JPH06237773A - ポックスウイルスのａ型封入体（ａｔｉ）プロモーター及び前期プロモーターを含んで成る外来遺伝子発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ウイルス感染の前期及び後期にわたって外来
構造遺伝子を効率よく発現することができるプロモータ
ーを提供する。 【構成】 ポックスウイルスのＡ型封入体（ATI ）プロ
モーター及び／又は複数反復するワクチニアウイルス
７．５Ｋ前期発現プロモーターを含んで成るプロモータ
ーであって、ウイルス遺伝子に挿入された該プロモータ
ーの下流に外来構造遺伝子が連結された場合に該構造遺
伝子をウイルス感染の前期及び後期にわたって発現する
ことができるプロモーター；該プロモーターが組み込ま
れたポックスウイルス血球凝集素（HA）遺伝子を含んで
成るベクター；並びに前期プロモーター及び該プロモー
ターの下流に連結された外来遺伝子を含んで成るワクシ
ニアウイルス。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、前期プロモーター活
性を持つ配列を改良し、且つ重複させ、さらにＡ型封入
体遺伝子５′上流配列と組み合わせたプロモーター、及
び該プロモーターを含有する外来遺伝子発現用ベクター
に関するものであり、これらは組換えワクシニアウイル
スの製造において有用である。

【０００２】

【従来の技術】組換えワクシニアウイルスは、外来遺伝
子の発現ベクターとして頻用されるようになった。その
理由は、種々の動物に感染して、体内で外来遺伝子産物
を生産するため、免疫誘導など個体の反応を調べられる
ことが挙げられる。これは、病原体の抗原遺伝子を発現
するワクシニアウイルスを作った場合に、ワクチンとし
て用いられることに通じる。又、非常に多種類の培養細
胞に感染し、比較的多量の外来蛋白質を生産することか
ら、蛋白質生産用のベクターとしても用い得る。

【０００３】特に糖蛋白質や分泌蛋白質の場合には、完
全な形の糖鎖の付加や多量体形成が活性発現や安定性に
重要な場合が多い。これは、高等動物細胞内でのみ成し
得るもので、これらの細胞を宿主とするワクシニアウイ
ルスベクターから発現された蛋白質において可能となる
ものである。ちなみに、他の頻用されているベクターで
あるバキュロウイルス、酵母及び大腸菌では、上記修飾
は不完全である。

【０００４】このようにワクシニアウイルスベクター
は、他にはない長所を持っているが、改良すべき点も存
在する。その一つは、外来蛋白質の生産量である。本発
明者ら、及び他のグループは生産量の増大のために種々
の努力を行なってきた。B.Moss等は、バクテリオファー
ジＴ７のRNA ポリメラーゼを発現する組換えワクシニア
ウイルスと、Ｔ７RNA ポリメラーゼのプロモーターの下
流に目的の外来遺伝子をつないだ組換えワクシニアウイ
ルスをCV-1細胞に重感染させることによって、大量の外
来蛋白質を生産させた〔Molecular and Cellular Biolo
gy, ７, (1987) p2538-2544 〕。

【０００５】しかし、この場合には、２種類の組換えワ
クシニアウイルスを重感染させる必要があり、動物には
接種できない。又、彼らは（IPTG）存在下でＴ７RNA ポ
リメラーゼを誘導する工夫をして、同一ワクシニアゲノ
ム内に、Ｔ７RNA ポリメラーゼ遺伝子と外来遺伝子と共
存し得るようにした〔Journal of Vivology, 66, (199
2) p.2934-2942〕。しかし、この場合には、外来蛋白質
の生産にはIPTGが要求されるため動物に接種しても効果
はない。上記２種類のワクシニアベクターにより生産さ
れる外来蛋白質の量は感染細胞蛋白質の２．５〜１０％
であった。

【０００６】本発明者らは、ワクシニアベクターの生産
力増大のためにワクシニアウイルス及び近縁の牛痘ウイ
ルスのプロモーターを開発、改良することを試みてき
た。つまり、ポックスウイルス属の中では最強と予想さ
れるＡ型封入体（ATI ）プロモーター領域をクローニン
グし、それがもっとも頻用されている７．５ｋ蛋白質遺
伝子のプロモーター（ｐ７．５プロモーター）より数倍
強いことを示した〔特開昭６１−２２２１９４号及びJo
urnal of Vivology, 65, (1991) p.5584-5588〕。さら
に、ｐ７．５プロモーターの前期領域を数個（５個ま
で）直列に並べ、ATI プロモーターと組み合わせること
により、ワクシニアウイルス感染の前期後期共によく働
くプロモーターを作成した〔Journal of Vivology, 6
5, (1991) p5584-5588 及び特許公開平２−１８６９９
２〕（表１）。これは、培養細胞、動物体内両方で働
く。ATI プロモーターを利用したワクシニアベクターよ
り生産される外来蛋白質は、感染細胞蛋白質の約４〜７
％であった（表２）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ワクシ
ニアベクターの生産力は、徐々に改善されてきた。しか
し、バキュロウイルスなど他のベクターに較べるとまだ
少ない。又、エイズワクチンなどの場合には、高い免疫
力の誘導と免疫効果の長期維持が要求される。これらの
点の解決に寄与するために、本発明は、ワクシニアベク
ターのプロモーターを改良することによって、細胞内及
び動物・人体内での外来蛋白質の生産力をさらに高めよ
うとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく種々のプロモーターの組み合わせを検討し
た結果、ｐ７．５プロモーター領域の塩基配列を変え
て、多数を同方向に接続し、かつATI プロモーターと組
み合わせることが効果的であることを見出した。さら
に、このプロモーターを挿入する部位であるワクシニア
の血球凝集素（HA）遺伝子の転写方向に順向きに入れる
ことが、このプロモーターの効率に重要であることを見
出した。これらの工夫の結果、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（CAT ）を指標として測定し
た場合、このワクシニアウイルスベクターより生産され
る外来蛋白質は、感染細胞の全蛋白質の１５％に及ぶこ
とを見出した。

【０００９】従って本発明は、ワクシニアウイルスのHA
遺伝子中に、重複した改良型ｐ７．５プロモーター配列
とATI プロモーターを組み合わせたプロモーターを含有
するプラスミド、及びこのプロモーターを含み、この下
流に配置された外来蛋白質遺伝子を強力に発現すること
ができる発現ベクターを提供するものである。本発明は
さらに、前期の複合プロモーター、及び該プロモーター
の下流に続く任意の外来構造遺伝子を含んで成るワクシ
ニアウイルスを提供する。

【００１０】

【具体的な説明】本発明の複合ウイルスプロモーター
は、後期発現を支配するポックスウイルスのATI プロモ
ーターと、前期発現を支配するプロモーターの下流側領
域とを含んで成る。

【００１１】後期発現プロモーター ATI プロモーターは例えば牛痘ウイルスのゲノムからク
ローニングすることができ、このプロモーターを含むAT
I 遺伝子のクローニング方法、及びATI プロモーターの
塩基配列は、Journal of general Virology,69,35-47(1
988)及び特開昭６１−２２２１９４号明細書（ヨーロッ
パ出願公開No. ８７３０８３７２．９）に詳細に記載さ
れており、そしてこのプロモーターを含有するプラスミ
ドpB２３により形質転換された大腸菌エシェリシャ・コ
リ（Escherichia coli) JM１０９−Ｂ２３は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１４５９号（FERM
BP−１４５９）として、ブタペスト条約に基づき国際寄
託されている。従って、ATI プロモーターは前記プラス
ミドpB２３から容易に切り出すことができ、また、前記
公開公報に開示されている方法に従って、当業者が容易
に入手することができる牛痘ウイルス株のいずれかから
容易にクローニングすることができる。

【００１２】前期発現プロモーター 本発明においては前期発現プロモーターとして、７．５
Ｋプロモーターの前期発現領域を用いる。ワクシニアウ
イルス７．５Ｋプロモーターの後期発現及び前期発現の
それぞれに必須の領域の同定はすでに行なわれている
（Journal of Virology Vol.54 p 30-37 (1985）。ま
た、Journal of Molecular Biology.Vol.210p749-769
(1989 ）においてB.Mossらは、７．５Ｋプロモーターの
前期発現領域を人工的に塩基配列を改変することによ
り、前期遺伝子発現への影響について論じている。しか
しながら、彼らは１塩基ごとを改変しているのみで、す
べての塩基について組合せを検討しているわけではな
い。

【００１３】本発明においてはmRNA転写開始点を＋１位
とした時の−２８位の位置から＋６位の位置からなる−
２４位をＧからＡに、−２２位をＡからＴに、−１６位
をＴからＡに、−１５位をＡからＣに、そして−１２位
をＴからＧに改変したDNA 断片を合成した。このDNA 断
片にBst XI部位の付着末端を付加することにより、head
to tailで前期発現プロモーターが連結するようにし
た。これをATI プロモーターに連結し、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（CAT ）遺伝子の前
期発現を検討し、次の式

【００１４】

【化２】

【００１５】により示される配列（Ｉ）によりCAT の前
期発現を得られることを確認した。従って本発明におい
ては、配列（Ｉ）を前期発現プロモーターとして使用す
ることができる。配列Ｉの前期発現プロモーターの化学
合成については実施例１において具体的に記載する。

【００１６】重複前期プロモーターを同一方向で並べる工夫 HA遺伝子中にATI プロモーターを含有するプラスミドpS
F とpSF ２〔Journalof Vivology, 65, p5584-5588 (1
991) 〕を改変して、配列（Ｉ）を多数順方向に導入で
きるようにした。特開昭６１−２２２１９４号にある複
合ウイルスプロモーターの作製法では制限酵素Bam HIに
よる切断部位に制限酵素Bam HIによる消化から生じる付
着末端を持つ合成プロモーターを用いて前期プロモータ
ー領域を重複させた。しかしながら、この方法は導入し
た合成プロモーターの方向性について塩基配列を決定す
ることによってのみ情報が得られ、順方向に多数並んだ
合成プロモーターが得られる確率は低く、合理的ではな
い。そこで、本発明においてはマルチクローニング部位
として導入されているBam HI部位に、５′−ＧＡＴＣＣ
ＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧ−３′（配列番号：３）及び
５′−ＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧ−３′（配列
番号：４）の２種のオリゴヌクレオチドをアニーリング
したものを組込んで制限酵素Bst XI認識部位を導入し
た。制限酵素BstXIは、１２bpの配列：

【００１７】

【化３】

【００１８】を認識して矢印の位置で切断する制限酵素
である。上記２種のオリゴヌクレオチドから作られる以
下の配列：

【００１９】

【化４】

【００２０】は、Bst XIによりＴＧＴＧ−３′，ＣＡＣ
Ａ−３′というお互いに相補的な末端を生じる。しか
し、例えば２分子のＴＧＴＧ−３′末端は相補的でない
ため、head-to-head連結は起こらない。同様にＣＡＣＡ
−３′末端もhead-to-head連結は起こらない。したがっ
て、配列（Ｉ）の前期プロモーターは配列番号：１の
３′末端にＴＧＴＧ−３′，配列番号：２の３′末端に
ＣＡＣＡ−３′を持つため記載のプロモーターは同一方
向でATI プロモーターと順方向にのみ連結がおこる。導
入し数個が連結した配列（Ｉ）の前期プロモーターは塩
基配列の決定によらないでも、制限酵素Ban HIによる消
化によっても連結している個数を決定することができ
る。

【００２１】複合プロモーター 本発明の複合プロモーターは前記の少なくとも１個のAT
I プロモーターと少なくとも１個の配列（Ｉ）からなる
前期発現プロモーターを含有すればよい。これら２種類
のプロモーターの順序はATI プロモーターの下流に前期
発現プロモーターが存在することからなる。これらのプ
ロモーターは必ずしも１個ずつである必要はなく、これ
らの両者又は一方を複数存在せしめることができる。例
えばATIプロモーター１個に対して配列（Ｉ）の前期発
現プロモーターを１〜３８個存在せしめ、この複合プロ
モーターの下流にCAT 遺伝子を存在せしめた場合、CAT
発現量が顕著に増加することが確認され、感染細胞の全
蛋白質の１５％にまでのぼった。B.MossらはJournal of
Molecular Biology, 210 (1989) p749-769 において前
期プロモーターの改変およびプロモーターを複数配列す
ることによる効果を述べているが、ATI プロモーターの
下流に連結することにより、プロモーター全体の発現量
が増加することには言及していない。

【００２２】ワクシニアウイルス 本発明の複合プロモーターを、ワクシニアウイルス中で
外来遺伝子、例えば外来抗原遺伝子の上流に存在せしめ
ることにより、該遺伝子を前期及び後期にわたって発現
せしめることができる。この様なワクシニアウイルスと
しては組換えワクシニアウイルスワクチンの製造におい
て常用される任意のワクシニアウイルス株を用いること
ができる。本発明の複合プロモーターにより発現せしめ
るウイルス遺伝子としては、例えば牛疫ウイルスのフュ
ージョン蛋白質遺伝子、牛疫ウイルスのヘマグルチニン
遺伝子、ウシ白血病ウイルス表面抗原遺伝子、成人Ｔ細
胞白血病ウイルス表面抗原遺伝子、エイズウイルス表面
抗原遺伝子、エイズウイルスのコア蛋白質遺伝子、サル
エイズウイルス表面抗原遺伝子、インフルエンザウイル
スのヘマグルチニン遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルスのエンベ
ロープ遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルスのNS１遺伝子等が挙げ
られるがこれらに限らない。

【００２３】組換えワクシニアウイルスの作製は常用の
相同性組換え法により行なうことができる。ワクシニア
ウイルスゲノム中の該ウイルスの増殖のために必須でな
い遺伝子、ヘマグルチニン（HA）遺伝子を含有するプラ
スミドの該遺伝子中に本発明の複合プロモーター及び任
意の外来遺伝子が挿入されている組換えプラスミドを作
製し、このプラスミドとワクシニアウイルスとの相同性
組換えにより、ワクシニアウイルスのゲノム中のHA遺伝
子中に前記複合プロモーター及び外来遺伝子が挿入され
た組換えワクシニアウイルスを作製することができる。

【００２４】組換えは常用のトランスフェクション法に
より行なうことができる。ワクシニアウイルスを培養さ
れた動物細胞、例えばサル腎臓細胞CV−１又はウサギ腎
臓細胞RK１３に感染せしめ、次にリン酸カルシウム法に
よりプラスミドをトランスフェクトし、候補組換えウイ
ルスを得る。次にこれらの候補ウイルスを動物細胞、例
えばRK１３細胞のモノレーヤーに感染せしめてプラーク
を形成せしめ、ニワトリ赤血球が吸着しない（HA^- ）ウ
イルスを選択する。

【００２５】

【発明の効果】本発明の複合プロモーターを用いて組換
えワクシニアウイルスを作製し、哺乳類由来の培養細胞
に感染させることによって、該組換えワクシニアウイル
スに組み込まれた外来遺伝子産物（外来蛋白質）を大量
に生産できる。生産された蛋白質は、哺乳類特有の糖鎖
の付加等の修飾を受けていることが期待できる。又、該
組換えワクシニアウイルスを哺乳類に接種することによ
り、従来の組換えワクシニアウイルス以上に効率的に免
疫を誘導できる。

【００２６】実施例１ ATI プロモーター含有プラスミ
ドの改変（図１） ワクシニアウイルスHA（血球凝集素）遺伝子〔Vivolog
y, 150, p.451-462 (1986) 〕内にATI プロモーター
（特開昭６１−２２２１９４）を含有するpSF とpSF ２
〔Journal of Vivology 65, p.5584-5588(1991) 〕を改
変して、マルチクローニング部位に制限酵素Bst XI認識
部位を導入した。具体的には、二種のオリゴヌクレオチ
ド： No. １ ５′−ＧＡＴＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧ−
３′（配列番号：３） No. ２ ５′−ＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＧ−
３′（配列番号：４） をホスホアミダイト法により合成した。０．１OD（３．
７μｇ）ずつの各オリゴヌクレオチドを別々に、５０mM
Tris-HCl（pH７．６），１０mM MgCl₂ ，１０mM２−
メルカプトエタノール、５０mM ATP 及び２μｌのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）製１０ユニッ
ト／μｌ）を含む全容２０μｌの反応混合物中で３７℃
にて１時間保温することによりキナーゼ処理を行った。
上記の反応混合物No. １とNo. ２をそれぞれ５μｌずつ
混合して７０℃にて２０分間加熱することにより酵素を
失活せしめると共にアニールせしめた。これにより制限
酵素Bst XI認識部位を有し、制限酵素Bam HI切断部位に
対する付着末端を二本鎖の両末端を形成するアニール生
成物：

【００２７】

【化５】

【００２８】を得た。３μｇのベクタープラスミドpSF
及びpSF ２のDNA を、１０mM Tris-HCl（pH８．０），
７mM MgCl₂ ，１００mM NaCl，２mM ２−メルカプト
エタノール及び１０ユニットの制限酵素Bam HIを含む５
０μｌの反応混合物中で３７℃にて２時間消化し、次に
１Ｍ Tris-HCl（pH８．０）中でアルカリホスファター
ゼ（大腸菌Ａ１９）（宝酒造（株）製）により、６５℃
にて１時間脱リン酸化反応を行った。反応混合物を２回
フェノール抽出し、１回フェノール／クロロホルム抽出
した後、エタノール沈殿によりDNA を回収した。このDN
A を３０μｌのTE緩衝液（１０mM Tris-HCl（pH８．
０），１mM EDTA）に溶解した。

【００２９】制限酵素Bam HIにより消化したpSF 及びpS
F ２のDNA ３０μｌのうち１μｌずつを前記のアニール
生成物２μｌと混合し、蒸留水を加え７．５μｌとした
後、TAKARAライゲーションキット（宝酒造（株）製）を
用いて連結反応を１６℃３０分間行った。このライゲー
ション反応液を用いて大腸菌DH５を形質転換した。形質
転換体に導入した制限酵素Bst XI認識部位を有する合成
DNA の有無についてはコロニーハイブリダイゼーション
法により確認を行った。ニトロセルロースフィルターに
写した大腸菌コロニーは１０％ SDSで３分間、０．５Ｍ
NaOHで５分間、１Ｍ Tris-HCl(pH７．５）で５分間、
及び１Ｍ Tris-HCl(pH７．５）／１．２５Ｍ NaCl で５
分間処理した。その後、８０℃にて９０分間処理して固
定した。固定後のニトロセルロースフィルターはMEGALA
BEL ^TMキット（宝酒造（株）製）にて３２Ｐで標識し
た、前記No. １のオリゴヌクレオチドをプローブとして
コロニー・ハイブリダイゼーションを行った。

【００３０】MEGALABEL ^TMキット（宝酒造（株）製）に
よる合成DNA の標識は、販社プロトコールにより、合成
DNA １０pmolを１０ｘPhosphory Iation Buffer １ulと
〔ｒ−３２ｐ〕ATP （２２２TBq ／mmol，３７０MBq ／
ml）５μｌをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニ
ット／μｌ）１μｌを混合し、全量１０μｌにした。３
７℃にて３０分間保温し、７０℃で１０分間加熱して酵
素を失活させた。

【００３１】１０mM Tris-HCl（pH７．５），０．３Ｍ
NaCl，１mM EDTAで平衡化したDEカラム（２００μ
ｌ）を用意し、１０μｌの反応液に５μｇのキャリアDN
A を加え、容量を１００μｌした後、カラムにチャージ
した。平衡化バッファーでカラムをよく洗ったあと、１
０mM Tris-HCl（pH７．５），２Ｍ NaCl，１mM EDTA
で溶出した。５００μｌずつ分画し、ピーク画分を集め
てプローブ溶液とした。

【００３２】固定されたフィルターは３×SSC ／０．１
％ SDSで室温５分洗い、同じ溶液で６５℃ １時間洗っ
た。プレハイブリダイゼーション溶液（６×SSC ／５×
Denhardt溶液／０．０５％ ピロリン酸ナトリウム／１
００μｇ／ml 煮沸したニシン精子 DNA ／０．５％
SDS ) 中に２３７℃で１時間保温した。ハイブリダイゼ
ーションは６×SSC ／１×Denhardt溶液／１００μｇ／
ml yeast tRNA／０．０５％ ピロリン酸ナトリウムの
溶液中で４８℃にて１０ngの³²ＰラベルのNo.１オリゴ
ヌクレオチドで１６時間保温した。洗いは６×SSC ／
０．０５％ ピロリン酸ナトリウムで１０分３回室温
で、次いで６×SSC ／０．０５％ ピロリン酸ナトリウ
ムで１０分３回４８℃で洗った。オートラジオグラフィ
ーにて検出を行なった。

【００３３】ハイブリダイゼーションの結果、陽性と判
定された大腸菌クローンについて、そのプラスミドDNA
を制限酵素Bst XIによる消化を行い、プラスミドDNA が
切断されるクローンをサンガー法により塩基配列を決定
した。制限酵素Bst XI認識部位を含む ATIプロモーター
に続くマルチクローニングサイトを下記に示す。

【００３４】

【化６】

【００３５】配列となっているクローンについて、pSFJ
１及び pSFJ２と命名した。

【００３６】実施例２ 改良型７．５プロモーターの合
成とpSFJ１又はpSFJ２への挿入 実施例１により作製したpSFJ１及びpSFJ２の制限酵素Bs
t XI認識部位に、合成した改良型７．５プロモーターを
挿入した。３μｇのプラスミドpSFJ１及びpSFJ２を制限
酵素Bst XI １０ユニットを用いて、１５０mM NaCl，
１０mM Tris-HCl（pH７．７），１０mM MgCl₂ ，１mM
DTT，１０μｇ／ml BSA反応液中にて５５℃にて４時間
反応させた。前記と同様な条件にてアルカリフォスター
ゼ処理を行った。

【００３７】合成オリゴヌクレオチド２種： No. ３ ５′−ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴ
ＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＧＧＴＧＴＧ−３′（配
列番号：１） No. ４ ５′−ＣＣＧＴＧＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＧＡＣ
ＴＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡ−３′（配
列番号：２） はホスホアミダイト法により合成し、前記と同じ条件に
て０．１ODの各オリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼによりキナーゼ処理を行った。

【００３８】反応生成物を７０℃にて酵素失活させると
ともに、アニールさせた。配列（Ｉ）で示される二本鎖
DNA を生成させ、制限酵素Bst XIにて消化したpSFJ１又
はpSFJ２とともに連結反応を行なった。pSFJ１又はpSFJ
２に対して、二本鎖の合成プロモーターをモル比１：１
００で連結反応を行うことにより、配列（Ｉ）を多数含
むクローンが得られた。大腸菌のクローンと、オリゴヌ
クレオチドNo. ３を実施例１と同様な方法（但し、ハイ
ブリダイゼーション後の２回目の洗いの際、４８℃を６
０℃にした）により標識して得たプローブとのコロニー
ハイブリダイゼーションにより、陽性クローンを多数得
た。

【００３９】陽性クローンについて通常のアルカリ法に
よりプラスミドDNA を調製し、得られたプラスミドDNA
を制限酵素Bam HIにて消化することで挿入された３８bp
の配列（Ｉ）の個数を決定した。また、塩基配列を決定
することで挿入配列の確認を行った。プラスミドpSFBに
配列（Ｉ）がそれぞれ１，４，１０，１６，２０個挿入
されたプラスミドをpSFJ１−１，pSFJ１−４，pSFJ１−
１０，pSFJ１−１６及びpSFJ１−２０と命名した。ま
た、pSFJ２に配列（Ｉ）がそれぞれ２，１６，３８個挿
入されたプラスミドはpSFJ２−２，pSFJ２−１６及びpS
FJ２−３８と命名した。

【００４０】実施例３ CAT 遺伝子を組込んだプラスミドの作製 図１にあるプラスミドpSFJ１−１，pSFJ１−４，pSFJ１
−１０，pSFJ１−１６，pSFJ１−２０，pSFJ２−２，pS
FJ２−１６，pSFJ２−３８の３μｇのDNA を、１０ユニ
ットの制限酵素SmaI，１００mM KOAc，２５mM Tris−
アセテート（pH７．６），１０mM MgOAc ，０．５mM
２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ml BSA の反応
液中で３０℃にて１晩反応させた。実施例１と同様、ア
ルカリフォスファターゼにより脱リン酸化反応を行っ
た。

【００４１】プロモーターの下流に挿入するクロラムフ
ェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（CAT ）遺伝
子については、プラスミドpSV₂ CAT（Gorman et al.,Mo
lecular and Cellular Biology 2 , p1044-1051, 198
2）をHind III及びSau ３ AIにより消化し、CAT 遺伝子
を含有する７９０bpのHind III−Sau ３ AI DNA 断片を
得た。

【００４２】Klenow断片により平滑末端化した後、前記
の制限酵素SmaIで消化、脱リン酸化したベクターDNA と
TAKARAライゲーションキットを用いて連結反応を行っ
た。各プロモーターの下流にCAT 遺伝子の挿入されたプ
ラスミドとして、pSFJ１−１ CAT，pSFJ１−４ CAT，pS
FJ１−１０ CAT，pSFJ１−１６ CAT，pSFJ１−２０ CA
T，pSFJ２−２ CAT，pSFJ２−１６ CAT及びpSFJ２−３
８ CATの各プラスミドを得た。

【００４３】実施例４ 組換えワクシニアウイルスの作製 組換えワクシニアウイルスを、R,Condit等、Ｖirology,
155，p 97-105, 1986に記載されている方法に従って、
イソ−Ｂ−チオセミカルバゾン（IBT ）依存性ワクシニ
アウイルスWR株を感染させた細胞にワクシニアウイルス
野生型のWR株のゲノムDNA 及び実施例３で得た各組換え
プラスミドを同時トランスフェクションすることにより
作製した。

【００４４】ゲノムDNA の調製は次の様にして行った。
１４本のルー（Roux）ボトルにCOS７細胞を増殖せし
め、これにワクシニアウイルスを野生型WR株を感染せし
めた。ワクシニアウイルス感染細胞を５０mlコーニング
チューブに移し、４℃２０００rpm にて１０分間遠心分
離し、上清を得た。残った沈殿を１０mlの１０mM Tris
-HCl（pH８．０）に懸濁し、氷上で１５秒ずつ３回超音
波処理した。

【００４５】これを２０００rpm にて１０分間遠心分離
し、上清を得、これを前記の上清と一緒にした。この上
清を９０００rpm （８０００×Ｇ）にて３０分間遠心
し、沈殿を１０mlのTris-HCl（pH８．０）に懸濁した。
この懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超音波処理し、これ
を３６％ショ糖溶液に上置して１４０００rpm （２８０
００×Ｇ）にて８０分間遠心し、沈殿を得た。この沈殿
を２mlの１０mM Tris-HCl（pH８．０）に懸濁し、この
懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超音波処理した。

【００４６】この超音波処理物を４℃、１２０００rpm
（２００００×Ｇ）にて４５分間、ショ糖密度勾配遠心
（２０％〜４０％）にかけ、沈殿を分離した後、バンド
を別の遠心チューブに移し、２０mlの１０mM Tris-HCl
（pH８．０）に溶解して４℃、２００００rpm （５５０
００×Ｇ）にて３０分間遠心し沈殿を得た。この沈殿を
前記の沈殿とに２mlの１０mM Tris-HCl（pH８．０）に
懸濁し、この懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超音波処理
した。

【００４７】この超音波処理物を４℃１２０００rpm
（２００００×Ｇ）にて４５分間のショ糖密度勾配遠心
（２０％〜４０％）にかけ、バンドを別の遠心チューブ
に移し、そして２０mlの１０mM Tris-HCl（pH８．０）
に溶解した。この溶液を、４℃、２００００rpm （５５
０００×Ｇ）にて３０分間遠心し、沈殿を得た。この沈
殿を５００μｌの５０mM Tris-HCl（pH７．５）に溶解
し、氷上で１５秒間超音波処理し、２６０nmの吸光度に
より測定した場合、合計２５０μｇのDNA を含有するウ
イルス粒子を得た。

【００４８】このウイルス粒子を、１０mM Tris-HCl
（pH７．８），５mM EDTA及び０．５％SDS を含有する
溶液中で５０μｇ／mlのプロティネースＫと共に３７℃
にて一夜保温することによりウイルスDNA を抽出した。
この反応混合物をフェノール／クロロホルムで３回抽出
し、そして水飽和ジエチルエーテルで２回抽出した後、
エタノール沈殿によりDNA を沈殿せしめた。このDNA を
TEに溶解して一夜放置した後、トランスフェクションの
材料として使用した。

【００４９】直径３．５cmのプラスチックシャーレにCV
−１細胞をコンフルエントに増殖させ、この細胞にIBT
依存性ワクシニアウイルスWR株をm.o.i. ０．１で感染
せしめ、１時間後に、リポフェクチン法により沈殿せし
めた。前記のワクシニアウイルス野生型WR株の１０μｇ
のゲノムDNA と、実施例３で作成した１０μｇの組換え
プラスミド８種類のうちのいずれかとを混合して前記細
胞にDNA を導入した。３７℃にて４８時間保温し、プラ
ーク形成せしめた。

【００５０】これに０．５％ニワトリ赤血球、及びPBS
溶液を加え、赤く染色しないプラークを選択した。相同
性組換えにより生じた組換えワクシニアウイルスは、HA
遺伝子が欠損しているので赤血球を凝集しない。単一プ
ラークを単離し、２回クローニングして組換えワクシニ
アウイルスを純化し、各プラスミドに対応する組換えワ
クシニアウイルスを得た。

【００５１】実施例５ 組換えウイルスによるCAT の発現 本発明の組換えウイルス、並びに特開平２−１８６９９
２に記載のベクターpSFA１．pSFA３，pSFB１，pSFB４及
びpSFB５（３６bpの合成７．５Ｋプロモーターを５個含
むベクター）にCAT 遺伝子を組込んだプラスミドから得
られた組換えウイルスを用いて、DNA 複製阻害剤である
アラビノシルシトシン（Ara −Ｃ）を４０μｇ／mlの濃
度で含有する培地、及びAra −Ｃを含有しない培地での
CAT の発現を調べた。なおAra −ＣはDNA の複製を阻害
するため、その存在下ではウイルスDNA の複製が阻害さ
れ、その結果ウイルスDNA の複製後にのみ機能する後期
プロモーターによるCAT 遺伝子の発現が抑制される。

【００５２】RK１３細胞を直径６cmのプラスチックシャ
ーレ中でコンフルエントに増殖せしめ、前記ウイルスを
m.o.i. １０で感染させた後、２４時間、３６時間、４
８時間培養し、細胞を回収した。各培養からの細胞を５
００μｌの０．２５Ｍ Tris-HCl（pH７．８），０．５
％ TritonX −１００に懸濁し、この懸濁液を用いてCA
T 活性を測定した。反応組成は ５μｌ 細胞懸濁液 ７０μｌ １Ｍ Tris-HCl（pH７．８） ５４μｌ 蒸留水 ２０μｌ ４mM アセチルCoA １μｌ ¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール（NEN 社製、
０．１mCi ／ml） とした。

【００５３】この反応混合物を３７℃にて１０分間保温
した後、ただちに酢酸エチルによりクロラムフェニコー
ル及びアセチル化されたクロラムフェニコールを抽出し
て反応を停止した。抽出物を薄層クロマトグラフィーに
より分離し、オートラジオグラフィーにかけてスポット
の位置を確認した。それぞれのスポットの放射能を液体
シンチレーションカウンターのより測定し、アセチル化
されたクロラムフェニコールの比率を求め、これをCAT
活性とした。この結果を表１及び表２に示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】数字はアセチル化されたクロラムフェニコ
ールの比率（％）を示す。ベクターはCAT 遺伝子を挿入
したプラスミド名を示す。Ara −Ｃ非存在下でのCAT 活
性はATI プロモーター及び合成プロモーターの両者によ
る発現の結果を表し、Ara −Ｃ存在下でのCAT 活性は合
成プロモーターによる発現の結果を表す。本発明のプロ
モーターを含むベクターは合成プロモーターの個数に依
存してその発現を高くすることができた。特に、AraC存
在下の発現はpSFJ１−１０，pSFJ１−１６で高く、HA遺
伝子と逆方向のプロモーター配列で前期遺伝子の発現が
高められる。AraC非存在下では、pSFJ２−１６及びpSFJ
２−３８のベクターで発現が高い。従って、前期遺伝子
の発現を高めたい際にはpSFJ１−１０又はpSFJ１−１６
を用いるのが望ましく、全体の発現量を高めたい際には
pSFJ２−１６又はpSFJ２−３８を用いることが望ましい
が、これに限らない。

【００５６】

【表２】

【００５７】数字は前記反応混合物をSDS −ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、クマシーブルー染色後 CAT蛋
白に相当するバンドをレーザー測定し、全蛋白量中のCA
T 蛋白の占める割合について２４時間、３６時間、４８
時間について行なったものである。数字はその全蛋白量
中の割合（％）を示す。

【００５８】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖又は二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： AAAAATTGAA AAACTAGTCT AATTTATTGC ACGGTGTG 38

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖又は二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： CCGTGCAATA AATTAGACTA GTTTTTCAAT TTTTCACA 38

【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖又は二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： GATCCCATTG TGCTGG 16

【００６１】配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖又は二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： GATCCCAGCA CAATGG 16

【００６２】配列番号：５ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： GGATCCCATT GTGCTGGGAT CCCCGGGTAC CGAGCTCGAA TTC 43

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドpSFJ１及びpSFJ２の作製過
程並びにpSFJ１−１，pSFJ１−４，pSFJ１−１０，pSFJ
１−１６，pSFJ１−２０，pSFJ２−２，pSFJ２−１６及
びpSFJ２−３８の作製過程を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 志田 壽利 京都府京都市左京区岩倉三宅町303−２

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ATI プロモーター及び前期発現プロモー
   ター配列を含んでなるポックスウイルスプロモーターで
   あって、該プロモーターの下流に外来構造遺伝子が連結
   された場合に該構造遺伝子をウイルス感染前期及び後期
   にわたって発現することができるプロモーター。
2. 【請求項２】 ATI プロモーター及び、以下の配列
   （Ｉ）をこの順序で含んでなる、請求項１に記載のプロ
   モーター。 【化１】
3. 【請求項３】 上記配列が１〜３８個存在する、請求項
   １又は２に記載のプロモーター。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のプロモーターが組み込
   まれたポックスウイルス血球凝集素（HA）遺伝子を含ん
   で成るベクター。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のプロモーター、及び該
   プロモーターの下流に連結された外来遺伝子を含んで成
   るワクシニアウイルス。