具体实施方式
以下详细说明本发明的重组痘苗病毒及其用途,但本发明的范围不受这些说明限定,即使在以下的例示之外,也可以在不损害本发明主旨的范围内适当变更而实施。予以说明,本说明书包括了作为本申请优先权基础的日本特愿2010-233064号说明书(2010年10月15日提出申请)的全部内容。此外,本说明书中引用的专利文献、非专利文献以及其它出版物均作为参照引入本说明书中。
1.本发明的概要
各种疫苗中,活疫苗都是特别有效的疫苗之一,但通常已知开发新病毒的弱毒性疫苗需要非常长的时间,且认为对于新型流感也如此。
作为这种情况下所采取的方法之一的、制作作为活疫苗的重组痘苗病毒(RVV)的基因工程学方法是已知的。例如,已经实际确认了本发明人等开发的、狂犬病病毒用或牛瘟用的重组痘苗病毒在野外试验等中发挥了优异的感染发病预防效果(参照例如Tsukiyama K.et al.,Arch.Virol.,1989,vol.107,p.225-235)。
此外,本发明人等对于新型肺炎SARS也成功制作了具有已知为其病原体的SARS-CoV的cDNA的重组痘苗病毒(WO2006/038742),已经确认其为预防效果优异且能够再给予的制剂(参照例如Kitabatake M.et al.,Vaccine,2007,vol.25,p.630-637)。
作为成为RVV制作中所使用的重组母体的痘苗病毒,必需为已经确认了安全性的疫苗株,作为这样的疫苗株,已知有痘苗病毒LC16m8株(参照例如“臨床とウイルス(临床和病毒)”,vol.3,No.3,p.269,1975)。LC16m8株是由Lister株分离而得的,实际中有过作为预防疫苗的给予经历,且安全性及有效性均已得到确认,是现在制造的唯一疫苗株。此外,本发明人等在针对牛瘟(rinderpest)、HIV、SARS-CoV等的重组痘苗病毒的开发研究过程中发现,使用可以极大提高抗体产生能力及细胞免疫的诱导能力的基因表达启动子对于本发明的痘苗病毒是有效的。具体而言,发现了质粒载体优选使用pSFJ1-10、pSFJ2-16(参照例如Jin N-Y et al.,Arch.Virol.,1994,vol.138,p.315-330;Elmowalid GA.et al.,Pros.Natl.Acad.Sci.,2007,vol.104,p.8427-8432;Arch.Virol.,vol.138,p.315-330,1994;日本特开平6-237773号公报)。
其结果是,本发明人通过将编码H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1HPAIV)或H1N1大流行性流感病毒(H1N1(2009)pdm)的血凝素(HA)蛋白质的基因与表达启动子一起重组到痘苗病毒中,从而成功地制作了表达H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm来源的HA蛋白的重组痘苗病毒。
如上所述,成为本发明的重组痘苗病毒的母体的病毒为痘苗病毒。在其基因组中重组了编码H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白的cDNA(该cDNA的全部或一部分)的病毒即为本发明的重组痘苗病毒。将编码H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白的cDNA(该cDNA的全部或一部分)分别作为表达单元,分别导入痘苗病毒载体。将该表达单元导入痘苗病毒LC16m8株的HA基因区域。已知的是,即使在HA基因区域导入外来基因也不会影响痘苗病毒的增殖活性,因此可以将增殖能力弱的安全的疫苗株作为重组母体病毒使用(参照Vaccine,vol.12,p.675-681,1994)。
就重组痘苗活疫苗而言,针对狂犬病病毒、牛瘟病毒的重组痘苗活疫苗已经进行了野外试验,已经证明了其感染发病预防效果的优秀性。
本发明人通过在杂合启动子的下游插入H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因而将这些基因重组到弱毒痘苗病毒LC16m8株的HA蛋白基因区域,从而制作了重组痘苗病毒(RVV)。杂合启动子由痘病毒A型包涵体(ATI)启动子及多个重复的痘苗病毒7.5kDa蛋白质(p7.5)前期表达启动子构成(参照Jin N-Y et al.,Arch.Virol.,1994,vol.138,p.315-330)。该启动子由北海道大学的志田寿利博士开发,可以从该博士处获得该启动子。
所制作的LC16m8株来源的RVV,通过使其感染动物细胞,已经确认了大量表达H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白,此外,通过将其接种于动物个体,还确认了在早期产生高效价的抗H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白的抗体,从而完成了本发明。
2.具有新型流感病毒的HA蛋白基因的重组痘苗病毒的制作
H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因已经在美国生物工程信息中心(NCBI;National Center for Biotechnology Information)所提供的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中以规定的登录号(Accession No.)登录。例如,GenBank登录号:EF541402登录的是编码H5N1HPAIV的进化枝1(属于H5亚型进化枝1的病毒株)来源的HA蛋白的基因(cDNA:序列号1),GenBank登录号:EF541394登录的是编码H5N1HPAIV的进化枝2.1(属于H5亚型进化枝2.1的病毒株)来源的HA蛋白的基因(cDNA:序列号2),GenBank登录号:DQ371928登录的是编码H5N1HPAIV的进化枝2.3(属于H5亚型进化枝2.3的病毒株)来源的HA蛋白的基因(cDNA:序列号4)。此外,GenBank登录号:FJ969540登录的是编码H1N1(2009)pdm(属于H1亚型的病毒株)来源的HA蛋白的基因(cDNA:序列号5)。
作为本发明的重组痘苗病毒中所含的编码HA蛋白的基因(cDNA),除了上述各基因外,也可以使用其一部分序列或其变异序列。例如,作为编码H5N1HPAIV的进化枝1的HA蛋白的基因(cDNA),可以使用包含序列号1所示的碱基序列的DNA的部分缺损而成的DNA(具体而言,包含序列号12所示的碱基序列的DNA),作为编码H5N1HPAIV的进化枝2.1的HA蛋白的基因(cDNA),可以使用包含序列号2所示的碱基序列的DNA的部分缺损而成的DNA(具体而言,包含序列号13所示的碱基序列的DNA);作为编码H5N1HPAIV的进化枝2.3的HA蛋白的基因(cDNA),可以使用包含序列号4所示的碱基序列的DNA的部分缺损而成的DNA(具体而言,包含序列号14所示的碱基序列的DNA)。此外,作为编码H1N1(2009)pdm的HA蛋白的基因(cDNA),可以使用包含序列号5所示的碱基序列的DNA的部分碱基发生变异(置换变异)而成的DNA(具体而言,包含序列号15所示的碱基序列的DNA)。予以说明,关于编码H5N1HPAIV的进化枝2.2(属于H5亚型进化枝2.2的病毒株)来源的HA蛋白的基因,该基因(cDNA)部分缺损而成的基因(cDNA:序列号3)以GenBank登录号:DQ659327进行了登录。
这些HA蛋白基因(也包括部分缺损、突变而成的基因)均已被克隆、插入质粒。因此本发明的重组痘苗病毒中所含的基因、即编码H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白的完整cDNA(也包括变异序列)或其一部分可以通过通常的基因工程方法得到。例如,可以使用作为基因工程方法通常使用的、利用DNA合成装置进行的核酸合成法。此外,可以使用如下的PCR法:在分离或者合成了作为模板的基因序列后,对各基因设计特异性引物,使用PCR装置扩增该基因序列;或可以使用利用了克隆载体的基因扩增法。上述方法可以参照“Moleculer cloning,A Laboratory Manual2nd ed.”(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等进行。获得的PCR产物的精制可以利用公知的方法进行。此外,对于变异序列、尤其是变异置换型的DNA,则可以根据例如上述“Moleculer cloning,A Laboratory Manual2nd ed.”、“Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)”等中所述的位点特异性变异诱导法来制备。具体而言,可以利用Kunkel法、缺口双链体(Gapped duplex)法等公知方法、并使用利用了位点特异性突变诱导法的变异导入用试剂盒来制备,作为该试剂盒,优选列举例如QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等,宝生物公司制)等。
本发明的优选方式中,可以用插入到上述质粒中的H5N1HPAIV的HA蛋白基因或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因作为上述PCR的模板。然后,通过以H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的cDNA为模板、使用各基因的特异引物进行PCR,从而可以制备H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因区域。本发明中,将作为编码H5N1HPAIV的进化枝1(属于H5亚型进化枝1的病毒株)来源的HA蛋白的基因的、包含序列号12所示的碱基序列的DNA编码的基因称为“mCl1”,将作为编码H5N1HPAIV的进化枝2.1(属于H5亚型进化枝2.1的病毒株)来源的HA蛋白的基因的、包含序列号13所示的碱基序列的DNA编码的基因称为“mCl2.1”,将作为编码H5N1HPAIV的进化枝2.2(属于H5亚型进化枝2.2的病毒株)来源的HA蛋白的基因的、包含序列号3所示的碱基序列的DNA编码的基因称为“mCl2.2”,将作为编码H5N1HPAIV的进化枝2.3(属于H5亚型进化枝2.3的病毒株)来源的HA蛋白的基因的、包含序列号14所示的碱基序列的DNA编码的基因称为“mCl2.3”,将作为编码H1N1(2009)pdm(属于H1亚型的病毒株)来源的HA蛋白的基因的、包含序列号15所示的碱基序列的DNA编码的基因称为“mIVR153”。
本发明中,除包含序列号1~5及12~15所示的碱基序列的DNA外,以下的各DNA也可以用作上述各HA蛋白基因(例如mCl1、mCl2.1、mCl2.2、mCl2.3及mIVR153等)的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝1来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA):包含同序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝1来源的HA蛋白的DNA(mCl1的变异型DNA):包含同序列号12所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝2.1来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA):包含同序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝2.1来源的HA蛋白的DNA(mCl2.1的变异型DNA):包含同序列号13所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝2.2来源的HA蛋白的DNA(mCl2.2的变异型DNA):包含同序列号3所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝2.3来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA):包含同序列号4所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H5N1HPAIV的进化枝2.3来源的HA蛋白的DNA(mCl2.3的变异型DNA):包含同序列号14所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H1N1(2009)pdm来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA):包含同序列号5所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
与下述DNA在严格条件下杂交且编码H1N1(2009)pdm来源的HA蛋白的DNA(mIVR153的变异型DNA):包含同序列号15所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
上述的各变异型DNA可以通过化学合成获得,或者也可以将包含序列号1~5及12~15所示的碱基序列的DNA或其片段作为探针,通过菌落杂交、嗜菌斑杂交、DNA印迹等公知的杂交法由cDNA文库及基因组文库获得。作为上述杂交中的严格的条件,可以列举例如0.1×SSC~10×SSC、0.1%~1.0%SDS及20℃~80℃的条件,更详细而言,可以列举如下条件:在37℃~56℃进行30分钟以上预杂交后,在0.1×SSC、0.1%SDS中,在室温下进行1~3次10~20分钟的洗涤。杂交法的详细步骤可以参照“MolecularCloning,A Laboratory Manual2nd ed.”(Cold Spring Harbor Press(1989))等。
此外,可以使用:与序列号1所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝1来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA),与序列号12所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝1来源的HA蛋白的DNA(mCl1的变异型DNA),与序列号2所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝2.1来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA),与序列号13所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝2.1来源的HA蛋白的DNA(mCl2.1的变异型DNA),与序列号3所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝2.2来源的HA蛋白的DNA(mCl2.2的变异型DNA),与序列号4所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝2.3来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA),与序列号14所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H5N1HPAIV的进化枝2.3来源的HA蛋白的DNA(mCl2.3的变异型DNA),与序列号5所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H1N1(2009)pdm来源的HA蛋白的DNA(变异型DNA),与序列号15所示的碱基序列具有50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性且编码H1N1(2009)pdm来源的HA蛋白的DNA(mIVR153的变异型DNA)。
本发明的重组痘苗病毒中所含的表达启动子为插入到痘苗病毒的血凝素(HA)基因区域内的启动子,为由痘病毒A型包涵体(ATI)启动子及多个重复的痘苗病毒7.5kDa蛋白质(p7.5)前期表达启动子构成的杂合启动子。已知该启动子可以连接到适当的质粒如pBMSF7C(参照Arch.Virol.vol.138,p.315-330,1994;日本特开平6-237773号公报)。
本发明中能够使用的杂合启动子的碱基序列如序列号6所示。但是,本发明中除了包含序列号6所示的碱基序列的DNA外,也可以将与下述DNA在严格条件下杂交且具有启动子活性的DNA作为表达启动子(尤其是杂合启动子)使用,其中,所述DNA为包含同序列号6所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA。“严格的条件”与前述同样。“具有启动子活性”是指具有编码结构蛋白质或非结构蛋白质的基因的转录活性。
该通过杂合启动子表达的蛋白质可以从痘苗病毒感染前期至后期以受到完全的糖修饰的形式大量表达。本发明中,将在pBMSF7C的启动子下游插入了H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的质粒载体称为pBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3、pBMSF7C-mIVR153。
通过将这些质粒载体导入作为宿主的痘苗病毒,可以制作重组痘苗病毒。质粒载体向宿主的导入可以采用公知的任意方法进行,例如可以在感染了弱毒痘苗病毒LC16m8株的动物细胞中分别导入质粒载体pBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3、pBMSF7C-mIVR153,从而在痘苗病毒的血凝素(HA)基因区域引发同源重组,制作分别表达H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的重组痘苗病毒(RVV-Flu HA(H5-mCl1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153))。
予以说明,RVV制作中使用的痘苗病毒LC16m8株能够在动物个体中增殖,但是为在神经细胞中的增殖性极低的弱毒株。在日本已经作为天花疫苗获得批准,在约5万名小儿中接种均未发生严重副作用(参照厚生省种痘研究班研究报告:臨床とウイルス(临床和病毒),vol.3,No.3,269,1975)。另外,据报道其免疫诱导能力与亲株Lister株为同等,LC16m8株是安全且有效的疫苗。
制作的重组痘苗病毒(RVV-Flu HA(H5-mCl1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)),由于在痘苗病毒的HA蛋白基因区域插入了H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因,因此痘苗病毒来源的HA蛋白的表达缺失。流感病毒来源的HA蛋白对绒猴红细胞显示凝集反应,而痘苗病毒来源的HA蛋白则不会引起绒猴红细胞的凝集反应。因此使RVV-FluHA(H5-mCl1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)感染动物细胞,以绒猴红细胞向着由此而形成的嗜菌斑的凝集反应为指标,进行RVV的筛选。作为目标的RVV,分选具有红细胞凝集活性的红色嗜菌斑即可。
通过红色嗜菌斑而获得的病毒,可以以病毒基因组为模板、利用H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的特异引物进行PCR,来确认H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的导入。
H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白的表达可以以感染了RVV-Flu HA(H5-mCl1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)后的动物细胞为样品通过蛋白质印迹法来确认。予以说明,抗体可以使用用H5N1HPAIV的HA蛋白来源的HA肽(a.a.198-217(序列号10)等)、或H1N1(2009)pdm的HA蛋白来源的HA肽(a.a.223-234(序列号11)等)进行免疫而制作的兔抗血清。
作为RVV制作中目的基因的插入位点,除了HA蛋白基因区域以外,通常使用胸苷激酶(TK)基因区域,但在TK基因区域插入目的基因导致的TK的表达缺失已知会使RVV的增殖性下降。另外,已经报道了HA蛋白表达缺失对于RVV的增殖性基本无影响(参照Vaccine,vol.12,p.675-681,1994)。因此本发明中,目的基因的插入位点优选为HA蛋白基因区域。
3.新型流感的预防用及治疗用药物组合物
本发明提供含有上述重组痘苗病毒的、新型流感(即H5N1高致病性禽流感及H1N1大流行性流感)的预防药及治疗药(预防用药物组合物及治疗用药物组合物)。此外,本发明还可以提供包括对患者(被验者)给予上述重组痘苗病毒的步骤的上述新型流感的预防方法及治疗方法;用于上述新型流感的预防及治疗的上述重组痘苗病毒的用途;上述重组痘苗病毒的用于制造上述新型流感的预防药及治疗药的用途等。
本发明的药物组合物可以利用所有公知的方法如肌肉、腹腔内、皮内或皮下等的注射或由鼻腔、口腔或肺的吸入、经口给予导入生物体内。进而,还可以将本发明的药物组合物中所含的重组痘苗病毒和现有的抗病毒药(例如达菲、瑞乐沙)一起使用。一起使用的方式没有特别限定,既可以同时给予本发明的重组痘苗病毒和现有的抗病毒药,此外也可以通过给予一方后再经过一定时间后给予另一方的方法导入生物体内。
此外,本发明的药物组合物可以与赋形剂、增量剂、结合剂、润滑剂等公知的药剂中允许的载体、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等混合。
本发明的药物组合物可以根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆剂等经口给予剂、注射剂、外用剂、栓剂、滴眼剂等非经口给予剂等形态进行经口给予或非经口给予。可以优选例示向皮内、肌肉、腹腔等的局部的注射等。
给予量可以根据有效成分的种类、给予途径、给予对象、患者的年龄、体重、性别、症状等条件适当选择,作为病毒的一天给予量,在经口的情况下为1000~1000000000PFU(plaque forming units,空斑形成单位)左右,优选为100000~100000000PFU左右,非经口的情况下为100~1000000000PFU左右,优选为1000~100000000PFU左右。病毒可以每天给予1次,也可以分成数次进行给予。
本发明的重组痘苗病毒可以作为新型流感预防用及治疗用疫苗使用。此外,迄今为止,针对H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的疫苗开发中,是着眼于针对H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的抗体和细胞毒性T细胞(CTL)进行研究。因此,优选预先测定疫苗的抗体效价或细胞免疫活性。
例如,对于制作的重组痘苗病毒(RVV-Flu HA(H5-mCl1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.1)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153))或作为亲株的LC16m8株的抗体效价,可以如下获得:对小鼠接种这些病毒株后,经时回收血清,测定血清的针对H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的ELISA效价,从而获得。就接种了RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)及RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)的小鼠的血清而言,从接种1周后起,可见针对H5N1HPAIV的HA蛋白的抗体效价的上升,就接种了RVV-Flu HA(H1-mIVR153)的小鼠的血清而言,接种2周后起可见针对H1N1(2009)pdm的HA蛋白的抗体效价的上升。
如上所述,本发明人等制作的重组痘苗病毒(总称为“Flu HA-RVVs”)是可以诱导针对新型流感的体液免疫的疫苗。
以下列举实施例更具体地说明本发明。这些实施例是用于进行说明的,对本发明的范围没有限定。
〔实施例1〕
重组痘苗病毒(RVV)的制作
分别将H5N1HPAIV(进化枝1、进化枝2.1、进化枝2.2、进化枝2.3)及H1N1(2009)pdm的各HA蛋白基因重组到pBMSF7C质粒(参照日本特开平6-237773号公报)的SbfI-SgfI位点间,从而制作了在血凝素(HA)基因区域内的ATI·p7.5杂合启动子下游插入了上述各HA蛋白基因的质粒载体pBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3及pBMSF7C-mIVR153(图1)。具体而言,在pBMSF7C-mCl1中插入作为H5N1HPAIV进化枝1的HA蛋白基因的包含序列号12所示的碱基序列的DNA,在pBMSF7C-mCl2.1中插入作为H5N1HPAIV进化枝2.1的HA蛋白基因的包含序列号13所示的碱基序列的DNA,在pBMSF7C-mCl2.2中插入作为H5N1HPAIV进化枝2.2的HA蛋白基因的包含序列号3所示的碱基序列的DNA,在pBMSF7C-mCl2.3中插入作为H5N1HPAIV进化枝2.3的HA蛋白基因的包含序列号14所示的碱基序列的DNA,在pBMSF7C-mIVR153中插入作为H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因的包含序列号15所示的碱基序列的DNA。
在35mm培养皿中播种初代肾培养细胞,达到铺满时,在30℃下以moi=10使痘苗病毒弱毒株LC16m8株感染1小时。予以说明,moi(multiplicityof infection,感染复数)是指每个细胞的PFU(plaque forming units,空斑形成单位)。感染后,抽吸去除病毒溶液,用PBS(-)洗涤细胞。接着,通过5倍稀释的TrypLE/0.5mM EDTA/PBS(-)进行处理,用10%FCS/DMEM培养基抗生素(-)、PBS(-)、HeBS缓冲液洗涤后,将细胞悬浮在HeBS缓冲液600μl中。用HeBS缓冲液分别将各1.5μg的质粒载体pBMSF7C-mCl1、pBMSF7C-mCl2.1、pBMSF7C-mCl2.2、pBMSF7C-mCl2.3及pBMSF7C-mIVR153稀释至总量为30μl,加入细胞悬浮液,混和,在冰上静置10分钟。将加入有质粒载体的细胞悬浮液吸至10μl芯片型金电极上,用电穿孔仪(Invitrogen公司制)进行电穿孔(1200V、脉冲宽度40ms、脉冲次数1次)。电穿孔后,立即添加到用2ml的10%FCS/DMEM培养基抗生素(-)培养基预先播种在35mm培养皿中的RK13细胞或初代肾培养细胞中。将电穿孔2批次添加到35mm培养皿中,在30℃下培养24小时。
培养24小时后,用刮棒从培养皿剥离细胞,回收细胞悬浮液,在冷水中进行超声波处理(30秒×4次)后,离心分离(2000rpm、10分钟)。将其上清作为病毒溶液使用。将病毒溶液稀释到5%FCS/MEM培养基中,在30℃下对播种在150mm培养皿中的初代肾培养细胞感染1小时。抽吸去除病毒溶液后,用PBS(-)洗涤细胞。添加5%FCS/0.5%甲基纤维素/MEM培养基,30℃下培养96小时。培养96小时后,抽吸去除上清,用PBS(-)洗涤。将用PBS(+)稀释的绒猴红细胞溶液添加到150mm培养皿中,在30℃下培养30分钟。抽吸去除红细胞溶液后,用PBS(+)洗涤细胞2次。用自动移液器回收附着了绒猴红细胞的嗜菌斑。对回收的嗜菌斑,利用PCR以及基因测序来确认前述各HA蛋白基因的导入。对确认有基因导入的嗜菌斑,重复进行3次嗜菌斑纯化。
对纯化了3次嗜菌斑的病毒,进行小规模培养。将第3次获得的菌落悬浮在500μl的5%FCS/MEM培养基中,在冷水中进行超声波处理。进行离心分离(2000rpm、10分钟)后,将上清250μl添加到预先播种在60mm培养皿中的初代肾培养细胞中,在30℃下进行1小时感染。感染后,添加2.5ml的5%FCS/MEM培养基,在30℃下培养96小时。96小时后,用刮棒从烧瓶剥离细胞,回收细胞悬浮液。将回收的细胞悬浮液在冷水中进行超声波处理(30秒、4次)后,离心分离,回收其上清作为病毒溶液。所回收的病毒溶液进行连续稀释,添加到预先播种在6孔板中的RK13细胞或初代肾培养细胞,在30℃下进行1小时感染。抽吸去除病毒溶液后,用PBS(-)洗涤细胞2次,然后添加5%FCS/0.5%甲基纤维素/MEM培养基,在30℃下培养96小时。96小时后,对孔中形成的嗜菌斑数进行计数,从而算出滴定度。
以该算出的滴定度为基础进行大规模培养。在10个150mm培养皿中播种RK13细胞或初代肾培养细胞,达到铺满时,在30℃下以moi=0.1使重组痘苗病毒溶液(2ml)感染1小时。感染后,抽吸去除病毒溶液,添加18ml的5%FCS/MEM培养基,在30℃下培养96小时。在96小时后,用刮棒从烧瓶剥离细胞,回收细胞悬浮液,于-80℃冻存。该细胞悬浮液在解冻1次后,在冷水中进行超声波处理(30秒、4次),离心分离,回收其上清作为病毒溶液。将该病毒溶液连续稀释,使其感染预先接种在6孔板中的RK13细胞或初代肾培养细胞,按照与上述同样的方法算出溶液中的病毒滴定度。将算出了滴定度的这些各病毒溶液(重组痘苗病毒)用于以下各实施例所示的各种实验。
〔实施例2〕
利用PCR来确认HA蛋白基因的导入
使用对实施例1所示的各HA蛋白基因(cDNA:序列号12、13、3、14及15)为特异性的以下引物、以获得的重组痘苗病毒的基因组为模板进行PCR,来确认该病毒基因组中是否导入了各HA蛋白基因(图2及3)。
用于确认插入的PCR引物的碱基序列
<F引物>
Fw:Cl2.2-1229-S20
5’-CACTCAGTTTGAGGCCGTTG-3’(序列号7)
(用于确认H5N1HPAIV的HA蛋白基因(4种))
Fw:mIVR153-1889-S20
5’-AATGCGAACTGTTGGTTCT-3’(序列号8)
(用于确认H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因)
<R引物>
Rv:HA-6-R
5’-CTAGTTCTGAGAAACCAGAGG-3’(序列号9)
(用于确认H5N1HPAIV及H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因)
具体而言,反应液组成为:相对于市售的聚合酶所附带的缓冲液50μl,设DNA聚合酶为1U、dNTP为0.3mM、F引物为1μM、R引物为1μM,循环条件为进行25个下述循环:95℃下熔解0.5分钟、58℃下退火0.5分钟、72℃下延伸2分钟。用琼脂糖凝胶对获得的PCR产物进行电泳,确认条带。其结果,若确认到通过引物设计而预先设定的长度的单一条带,则可知在重组病毒基因组中导入了H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因,另一方面,若未确认到该条带则可知未导入H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因。
如图3所示,可知:PCR产物(扩增片段)的1%琼脂糖凝胶电泳的结果是在重组病毒基因组中导入了H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白基因基因。
〔实施例3〕
利用蛋白质印迹法来确认H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白
的表达
使重组痘苗病毒在30℃下以moi=10感染预先接种在6孔板中的RK13细胞1小时。感染后,抽吸去除病毒溶液,用PBS(-)洗涤细胞1次。在各孔中添加2ml的5%FCS/MEM培养基,在30℃培养18小时。18小时后,抽吸去除培养基,用PBS(-)洗涤细胞2次。添加100μl的溶解缓冲液(1%SDS、0.5%NP-40、0.15M NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4))来溶解细胞,将其溶液转移到1.5ml的Eppendorf管中。对所回收的溶液在冷水中进行超声波处理至其没有粘性为止。通过Lowry法对所制备的溶液中的蛋白质含量进行定量。
使用10%聚丙烯酰胺凝胶,对30μg的蛋白质进行电泳。电泳结束后,取出凝胶,用半干转印系统(Semi-dry blotter)以2mA/cm2通电60分钟,使凝胶中的蛋白质转移制PVDF膜。用TBS-T溶液洗涤膜后,添加5%脱脂乳-TBS-T溶液进行封闭。封闭结束后,用TBS-T溶液洗涤膜3次。一抗使用的是抗H5N1HPAIV的HA蛋白来源的HA肽(a.a.198-217(序列号10;NDAAEQTKLYQNPTTYISVG))或H1N1(2009)pdm的HA蛋白来源的HA肽(a.a.223-234(序列号11;YSKKFKPEIAIR))的兔多克隆抗体。与一抗的反应结束后,用TBS-T溶液洗涤膜3次。二抗使用的是抗兔IgG-linkedHRPO(来自驴、Amersham公司制)。与二抗的反应结束后,再次用TBS-T溶液洗涤膜3次,将Immobilon western检测用试剂(Millipore公司制)添加到膜上,用CCD相机读取荧光,进行图像解析。
其结果如图4所示,可知RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)的重组病毒基因组表达了H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白。
〔实施例4〕
对小鼠接种重组痘苗病毒的实验(图5)
图5为表示重组痘苗病毒(Flu HA-RVVs)的体液免疫诱导能力的确认方法的图。
将实施例1所获得的重组痘苗病毒或插入了空载体的RVV-空,以1×107PFU经内皮接种(皮内接种(i.d.))于BALB/c小鼠(雌)后,在1、2、3及4周后,由眼窝静脉进行采血。将采集的血液全部放入加入了血清分离剂的0.5ml管中,离心分离(15000rpm、10分钟),对血清进行分离回收。血清在进行后述ELISA试验之前均冻存在-80℃。
〔实施例5〕
利用ELISA法测定用重组痘苗病毒(Flu HA-RVVs)免疫后的小鼠血清
中的抗H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白抗体的效价
对96孔板,预先包被H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白,将冻结的血清样品稀释至100~1000倍后添加至板中,在4度下静置一晚。用TBS-T溶液洗涤96孔板后,在96孔板中添加抗小鼠IgG-linked HRPO(来自绵羊、Amersham公司制)作为二抗。在室温下反应2小时后,再次用TBS-T溶液洗涤96孔板3次。添加100μl/孔的显色液。在室温下静置30分钟后,添加50μl/孔的2M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定490nm的吸光度。
其结果如图6及7所示,确认接种了RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-FluHA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)的小鼠血清中以高抗体效价诱导了抗H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm的HA蛋白的抗体。
〔实施例6〕
重组痘苗病毒(RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及
RVV-Flu HA(H1-mIVR153))对新型流感的预防效果的研究
如图8所示,为了确认接种RVV-Flu HA(H1-mIVR153)所产生的免疫诱导效果,对于接种了这些重组痘苗病毒(疫苗)的小鼠,在疫苗接种起5周后,经鼻攻击感染H1N1(2009)pdm。逐日测定体重变化,在感染起9天后剖检,进行肺部病理解析。可知:未接种疫苗的小鼠,确认到在流感病毒感染后体重逐日减轻,9天后降低约20%;而疫苗接种组,虽然在H1N1(2009)pdm感染后的初期可见体重一过性的减轻,但此后体重迅速增加并恢复至正常值附近。
此外可知:肺病理组织的解析表明,未接种疫苗的小鼠,由于感染H1N1(2009)pdm,肺表现出间质细胞的肥厚化、粘液的渗出、作为免疫活性细胞的淋巴细胞浸润致使局部的肺胞空间被充满的肺炎像,与此相对,疫苗接种组中虽然在感染部位即支气管周围可见显著的淋巴细胞浸润,但肺泡腔得到维持,肺炎显著减轻(图9)。
另一方面,对单次接种了RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)或RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)的小鼠,在接种这些重组痘苗病毒(疫苗)起5周后,使H5N1HPAIV的进化枝2.3攻击感染,研究疫苗效果。攻击感染以1×104PFU及1×105PFU这2个浓度进行。对于1×104PFU及1×105PFU中任一攻击感染,RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)或RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)接种组的生存率均为100%,体重变化方面,在流感病毒感染3天后体重逐渐增加,恢复至与感染前几乎相同的体重。进而,高浓度侧即1×105PFU的攻击感染时的肺病理组织的解析的结果是:未接种疫苗的小鼠由于H5N1病毒感染,生存个体的肺中也可见间质细胞的肥厚化,与此相对,RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)或RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)接种组中,虽在作为感染部位的支气管周围、血管周围观察到显著的淋巴细胞浸润和间质部分的局部肥厚化,但肺泡腔比较整洁、得以维持,肺炎显著减轻。因此即使对显示致死性的H5N1HPAIV感染,此次制作的重组痘苗病毒(疫苗)也显示出感染防御效果。此外,进化枝不同的进化枝2.2的疫苗接种组对进化枝2.3的病毒感染也显示出充分的疫苗效果。
作为新型流感重组痘苗病毒,使用了表达血凝素(HA)蛋白质的RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)(图1)。为了评价这些Flu HA-RVVs的效果,以1×107PFU单次皮内接种RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)或RVV-Flu HA(H1-mIVR153),在接种起5周后经鼻感染H5N1HPAIV或H1N1(2009)pdm,此后逐日测定体重变化,在感染起9天后采集肺组织(图8~11),进行肺病理组织解析(图9及11)。
就RVV-Flu HA(H5-mCl2.2)、RVV-Flu HA(H5-mCl2.3)及RVV-Flu HA(H1-mIVR153)接种组而言,对于各流感病毒的攻击感染,均确认到体重减轻的抑制及肺炎减轻效果(图8~11)。
因此表明,本发明的痘苗病毒具有新型流感的预防及治疗效果,作为新型流感疫苗是有用的。
产业上的可利用性
根据本发明,可以提供对新型流感的预防或治疗有效且安全性高的新型重组痘苗病毒、及含有其的新型流感用预防药或治疗药(新型流感的预防或治疗用疫苗)。
序列表自由文本
序列号7:合成DNA
序列号8:合成DNA
序列号9:合成DNA
序列号12:重组DNA
序列号13:重组DNA
序列号14:重组DNA
序列号15:重组DNA