CN117286178B - 一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用。本发明针对双组份植物病毒载体进行了优化，使双组份的病毒基因组放置在单一质粒中。单一质粒的使用，避免了辅助菌的活化、重悬和混匀过程，简化了农杆菌实验阶段一半的工作量，避免了混菌过程中潜在的交叉污染风险，提高了病毒侵染性，因此极大简化了双组份病毒载体的使用。本发明能够通过串联多个病毒基因组实现更为复杂的基因操纵，因而更适用于构建VIGS突变体库以及基于VIF的大规模材料快速繁种等高通量应用。本发明还为其它双组份病毒载体的从头开发和应用提供了简化模版。
Description
技术领域
本申请属于生物工程技术领域，具体涉及一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用。
背景技术
植物病毒载体是一类特殊的植物表达载体，常被用于病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）实验。相较于普通的植物表达载体，病毒载体在植物基因功能研究中具有独特的优势。其原理是利用植物对病毒的RNAi免疫反应和植物病毒可以在植物体内复制并系统性侵染植物的特点，可以将内源基因片段或全长通过植物病毒载体进行表达，从而实现病毒介导的基因沉默（VIGS）、病毒介导的基因过表达（VOX）、病毒诱导的开花（VIF）和病毒介导的基因编辑（VIGE）等。
目前被改造应用于植物基因功能研究的病毒载体相对较少，主要是一些RNA病毒和少数DNA病毒。其中，单链线状RNA病毒TRV因其宽泛的宿主范围，成为应用最广泛的病毒载体。TRV病毒包含两个基因组组分，分别被放置到pTRV1和pTRV2两个质粒中。使用TRV系统时，目的片段需要构建在pTRV2的多克隆位点处，随后两个质粒共同混合递送至植物细胞。质粒上的TRV病毒由35S表达框驱动转录，因此进入植物细胞转录后即可恢复病毒活性。双组份环状DNA病毒CLCrV是棉花中应用非常广泛的病毒载体。其载体系统包括pCLCrVA和pCLCrVB两个基因组（后续简称pVA和pVB）。使用CLCrV系统时，目的片段需要构建在VA的多克隆位点处，随后两个质粒共同混合递送至植物细胞。质粒上的CLCrV病毒编码组分的两侧为各自的CR区（包含剪接位点的保守区域），当病毒复制酶表达后，会将线性的CLCrV病毒组分剪接，重新形成环状的VA和VB基因组从而恢复病毒活性。值得注意的是，VA多克隆位点处包含病毒蛋白的编码框，因此将外源基因置于编码框中可实现基因的过表达。过往对于TRV病毒载体的优化主要是优化pTRV2质粒的多克隆位点区域来改进载体构建方式，而对于CLCrV病毒载体的优化主要是从基因枪改为借助农杆菌侵染。此外还有对于农杆菌侵染条件如温度、重悬液配方等方面的优化。目前未见将多基因组组分的病毒载体构建为单质粒系统的相关报道。
目前使用植物病毒载体的主流方法是通过农杆菌越过细胞屏障递送至植物细胞中。因此植物病毒载体的使用主要分为质粒构建、农杆菌转化和侵染三个步骤。因上述的两类病毒载体均为双组份系统，其侵染步骤需要额外对于辅助菌（携带质粒pTRV1或pCLCrVB）进行活化、摇菌、重悬以及和主效菌（携带质粒pTRV2或pCLCrVA）混匀的步骤。此过程极大增加了侵染步骤的工作量，提高了菌液交叉污染的风险。当需要进行高通量实验时，实验操作的复杂度和污染风险会显著增加。另一方面目前植物学领域对于新的病毒载体开发较少，双组份病毒载体因其宿主特异性和有效性，往往在科研应用中不容易被新的病毒载体取代。因此对其本身进行简化改造具有极高的应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够简化双组份植物病毒载体的制备方法及其相关的应用。本发明针对双组份DNA和RNA病毒复制的特点，将双组份的病毒的基因组串联，改造成单质粒系统，极大简化了实验操作，并有效避免了潜在的实验污染。
为了达到上述目的，本发明提出了了以下技术方案：
本发明提供了一对接头序列，所述接头序列包括如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的序列。其意义在于通过单一PCR产物简单快速的构建一个基因的多种病毒的VIGS载体。在实际操作中，本发明通过提前预留接头序列以便后续目的基因的替换。
本发明还提供了一种双组份病毒载体的简化构建方法，所述简化构建方法包括以下步骤；改造病毒载体骨架和构建双组分病毒的串联质粒；
所述改造病毒载体骨架包括以下步骤：
分析得到多克隆位点处的酶切位点，将病毒载体骨架中多克隆位点处的酶切位点改造为多克隆位点区的限制性内切酶或外切酶的酶切位点；
所述酶切位点的侧翼序列改造为上述接头序列；
所述构建双组分病毒的串联质粒包括以下步骤：
通过PCR和同源重组的方式串联得到双组份病毒载体的单一质粒。
本发明还提供了上述接头序列或上述简化构建方法在通过一个PCR产物完成多个病毒载体的构建中的应用。
本发明提供了两个VIGS质粒：pVS和pVS2。通常DNA病毒和RNA病毒载体具有不同的多克隆位点，不能通过一个PCR产物完成多个病毒载体的构建。本发明在基于TRV病毒的pVS2质粒中引入了与基于CLCrV病毒的pVS质粒相同的多克隆位点接头序列，因此可以用于同时构建两种病毒的基因沉默质粒。
本发明提供了一种双组份DNA病毒载体，所述双组份DNA病毒载体的制备方法如上文所示；
当所述双组份DNA病毒载体为环状DNA病毒时，所述双组份DNA病毒载体中的两个组分的两侧为各自的CR区，所述CR区可通过任意为酶切位点序列连接，另一端CR区连接质粒的T-DNA border或其它原核表达组分；所述CR区包括剪接位点的保守区域。
本发明提供了一种双组份RNA病毒载体，所述双组份RNA病毒载体的制备方法如上文所示；
当所述双组份RNA病毒载体为为线状RNA病毒时，所述双组份RNA病毒载体中的两个组分置于两个表达框中独立表达；所述的表达框为35S表达框，启动子为35S，终止子为NOS。所述应用优选包括了对其它未被载体化的多组分病毒的载体的从头开发的应用。
本发明针对双组份环状DNA病毒的复制特点，病毒的两个基因组只需以任意方向和顺序放置入T-DNA border中即可；双组份RNA病毒的两个基因组需要放入两个不同的真核基因表达框来进行转录。优选的，所述DNA病毒为CLCrV，RNA病毒为TRV。
本发明提供了上述双组份DNA病毒载体和/或上述双组份RNA病毒载体在农杆菌侵染中的应用。
在本发明中，述农杆菌侵染还包括病毒载体的下游应用；所述下游应用包括VIGS、VOX、VIGE和VIF。
基于上文提供的技术方案本发明提供了一种串联多个病毒基因组模块的单质粒的方法，能够更加简易的利用病毒载体进行复杂的基因操纵。通常组合利用病毒载体进行基因操纵的方式是将带有不同基因操纵病毒质粒的农杆菌混合注射。本发明提供了一种更加模块化的方式，通过在单一质粒中串联多个病毒基因组，来实现复杂的基因操纵，以达到特定的应用目的。
本发明的有益效果体现在：将双组份的病毒的基因组串联，改造成单质粒系统时，不仅可以简化实验操作、避免实验污染，还能提高病毒的侵染性，提高实验的成功率。包含双组份或多组分的单质粒病毒载体，同样适用于高通量的实验，如VIGS突变体库以及基于VIF的大规模材料快速繁种等方面。简化后的DNA和RNA病毒载体的使用流程图如图1所示。
附图说明
图1为简化后的DNA和RNA病毒载体的使用流程图
图2为使用VS1系统成功沉默棉花PDS基因后植株出现PDS基因沉默后的白化表型；
图3为使用VS2系统成功沉默棉花CLA基因后植株出现CLA基因沉默后的白化表型；
图4为使用多个VA基因组串联的VS1系统同时过表达SFT基因并沉默SP基因；
图5为实施例4中的菌液PCR鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例1
双组份DNA病毒——CLCrV载体的简化方法
在本实施事例中，以双组份病毒—CLCrV为例来阐述双组份DNA病毒的简化过程，通过对农杆菌侵染后对棉花PDS基因的VIGS表型结果来判断简化后的单质粒是否可以正常工作。
具体实施过程简介如下：
（一）病毒载体骨架改造
通过两轮的质粒点突变实验，依次突变pVA质粒上的Bsa I酶切位点并删除35S表达框。
所使用的点突变引物如下：
clcrv M-BSA F：5’- GGAAAGACACCTTTTCGACCTTTTTCCCCT-3’，SEQ ID NO.1；
clcrv M-Bsa R：5’-AAAAGGTGTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACAT-3’，SEQ ID NO.2；
clcrv-D-HygR F：5’- TAATTCGGGGATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGT-3’，SEQ IDNO.3；
clcrv-D-HygR R：5’- CAAAGGGCTATCCCCGAATTAATTCGGCGTTAATTCA-3’，SEQ IDNO.4。
PCR反应体系如表1所示，PCR扩增程序如表2所示。
表1 PCR反应体系
表2 PCR扩增程序：
进一步地，扩增得到的PCR产物纯化后，加入1μL Dpn I置于37℃ 2h消化模版质粒。
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组线性的PCR产物。
进一步地，重组产物转化大肠杆菌菌株DH5α。平板过夜生长后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用Sanger测序方法，确认点突变是否成功。最终得到测序成功的质粒命名为pMDA。
（二）构建双组分病毒的串联质粒
通过两轮的载体构建，得到构建双组分病毒的串联质粒。首先将棉花PDS基因的沉默片段构建到pMDA的多克隆位点上，得到pMDA-PDS质粒，再将VB构建到pMDA-PDS质粒上，得到pMDAB-PDS（后续简称pVS-PDS）。
所使用的PCR扩增引物如下：
clcrv-PDS F：5’- AACGCTAGCGAATTCACTAGTGCCTGAAGACTGGAG-3’，SEQ ID NO.5；
clcrv-PDS R：5’- GGCATGCCTGCAGACTAGTGCTTTACTCTGATCC-3’，SEQ ID NO.6；
Clone VB F：5’- AACCTATCCCAAGTGGAGCTCCGGGGGATCCACTAGTAAAC-3’，SEQ IDNO.7；
Clone VB R：5’- CATGATTACGAATTCGAGCTCATTCGAGCTCCAGAACGATC，SEQ ID NO.8。
PCR反应体系如表3所示，PCR扩增程序如表4所示。
表3 PCR反应体系
表4 PCR扩增程序
扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （增强型）进行回收。
使用限制性内切酶SpeI和SacI分别对两轮实验使用到的载体进行线性化。
酶切体系如表5所示。
表5 酶切体系
反应体系置于37℃培养箱中酶切过夜。
进一步地，使用超薄DNA产物纯化试剂盒回收线性化的载体；
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组PCR产物和线性化载体。
进一步地，重组产物转化大肠杆菌菌株DH5α。平板过夜生长后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用Sanger测序方法，确认PCR片段是否构建成功。最终得到的质粒即为pVS-PDS。
（三）农杆菌侵染
由于将CLCrV病毒的VA和VB基因组置于单个质粒中，且质粒包含棉花PDS的沉默片段，故可通过pVS-PDS农杆菌侵染棉花子叶是否出现白化的方式，判断简化方法是否成功。
进一步地，将pVS-PDS通过热激转化的方式转化进入农杆菌GV3101。
进一步地，平板在卡那和利福平双抗性平板生长两天后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，挑取阳性单克隆摇菌过夜，直至OD值为0.5-1.0。
进一步地，通过6000rpm，10min离心将菌液收集于离心管底，弃去上清，用重悬液调整至OD=0.5-1.0。
重悬液配方如表6所示。
表6 重悬液配方
进一步地，避光静置3h后，在子叶期棉花平展的子叶背面点孔进行注射。
进一步地，避光12 h后，置于25-28℃培养间条件培养。
如图2所示，pVS-PDS注射植株的沉默表型可持续到棉花生长发育的后期，在叶片、茎秆和苞叶都可见明显的白化表型。上述结果表明，针对双组份DNA病毒——CLCrV载体的简化成功。
实施例2
双组份RNA病毒——TRV载体的简化方法
在本实施事例中，以双组份病毒—TRV为例来阐述双组份RNA病毒的简化过程，通过对农杆菌侵染后棉花新生叶片CLA基因的VIGS表型结果来判断简化后的单质粒是否可以正常工作。
具体实施过程简介如下：
（一）病毒载体骨架改造
由于pTRV1质粒上的病毒组分含有五处分散的Bsa I酶切位点，故通过基因合成公司分次基因合成和载体构建的方式来同义突变pTRV1质粒上的所有Bsa I酶切位点。随后通过BamH I酶切的方式删除35S表达框中的抗性筛选基因BlpR，通过基因合成的方式引入两个串联的Bsa I，用于后续在此处串联pTRV2质粒。其中分次合成的基因片段如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。用于中间质粒构建的合成片段如SEQ ID NO.12所示。最终得到的中间质粒命名为2_3_2_1_VIGS pYL192（TRV1）。
SEQ ID NO.9：
GTTATTGCTTTTAGATAGAGTTCCTGCTCTGCAAGAGGTGGATGACATCGGTGGTCAATGGTCGTTTTGGGTAACTAGAGGTGAGAAAAGGATTCATTCCTGTTGTCCAAATCTAGATATTCGGGATGATCAGAGAGAAATTTCTCGACAGATATTTCTTACTGCTATTGGTGATCAAGCTAGAAGTGGTAAGAGACAGATGTCGGAGAATGAGCTGTGGATGTATGACCAATTTCGTGAAAATATTGCTGCGCCTAACGCGGTTAGGTGCAATAATACATATCAGGGTTGTACATGTAGGGGTTTTTCTGATGGTAAGAAGAAAGGCGCGCAGTATGCGATAGCTCTTCACAGCCTGTATGACTTCAAGTTGAAAGACTTGATGGCTACTATGGTTGAGAAGAAAACTAAAGTGGTTCATGCTGCTATGCTTTTTGCTCCTGAAAGTATGTTAGTGGACGAAGGTCCATTACCTTCTGTTGACGGTTACTACATGAAGAAGAACGGGAAGATCTATTTCGGTTTTGAGAAAGATCCTTCCTTTTCTTACATTCATGACTGGGAAGAGTACAAGAAGTATCTACTGGGGAAGCCAGTGAGTTACCAAGGGAATGTGTTCTACTTCGAACCGTGGCAGGTGAGAGGAGACACAATGCTTTTTTCGATCTACAGGATAGCTGGAGTTCCGAGGAGGTCGCTATCATCGCAAGAGTACTACCGAAGAATATATATCAGTAGATGGGAAAACATGGTTGTTGTCCCAATTTTCGATCTGGTCGAATCAACGCGAGAGTTGGTCAAGAAAGACCTGTTTGTAGAGAAACAATTCATGGACAAGTGTTTGGATTACATAGCTAGGTTATCTGACCAGCAGCTGACCATAAGCAATGTTAAATCATACTTGAGTTCAAATAATTGGGTCTTATTCATAAACGGGGCGGCCGTGAAGAACAAGCAAAGTGTAGATTCTCGAGATTTACAGTTGTTGGCTCAAACTTTGCTAGTGAAGGAACAAGTGGCGCGACCTGTCATGAGGGAGTTGCGTGAAGCAATTCTGACTGAGACGAAACCTATCACGTCATTGACTGATGTGCTGGGTTTAATATCAAGAAAACTGTGGAAGCAGTTTGCTAACAAGATCGCAGTCGGCGGATTCGTTGGCATGGTTGGTACTCTAATTGGATTCTATCCAAAGAAGGTACTAACCTGGGCGAAGGACACACCAAATGGTCCAGAACTATGTTACGAGAACTCGCACAAAACCAAGGTGATAGTATTTCTGAGTGTTGTGTATGCCATTGGAGGAATCACGCTTATGCGTCGAGACATCCGAGATGGACTGGTGAAAAAACTATGTGATATGTTTGATATCAAACGGGGGGCCCATGTCTTAGACGTTGAGAATCCGTGCCGCTATTATGAAATCAACGATTTCTTTAGCAGTCTGTATTCGGCATCTGAGTCCGGTGAGACG；
SEQ ID NO.10：
TGCCGCGCTTACGAAGGCGGCTTTGGCAAGATTTTTTGTTACTGAGACGGTCTTATGACGGTTTCGGTCTAGGTTTGATGTCTTTAGACATCATGAAGGGCCTTGCG；
SEQ ID NO.11：
GCCGAAGTATTTTCACAGAAGAAGAGAAACTGTCCTAAATCATGTTGGTGGGAAGAAGAGTGAACACAAGTTAGACGTTTTTGACCAAAGGGATTACAAAATGATTAAATCTTACGCGTTTCTAAAGATAGTAGGTGTACAATTG；
SEQ ID NO.12：
GGATCCCAGGAAACAGCTATGACCAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTGAGACCGTAGGTCTCATTCTACTGCGATCACTGACATACCCCAGCCAGGGCAACACCATAGGTGCAATGTTTTATCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATG。
另一方面为了可以使用相同的PCR产物同时构建TRV和CLCrV载体，故将pTRV2质粒上的接头序列被替换为与CLCrV完全相同，多克隆位点处采用与CLCrV相同的Bsa I酶切策略。
通过重叠延伸PCR扩增的方式将接头和酶切位点序列引入CLA基因的两端。
重叠延伸PCR所用引物如下：
V2 F1：5’- CTTTGGAAGAAGACTTGTACACTTATTACAAATTCGAT-3’，SEQ ID NO.13；
V2 R1：5’- TCCTTAAATCCCTAAAGCTTGGGATTAGGACGTATCGGACCTC-3’，SEQ IDNO.14；
V2 F2：5’- AAGCTTTAGGGATTTAAGGACGTGAACTCTGTTGA-3’，SEQ ID NO.15；
V2 R2：5’- ATTCGCTAGCGTTAACTGGCCAATTCGGTAACCTTACTCACAGAATCTAA GTC-3’，SEQ ID NO.16；
V2 F3：5’- GCCAGTTAACGCTAGCGAATCGAGACCGCCCTTTGTGCATCTTCATTTCC T-3’，SEQID NO.17；
V2 R3：5’-GGGACATGCCCGGGCCTCGAATGGCATGCCTGCAGACTAGTTGAGACCATTAACACCGTTGCGGCTAAGC-3’，SEQ ID NO.18。
PCR反应体系如表7所示，PCR扩增程序如表8所示。
表7 PCR反应体系
表8 PCR扩增程序
进一步地，纯化扩增得到的重叠延伸PCR产物。
进一步地，通过BsrG I和Xho I线性化pTRV2质粒。
酶切体系如表9所示。
表9 酶切体系
反应体系置于37℃培养箱中酶切过夜。
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组PCR产物和线性化pTRV2质粒。
进一步地，重组产物转化大肠杆菌菌株EPI300。平板过夜生长后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用Sanger测序方法，确认pTRV2的改造是否成功。最终得到的改造后的pTRV1和pTRV2质粒分别命名为2_3_2_1_VIGS pYL192 （TRV1）和V2-CLA-Bsa I。
（二）构建双组分病毒的串联质粒
通过PCR的方式将V2-CLA-Bsa I质粒上的病毒组分扩增下来。
所使用的PCR扩增引物如下：
Clone V2 F：5’- TGTCAGTGATCGCAGTAGAATGTACTAATT-3’，SEQ ID NO.19；
Clone V2 R：5’- CGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCG-3’，SEQ ID NO.20。
PCR反应体系如表10所示，PCR扩增程序如表11所示。
表10 PCR反应体系
表11 PCR扩增程序
扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （增强型）进行回收。
使用限制性内切酶Bsa I对中间质粒2_3_2_1_VIGS pYL192 （TRV1）进行线性化。
酶切体系如表12所示。
表12 酶切体系
反应体系置于37℃培养箱中酶切过夜。
进一步地，使用超薄DNA产物纯化试剂盒回收线性化的载体；
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组PCR产物和线性化载体。
进一步地，重组产物转化大肠杆菌菌株EPI300。平板过夜生长后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用菌液PCR产物进行Sanger测序方法，确认阳性克隆。通过全质粒二代测序的方式最终确认串联质粒是否构建成功。最终质粒命名为为pVS2-CLA。
（三）农杆菌侵染
由于将TRV病毒的RNA1和RNA2基因组置于单个质粒中，且质粒包含棉花CLA的沉默片段，故可通过pVS2-CLA农杆菌侵染棉花子叶是否出现白化的方式，判断简化方法是否成功。
进一步地，将pVS2-CLA通过热激转化的方式转化进入农杆菌GV3101。
进一步地，平板在卡那和利福平双抗性平板生长两天后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，挑取阳性单克隆摇菌过夜，直至OD值为0.5-1.0。
进一步地，通过6000rpm，10min离心将菌液收集于离心管底，弃去上清，用重悬液调整至OD=0.1-0.3。
重悬液配方如表13所示。
表13 重悬液配方
进一步地，避光静置3h后，在子叶期棉花平展的子叶背面点孔进行注射。
进一步地，避光12 h后，置于25℃及以下的培养间条件培养。
如图3所示，注射2周后，pVS2-CLA注射植株子叶节以上完全白化，表明CLA基因被成功沉默。故针对双组份RNA病毒——TRV载体的简化成功。当在棉花中使用双组份RNA病毒载体时，菌液浓度为OD=0.3。
实施例3
应用简化的双组份病毒载体同时实现VIGS、VOX和VIF
在本实施事例中，首先构建pVF-SFT和pVS-SP两个质粒分别用于过表达SFT基因和沉默SP基因。再以这两个质粒为模版，通过重叠延伸PCR的方式得到质粒pVF-SFT-SP。pVF-SFT-SP质粒中的两个VA基因组共享同一个CR区，从而保证两个VA基因组均能恢复环状。此外构建不含任何内源基因片段的空载pVSe作为阴性对照，通过qRT-PCR结果和开花时间的表型验证使用该三组分单质粒系统是否能成功过表达SFT基因和沉默SP基因，从而同时实现VIGS、VOX和VIF。示意图如图4所示。
具体实施过程简介如下：
（一）构建pVF-SFT和pVS-SP两个质粒
所使用的引物如下：
VF-SFT F：5’- ATGGCATGCCTGCAGACTAGTATGCCTAGAGATAGAGATCCTTTG GTTG-3’，SEQ ID NO.21；
VF-SFT R：5’- GGCCAGTTAACGCTAGCGAATTCATGTCCTACGGCCACCGG-3’，SEQ IDNO.22；
VS GHSP F：5’- ATGGCATGCCTGCAGACTAGTGCGTCTTCTAGCAGCTGTTTCCC-3’，SEQ IDNO.23；
VS GHSP R：5’- GGCCAGTTAACGCTAGCGAATGAGTGATTGGGGATGTTATTGATG CCC-3’，SEQ ID NO.24。
PCR反应体系如表14所示，PCR扩增程序如表15所示。
表14 PCR反应体系
表15 PCR扩增程序
扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （增强型）进行回收。
使用限制性内切酶BsaI将pVS载体进行线性化。
酶切体系如表16所示，表16中组分10x Cut smart buffer的体积为10μL，组分BsaI的体积为1μL，组分载体的体积为2000ng，最后补充双蒸水加水补至100μL。
表16 酶切体系
反应体系置于37℃培养箱中酶切过夜。
进一步地，使用超薄DNA产物纯化试剂盒回收线性化的载体；
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组PCR产物和线性化载体。
进一步地，重组产物转化大肠杆菌菌株DH5α。平板过夜生长后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用Sanger测序方法，确认PCR片段是否构建成功。最终得到的质粒即为pVF-SFT和pVS-SP。
（二）构建pVF-SFT-SP质粒
所使用的引物如下：
VS GHSP F：5’- ATGGCATGCCTGCAGACTAGTGCGTCTTCTAGCAGCTGTTTCCC-3’，SEQ IDNO.25；
VF R1：5’- CTAGGCTAGTCAGGCGCAAAATGAT-3’，SEQ ID NO.26；
VF F1：5’- ATCATTTTGCGCCTGACTAGCCTAG-3’，SEQ ID NO.27；
VF-SFT R：5’- GGCCAGTTAACGCTAGCGAATTCATGTCCTACGGCCACCGG-3’，SEQ IDNO.28；
前两个引物用来扩增SP沉默片段和CR区，后两个引物用来扩增SFT的cDNA全长。
PCR反应体系如表17所示，PCR扩增程序如表18所示。
表17 PCR反应体系
表18 PCR扩增程序
扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （增强型）进行回收。
使用限制性内切酶BsaI将pVS载体进行线性化。
酶切体系如表19所示
表19 酶切体系
反应体系置于37℃培养箱中酶切过夜。
进一步地，使用超薄DNA产物纯化试剂盒回收线性化的载体；
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组PCR产物和线性化载体。
进一步地，重组产物转化大肠杆菌菌株DH5α。平板过夜生长后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用Sanger测序方法，确认PCR片段是否构建成功。最终得到的质粒即为pVF-SFT-SP。
（三）构建阴性对照质粒pVSe
所使用的引物如下：
VSE F：5’- ATGGCATGCCTGCAGACTAGTGAGACCGTGTAAGAGGTCTCG-3’，SEQ ID NO.29；
VSE R：5’- GGCCAGTTAACGCTAGCGAATCGAGACCTCTTACACGGTCTC-3’，SEQ ID NO.30。
参考授权专利CN113215145A，通过片段退火的方式制备退火产物，并进行重组和转化。
（四）农杆菌侵染
将pVF-SFT和pVF-SFT-SP质粒通过热激转化的方式转化进入农杆菌GV3101。
进一步地，平板在卡那和利福平双抗性平板生长两天后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，挑取阳性单克隆摇菌过夜，直至OD值为0.5-1.0。
进一步地，通过6000rpm，10min离心将菌液收集于离心管底，弃去上清，用重悬液调整至OD=0.5-1.0。
重悬液配方如表20所示。
表20 重悬液配方
进一步地，避光静置3h后，在子叶期棉花平展的子叶背面点孔进行注射。
进一步地，避光12 h后，置于28℃培养间条件培养。
进一步地，注射后一个月后进行表型观察，并提取新生叶片RNA，通过荧光定量PCR的方式检测SFT和SP表达量。由检测结果可知，VF-SFT组的侵染植株优先出现花芽。注射五周后统计发现，VSe对照组未出现花芽，VF-SFT组42%的植株出现花芽，VF-SFT-SP组14%的植株出现花芽。
由上可知，与对照相比，SP被成功的沉默，SFT被成功过表达。总的来说VF-SFT组通过病毒诱导开花的效果比VF-SFT-SP组效果好。以上结果表明应用简化的双组份病毒载体，串联多个A基因组拷贝可以同时实现VIGS、VOX和VIF。注射后一个月后的实验结果如表21所示。
表21 荧光定量PCR的实验结果
。
实施例4
通过单一PCR产物同时构建两种简化的双组份病毒载体的VIGS质粒
在本实施事例中，设计包含载体多克隆位点两侧接头序列的引物，通过PCR扩增待沉默目的基因GhOMT1的部分片段。该PCR产物可同时用于构建两种病毒的VIGS质粒。
具体实施过程简介如下：
（一）构建pVS GhOMT1和pVS2 GhOMT1两个质粒
所使用的引物如下：
VS GhOMT1 F2：5’- GGCCAGTTAACGCTAGCGAATTGTTGCACCATGACCAAGTCTT CA -3’，SEQ ID NO.33；
VS GhOMT1 R2：5’- ATGGCATGCCTGCAGACTAGTTGATGCCCTTGATTTGAGGATAC TTTG-3’，SEQ ID NO.34；
PCR反应体系如表22所示，PCR扩增程序如表23所示。
表22 PCR反应体系
表23 PCR扩增程序
扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 （增强型）进行回收。
使用限制性内切酶BsaI将pVS和pVS2载体进行线性化。
酶切体系如表24所示。
表24 酶切体系
反应体系置于37℃培养箱中酶切过夜。
进一步地，使用超薄DNA产物纯化试剂盒回收线性化的载体；
进一步地，使用ClonExpress ® II One Step Cloning Kit试剂盒，重组PCR产物和线性化载体。
进一步地，pVS-GhOMT1和pVS2-GhOMT1重组产物分别转化大肠杆菌菌株DH5α和EPI300。平板过夜生长后，各挑取四个单克隆进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。
进一步地，使用Sanger测序方法，确认PCR片段是否构建成功。
由图5所示，菌液PCR鉴定结果表明全部八个单克隆条带都正确。Sanger测序结果也证实了GhOMT1被成功构建到pVS和pVS2两种病毒质粒中。这表明本发明通过接头序列的使用，可以通过单一PCR产物简单快速的构建一个基因的多种病毒的VIGS载体。未来可通过本发明中的简化构建方法和该接头的使用，拓展更多不同的病毒载体，用于单基因的多种病毒质粒的快速构建。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种双组份病毒载体的简化构建方法，其特征在于，所述简化构建方法包括以下步骤；改造病毒载体骨架和构建双组分病毒的串联质粒；
所述改造病毒载体骨架包括以下步骤：
分析得到多克隆位点处的酶切位点，将病毒载体骨架中多克隆位点处的酶切位点改造为多克隆位点区的限制性内切酶或外切酶的酶切位点；所述酶切位点的侧翼序列改造为接头序列；
所述构建双组分病毒的串联质粒包括以下步骤：
将接头序列，通过PCR和同源重组的方式进行串联得到双组份病毒载体的单一质粒；
所述接头序列为如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的序列；
所述双组份病毒载体包括双组份DNA病毒载体或双组份RNA病毒载体；
当所述双组份DNA病毒载体为棉花皱叶病毒CLCrV时，所述双组份DNA病毒载体中的两个组分的两侧为各自的CR区，所述CR区可通过任意为酶切位点序列连接，另一端CR区连接质粒的T-DNA border或其它原核表达组分；
所述CR区包括病毒复制时保守的剪接位点；
当所述双组份RNA病毒载体为烟草脆裂病毒TRV时，所述双组份RNA病毒载体中的两个组分置于两个表达框中独立表达；
所述的表达框为35S表达框，启动子为35S，终止子为NOS。
2.权利要求1所述的简化构建方法构建得到的双组份DNA病毒载体或双组份RNA病毒载体在农杆菌侵染中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用还包括对未被载体化的多组分病毒的载体的从头开发的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述农杆菌侵染还包括病毒载体的下游应用；所述下游应用包括VIGS、VOX和VIF。
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| GR01 | Patent grant | ||
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