CN113462717A - BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法 - Google Patents
BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种BSMV投送splited‑Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,包括以下步骤:BSMV投送单sgRNA、BSMV投送双sgRNA、BSMV投送sgRNA和splited‑Sacas9。本发明通过BSMV投送splited‑Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,与传统的双元载体介导的CRISPR/Cas9技术相比,该病毒介导的植物基因编辑因病毒不断复制,能够提高编辑效率,并且具有很强的移动性,对整株植物产生有效突变。本发明所使用的SaCas9更加小巧,移动性更强,具有比SpCas9更大的可能移动到顶端分生组织,对病毒介导的CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑的应用研究具有重要意义,也为进一步利用病毒载体侵染生殖组织,进而获得非转基因编辑种子的目标奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及到一种BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法。
背景技术
CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated nuclease 9,Cas9)技术是一种发现于细菌和古生菌中的基于RNA编程的DNA切割技术,由于CRISPR/Cas9具有定向性、高目标特异性和可编程性等特点,所以使用其对植物基因组进行定向基因编辑拥有了可能。CRISPR/Cas9由两个部分组成,一部分是DNA核酸内切酶(Cas9蛋白),另一部分是具有靶向作用的小片段单链RNA分子(single-guide RNA,sgRNA),Cas蛋白可以与sgRNA结合,形成一种核糖核酸蛋白复合物RNPs(Ribonucleoproteins,RNPs),该复合物可以特异性识别植物基因组中的原间隔物相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM),通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。为了保持基因组的完整性,植物细胞需要对断裂进行修复,导致了在靶序列中引入了不同类型的突变,这种修复损伤的机制分为以下两种途径:第一种途径是通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ),这种修复在DNA断裂处插入、缺失或者替换碱基;第二种途径是是通过同源介导的修复(HDR,homology-directed repair),这种修复要求DNA断裂周围具有同源的DNA模板,目标部位可以出发同源性导向修复,从而导致DNA模板的插入,从而使基因进行替换或者插入。相比于锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)和类转录激活效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)等基因组编辑技术,CRISPR/Cas9基因组编辑技术仅需要更换sgRNA中前20nt序列,便可配合Cas9蛋白靶向编辑不同的基因,更加简单、成本更低、且编辑效率和脱靶效率也大大的得到了优化,因此这项技术被广泛的应用到了植物组基因编辑中。
专利公开了一种名称为“一种BSMV病毒载体介导的CRISPR_Cas9重组载体及其应用”,专利号为CN202011509062.7,本专利中的CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA,重组载体包括BSMV介导的sgRNA重组载体和BSMV介导的split—Cas9重组载体,还公开了该重组载体的构建方法,以及该重组载体在植物基因编辑中的应用。利用本发明重组载体可以在植物目的基因中产生系统性编辑结果,建立了一种研究植物基因功能的有效方法,为植物非转基因编辑提供了一个新的思路,本专利用的化脓性链球菌Cas9(Streptococcuspyogenes Cas9,SpCas9)的大小达到了4.2kb,远远超过了BSMV病毒的承载量,即使使用蛋白分割的手段,分割得到的片段大小也达到了2.2kb,不能很好的承载它。并且,需要用两套病毒载体分别对分割蛋白进行投送,这就造成了病毒之间会进行拮抗作用,使蛋白片段的重组效率降低。因此,金黄色葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9,SaCas9)进入了我们的视野,SaCas9的大小只有3.2kb,远远的小于SpCas9,并且切割后的蛋白大小为1.0kb、2.2kb,这使使用四组分BSMV病毒共投送sgRNA和Cas9蛋白成为了可能。
CRISPR-Cas9系统具有特异性、目标高和可编程性等特性,可以对作物进行精确的基因操作,这种编辑技术已经极大的改变了分子生物学,它的发展前景超出我们的预期。如何有效的将CRISPR-Cas9有效的投送到植物中,成为了应用这项技术的关键,现有的将CRISPR-Cas9有效的投送到植物中的方法是:植物原生质体转化、农杆菌介导的T-DNA转化、基因枪转化,然后经过筛选、再生,获得转基因植株,通过这几种方法所催产出的植株超表达Cas9蛋白和sgRNA表达盒,从而引起基因编辑,经过靶向测序后即可获得编辑植株,但是这种植株将外源的Cas9蛋白和sgRNA表达盒插入了自身基因组,对新物种的开发造成不利的影响,且这种方法需要植物经过1~2代的自交后,才能获得编辑位点纯合、无外源基因存留的后代植株,整个过程耗时耗力,且需要通过培养愈伤组织来再生出稳定的遗传植株,而愈伤组织的培养转化过程耗时长,转化率低且筛选再生困难,并且仅限于少数几个易于转化植物,所以我们需要通过一种新的方法来对编辑试剂进行投送。
可以进行自我复制的DNA和RNA病毒为编辑试剂的投送提供了一种新的方法,其中RNA病毒不会将自身基因组整合到植物基因组中,以此获得的植株为非转基因植株。有人利用棒状病毒和TRV病毒来对基因编辑进行投送,但是棒状病毒作为RNA负义链病毒,在复制过程中会对基因两端进行随机剪切,这就可能造成所携带的基因编辑试剂失活,而TRV病毒承载能力有限,不能对sgRNA和Cas9蛋白进行共投送,所以我们选择了大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV),BSMV是一种RNA正义链病毒,常被人们用来做基因沉默(Virus induced gene slience,VIGS)。BSMV由三个基因组构成,分别命名为α、β和γ,BSMV三组分系统可以用来对外源基因进行超表达,但是所表达的基因片段较短。2018年初,Cheuk和Houde报道了一种新的BSMV系统超表达系统,他们将BSMV基因组的γ基因组重构成了γ1和γ2两个亚基因组,这使得该系统的装载能力大大提升,并且提供了两个外源基因的插入位点,但是即使是改造后的BSMV病毒承载能力也十分有限,它的最大承载量为2.2kb,而现研究中最常用的化脓性链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9,SpCas9)的大小达到了4.2kb,远远超过了BSMV病毒的承载量,即使使用蛋白分割的手段,也不能很好的承载它。因此,金黄色葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9,SaCas9)进入了我们的视野,SaCas9的大小只有3.2kb,远远的小于SpCas9,这使使用四组分BSMV病毒共投送sgRNA和Cas9病毒成为了可能。经农杆菌介导的BSMV病毒载体进入植物细胞后,病毒的表达系统介导重组病毒RNA在植物细胞内合成,进一步复制以后扩散到发育和分生组织,甚至到生殖细胞系中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点,提供一种在植物中稳定复制、安全高效表达、并完成对植物基因组的高效编辑的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,包括以下步骤:
S1,BSMV投送单sgRNA
S11,挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S12,取S11中农杆菌菌液1ml接种至至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃条件下离心10min后收集菌体,将菌体震荡重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600=0.3;
S13,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ:sgRNA1混合均匀形成BSMV三组份系统,BSMV三组份系统与S12中的菌液形成混合菌液,在28℃黑暗培养3~4个小时;
S14,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2和BSMV-γ1:sgRNA1或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1和BSMV-γ2:sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S12中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S15,分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体,28℃黑暗培养3~4个小时;
S17,用不带针头的注射器分别吸取S13和S14中的混合菌液分别与S15中的Ti质粒载体混合,侵染6~8叶期的的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S18,注射结束后,对侵染叶片喷施清水,黑暗处理24h后正常光周期养护,一周后在系统叶注射相应的含有pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体;
S2,BSMV投送双sgRNA
S21,挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S22,取S21中农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃离心10min后收集菌体,然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液并调节OD600=0.3;
S23,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,反应条件为28℃,黑暗培养3~4个小时;
S24,用不带针头的注射器吸取步骤S23中的混合菌液,侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S25,分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体,28℃黑暗培养3~4个小时;
S26,用不带针头的注射器分别吸取S23中的混合菌液分别与S25中的Ti质粒载体混合,侵染6~8叶期的的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S27,注射结束后,对侵染叶片喷施少量清水,并进行黑暗处理24h后正常光周期养护,在一周后在系统叶注射相应的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体;
S3,BSMV投送sgRNA和splited-Sacas9
S31,挑取含重组质粒载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S32,取上述农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min后振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃条件下离心10min来收集菌体,将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600=0.3;
S33,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:Cas9N和BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统,BSMV八组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S34,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:SaCas9C-sgRNA1、BSMV-γ2混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S35,用不带针头的注射器吸取S33中的混合菌液,侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射,整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S36,用不带针头的注射器吸取步骤S34中的混合菌液,然后侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S37,注射结束后,对侵染叶片喷施少量清水,并进行黑暗处理24h后正常光周期养护。
本发明的S13中BSMV-γ:sgRNA1、S14中BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA1、S23中的BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA2、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA1的构建方法为:
S131,使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体,凝胶电泳回收;
S132,使用高保真酶,以pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2为模板,通过PCR扩增出各sgRNA片段序列,琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物;
S133,通过LIC的连接方法,将步骤S131中的线性化病毒载体和步骤S132中的sgRNA片段序列连接,构成重组载体BSMV-γ:sgRNA1、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA1、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA2。
本发明的的S33中的BSMV-γ2:Cas9N、BSMV-γ2:Cas9C的构建方法为:
S331,使用ApaI单酶切BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体,凝胶电泳回收;
S332,将SaCas9从其第739个氨基酸分割,使用高保真酶,以pKSE401载体为模板,分别扩增Cas9N端和Cas9C端;
S333,通过LIC的连接方法,将步骤S331中的线性化病毒载体和步骤S332中的Cas9N、Cas9C片段连接,构成重组载体BSMV-γ2:Cas9N、BSMV-γ2:Cas9C。
本发明的步骤S332中Cas9N端PCR引物为:
正向引物序列为:
5’-AAGGAAGTTTAAATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
反向引物序列为:
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
本发明的步骤S332中Cas9C端PCR引物为:
正向引物序列为:
5’-AAGGAAGTTTAAATGGCCCCAAAGAAGAAGAGAAA-3’
反向引物序列为:
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’。
本发明的S34中的BSMV-γ1:SaCas9C-sgRNA1的构建方法为:
S341,使用ApaI单酶切pCaBs-γ1、pCaBs-γ2病毒载体,凝胶电泳回收;
S342,使用HindIII单酶切pKSE401载体,凝胶电泳,回收15kb的大片段;
S343,使用高保真酶,以pKSE401载体为模板,分别扩增出含有同源重组接头的sgRNA1和Cas9C端片段,将Cas9C分别与sgRNA连接入步骤S342中单酶切pKSE401载体中;
S344,使用BsaI对S33中构建好的载体进行单酶切凝胶电泳,回收15kb的大片段;
S345,将各个sgRNA正反向引物等比例混合,85℃水浴15min后形成双链DNA插入步骤S342酶切好的载体中,构建pKSE401-CasC-sgRNA1、pKSE401-CasC-sgRNA2载体;
S346,通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法,使用2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)高保真酶,以S345中构建好的pKSE401载体为模板,分别扩增Cas9C端;
S347,通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法,将S31中的线性化载体和S36中的Cas9C片段连接,构成重组载体pCaBs-γ1:Cas9C-sgRNA1、pCaBs-γ1:Cas9C-sgRNA2。
本发明的步骤S343中的Cas9C、sgRNA的引物为:
Cas9C的正向引物序列为:
5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列为:
5’-GCTCAACACGTACCCGGCCGCGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
sgRNA的正向引物序列为:
5’-TCGCGGCCGGGTACGTGTTGAGCCGAAGTAGTGATTGGGAGACC-3’
sgRNA的反向引物序列为:
5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3’。
本发明的S15的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9的构建方法为:
S151,首先使用XbaI和SacI双酶切pKSE401载体,然后将酶切好的pKSE401载体进行琼脂糖凝胶电泳,回收12kb的酶切产物;
S152,以VK101载体为模板各部分进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,分别回收3.2kb、2.2kb、1kb的条带,然后使用XbaI和SacI对胶回收产物进行双酶切,将其插入S151中酶切好的载体中,构建成pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9。
本发明的SaCas9N、SaCas9C、SaCas9的正、反向引物的序列为:
Cas9N的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9N的反向引物序列:
5’-CGAGCTCTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
Cas9C的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9的反向引物序列:
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
本发明采用了BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,与传统的双元载体介导的CRISPR/Cas9技术相比,该病毒介导的植物基因编辑因病毒不断复制,能够提高编辑效率,并且具有很强的移动性,对整株植物产生有效突变。本发明所使用的SaCas9更加小巧,移动性更强,具有比SpCas9更大的可能移动到顶端分生组织。本发明提出新的植物基因编辑的思路,对病毒介导的CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑的应用研究具有重要意义,也为进一步利用病毒载体侵染生殖组织,进而获得非转基因编辑种子的目标奠定了基础。
附图说明
图1是BSMV三组分载体图谱。
图2是BSMV四组分载体图谱。
图3是Ti质粒投送载体模式图。
图4是split-SaCas9模式图。
图5是四组分BSMV共投送sgRNA+SaCas9载体示意图。
图6是三组分BSMV系统投送sgRNA1介导的烟草PDS编辑情况。
图7是四组分BSMV系统投送sgRNA1介导的烟草PDS编辑情况。
图8是pKSE401载体投送sgRNA1+Cas9结果图。
图9是四组分BSMV共投送sgRNA1+Cas9的PCR结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
生物材料:野生烟草(本式烟)。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。
如图1-2所示,本实施例参照Mario Houde 2017构建了四组分BSMV系统为pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γ1、pCaBS-γ2,pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γ来源于中国农业大学李大伟教授馈赠,pCaBS-γ1、pCaBS-γ2可根据现有文献自行构建。
(一)BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法包括以下步骤:
S1,BSMV投送单sgRNA
S11,挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S12,取S11中农杆菌菌液1ml接种至至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃条件下离心10min后收集菌体,将菌体体震荡重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600=0.3;
S13,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ:sgRNA1混合均匀形成BSMV三组份系统,BSMV三组份系统与S12中的菌液形成混合菌液,在28℃黑暗培养3~4个小时;
S14,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2和BSMV-γ1:sgRNA1或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1和BSMV-γ2:sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S12中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S13与S14中的BSMV-γ:sgRNA1、S14中BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA1、S23中的BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA2、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA1的构建方法为:
S131,使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体,凝胶电泳回收;
S132,使用2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)高保真酶,以pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2为模板,通过PCR扩增出各sgRNA片段序列,琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物;
S133,通过LIC的连接方法,将步骤S131中的线性化病毒载体和步骤S132中的sgRNA片段序列连接,构成重组载体BSMV-γ:sgRNA1、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA1、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA2。
S15,分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体,28℃黑暗培养3~4个小时;
如图3所示,pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9的构建方法为:
S151,首先使用XbaI和SacI双酶切pKSE401载体,然后将酶切好的pKSE401载体进行琼脂糖凝胶电泳,回收12kb的酶切产物;
S152,以VK101载体为模板各部分进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,分别回收3.2kb、2.2kb、1kb的条带,然后使用XbaI和SacI对胶回收产物进行双酶切,将其插入S151中酶切好的载体中,构建成pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9,
Cas9N的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9N的反向引物序列:
5’-CGAGCTCTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
Cas9C的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9的反向引物序列:
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
S17,用不带针头的注射器分别吸取S13和S14中的混合菌液分别与S15中的Ti质粒载体混合,侵染6~8叶期的的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S18,注射结束后,对侵染叶片喷施清水,黑暗处理24h后正常光周期养护,一周后在系统叶注射相应的含有pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体;
S2,BSMV投送双sgRNA
S21,挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S22,取S21中农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃离心10min后收集菌体,然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液并调节OD600=0.3;
S23,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,反应条件为28℃,黑暗培养3~4个小时;
S24,用不带针头的注射器吸取步骤S23中的混合菌液,侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S25,分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体,28℃黑暗培养3~4个小时;
S26,用不带针头的注射器分别吸取S23中的混合菌液分别与S25中的Ti质粒载体混合,侵染6~8叶期的的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S27,注射结束后,对侵染叶片喷施少量清水,并进行黑暗处理24h后正常光周期养护,在一周后在系统叶注射相应的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体;
如图4-5所示,S3,BSMV投送sgRNA和splited-Sacas9
S31,挑取含重组质粒载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S32,取上述农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min后振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃条件下离心10min来收集菌体,将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600=0.3;
S33,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:Cas9N和BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统,BSMV八组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
BSMV-γ2:Cas9N、BSMV-γ2:Cas9C的构建方法为:
S331,使用ApaI单酶切BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体,凝胶电泳回收;
S332,将SaCas9从其第739个氨基酸分割,使用2×PhantaMaxMasterMix(DyePlus)高保真酶,以pKSE401载体为模板,分别扩增Cas9N端和Cas9C端;
Cas9N端正向引物序列为:
5’-AAGGAAGTTTAAATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9N端反向引物序列为:
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9C端正向引物序列为:
5’-AAGGAAGTTTAAATGGCCCCAAAGAAGAAGAGAAA-3’
Cas9C端反向引物序列为:
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
S333,通过LIC的连接方法,将步骤S331中的线性化病毒载体和步骤S332中的Cas9N、Cas9C片段连接,构成重组载体BSMV-γ2:Cas9N、BSMV-γ2:Cas9C。
S34,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:SaCas9C-sgRNA1、BSMV-γ2混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
BSMV-γ1:SaCas9C-sgRNA1的构建方法为:
S341,使用ApaI单酶切pCaBs-γ1、pCaBs-γ2病毒载体,凝胶电泳回收;
S342,使用HindIII单酶切pKSE401载体,凝胶电泳,回收15kb的大片段;
S343,使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)高保真酶,以pKSE401载体为模板,分别扩增出含有同源重组接头的sgRNA1和Cas9C端片段,使用诺威赞公司的同源重组试剂CloneExpress Ultre One Step Clonging Kit,将Cas9C分别与sgRNA连接入步骤S342中单酶切pKSE401载体中;
Cas9C的正向引物序列为:
5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列为:
5’-GCTCAACACGTACCCGGCCGCGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
sgRNA的正向引物序列为:
5’-TCGCGGCCGGGTACGTGTTGAGCCGAAGTAGTGATTGGGAGACC-3’
sgRNA的反向引物序列为:
5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3’。
S344,使用BsaI对S33中构建好的载体进行单酶切凝胶电泳,回收15kb的大片段;
S345,将各个sgRNA正反向引物等比例混合,85℃水浴15min后形成双链DNA插入步骤S342酶切好的载体中,构建pKSE401-CasC-sgRNA1、pKSE401-CasC-sgRNA2载体;
S346,通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法,使用2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)高保真酶,以S345中构建好的pKSE401载体为模板,分别扩增Cas9C端;
S347,通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法,将S31中的线性化载体和S36中的Cas9C片段连接,构成重组载体pCaBs-γ1:Cas9C-sgRNA1、pCaBs-γ1:Cas9C-sgRNA2。
S35,用不带针头的注射器吸取S33中的混合菌液,侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射,整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S36,用不带针头的注射器吸取步骤S34中的混合菌液,然后侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S37,注射结束后,对侵染叶片喷施少量清水,并进行黑暗处理24h后正常光周期养护。
(二)BSMV载体介导的CRISPR/Cas9试剂投送方法的可行性检测包括以下步骤:
S1,提取实验处理本氏烟的侵染叶片和系统叶片的基因组DNA;
S2,测序检测基因编辑类型;
S21,BSMV投送单sgRNA:
以提取的烟草叶片DNA为模版,用高保真酶扩增NbPDS3基因相应靶位点的PCR片段,PCR产物回收后,用BstN I限制性内切酶分别酶切相应靶位点PCR扩增片段,酶切完成后用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-TVector进行测序分析,其中,
sgRNA1的正向引物为:5’-TGGAGATTGGTACGAGACTGG-3’
sgRNA1的反向引物为:5’-GTCTTGAGCTTCAACATAAGATTGC-3’
如图6所示,三组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株,在注射叶和系统叶中均可检测到基因编辑结果。
如图7所示,四组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株,在注射叶和系统叶中均可检测到基因编辑结果。
S22,BSMV投送双sgRNA:
以提取的烟草叶片DNA为模版,用高保真酶扩增NbPDS1基因包括俩个靶位点在内的PCR片段,野生型作为对照,用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果,分析胶图是否有片段缺失突变,将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-T Vector进行测序分析,其中,检测缺失的PCR引物为:
正向引物为:5’-AGGTTCACAAGTGGGACAATC-3’
反向引物为:5’-GCAACCCAGTCTCGTACCAA-3’
PCR反应体系:5ul 2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)高保真酶,0.4ulForward Primer,0.4ul Reverse Primer,0.2ul DNA模板,4ul ddH2O;反应程序:95℃变性3min、59℃退火15s、72℃延伸1min、循环35次。
BstN I单酶切体系:0.5ul BstN I、1ul Cutsmart缓冲液,2.5ulPCR产物、ddH2O6ul;反应条件:65℃酶切两小时。
S23,BSMV共投送sgRNA和Cas9:
以提取的烟草叶片DNA为模版,用高保真酶扩增NbPDS3基因相应靶位点的PCR片段,PCR产物回收后,用BstN I限制性内切酶分别酶切相应靶位点PCR扩增片段,酶切完成后用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,将目的片段切胶回收后连入测序载体pMDTM19-TVector进行测序分析,其中,检测突变的PCR引物为:
正向引物为:5’-TGGAGATTGGTACGAGACTGG-3’
反向引物为:5’-GTCTTGAGCTTCAACATAAGATTGC-3’。
如图8、9所示,四组分BSMV系统可以系统侵染烟草植株,在注射叶和系统叶中均可检测到基因编辑结果。
上述结果表明,BSMV系统可以对基因编辑试剂进行系统性投送,在注射叶和系统叶中均可以检测到基因编辑时间的发生,且该系统不仅仅可以对sgRNA进行投送,也可以对sgRNA和Cas9进行共投送。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,并非用于限定本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,BSMV投送单sgRNA
S11,挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S12,取S11中农杆菌菌液1ml接种至至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃条件下离心10min后收集菌体,将菌体震荡重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600=0.3;
S13,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ:sgRNA1混合均匀形成BSMV三组份系统,BSMV三组份系统与S12中的菌液形成混合菌液,在28℃黑暗培养3~4个小时;
S14,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ2和BSMV-γ1:sgRNA1或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1和BSMV-γ2:sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S12中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S15,分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体,28℃黑暗培养3~4个小时;
S17,用不带针头的注射器分别吸取S13和S14中的混合菌液分别与S15中的Ti质粒载体混合,侵染6~8叶期的的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S18,注射结束后,对侵染叶片喷施清水,黑暗处理24h后正常光周期养护,一周后在系统叶注射相应的含有pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体;
S2,BSMV投送双sgRNA
S21,挑取含BSMV介导的sgRNA重组载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S22,取S21中农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃离心10min后收集菌体,然后将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液并调节OD600=0.3;
S23,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA2或BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA1混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,反应条件为28℃,黑暗培养3~4个小时;
S24,用不带针头的注射器吸取步骤S23中的混合菌液,侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S25,分别取等体积的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9Ti质粒载体,28℃黑暗培养3~4个小时;
S26,用不带针头的注射器分别吸取S23中的混合菌液分别与S25中的Ti质粒载体混合,侵染6~8叶期的的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S27,注射结束后,对侵染叶片喷施少量清水,并进行黑暗处理24h后正常光周期养护,在一周后在系统叶注射相应的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9 Ti质粒载体;
S3,BSMV投送sgRNA和splited-Sacas9
S31,挑取含重组质粒载体的农杆菌克隆,接种到12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min振荡培养24h;
S32,取上述农杆菌菌液1ml接种至新的含有12.5ug/ml利福平和50ug/ml卡那的液体YEB培养基中于28℃、200r/min后振荡培养8~10小时,农杆菌菌液1ml与培养基溶液的体积比为1:50,将获得的菌液在5000r/min,20℃条件下离心10min来收集菌体,将菌体重悬于MMA-10mmol/L,10mmol/LMES,100umol/LAS,获得菌液重悬液且调节OD600=0.3;
S33,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:Cas9N和BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:Cas9C混合均匀形成BSMV八组份系统,BSMV八组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S34,分别取等体积BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ1:SaCas9C-sgRNA1、BSMV-γ2混合均匀形成BSMV四组份系统,BSMV四组份系统与S22中的菌液形成混合菌液,28℃黑暗培养3~4个小时;
S35,用不带针头的注射器吸取S33中的混合菌液,侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射,整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S36,用不带针头的注射器吸取步骤S34中的混合菌液,然后侵染6~8叶期的本氏烟叶片,每片叶选取3~4个孔进行注射直至整张叶片被菌液浸透时停止注射;
S37,注射结束后,对侵染叶片喷施少量清水,并进行黑暗处理24h后正常光周期养护。
2.根据权利要求1所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,所述的S13中BSMV-γ:sgRNA1、S14中BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA1、S23中的BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA2、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA1的构建方法为:
S131,使用ApaI单酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体,凝胶电泳回收;
S132,使用高保真酶,以pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2为模板,通过PCR扩增出各sgRNA片段序列,琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物;
S133,通过LIC的连接方法,将步骤S131中的线性化病毒载体和步骤S132中的sgRNA片段序列连接,构成重组载体BSMV-γ:sgRNA1、BSMV-γ1:sgRNA1、BSMV-γ2:sgRNA1、BSMV-γ1:sgRNA2、BSMV-γ2:sgRNA2。
3.根据权利要求1所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,所述的S33中的BSMV-γ2:Cas9N、BSMV-γ2:Cas9C的构建方法为:
S331,使用ApaI单酶切BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒载体后形成线性化病毒载体,凝胶电泳回收;
S332,将SaCas9从其第739个氨基酸分割,使用高保真酶,以pKSE401载体为模板,分别扩增Cas9N端和Cas9C端;
S333,通过LIC的连接方法,将步骤S331中的线性化病毒载体和步骤S332中的Cas9N、Cas9C片段连接,构成重组载体BSMV-γ2:Cas9N、BSMV-γ2:Cas9C。
4.根据权利要求3所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,所述的步骤S332中Cas9N端PCR引物为:
正向引物序列为:
5’-AAGGAAGTTTAAATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
反向引物序列为:
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
5.根据权利要求3所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,所述的步骤S332中Cas9C端PCR引物为:
正向引物序列为:
5’-AAGGAAGTTTAAATGGCCCCAAAGAAGAAGAGAAA-3’
反向引物序列为:
5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’。
6.根据权利要求3所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,所述的S34中的BSMV-γ1:SaCas9C-sgRNA1的构建方法为:
S341,使用ApaI单酶切pCaBs-γ1、pCaBs-γ2病毒载体,凝胶电泳回收;
S342,使用HindIII单酶切pKSE401载体,凝胶电泳,回收15kb的大片段;
S343,使用高保真酶,以pKSE401载体为模板,分别扩增出含有同源重组接头的sgRNA1和Cas9C端片段,将Cas9C分别与sgRNA连接入步骤S342中单酶切pKSE401载体中;
S344,使用BsaI对S33中构建好的载体进行单酶切凝胶电泳,回收15kb的大片段;
S345,将各个sgRNA正反向引物等比例混合,85℃水浴15min后形成双链DNA插入步骤S342酶切好的载体中,构建pKSE401-CasC-sgRNA1、pKSE401-CasC-sgRNA2载体;
S346,通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法,使用2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)高保真酶,以S345中构建好的pKSE401载体为模板,分别扩增Cas9C端;
S347,通过LIC(Ligation independent cloning)的连接方法,将S31中的线性化载体和S36中的Cas9C片段连接,构成重组载体pCaBs-γ1:Cas9C-sgRNA1、pCaBs-γ1:Cas9C-sgRNA2。
7.根据权利要求6所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于:所述的步骤S343中的Cas9C、sgRNA的引物为:
Cas9C的正向引物序列为:
5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列为:
5’-GCTCAACACGTACCCGGCCGCGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
sgRNA的正向引物序列为:
5’-TCGCGGCCGGGTACGTGTTGAGCCGAAGTAGTGATTGGGAGACC-3’
sgRNA的反向引物序列为:
5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3’。
8.根据权利要求1所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于,所述S15的pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9的构建方法为:
S151,首先使用XbaI和SacI双酶切pKSE401载体,然后将酶切好的pKSE401载体进行琼脂糖凝胶电泳,回收12kb的酶切产物;
S152,以VK101载体为模板各部分进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,分别回收3.2kb、2.2kb、1kb的条带,然后使用XbaI和SacI对胶回收产物进行双酶切,将其插入S151中酶切好的载体中,构建成pKSE401-SaCas9N、pKSE401-SaCas9C、pKSE401-SaCas9。
9.根据权利要求8所述的BSMV投送splited-Sacas9和sgRNA介导的基因编辑方法,其特征在于:所述的SaCas9N、SaCas9C、SaCas9的正、反向引物的序列为:
Cas9N的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9N的反向引物序列:
5’-CGAGCTCTTACTCGGCCTGCTTTTCCTC-3’
Cas9C的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGAGTATGCCAGAGATCGAAAC-3’
Cas9C的反向引物序列
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’
Cas9的正向引物序列:
5’-GCTCTAGATGGCGTGCAGGTCGAC-3’
Cas9的反向引物序列:
5’-CGAGCTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGTCCG-3’。
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