CN113462717A - BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法 - Google Patents

BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种BSMV投送splited‑Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，包括以下步骤：BSMV投送单sgRNA、BSMV投送双sgRNA、BSMV投送sgRNA和splited‑Sacas9。本发明通过BSMV投送splited‑Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，与传统的双元载体介导的CRISPR/Cas9技术相比，该病毒介导的植物基因编辑因病毒不断复制，能够提高编辑效率，并且具有很强的移动性，对整株植物产生有效突变。本发明所使用的SaCas9更加小巧，移动性更强，具有比SpCas9更大的可能移动到顶端分生组织，对病毒介导的CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑的应用研究具有重要意义，也为进一步利用病毒载体侵染生殖组织，进而获得非转基因编辑种子的目标奠定了基础。

Description

BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法。
背景技术
CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated nuclease 9，Cas9)技术是一种发现于细菌和古生菌中的基于RNA编程的DNA切割技术，由于CRISPR/Cas9具有定向性、高目标特异性和可编程性等特点，所以使用其对植物基因组进行定向基因编辑拥有了可能。CRISPR/Cas9由两个部分组成，一部分是DNA核酸内切酶(Cas9蛋白)，另一部分是具有靶向作用的小片段单链RNA分子(single-guide RNA，sgRNA)，Cas蛋白可以与sgRNA结合，形成一种核糖核酸蛋白复合物RNPs(Ribonucleoproteins，RNPs)，该复合物可以特异性识别植物基因组中的原间隔物相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)，通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。为了保持基因组的完整性，植物细胞需要对断裂进行修复，导致了在靶序列中引入了不同类型的突变，这种修复损伤的机制分为以下两种途径：第一种途径是通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，这种修复在DNA断裂处插入、缺失或者替换碱基；第二种途径是是通过同源介导的修复(HDR，homology-directed repair)，这种修复要求DNA断裂周围具有同源的DNA模板，目标部位可以出发同源性导向修复，从而导致DNA模板的插入，从而使基因进行替换或者插入。相比于锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)和类转录激活效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等基因组编辑技术，CRISPR/Cas9基因组编辑技术仅需要更换sgRNA中前20nt序列，便可配合Cas9蛋白靶向编辑不同的基因，更加简单、成本更低、且编辑效率和脱靶效率也大大的得到了优化，因此这项技术被广泛的应用到了植物组基因编辑中。
专利公开了一种名称为“一种BSMV病毒载体介导的CRISPR_Cas9重组载体及其应用”，专利号为CN202011509062.7，本专利中的CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA，重组载体包括BSMV介导的sgRNA重组载体和BSMV介导的split—Cas9重组载体，还公开了该重组载体的构建方法，以及该重组载体在植物基因编辑中的应用。利用本发明重组载体可以在植物目的基因中产生系统性编辑结果，建立了一种研究植物基因功能的有效方法，为植物非转基因编辑提供了一个新的思路，本专利用的化脓性链球菌Cas9(Streptococcuspyogenes Cas9，SpCas9)的大小达到了4.2kb，远远超过了BSMV病毒的承载量，即使使用蛋白分割的手段，分割得到的片段大小也达到了2.2kb，不能很好的承载它。并且，需要用两套病毒载体分别对分割蛋白进行投送，这就造成了病毒之间会进行拮抗作用，使蛋白片段的重组效率降低。因此，金黄色葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9，SaCas9)进入了我们的视野，SaCas9的大小只有3.2kb，远远的小于SpCas9，并且切割后的蛋白大小为1.0kb、2.2kb，这使使用四组分BSMV病毒共投送sgRNA和Cas9蛋白成为了可能。
CRISPR-Cas9系统具有特异性、目标高和可编程性等特性，可以对作物进行精确的基因操作，这种编辑技术已经极大的改变了分子生物学，它的发展前景超出我们的预期。如何有效的将CRISPR-Cas9有效的投送到植物中，成为了应用这项技术的关键，现有的将CRISPR-Cas9有效的投送到植物中的方法是：植物原生质体转化、农杆菌介导的T-DNA转化、基因枪转化，然后经过筛选、再生，获得转基因植株，通过这几种方法所催产出的植株超表达Cas9蛋白和sgRNA表达盒，从而引起基因编辑，经过靶向测序后即可获得编辑植株，但是这种植株将外源的Cas9蛋白和sgRNA表达盒插入了自身基因组，对新物种的开发造成不利的影响，且这种方法需要植物经过1～2代的自交后，才能获得编辑位点纯合、无外源基因存留的后代植株，整个过程耗时耗力，且需要通过培养愈伤组织来再生出稳定的遗传植株，而愈伤组织的培养转化过程耗时长，转化率低且筛选再生困难，并且仅限于少数几个易于转化植物，所以我们需要通过一种新的方法来对编辑试剂进行投送。
可以进行自我复制的DNA和RNA病毒为编辑试剂的投送提供了一种新的方法，其中RNA病毒不会将自身基因组整合到植物基因组中，以此获得的植株为非转基因植株。有人利用棒状病毒和TRV病毒来对基因编辑进行投送，但是棒状病毒作为RNA负义链病毒，在复制过程中会对基因两端进行随机剪切，这就可能造成所携带的基因编辑试剂失活，而TRV病毒承载能力有限，不能对sgRNA和Cas9蛋白进行共投送，所以我们选择了大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)，BSMV是一种RNA正义链病毒，常被人们用来做基因沉默(Virus induced gene slience，VIGS)。BSMV由三个基因组构成，分别命名为α、β和γ，BSMV三组分系统可以用来对外源基因进行超表达，但是所表达的基因片段较短。2018年初，Cheuk和Houde报道了一种新的BSMV系统超表达系统，他们将BSMV基因组的γ基因组重构成了γ1和γ2两个亚基因组，这使得该系统的装载能力大大提升，并且提供了两个外源基因的插入位点，但是即使是改造后的BSMV病毒承载能力也十分有限，它的最大承载量为2.2kb，而现研究中最常用的化脓性链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9)的大小达到了4.2kb，远远超过了BSMV病毒的承载量，即使使用蛋白分割的手段，也不能很好的承载它。因此，金黄色葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9，SaCas9)进入了我们的视野，SaCas9的大小只有3.2kb，远远的小于SpCas9，这使使用四组分BSMV病毒共投送sgRNA和Cas9病毒成为了可能。经农杆菌介导的BSMV病毒载体进入植物细胞后，病毒的表达系统介导重组病毒RNA在植物细胞内合成，进一步复制以后扩散到发育和分生组织，甚至到生殖细胞系中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种在植物中稳定复制、安全高效表达、并完成对植物基因组的高效编辑的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，包括以下步骤：
S1，BSMV投送单sgRNA
S11，挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S12，取S11中农杆菌菌液1ml接种至至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min后收集菌体，将菌体震荡重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
S13，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ：sgRNA1混合均匀形成BSMV三组份系统，BSMV三组份系统与S12中的菌液形成混合菌液，在28℃黑暗培养3～4个小时；
S14，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2和BSMV-γ1：sgRNA1或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1和BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S12中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S15，分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体，28℃黑暗培养3～4个小时；
S17，用不带针头的注射器分别吸取S13和S14中的混合菌液分别与S15中的Ti质粒载体混合，侵染6～8叶期的的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S18，注射结束后，对侵染叶片喷施清水，黑暗处理24h后正常光周期养护，一周后在系统叶注射相应的含有pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体；
S2，BSMV投送双sgRNA
S21，挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S22，取S21中农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃离心10min后收集菌体，然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液并调节OD600＝0.3；
S23，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，反应条件为28℃，黑暗培养3～4个小时；
S24，用不带针头的注射器吸取步骤S23中的混合菌液，侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S25，分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体，28℃黑暗培养3～4个小时；
S26，用不带针头的注射器分别吸取S23中的混合菌液分别与S25中的Ti质粒载体混合，侵染6～8叶期的的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S27，注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h后正常光周期养护，在一周后在系统叶注射相应的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体；
S3，BSMV投送sgRNA和splited-Sacas9
S31，挑取含重组质粒载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S32，取上述农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min后振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min来收集菌体，将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
S33，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：Cas9N和BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统，BSMV八组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S34，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：SaCas9C-sgRNA1、BSMV-γ2混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S35，用不带针头的注射器吸取S33中的混合菌液，侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射，整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S36，用不带针头的注射器吸取步骤S34中的混合菌液，然后侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S37，注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h后正常光周期养护。
本发明的S13中BSMV-γ：sgRNA1、S14中BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1、S23中的BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1的构建方法为：
S131，使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体，凝胶电泳回收；
S132，使用高保真酶，以pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2为模板，通过PCR扩增出各sgRNA片段序列，琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物；
S133，通过LIC的连接方法，将步骤S131中的线性化病毒载体和步骤S132中的sgRNA片段序列连接，构成重组载体BSMV-γ：sgRNA1、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2。
本发明的的S33中的BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C的构建方法为：
S331，使用ApaI单酶切BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体，凝胶电泳回收；
S332，将SaCas9从其第739个氨基酸分割，使用高保真酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9N端和Cas9C端；
S333，通过LIC的连接方法，将步骤S331中的线性化病毒载体和步骤S332中的Cas9N、Cas9C片段连接，构成重组载体BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C。
本发明的步骤S332中Cas9N端PCR引物为：
正向引物序列为：
5’-AAGGAAGTTTAAATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
反向引物序列为：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
本发明的步骤S332中Cas9C端PCR引物为：
正向引物序列为：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGCCCCAAAGAAGAAGAGAAA-3’
反向引物序列为：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’。
本发明的S34中的BSMV-γ1：SaCas9C-sgRNA1的构建方法为：
S341，使用ApaI单酶切pCaBs-γ1、pCaBs-γ2病毒载体，凝胶电泳回收；
S342，使用HindIII单酶切pKSE401载体，凝胶电泳，回收15kb的大片段；
S343，使用高保真酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增出含有同源重组接头的sgRNA1和Cas9C端片段，将Cas9C分别与sgRNA连接入步骤S342中单酶切pKSE401载体中；
S344，使用BsaI对S33中构建好的载体进行单酶切凝胶电泳，回收15kb的大片段；
S345，将各个sgRNA正反向引物等比例混合，85℃水浴15min后形成双链DNA插入步骤S342酶切好的载体中，构建pKSE401-CasC-sgRNA1、pKSE401-CasC-sgRNA2载体；
S346，通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法，使用2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)高保真酶，以S345中构建好的pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9C端；
S347，通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法，将S31中的线性化载体和S36中的Cas9C片段连接，构成重组载体pCaBs-γ1：Cas9C-sgRNA1、pCaBs-γ1：Cas9C-sgRNA2。
本发明的步骤S343中的Cas9C、sgRNA的引物为：
Cas9C的正向引物序列为：
5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列为：
5’-GCTCAACACGTACCCGGCCGCGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
sgRNA的正向引物序列为：
5’-TCGCGGCCGGGTACGTGTTGAGCCGAAGTAGTGATTGGGAGACC-3’
sgRNA的反向引物序列为：
5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3’。
本发明的S15的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9的构建方法为：
S151,首先使用XbaI和SacI双酶切pKSE401载体，然后将酶切好的pKSE401载体进行琼脂糖凝胶电泳，回收12kb的酶切产物；
S152,以VK101载体为模板各部分进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收3.2kb、2.2kb、1kb的条带，然后使用XbaI和SacI对胶回收产物进行双酶切，将其插入S151中酶切好的载体中，构建成pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9。
本发明的SaCas9N、SaCas9C、SaCas9的正、反向引物的序列为：
Cas9N的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9N的反向引物序列：
5’-CGAGCTCTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
Cas9C的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9的反向引物序列：
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
本发明采用了BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，与传统的双元载体介导的CRISPR/Cas9技术相比，该病毒介导的植物基因编辑因病毒不断复制，能够提高编辑效率，并且具有很强的移动性，对整株植物产生有效突变。本发明所使用的SaCas9更加小巧，移动性更强，具有比SpCas9更大的可能移动到顶端分生组织。本发明提出新的植物基因编辑的思路，对病毒介导的CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑的应用研究具有重要意义，也为进一步利用病毒载体侵染生殖组织，进而获得非转基因编辑种子的目标奠定了基础。
附图说明
图1是BSMV三组分载体图谱。
图2是BSMV四组分载体图谱。
图3是Ti质粒投送载体模式图。
图4是split-SaCas9模式图。
图5是四组分BSMV共投送sgRNA+SaCas9载体示意图。
图6是三组分BSMV系统投送sgRNA1介导的烟草PDS编辑情况。
图7是四组分BSMV系统投送sgRNA1介导的烟草PDS编辑情况。
图8是pKSE401载体投送sgRNA1+Cas9结果图。
图9是四组分BSMV共投送sgRNA1+Cas9的PCR结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
生物材料：野生烟草(本式烟)。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
如图1-2所示，本实施例参照Mario Houde 2017构建了四组分BSMV系统为pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γ1、pCaBS-γ2，pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γ来源于中国农业大学李大伟教授馈赠，pCaBS-γ1、pCaBS-γ2可根据现有文献自行构建。
(一)BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法包括以下步骤：
S1，BSMV投送单sgRNA
S11，挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S12，取S11中农杆菌菌液1ml接种至至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min后收集菌体，将菌体体震荡重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
S13，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ：sgRNA1混合均匀形成BSMV三组份系统，BSMV三组份系统与S12中的菌液形成混合菌液，在28℃黑暗培养3～4个小时；
S14，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2和BSMV-γ1：sgRNA1或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1和BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S12中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S13与S14中的BSMV-γ：sgRNA1、S14中BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1、S23中的BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1的构建方法为：
S131，使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体，凝胶电泳回收；
S132，使用2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)高保真酶，以pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2为模板，通过PCR扩增出各sgRNA片段序列，琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物；
S133，通过LIC的连接方法，将步骤S131中的线性化病毒载体和步骤S132中的sgRNA片段序列连接，构成重组载体BSMV-γ：sgRNA1、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2。
S15，分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体，28℃黑暗培养3～4个小时；
如图3所示，pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9的构建方法为：
S151,首先使用XbaI和SacI双酶切pKSE401载体，然后将酶切好的pKSE401载体进行琼脂糖凝胶电泳，回收12kb的酶切产物；
S152,以VK101载体为模板各部分进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收3.2kb、2.2kb、1kb的条带，然后使用XbaI和SacI对胶回收产物进行双酶切，将其插入S151中酶切好的载体中，构建成pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9，
Cas9N的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9N的反向引物序列：
5’-CGAGCTCTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
Cas9C的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9的反向引物序列：
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
S17，用不带针头的注射器分别吸取S13和S14中的混合菌液分别与S15中的Ti质粒载体混合，侵染6～8叶期的的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S18，注射结束后，对侵染叶片喷施清水，黑暗处理24h后正常光周期养护，一周后在系统叶注射相应的含有pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体；
S2，BSMV投送双sgRNA
S21，挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S22，取S21中农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃离心10min后收集菌体，然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液并调节OD600＝0.3；
S23，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，反应条件为28℃，黑暗培养3～4个小时；
S24，用不带针头的注射器吸取步骤S23中的混合菌液，侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S25，分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体，28℃黑暗培养3～4个小时；
S26，用不带针头的注射器分别吸取S23中的混合菌液分别与S25中的Ti质粒载体混合，侵染6～8叶期的的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S27，注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h后正常光周期养护，在一周后在系统叶注射相应的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体；
如图4-5所示，S3，BSMV投送sgRNA和splited-Sacas9
S31，挑取含重组质粒载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S32，取上述农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min后振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min来收集菌体，将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
S33，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：Cas9N和BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统，BSMV八组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C的构建方法为：
S331，使用ApaI单酶切BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体，凝胶电泳回收；
S332，将SaCas9从其第739个氨基酸分割，使用2×PhantaMaxMasterMix(DyePlus)高保真酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9N端和Cas9C端；
Cas9N端正向引物序列为：
5’-AAGGAAGTTTAAATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9N端反向引物序列为：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9C端正向引物序列为：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGCCCCAAAGAAGAAGAGAAA-3’
Cas9C端反向引物序列为：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
S333，通过LIC的连接方法，将步骤S331中的线性化病毒载体和步骤S332中的Cas9N、Cas9C片段连接，构成重组载体BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C。
S34，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：SaCas9C-sgRNA1、BSMV-γ2混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
BSMV-γ1：SaCas9C-sgRNA1的构建方法为：
S341，使用ApaI单酶切pCaBs-γ1、pCaBs-γ2病毒载体，凝胶电泳回收；
S342，使用HindIII单酶切pKSE401载体，凝胶电泳，回收15kb的大片段；
S343，使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)高保真酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增出含有同源重组接头的sgRNA1和Cas9C端片段，使用诺威赞公司的同源重组试剂CloneExpress Ultre One Step Clonging Kit，将Cas9C分别与sgRNA连接入步骤S342中单酶切pKSE401载体中；
Cas9C的正向引物序列为：
5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列为：
5’-GCTCAACACGTACCCGGCCGCGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
sgRNA的正向引物序列为：
5’-TCGCGGCCGGGTACGTGTTGAGCCGAAGTAGTGATTGGGAGACC-3’
sgRNA的反向引物序列为：
5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3’。
S344，使用BsaI对S33中构建好的载体进行单酶切凝胶电泳，回收15kb的大片段；
S345，将各个sgRNA正反向引物等比例混合，85℃水浴15min后形成双链DNA插入步骤S342酶切好的载体中，构建pKSE401-CasC-sgRNA1、pKSE401-CasC-sgRNA2载体；
S346，通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法，使用2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)高保真酶，以S345中构建好的pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9C端；
S347，通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法，将S31中的线性化载体和S36中的Cas9C片段连接，构成重组载体pCaBs-γ1：Cas9C-sgRNA1、pCaBs-γ1：Cas9C-sgRNA2。
S35，用不带针头的注射器吸取S33中的混合菌液，侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射，整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S36，用不带针头的注射器吸取步骤S34中的混合菌液，然后侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S37，注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h后正常光周期养护。
(二)BSMV载体介导的CRISPR/Cas9试剂投送方法的可行性检测包括以下步骤：
S1，提取实验处理本氏烟的侵染叶片和系统叶片的基因组DNA；
S2，测序检测基因编辑类型；
S21，BSMV投送单sgRNA：
以提取的烟草叶片DNA为模版，用高保真酶扩增NbPDS3基因相应靶位点的PCR片段，PCR产物回收后，用BstN I限制性内切酶分别酶切相应靶位点PCR扩增片段，酶切完成后用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-TVector进行测序分析，其中，
sgRNA1的正向引物为：5’-TGGAGATTGGTACGAGACTGG-3’
sgRNA1的反向引物为：5’-GTCTTGAGCTTCAACATAAGATTGC-3’
如图6所示，三组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株，在注射叶和系统叶中均可检测到基因编辑结果。
如图7所示，四组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株，在注射叶和系统叶中均可检测到基因编辑结果。
S22，BSMV投送双sgRNA：
以提取的烟草叶片DNA为模版，用高保真酶扩增NbPDS1基因包括俩个靶位点在内的PCR片段，野生型作为对照，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，分析胶图是否有片段缺失突变，将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-T Vector进行测序分析，其中，检测缺失的PCR引物为：
正向引物为：5’-AGGTTCACAAGTGGGACAATC-3’
反向引物为：5’-GCAACCCAGTCTCGTACCAA-3’
PCR反应体系：5ul 2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)高保真酶，0.4ulForward Primer，0.4ul Reverse Primer，0.2ul DNA模板，4ul ddH2O；反应程序：95℃变性3min、59℃退火15s、72℃延伸1min、循环35次。
BstN I单酶切体系：0.5ul BstN I、1ul Cutsmart缓冲液，2.5ulPCR产物、ddH2O6ul；反应条件：65℃酶切两小时。
S23，BSMV共投送sgRNA和Cas9：
以提取的烟草叶片DNA为模版，用高保真酶扩增NbPDS3基因相应靶位点的PCR片段，PCR产物回收后，用BstN I限制性内切酶分别酶切相应靶位点PCR扩增片段，酶切完成后用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-TVector进行测序分析，其中，检测突变的PCR引物为：
正向引物为：5’-TGGAGATTGGTACGAGACTGG-3’
反向引物为：5’-GTCTTGAGCTTCAACATAAGATTGC-3’。
如图8、9所示，四组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株，在注射叶和系统叶中均可检测到基因编辑结果。
上述结果表明，BSMV系统可以对基因编辑试剂进行系统性投送，在注射叶和系统叶中均可以检测到基因编辑时间的发生，且该系统不仅仅可以对sgRNA进行投送，也可以对sgRNA和Cas9进行共投送。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，BSMV投送单sgRNA
S11，挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S12，取S11中农杆菌菌液1ml接种至至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min后收集菌体，将菌体震荡重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
S13，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ：sgRNA1混合均匀形成BSMV三组份系统，BSMV三组份系统与S12中的菌液形成混合菌液，在28℃黑暗培养3～4个小时；
S14，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2和BSMV-γ1：sgRNA1或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1和BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S12中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S15，分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体，28℃黑暗培养3～4个小时；
S17，用不带针头的注射器分别吸取S13和S14中的混合菌液分别与S15中的Ti质粒载体混合，侵染6～8叶期的的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S18，注射结束后，对侵染叶片喷施清水，黑暗处理24h后正常光周期养护，一周后在系统叶注射相应的含有pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体；
S2，BSMV投送双sgRNA
S21，挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S22，取S21中农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃离心10min后收集菌体，然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液并调节OD600＝0.3；
S23，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，反应条件为28℃，黑暗培养3～4个小时；
S24，用不带针头的注射器吸取步骤S23中的混合菌液，侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S25，分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体，28℃黑暗培养3～4个小时；
S26，用不带针头的注射器分别吸取S23中的混合菌液分别与S25中的Ti质粒载体混合，侵染6～8叶期的的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S27，注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h后正常光周期养护，在一周后在系统叶注射相应的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体；
S3，BSMV投送sgRNA和splited-Sacas9
S31，挑取含重组质粒载体的农杆菌克隆，接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h；
S32，取上述农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min后振荡培养8～10小时，农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50，将获得的菌液在5000r/min，20℃条件下离心10min来收集菌体，将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600＝0.3；
S33，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：Cas9N和BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统，BSMV八组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S34，分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1：SaCas9C-sgRNA1、BSMV-γ2混合均匀形成BSMV四组份系统，BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液，28℃黑暗培养3～4个小时；
S35，用不带针头的注射器吸取S33中的混合菌液，侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射，整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S36，用不带针头的注射器吸取步骤S34中的混合菌液，然后侵染6～8叶期的本氏烟叶片，每片叶选取3～4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射；
S37，注射结束后，对侵染叶片喷施少量清水，并进行黑暗处理24h后正常光周期养护。
2.根据权利要求1所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，所述的S13中BSMV-γ：sgRNA1、S14中BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1、S23中的BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA1的构建方法为：
S131，使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体，凝胶电泳回收；
S132，使用高保真酶，以pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2为模板，通过PCR扩增出各sgRNA片段序列，琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物；
S133，通过LIC的连接方法，将步骤S131中的线性化病毒载体和步骤S132中的sgRNA片段序列连接，构成重组载体BSMV-γ：sgRNA1、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1、BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2。
3.根据权利要求1所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，所述的S33中的BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C的构建方法为：
S331，使用ApaI单酶切BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体，凝胶电泳回收；
S332，将SaCas9从其第739个氨基酸分割，使用高保真酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9N端和Cas9C端；
S333，通过LIC的连接方法，将步骤S331中的线性化病毒载体和步骤S332中的Cas9N、Cas9C片段连接，构成重组载体BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C。
4.根据权利要求3所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，所述的步骤S332中Cas9N端PCR引物为：
正向引物序列为：
5’-AAGGAAGTTTAAATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
反向引物序列为：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
5.根据权利要求3所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，所述的步骤S332中Cas9C端PCR引物为：
正向引物序列为：
5’-AAGGAAGTTTAAATGGCCCCAAAGAAGAAGAGAAA-3’
反向引物序列为：
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’。
6.根据权利要求3所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，所述的S34中的BSMV-γ1：SaCas9C-sgRNA1的构建方法为：
S341，使用ApaI单酶切pCaBs-γ1、pCaBs-γ2病毒载体，凝胶电泳回收；
S342，使用HindIII单酶切pKSE401载体，凝胶电泳，回收15kb的大片段；
S343，使用高保真酶，以pKSE401载体为模板，分别扩增出含有同源重组接头的sgRNA1和Cas9C端片段，将Cas9C分别与sgRNA连接入步骤S342中单酶切pKSE401载体中；
S344，使用BsaI对S33中构建好的载体进行单酶切凝胶电泳，回收15kb的大片段；
S345，将各个sgRNA正反向引物等比例混合，85℃水浴15min后形成双链DNA插入步骤S342酶切好的载体中，构建pKSE401-CasC-sgRNA1、pKSE401-CasC-sgRNA2载体；
S346，通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法，使用2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)高保真酶，以S345中构建好的pKSE401载体为模板，分别扩增Cas9C端；
S347，通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法，将S31中的线性化载体和S36中的Cas9C片段连接，构成重组载体pCaBs-γ1：Cas9C-sgRNA1、pCaBs-γ1：Cas9C-sgRNA2。
7.根据权利要求6所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于：所述的步骤S343中的Cas9C、sgRNA的引物为：
Cas9C的正向引物序列为：
5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列为：
5’-GCTCAACACGTACCCGGCCGCGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
sgRNA的正向引物序列为：
5’-TCGCGGCCGGGTACGTGTTGAGCCGAAGTAGTGATTGGGAGACC-3’
sgRNA的反向引物序列为：
5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3’。
8.根据权利要求1所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于，所述S15的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9的构建方法为：
S151,首先使用XbaI和SacI双酶切pKSE401载体，然后将酶切好的pKSE401载体进行琼脂糖凝胶电泳，回收12kb的酶切产物；
S152,以VK101载体为模板各部分进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收3.2kb、2.2kb、1kb的条带，然后使用XbaI和SacI对胶回收产物进行双酶切，将其插入S151中酶切好的载体中，构建成pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9。
9.根据权利要求8所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法，其特征在于：所述的SaCas9N、SaCas9C、SaCas9的正、反向引物的序列为：
Cas9N的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9N的反向引物序列：
5’-CGAGCTCTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
Cas9C的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9的正向引物序列：
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9的反向引物序列：
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209624A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 明尼苏达大学董事会 采用CRISPR/Cas系统的植物基因组的工程改造
US20170211081A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Iowa State University Research Foundation, Inc. Foxtail mosaic virus-based vectors for gene silencing and gene expression
WO2017207589A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Kws Saat Se Hybrid nucleic acid sequences for genome engineering
CN109371059A (zh) * 2018-11-08 2019-02-22 江苏沿海地区农业科学研究所 一种棉花的基因编辑方法
CN110172473A (zh) * 2019-05-17 2019-08-27 郑州大学 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS
CN110183525A (zh) * 2019-06-14 2019-08-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 小麦抗条锈病相关的txr蛋白及其编码基因与应用
CN110468147A (zh) * 2018-10-24 2019-11-19 中国农业大学 一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统
CN110914426A (zh) * 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
CN112522307A (zh) * 2020-12-18 2021-03-19 郑州大学 一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209624A (zh) * 2013-03-15 2015-12-30 明尼苏达大学董事会 采用CRISPR/Cas系统的植物基因组的工程改造
US20170211081A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Iowa State University Research Foundation, Inc. Foxtail mosaic virus-based vectors for gene silencing and gene expression
WO2017207589A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Kws Saat Se Hybrid nucleic acid sequences for genome engineering
CN110914426A (zh) * 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
CN110468147A (zh) * 2018-10-24 2019-11-19 中国农业大学 一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统
CN109371059A (zh) * 2018-11-08 2019-02-22 江苏沿海地区农业科学研究所 一种棉花的基因编辑方法
CN110172473A (zh) * 2019-05-17 2019-08-27 郑州大学 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS
CN110183525A (zh) * 2019-06-14 2019-08-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 小麦抗条锈病相关的txr蛋白及其编码基因与应用
CN112522307A (zh) * 2020-12-18 2021-03-19 郑州大学 一种BSMV病毒载体介导的CRISPR/Cas9重组载体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GONGYAO SHI ET AL.: "A Methodological Advance of Tobacco Rattle Virus-Induced Gene Silencing for Functional Genomics in Plants", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》 *

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