WO2012050229A1 - 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス - Google Patents

新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス Download PDF

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vaccinia virus
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小原道法
安井文彦
村上利夫
喜田宏
迫田義博
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財団法人東京都医学総合研究所
一般財団法人化学及血清療法研究所
国立大学法人北海道大学
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    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to preventive and therapeutic agents for H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (H5N1 HPAIV) infection and H1N1 pandemic influenza virus (H1N1 (2009) pd) infection, which are the causes of the development of new influenza.
  • the present invention relates to a recombinant vaccinia virus capable of expressing the hemagglutinin (HA) protein gene of H5N1 HPAIV and H1N1 (2009) pdm, and a preventive and therapeutic agent for new influenza containing the recombinant vaccinia virus.
  • H5N1 highly pathogenic avian influenza virus H5N1 HPAIV was first reported in 1997, after which the number of infected persons spread mainly in China, Southeast Asia and the Middle East. So far, 296 people, about 60%, have died, despite the fact that 500 people have been transferred to hospitals and received intensive care.
  • a vaccine for H5N1 HPAIV a pre-pandemic vaccine prepared by predicting the epidemic strain is infected with 4 clades (clade 1, 2.1, 2.2, 2.3) using hatched chicken eggs. ⁇ Stocked as a whole particle inactivated virus vaccine of the propagated virus.
  • H5N1 HPAIV infection of embryonated chicken eggs has problems such as high lethality and difficulty in large-scale preparation due to low virus yield. Moreover, since the storage period is 3 years, the period has been sequentially exceeded from those manufactured in FY2006. In 2009, due to the global pandemic of H1N1 (2009) pdm, no prepandemic vaccine for H5N1 was manufactured. Moreover, since it is a vaccine produced by predicting epidemic strains, there are many unclear points as to whether or not the vaccine effect can be exerted against strains that are actually epidemic.
  • H1N1 pandemic influenza virus (H1N1 (2009) pdm), which is thought to have originated in Mexico in April 2009, is significantly different in antigenicity from conventional seasonal influenza viruses and has no immunity Because there were many, the infection spread rapidly to the whole world.
  • the vaccine for H1N1 (2009) pdm is an inactivated split vaccine manufactured by the same method as the seasonal influenza vaccine. Since this split vaccine is also an inactivated vaccine, it is not always possible to exert a vaccine effect against epidemic strains.
  • Tamiflu and Relenza that inhibits the action of neuraminidase (NA), which is important for influenza virus budding, there are limited effects such as medication within 48 hours after onset. ing.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a therapeutic agent and a preventive agent containing a recombinant vaccinia virus effective in preventing the onset due to a new influenza virus infection containing H5N1 HPAIV and H1N1 (2009) pdm. .
  • a preventive agent containing a recombinant vaccinia virus effective in preventing the onset due to a new influenza virus infection containing H5N1 HPAIV and H1N1 (2009) pdm.
  • the present inventors have found that it is possible to bring about strong activation of immunity using a recombinant vaccinia vaccine. We thought that it would lead to influenza virus infection prevention method.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies so far in order to solve the above problems.
  • the inventors succeeded in producing a recombinant vaccinia virus effective in preventing the onset of infection with H5N1 HPAIV and H1N1 (2009) pdm.
  • the recombinant vaccinia virus for H5N1 HPAIV can be protected against attack infection by different strains of clade by single inoculation, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • H5N1 HPAIV highly pathogenic avian influenza virus
  • H1N1 pandemic influenza virus H1N1 (2009) pdm
  • H5N1 highly pathogenic avian influenza virus for example, virus strains belonging to H5 subtype, specifically H5 subtype clade 1, H5 subtype clade 2.1, H5 subtype clade 2.2 or H5 subtype Virus strains belonging to Clade 2.3 are mentioned, and examples of H1N1 pandemic influenza viruses include virus strains belonging to H1 subtype.
  • examples of the cDNA encoding the HA protein include the following DNAs (a) to (j).
  • A DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (H5 subtype clade 1; Vietnamese strain sequence)
  • B DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes the HA protein of a virus strain belonging to H5 subtype clade 1
  • C DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (H5 subtype clade 2.1; sequence of Indonesian strain)
  • D DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes the HA protein of a virus strain belonging to H5 subtype clade 2.1
  • E DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (H5 subtype clade 2.2; sequence of vaccine strain of Aomi strain)
  • F DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and encodes the
  • hybrid promoter examples include those consisting of the following DNA (a) or (b).
  • a pharmaceutical composition comprising the recombinant vaccinia virus of (1) above.
  • the pharmaceutical composition can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for new influenza, specifically as a prophylactic and / or therapeutic agent for H5N1 highly pathogenic avian influenza or H1N1 pandemic influenza.
  • FIG. 1 is a diagram showing the gene structure of a plasmid for the production of a recombinant vaccinia virus having a new influenza virus HA protein gene.
  • influenza HA represents the HA protein gene (cDNA: SEQ ID NOs: 12, 13, 3, 14, and 15) of each new influenza virus
  • H5 subtype represents H5N1 HPIV, “H1 subtype”.
  • Type represents H1N1 (2009) pdm (the same applies to other figures).
  • FIG. 2 is a diagram showing the positions and names of primers used for confirming introduction of the HA protein gene by PCR.
  • FIG. 3 is a photograph of agarose gel electrophoresis showing the results of confirmation of introduction of the HA protein gene by PCR.
  • FIG. 4 is a photograph of a PVDF membrane showing the results of confirming the expression of HA protein by Western blotting.
  • FIG. 5 is a diagram showing a method for confirming the ability to induce humoral immunity of a recombinant vaccinia virus having the HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the effect (antibody titer) of humoral immunity inducing ability as a vaccine of a recombinant vaccinia virus having an HA protein gene derived from H1N1 (2009) pdm by ELISA.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the effect of humoral immunity induction ability (antibody titer) as a vaccine of a recombinant vaccinia virus having an H5N1 HPAIV-derived HA protein gene by the ELISA method.
  • “RVV-mCl2.2” and “RVV-mCl2.3” are “RVV-Flu HA (H5-mCl2.2)” and “RVV-Flu HA (H5-mCl2.3)”, respectively.
  • “1 + E05”, “1 + E06”, and “1 + E07” indicate “1 ⁇ 10 5 PFU”, “1 ⁇ 10 6 PFU”, and “1 ⁇ 10 7 PFU”, respectively.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in body weight due to H1N1 (2009) pd challenge infection in BALB / c mice once vaccinated with a recombinant vaccinia virus having a HA protein gene derived from H1N1 (2009) pdm as a vaccine.
  • FIG. 9 is a diagram showing a pulmonary histopathological analysis 9 days after the H1N1 (2009) pd challenge infection to BALB / c mice once vaccinated with a recombinant vaccinia virus having a HA protein gene derived from H1N1 (2009) pdm as a vaccine. It is.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in body weight due to H5N1 HPAIV challenge infection in BALB / c mice that were once vaccinated with a recombinant vaccinia virus having a HA protein gene derived from H5N1 HPAIV as a vaccine.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in body weight due to H5N1 HPAIV challenge infection in BALB / c mice that were once vaccinated with a recombinant vaccinia virus having a HA protein gene derived from H5N1 HPAIV as a vaccine.
  • FIG. 11 is a diagram showing a pulmonary histopathological analysis 9 days after the H5N1 HPAIV challenge infection to BALB / c mice once vaccinated with a recombinant vaccinia virus having a HA protein gene derived from H5N1 HPAIV as a vaccine.
  • a recombinant vaccinia virus having a HA protein gene derived from H5N1 HPAIV as a vaccine.
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.2
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.3
  • a genetic engineering technique of producing a recombinant vaccinia virus (RVV) as a live vaccine is known.
  • the recombinant vaccinia virus for rabies virus or Lindapes developed by the present inventors has been demonstrated to exhibit an excellent infection prevention effect in field tests and the like (for example, Tsukiyama K. et. al., Arch.Virol., 1989, vol.107, p.225-235).
  • vaccinia virus having SARS-CoV cDNA known as a pathogen for the new type of pneumonia SARS (WO 2006/038742), and have an excellent preventive effect and re-administration.
  • a vaccinia virus that is a recombinant parent used for the production of RVV needs to be a vaccine strain with established safety.
  • vaccinia virus LC16m8 strain for example, clinical and viral, vol. .3, No. 3, p.269, 1975).
  • the LC16m8 strain has been isolated from the Lister strain, and has actually been administered as a preventive vaccine, has been confirmed to be safe and effective, and is the only vaccine strain currently produced.
  • the present inventors use a gene expression promoter that can greatly enhance the ability to produce antibodies and induce cellular immunity in the course of studying the development of recombinant vaccinia viruses against Lindapesto, HIV, SARS-CoV, etc. Was found to be effective against the vaccinia virus of the present invention.
  • pSFJ1-10 or pSFJ2-16 as a plasmid vector (for example, Jin NY et al., Arch. Virol., 1994, vol. 138, p. 315-330).
  • H5N1 HPAIV highly pathogenic avian influenza virus
  • H1N1 pandemic influenza virus H1N1 (2009) pdm
  • a recombinant vaccinia virus expressing a HA protein derived from H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm has been successfully produced.
  • the virus serving as the parent of the recombinant vaccinia virus according to the present invention is vaccinia virus as described above.
  • the recombinant vaccinia virus of the present invention is a cDNA in which the H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm HA protein (all or a part of the cDNA) is incorporated in its genome.
  • CDNAs encoding the HA protein of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm were used as expression units, respectively, and introduced into vaccinia virus vectors.
  • This expression unit was introduced into the HA gene region of vaccinia virus LC16m8 strain. It is already known that introduction of a foreign gene into the HA gene region does not affect the growth activity of vaccinia virus, so that a safe vaccine strain with weak growth ability can be used as a recombinant maternal virus (Vaccine). , Vol.12, p.675-681, 1994).
  • Recombinant vaccinia live vaccines have been tested in the field against rabies virus and Linda virus, and their superior infection prevention effect has been proven.
  • the present inventor inserted the H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pd HA protein gene downstream of the hybrid promoter, and incorporated these genes into the HA protein gene region of the attenuated vaccinia virus strain LC16m8, thereby producing a recombinant vaccinia virus (RVV). ) was produced.
  • the hybrid promoter is composed of a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and a multi-repeating vaccinia virus 7.5 kDa protein (p7.5) early expression promoter (Jin NY et al., Arch. Virol.,).
  • HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm is already available from the GenBank database (http: //www.ncbi.nlm. genbank /) is registered with a predetermined accession number (Accession No.).
  • a gene encoding a HA protein derived from H5N1 HPAIV clade 1 (virus strain belonging to H5 subtype clade 1) (cDNA: SEQ ID NO: 1) is registered in GenBank accession number: EF541040, and GenBank accession number: In EF541394, a gene (cDNA: SEQ ID NO: 2) encoding an HA protein derived from H5N1 HPIV clade 2.1 (a virus strain belonging to H5 subtype clade 2.1) was registered, and GenBank accession number: DQ371719 was registered.
  • a gene (cDNA: SEQ ID NO: 5) encoding an HA protein derived from H1N1 (2009) pdm (a virus strain belonging to H1 subtype) is registered in GenBank accession number: FJ969540.
  • a gene (cDNA) encoding the HA protein contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention in addition to the above genes, a part thereof or a mutant sequence thereof can be used.
  • the gene (cDNA) encoding the H5N1 HPAIV clade 1 HA protein may be a DNA in which a part of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is deleted (specifically, it is shown in SEQ ID NO: 12).
  • DNA encoding the HA protein of clade 2.1 of H5N1 HPAIV) and DNA lacking a part of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (specifically A DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 13), and a gene (cDNA) encoding the HA protein of clade 2.3 of H5N1 HPAIV is a part of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 Is used (specifically, a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 14) Door can be.
  • a gene (cDNA) encoding the HA protein of H1N1 (2009) pdm a DNA obtained by mutating (substituting) a part of the base of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (specifically, , DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15).
  • a gene (cDNA: sequence) in which a part of the gene (cDNA) is deleted Number 3) is registered in GenBank accession number: DQ659327.
  • HA protein genes (including partially deleted and mutated genes) have already been cloned and inserted into plasmids. Therefore, the gene contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention, that is, the entire cDNA (including the mutant sequence) encoding the HA protein of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pd, or a part thereof, is a normal genetic engineering technique. Can be obtained. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a genetic engineering technique can be used.
  • It can be prepared according to the site-specific displacement induction method. Specifically, it can be prepared using a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis by a known method such as the Kunkel method or Gapped duplex method, and examples of the kit include QuickChange.
  • TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Preferred examples include Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • the HA protein gene of H5N1 HPAIV or the HA protein gene of H1N1 (2009) pdm inserted in the plasmid can be used as the PCR template.
  • the H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm HA protein gene cDNA is used as a template, and PCR is performed using each gene-specific primer to prepare the H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm HA protein gene region. can do.
  • the gene encoded by the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is designated as “mCl1” as the gene encoding the HA protein derived from H5N1 HPAIV clade 1 (virus strain belonging to H5 subtype clade 1).
  • the gene encoded by the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is “ It is called “mCl2.1” and is encoded by DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a gene encoding HA protein derived from clade 2.2 of H5N1 HPIV (a virus strain belonging to H5 subtype clade 2.2).
  • This gene is called “mCl2.2” and H5N1 HPAIV
  • mCl2.3 As a gene encoding HA protein derived from Clade 2.3 (virus strain belonging to H5 subtype clade 2.3), the gene encoded by the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 is referred to as “mCl2.3”.
  • mIVR153 As a gene encoding the HA protein derived from H1N1 (2009) pdm (virus strain belonging to H1 subtype), the gene encoded by the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 is referred to as “mIVR153”.
  • DNA in addition to the DNA consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 and 12 to 15, the following DNAs are also included in the respective HA protein genes (for example, mCl1, mCl2.1, mCl2.2, mCl2. 3 and mIVR153 etc.).
  • a DNA (mutant DNA) that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes an HA protein derived from H5N1 HPA IV clade 1.
  • DNA that hybridizes with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 under stringent conditions and encodes HA protein derived from H5N1 HPA Clade 2.1 (mutation of mCl2.1) Type DNA).
  • Each of the above mutant DNAs can be obtained by chemical synthesis, or colony hybridization or plaque hybridization using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 5 and 12 to 15 or fragments thereof as probes. It can also be obtained from a cDNA library and a genomic library by a known hybridization method such as Southern blot.
  • Examples of stringent conditions in the above hybridization include 0.1 ⁇ SSC to 10 ⁇ SSC, 0.1% to 1.0% SDS, and 20 ° C. to 80 ° C., and more specifically, An example is a condition in which pre-hybridization is performed at 37 ° C. to 56 ° C. for 30 minutes or more and then washing is performed 1 to 3 times in 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS at room temperature for 10 to 20 minutes.
  • Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)) and the like can be referred to.
  • DNA (mutant DNA) having the above homology and encoding HA protein derived from H5N1 HPA Clade 2.3, the base sequence shown in SEQ ID NO: 14, 50% or more, 60% or more, 70% or more 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more of homology and a DNA encoding HA protein derived from H5N1 HPA Clade 2.3 (mutation of mCl2.3) Type DNA), 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5,
  • DNA (mutant DNA) encoding HA protein derived from H1N1 (2009) pdm, the base sequence
  • the expression promoter contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention is inserted into the hemagglutinin (HA) gene region of the vaccinia virus, and includes a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and a replicant vaccinia virus. It is a hybrid promoter composed of a 5 kDa protein (p7.5) early expression promoter. This promoter can be ligated to an appropriate plasmid, for example, pBMSF7C is known (Arch. Virol. Vol. 138, p. 315-330, 1994; see JP-A-6-237773). The base sequence of a hybrid promoter that can be used in the present invention is shown in SEQ ID NO: 6.
  • a promoter DNA having activity can also be used as an expression promoter (particularly a hybrid promoter).
  • Stringent conditions are the same as described above.
  • Having promoter activity means having the transcriptional activity of a gene encoding a structural protein or a nonstructural protein.
  • the protein expressed by this hybrid promoter can be expressed in a large amount in the form of complete sugar modification from the early stage to the late stage of vaccinia virus infection.
  • plasmid vectors in which the HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm is inserted downstream of the promoter of pBMSF7C are pBMSF7C-mCl1, pBMSF7C-mCl2.1, pBMSF7C-mCl2.2, pBMSF7C-mCl2.3, It is called pBMSF7C-mIVR153.
  • a recombinant vaccinia virus can be produced by introducing these plasmid vectors into a host vaccinia virus. Any known method can be employed for introducing the plasmid vector into the host.
  • plasmid vectors pBMSF7C-mCl1, pBMSF7C-mCl2.1, pBMSF7C-mCl2,... are introduced into animal cells infected with attenuated vaccinia virus strain LC16m8. 2.
  • pBMSF7C-mCl2.3 and pBMSF7C-mIVR153 respectively homologous recombination is caused in the hemagglutinin (HA) gene region of vaccinia virus, and the HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm is expressed, respectively.
  • HA hemagglutinin
  • Recombinant vaccinia viruses (RVV-Flu HA (H5-mCl1), RVV-Flu HA (H5-mCl2.1), RVV-Flu HA (H5-mCl2.2), RVV-Fl u HA (H5-mCl 2.3) and RVV-Flu HA (H1-mIVR 153)) can be made.
  • the vaccinia virus LC16m8 strain used for the production of RVV is an attenuated strain that can grow in individual animals but has extremely low proliferation in neurons.
  • H1-mIVR153 RVV-Flu HA (H1-mIVR153)
  • the HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm is inserted into the HA protein gene region of vaccinia virus.
  • Lack. HA protein derived from influenza virus exhibits an agglutination reaction on guinea pig erythrocytes, whereas HA protein derived from vaccinia virus does not cause an agglutination reaction on guinea pig erythrocytes.
  • RVV-Flu HA H5-mCl1
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.1
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.2
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.3
  • RVV- An animal cell is infected with Flu HA (H1-mIVR153), and RVV screening is performed using the aggregation reaction of guinea pig erythrocytes on the plaque formed thereby as an index.
  • the target RVV may be selected from red plaques having hemagglutination activity.
  • the expression of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pd HA protein is RVV-Flu HA (H5-mCl1), RVV-Flu HA (H5-mCl2.1), RVV-Flu HA (H5-mCl2.2), RVV.
  • the antibody may be an HA peptide derived from the HA protein of H5N1 HPAIV (aa 198-217 (SEQ ID NO: 10) or the like) or an HA peptide derived from the HA protein of H1N1 (2009) pdm (aa 223- Rabbit antiserum prepared by immunizing 234 (SEQ ID NO: 11) or the like can be used.
  • the thymidine kinase (TK) gene region is generally used as the insertion site of the target gene other than the HA protein gene region.
  • TK thymidine kinase
  • composition for prevention and treatment of new influenza provides a preventive agent and a therapeutic agent (preventive and therapeutic pharmaceutical composition) for a novel influenza (ie, H5N1 highly pathogenic avian influenza and H1N1 pandemic influenza), comprising the above recombinant vaccinia virus.
  • a novel influenza ie, H5N1 highly pathogenic avian influenza and H1N1 pandemic influenza
  • the present invention also provides a method for preventing and treating the above-mentioned new influenza, including the administration of the above-mentioned recombinant vaccinia virus to a patient (subject), use of the above-mentioned recombinant vaccinia virus for the prevention and treatment of the above-mentioned novel influenza,
  • the use of the above recombinant vaccinia virus for producing the above-mentioned novel influenza preventive and therapeutic agents can be provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be introduced into a living body by any known method, for example, intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous injection, inhalation from the nasal cavity, oral cavity or lung, or oral administration.
  • a recombinant vaccinia virus contained in the pharmaceutical composition of the present invention in combination with an existing antiviral drug (eg, Tamiflu, Relenza).
  • an existing antiviral drug eg, Tamiflu, Relenza
  • the mode of combined use is not particularly limited, and the recombinant vaccinia virus of the present invention and an existing antiviral agent can be administered simultaneously, and after administration of one, a method of administering the other after a certain period of time has elapsed. Can also be introduced into the living body.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises known pharmaceutically acceptable carriers such as excipients, extenders, binders, lubricants, buffers, tonicity agents, chelating agents, coloring agents, preservatives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, syrups and other oral administration agents, injections, external preparations, suppositories, ophthalmic preparations and the like. Depending on the form, it can be administered orally or parenterally. Preferable examples include intradermal, intramuscular, abdominal injection and the like.
  • the dosage is appropriately selected according to the type of active ingredient, administration route, administration subject, patient age, weight, sex, symptom and other conditions.
  • the daily dose of virus is 1000 to 1,000,000,000 PFU for oral administration. In the case of parenteral, it is about 100 to 1,000,000 PFU, preferably about 1,000 to 100,000,000 PFU.
  • the virus can be administered once a day or in several divided doses.
  • the recombinant vaccinia virus of the present invention is used as a vaccine for preventing and treating new influenza.
  • studies focusing on antibodies against H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm and cytotoxic T cells (CTL) have been conducted. Therefore, it is preferable to previously measure the antibody titer or cellular immune activity as a vaccine.
  • the prepared recombinant vaccinia viruses RVV-Flu HA (H5-mCl1), RVV-Flu HA (H5-mCl2.1), RVV-Flu HA (H5-mCl2.2), RVV-Flu HA (H5- The antibody titer against mCl2.3) and RVV-Flu HA (H1-mIVR153)
  • the parental strain LC16m8 was obtained by inoculating mice with these virus strains, and collecting serum over time to obtain serum H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) It can be obtained by measuring the ELISA titer for pd HA protein gene.
  • vaccinia virus (RVV) H5N1 HPAIV (clade 1, clade 2.1, clade 2.2, clade 2.3) between SbfI and SgfI sites of pBMSF7C plasmid (see JP-A-6-237773)
  • DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is inserted into pBMSF7C-mCl1 as the HA protein gene of H5N1 HPAIV clade 1
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 is inserted into pBMSF7C-mCl2.1.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is inserted into pBMSF7C-mCl2.2 as the HA protein gene of H5N1 HPAIV clade 2.2.
  • PBMSF7C-mCl2.3 has a DNA sequence comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 inserted as the H5N1 HPAIV clade 2.3 HA protein gene, and pBMSF7C-mIVR153 has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 Is inserted as the HA protein gene of H1N1 (2009) pdm.
  • moi multiplicity of infection
  • moi multiplicity of infection
  • the virus solution was removed by aspiration, and the cells were washed with PBS ( ⁇ ). Subsequently, the cells were treated with 5-fold diluted TrypLE / 0.5 mM EDTA / PBS ( ⁇ ), washed with 10% FCS / DMEM medium antibiotic ( ⁇ ), PBS ( ⁇ ), HeBS buffer, and the cells were suspended in 600 ⁇ l of HeBS buffer. It became cloudy.
  • FCS / DMEM medium was added to RK13 cells or primary kidney cultured cells previously seeded in a 35 mm dish with 2 ml of antibiotic ( ⁇ ) medium. Two portions of electroporation were added to a 35 mm dish and cultured at 30 ° C. for 24 hours. After culturing for 24 hours, the cells were peeled off from the dish using a scraper, the cell suspension was collected, subjected to sonication (30 sec ⁇ 4 times) in cold water, and then centrifuged (2000 rpm, 10 min). The supernatant was used as a virus solution.
  • the virus solution was diluted in 5% FCS / MEM medium and infected with primary kidney cultured cells that had been seeded in a 150 mm dish at 30 ° C. for 1 hour. After removing the virus solution by suction, the cells were washed with PBS ( ⁇ ). 5% FCS / 0.5% methylcellulose / MEM medium was added and cultured at 30 ° C. for 96 hours. After 96 hours of culture, the supernatant was removed by aspiration and washed with PBS ( ⁇ ). A guinea pig erythrocyte solution diluted with PBS (+) was added to a 150 mm dish and cultured at 30 ° C. for 30 min.
  • Plaques adsorbed with guinea pig erythrocytes were collected using a Pipetman. About the collected plaques, introduction of each HA protein gene was confirmed by PCR and determination of gene sequence. Plaque purification was repeated three times for the plaques that were confirmed to have been transfected. Small scale cultures were performed on the virus purified plaque three times. The third colony was suspended in 500 ⁇ l of 5% FCS / MEM medium and sonicated in cold water.
  • the recovered virus solution was serially diluted and added to RK13 cells or primary kidney cultured cells that had been seeded in a 6-well plate, and infected at 30 ° C. for 1 hour. After removing the virus solution by suction, the cells were washed twice with PBS ( ⁇ ), 5% FCS / 0.5% methylcellulose / MEM medium was added, and the mixture was cultured at 30 ° C. for 96 hours. After 96 hours, titer was calculated by counting the number of plaques formed in the well. Large-scale culture was performed based on the calculated titer.
  • This cell suspension was freeze-thawed once, then sonicated in cold water (30 sec, 4 times), centrifuged, and the supernatant was recovered as a virus solution.
  • This virus solution was serially diluted and infected with RK13 cells or primary kidney cultured cells that had been seeded in a 6-well plate, and virus titer in the solution was calculated by the same method as described above.
  • Each virus solution (recombinant vaccinia virus) for which titer was calculated was used in various experiments shown in the following examples.
  • Base sequence of insert confirmation PCR primer ⁇ F primer> (For confirmation of HA protein genes (4 types) of H5N1 HPAIV) (For HA protein gene confirmation of H1N1 (2009) pdm)
  • R primer> (For HA protein gene confirmation of H5N1 HPAIV and H1N1 (2009) pdm)
  • the composition of the reaction solution was DNA polymerase 1U, dNTP 0.3 mM, F primer 1 ⁇ M, R primer 1 ⁇ M with respect to 50 ⁇ l of the buffer solution attached to the commercially available polymerase, and the cycle conditions were: A total of 25 cycles of 5 minutes, annealing for 0.5 minutes at 58 ° C., and elongation for 2 minutes at 72 ° C.
  • the obtained PCR product was electrophoresed using an agarose gel, and the band was confirmed.
  • the HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm is introduced into the recombinant virus genome, If this band is not recognized, it will be understood that the HA protein gene of H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pdm has not been introduced. As shown in FIG.
  • lysis buffer 1% SDS, 0.5% NP-40, 0.15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)
  • the collected solution was sonicated in cold water until it became viscous.
  • the amount of protein in the prepared solution was quantified by the Lowry method.
  • Electrophoresis was performed on 30 ⁇ g protein using a 10% acrylamide gel. After the completion of electrophoresis, the gel was taken out and energized at 2 mA / cm 2 for 60 minutes using a Semi-dry blotter to transfer the protein in the gel to a PVDF membrane.
  • the primary antibody is an HA peptide derived from the H5N1 HPAIV HA protein (aa 198-217 (SEQ ID NO: 10; NDAAEQTKLYQNPTYTYVG)) or an HA peptide derived from the H1N1 (2009) pd HA protein (aa 223-234).
  • a rabbit polyclonal antibody against (SEQ ID NO: 11; YSKKKFPEIAIR) was used.
  • the membrane was washed 3 times with a TBS-T solution.
  • Anti-rabbit IgG-linked HRPO from Donkey, Amersham
  • the membrane was washed again three times with the TBS-T solution, Immobilon Western detection reagent (Millipore) was added to the membrane, fluorescence was captured with a CCD camera, and image analysis was performed. As a result, as shown in FIG.
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.2
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.3
  • RVV-Flu HA H1-mIVR153
  • FIG. 5 is a diagram showing a method for confirming the ability to induce humoral immunity of recombinant vaccinia virus (Flu HA-RVVs).
  • transendothelial inoculation intradermal inoculation (id)
  • BALB / c mice female
  • RVV-Empty inserted with the recombinant vaccinia virus or empty vector obtained in Example 1 at 1 ⁇ 10 7 PFU 1, 2, 3 and 4 weeks later
  • blood was collected from the orbital vein.
  • All the collected blood was collected in a 0.5 ml tube containing a serum separating agent, and centrifuged (15000 rpm, 10 minutes) to separate and collect the serum.
  • the serum was stored frozen at ⁇ 80 ° C. until the ELISA test described below was performed.
  • Flu HA-RVVs recombinant vaccinia virus
  • H5N1 HPAIV or H1N1 (2009) pd HA A serum sample coated with protein and frozen was diluted 100 to 1000 times and added, and allowed to stand overnight at 4 degrees. After the 96-well plate was washed with the TBS-T solution, anti-mouse IgG-linked HRPO (from Sheep, manufactured by Amersham) was added as a secondary antibody to the 96-well plate.
  • mice that had been inoculated once with RVV-Flu HA (H5-mCl2.2) or RVV-Flu HA (H5-mCl2.3) were treated with H5N1 five weeks after inoculation with these recombinant vaccinia viruses (vaccines). HPAIV clade 2.3 was challenged and the vaccine effect was examined.
  • Challenge infection was performed at two concentrations, 1 ⁇ 10 4 PFU and 1 ⁇ 10 5 PFU.
  • the survival rate was 100 in the RVV-Flu HA (H5-mCl2.2) or RVV-Flu HA (H5-mCl2.3) inoculated groups.
  • the change in body weight also increased from 3 days after the influenza virus infection and recovered to almost the same body weight as before the infection.
  • the lung pathological tissue in the aggressive infection of 1 ⁇ 10 5 PFU on the high concentration side was analyzed, the stromal stroma was also detected in the lungs of the surviving individuals due to the H5N1 virus infection in the non-vaccinated mice.
  • New influenza recombinant vaccinia viruses include hemagglutinin (HA) protein expressing RVV-Flu HA (H5-mCl2.2), RVV-Flu HA (H5-mCl2.3) and RVV-Flu HA (H1-mIVR153) was used (FIG. 1).
  • HA hemagglutinin
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.2
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.3
  • RVV-Flu HA H1-mIVR153
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.2
  • RVV-Flu HA H5-mCl2.3
  • RVV-Flu HA H1-mIVR153
  • a novel recombinant vaccinia virus that is effective in preventing or treating new influenza and having high safety, and a preventive or therapeutic agent for new influenza containing the same (a vaccine for preventing or treating new influenza) ) Can be provided.
  • SEQ ID NO: 7 synthetic DNA Sequence number 8: Synthetic DNA SEQ ID NO: 9: synthetic DNA SEQ ID NO: 12: recombinant DNA SEQ ID NO: 13: recombinant DNA SEQ ID NO: 14: recombinant DNA SEQ ID NO: 15: recombinant DNA

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Abstract

　新型インフルエンザウイルス感染による発症の防止に有効性があり安全性の高い組換えワクシニアウイルス、及びこれを含む新型インフルエンザウイルス用ワクチンを提供する。本発明にかかる組換えワクシニアウイルスは、新型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質遺伝子を発現することができる。本発明にかかる新型インフルエンザウイルスワクチンは、当該組換えワクシニアウイルスを含むものである。

Description

新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス
　本発明は、新型インフルエンザの発症原因であるＨ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ）感染及びＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ）感染の予防薬及び治療薬に関する。詳しくは、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ及びＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質遺伝子を発現することができる組換えワクシニアウイルス、ならびに当該組換えワクシニアウイルスを含む新型インフルエンザ用の予防薬及び治療薬に関する。
　Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ）は、１９９７年に最初の感染患者が報告され、その後中国、東南アジア、中近東地域を中心に感染者が拡大した。これまでに、５００人が病院に搬送され、高度集中治療を受けたにもかかわらず、約６０％にあたる２９６人が死亡した。現在、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ用ワクチンとしては、その流行株を予測して作製されたプレパンデミックワクチンが４つのクレード（クレード１、２．１、２．２、２．３）について、孵化鶏卵を用いて感染・増殖させたウイルスの全粒子不活化ウイルスワクチンとして、備蓄されている。しかし、孵化鶏卵へのＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ感染は、致死性が高く、ウイルス収量が低いために大量調製が困難であるなどの問題点がある。また、保存期限が３年であることから、２００６年度に製造されたものから順次その期限を超過してきている。２００９年度は、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍの世界的な大流行の影響により、Ｈ５Ｎ１用プレパンデミックワクチンの製造は行われていない。しかも、あくまで流行株を予測して作製されるワクチンであるため、実際に流行する株に対してワクチン効果を発揮できるか否かについては不明な点も多い。
　一方、２００９年４月にメキシコから発生したと考えられているＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ）は、これまでの季節性インフルエンザウイルスと抗原性が大きく異なり、免疫を有していない人が多いことから、急速に全世界へと感染拡大した。Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ用ワクチンは、季節性インフルエンザワクチンと同一方法により製造された不活化スプリットワクチンである。このスプリットワクチンについても、不活化ワクチンであるため、必ずしも流行株に対してワクチン効果を発揮できるとは限らない。
　現在、インフルエンザ治療薬としては、インフルエンザウイルスの出芽に重要であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）の作用を阻害するタミフル及びリレンザがあるものの、発症後４８時間以内の投薬が重要であるなど、その効果は限られている。その他、ＮＡ阻害剤の静注剤やインフルエンザウイルスのポリメラーゼ阻害剤などが開発中であるが、現在のところ臨床治験段階である。
　このような現状から、流行予測が困難であるインフルエンザウイルスに対して、幅広くかつ長期にわたり効果を発揮できる予防薬及び治療薬の確立が強く望まれている。
　日本で製造・備蓄されたＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ用プレパンデミックワクチンについては、２００８年から２００９年にかけて６０００人規模で実施された「安全性試験」、ならびに２００人を対象にした「初回接種試験」、及び既に初期済みの２００人を対象にした「追加接種試験」の３つの臨床試験が行われた。安全性については、予測の範囲内であったとの見解が出されている。一方、既に「ベトナム株」のＨ５Ｎ１ワクチンにて初期済みの被験者に対して異なるワクチン株であるインドネシア株あるいは、安徽株で接種された「追加接種試験」では、反応交叉性が確認されたものの、３週間間隔で同一ワクチンにより２回接種された「初回接種試験」では、異なるウイルス株に対する中和抗体誘導が不十分であることが報告されている。また、マウスモデルを用いた感染防御実験においても、実験室レベルにて同様の手法により作製したこれら４種のワクチンのうち、特に、クレード２．２及び２．３の亜型間における反応交叉性が低く、致死性を完全に抑えることができなかったとの報告がされている（Ｍｕａｒａｋａｍｉ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｏｆ　Ｈ５Ｎ１　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２６（５０），ｐ．６３９８−６４０４，２００８．）。
　本発明が解決しようとする課題は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ及びＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍを含む新型インフルエンザウイルス感染による発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルスを含む治療薬及び予防薬を提供することにある。
　本発明者らは、前記新型インフルエンザウイルス感染に関する解析及び検討結果をもとに、さらに鋭意研究を行った結果、組換えワクシニアワクチンを用いて免疫の強力な活性化をもたらすことが、有力な新型インフルエンザウイルス感染予防法につながるものと考えた。そして、本発明者らは、これまでに上記課題を解決するべく鋭意検討を行なった。その結果、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ及びＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍの感染発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルスを作製することに成功した。特に、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ用組換えワクシニアウイルスにおいては、単回接種により、クレードの異なる株による攻撃感染に対しても、発症防御できることが確認され、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）発現プロモーターと、Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ）又はＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
　ここで、ワクシニアウイルスとしては、例えばＬＣ１６ｍ８株が挙げられる。また、Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルスとしては、例えばＨ５亜型に属するウイルス株、具体的にはＨ５亜型クレード１、Ｈ５亜型クレード２．１、Ｈ５亜型クレード２．２又はＨ５亜型クレード２．３に属するウイルス株が挙げられ、Ｈ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルスとしては、例えばＨ１亜型に属するウイルス株が挙げられる。
　上記ＨＡタンパク質をコードするｃＤＮＡとしては、以下の（ａ）~（ｊ）のＤＮＡを例示することができる。
　（ａ）配列番号１（Ｈ５亜型クレード１；ベトナム株の配列）に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード１に属するウイルス株のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号２（Ｈ５亜型クレード２．１；インドネシア株の配列）に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード２．１に属するウイルス株のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｅ）配列番号３（Ｈ５亜型クレード２．２；青海株のワクチン株の配列）に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｆ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード２．２に属するウイルス株のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｇ）配列番号４（Ｈ５亜型クレード２．３；安徽株の配列）に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｈ）配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード２．３に属するウイルス株のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｉ）配列番号５（Ｈ１亜型；カリフォルニア株のワクチン株の配列）に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｊ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ１亜型に属するウイルス株のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ
　さらに、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターとしては、例えばハイブリッドプロモーターが挙げられる。具体的には、ハイブリッドプロモーターとしては、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるものを例示することができる。
　（ａ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（２）上記（１）の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
　上記医薬組成物は、新型インフルエンザの予防薬及び／又は治療薬、具体的にはＨ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ又はＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザの予防薬及び／又は治療薬として使用することができる。
　図１は、新型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの作製のための、プラスミドの遺伝子構造を示す図である。図中、「インフルエンザＨＡ」は、各新型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号１２、１３、３、１４及び１５）を表し、また、「Ｈ５亜型」はＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶを、「Ｈ１亜型」はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍを表す（他の図においても同様）。
　図２は、ＰＣＲによるＨＡタンパク質遺伝子の導入確認に用いたプライマーの位置と名称を示す図である。
　図３は、ＰＣＲによるＨＡタンパク質遺伝子の導入確認の結果を示す、アガロースゲル電気泳動の写真である。
　図４は、ウエスタンブロット法によるＨＡタンパク質の発現確認の結果を示す、ＰＶＤＦメンブレンの写真である。
　図５は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの液性免疫誘導能の確認方法を示す図である。
　図６は、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来ＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスのワクチンとしての液性免疫誘導能の効果（抗体価）を、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す図である。図中、「Ｅｍｐｔｙ（１＋Ｅ０６）」はＲＶＶ−Ｅｍｐｔｙを１×１０６ＰＦＵで接種した場合、「Ｅｍｐｔｙ（１＋Ｅ０７）」はＲＶＶ−Ｅｍｐｔｙを１×１０７ＰＦＵで接種した場合、「ｍＩＶＲ１５３（１＋Ｅ０６）」はＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を１×１０６ＰＦＵで接種した場合、「ｍＩＶＲ１５３（１＋Ｅ０７）」はＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を１×１０７ＰＦＵで接種した場合の結果を示す。
　図７は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ由来ＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスのワクチンとしての液性免疫誘導能の効果（抗体価）を、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す図である。図中、「ＲＶＶ−ｍＣｌ２．２」及び「ＲＶＶ−ｍＣｌ２．３」は、それぞれ、「ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）」及び「ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）」を示し、「１＋Ｅ０５」、「１＋Ｅ０６」及び「１＋Ｅ０７」は、それぞれ、「１×１０５ＰＦＵ」、「１×１０６ＰＦＵ」及び「１×１０７ＰＦＵ」を示す。
　図８は、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来ＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスをワクチンとして単回接種したＢＡＬＢ／ｃマウスへのＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍの攻撃感染による体重変化を示した図である。
　図９は、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来ＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスをワクチンとして単回接種したＢＡＬＢ／ｃマウスへのＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍの攻撃感染から９日後の肺病理組織解析した図である。組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３））接種群では、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ感染による肺炎を顕著に軽減できた。
　図１０は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ由来ＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスをワクチンとして単回接種したＢＡＬＢ／ｃマウスへのＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶの攻撃感染による体重変化を示した図である。
　図１１は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ由来ＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスをワクチンとして単回接種したＢＡＬＢ／ｃマウスへのＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶの攻撃感染から９日後の肺病理組織解析した図である。組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３））接種群では、致死性を示す高病原性鳥インフルエンザウイルス感染による肺炎を顕著に軽減できた。
　以下、本発明にかかる組換えワクシニアウイルス及びその用途について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１０−２３３０６４号明細書（２０１０年１０月１５日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用した特許文献、非特許文献その他の刊行物は、参照として本明細書に組み込まれるものとする。
１．本発明の概要
　各種ワクチンの中でも、生ワクチンは特に有効なものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンを開発するには非常に長い期間が必要となることが知られており、このことは新型インフルエンザに関しても同様であると考えられる。
　このような場合に採られる手法の一つとして、生ワクチンとして組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ）を作製するという遺伝子工学的手法が知られている。例えば、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用又はリンダペスト用の組換えワクシニアウイルスは、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている（例えば、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９，ｖｏｌ．１０７，ｐ．２２５−２３５参照）。
　また本発明者らは、新型肺炎ＳＡＲＳに関して、その病原体として知られるＳＡＲＳ−ＣｏＶのｃＤＮＡを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており（ＷＯ　２００６／０３８７４２）、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている（例えば、Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７，ｖｏｌ．２５，ｐ．６３０−６３７参照）。
　ＲＶＶの作製に用いる組換え母体となるワクシニアウイルスとしては、安全性の確立されているワクチン株である必要があるが、そのようなワクチン株としてはワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株（例えば、臨床とウイルス，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐ．２６９，１９７５参照）が知られている。ＬＣ１６ｍ８株はリスター株から分離されたものであって、実際に予防ワクチンとしての投与実績があり、かつ安全性及び有効性が確認されており、現在製造されている唯一のワクチン株である。また本発明者らは、リンダペスト、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ等に対する組換えワクシニアウイルスの開発検討の過程で、抗体産生能及び細胞性免疫の誘導能を非常に高めることのできる遺伝子発現プロモーターを用いることが、本発明のワクシニアウイルスに有効であることを見出した。具体的にはプラスミドベクターとしてｐＳＦＪ１−１０やｐＳＦＪ２−１６を用いることが好ましいことを見出した（例えば、Ｊｉｎ　Ｎ−Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，ｖｏｌ．１３８，ｐ．３１５−３３０；Ｅｌｍｏｗａｌｉｄ　ＧＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｐ．８４２７−８４３２；Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．１３８，ｐ．３１５−３３０，１９９４；特開平６−２３７７７３号公報　参照）。
　その結果、本発明者は、Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ）又はＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードする遺伝子を、発現プロモーターとともにワクシニアウイルスに組み込むことにより、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来ＨＡタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを作製することに成功したものである。
　本発明にかかる組換えワクシニアウイルスの母体となるウイルスは、上記のとおりワクシニアウイルスである。そのゲノム中にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質をコードするｃＤＮＡ（当該ｃＤＮＡの全部又は一部）が組み込まれたものが、本発明の組換えワクシニアウイルスである。Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質をコードするｃＤＮＡ（当該ｃＤＮＡの全部又は一部）をそれぞれ発現ユニットとし、それぞれワクシニアウイルスベクターに導入した。この発現ユニットをワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株のＨＡ遺伝子領域に導入した。ＨＡ遺伝子領域に外来遺伝子を導入してもワクシニアウイルスの増殖活性には影響を与えないので増殖能の弱い安全なワクチン株を組換え母体ウイルスとして使用することができることはすでに知られている（Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．６７５−６８１，１９９４参照）。
　組換えワクシニア生ワクチンは、狂犬病ウイルスやリンダペストウイルスに対するものが野外試験されており、その感染発症予防効果の優秀性が証明されている。
　本発明者は、ハイブリットプロモーターの下流にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子を挿入し、これらの遺伝子を弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株のＨＡタンパク質遺伝子領域に組み込むことで組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ）を作製した。ハイブリッドプロモーターは、ポックスウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス７．５ｋＤａタンパク質（ｐ７．５）前期発現プロモーターにより構成される（Ｊｉｎ　Ｎ−Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，ｖｏｌ．１３８，ｐ．３１５−３３０参照）。このプロモーターは、北海道大学の志田壽利博士により開発され、同博士から提供を受けることも可能である。
　作製したＬＣ１６ｍ８株由来ＲＶＶは、動物細胞に感染させることにより、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質を大量に発現することが確認され、また動物個体に接種することでＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質に対する高力価の抗体が早期に産生することが併せて確認され、本発明を完成した。
２．新型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの作製
　Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子は、すでに米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）において、所定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）により登録されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＦ５４１４０２に、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１（Ｈ５亜型クレード１に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号１）が登録され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＦ５４１３９４に、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１（Ｈ５亜型クレード２．１に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号２）が登録され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＱ３７１９２８に、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３（Ｈ５亜型クレード２．３に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号４）が登録されている。また、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＪ９６９５４０に、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ（Ｈ１亜型に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号５）が登録されている。
　本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれるＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、上記各遺伝子のほか、その一部やその変異配列も用いることができる。例えば、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡ（具体的には、配列番号１２に示される塩基配列からなるＤＮＡ）、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡ（具体的には、配列番号１３に示される塩基配列からなるＤＮＡ）、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３のＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡ（具体的には、配列番号１４に示される塩基配列からなるＤＮＡ）を用いることができる。また、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの一部の塩基を変異（置換変異）させたＤＮＡ（具体的には、配列番号１５に示される塩基配列からなるＤＮＡ）を用いることができる。なお、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．２（Ｈ５亜型クレード２．２に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子に関しては、当該遺伝子（ｃＤＮＡ）の一部を欠損させた遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号３）が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＱ６５９３２７に登録されている。
　これらＨＡタンパク質遺伝子（一部欠損・変異させた遺伝子も含む）は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。従って、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子、すなわちＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質をコードするｃＤＮＡの全部（変異配列も含む）又はその一部は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等を参照して行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。また、変異配列、特に変異置換型のＤＮＡについては、例えば、上記「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．」や「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）」等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
　本発明の好ましい態様においては、上記プラスミドに挿入されているＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子を、上記ＰＣＲの鋳型に用いることができる。そして、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とし、各遺伝子特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子領域を調製することができる。本発明においては、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１（Ｈ５亜型クレード１に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる遺伝子を「ｍＣｌ１」と称し、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１（Ｈ５亜型クレード２．１に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる遺伝子を「ｍＣｌ２．１」と称し、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．２（Ｈ５亜型クレード２．２に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる遺伝子を「ｍＣｌ２．２」と称し、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３（Ｈ５亜型クレード２．３に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる遺伝子を「ｍＣｌ２．３」と称し、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ（Ｈ１亜型に属するウイルス株）由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号１５に示す塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる遺伝子を「ｍＩＶＲ１５３」と称する。
　本発明においては、配列番号１~５及び１２~１５に示される塩基配列からなるＤＮＡのほか、以下の各ＤＮＡも、上記各ＨＡタンパク質遺伝子（例えばｍＣｌ１、ｍＣｌ２．１、ｍＣｌ２．２、ｍＣｌ２．３及びｍＩＶＲ１５３等）のＤＮＡとして使用することができる。
　配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）。
　配列番号１２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ１の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）。
　配列番号１３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ２．１の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．２由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ２．２の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）。
　配列番号１４に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ２．３の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）。
　配列番号１５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＩＶＲ１５３の変異型ＤＮＡ）。
　上記の各変異型ＤＮＡは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１~５及び１２~１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることもできる。上記ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＳＣ~１０×ＳＳＣ、０．１％~１．０％ＳＤＳ及び２０℃~８０℃の条件が挙げられ、より詳細には、３７℃~５６℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０~２０分の洗浄を１~３回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等を参照することができる。
　また、配列番号１に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）、配列番号１２に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ１の変異型ＤＮＡ）、配列番号２に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）、配列番号１３に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．１由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ２．１の変異型ＤＮＡ）、配列番号３に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．２由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ２．２の変異型ＤＮＡ）、配列番号４に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）、配列番号１４に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＣｌ２．３の変異型ＤＮＡ）、配列番号５に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（変異型ＤＮＡ）、配列番号１５に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ（ｍＩＶＲ１５３の変異型ＤＮＡ）を用いることができる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域内に挿入されるものであり、ポックスウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス７．５ｋＤａタンパク質（ｐ７．５）前期発現プロモーターにより構成されるハイブリットプロモーターである。このプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができ、例えばｐＢＭＳＦ７Ｃが知られている（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．１３８，ｐ．３１５−３３０，１９９４；特開平６−２３７７７３号公報　参照）。
　本発明において使用可能なハイブリッドプロモーターの塩基配列を配列番号６に示す。但し、本発明においては、配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡのほか、配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡも、発現プロモーター（特にハイブリッドプロモーター）として使用することができる。「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。
　このハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。本発明においては、ｐＢＭＳＦ７Ｃのプロモーター下流にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子を挿入したプラスミドベクターをｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．３、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＩＶＲ１５３という。
　これらのプラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製することができる。プラスミドベクターの宿主への導入は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株を感染した動物細胞中にプラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．３、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＩＶＲ１５３をそれぞれ導入することにより、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域において相同組換えを引き起こし、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子をそれぞれ発現する組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３））を作製することができる。
　なお、ＲＶＶの作製に用いたワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株は、動物個体で増殖可能であるが、神経細胞における増殖性は極めて低い弱毒株である。日本では痘瘡ワクチンとして認可されており、約５万人の小児に接種の結果、重篤な副作用は発生していない（厚生省種痘研究班研究報告：臨床とウイルス，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５参照）。一方、免疫誘導能に関しては親株であるＬｉｓｔｅｒ株と同等であることが報告されており、ＬＣ１６ｍ８株は安全で効果的なワクチンである。
　作製した組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３））は、ワクシニアウイルスのＨＡタンパク質遺伝子領域にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子が挿入されるため、ワクシニアウイルス由来のＨＡタンパク質の発現が欠如する。インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質は、モルモット赤血球に対して凝集反応を示すが、ワクシニアウイルス由来のＨＡタンパク質はモルモット赤血球に対して凝集反応を起こさない。従って、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を動物細胞に感染させ、これにより形成するプラークへのモルモット赤血球の凝集反応を指標にして、ＲＶＶのスクリーニングを行う。目的のＲＶＶは、赤血球凝集活性を持つレッドプラークを選別すればよい。
　レッドプラークより得られたウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子特異的なプライマーによりＰＣＲを行い、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子の導入を確認することができる。
　Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質の発現は、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、抗体は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質由来のＨＡペプチド（ａ．ａ．１９８−２１７（配列番号１０）等）、又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質由来のＨＡペプチド（ａ．ａ．２２３−２３４（配列番号１１）等）を免疫して作製したウサギ抗血清を用いることができる。
　ＲＶＶの作製において目的遺伝子の挿入部位としては、ＨＡタンパク質遺伝子領域以外として、一般にはチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子領域が用いられるが、ＴＫ遺伝子領域に目的遺伝子を挿入することによるＴＫの発現欠損によりＲＶＶの増殖性が低下することが知られている。一方、ＨＡタンパク質発現欠損によるＲＶＶの増殖性はほとんど影響がないことが報告されている（Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐ．６７５−６８１，１９９４参照）。従って、本発明においては、目的遺伝子の挿入部位としてＨＡタンパク質遺伝子領域が好ましい。
３．新型インフルエンザの予防用及び治療用医薬組成物
　本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを含む、新型インフルエンザ（すなわちＨ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ及びＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザ）の予防薬及び治療薬（予防用及び治療用医薬組成物）を提供する。また本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを患者（被験者）に投与することを含む、上記新型インフルエンザの予防及び治療方法や、上記新型インフルエンザの予防及び治療のための上記組換えワクシニアウイルスの使用や、上記新型インフルエンザの予防薬及び治療薬を製造するための上記組換えワクシニアウイルスの使用等も提供することができる。
　本発明の医薬組成物は、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えワクシニアウイルスと、既存の抗ウイルス薬（例えば、タミフル、リレンザ）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えワクシニアウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもでき、また、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
　また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
　本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
　投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ウイルスの一日投与量としては、経口の場合は１０００~１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００００~１００００００００ＰＦＵ程度であり、非経口の場合は１００~１０００００００００ＰＦＵ程度、好ましくは１０００~１００００００００ＰＦＵ程度である。ウイルスは、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスは、新型インフルエンザ予防用及び治療用ワクチンとして使用される。また、これまでに、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍに対するワクチンの開発では、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍに対する抗体と細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に着目した研究が行われている。従って、予めワクチンとしての抗体価又は細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
　例えば、作製した組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３））又は親株であるＬＣ１６ｍ８株に対する抗体価は、これらのウイルス株をマウスに接種後、経時的に血清を回収し、血清のＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子に対するＥＬＩＳＡ価を測定することで得ることができる。ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）を接種したマウスの血清では、接種１週間後からＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質に対する抗体価の上昇が認められており、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を接種したマウスの血清は、接種２週間後からＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質に対する抗体価の上昇が認められる。
　以上のとおり、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルス（総称して「Ｆｌｕ　ＨＡ−ＲＶＶｓ」という）は、新型インフルエンザに対する液性免疫を誘導し得るものである。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ）の作製
　ｐＢＭＳＦ７Ｃプラスミド（特開平６−２３７７７３号公報　参照）のＳｂｆＩ−ＳｇｆＩサイト間に、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ（クレード１、クレード２．１、クレード２．２、クレード２．３）及びＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍの各ＨＡタンパク質遺伝子をそれぞれ組み込むことにより、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域内のＡＴＩ・ｐ７．５ハイブリットプロモーター下流に上記各ＨＡタンパク質遺伝子が挿入されたプラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．３及びｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＩＶＲ１５３を作製した（図１）。具体的には、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ１には配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡがＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶクレード１のＨＡタンパク質遺伝子として挿入されており、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．１には配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡがＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶクレード２．１のＨＡタンパク質遺伝子として挿入されており、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．２には配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡがＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶクレード２．２のＨＡタンパク質遺伝子として挿入されており、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．３には配列番号１４に示す塩基配列からなるＤＮＡがＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶクレード２．３のＨＡタンパク質遺伝子として挿入されており、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＩＶＲ１５３には配列番号１５に示す塩基配列からなるＤＮＡがＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子として挿入されている。
　初代腎培養細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、コンフルエントに達したところで、ワクシニアウイルス弱毒株ＬＣ１６ｍ８株を、ｍｏｉ＝１０で、３０℃で１時間感染させた。なお、ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）とは、細胞１個あたりのＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）をいう。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、５倍希釈ＴｒｙｐＬＥ／０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）により処理し、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地　抗生物質（−）、ＰＢＳ（−）、ＨｅＢＳ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、細胞をＨｅＢＳ　ｂｕｆｆｅｒ　６００μｌに懸濁した。プラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．３及びｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＩＶＲ１５３の各１．５μｇを、それぞれ全量３０μｌになるようにＨｅＢＳ　ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、細胞懸濁液に加えて混和し、氷上で１０分間静置した。プラスミドベクターを加えた細胞懸濁液を１０μｌチップ型金電極で吸い上げ、エレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてエレクトロポレーション（１２００Ｖ、パルス幅４０ｍｓ、パルス回数１回）を行った。エレクトロポレーション後、直ちに１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地　抗生物質（−）培地２ｍｌであらかじめ３５ｍｍディッシュに播種しておいたＲＫ１３細胞又は初代腎培養細胞に、添加した。エレクトロポレーション２回分を３５ｍｍディッシュに添加し、３０℃で２４時間培養した。
　２４時間培養後、スクレーパーを用いて細胞をディッシュから剥がし、細胞懸濁液を回収し、冷水中において超音波処理（３０ｓｅｃ×４回）を行った後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した。その上清をウイルス溶液として使用した。ウイルス溶液を５％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地に希釈し、１５０ｍｍディッシュに播種しておいた初代腎培養細胞に３０℃、１時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した。５％ＦＣＳ／０．５％メチルセルロース／ＭＥＭ培地を添加して、３０℃で９６時間培養した。９６時間培養後、上清を吸引除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ＰＢＳ（＋）で希釈したモルモット赤血球溶液を１５０ｍｍディッシュに添加し、３０℃で３０ｍｉｎ培養した。赤血球溶液を吸引除去した後、細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄した。モルモット赤血球が吸着したプラークを、ピペットマンを用いて回収した。回収したプラークについて、ＰＣＲならびに遺伝子配列の決定により前記各ＨＡタンパク質遺伝子の導入を確認した。遺伝子導入が確認されたプラークについてはプラーク精製を３回繰り返した。
　３回プラーク精製したウイルスについて、小スケール培養を行った。３回目に得たコロニーを５００μｌの５％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地に懸濁し、冷水中で超音波処理を行った。遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行った後、上清２５０μｌを６０ｍｍディッシュに播種しておいた初代腎培養細胞に添加し、３０℃で１時間感染させた。感染後、２．５ｍｌの５％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地を添加し、３０℃で９６時間培養した。９６時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコから剥がし、細胞懸濁液を回収した。回収した細胞懸濁液を冷水中で超音波処理（３０ｓｅｃ、４回）した後、遠心分離し、その上清をウイルス溶液として回収した。回収したウイルス溶液は、段階希釈して６ウェルプレートに播種しておいたＲＫ１３細胞又は初代腎培養細胞に添加し、３０℃で１時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、ＰＢＳ（−）で細胞を２回洗浄した後、５％ＦＣＳ／０．５％メチルセルロース／ＭＥＭ培地を添加して、３０℃で９６時間培養した。９６時間後に、ウェル中に形成されるプラーク数をカウントすることによりｔｉｔｅｒを算出した。
　この算出したｔｉｔｅｒをもとに大スケール培養を行った。１５０ｍｍディッシュ１０枚にＲＫ１３細胞又は初代腎培養細胞を播種し、コンフルエントに達したところで、組換えワクシニアウイルス溶液（２ｍｌ）を、ｍｏｉ＝０．１で、３０℃で１時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、１８ｍｌの５％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地を添加し、３０℃、９６時間培養した。９６時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコからはがし、細胞懸濁液を回収し、−８０℃で凍結保存した。この細胞懸濁液は凍結融解を１回行った後、冷水中で超音波処理（３０ｓｅｃ、４回）、遠心分離をし、その上清をウイルス溶液として回収した。このウイルス溶液を段階希釈して、６ウェルプレートに播種しておいたＲＫ１３細胞又は初代腎培養細胞に感染させて、上記と同様の方法により溶液中のウイルスｔｉｔｅｒを算出した。ｔｉｔｅｒを算出したこれらの各ウイルス溶液（組換えワクシニアウイルス）を、以下の各実施例に示す種々の実験に使用した。
ＰＣＲによるＨＡタンパク質遺伝子の導入確認
　実施例１に示した各ＨＡタンパク質遺伝子（ｃＤＮＡ：配列番号１２、１３、３、１４及び１５）に特異的な以下のプライマーを用い、得られた組換えワクシニアウイルスのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、当該ウイルスゲノム中に各ＨＡタンパク質遺伝子が導入されているか確認した（図２及び３）。
インサート確認ＰＣＲ用プライマーの塩基配列
＜Ｆプライマー＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
（Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子（４種）確認用）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
（Ｈ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子確認用）
＜Ｒプライマー＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ及びＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子確認用）
　具体的には、反応液組成は、市販のポリメラーゼに添付の緩衝液５０μｌに対しＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ、ｄＮＴＰ　０．３ｍＭ、Ｆプライマー１μＭ、Ｒプライマー１μＭとし、サイクル条件は、融解を９５℃で０．５分、アニーリングを５８℃で０．５分、伸長を７２℃で２分とするサイクルを計２５サイクルとした。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドを確認した。その結果、プライマー設計により予め想定した長さの単一のバンドが認められれば、組換えウイルスゲノム中にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子が導入されていることが分かり、一方、当該バンドが認められなければ、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子は導入されていないことが分かることになる。
　図３に示すように、ＰＣＲ産物（増幅断片）の１％アガロースゲル電気泳動の結果、組換えウイルスゲノム中にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質遺伝子遺伝子が導入されていることが分かった。
ウエスタンブロット法によるＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質の発現確認
　組換えワクシニアウイルスを、予め６ウェルプレートに播種しておいたＲＫ１３細胞に、ｍｏｉ＝１０で、３０℃で１時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、ＰＢＳ（−）により細胞を１回洗浄した。各ウェルに２ｍｌの５％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地を添加し、３０℃、１８時間培養した。１８時間後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（−）により細胞を２回洗浄した。１００μｌの溶解ｂｕｆｆｅｒ（１％　ＳＤＳ、０．５％　ＮＰ−４０、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を添加して細胞を溶解させ、その溶液を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し入れた。回収した溶液は粘性がなくなるまで冷水中で超音波処理を行った。調製した溶液中のタンパク質量は、Ｌｏｗｒｙ法により定量した。
　電気泳動は、１０％　アクリルアミドゲルを用い、３０μｇのタンパク質に対して行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出し、Ｓｅｍｉ−ｄｒｙ　ｂｌｏｔｔｅｒを用いて２ｍＡ／ｃｍ２で６０分間通電し、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、５％スキムミルク−ＴＢＳ−Ｔ溶液につけてブロッキングを行った。ブロッキング終了後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。一次抗体は、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質由来のＨＡペプチド（ａ．ａ．１９８−２１７（配列番号１０；ＮＤＡＡＥＱＴＫＬＹＱＮＰＴＴＹＩＳＶＧ））又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質由来のＨＡペプチド（ａ．ａ．２２３−２３４（配列番号１１；ＹＳＫＫＦＫＰＥＩＡＩＲ））に対するウサギポリクローナル抗体を使用した。一次抗体との反応終了後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。二次抗体には抗ウサギＩｇＧ−ｌｉｎｋｅｄ　ＨＲＰＯ（ｆｒｏｍ　Ｄｏｎｋｅｙ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用した。二次抗体との反応終了後、再度ＴＢＳ−Ｔ溶液でメンブレンを３回洗浄し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　ｗｅｓｔｅｒｎ検出用試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をメンブレンに添加し、蛍光をＣＣＤカメラで取り込み、画像解析した。
　その結果、図４に示すように、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）の組換えウイルスゲノム中においてＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質が発現していることが分かった。
マウスへの組換えワクシニアウイルス接種実験（図５）
　図５は、組換えワクシニアウイルス（Ｆｌｕ　ＨＡ−ＲＶＶｓ）の液性免疫誘導能の確認方法を示す図である。
　実施例１で得た組換えワクシニアウイルス又は空ベクターを挿入したＲＶＶ−ＥｍｐｔｙをＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に１×１０７ＰＦＵで経内皮接種（皮内接種（ｉ．ｄ．））した後、１、２、３及び４週間後に、眼窩静脈より採血を行った。採取した血液は、すべて血清分離剤を入れた０．５ｍｌチューブにとり、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して血清を分離回収した。血清は、後述するＥＬＩＳＡ試験を行うまで、−８０℃に凍結保存した。
組換えワクシニアウイルス（Ｆｌｕ　ＨＡ−ＲＶＶｓ）で免疫したマウス血清中のＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質に対する、ＥＬＩＳＡ法による抗体価測定
　９６ウェルプレートにＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質をコートしておき、凍結しておいた血清サンプルを１００~１０００倍に希釈して添加し、４度で一晩静置した。９６ウェルプレートをＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、９６ウェルプレートに抗マウスＩｇＧ−ｌｉｎｋｅｄ　ＨＲＰＯ（ｆｒｏｍ　Ｓｈｅｅｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を二次抗体として添加した。室温で２時間反応させた後、再度ＴＢＳ−Ｔ溶液で９６ウェルプレートを３回洗浄した。発色液を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。室温で３０分間静置後、２Ｍ硫酸溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して反応を停止した。マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、図６及び７に示すように、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を接種したマウス血清中にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍのＨＡタンパク質に対して高い抗体価の誘導が認められた。
組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３））の新型インフルエンザに対する予防効果の検討
　図８に示すように、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）接種による免疫誘導効果が確認されたため、これら組換えワクシニアウイルス（ワクチン）接種マウスに対して、ワクチン接種から５週間後に、鼻からＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍを攻撃感染させた。経日的な体重変化を測定し、感染から９日後に剖検を行い、肺の病理解析を行った。ワクチンを接種していないマウスでは、インフルエンザウイルス感染後、経日的に体重が減少していき、９日後には、約２０％の低下が認められるのに対して、ワクチン接種群ではＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍ感染後の初期に一過性に体重減少が見られるものの、その後は速やかに体重が増加し、正常値付近にまで回復することが分った。
　また、肺病理組織を解析から、ワクチンを接種していないマウスへのＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍの感染により、肺は、間質細胞の肥厚化や、粘液の滲出、免疫担当細胞であるリンパ球侵潤により肺胞の空間が局所的に充満した肺炎像を示したのに対して、ワクチン接種群では、感染部位である気管支周囲への顕著なリンパ球侵潤は、認められるものの、肺胞腔は、きれいに維持されており、肺炎が顕著に軽減されることが分かった（図９）。
　一方、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）又はＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）を単回接種したマウスに対して、これら組換えワクシニアウイルス（ワクチン）接種から５週間後に、Ｈ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶのクレード２．３を攻撃感染させ、ワクチン効果を検討した。攻撃感染は、１×１０４ＰＦＵ及び１×１０５ＰＦＵの２つの濃度で行った。１×１０４ＰＦＵ及び１×１０５ＰＦＵのいずれの攻撃感染に対しても、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）又はＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）接種群では生存率１００％であり、体重変化もインフルエンザウイルス感染３日後より増加していき、ほぼ感染前と同じ体重にまで回復した。さらに、高濃度側である１×１０５ＰＦＵの攻撃感染における肺病理組織を解析したところ、ワクチンを接種していないマウスへのＨ５Ｎ１ウイルス感染により、生存していた個体の肺においても、間質細胞の肥厚化が認められたのに対して、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）又はＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）接種群では、感染部位である気管支周囲や、血管周囲への顕著なリンパ球侵潤と間質部分の局所的な肥厚化が観察されるものの、肺胞腔は、比較的きれいに維持されており、肺炎が顕著に軽減されていた。よって、今回作製した組換えワクシニアウイルス（ワクチン）は、致死性を示すＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ感染に対しても、感染防御効果を示した。また、クレードの異なるクレード２．２のワクチン接種群でもクレード２．３のウイルス感染に対して十分なワクチン効果を示した。
　新型インフルエンザ組換えワクシニアウイルスとしては、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を発現するＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を用いた（図１）。これらＦｌｕ　ＨＡ−ＲＶＶｓの効果を評価するために、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）又はＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）を１×１０７ＰＦＵで単回皮内接種し、接種から５週間後にＨ５Ｎ１　ＨＰＡＩＶ又はＨ１Ｎ１（２００９）ｐｄｍを経鼻感染させ、その後経日的な体重変化測定を行い、感染から９日後に肺組織を採材し（図８~１１）、肺病理組織解析を行った（図９及び１１）。
　ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）及びＲＶＶ−Ｆｌｕ　ＨＡ（Ｈ１−ｍＩＶＲ１５３）接種群は、それぞれのインフルエンザウイルスによる攻撃感染に対して、いずれも体重減少抑制及び肺炎軽減効果を認めた（図８~１１）。
　従って、本発明のワクシニアウイルスは、新型インフルエンザの予防及び治療効果を有し、新型インフルエンザワクチンとして有用であることが示された。
　本発明によれば、新型インフルエンザの予防又は治療に有効であり、かつ安全性の高い新規な組換えワクシニアウイルス、及びこれを含む新型インフルエンザ用予防薬又は治療薬（新型インフルエンザの予防又は治療用ワクチン）を提供することができる。
　配列番号７：合成ＤＮＡ
　配列番号８：合成ＤＮＡ
　配列番号９：合成ＤＮＡ
　配列番号１２：組換えＤＮＡ
　配列番号１３：組換えＤＮＡ
　配列番号１４：組換えＤＮＡ
　配列番号１５：組換えＤＮＡ

Claims (10)

  1. 発現プロモーターと、Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルス又はＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
  2. ワクシニアウイルスがＬＣ１６ｍ８株である、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
  3. Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザウイルスが、Ｈ５亜型クレード１、Ｈ５亜型クレード２．１、Ｈ５亜型クレード２．２又はＨ５亜型クレード２．３に属するウイルス株である、請求項１又は２に記載の組換えワクシニアウイルス。
  4. Ｈ１Ｎ１パンデミックインフルエンザウイルスが、Ｈ１亜型に属するウイルス株である、請求項１又は２に記載の組換えワクシニアウイルス。
  5. ヘマグルチニンタンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｊ）のＤＮＡである、請求項１~４のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
    　（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード１に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするＤＮＡ
    　（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード２．１に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするＤＮＡ
    　（ｅ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｆ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード２．２に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするＤＮＡ
    　（ｇ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｈ）配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ５亜型クレード２．３に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするＤＮＡ
    　（ｉ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｊ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ１亜型に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするＤＮＡ
  6. 発現プロモーターがハイブリッドプロモーターである、請求項１~５のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
  7. ハイブリッドプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるものである、請求項６に記載の組換えワクシニアウイルス。
    　（ａ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｂ）配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ
  8. 請求項１~７のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
  9. Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ又はＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザの予防薬である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. Ｈ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ又はＨ１Ｎ１パンデミックインフルエンザの治療薬である、請求項８に記載の医薬組成物。
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