com o agente de doenças fúngicas.

LEDRNA DIRECIONADO AOS GENES VVMLO DE VITIS VINIFERA

[0674] Os genes MLO de Vitis vinifera e Vitis pseudoreticulata codificam polipeptídeos de MLO que conferem suscetibilidade à doença fúngica do oídio, causada pelo fungo ascomiceto Erysiphe necator. E. necator é um patógeno fúngico biotrófico obrigatório que requer um hospedeiro da planta para reprodução, envolvendo uma interação próxima entre as células do fungo e do hospedeiro para que o fungo adquira nutrientes da planta. Existem várias proteínas MLO estreitamente relacionadas, codificadas por uma família de genes, que são únicas para plantas e codificam proteínas de sete domínios transmembranares de atividade bioquímica desconhecida, localizadas na membrana plasmática. Significativamente, apenas genes MLO específicos dentro da família são capazes de atuar como genes de suscetibilidade ao oídio e esses codificam polipeptídeos com motivos conservados no domínio C-terminal citoplasmático das proteínas MLO. O mecanismo pelo qual os polipeptídeos MLO atuam como fatores de suscetibilidade ao oídio é desconhecido.

[0675] Construtos de LedRNA direcionado a três genes MLO diferentes, mas relacionados, das espécies de Vitis, a saber VvML03, VvMLO4 e VvML017 (nomenclatura de acordo com Feechan et al., Functional Plant Biology, 2008, 35:1255 a 1266)

foram projetados e produzidos da seguinte forma. Para o primeiro, por exemplo, uma sequência de 860 nucleotídeos de um gene alvo VvML03 foi selecionada, correspondendo aos nucleotídeos 556 a 1155 da SEQ ID NO:138. DNAs quiméricos que codificam três construtos de ledRNA direcionado a os genes VvML03, VvML04 e VvMLOl7 foram produzidos. Os construtos genéticos foram feitos usando os princípios de design dos ledRNAs descritos acima, com a sequência dividida sendo a sequência antissentido e a sequência contígua sendo a sequência de sentido (Figura 1A). A região dsRNA de cada ledRNA tinha 600 bp de comprimento; a sequência de sentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta, por exemplo, correspondia aos nucleotídeos 427 a 1156 da SEQ ID NO:138. A sequência de nucleotídeos que codifica um dos ledRNAs é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:139.

[0676] Os ledRNAs são preparados por transcrição in vitro e aplicados, separadamente ou como uma mistura dos três, a folhas de plantas Vitis vinifera, variedade Cabernet Sauvignon. Posteriormente, os esporos do fungo do oídio são aplicados às zonas tratadas e não tratadas das folhas. A redução nos níveis dos mRNAs alvo foi observada usando RT-PCR quantitativo. A progressão da doença é acompanhada ao longo do tempo. Foi observada infrarregulação substancial de VvMlo4 a partir da aplicação de solução de ledRNA a 1 µg/ml direcionado a VvMlo3, VvMlo4 ou VvMlo11.

LEDRNA DIRECIONADO A GENES FÚNGICOS

[0677] Construtos LedRNA foram projetados contra a região codificadora do gene Cyp51 do patógeno fúngico Rhizoctonia solani, um gene que é exigido para a síntese de ergosterol e sobrevivência e crescimento do fungo. Os construtos genéticos foram feitos usando os princípios de design para ledRNAs descritos acima, com a sequência de divisão sendo a sequência antissentido e a sequência contígua sendo a sequência de sentido (Figura 1A). Um único construto de ledRNA foi projetado direcionado a dois genes de R. solani com a região de dsRNA do ledRNA contendo 350 bp de cada gene; a sequência de sentido na região de dsRNA era uma sequência contínua ininterrupta, por exemplo, que correspondia aos nucleotídeos 884 a 1233 da SEQ ID NO:140 e aos nucleotídeos 174 a 523 da SEQ ID NO:141. A sequência de nucleotídeos que codifica um dos ledRNAs é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:142. Os ledRNAs foram preparados por transcrição in vitro e aplicados ao meio de cultura em uma concentração de 5 µg por 100 µl de cultura com um inóculo de micélio de R. solani. O crescimento do fungo foi medido no tempo zero e a cada dia da semana seguinte pela leitura da densidade óptica da cultura a 600 nm. O crescimento de R. solani em culturas contendo o ledRsCyp51 foi significativamente menor do que as culturas de controle contendo tampão de RNA ou o ledGFP de controle para o qual não há alvo correspondente em R. solani.

[0678] Um construto de codificação de ledRNA também foi projetado e produzido contra a região codificante do gene da sintase de celulose CesA3 no isolado de Phytophthora cinnamomi 94.48. Os construtos genéticos foram feitos usando os princípios de design para ledRNAs descritos acima, com a sequência de divisão sendo a sequência antissentido e a sequência contígua sendo a sequência de sentido (Figura 1A). Um construto de ledRNA foi projetado direcionado ao gene CesA3 de Phytophthora cinnamomi com a região de dsRNA do ledRNA contendo 500 bp da região codificadora do gene; a sequência de sentido na região de dsRNA era uma sequência contínua ininterrupta, por exemplo, que correspondia aos nucleotídeos 884 a 1233 de SEQ ID NO:143. A sequência de nucleotídeos que codifica um dos ledRNAs é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:144. O ledRNA foi transcrito in vitro e aplicado ao meio de cultura a uma taxa de 3 µg por 100 µl de cultura. Foi observada perda substancial de crescimento micelial direcional em culturas com o ledRNA direcionado a PcCesA3 em comparação com as culturas tratadas com simulação (apenas tampão de RNA) ou com ledGFP. A perda de crescimento direcional e o padrão de crescimento amorfo e bulboso resultante era reminiscente de células com interrupção de biossíntese da parede celular e, portanto, era consistente com o silenciamento do gene PcCesA3. EXEMPLO 18. CONSTRUTOS DE RNA DIRECIONADO A OUTROS

GENES EM PLANTAS LEDRNAS DIRECIONADOS AOS GENES TOR DE A. THALIANA E N. BENTHAMIANA

[0679] O gene alvo da rapamicina (TOR) codifica um polipeptídeo de proteína serina-treonina quinase que controla muitas funções celulares em células eucariotas, por exemplo, em resposta a vários hormônios, estresse e disponibilidade de nutrientes. É conhecido como um regulador mestre que regula o mecanismo de tradução para otimizar os recursos celulares para o crescimento (Abraham, 2002). Pelo menos em animais e leveduras, o polipeptídeo TOR é inativado pelo agente antifúngico rapamicina, levando à sua designação como Alvo da Rapamicina. Nas plantas, a TOR é essencial para o desenvolvimento embrionário na semente em desenvolvimento, como mostra a letalidade de mutantes homozigotos na TOR (Mahfouz et al., 2006), além de estar envolvida no acoplamento de pistas de crescimento ao metabolismo celular. Pensa-se que a regulação negativa da expressão do gene TOR resultasse em um aumento na síntese de ácidos graxos, resultando em um aumento do conteúdo lipídico nos tecidos das plantas.

[0680] Construtos de LedRNA direcionados a um gene TOR de Nicotiana benthamiana, a sequência de nucleotídeos da região de codificação da proteína cDNA é fornecida como SEQ ID NO:105, foram projetados e fabricados usando os princípios de design para ledRNAs, com a sequência dividida sendo a sequência de sentido e a sequência contígua sendo a sequência antissentido (Figura IB). A região alvo tinha 603 nucleotídeos de comprimento, correspondendo aos nucleotídeos 2595 a 3197 da SEQ ID NO:105. A região dsRNA do ledRNA tinha 603 bp de comprimento; a sequência antissentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta que correspondia ao complemento dos nucleotídeos 2595 a 3197 da SEQ ID NO:105. As sequências de nucleotídeos que codificam o ledRNA são aqui fornecidas como SEQ ID NO:106. As preparações de DNA dos construtos genéticos que codificam os construtos de ledRNA foram clivadas com a enzima de restrição Mlyl, que clivou o DNA imediatamente após a região de codificação, transcrita in vitro com RNA polimerase SP6 e o RNA purificado e depois concentrado em uma solução tampão aquosa. Amostras do ledRNA foram aplicadas na superfície superior das folhas de N. benthamiana. Após 2 dias e 4 dias, as amostras de folhas tratadas foram colhidas, secas e o conteúdo total de ácidos graxos medido por cromatografia gasosa quantitativa (GC). As amostras de folhas tratadas com os ledRNAs TOR mostraram um aumento no teor de ácidos graxos totais (TFA) de 2,5 a 3,0% (peso de TF A/peso seco) observado nas amostras controle (não tratadas) para 3,5 a 4,0% para o ledRNA amostras tratadas. Isso representou um aumento entre 17% e 60% no conteúdo de TFA em relação ao controle, indicando que a expressão do gene TOR havia sido reduzida nos tecidos tratados com ledRNA. LEDRNA DIRECIONADO AO GENE ALS DE H. VULGARE

[0681] Os genes da acetolactato sintase (ALS) codificam uma enzima (EC 2.2.1.6) encontrada em plantas e microrganismos que catalisa o primeiro passo na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, valina e isoleucina. A enzima ALS catalisa a conversão de piruvato em acetolactato, que é posteriormente convertido em aminoácidos de cadeia ramificada por outras enzimas. Os inibidores da ELA são utilizados como herbicidas, como as classes de herbicidas sulfonilureia, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidinil oxibenzoato e sulfonilamino carbonil triazolinonas.

[0682] Para testar se um ledRNA poderia reduzir a expressão do gene ALS por entrega exógena do RNA às plantas, um construto genético que codifica um ledRNA foi projetado e fabricado para atingir um gene ALS na cevada, Hordeum vulgare. A sequência do gene ALS de H. vulgare é fornecida aqui como SEQ ID NO:107 (número de acesso LT601589). O construto genético foi feito usando os princípios de design dos ledRNAs, com a sequência dividida sendo a sequência de sentido e a sequência contígua sendo a sequência antissentido (Figura IB). A região alvo tinha 606 nucleotídeos de comprimento, correspondendo aos nucleotídeos 1333 a 1938 da SEQ ID NO:107. A região dsRNA do ledRNA tinha 606 bp de comprimento; a sequência antissentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta correspondia ao complemento dos nucleotídeos 1333 a 1938 da SEQ ID NO:107. As sequências de nucleotídeos que codificam o ledRNA são aqui fornecidas como SEQ ID NO:108. A região de codificação estava sob o controle de um promotor de RNA polimerase SP6 para transcrição in vitro.

[0683] O construto genético que codifica o ledRNA foi digerida com a enzima de restrição Mlyl, que clivou a jusante da região de codificação do ledRNA e transcrita in vitro com RNA polimerase SP6 de acordo com as instruções do kit de transcrição. O RNA foi aplicado na superfície superior das folhas das plantas de cevada. O RNA foi extraído das amostras de folhas tratadas (após 24 horas). Os ensaios quantitativos de transcrição reversa-PCR (QPCR) foram realizados nas amostras de RNA. Os ensaios mostraram que o nível de mRNA de ALS foi reduzido nos tecidos tratados com ledRNA. (O RNA total foi extraído para plantas tratadas e não tratadas, tratado com DNase, quantificado e transcrito reversamente 2 ug usando o iniciador CTTGCCAATCTCAGCTGGATC. O cDNA foi utilizado como modelo para PCR quantitativa usando o iniciador direto TAAGGCTGACCTGTTGCTTGC e o iniciador reverso CTTGCCAATCTCAGCTGGATC. A expressão do mRNA de ALS foi normalizada contra o gene do licopeno-ciclase HI isolado de Horendeum chilense. A expressão de ALS foi reduzida em 82% nas plantas tratadas com LED. LEDRNAS DIRECIONADOS AOS GENES NCED1 E NCED2 DE TRIGO

E CEVADA

[0684] Em plantas, o ácido abscísico do hormônio vegetal (ABA) é sintetizado a partir de precursores de carotenoides, com o primeiro passo comprometido na via de síntese sendo catalisado pela enzima 9-cis epoxi-carotenoide dioxigenase (NCED) que cliva 9-cis xantofilas em xantoxina (Schwartz et al., 1997). Sabe-se que o hormônio ABA promove dormência nas sementes (Millar et al., 2006), além de estar envolvido em outros processos, como respostas ao estresse. Pensa-se que uma expressão aumentada de um gene NCED aumenta a concentração de ABA e, assim, promove a dormência. Existem duas isoenzimas NCED em cereais como trigo e cevada, designadas NCED1 e NCED2, codificadas por genes homólogos separados.

[0685] Para a decomposição do ABA, a enzima ABA- 8-hidroxilase (ABA80H-2, também conhecida como CYP707A2) hidroxila o ABA como um passo no seu catabolismo, resultando na quebra da dormência e na germinação das sementes.

[0686] Construtos de LedRNA direcionados a genes que codificam HvNCEDl (nº de acesso AK361999, SEQ ID NO:109) ou HvNCED2 (número de acesso AB239298; SEQ ID NO:110) na cevada Hordeum vulgare e os correspondentes genes homólogos no trigo foram projetados para expressão transgênica em plantas de cevada e trigo. Estes construtos usaram uma região altamente conservada dos genes NCED1 e NCED2 de trigo e cevada, sendo as sequências de nucleotídeos de trigo e cevada cerca de 97% idênticas na região conservada. Os construtos genéticos foram feitos usando os princípios de design dos ledRNAs descritos acima, com a sequência dividida sendo a sequência antissentido e a sequência contígua sendo a sequência de sentido (Figura 1A). A região alvo tinha 602 nucleotídeos de comprimento, correspondendo aos nucleotídeos 435 a 1035 da SEQ ID NO:109. A região dsRNA do ledRNA tinha 602 bp de comprimento; a sequência de sentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta correspondia aos nucleotídeos 435 a 1035 da SEQ ID NO:110. As sequências de nucleotídeos que codificam os ledRNAs NCED1 e NCED2 são fornecidas aqui como SEQ ID NO:111 e 112.

[0687] De maneira semelhante, um construto de ledRNA foi feita direcionado a um gene ABA-OH-2 de T. aestivum de trigo e cevada H. vulgare (número de acesso DQ145933, SEQ ID NO:113). A região alvo tinha 600 nucleotídeos de comprimento, correspondendo aos nucleotídeos 639 a 1238 da SEQ ID NO:113. A região dsRNA do ledRNA tinha 600 bp de comprimento; a sequência de sentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta correspondia aos nucleotídeos 639 a 1238 da SEQ ID NO:113. A sequência de nucleotídeos do DNA quimérico que codifica o ledRNA é fornecida como SEQ ID NO:14.

[0688] Os DNAs quiméricos que codificam os ledRNAs foram inseridos em um vetor de expressão sob o controle de um promotor do gene Ubi que é expresso constitutivamente na maioria dos tecidos, inclusive no desenvolvimento de sementes. Os cassetes de expressão foram excisados e inseridos num vetor binário. Estes foram utilizados para produzir plantas de trigo transformadas.

[0689] As plantas de trigo transgênicas são cultivadas até a maturidade, sementes obtidas a partir delas e analisadas quanto à expressão diminuída dos genes NCED ou ABA-OH-2 e quanto aos efeitos na dormência dos grãos correspondentes à expressão gênica diminuída. É esperada uma variedade de fenótipos na extensão da dormência alterada. Para modular a extensão dos fenótipos alterados, construtos genéticos modificados são produzidos para expressão de ledRNAs com pares de base G:U nas regiões de RNA de filamento duplo, particularmente para ledRNAs em que entre 15 a 25% dos nucleotídeos na região de filamento duplo de o ledRNA está envolvido em um par de bases G:U, como uma porcentagem do número total de nucleotídeos na região de filamento duplo. LEDRNA DIRECIONADO AO GENE EIN2 DE A. THALIANA

[0690] Como descrito no Exemplo 10, o gene EIN2 de Arabidopsis thaliana codifica uma proteína receptora envolvida na percepção do etileno. Plântulas mutantes EIN2 exibem alongamento de hipocótilo em relação a plântulas do tipo selvagem quando germinadas em ACC. Como o gene é expresso em mudas logo após a germinação das sementes, a entrega de um ledRNA por meios transgênicos foi considerada a abordagem mais adequada para testar a extensão da regulação negativa de EIN2, em relação à entrega exógena de RNA pré-formado.

[0691] Um construto de ledRNA direcionada ao gene EIN2 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:115) foi projetado, direcionado a uma região de 400 nucleotídeos do mRNA do gene alvo. O construto é feito inserindo uma sequência (SEQ ID NO:116) codificando o ledRNA em um vetor que compreende um promotor 35S para expressar o ledRNA em plantas de A. thaliana. Plantas transgênicas de A. thaliana são produzidas e testadas quanto à redução da expressão do gene EIN2 por QPCR e para o ensaio de comprimento de hipocótilo na presença de ACC. Observa-se redução nos níveis de expressão de EIN2 e aumento do comprimento do hipocótilo em plantas de algumas linhagens transgênicas. LEDRNA DIRECIONADO AO GENE CHS DE A. THALIANA

[0692] O gene da chalcona sintase (CHS) nas plantas codifica uma enzima que catalisa a conversão de 4- coumaroil-CoA e malonil-CoA em naringenina chalcona, que é a primeira enzima comprometida na biossíntese de flavonoides. Os flavonoides são uma classe de compostos orgânicos encontrados principalmente em plantas, envolvidos em mecanismos de defesa e tolerância ao estresse.

[0693] Um construto de ledRNA direcionada ao gene CHS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:117) foi concebido, tendo como alvo uma região de 338 nucleotídeos do mRNA de gene alvo. O construto é feito inserindo uma sequência de DNA (SEQ ID NO:118) codificando o ledRNA em um vetor que compreende um promotor 35S para expressar o ledRNA em plantas de A. thaliana. As plantas transgênicas de A. thaliana são produzidas por transformação com o construto genético em um vetor binário e testadas quanto à redução da expressão do gene CHS por QPCR e à produção reduzida de flavonoides. Observa-se redução nos níveis de expressão de CHS e níveis reduzidos de flavonoides em plantas de algumas linhagens transgênicas, por exemplo no revestimento de sementes de sementes transgênicas.

LEDRNA DIRECIONADO AO GENE LANR DE LUPINUS ANGUSTIFOLIUS

[0694] O gene LanR do tremoço de folhas estreitas, Lupinus angustifolius L., codifica um polipeptídeo relacionado em sequência ao gene N do tabaco, que confere resistência à doença viral causada pelo vírus do mosaico do tabaco (TMV).

[0695] DNA quimérico para a produção de moléculas de ledRNA direcionadas ao gene LanR de L. angustifolius (número de acesso XM_019604347, SEQ ID NO:119) foi projetado e fabricado. O construto genético foi feito usando os princípios de design dos ledRNAs descritos acima, com a sequência dividida sendo a sequência antissentido e a sequência contígua sendo a sequência de sentido (Figura 1A). A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA é aqui fornecida como SEQ ID NO:120. O ledRNA foi produzido por transcrição in vitro, purificado e concentrado, e alíquotas do RNA são aplicadas a folhas de plantas de L. angustifolius que contêm o gene LanR. Amostras de vírus são aplicadas a plantas tratadas e não tratadas, e os sintomas da doença são comparados após vários dias. LEDRNAI DIRECIONADO AO GENE VRN2 QUE CONFERE

RESPONSIVIDADE DE VERNALIZAÇÃO AO TRIGO

[0696] Os genes de trigo candidatos VRN2A, VRN2B e VRN2D, conforme identificados em TGACv1_scaffold_374416_5AL, TGACv1_scaffold_320642_4BL e TGACv1_scaffold_342601_4DL, que são homólogos do gene ZCCT1 de trigo (No de Acesso Genbank AAS481) foram identificados como alvos para design de um construto ledRNAi. Uma região de 309 bp do gene VRN2B foi usada para a região de dsRNA do construto ledRNAi designada LedTaVRN2. O Led RNAi foi produzido por transcrição in vitro usando T7 RNA polimerase e diluído em água. A solução foi usada para embeber grãos de trigo para germinação a 4 ˚C por 3 dias. Foram utilizadas sementes da variedade de trigo sensível à vernalização CSIRO W7. As sementes tratadas foram plantadas no solo e as plantas resultantes observadas ao longo do tempo para a transição do crescimento vegetativo para o desenvolvimento floral. O momento da floração, indicado pela emergência da espiga da bota, e o número de folhas do caule principal no momento da floração foram registrados. As plantas derivadas de sementes incubadas com LedTaVRN2 floresceram em média pelo menos 17 dias antes do que as plantas derivadas de sementes incubadas apenas com tampão ou controles de dsRNA não específicos. Além disso, as plantas derivadas de sementes incubadas com LedTaVRN2 tinham em média 2,3 menos folhas no caule principal no momento da floração, indicando que menos nós foram dedicados à produção de folhas e mais nós dedicados às flores/grãos.

EXEMPLO 19. CONSTRUTOS DE RNA DIRECIONADO A UM GENE

DE INSETO INTRODUÇÃO

[0697] Os afídeos são insetos sugadores de seiva que causam danos substanciais e às vezes graves às plantas diretamente através da alimentação da seiva das plantas e, em alguns casos, indiretamente através da transmissão de vários vírus que causam doenças nas plantas. Embora a toxina Bt tenha, em alguns casos, sido eficaz na proteção de plantas de safra contra insetos mastigadores, geralmente não é eficaz para insetos sugadores de seiva. O uso dos cultivares de plantas que contêm genes de resistência podem ser uma maneira eficaz de controlar os afídeos. No entanto, a maioria dos genes de resistência é altamente específica para certas espécies ou biótipos de afídeos e a resistência é frequentemente superada devido à rápida evolução de novos biótipos através de alterações genéticas ou epigenéticas. Além disso, os genes de resistência não são acessíveis em muitas culturas ou podem não existir para certas espécies generalizadas de afídeos, como o afídeo-verde, que infestam uma ampla espécie hospedeira. Atualmente, os afídeos são controlados principalmente pela aplicação frequente de pesticidas, o que levou à resistência a pesticidas em afídeos. Por exemplo, apenas um modo de ação de pesticidas permanece eficaz na Austrália contra o afídeo verde-pêssego, pois conseguiu ganhar resistência a todos os outros inseticidas registrados.

[0698] O silenciamento de genes mediado por RNAi demonstrou em alguns estudos ser útil como uma ferramenta de pesquisa em várias espécies de afídeos, para revisões, ver Scott et al., 2013; Yu et al., 2016, mas não demonstrou proteger efetivamente as plantas contra ataques de afídeos. Nesses estudos, os dsRNAs direcionados a genes-chave envolvidos no crescimento e desenvolvimento de afídeos, processos de infestação ou alimentação foram entregues por injeção direta aos afídeos ou alimentando-os com dietas artificiais contendo o dsRNA.

[0699] Para testar o potencial de moléculas de RNAi modificadas, como as moléculas de ledRNA descritas no presente documento para o controle de insetos sugadores de seiva, os inventores selecionaram o afídeo verde pêssego (Myzus persicae) como um modelo de inseto sugador de seiva, por várias razões. Em primeiro lugar, o afídeo verde pêssego é um inseto polifágico que infesta uma ampla variedade de espécies de plantas hospedeiras, incluindo as principais culturas de grãos e hortaliças em todo o mundo. Em segundo lugar, o afídeo verde pêssego é responsável pela transmissão de alguns vírus devastadores, como o vírus Western Yellows da beterraba, que tem sido altamente prejudicial em algumas áreas de cultivo de canola. Dois genes afídeos foram inicialmente selecionados para este estudo como genes alvo para a regulação negativa, um codificando uma proteína efetora chave (C002) e o segundo codificando um receptor da proteína quinase C ativada (Rack- 1). A proteína C002 é uma proteína da glândula salivar de afídeos que é essencial para a alimentação de afídeos em sua planta hospedeira (Mutti et al., 2006; Mutti et al., 2008). Rack1 é um receptor intracelular que liga a proteína quinase C ativada, uma enzima envolvida principalmente nas cascatas de transdução de sinal (McCahill et al., 2002; Seddas et al., 2004). MpC002 é predominantemente expresso na glândula salivar afídeo e MpRack1 é predominantemente expresso no intestino. Em estudos anteriores, o uso de RNAi por injeção direta ou alimentação artificial por dieta levou à morte de várias espécies de afídeos testadas (Pitino et al., 2011; Pitino e Hogenhout, 2012; Yu et al., 2016). MATERIAIS E MÉTODOS: CULTURA DE AFÍDEOS E MATERIAIS

VEGETAIS

[0700] Afídeos verdes de pêssego (Myzus persicae) foram coletados na Austrália Ocidental. Antes de cada experimento, os afídeos foram criados em plantas de rabanete (Raphanus sativus L.) sob luz ambiente em uma sala de insetos. Os afídeos foram transferidos para gaiolas artificiais experimentais com um pincel fino.

[0701] Os componentes da dieta artificial para a alimentação dos afídeos foram os mesmos descritos em Dadd e Mittler (1966). O aparelho utilizado para a dieta artificial dos afídeos utilizava um tubo de plástico com 1 cm de diâmetro e 1cm de altura. A dieta artificial de afídeos, 100 μl com ou sem ledRNA, foi colocada entre duas camadas de parafilme para criar um saquinho de dieta. Em cima dessa saqueta, havia uma câmara para os afídeos se movimentarem e se alimentarem da dieta, perfurando seus estiletes pela camada superior do parafilme esticado. Oito ninfas de primeiro ou segundo ínstar foram gentilmente transferidas para a câmara de afídeos usando um pincel fino. O experimento foi realizado em um gabinete de crescimento a 20 ºC.

[0702] As folhas de tabaco e rabanete utilizadas em um experimento foram coletadas de plantas cultivadas em solo sob ciclo de 16 h luz/8 h escuro a 22 ºC. Com os experimentos envolvendo folhas de rabanete retiradas, uma pequena folha de rabanete (2 a 4 cm2) fixada a um fragmento de caule (~2 cm de comprimento) foi retirada. Para manter a folha fresca, o caule foi inserido em meio contendo 1,5 g de Bacto Agar e 1,16 g de Aquasol por 100 ml de água em uma placa de Petri de 5cm de diâmetro. Os afídeos foram transferidos para as folhas com um pincel de pintura fino. As placas de petri com as folhas e afídeos foram mantidas em um gabinete de crescimento sob ciclo de 16 h luz/8 h escuro a 20 ºC.

[0703] O RNA de filamento duplo (dsRNA) foi preparado por transcrição de RNA in vitro de modelos de DNA que compreendem um ou mais promotores T7 e polimerase de RNA T7 usando métodos padrão. GENES MPC002 E MPRACK-1 E CONSTRUTOS DE LEDRNA

[0704] Os genes MpC002 e MpRack-1 de afídeo verde- pêssego testados como genes-alvo foram os mesmos descritos por Pitino et al. (2011; 2012). As sequências de DNA de ambos os genes foram obtidas no site da NCBI, MpC002 (> MYZPE13164_0_vl .0_000024990.1 | 894 nt) e MpRack-1 (> MYZPE13164_0_vl .0_000198310.1 | 960 nt). As sequências de cDNA dos dois genes são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 123 e 124. os construtos de LedRNA foram projetadas da mesma maneira como descrito nos Exemplos anteriores. As sequências de DNA que codificam as moléculas de ledRNA são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 125 e 126 foram utilizados como modelos de transcrição para sintetizar o ledRNA. Os DNAs vetoriais que codificam as moléculas de ledRNA direcionados aos genes MpC002 e MpRack-1 foram introduzidos na estirpe DH5a de E. coli para a preparação de DNA plasmídeo para transcrição de RNA in vitro e na estirpe HT115 da E. coli para transcrição in vivo (em bactérias).

EFICÁCIA DAS MOLÉCULAS DE LEDRNA NA REDUÇÃO DO DESEMPENHO DE AFÍDEOS

[0705] Para examinar se os ledRNAs direcionados aos genes MpC002 ou MpRack-1 afetaram o desempenho do afídeo, cada ledRNA foi entregue aos afídeos através dos meios artificiais da dieta, conforme descrito no Exemplo 1. Em cada experimento, dez réplicas biológicas foram montadas; cada réplica biológica tinha oito ninfas de um a dois instares de afídeo-verde-pêssego. Os controles em cada experimento usaram concentrações equivalentes de um ledRNA não relacionado, chamado ledGFP.

[0706] Em uma concentração mais baixa de 50 ng/ml de cada molécula de ledRNA, a sobrevivência do afídeo após a alimentação da dieta artificial contendo MpC002 ou MpRack-1 ledRNA não foi significativamente diferente da ledGFP de controle. No entanto, o ledRNA direcionado ao gene MpC002 reduziu significativamente (P <0,05) a taxa de reprodução de afídeos verdes de pêssego (Figura 37 A). O número médio de ninfas produzidas por afídeo adulto foi reduzido em cerca de 75% em comparação com o número de ninfas produzidas a partir de adultos mantidos na dieta de controle com o ledRNA de controle. Em uma concentração mais alta de 200 ng/μl, os ledRNAs direcionados para MpC002 ou MpRack-l aumentaram a mortalidade de afídeos adultos (Figura 37B). A redução da sobrevivência de afídeos nas dietas, incluindo os ledRNAs MpC002 ou MpRack-1, também foi observada após 24 horas e continuou durante o período de cinco dias do experimento. Os resultados indicaram que o uso dos ledRNAs direcionados aos genes essenciais dos afídeos foi capaz de causar a morte de afídeos e reduzir a reprodução dos afídeos. A eficácia de cada ledRNA foi comparada a moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNAi) compostas por filamentos de RNA de sentido e antissentido separadas, mas recozidas, direcionadas à mesma região do gene alvo.

CAPTAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LEDRNA POR AFÍDEOS

[0707] Para rastrear a captação e distribuição dos ledRNAs dentro dos afídeos, os ledRNAs direcionados aos genes MpC002 ou MpRack-1 foram marcados com Cy3 (trifosfatos de nucleotídeos marcados com corante cianino) durante o processo de síntese, conforme descrito no Exemplo 1. Foi relatado que a marcação Cy3 não tem efeito sobre a função biológica das moléculas de dsRNA convencionais e, portanto, pode ser usada como um marcador para detecção por fluorescência. Os afídeos que foram alimentados com os ledRNAs marcados foram examinados por microscopia confocal usando um instrumento de microssistemas Leica EL 6000. O ledRNA marcado com Cy3 direcionado a MpC002 ou MpRack-1 foi detectável em tripas de afídeos poucas horas após a alimentação com dieta artificial e subsequentemente no sistema de reprodução e até em ninfas recém-nascidas que eram descendentes dos adultos que foram alimentados. Os resultados indicaram que genes de afídeos críticos para a função ou reprodução do sistema digestivo podem ser alvos eficazes para as moléculas de ledRNA através da alimentação.

ESTABILIDADE DO LEDRNA

[0708] Para examinar a estabilidade do ledRNA na dieta e conforme recuperado dos afídeos alimentados, o RNA foi recuperado da dieta artificial e do melado de afídeo após a alimentação das dietas contendo as moléculas de ledRNA marcadas. As amostras de RNA foram submetidas a eletroforese em géis e examinadas por detecção de fluorescência. O RNA ledMpC002 antes da alimentação exibia claramente um único produto de cerca de 700 bp no gel de agarose. O RNA recuperado da dieta artificial mostrou uma mancha de RNA com tamanho de 100 a 700 bp, indicando alguma degradação após ter sido exposto à dieta à temperatura ambiente por 25 dias, mas ainda em grande parte intacto. O RNA recuperado do melado de afídeo mostrou fluorescência na faixa de RNA de 350 a 700 bp, então novamente estava praticamente intacto. Apesar da degradação de alguns ledRNA, uma grande proporção das moléculas de ledRNA foi capaz de permanecer intacta na dieta artificial e também no melado de afídeo por um período de tempo considerável. Este grau de estabilidade das moléculas de ledRNA deve permitir que o ledRNA fique ativo e retenha a atividade quando aplicado exogenamente.

ABSORVÊNCIA DO LEDRNA MARCADO PELAS FOLHAS DAS PLANTAS

[0709] O RNA ledMpC002 marcado com Cy3 foi pintado na superfície superior das folhas de tabaco para verificar se era capaz de penetrar nos tecidos foliares. Dez microlitros de ledMpC002 marcado com Cy3 (concentração de 1 μg/μl) foram pintados em um círculo de 2 cm de diâmetro e a região aplicada marcada com uma caneta preta. Imagens de fluorescência foliar a uma excitação de 525 nm foram capturadas durante um período de cinco horas usando um instrumento de microssistemas Leica EL 6000, comparando os tecidos pintados com os não pintados. O rótulo Cy3 era claramente detectável no tecido mesofílico dentro de uma hora após a aplicação, portanto havia penetrado claramente através da camada de cutícula cerosa na superfície da folha. O nível de fluorescência aumentou em 2 horas e foi mantido até o ponto de 5 horas. Não ficou claro se as moléculas de ledRNA entraram nas células ou nos núcleos das células. No entanto, como os insetos sugadores de seiva se alimentam especificamente dos elementos da peneira do floema das folhas e caules das plantas, a transmissão do RNA para as células das plantas não era necessária para o silenciamento dos genes dos afídeos. O experimento indicou que as moléculas de ledRNA foram encontradas nos tecidos das plantas por aplicação tópica.

CAPTAÇÃO DE LEDRNA TÓPICO POR AFÍDEOS

[0710] O RNA ledGFP marcado com Cy3 foi pintado em folhas de rabanete para verificar se os afídeos eram capazes de captar ledRNA aplicado topicamente de plantas. Dez microlitros de cada ledGFP marcado com Cy3 (concentração de 10 µg/µl) foram pintados em uma pequena folha de rabanete retirada (~2 cm2). A folha de controle foi pintada com uma quantidade igual de ledGFP não marcado. As folhas de rabanete marcadas e de controle foram, cada uma, infestadas com oito afídeos de vários estágios de desenvolvimento. Imagens de fluorescência de folha e afídeo foram capturadas usando o método descrito acima para as folhas de tabaco. Embora não houvesse fluorescência detectável nas folhas de controle e afídeos, a folha pintada com ledGFP marcado com Cy3 era altamente fluorescente. Dentro de 24 horas após a alimentação na folha com ledRNA marcado com Cy3, os afídeos mostraram forte fluorescência em todo o corpo, mas mais pronunciada nos intestinos e nas pernas do que outras partes do corpo. O experimento indicou que os afídeos foram capazes de captar as moléculas de ledRNA das plantas através de aplicação tópica.

TRIAGEM ADICIONAL DE GENES ALVO DE RNAI DE AFÍDEO

[0711] A fim de identificar mais genes alvo de afídeos, no total 16 genes de afídeos foram avaliados quanto à sua adequação como alvos de RNAi. Os genes candidatos selecionados estavam envolvidos no desenvolvimento,

reprodução, alimentação ou desintoxicação de afídeos. DsRNA convencional (dsRNAi) direcionado a cada gene que compreendem sequências de sentido e antissentido correspondentes a uma região do gene alvo mRNA foi suplementado à dieta artificial de afídeos a uma concentração de 2 µg de RNA por µl de dieta. O impacto sobre as taxas de sobrevivência e reprodução dos afídeos foi usado para determinar a adequação dos genes-alvo do RNAi para os afídeos. Dos 16 genes investigados, nove genes apresentaram redução nas taxas de sobrevivência e/ou reprodução dos afídeos. Além de MpC002 e MpRack-1, outros genes alvo adequados foram genes que codificam os seguintes polipeptídeos e o tipo de função que os mesmos tinham em afídeos: tubulina (No. de acesso XM_022321900.1, estrutura celular), peptídeo relacionado à insulina (XM_022313196.1, desenvolvimento embrionário), subunidade ATPase E do tipo V (XM_022312248.1, metabolismo energético), gap hunchback (XM_022313819.1, crescimento e desenvolvimento), hormônio desencadeador de Ecdysis (XM_022323100.1, desenvolvimento - ecdise), neuropeptídeo F curto (XM_022314068.1, sistema nervoso) e leucocinina (XM_022308286.1, balanço hídrico e ingestão de alimentos). Para a maioria dos genes, o impacto do RNAi pareceu mais robusto e forte na reprodução do afídeo do que na sobrevivência, ou seja, houve maiores efeitos na reprodução.

EFEITO DE TRANSGERAÇÃO DE RNAI EXÓGENO EM AFÍDEOS

[0712] Para examinar quanto tempo o efeito de RNAi poderia durar, os afídeos no estágio de desenvolvimento de dois ou três instares foram alimentados com uma dieta artificial suplementada com dsRNAi direcionado a MpC002, MpRack-1, MpGhb ou com dsGFP de controle por 10 dias. Os afídeos que sobreviveram foram então transferidos para folhas de rabanete retiradas sem aplicação de RNA. Para todos os três genes, até 6 dias, o número de ninfas produzidas por afídeo sobrevivente foi significativamente menor do que o número de afídeos alimentados com moléculas de RNA dsGFP de controle ou água. Para os dsRNAs MpC002 e MpRack-1, a menor taxa de reprodução nas folhas de rabanete foi mantida por pelo menos 9 dias. Para investigar se o dsRNAi afetou as gerações seguintes, os afídeos que nasceram dentro de três dias nas folhas do rabanete e que não se alimentaram diretamente da dieta contendo RNA foram removidos em folhas frescas de rabanete retiradas e sua sobrevivência e taxa de produção foram monitoradas por 15 dias. Embora não tenha havido diferença significativa na taxa de sobrevivência, os afídeos que nasceram de afídeos mães alimentados com dieta com dsRNA de MpC002, MpRack-1 ou MpGh, todos produziram um número significativamente menor de afídeos em comparação com os afídeos mães alimentados com a dieta com o controle dsGFP ou água. Concluiu-se que os efeitos causados pela alimentação com moléculas de dsRNA para o afídeo pai persistiram nos afídeos descendentes.

CONCLUSÕES

[0713] Os objetivos deste estudo foram testar a aplicação de RNAi exógeno usando o design de ledRNA para o controle de afídeos, um grande grupo de pragas de insetos sugadores de seiva que são um problema em todo o mundo e identificar genes alvo adequados. Sabe-se que os afídeos possuem o maquinário de RNAi para processar o RNA exógeno (Scott et al., 2013; Yu et al., 2016). No presente contexto, a entrega oral através de uma dieta artificial contendo moléculas de ledRNA direcionadas aos genes MpC002 ou MpRack-1 foi capaz de causar mortalidade de afídeos e reduzir a reprodução dos afídeos. As moléculas foram testadas contra dois genes-alvo diferentes, um codificador da proteína efetora C002 e o outro um receptor da proteína quinase ativada (Rack- 1), essencial para a alimentação e desenvolvimento do afídeo de pêssego verde (Myzus persicae). Quando adicionadas à dieta artificial com uma concentração tão baixa quanto 50 ng/μl, as moléculas de ledRNA direcionadas a esses genes reduziram significativamente a reprodução de afídeos. Em uma concentração mais alta de 200 ng/μl, os ledRNAs também aumentaram a mortalidade de afídeos. Quando a captação de ledRNA foi investigada usando a marcação Cy3, as moléculas de ledRNA foram observadas nas tripas de afídeos poucas horas após a alimentação com a dieta artificial e subsequentemente no sistema de reprodução e até mesmo nas ninfas recém-nascidas que eram a progênie de adultos alimentados. O efeito do ledRNA na reprodução do afídeo poderia durar pelo menos duas gerações, conforme indicado nos resultados com o dsRNA tradicional.

[0714] Também foi demonstrado que as moléculas de ledRNA permaneceram em grande parte intactas na dieta artificial por pelo menos três semanas e meia. Também foram encontradas moléculas de ledRNA intactas na melada de afídeo, um produto de excreção dos afídeos. Quando o ledRNA rotulado era aplicado nas folhas das plantas, ele entrava no floema onde os afídeos se alimentam e foi detectado nos afídeos. Juntos, esses resultados indicaram o forte potencial do ledRNA para o controle de afídeos e outros insetos sugadores de seiva, inclusive por entrega exógena através da dieta, fornecendo uma abordagem prática para o manejo de afídeos e outros insetos sugadores de seiva. Essas moléculas de RNA também podem ser expressas em plantas transgênicas, usando promotores que favorecem a síntese do RNA nos tecidos do floema, para controlar afídeos e outros insetos sugadores de seiva. Além disso, espera-se que o uso de ledRNA[G:U] ou RNA em grampo [G:U] que compreendem pares de base G:U de 10 a 30% na região de dsRNA das moléculas forneça um controle ainda melhor, com base nos níveis aumentados de acúmulo dessas moléculas de dsRNA por meio de autossilenciamento reduzido dos transgenes que codificam essas moléculas. EXEMPLO 20. CONSTRUTOS DE RNA DIRECIONADO A OUTROS

GENES DE INSETOS LEDRNA DIRECIONADO A GENES DE PRAGAS DE INSETOS

[0715] Helicoverpa armigera é uma praga de insetos da ordem Lepidoptera, também conhecida como lagarta do algodão ou lagarta da espiga. As larvas de H. armigera alimentam-se de uma ampla variedade de plantas, incluindo muitas safras cultivadas importantes e causam danos consideráveis às safras no valor de bilhões de dólares por ano. As larvas são pragas polifágicas e cosmopolitas que podem se alimentar de uma ampla variedade de espécies vegetais, incluindo algodão, maíz, tomate, grão de bico, ervilha de pombo, alfafa, arroz, sorgo e feijão-caupi.

[0716] O gene branco do transportador de H. armigera ABC (ABCwhite) foi selecionado como um gene alvo com um fenótipo prontamente detectado para testar os construtos de ledRNA e ledRNA (G:U) em uma larva de inseto. Os transportadores ABC pertencem à superfamília de transportadores ATP Binding Cassette - por exemplo, 54 genes diferentes de transportadores ABC foram identificados no genoma Helicoverpa. Os transportadores ABC codificam proteínas ligadas à membrana que transportam qualquer uma ou mais de uma ampla gama de moléculas através das membranas. As proteínas usam energia liberada pela hidrólise de ATP para transportar as moléculas através da membrana. Alguns transportadores de ABC foram implicados na degradação dos metabólitos secundários das plantas na lagarta do algodão, H. armigera (Khan et al., 2017). A proteína ABCwhite transporta precursores da via ommocromo e pteridina para grânulos de pigmento no olho e os mutantes knockout exibem olhos brancos.

[0717] A sequência de nucleotídeos do gene ABCwhite é fornecida como SEQ ID NO:127 (Nº de acesso KU754476). Para testar se um ledRNA poderia reduzir a expressão do gene ABCwhite pela entrega exógena do RNA na dieta larval, um construto genético que codifica um ledRNA foi projetado e fabricado direcionado ao gene. O construto genético foi feito usando os princípios de design dos ledRNAs, com a sequência dividida sendo a sequência de sentido e a sequência contígua sendo a sequência antissentido (Figura IB). A região alvo tinha 603 nucleotídeos de comprimento, correspondendo aos nucleotídeos 496 a 1097 da SEQ ID NO:127. A região dsRNA do ledRNA tinha 603 bp de comprimento; a sequência antissentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta que correspondia ao complemento dos nucleotídeos 496 a 1097 da SEQ ID NO:127. As sequências de nucleotídeos que codificam o ledRNA são aqui fornecidas como SEQ ID NO:128. A região de codificação estava sob o controle de um promotor da RNA polimerase T7 para transcrição in vitro.

[0718] O construto genético que codifica o ledRNA foi digerida com a enzima de restrição SnaBI, que clivou a jusante da região de codificação do ledRNA e transcrita in vitro com RNA polimerase T7 de acordo com as instruções do kit de transcrição. O RNA é adicionado a uma dieta artificial e fornecido às larvas de H. armigera.

[0719] Um construto de ledRNA correspondente com pares de base G:U na haste de filamento duplo é feita e comparada com o ledRNA com emparelhamento de base canônico.

LEDRNAS DIRECIONADOS A UM GENE EM FORMIGAS

[0720] O linepithema humile, conhecido como formiga argentina, é uma praga de inseto que se espalhou amplamente em vários continentes. O gene L. humile que codifica o neuropeptídio ativador da biossíntese de feromônios (PBAN) (LOCI 05673224) foi selecionado como um gene alvo, envolvido na comunicação entre os insetos pelos feromônios.

[0721] A sequência de nucleotídeos do gene PBAN é fornecida como SEQ ID NO:129 (Nº de acesso XM_012368710). Para testar se um ledRNA poderia reduzir a expressão do gene PBAN por entrega exógena do RNA na dieta na forma de isca, foi projetado e fabricado um construto genético que codifica um ledRNA que visa o gene. O construto genético foi feito usando os princípios de design dos ledRNAs, com a sequência dividida sendo a sequência de sentido e a sequência contígua sendo a sequência antissentido (Figura IB). A região alvo tinha 540 nucleotídeos de comprimento, correspondendo aos nucleotídeos 136 a 675 da SEQ ID NO:129. A região dsRNA do ledRNA tinha 540 bp de comprimento; a sequência antissentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta que correspondia ao complemento dos nucleotídeos 136 a 675 da SEQ ID NO:129. As sequências de nucleotídeos que codificam o ledRNA são aqui fornecidas como SEQ ID NO:130. A região de codificação estava sob o controle de um promotor da RNA polimerase T7 para transcrição in vitro.

[0722] O construto genético que codifica o ledRNA foi digerida com a enzima de restrição SnaBI, que clivou a jusante da região de codificação do ledRNA e transcrita in vitro com RNA polimerase T7 de acordo com as instruções do kit de transcrição. O RNA é revestido em pó de maíz para administração oral em formigas L. humile. GENES DIRECIONADOS A LEDRNA DE L. CUPRINA

[0723] Lucilia cuprina é uma praga de inseto mais conhecida como mosca de ovelha australiana. Pertence à família das moscas, Calliphoridae, e é membro da ordem dos insetos Diptera. Cinco genes-alvo foram selecionados para teste com construtos de ledRNA, ou seja, genes que codificam a subunidade catalítica A de ATPase de próton do tipo V (nº de acesso XM_023443547), RNAse 1/2 (nº de acesso XM_023448015), quitina sintetizada (nº de acesso XM_023449557), ecdisona receptor (EcR; No. de acesso U75355) e gama-tubulina tipo 1/1 (No. de acesso XM_023449717) de L. cuprina. Cada um dos construtos genéticos foi feito usando os princípios de design dos ledRNAs, com a sequência dividida sendo a sequência de sentido e a sequência contígua sendo a sequência antissentido (Figura 1B). Em cada caso, a região alvo tinha cerca de 600 nucleotídeos de comprimento e a sequência antissentido na região dsRNA era uma sequência contígua e ininterrupta. A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA que tem como alvo o gene ATPase-A é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:131. A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA que tem como alvo o gene RNAse 1/2 é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:132. A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA que tem como alvo o gene da quitina sintase é aqui fornecida como SEQ ID NO:133. A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA que tem como alvo o gene EcR é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:134. A sequência de nucleotídeos que codifica o ledRNA que tem como alvo o gene semelhante a 1/1 de gama- tubulina é fornecida no presente documento como SEQ ID NO:135. Em cada construto, a região de codificação estava sob o controle de um promotor da RNA polimerase T7 para transcrição in vitro. EXEMPLO 21. LEDRNA DERIVADO DE TRANSGÊNICO ACUMULA

A NÍVEIS ALTOS EM PLANTAS TRANSFORMADAS DE FORMA ESTÁVEL

[0724] Os fragmentos de DNA que codificam sequências de ledRNA direcionados aos mRNAs de um gene repórter GUS ou do gene A. thaliana EIN2 foram sintetizados e clonados em pART7 para formar cassetes de expressão de terminador/região de poliadenilação de p35S:ledRNA:Ocs3’ para expressão em células vegetais. Os fragmentos foram então retirados com Not I e inseridos no local Not I de pART27 para formar os vetores ledGUS e ledEIN2 para transformação de plantas. O construto ledGUS e o construto hpGUS existente projetado para gerar um hpRNA longo com uma haste de dsRNA de 563 bp e laço de 1.113 nt foram separadamente na linhagem de N. tabacum que expressa GUS PPGH24 por métodos de transformação mediados por Agrobacterium. Amostras de RNA de transformantes independentes que exibiram forte silenciamento de GUS ou pouca ou nenhuma redução aparente na atividade de GUS foram usadas em ensaios de hibridização de Northern blot para detectar RNA de hpGUS ou ledGUS codificado por transgene. Conforme mostrado na Figura 38, sinais de hibridização muito mais intensos foram detectados das plantas transformadas com ledGUS do que nas plantas transformadas com hpGUS que mostraram silenciamento de GUS forte (indicado por “-” na Figura 38). Na verdade, a maioria dos sinais de hibridização para as amostras de RNA de hpGUS eram sinais de fundo não específicos que também foram observados para RNA de plantas não transformadas de controle (WT). Várias bandas de hibridização intensa foram observadas para as linhagens de ledGUS, presumivelmente devido a algum processamento parcial do ledRNA de comprimento total.

[0725] A sequência de nucleotídeos do construto genético que codifica ledGUS é mostrada na SEQ ID NO:5. Os nucleotídeos 1 a 17 correspondem a um promotor de RNA polimerase T7 para a síntese de RNA in vitro, os nucleotídeos 18 a 270 correspondem à metade 5’ da sequência antissentido de GUS, os nucleotídeos 271 a 430 correspondem à sequência de laço 1, os nucleotídeos 431 a 933 correspondem à sequência de sentido de GUS, os nucleotídeos 934 a 1093 correspondem à sequência do laço 2 e os nucleotídeos 1094 a 1343 correspondem à metade 3’ da sequência antissentido de GUS.

[0726] De maneira semelhante, os construtos ledEIN2 e hpEIN2 foram introduzidos separadamente em plantas de A. thaliana do ecótipo Col-0 por transformação mediada por Agrobacterium. O construto hpEIN2, que codifica o RNA hpEIN2[wt], era conforme descrito anteriormente e continha sequências EIN2 de sentido e antissentido de 200 bp em uma configuração de repetição invertida, separada pelo íntron PDK. A sequência de nucleotídeos do construto genético que codifica ledEIN2 é mostrada na SEQ ID NO:116. Os nucleotídeos 37 a 225 correspondem à metade 5’ da sequência antissentido de EIN2, os nucleotídeos 226 a 373 correspondem à sequência do laço 1, os nucleotídeos 374 a 773 correspondem à sequência de sentido de

EIN2, os nucleotídeos 774 a 893 correspondem à sequência do laço 2 e os nucleotídeos 894 a 1085 correspondem à metade 3’ da sequência antissentido de EIN2. Os nucleotídeos 37 a 225 (antissentido) são complementares aos nucleotídeos 374 a 573 (sentido) e os nucleotídeos 894 a 1085 (antissentido) são complementares aos nucleotídeos 574 a 773 (sentido).

[0727] Amostras de RNA de transformantes independentes primários foram usadas para análise de hibridização Northern blot. Conforme mostrado na Figura 39, as plantas ledEIN2 mostraram sinais de hibridização mais intensos do que as plantas hpEIN2 para moléculas de RNA maiores (Figura 39, painel superior), indicando que o RNA derivado de ledEIN2 se acumulou em níveis maiores do que os RNAs derivados de hpEIN2. Para RNAs processados na faixa de tamanho de 20 a 25 nucleotídeos (siRNAs), os siRNAs foram detectados nas plantas ledEIN2 em maior abundância do que nas plantas hpEIN2 (Figura 39, painel inferior), e a quantidade de siRNAs se correlacionou bem com a abundância das moléculas de RNA maiores. Esses resultados indicaram que ledRNA derivado de transgene foi processado até certo ponto, mas não completamente, por Dicer em siRNAs. Isso também indicou que os transgenes ledRNA geraram mais siRNAs do que um transgene hpRNA correspondente.

[0728] Esses resultados indicaram que os construtos de ledRNA, quando expressos em células vegetais, resultaram em níveis maiores de transcritos acumulados, não processados e processados, do que os construtos de hpRNA correspondentes. Acreditava-se que isso era uma indicação de estabilidade aumentada das moléculas de ledRNA. EXEMPLO 22. RNA EM GRAMPO É UM PRECURSOR EFICIENTE

DE RNA CIRCULAR EM PLANTAS

[0729] Os RNAs circulares (circRNAs) são ligados covalentemente, círculos fechados sem terminais 5’ e 3' livres ou sequências poliadeniladas como regiões 3’. Os mesmos são geralmente não codificantes porque não codificam polipeptídeos e, portanto, não são traduzidos. circRNAs são relativamente resistentes à digestão por RNAses, em particular a exonucleases, como RNase R. circRNAs de origem viral ou viroide ou como RNAs satélites associados a vírus têm sido observados há muito tempo em plantas e animais. Por exemplo, Viroide de Tubérculo de Fuso de Batata, um patógeno de RNA subviral em plantas, tem um genoma de RNA circular de cerca de 360 nt de tamanho. Em plantas, esses RNAs satélites são frequentemente capazes de ser replicados na presença de um vírus auxiliar. Em contraste, os viroides dependem inteiramente de funções do hospedeiro, incluindo a polimerase de RNA de planta endógena, para sua replicação.

[0730] Usando tecnologias de sequenciamento profundo de RNA em conjunto com ferramentas de bioinformática especialmente projetadas, um grande número de cirRNAs já foi identificado a partir de genomas de plantas e animais. Milhares de circRNAs putativos foram identificados em plantas, incluindo A. thaliana, arroz e soja, que tendem a apresentar padrões de expressão sensíveis ao estresse biótico e abiótico, mas a função biológica (ou funções biológicas) dos circRNAs em plantas ainda precisa ser demonstrada. Os padrões de expressão específicos do tecido ou responsivos ao estresse de muitos circRNAs de plantas putativos sugerem que os mesmos podem ter papéis potenciais no desenvolvimento da planta e nas respostas de defesa, mas isso ainda não foi demonstrado.

[0731] Uma visão consensual sobre a biogênese dos circRNAs é que os mesmos são formados por back-splicing do íntron, ou seja, o mecanismo de splicing “emenda de volta” pré-mRNA e une covalentemente os exons emendados. Assim, o mecanismo de splicing de íntrons endógenos é essencial para o modelo atual de biogênese de circRNA. Esse modelo de biogênese é com base principalmente em estudos em sistemas de mamíferos, em que é mostrado que a maioria dos circRNAs exônicos contêm sinais de splicing de íntron canônico, que incluem os dinucleotídeos de borda de íntron GT/AG de consenso. Em animais, as regiões de íntron que flanqueiam circRNAs exônicos frequentemente contêm repetições curtas invertidas de sequências de elementos transponíveis, e isso levou à sugestão de que sequências de íntrons complementares facilitam a formação de circRNA. De fato, sistemas de vetor para expressar circRNAs em animais foram desenvolvidos com base nas sequências de exon-íntron de ocorrência natural com íntrons que podem ser emendados contendo repetições de TE complementares. No entanto, o papel das sequências flanqueadoras complementares na formação de circRNA permanece obscuro em plantas, uma vez que a proporção de circRNAs exônicos identificados com tais sequências de íntron flanqueadoras é muito baixa, variando de 0,3% em Arabidopsis a 6,2% em arroz.

[0732] Os transgenes de RNA em grampo longos (hpRNA) têm sido amplamente usados para induzir o silenciamento de genes ou interferência de RNA em plantas (Wesley et al., 2001). Um construto de transgene de hpRNA é tipicamente composto por uma repetição invertida com sequências de sentido e antissentido complementares com referência a uma sequência promotora e com uma sequência espaçadora entre as mesmas para separar e ligar as sequências de sentido e antissentido. O espaçador também estabiliza a estrutura de repetição invertida em um plasmídeo de DNA em células bacterianas durante a construção do vetor. Consequentemente, espera-se que o transcrito de RNA de um transgene hpRNA típico forme uma estrutura ansa pedunculada com uma haste de filamento duplo (ds) de sequências de sentido e antissentido emparelhadas em base e um "laço" correspondente à sequência espaçadora. Esses transcritos de RNA também são denominados como RNAs autocomplementares devido à capacidade das regiões de sentido e antissentido de anelar por emparelhamento em base, formando a região de dsRNA ou região de haste da molécula.

FRAGMENTOS DE LAÇO DE HPRNA LONGO ACUMULAM EM CÉLULAS VEGETAIS E SÃO RESISTENTES A RNASE R

[0733] Foi produzido um transgene que codificou um hpRNA longo direcionado ao mRNA de GUS, que tem sequências de sentido e antissentido de 563 bp e um espaçador de 1113 bp (Figura 40, GUShp1100). Um segundo transgene também foi produzido, o qual codificou um hpRNA mais curto direcionado ao mesmo mRNA de GUS, que tem sequências de sentido e antissentido de 93 bp e um espaçador de 93 bp (GUShp93-1). Ambos os construtos foram introduzidos separadamente em células de folha de Nicotiana benthamiana para expressão transitória dos RNAs em grampo e também foram usados para transformar plantas de A. thaliana para expressão como transgenes hereditários e integrados de forma estável. Conforme relatado anteriormente, ambos os construtos geraram fragmentos de RNA distintos, do tamanho esperado para as sequências de laço quando introduzidos e expressos em células vegetais (Figura 41; Wang et al., 2008; Shen et al., 2015). No presente estudo, os inventores queriam determinar se as sequências de laço eram convertidas em RNAs circulares.

[0734] Um terceiro construto foi produzido tendo um promotor U6 de Arabidopsis em vez do promotor 35S para a expressão do hpRNA mais curto (GUShp93-2). Um quarto construto de hpRNA de GUS também foi produzido, incluindo um íntron PDK como sequência espaçadora (GUShpPDK na Figura 40). Esse construto codifica um RNA em grampo em que se espera que o íntron seja dividido após a transcrição, deixando uma sequência de laço muito mais curta. Esses construtos também foram introduzidos nas folhas de N. benthamiana para examinar se as sequências de laço poderiam ser detectadas e se as mesmas formavam RNA circular. A haste do dsRNA e as sequências de laço nesses construtos foram todas derivadas da sequência de codificação de GUS e nenhuma sequência de íntron conhecida foi introduzida. Os construtos foram introduzidos separadamente nas folhas de N. benthamiana usando infiltração mediada por Agrobacterium, na presença ou ausência de um construto de expressão de GUS alvo, juntamente com um construto genético que codifica e expressa a proteína 2b do vírus do mosaico do pepino como uma proteína supressora viral (VSP) para aumentar a expressão do transgene. O acúmulo e o tamanho dos fragmentos de laço foram analisados usando ensaios de hibridização de Northern blot. A autorradiografia de um Northern blot representativo é mostrada na Figura 42.

[0735] Conforme mostrado na Figura 42, o fragmento de laço longo de GUShp1100 foi prontamente detectado em amostras infiltradas com Agrobacterium, conforme relatado anteriormente (Shen et al., 2015). Para testar se esse fragmento de laço era circular, as amostras de RNA foram tratadas com RNase R e submetidas à eletroforese em géis de poliacrilamida. O tratamento com RNase R usou 10 µg de RNA total (ou 50 ng de transcrição in vitro) misturado com tampão de RNase R e água em um volume total de 20 µl. As misturas foram aquecidas em água fervente por 3 min, resfriadas rapidamente em gelo, em seguida 0,5 µl de RNase R foi adicionado e o tubo foi incubado a 37 o C por 10 min. A enzima foi inativada e o RNA residual recuperado por precipitação com etanol. O tratamento com RNase R degradou a maior parte do RNA, conforme indicado pela redução dramática no material marcado com brometo de etídio nos géis (Figura 42, painel inferior). Com todos os ensaios de tratamento com RNase R, vários fragmentos de RNA ribossômico permaneceram visíveis nos géis, indicando resistência parcial de algumas espécies de RNA a RNase R. Apesar do esgotamento de RNA total nas amostras tratadas com RNase R, o fragmento de laço de aproximadamente

1.100 nt permaneceu abundante, com apenas cerca de 24% de redução na quantidade em comparação com as amostras não tratadas. Isso indicou que o fragmento de laço era relativamente resistente à digestão com RNase R e, portanto, tinha uma estrutura circular. A redução de 24% na quantidade de RNA de laço em relação à amostra não tratada foi atribuída a quantidades residuais de atividade de endonuclease na enzima RNase R obtida comercialmente ou à recuperação de RNA reduzida após digestão de RNase R durante a etapa de precipitação com etanol.

[0736] O ensaio de tratamento com RNase R foi repetido com inclusão de 50 ng de RNA transcrito in vitro que corresponde à sequência de laço como um controle de RNA linear. Além disso, uma amostra de RNA de N. benthamiana infiltrado por hpGUS1100 foi tratada com duas rodadas de tratamento com

RNase R, para testar a resistência a RNase R de forma mais rigorosa. Observou-se que 76% do fragmento de laço das folhas de N. benthamiana infiltradas com GUShp1100 permaneceu após um tratamento com RNase R, enquanto apenas cerca de 8,5% do transcrito linear in vitro permaneceu. O tratamento com RNase R duplo reduziu adicionalmente o material derivado do laço, mas não o eliminou. Também foi notado que a banda de RNA de amostras de N. benthamiana correspondente à sequência de laço apareceu maior no gel blot do que no transcrito in vitro, consistente com RNA circular cuja migração foi relatada como sendo mais lenta em eletroforese em gel do que moléculas de RNA linear com o mesmo número de nucleotídeos. Concluiu-se a partir desses experimentos que a sequência de laço de cerca de

1.100 nucleotídeos era circular.

[0737] A análise de hibridização de Northern blot de amostras de RNA de N. benthamiana infiltradas com GUShp93- 1 e GUShpPDK também detectou moléculas de RNA de um tamanho correspondente ao comprimento das sequências de laço. Para os construtos GUShp93-1 e GUShp93-2, o GUShp93-2 dirigido pelo promotor U6 rendeu mais fragmento de laço do que o GUShp93-1 dirigido pelo promotor 35S, indicando que o promotor U6 tinha atividade transcricional mais forte do que o promotor 35S nas células de folha de N. benthamiana ou que as moléculas eram de alguma forma mais estáveis.

[0738] O construto GUShpPDK tinha uma sequência espaçadora que incluía um íntron PDK que pode ser processado de 0,76 kb de tamanho e os transcritos primários deste construto, portanto, continham um laço de aproximadamente 0,8 kb. Os Northern blots foram tratados para remover a sonda GUS e sondados novamente com uma sonda antissentido de comprimento total contra a sequência do íntron PDK. A sonda PDK hibridizou fortemente com uma espécie desconhecida de RNA que foi observada como uma banda intensa em todas as faixas. O tratamento com RNase A reduziu, mas não conseguiu eliminar totalmente essa banda não específica. No entanto, uma banda específica do íntron PDK do tamanho esperado pode ser detectada nas amostras de RNA infiltradas com GUShpPDK, embora a abundância do fragmento pareça relativamente fraca, possivelmente porque a sequência do íntron foi separada da maioria dos transcritos primários de GUShpPDK. Para examinar se o fragmento de laço de PDK era circular, o RNA de folhas de N. benthamiana infiltradas com GUShpPDK foi tratado com RNase R. A banda de hibridização não específica foi quase completamente removida por tratamento com RNase R. Em contraste, a banda de íntron PDK foi prontamente detectada após o tratamento com RNase R, embora a abundância não pudesse ser facilmente comparada com a amostra não tratada devido ao forte sinal da banda não específica. Tomados em conjunto, esses resultados indicaram que os transcritos de hpRNA foram um precursor eficaz para a formação de RNA circular e sugeriram que o RNA circular correspondia a toda a sequência de laço.

FRAGMENTO DE LAÇO RESISTENTE A RNASE R TAMBÉM SE ACUMULA EM PLANTAS ARABIDOPSIS TRANSFORMADAS DE FORMA ESTÁVEL

[0739] O hpGUS347 e os dois construtos hpGFP (Figura 40) foram usados para transformar plantas A. thaliana do ecótipo Col-0 e duas plantas que expressam o transgene selecionado para cada construto. O construto hpGUS347 foi usado nesse experimento como um controle para os construtos hpGFP que foram projetados para conter locais de ligação miR165/166 para testar a função de esponja de miRNA (discutida no Exemplo

24). As plantas transgênicas da geração T2 foram analisadas quanto ao acúmulo de moléculas de RNA produzidas a partir do construto hpGUS347, em particular para detectar sequências de laço e se as mesmas eram circulares. Uma banda correspondente ao laço de transcritos de hpGUS347 foi detectada nas amostras de RNA tanto tratadas com RNase R quanto não tratadas de duas linhagens de hpGUS347. Como às amostras de RNA dos tecidos de N. benthamiana infiltrados com Agrobacterium, pareceu haver uma ligeira redução na intensidade da banda nas amostras tratadas com RNase R em comparação com as não tratadas, mas a maior parte do sinal de RNA foi retido. A análise RT-qPCR, usando iniciadores projetados para detectar circRNA, confirmou a presença de circRNA em amostras de hpGUS347 tratadas com RNase R com uma ligeira redução na abundância em comparação com as amostras não tratadas. Esses resultados indicaram que os transgenes de hpRNA integrados de forma estável que foram expressos para produzir RNAs em grampo também geraram circRNAs a partir das sequências de laço.

OS LAÇOS DE TRANSCRIÇÕES DE HPRNA FORAM RETIRADOS NA JUNÇÃO DE ANSA PEDUNCULADA DE DSRNA E FORMARAM RNA CIRCULAR

[0740] Para confirmar adicionalmente a natureza circular das moléculas de RNA derivadas das sequências de laço e para caracterizar suas sequências de junção, as sequências de laço foram amplificadas por RT-PCR de amostras infiltradas por GUShp1100, GUShp93 e GUShpPDK usando iniciadores de oligonucleotídeo que amplificariam sequências de junção putativas. Os produtos de RT-PCR foram então clonados no vetor pGEM-T Easy e sequenciados, confirmando as sequências de nucleotídeos nas junções. As posições dos nucleotídeos de excisão e junção do laço nos RNAs circulares foram um tanto variáveis, com os locais 5’ localizados dentro da extremidade 3' da haste do dsRNA e os locais 3’ próximos da extremidade 3’ do laço, mas os locais 5’ mostraram uma clara preferência pelo nucleotídeo G localizado a 10 nucleotídeos da extremidade 3’ da haste do dsRNA. Observou-se que os locais de excisão e de união do RNA circular do íntron PDK seguiram o mesmo padrão que aqueles do RNA GUShp1100 e GUShp93, e estavam fora dos locais de splicing do íntron canônico. Concluiu-se que a formação do RNA circular foi determinada pela estrutura ansa pedunculada independentemente do splicing do íntron. Também foi concluído que, pelo menos nesse exemplo, o RNA em grampo foi processado para liberar e tornar circular a sequência de laço por uma clivagem de 5’ dentro da extremidade 3' da haste do dsRNA e uma clivagem de 3’ perto da extremidade 3' da sequência de laço, com uma ligação covalente formada entre as extremidades 5’ e 3' da sequência retirada. EXEMPLO 23. HPRNA EXPRESSO EM SACCHAROMYCES

CEREVISIAE NÃO FOI PROCESSADO EM RNA CIRCULAR

[0741] A espécie de levedura, Saccharomyces cerevisiae, é um organismo eucariota e possui mecanismo de splicing de íntron como todos os eucariotas. Como o atual modelo de consenso para a formação de RNA circular é com base em splicing de íntron, os inventores investigaram se o hpRNA poderia formar RNA circular em S. cerevisiae como fez em células vegetais. Para gerar um construto para expressar um hpRNA, a região de repetição invertida de GUShp1100 foi retirada do vetor de expressão de planta e inserida em um vetor de expressão de levedura sob o controle de um promotor ADH1 de levedura (Figura 43), e o construto genético resultante introduzido em células S cerevisiae. Conforme mostrado na

Figura 43, a análise de hibridização de Northern blot de RNA extraído de cada uma das três cepas de leveduras transgênicas independentes detectou uma banda de alto peso molecular correspondente ao transcrito GUShp1100. Isso indicou que o transcrito GUShp1100 não foi processado em S. cerevisiae, mas permaneceu completo. Para confirmar isto, os transcritos GUShp1100 expressos por S. cerevisiae e por N. benthamiana expressos foram comparados quanto à sua resposta ao tratamento com RNase R. Conforme mostrado na Figura 44, o RNA expresso por S. cerevisiae mostrou uma banda de alto peso molecular que era altamente sensível ao tratamento com RNase R e, portanto, não circular. Ou seja, as amostras de RNA de levedura não exibiram moléculas circulares derivadas da sequência de laço, como foi produzido nas células de N. benthamiana. Os resultados indicaram que o transcrito GUShp1100 expresso em S. cerevisiae não foi processado e permaneceu completo. O tamanho da banda de RNA de S. cerevisiae pareceu maior por eletroforese em gel do que o transcrito GUShp1100 in vitro, presumivelmente devido às sequências de UTR e poli (A) 5’ e 3' que estavam presentes no RNA expresso em S. cerevisiae, mas não na transcrição in vitro. Assim, a presença de mecanismo de splicing de íntron em S. cerevisiae não foi suficiente para permitir o processamento do laço de hpRNA e a formação de RNA circular como ocorreu nas células vegetais.

[0742] De forma semelhante, o construto genético GUShp347 foi introduzido em S. cerevisiae e expressa. A análise de hibridização de Northern blot mostrou novamente que o hpRNA parecia de comprimento completo e aparentemente não foi processado, pelo menos não com a clivagem da sequência do laço ou da região do dsRNA.

[0743] Os inventores concluíram que a levedura S. cerevisiae e suas leveduras de brotação relacionadas, que não têm enzimas Dicer (Drinnenberg et al., 2003), são vantajosas como um organismo para a produção de grampo de comprimento total e ledRNAs, incluindo as moléculas de RNA modificadas descritas no presente documento. Esses RNAs de comprimento total são úteis quando o dsRNA não processado é desejado, por exemplo, para silenciar a atividade do gene por aplicação tópica a insetos. EXEMPLO 24. LAÇOS DE HPRNA PODEM FUNCIONAR COMO UMA "ESPONJA" EFICAZ PARA SUPRIMIR A FUNÇÃO DE MIRNA

[0744] Constatou-se que alguns RNAs circulares em animais contêm múltiplas sequências que são complementares a miRNAs específicos e, portanto, atuam como locais de ligação para esses miRNAs, denominados como "esponjas" de miRNA. Os inventores testaram se o RNA circular produzido a partir de construtos longos de hpRNA poderia funcionar como uma esponja de miRNA em células vegetais. Foram projetados dois construtos de hpRNA de GFP (Figura 40) que tinham o mesmo espaçador derivado de sequência de GUS, exceto que um foi modificado na sequência para ter dois locais de ligação de Arabidopsis miR165/166. Esse construto, GFPhp[G:U], tinha uma sequência de repetição invertida que tinha a mesma sequência antissentido que o segundo construto (controle) GFPhp[WT], mas com uma sequência de sentido modificada na qual todos os nucleotídeos de citosina foram substituídos por timinas. A transcrição de GFPhp[G:U] formaria, portanto, uma região de dsRNA correspondente à sequência de GFP, exceto que cerca de 25% dos pares de base eram pares de base G:U. O outro construto, GFPhp[WT], codificou um RNA em grampo com uma haste de dsRNA emparelhada em base de forma totalmente canônica do mesmo comprimento que o grampo de GFPhp[G:U], e foi usado como um controle (Figura 40). O construto hpRNA de GUS GUShp347, contendo um espaçador sem locais de ligação a miR165/166, foi incluído como segundo controle.

[0745] Os construtos foram usados para transformar separadamente A. thaliana e as plantas transgênicas foram obtidas para cada um dos três construtos. As plantas transformadas foram examinadas visualmente para fenótipos relacionados à redução em miR165/166, que incluiu um dobramento distinto de folhas em “trombetas”. Como esperado, as plantas transformadas com GUShp347 não mostraram fenótipos associados à repressão de miR165/166. De forma semelhante, nenhum fenótipo claro foi observado em plantas transformadas com GFPhp[WT]. Em contraste, a maioria das plantas GFPhp[G:U] mostrou vários níveis de fenótipos reminiscentes da repressão de miR165/166, incluindo o fenótipo de trombeta.

[0746] A hibridização Northern blot foi realizada em RNA extraído de plantas transformadas com GFPhp[G:U] com uma gama de fenótipos leves, moderados e fortes a graves para examinar o acúmulo de expressão de hpRNA. A sonda utilizada foi um RNA antissentido de comprimento total correspondente ao mRNA de GUS. A sonda tinha uma complementaridade de sequência contínua de 822 bp com o sentido e o laço adjacente do transcrito GUShp347. A sonda tinha menos complementaridade de sequência com os transcritos de GFPhp que tinham um total de 228 bp da região de laço como sequência derivada de GUS, em três regiões não contíguas de 49, 109 e 70 bp de comprimento flanqueando as duas sequências de ligação de miRNA. Conforme mostrado na Figura 45B, quantidades altamente abundantes de moléculas de GFP hpRNA foram detectadas nas plantas GFPhp[G:U] e as quantidades de moléculas de RNA detectadas nos Northern blots correlacionaram-se positivamente com a gravidade dos fenótipos. As plantas GFPhp[WT] exibiram níveis baixos de acúmulo de moléculas de hpRNA que foram apenas detectáveis nas análises de Northern blot, consistentes com níveis de transcrição relativamente baixos de transgenes hpRNA convencionais em comparação com os transgenes hpRNA modificados com G:U. Isto é, conforme mostrado nos Exemplos acima, os transgenes hpRNA[G:U] foram menos sujeitos a autossilenciamento em comparação com o transgene hpRNA[WT] correspondente.

[0747] RT-qPCR foi usado para quantificar o acúmulo de moléculas de RNA circulares derivadas das sequências de laço. Os resultados mostraram que grandes quantidades de circRNA estavam presentes nas plantas transgênicas GFPhp[G:U] que se correlacionaram com os níveis de acúmulo de hpRNA de comprimento total (Figura 45C). As análises de hibridização de Northern blot para detectar RNAs pequenos no intervalo de tamanho de 20 a 25 nt confirmaram a infrarregulação de miR165/166 nas plantas GFPhp[G:U]. A extensão da redução se correlacionou com a quantidade de hpRNA e circRNA e a gravidade dos fenótipos. A análise de expressão do gene alvo miR165/166 usando RT-qPCR mostrou que a repressão do gene alvo por miR165/166 foi liberada nas plantas que mostraram infrarregulação forte de miR165/166 e fenótipos graves. Tomados em conjunto, esses resultados mostraram que laços de hpRNA podem ser usados como uma esponja de miRNA específica para reprimir a função de miRNA em plantas.

[0748] Os inventores também conceberam o uso dos

RNAs circulares, produzidos em níveis altos em células vegetais como moléculas estáveis, para serem traduzidos como um meio para produzir níveis altos de polipeptídeos. Para o início da tradução independente do cap, os locais de entrada do ribossomo interno (IRES) são idealmente usados. Inúmeras sequências de IRES foram identificadas.

[0749] Será entendido por pessoas versadas na técnica que várias variações e/ou modificações podem ser feitas à invenção, conforme mostrado nas modalidades específicas, sem se afastar do espírito e escopo da invenção, conforme amplamente descrita. Portanto, as presentes modalidades devem ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.

[0750] O presente pedido reivindica prioridade dos documentos AU 2018902840 depositado em 3 de agosto de 2018, AU 2018902896 depositado em 8 de agosto de 2018, PCT/AU2018/051015 depositado em 17 de setembro de 2018 e AU 2019900941 depositado em 20 de março de 2019 cujas revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência.

[0751] Todas as publicações discutidas e/ou referenciadas no presente documento são incorporadas no presente documento em sua totalidade.

[0752] Qualquer discussão de documentos, ações, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foram incluídos no presente relatório descritivo para o propósito de fornecer um contexto para a presente invenção. Não deve ser tomado como uma admissão que qualquer um ou todas essas matérias fazem parte da base da técnica anterior ou eram conhecimento comum no campo relevante à presente invenção na medida que existia antes da data de prioridade de cada reivindicação deste pedido.

REFERÊNCIAS Abraham (2002). Cell 111 :9 a 12. Acevedo a Garcia et al., (2017). Plant Biotechnology Journal 15:367 a 378. Alvarez et al., (2000). Theor Appl Genet 100:319 a 327. Baumlein et al., (1991). Mol. Gen. Genet. 225:459 a 467. Baumlein et al., (1992). Plant J. 2:233 a 239. Bhattacharyya et al., (1990) Cell 60: 155 a 122. Brar et al., (1996) Biotech Genet. Eng Rev 13: 167 a 79. Broothaerts et al., (2005). Nature 433 :629 a 633. Broun et al., (1998). Plant J. 13 :201 a 210. Buchanan a Wollaston, (1994) Plant physiology 105:839 a 846. Busk et al., (1997). Plant J. 11: 1285 a 1295. Chen et al., (2005). Functional Plant Biology 32:671 a 681. Chikwamba et al., (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 11127 a 11132. Christou e Klee, (2004) Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons. Chung et al., (2006). BMC Genomics 7: 120. Clough e Bent (1998). Plant J. 16:735 a 743. Corrado e Karali (2009). Biotechnol. Adv. 27:733 a 743. Courvalin et al., (1995). Life Sci. 318: 1209 a 1212. Dadd e Mittler (1966). Experientia 22:832 a 833. Darji et al., (1997). Cell 91 :765 a 775. Dong et al., (201 1) Plant J. 68:633 a 45. Draper e Scott (1988). In: J. Draper et al., (Eds.), Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual, Alden Press, Oxford, pp. 199 a 236. Dunwell (2000). J Exp Botany 51 Spec No:487 a 496.

Ellerstrom et al., (1996). Plant Mol. Biol. 32: 1019 a 1027. Elliott et al., (2002). Mol. Plant Microbe Interact. 15: 1069 a 1077. Ellis et al., (1987). EMBO J 6: 11 a 16. Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987). Gan (1995). Molecular characterization and genetic manipulation of plant senescence. PhD thesis. University of Wisconsin, Madison. Gan and Amasino (1995). Science 270: 1986 a 1988. Glawe (2008). Ann. Rev. Phytopathol. 46:27 a 51. Gleave (1992). Plant Mol Biol 20: 1203 a 1207. Gupta et al., (1988) Plant Mol. Biol. 10:215 a 224. Helliwell and Waterhouse (2005). Methods in Enzymology 392:24 a 35. Hinchee et al., (1988). Biotechnology 6:915 a 922. Horvath et al., (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 1914 a 1919. Hsieh and Fire (2000) Annu Rev Genet 14: 187 a 204. Jeddeloh,et al., (1999). Nat. Genet. 22:94 a 97. Jefferson et al., (1987). EMBO J 6:3901 a 3907. Jepson et al., (1994). Plant Mol. Biol. 26: 1855 a 1866. Khan (2017). Sci Rep 7, 40025 Kishore and Somerville (1993). Curr Opin Biotechnol. 4: 152 a

158. Koziel et al., (1996). Plant Mol. Biol. 32:393 a 405. Lacroix et al., (2008). Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 105: 15429 a 15434. Li et al., (1996). FEB S Lett. 379: 117 a 121. McCahill et al., (2002). Molecular Pharmacology 62: 1261 a

1273.

McCullough and Schuler (1997). Nucl Acids Res. 25: 1071 a 1077. Mahfouz et al., (2006). Plant Cell 18:477 a 490. Matsuoka et al., (1994). Plant J. 6:311 a 319. Meier et al., (1997). FEBS Lett. 415:91 a 95. Melamed a Bessudo et al., (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(16):e981 a 988. Millar et al., (2006). Plant J. 45:942 a 954. Mutti et al., (2006). J Insect Sci 6:38. Mutti et al., (2008). Proceedings of the National Academy of Sciences 105:9965 a 9969. Olive et al., (1989) Plant Mol Biol 12:525 a 538. Padidam (2003). Transgenic Res. 12: 101 a 109. Perrin et al., (2000). Mol Breed 6:345 a 352. Pitino et al., (2011). PLoS ONE 6, e25709. Pitino and Hogenhout (2012). Molecular Plant a Microbe Interactions 26: 130 a 139. Potenza et al., (2004). In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 40: 1 a 22. Powell et al., (1996). Vaccines 183, Abstract. Preiss et al., (1987). In: Tailoring Genes for Crop Improvement (Bruening et al., eds.), Plenum Press, S.133 a 152. Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Schaffner (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:2163 a 2167. Schwartz et al., (1997). Science 276: 1872 a 1874. Scott et al., (2013). Journal of Insect Physiology 59: 1212 a

1221. Seddas et al., (2004). Virology 325:399 a 412. Shiina et al., (1997). Plant Physiol. 115:477 a 483. Shure et al., (1983). Cell 35:225 a 233.

Sizemore et al., (1995). Science 270:299 a 302. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003). Smith et al., (2000). Nature 407:319 a 320. Stalker et al., (1988). Science 242: 419 a 423. Stewart et al., (2000). J Mol Biol 298:61 1 a 622. Tan et al., (201 1). Plant Physiol. 156: 1577 a 1588. Thillet et al., (1988). J. Biol. Chem 263: 12500 a 12508. Timmons et al., (2001). Gen 263: 103 a 1 12. Ulmasov et al., (1995). Plant Physiol. 108:919 a 927. Wang MB. Isolation of phloem specific gene promoters for use in genetic engineering of insect resistance in rice. PhD thesis, University of Durham, UK. Wang et al., (1994) Plant Molecular Biology 24: 159 a 170. Wang et al., (1998) Acta Horticulturae 461 :401 a 407. Wang et al., (2008) RNA 14: 903 a 913.Wang et al., (2013). PLoS Genet 9, el003865. Wang et al., (2014). Nature Biotechnology 32:9. Weiss (2003). Int. J. Med. Microbiol. 293:95: 106. Weissbach et al., (1988). In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif. Wijnker et al., (2008). Trends in Plant Science 13 :640 a 646. Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Yang et al., (2003). Planta 216:597 a 603. Yelina et al., (2012). PLoS Genetics 8(8):el002844. doi:

10.1371/journal.pgen. l002844 Yu et al., (2016). Pest Management Science 72: 1090 a 1098. Zhang et al., (2018). Nat Rev Mol Cell Biol. 19:489 a 506.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO (RNA), caracterizada por compreender uma região de RNA de filamento duplo (dsRNA) que compreende um primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de comprimento e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos de comprimento, pelos quais a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e as primeiras sequências de ribonucleotídeos antissentido têm capacidade para hibridizar um ao outro para formar a região de dsRNA, em que i) a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em, covalentemente ligados na ordem 5' a 3', um primeiro ribonucleotídeo 5', uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', ii) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em, covalentemente ligados na ordem 5' a 3', um segundo ribonucleotídeo 5', uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3', iii) os primeiros pares de base de ribonucleotídeos 5' com o segundo ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA, iv) os segundos pares de base de ribonucleotídeo 5' com o primeiro ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA, v) entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido totalmente emparelhados em base em um par de base não canônico vi) a região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos, vii) a molécula de RNA tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pelo qual a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curtas (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento, viii) a molécula de RNA ou ao menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, são capazes de reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA-alvo na célula eucariota, e ix) a molécula de RNA é capaz de ser produzida enzimaticamente por transcrição in vitro ou em uma célula, ou ambos.

2. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido ser ligada de modo covalente à primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos, ou entre 4 e 1.000 ribonucleotídeos, ou entre 4 e 200 ribonucleotídeos, ou entre 4 e 50 ribonucleotídeos, ou pelo menos 10 nucleotídeos, ou entre 10 e 1.000 ribonucleotídeos, ou entre 10 e 200 ribonucleotídeos, ou entre 10 e 50 ribonucleotídeos, de comprimento, pelos quais a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3' e ao primeiro ribonucleotídeo 5’ ou, de preferência, ao primeiro ribonucleotídeo 3' e ao segundo ribonucleotídeo 5’, de modo que as sequências sejam compreendidas em um único filamento contíguo de RNA.

3. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela sequência de laço na molécula de RNA compreender uma ou mais sequências de ligação que são complementares a uma molécula de RNA que é endógena à célula eucariota, e/ou a sequência de laço na molécula de RNA compreende uma fase de leitura aberta que codifica um polipeptídeo ou um polinucleotídeo funcional.

4. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA)QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido do dsRNA, no total, serem emparelhados em base em pares de base G:U.

5. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA)QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido ser totalmente complementar a uma região do RNA alvo e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido é diferente em sequência à região do RNA alvo pela substituição de nucleotídeos C na região do RNA alvo por nucleotídeos U.

6. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA)QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 3' e ao segundo ribonucleotídeo 5’,

e a molécula de RNA compreende adicionalmente uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende a sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3' e a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido.

7. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3' e ao primeiro ribonucleotídeo 5’, e a molécula de RNA compreende adicionalmente uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende a sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3' e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido.

8. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segundas sequências de ribonucleotídeos antissentido têm capacidade para hibridizar um ao outro para formar uma segunda região de dsRNA, e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 3' e ao segundo ribonucleotídeo 5’, e a molécula de RNA compreende, opcionalmente, uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3' e a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido ou que liga covalentemente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido.

9. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido são ligadas por uma primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento, pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3' e ao primeiro ribonucleotídeo 5’, e a molécula de RNA compreende adicionalmente uma segunda sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende uma sequência de laço de pelo menos 4 nucleotídeos de comprimento e que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 3' e à segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, ou que liga covalentemente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido.

10. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pela segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e pela segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido compreenderem, cada uma, pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento.

11. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizada pela primeira e segunda sequências de ribonucleotídeos de sentido serem ligadas covalentemente por uma sequência de ribonucleotídeos interveniente que não está relacionada em sequência à molécula de RNA alvo, ou que está relacionada em sequência à molécula de RNA alvo, ou a primeira e segunda sequências de ribonucleotídeos de sentido são ligadas covalentemente sem uma sequência de ribonucleotídeos interveniente.

12. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizada pela primeira e segunda sequências de ribonucleotídeos antissentido serem ligadas covalentemente por uma sequência de ribonucleotídeos interveniente que não está relacionada em sequência ao complemento de uma molécula de RNA alvo, ou que está relacionada em sequência ao complemento de uma molécula de RNA alvo, ou a primeira e segunda sequências de ribonucleotídeos antissentido são ligadas covalentemente sem uma sequência de ribonucleotídeos interveniente.

13. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO,

de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizada por entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e da segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, serem emparelhados em base em um par de base não canônico ou não serem emparelhados em base, de preferência emparelhados em base em pares de base G:U, em que a segunda região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos, e em que a molécula de RNA tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pela qual a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curtas (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento.

14. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizada por cada sequência de ribonucleotídeo de ligação ter independentemente entre 4 e cerca de 2.000 nucleotídeos de comprimento, de preferência entre 4 e cerca de 1.200 nucleotídeos de comprimento, com mais preferência entre 4 e cerca de 200 nucleotídeos de comprimento e com máxima preferência entre 4 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.

15. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, caracterizada por compreender adicionalmente a sequência dianteira de 5' ou uma sequência traseira de 3' ou ambas.

16. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, caracterizada por compreender um primeiro componente de RNA e um segundo componente de RNA que é ligado covalentemente ao primeiro componente de RNA, em que o primeiro componente de RNA compreende uma primeira região de RNA de filamento duplo (dsRNA), que compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido que têm capacidade para hibridizar entre si a fim de formar a primeira região de dsRNA, e uma primeira sequência de ribonucleotídeos interveniente de pelo menos 4 nucleotídeos que liga de modo covalente a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que o segundo componente de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos interveniente de pelo menos 4 ribonucleotídeos que liga de modo covalente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido hibridiza com a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido na molécula de RNA, em que no primeiro componente de RNA, i) a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5’ a 3’, um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3’, ii) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos ligados covalentemente, na ordem de 5’ a 3’, um segundo ribonucleotídeo 5’, uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3', iii) os primeiros pares de base de ribonucleotídeos

5' com o segundo ribonucleotídeo 3', iv) os segundos pares de base de ribonucleotídeo 5' com o primeiro ribonucleotídeo 3', v) entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido totalmente emparelhados em base em um par de base não canônico, e vi) a primeira região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos, em que a molécula de RNA quimérico tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curto (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento, e em que (a) a molécula de RNA quimérico ou pelo menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, têm capacidade para reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA alvo na célula eucariota, ou (b) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido compreende uma sequência de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos que é pelo menos 50% idêntica em sequência, de preferência pelo menos 90% ou 100% idêntica em sequência, a uma região do complemento da molécula de RNA alvo, ou (c) ambos (a) e (b).

17. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada por pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido terem, todos, capacidade para emparelhamento de base a nucleotídeos de uma primeira região da molécula de RNA alvo.

18. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a molécula de RNA é caracterizada por compreender duas ou mais primeiras sequências de ribonucleotídeos antissentido, e sequências de ribonucleotídeos de sentido emparelhada em base às mesmas, sequências antissentido as quais são, cada uma, complementares, de preferência totalmente complementares, a uma região de uma molécula de RNA alvo.

19. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelas duas ou mais primeiras sequências de ribonucleotídeos antissentido serem complementares a diferentes regiões da mesma molécula de RNA alvo.

20. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelas duas ou mais primeiras sequências de ribonucleotídeos antissentido serem complementares a regiões de diferentes moléculas de RNA alvo.

21. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA)QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por compreender um estrutura de RNA em grampo (hpRNA) que tem uma extremidade 5’, uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento, uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que é totalmente emparelhada em base com a sequência de ribonucleotídeos de sentido ao longo de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos, uma sequência de laço interveniente e uma extremidade 3’.

22. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO,

de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por compreender um único filamento de ribonucleotídeos que têm uma extremidade 5’, pelo menos uma sequência de ribonucleotídeos de sentido que tem pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento, uma sequência de ribonucleotídeos antissentido que é totalmente emparelhada em base com cada sequência de ribonucleotídeos de sentido ao longo de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos, pelo menos duas sequências de laço e uma extremidade 3’.

23. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada por entre cerca de 10% e cerca de 30%, entre cerca de 15% e cerca de 30%, ou entre cerca de 16% e cerca de 25%, dos ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de sentido e da sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, serem emparelhados em base em um par de base não canônico, de preferência emparelhados em base em pares de base G:U.

24. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada por pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou 100% dos pares de base não canônicos serem pares de base G:U.

25. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada por menos que 25%, menos que 20%, menos que 15%, menos que 10%, menos que 5%, menos que 1%, ou nenhum, dos ribonucleotídeos na região de dsRNA não serem emparelhados em base.

26. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada por cada um em quatro a todos em seis ribonucleotídeos na região de dsRNA formarem um par de base não canônico ou não serem emparelhados em base, de preferência formarem um par de base G:U.

27. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pela região de dsRNA não compreender 8 pares de base canônicos contíguos.

28. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pela região de dsRNA compreender pelo menos 8 pares de base canônicos contíguos, de preferência pelo menos 8, mas não mais que 12 pares de base canônicos contíguos.

29. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada por todos os ribonucleotídeos na região de dsRNA, ou em cada região de dsRNA, serem emparelhados em base com um par de base canônico ou um par de base não canônico.

30. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada por um ou mais ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos de sentido ou um ou mais ribonucleotídeos da sequência de ribonucleotídeos antissentido, ou ambos, não serem emparelhados em base.

31. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada por a sequência de RNA antissentido ser menos que 100% idêntica, ou entre cerca de 80% e 99,9% idêntica, ou entre cerca de 90% e 98% idêntica, ou entre cerca de 95% e 98% idêntica, em sequência ao complemento de uma região da molécula de RNA alvo.

32. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pela sequência de RNA antissentido ser 100% idêntica em sequência a uma região da molécula de RNA alvo.

33. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizada pela sequência de ribonucleotídeos de sentido e/ou antissentido, de preferência ambas, terem pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1.000, ou cerca de 100 a cerca de 1.000, ou 50 a cerca de 1.000 nucleotídeos, ou 50 a cerca de 500 nucleotídeos, de comprimento.

34. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizada pelo número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos de sentido estar entre cerca de 90% e cerca de 110% do número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos antissentido.

35. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos de sentido ser igual ao número de ribonucleotídeos na sequência de ribonucleotídeos antissentido.

36. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO,

de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, em que a molécula de RNA quimérico é caracterizada por compreender adicionalmente uma sequência de extensão de 5’ que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 5’ ou uma sequência de extensão de 3’ que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 3', ou ambas.

37. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, em que a molécula de RNA quimérico é caracterizada por compreender adicionalmente uma sequência de extensão de 5’ que é ligada de modo covalente ao segundo ribonucleotídeo 5’ ou uma sequência de extensão 3’ que é ligada de modo covalente ao primeiro ribonucleotídeo 3’, ou ambas.

38. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada por compreender duas ou mais regiões de dsRNA que são iguais ou diferentes.

39. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizada por, quando expressa em uma célula eucariota, mais moléculas de asRNA serem formadas, as quais têm 22 e/ou 20 ribonucleotídeos de comprimento quando comparadas ao processamento de uma molécula de RNA análoga que tem uma região de dsRNA correspondente que é totalmente emparelhada em base com pares de base canônicos.

40. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO E/OU EXÓGENO, caracterizado por codificar uma molécula de RNA quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39.

41. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser um construto de DNA.

42. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 ou 41, caracterizado por ser operacionalmente ligado a um promotor com capacidade para direcionar a expressão da molécula de RNA em uma célula hospedeira ou in vitro.

43. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo promotor ser um promotor de RNA polimerase como um promotor de RNA polimerase III, um promotor de RNA polimerase II, ou um promotor que funciona in vitro.

44. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado por codificar uma molécula precursora de RNA que compreendem um íntron, de preferência em uma sequência de extensão de 5’ ou em pelo menos uma sequência de laço, em que o íntron tem capacidade para ser emendado durante a transcrição do polinucleotídeo em uma célula hospedeira ou in vitro.

45. VETOR, caracterizado por compreender um polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 44.

46. VETOR, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por ser um vetor viral.

47. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender uma ou mais ou toda a molécula de RNA quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44, ou um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46.

48. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada por ser uma célula bacteriana, uma célula fúngica como uma célula de levedura, uma célula vegetal ou uma célula animal, de preferência uma célula vegetal.

49. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 ou 48, caracterizada por estar morta e/ou não ter capacidade para reprodução.

50. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 ou 43, ou a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizada por codificar e/ou compreender a molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, em que a região de promotor do polinucleotídeo tem um nível inferior de metilação, como menos que cerca de 50%, menos que cerca de 40%, menos que cerca de 30% ou menos que cerca de 20%, quando comparados ao promotor de um polinucleotídeo correspondente que codifica uma molécula de RNA que tem uma região de dsRNA correspondente que é totalmente emparelhada em base com pares de base canônicos.

51. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 50, de preferência uma célula vegetal ou uma célula fúngica, caracterizada por compreender a molécula de RNA quimérico ou moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, em que a molécula de RNA quimérico compreende, na ordem de 5’ a 3’, a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido, a primeira sequência de ribonucleotídeos de ligação que compreende a sequência de laço, e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido.

52. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 51, caracterizada por ser uma célula eucariota e que compreende pelo menos duas cópias do polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA quimérico,

conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, e em que i) o nível de redução na expressão ou atividade da molécula de RNA alvo na célula eucariota é cerca igual a, ou maior que, o nível de redução na expressão ou atividade da molécula de RNA alvo se a célula tivesse uma única cópia do polinucleotídeo, e/ou ii) o nível de redução na expressão ou atividade da molécula de RNA alvo na célula eucariota é menor quando comparada a uma célula correspondente que compreende uma molécula de RNA que tem uma região de dsRNA correspondente que é totalmente emparelhada em base com pares de base canônicos.

53. ORGANISMO NÃO HUMANO, caracterizado por compreender uma ou mais ou toda a molécula de RNA quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, ou uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52.

54. ORGANISMO NÃO HUMANO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por ser um organismo não humano transgênico, de preferência uma planta ou fungo, que compreende um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50.

55. ORGANISMO NÃO HUMANO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo polinucleotídeo ser integrado de modo estável no genoma do organismo.

56. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO

RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado por compreender expressar o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, em uma célula hospedeira ou sistema de expressão isento de células.

57. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por compreender adicionalmente purificar pelo menos parcialmente a molécula de RNA.

58. MÉTODO, para produzir um organismo não humano, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 54 ou 55, caracterizado por compreender introduzir o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, no interior de uma célula de modo que seja integrado de modo estável no genoma da célula, e gerar o organismo não humano a partir da célula.

59. EXTRATO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, em que o extrato é caracterizado por compreender uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50.

60. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo conforme definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, ou um extrato, conforme definido na reivindicação 59, e um ou mais carreadores adequados.

61. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada por ser uma composição farmacêutica.

62. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada por ser adequada para aplicação a plantas em crescimento em um campo.

63. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos um composto que aperfeiçoa a estabilidade de uma ou mais da molécula de RNA quimérico, moléculas de RNA produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, e o polinucleotídeo e/ou que assiste na molécula de RNA, molécula de RNA quimérico ou polinucleotídeo sendo captado por uma célula de um organismo.

64. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo composto ser um agente promotor de transfecção.

65. MÉTODO PARA REDUZIR OU INFRARREGULAR O NÍVEL E/OU

ATIVIDADE DE UMA MOLÉCULA DE RNA ALVO EM UMA CÉLULA OU UM ORGANISMO, caracterizado por compreender entregar à célula ou organismo uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 64.

66. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pela molécula de RNA quimérico ou moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, serem colocadas em contato com a célula ou organismo, de preferência uma célula vegetal, planta, fungo ou inseto, pela aplicação tópica à célula ou organismo, ou fornecida em uma alimentação para o organismo.

67. MÉTODO PARA REDUZIR DANOS CAUSADOS POR UMA PRAGA OU PATÓGENO A UM ORGANISMO NÃO HUMANO, caracterizado por compreender entregar à praga ou patógeno, ou contatar a praga ou patógeno com uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 64.

68. MÉTODO PARA CONTROLAR UM ORGANISMO NÃO HUMANO, caracterizado por compreender entregar ao organismo não humano uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 64, em que a molécula de RNA ou moléculas de RNA pequenas têm um efeito prejudicial sobre o organismo não humano.

69. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo organismo não humano ser um artrópode ou uma planta.

70. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo organismo não humano, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 53 a 55, ser uma planta, e o artrópode comer a planta ou uma porção da mesma.

71. MÉTODO PARA EVITAR OU TRATAR UMA DOENÇA EM UM SUJEITO, caracterizado por compreender administrar ao sujeito uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 64, em que a molécula de RNA quimérico ou as moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, têm um efeito benéfico sobre pelo menos um sintoma da doença.

72. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela molécula de RNA quimérico, polinucleotídeo,

vetor ou composição serem administrados topicamente, oralmente ou injetados.

73. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizado pelo sujeito ser um animal vertebrado.

74. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo animal vertebrado ser um mamífero como um humano.

75. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 64, caracterizada por ser para uso na prevenção ou tratamento de uma doença em um sujeito, em que a molécula de RNA quimérico ou as moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, têm um efeito benéfico sobre pelo menos um sintoma da doença.

76. USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 60 a 64, caracterizada por ser para a fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença em um sujeito, em que a molécula de RNA quimérico ou as moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, ou ambas, têm um efeito benéfico sobre pelo menos um sintoma da doença.

77. KIT, caracterizado por compreender uma ou mais de uma molécula de RNA quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, moléculas de RNA pequenas produzidas pelo processamento da molécula de RNA quimérico, um polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 44 ou 50, um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 45 ou 46, uma célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 47 a 52, um extrato, conforme definido na reivindicação 59, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 60 a 64.

78. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO QUIMÉRICO (RNA), caracterizada por compreender uma região de RNA de filamento duplo (dsRNA) que compreende um primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, pelos quais a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e as primeiras sequências de ribonucleotídeos antissentido têm capacidade para hibridizar um ao outro para formar a região de dsRNA, em que i) a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em, covalentemente ligados na ordem 5' a 3', um primeiro ribonucleotídeo 5', uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3', ii) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em, covalentemente ligados na ordem 5' a 3', um segundo ribonucleotídeo 5', uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3', iii) os primeiros pares de base de ribonucleotídeos 5' com o segundo ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA, iv) os segundos pares de base de ribonucleotídeo 5' com o primeiro ribonucleotídeo 3' para formar um par de base terminal da região de dsRNA, v) entre cerca de 5% e cerca de 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, têm emparelhamento de base em um par de base não canônico ou não têm emparelhamento de base, vi) a região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos, vii) a molécula de RNA tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pelo qual a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curtas (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento, viii) a molécula de RNA ou ao menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, são capazes de reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA-alvo na célula eucariota, e ix) a molécula de RNA é capaz de ser produzida enzimaticamente por transcrição in vitro ou em uma célula, ou ambos.

79. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada por compreender adicionalmente as particularidades, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15 ou reivindicações 17 a 39.

80. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, caracterizada por compreender um primeiro componente de RNA e um segundo componente de RNA que é ligado covalentemente ao primeiro componente de RNA, em que o primeiro componente de RNA compreende uma primeira região de RNA de filamento duplo (dsRNA), que compreende uma primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e uma primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido que têm capacidade para hibridizar entre si a fim de formar a primeira região de dsRNA, e uma primeira sequência de ribonucleotídeos interveniente de pelo menos 4 nucleotídeos que liga de modo covalente a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que o segundo componente de RNA compreende uma segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido, uma segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido e uma segunda sequência de ribonucleotídeos interveniente de pelo menos 4 ribonucleotídeos que liga de modo covalente a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido e a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido, em que a segunda sequência de ribonucleotídeos de sentido hibridiza com a segunda sequência de ribonucleotídeos antissentido na molécula de RNA, em que no primeiro componente de RNA,

i) a primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos covalentemente ligados, na ordem 5’ a 3’, um primeiro ribonucleotídeo 5’, uma primeira sequência de RNA e um primeiro ribonucleotídeo 3’, ii) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido consiste em pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos ligados covalentemente, na ordem de 5’ a 3’, um segundo ribonucleotídeo 5’, uma segunda sequência de RNA e um segundo ribonucleotídeo 3', iii) os primeiros pares de base de ribonucleotídeos 5' com o segundo ribonucleotídeo 3', iv) os segundos pares de base de ribonucleotídeo 5' com o primeiro ribonucleotídeo 3', v) entre 5% e 40% dos ribonucleotídeos da primeira sequência de ribonucleotídeos de sentido e da primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido, no total, têm emparelhamento de base em um par de base não canônico ou não têm emparelhamento de base, e vi) a primeira região de dsRNA não compreende 20 pares de base canônicos contíguos, em que a molécula de RNA quimérico tem capacidade para ser processada em uma célula eucariota ou in vitro pela qual a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido é clivada para produzir moléculas de RNA antissentido curto (asRNA) de 20 a 24 ribonucleotídeos de comprimento, e em que (a) a molécula de RNA quimérico ou pelo menos algumas das moléculas de asRNA, ou ambas, têm capacidade para reduzir a expressão ou atividade de uma molécula de RNA alvo na célula eucariota, ou

(b) a primeira sequência de ribonucleotídeos antissentido compreende uma sequência de pelo menos 20 ribonucleotídeos contíguos que é pelo menos 50% idêntica em sequência, de preferência pelo menos 90% ou 100% idêntica em sequência, a uma região do complemento da molécula de RNA alvo, ou (c) ambos (a) e (b).

81. MOLÉCULA DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizada por compreender adicionalmente as particularidades, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 39.