CN116716322B - 一种denv-3全长感染性克隆及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DENV‑3全长感染性克隆及其构建方法与应用。涉及生物技术领域。本发明提供一种DENV‑3全长感染性克隆,所述DENV‑3全长感染性克隆的序列为SEQ ID NO:1所示。本文利用广州分离株GZ2D3的5’和3’UTR的末端部分序列,拼接形成嵌合全长基因组序列,构建出了感染性克隆pTight D19syn。该系统能成功地拯救出活病毒;经过在感染BHK‑21细胞中连续传代,测序鉴定得到4个适应性突变(4M),加入突变后的D19syn_4M在转染BHK‑21细胞后产生1.1×104FFU/mL的病毒滴度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种DENV-3全长感染性克隆及其构建方法与应用。
背景技术
登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。DENV感染可引起一系列疾病,症状轻微的为登革热(dengue fever,DF),严重的病人则发生登革出血热(dengue haemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)等重症登革(severedengue,SD)症状。DENV在1000年前出现,起源于非洲和亚洲的非人类灵长类动物,并在近几百年来开始在人群中广泛传播。2019年全球登革热病例数达到新的高峰,世界卫生组织将登革列为全球健康十大威胁。
感染DENV并出现重症的原因,普遍认为是抗体依赖性增强作用(Antibodydependent enhancement,ADE)和病毒蛋白的直接作用。ADE即第二次感染了DENV的病患会因为初次感染DENV所产生的抗体而使得病情加重的现象,会导致血管通透性增加。登革热的发病率约为2.9%~4.6%,但登革热的暴发是难以预测的,因此为了防止疫情突然爆发可能带来的医疗问题和保护人民的生命财产安全,注射登革疫苗是一种选择。然而登革疫苗的研制由于DENV拥有四种血清型的原因而困难重重。其一是因为感染DENV的一种血清型后只对该种血清型有免疫反应,其二是因为继发感染DENV的病患体内有ADE效应的出现。
与传统遗传不同,反向遗传是在获得生物体基因组序列的基础上,通过对基因分子进行定点突变、基因插入、基因缺失、基因置换、RNA干扰等操作,以研究生物体结构与功能的一种方法。反向遗传学在黄病毒的研究中同样可以发挥重要的作用,通过改造病毒基因组,研究者可以探索与病毒毒力相关的基因,研究病毒的发病机制,从而研发疫苗和寻找抗病毒药物等。感染性克隆为反向遗传学中最常见的一种技术,即将病毒的全长基因组构建到载体上,并将其转化进感受态细胞,最后获得拥有全长基因组的质粒。登革疫苗的构建与感染性克隆的构建原理相同,且使用的构建方法也和感染性克隆一样非常多样,但由于多数黄病毒cDNA基因组在转化受体菌中不稳定,目前具细菌复制稳定性DENV全长感染性克隆极少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种DENV-3全长感染性克隆及其构建方法与应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种DENV-3全长感染性克隆,所述DENV-3全长感染性克隆的序列为SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述DENV-3全长感染性克隆的优选实施方式,所述DENV-3全长感染性克隆的构建方法包括以下步骤:
(1)将病毒序列分为五个片段进行PCR,片段A:1~455bp,片段B:418~3055bp,片段C:2914~5952bp,片段D:5812~8854bp和片段E:8740~10707bp;所述片段A包括片段A1和片段A2;所述片段E包括片段E1和片段E2;
(2)将片段B与A2通过融合PCR连接得到A2-B,再将A1通过融合PCR与A2-B连接,再与pTight载体同源重组连接形成pTight-A-B;
(3)将片段D与E2通过融合PCR连接得到E2-D,再将E1通过融合PCR与E2-D连接,再与pTight载体同源重组连接形成pTight-D-E,通过同源重组插入pTight-A-B中,形成pTight-A-B-D-E质粒;
(4)将片段C同源重组插入pTight-A-B-D-E质粒中,最终获得DENV-3全长感染性克隆pTight D19syn。
作为本发明所述DENV-3全长感染性克隆的优选实施方式,所述片段A1和片段E2源于序列如GenBank:JN662391.1所示的GZ2D3病毒株。
本发明还提供含有所述DENV-3全长感染性克隆的重组病毒。
本发明还提供所述DENV-3全长感染性克隆或所述重组病毒在制备抗登革热病毒的药物中的应用。
本发明还提供所述DENV-3全长感染性克隆或所述重组病毒在制备登革热病毒疫苗中的应用。
本发明还提供所述DENV-3全长感染性克隆在拯救登革热病毒中的应用。
本发明还提供所述DENV-3全长感染性克隆在制备检测登革热病毒的产品中的应用。
本发明的有益效果:本发明构建了DENV-3全长感染性克隆pTight D19syn。D191267是广东地区的登革病毒的流行株,属于登革病毒血清型III型。本文利用广州分离株GZ2D3的5’和3’UTR的末端部分序列,拼接形成嵌合全长基因组序列,并通过分析GenBank中DENV-3病毒的共有序列,并将该区间片段替换为DENV-3共有序列,并结合大肠杆菌启动子(ECP)的预测与沉默突变(抑制或不表达病毒编码的cDNA细菌毒性蛋白),构建出了感染性克隆pTight D19syn。该系统能成功地拯救出活病毒;经过在感染BHK-21细胞中连续传代,测序鉴定得到4个适应性突变(4M),加入突变后的D19syn_4M在转染BHK-21细胞后产生1.1×104FFU/mL的病毒滴度。
附图说明
图1为DENV-3_D191267毒株的进化树。
图2为D191267PCR电泳结果与pTight-D19syn人工全长克隆的构建步骤;其中A为DENV3-D191267的基因组、合成目的序列、全长克隆的酶切与原质粒。M1为marker GenStarD2000 Plus,M2为marker Trans15K,泳道1为合成的目的序列(2862bp),泳道2为部分5’UTR-C-合成序列(2979bp),泳道3为D191267部分5’UTR至部分NS1(2979bp),泳道4为PCR-2(2977bp),泳道5为PCR-3(3043bp),泳道6为PCR-4(1884bp)泳道7为pTight-D19syn全长克隆酶切(MluI-BsrGI双酶切,条带大小为2789bp与13174bp),泳道8为pTight-D19syn人工全长克隆原质粒(15963bp);B为pTight-D19syn人工全长克隆的构建步骤。
图3为pTight-D19syn的转染后IFA图与病毒滴度;A为为转染换液后的第2、4、6、8天的IFA图;B为D19syn_WT转染BHK-21后的病毒滴度,进行三次独立重复试验,数据以Mean±SD显示,*表示观察滴度低于0.69log10FFU/ml。
图4为D19syn适应性突变情况;其中A为D19syn连续传代所产生的4个突变位于基因组全长的位置;B为D19syn_WT,D19syn_1M与D19syn_4M转染BHK-21细胞后的IFA,IFA中阳性细胞为染上绿色荧光的DENV NS3蛋白,蓝色荧光为细胞核,右下角标尺为100μm;C为三种克隆转染后的病毒滴度,三种克隆转染BHK-21细胞后收取时间点的上清液作IFA,进行三次独立重复试验,数据以Mean±SD显示,*表示观察滴度低于0.69log10FFU/ml。
图5为FFU法检测D19syn_4M在转化中病毒滴度;D19syn_4M/5TPC克隆质粒产生了与D19syn_4M克隆相似的感染性病毒粒子,进行三次独立重复试验,数据以Mean±SD显示。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明采用的材料与方法如下:
1、材料:
实验细胞系:Huh7.5.1由Dr.Frankcis Chisari(美国斯克里普斯研究所)和钟劲教授(中国上海巴斯德研究所)提供;C6/36由张萍教授(中山大学)提供。
质粒:克隆载体pTight由中国台湾地区卫生研究院Yueh教授提供。
病毒:DENV-3_D191267由中国广东省疾控中心病原所吴德研究员提供。
2、方法:
(1)病毒RNA提取与反转录
病毒RNA提取:取病毒液200μL于1.5mL离心管中,加入1mL的Trizol振荡混匀,室温下裂解2min,后加入200μL氯仿室温振荡混匀,放置5min。此处样品:Trizol:氯仿体积比为1:5:1。随后将样品置于4℃,12000rpm离心机离心15min。此时样品会出现明显的分层,小心地吸取最上层透明液体部分至新的1.5mL离心管中,注意不要吸取到中间与下层物质。随后在新的上清中加入等体积的异丙醇,并加入2μL的糖原帮助沉淀RNA,上下轻轻混匀后,室温放置10~15min。在4℃12000rpm离心机离心15min后,可以观察到有白色絮状沉淀,吸弃上清,加入75%乙醇清洗,轻轻摇晃使沉淀飘起,在4℃7500rpm离心机离心5min,此清洗步骤重复2次。之后去掉酒精,置于室温晾干乙醇10min,待沉淀变得透明,即可加入适量DEPC水,置于冰上溶解10min。溶解结束即可测RNA浓度。
病毒基因组的反转录:DENV全长基因组的反转录使用的是Invitrogen的SuperScript III的反转录酶,该酶反转效率高,但若要反转全长则需要添加DENV特异引物,这样才能确保序列能够完整地反转。因此为了获得DENV全长基因组序列,本人在病毒基因组3’UTR靠近末端处,以及基因组中间处各设了一个反向的特异引物,确保反转录能够包含整个病毒序列。配置反转录体系需要在冰上进行,详细体系如下:
成分 | 体积(使总体积13μL) |
gene specific primer-1 | 1μL |
gene specific primer-2 | 1μL |
RNA | 10μL |
RNase-free H2O | 1μL |
dNTP(10mM) | 1μL |
置于65℃水中热激5min,冰上5min。后继续在上述体系中添加以下成分:
成分 | 体积(使总体积20μL) |
5×First-Stand Buffer | 4μL |
DTT(0.1M) | 1μL |
RNase Inhibitor(40U/μL) | 1μL |
SuperScript III | 1μL |
轻弹管壁混匀体系,瞬时离心后,置于PCR仪设置程序55℃反应60min,最后70℃反应15min使反转录酶失活。反转录后的产物可置于-20℃保存或直接使用。
病毒基因组短片段的反转录:DENV基因组短片段的反转录使用的是Vazyme的HiScript II Q RT SuperMix,该反转录主要用于做qPCR以及病毒的鉴定。若是用于病毒鉴定,则最好在体系中添加特异引物。但是该反转录酶的混合Mix中也包含了随机引物,可以不用添加。配置反转录体系需要在冰上进行,详细体系如下:
成分 | 体积(使总体积16μL) |
RNase-free H2O | 2μL |
4×gDNA wiper Mix | 4μL |
RNA | 10μL |
轻弹混匀体系,瞬时离心,置于42℃水中反应2min。随后在管内继续添加一下成分:
成分 | 体积(使总体积16μL) |
5×HiScript II qRT SuperMix II | 4μL |
gene specific primers(10μM) | 1μL |
轻弹混匀体系,瞬时离心,置于PCR仪设置程序50℃反应15min,85℃反应5s失活反转录酶。转录后的产物可置于-20℃保存或直接使用。
(3)病毒cDNA全长的分片段扩增
通过将病毒基因组进行反转录,我们获得了病毒的全长cDNA,然后将cDNA用ddH2O进行两倍稀释后,再作为模板进行PCR片段的扩增。DENV全长主要分成4个片段来进行扩增,使用的是Vazyme的高保真酶(Max Super-Fidelity DNA Polymerase),根据其使用说明,以下为片段的扩增体系,体系配置需要全程在冰上。病毒基因组PCR扩增体系1如下:
成分 | 体积(使总体积50μL) |
2×Phanta Max Buffer | 25μL |
dNTP Mix(10mM) | 1μL |
上游引物(10μM) | 1μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
Super-Fidelity DNA Polymerase | 1μL |
模板(cDNA或者一轮产物) | 2μL |
ddH2O | 19μL |
在该体系中,需要根据产物的片段大小,来增加(大于4000bp)或减少(小于1000bp)dNTP和DNA聚合酶的使用量。模板可为病毒的cDNA、在进行过第一轮PCR扩增后的产物或者是质粒中的某些片段。配置好PCR体系后,同样需要轻弹管壁,混匀体系,然后瞬时离心,并置于PCR仪中反应。以下为PCR反应程序:
退火所设置的温度通常由引物的Tm值来决定,但一般可使用55~58℃。而延伸时间由产物长度以及DNA聚合酶特性决定。在本实验中使用的Vazyme高保真酶的扩增速度为1kb/min。获得的PCR产物将加入10×Loading混匀,通过核酸电泳来确认结果。若电泳结果正确,则进行产物的胶回收,送测序。
实施例1DENV-3_D191267序列分析与进化树
DENV-3_D191267毒株于2019年9月分离于广东省清远市。该毒株在从病人血清分离后经广东省疾病与控制中心病毒所在C6/36细胞传代一次(共6天)后,实验组获得了该毒株的细胞培养液,提取病毒RNA,在通过使用SuperScript III进行反转录后,扩增出了DENV-3全长10707bp中的54~10623bp,并将扩增的片段进行测序。通过在NCBI搜索,获得由广东省疾控中心上传的7条DENV-3全长序列,并根据这几条序列的保守区域设计了4对特异性的扩增引物,且将第4对的下游引物作为反转录的特异性引物。在经过NCBI的BLAST(version+2.13.0)比对后,分析发现D191267与分离于广州的GZ8H/2019149/2019/III有99.97%的核苷酸同源性,两条序列有3个nt与1个aa的差异;与GZ8H/2019154/2019/III有99.95%的核苷酸同源性,有5个nt和1个aa的差异。取DENV-3的5种基因型以及其他几种血清型的DENV ORF片段构建进化树(图1)。通过使用MEGA 6(Kimura2-parameter)的neighbor-joining法,分析得出结果发现D191267属于DENV的基因III型。
实施例2D191267全长感染性克隆的构建
本发明DENV-3GZ2D3(JN662391.1)毒株的部分序列(5’UTR 1~53bp,3’UTR 10624~10707bp)来补全UTR片段。GZ2D3与D191267一样均属于基因III型,而使用的片段在DENV属于是保守的区域,且除了5’UTR 1~53bp外,5’UTR其余位置并没有不同,而3’UTR的其余片段有8个碱基不同。
经过GZ2D3的UTR片段的补充,将DENV-3病毒序列主要分为5个部分进行构建,分别为片段A(1~455bp,SacI),片段B即为合成的目的片段(418~3055bp,BsrGI),片段C(2914~5952bp,BsrGI-SacII),片段D(5812~8854bp,SacII-KasI)与片段E(8740~10707bp,KasI-RsrII)(图2)。在获得了合成后的无ECP目的片段(B)后,其与D191267的5’UTR-C(A2)通过融合PCR连接,再将GZ2D3的5’UTR 1~53bp(A1)通过融合PCR与A2-B连接,再与pTight载体同源重组连接形成pTight-A-B。同样的,将3’UTR的10624~10707bp(E2)与D191267的NS3~NS5(D)和NS5-3’UTR(E1)通过融合PCR连接后,通过同源重组插入pTight-A-B中,形成pTight-A-B-D-E质粒。最后经过酶切将片段C同源重组插入pTight-A-B-D-E质粒中,最后获得完整的全长克隆,并将其命名为pTight D19syn(图2)。构建的所有克隆均在Turbo感受态中完成,转化条件如试验方法所述没有改动。
最初在获得D191267四个相互重叠的片段后,计划将其连接上T载体,并通过转化Turbo感受态细胞来扩增质粒。然而唯有其中的第一个(即5’UTR至部分NS1,54~3055bp)片段无法连接上T载体。于是尝试将第一段从病毒E蛋白处分成两段连接T载体,但也依旧没有长出阳性克隆。考虑到是病毒E蛋白的影响,于是我们将第一段分为5’UTR-C、E与NS1三段分别连接T载体,结果仅有5’UTR-C与NS1的病毒片段能成功连接上T载体。由于连接T载体失败,于是决定将第一段直接连接pTight载体,但也依旧长不出正确的克隆。然而即使在将第二、三和四段连接上pTight载体后,最后尝试连接第一段,也依然无法得到完整的阳性克隆。
因此,本申请发明人决定单独设计一段经过设计没有大肠杆菌启动子(ECP)的DENV-3序列,通过设计该序列成功构建完整的且没有毒性蛋白表达的DENV-3全长感染性克隆。于是本文选择了prM-E-部分NS1的序列(437~2933bp)进行设计,正好包括E蛋白在内的与其前后约500bp的片段。
发明人从NCBI的基因库中随机下载了180条DENV-3含完整ORF的病毒序列,并截取相应区域的序列另外保存。后根据病毒序列上传信息中的地理位置按洲进行分组,最后得出共有来自非洲毒株5条,亚洲毒株112条,欧洲毒株2条,北美洲毒株30条,南美洲毒株27条,大洋洲毒株4条。分别将各洲毒株加载进Vector NTI中进行核酸序列的比对,并得出各洲的共有序列(Vector NTI的all consensus)。后再将各洲的共有序列一同再进行比对,获得最后所需要使用的共有序列。随后将最后的共有序列上传至伯克利果蝇基因组计划网站进行启动子的预测,得出了19条长46bp、分数高于0.8的预测结果(满分为1.0),其中分数代表启动子的活性,越高代表启动子活性高。并在最后的共有序列上根据结果修改ECP位点。
由于亚洲、北美洲和南美洲的DENV毒株较多,因此本文主要分析这三大洲的病毒序列。每一条ECP根据预测得出的序列位置,同时比对三大洲的所有病毒序列在该预测位置中,是否有出现个别序列拥有与其他序列不同的碱基。将同一位置出现的不同碱基记录后,后将单一不同点的碱基替换至该条ECP的原序列中,并输入进网站进行预测,记录预测后的分数。每一条预测的ECP片段尽量只修改1个bp,且使该条ECP分数低于0.8,即可修改至最后共有序列中。在修改的过程中,有出现一条ECP序列需要同时修改2个碱基后才能降低ECP分数的情况,还有出现在比对全部不同点后依旧无法使ECP分数低于0.8的情况。而在修改完最后共有序列的全部ECP片段后,一共出现19个需要修改的碱基(表1)。在将需要修改的碱基替换至最后共有序列后,无ECP的目的序列便完成了。
表1DENV-3prM-E-NS1片段ECP的修改
实施例2pTight-D19syn成功拯救活病毒
通过质粒提取的pTight-D19syn与pTet-off以2:1比例共转染进BHK-21细胞中,在转染、换液后的第2、4、6和8天收取上清液,并做IFA进行病毒滴度的观察。D19syn在转染后的IFA观察发现,在第2天与第4天并没看到阳性的荧光细胞,而在第6和8天能看到比D19044更圆更小的感染阳性荧光细胞(图3A)。病毒的滴度随天数增加而升高,但病毒滴度在第6天较低仅有1.5×102FFU/ml,第8天也仅有2.2×102FFU/ml(图3B)。虽然病毒滴度较低,但依然可以通过病毒滴度结果与IFA图片得知成功拯救了pTight-D19syn病毒。由于经过prM-E-NS1改造后的D19syn没有临床株,因此后续试验中使用的野生型D19syn_WT即为此次拯救的D19syn病毒。
实施例3D19syn传代产生高效产毒的适应性突变
由于pTight-D19syn转染后的滴度较低,转染后第八天滴度仅在2.2×102FFU/ml,因此需要通过在BHK-21细胞中进行连续传代,让病毒在多次感染细胞中获得适应性突变,提高病毒滴度。病毒传代的方法与D19044相同,是约72h进行一次传代,病毒上清液是一半保存于-80℃,另一半继续感染新细胞。
在转染后的D19syn传至第16代(转染后第55天)时,病毒滴度便高于1×104FFU/ml,于是我们测序这代病毒的全长序列,获得了一个位于NS1的突变(nt A3118G,aaN1007D)。而在连续传代至第36代时,病毒滴度已有6.7×104FFU/ml,由于滴度变得稳定且与第16代相差不大,我们判断病毒滴度并不会变得更高,于是便测序了该病毒的全基因序列,并获得了除第一个外的另外三个突变(表2)。于是我们便将第16代获得的1个突变单独做进pTight-D19syn质粒,并命名为D19syn_1M。而在第36代测出的全部4个突变也全部做进另一个pTight-D19syn质粒,并命名为D19syn_4M。
表2D19syn_WT连续传代的适应性突变
为了鉴定突变后的全长克隆D19syn_1M与D19syn_4M能否强D19syn_WT,我们便将这三种克隆分别与pTet-off共转染进BHK-21细胞中,转染换液后收集第2、4、6和8天的病毒上清作IFA观察病毒的滴度。实验结果如图4所示,在第2天时,WT并未看见阳性荧光细胞,1M与4M均能观察到荧光,其中4M滴度是1M的27倍。在第4天时,WT也依旧看不到荧光,4M病毒滴度超过1×103FFU/ml,且是1M的17倍。在第6天,WT观察到了少量荧光细胞,其滴度近1×102FFU/ml,1M滴度达1.2×103FFU/ml,而4M的滴度则为8.2×103FFU/ml,病毒滴度接近稳定。在第8天,WT滴度有稍微的升高,而4M的滴度已为1.1×104FFU/ml,是WT的57倍,1M的17倍,荧光图中阳性细胞也明显多于WT与1M。我们对本次实验第8天的三种病毒上清进行测序鉴定,发现病毒序列正确,并没有发生污染,可以确定这些病毒滴度结果可靠。
实施例4D19syn_4M在细菌中稳定存在
DENV在细菌中容易出现不稳定的现象,且在构建D19syn克隆的时候也同样出现大片段缺失的情况,尤其是病毒蛋白E。然而就在我们将D19syn_4M转化进Turbo感受态,随机挑取一个单菌落,然后提取质粒纯化后再转化,并重复该步骤5次后,我们测序了最后的D19syn_4M/5TPC质粒,并没有发现任何突变与片段的缺失。这说明D19syn_4M已能在细菌中完全稳定存在,且不出现突变与缺失。
将D19syn_4M与D19syn_4M/5TPC转染进BHK-21细胞,检测转化5次后的质粒能否与原质粒一样能成功产生高效病毒。而转染后病毒滴度的结果如图5所示,两个病毒的滴度也几乎一样,在第4天滴度开始逐渐稳定,在第8天滴度到达峰值1.5×104FFU/ml,两个克隆在这个结果差别并不明显。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种DENV-3全长感染性克隆,其特征在于,所述DENV-3全长感染性克隆的序列是在SEQ ID NO:1的基础上进行如下突变得到:A3113G,A486G,A4716G,T7152C。
2.含有权利要求1所述DENV-3全长感染性克隆的重组病毒。
3.权利要求1所述DENV-3全长感染性克隆或权利要求2所述重组病毒在制备登革热病毒疫苗中的应用。
4.权利要求1所述DENV-3全长感染性克隆在拯救登革热病毒中的应用。
5.权利要求1所述DENV-3全长感染性克隆在制备检测登革热病毒的产品中的应用。
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