CN109797162A - 马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法，是将马铃薯卷叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒双35S启动子的pCB301双元载体中构建得到。本发明首次制备得到了能通过农杆菌浸润方法接种并稳定高效侵染本氏烟、马铃薯等寄主植物的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆，对于马铃薯卷叶病毒病的防治具有重要的意义。

Description

马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法。

背景技术

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus；PLRV)是马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的代表种，侵染马铃薯后引起幼叶沿叶脉上卷、黄化，叶片基部变紫及块茎网状坏死等症状，是影响我国马铃薯生产最严重的病毒之一。

PLRV主要局限于寄主韧皮部中，由蚜虫以持久性方式传播。PLRV不能通过摩擦进行机械传播，但可以通过农杆菌介导的接种进行侵染。因此获得马铃薯卷叶病毒的侵染性克隆具有广泛应用前景。

侵染性克隆是指将病毒全长基因组序列构建在特定载体上，且具有侵染宿主的功能。根据病毒基因组(DNA或RNA)类型不同，通常分为全长DNA侵染性克隆或全长cDNA侵染性克隆。但全长性的侵染性cDNA克隆构建技术性较强，构建植物病毒侵染性克隆存在诸多的技术难点，例如：1)由于不同植物病毒的基因组结构不同，构建病毒侵染性克隆时首先需要将病毒RNA反转录成cDNA，然后根据第一链cDNA合成全长DNA，对于基因组较长的病毒来说，由于RNA纯度、反转录酶及DNA聚合酶扩增效率的问题难以合成全长的DNA。2)在构建病毒侵染性克隆的过程中，在病毒基因组5’端和3’端引入非病毒核苷酸序列也会对转录物的侵染性产生很大影响，使侵染性降低甚至丧失。3)RNA病毒基因组转变为cDNA后需要克隆到载体中才能进行体外转录，但并不是任何载体都能克隆全长病毒基因组，因此载体的选择非常重要。4)合成的cDNA转入宿主菌时很不稳定，特别是基因组较大的RNA病毒，从而导致侵染性克隆很难获得。基于上述原因，目前只有为数不多的植物病毒获得了侵染性克隆，而迄今为止仍未见关于构建马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法。本发明构建的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆能够稳定高效的侵染本氏烟、马铃薯等寄主植物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

(1)从马铃薯卷叶病毒侵染的发病株中提取植物总RNA，对获得的总RNA进行反转录合成cDNA；

(2)以步骤(1)合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，获得PLRV全基因组序列；

(3)将花椰菜花叶病毒的35S启动子克隆到pCB301载体上，获得含有双35S启动子的pCB301载体；

(4)利用同源重组的方法将PLRV全基因组序列克隆到pCB301载体35S启动子的下游，即得到马铃薯卷叶病毒侵染性克隆。

优选的，步骤(1)中，利用随机引物和SEQ ID NO.4所示的引物对获得的总RNA进行反转录；更优选的，所述随机引物的序列为：5'-NNNNNN-3'，N＝G、A、T or C。

优选的，步骤(1)中，反转录的程序为：将模板RNA、随机引物、SEQ ID NO.4所示的引物和RNase free dH₂O混合，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬间离心；再加入HiScriptⅡBuffer、dNTP、Hiscript II Reverse Transcriptase和RNA酶抑制剂；25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min；终止反应。

优选的，步骤(2)中，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得PLRV1-3161nt片段；利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行PCR扩增，获得PLRV3162-5882nt片段。

优选的，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：

1)98℃，预变性，30s；

2)98℃，变性，10s；62℃，退火，30s；72℃，延伸，2min；共32个循环；

3)72℃，后延伸，10min。

优选的，步骤(3)中，利用同源重组的方法分两次将PLRV全基因组序列克隆到pCB301载体35S启动子的下游，即：第一次连接PLRV1-3161nt片段，得到质粒pCB-PLRV₃₁₆₁；第二次将PLRV3162-5882nt片段连接到质粒pCB-PLRV₃₁₆₁上，获得含有PLRV全基因组的侵染性克隆。

本发明的第二方面，提供上述方法构建的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆，命名为pCB-PLRV；所述马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的第三方面，提供上述马铃薯卷叶病毒侵染性克隆在使植株获得交叉保护中的应用。

本发明的第四方面，提供一种重组农杆菌菌株，由上述的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆导入到农杆菌中获得。

本发明的有益效果：

本发明首次制备得到了能通过农杆菌浸润方法接种并稳定高效侵染本氏烟、马铃薯等寄主植物的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆，对于研究马铃薯卷叶病毒致病机制及病害的防治具有重要的意义。

附图说明

图1：pCB-PLRV侵染性克隆载体构建策略。

图2：pCB-PLRV侵染性克隆的侵染性鉴定。

图3：pCB-PLRV侵染性克隆侵染寄主后PCR检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术中所介绍的，由于全长侵染性cDNA克隆的构建涉及的技术性较强，其构建过程中存在病毒基因组对大肠杆菌有毒性、构建克隆无侵染性以及载体不稳定等难题，目前关于RNA病毒侵染性克隆方面的报道不多，有关马铃薯卷叶病毒侵染性克隆更是未见报道。

由于马铃薯卷叶病毒严格由蚜虫传播，寄主体内含量低，主要集中于维管束中，难于大量提纯，致使其分子生物学研究进展缓慢。本发明首次构建了马铃薯卷叶病毒侵染性克隆。在本发明的一个实施方案中，所给出的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的构建方法具体如下：

a.利用TRIzol法从马铃薯卷叶病毒侵染的马铃薯叶片中提取总RNA。用随机引物(5'-NNNNNN-3')对获得的总RNA进行反转录合成cDNA。

b.设计马铃薯卷叶病毒特异性引物，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，获得PLRV全基因组序列。

c.利用同源重组的方法分两次将PLRV基因组克隆到pCB301载体35S启动子下游，第一次连接基因组的1-3161nt片段，得到质粒pCB-PLRV₃₁₆₁。第二次将3162-5882nt片段连接到pCB-PLRV₃₁₆₁上，获得含有PLRV全基因组的克隆pCB-PLRV。

d.通过农杆菌浸润方法接种寄主植物，观察症状及检测。

目前只有为数不多的病毒构建了侵染性克隆，可能是侵染性的cDNA主要由真核生物基因的复制、表达调控信号所控制，而不是由克隆载体中所使用的启动子(如35S启动子)来控制的。由于马铃薯卷叶病毒侵染性克隆系本发明首次构建得到，现有技术中无相关资料可供参考，因此在构建过程中存在诸多的技术难点。

要构建侵染性cDNA克隆，首先是如何正确的获得病毒全基因组，本发明获得马铃薯卷叶病毒全基因组的主要难点有(1)马铃薯卷叶病毒基因组3‘端无poly A尾，获得最末端序列对是否具有侵染性十分关键；(2)马铃薯卷叶病毒局限在维管束部位，病毒积累水平较低，提取的RNA中含有全长RNA基因组的含量较低，一次性扩增马铃薯卷叶病毒基因组难度较高；(3)病毒自身复制酶没有校正功能，在复制过程中会出现没有侵染性的序列，因此在构建过程中会出现虽然具有全长序列但没有侵染性的情况，本研究获得的侵染性克隆具有侵染性。

马铃薯卷叶病毒局限在维管束部位，病毒积累水平较低，提取病毒粒体难度较大。本申请是直接以提取的植物总RNA为模板，用随机引物(5'-NNNNNN-3')和设计的引物(SEQID NO.4)组合使用对获得的总RNA进行反转录，获得cDNA模板，解决了马铃薯卷叶病毒在寄主体内含量低、难以进行提纯的问题。另外，由于提取的马铃薯卷叶病毒RNA中含有全长RNA基因组的含量较低，一次性扩增马铃薯卷叶病毒基因组难度较高。本发明采用两段克隆的方法获得马铃薯卷叶病毒全基因组序列，再利用同源重组的方法分两次将PLRV基因组克隆到双元载体中，解决了马铃薯卷叶病毒全基因组序列难以克隆的难题。

构建马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的另一技术难点在于将PLRV全基因组序列克隆到双元载体当中，并且能够保证获得的克隆在寄主上具有侵染性。构建的克隆无侵染性以及载体不稳定等难题是限制病毒表达载体构建的瓶颈。个别表达载体在插入病毒序列后会产生对宿主菌有毒性，因此，表达载体的选择非常重要。由于现有技术中表达载体的种类众多，如何从如此多的表达载体中选择适合构建西瓜花叶病毒侵染性克隆的载体难度很大，本发明发现，pCB301载体特别适合于西瓜花叶病毒侵染性克隆的构建，pCB301载体中含有双35S启动子，双启动子可以增强在接种部分侵染性克隆的转录水平，从而提高侵染性克隆的侵染性，以pCB301为载体构建的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆对寄主的侵染性达100％；而以其他的表达载体构建马铃薯卷叶病毒侵染性克隆则存在克隆不稳定、在寄主上不具有侵染性等问题。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

其中本发明将表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法等。本发明实施例中所采用的方法未做详细说明的均为本领域现有技术。

本发明实施例中所采用的引物序列如下表：

引物1和2应用于扩增马铃薯卷叶病毒5'端1-3161nt片段，引物3和4应用于扩增3'端3162-5882nt片段，引物5和6应用于扩增pCB301载体，引物7和8应用于扩增pCB-PLRV₃₁₆₁。

实施例1：马铃薯卷叶病毒RNA的提取

利用TRIzol法提取植物总RNA，提取方法参照植物RNA提取试剂盒说明。

取0.1g马铃薯卷叶病毒侵染的马铃薯病叶，加入至预冷的研钵，液氮研磨成粉状后迅速转移至灭菌的1.5ml离心管中，加入1mL TRIzol剧烈震荡30s。室温孵育5min后加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后室温孵育3min。4℃，10000g离心15min后取上层水相0.5ml于新的离心管中，加入0.5ml异丙醇颠倒混匀，室温孵育10min。4℃，10000g离心10min后去上清，加入1ml 75％乙醇剧烈震荡。4℃，7500g离心5min后小心吸取上清液，弃上清，将沉淀室温干燥5min。加50μL RNA溶解液。60℃孵育10min，-80℃保存备用。

实施例2：马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的构建

以实施例1中获得的病毒RNA为模板，以随机引物和引物4进行反转录。反转录反应程序如下：

65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬离。

25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min终止反应。以所得反转录产物(cDNA)为模板，使用Phusion高保真聚合酶进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

反应程序：

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收备用，获得PLRV 1-3161bp片段PCR产物。利用引物5和6扩增pCB301载体序列，退火温度60℃，延伸时间3min，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。与前面获得的PLRV 1-3161nt片段PCR产物进行同源重组获得重组质粒，命名为pCB-PLRV₃₁₆₁。利用引物3和4扩增PLRV 3162-5882nt片段(其PCR反应体系与利用引物1和引物2进行扩增的反应体系和条件是一致的)，退火温度62℃，延伸时间2min。以重组质粒pCB-PLRV₃₁₆₁为模板，利用引物7和8进行扩增，与获得的PLRV 3162-5882nt片段进行同源重组，获得含有PLRV全基因组的克隆pCB-PLRV(图1)，序列如SEQ ID No.9所示。

实施例3：pCB-PLRV侵染性效果测定

将pCB-PLRV质粒转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)(50μL)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)(1μL)及与上步相同抗生素的LB培养基中，于28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于农杆菌菌体重悬溶液(10mmol/L MgCl₂(100mL)，10mmol/L MES(1mL)，0.15μmol/L AS(150μL))中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5-0.6之间，室温静置3小时。取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，浸润本氏烟、马铃薯。每株浸润2片叶。浸润两周后植株表现典型PLRV症状(图2，图3)。

结果表明，本发明构建的pCB-PLRV具有很好的侵染性，能成功的侵染本氏烟和马铃薯，侵染效率达100％。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法

<130> 2019

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacaaaagaa taccaggagg aattgc 26

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagttctcga cctacctcga c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaattctgtt cacacatctt cag 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actacacaac cctgtaagag gatc 24

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtaggtcgag aactcgagct cgaatttccc cgat 34

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctggtattct tttgtcctct ccaaatgaaa tgaacttc 38

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acagggttgt gtagtgagct cgaatttccc cgat 34

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgtgaacag aattcgagtt ctcgacctac ctcgac 36

<210> 9

<211> 10391

<212> DNA

<213> 含有PLRV全基因组的克隆pCB-PLRV

<400> 9

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tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 180

aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaaa 240

gaatgcctct accgacagtg gtcccaaaga tggacccccc acccacgagg aacatcgtgg 300

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg 360

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ctattgagac tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 480

tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca 540

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aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 720

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca aaagaatacc 780

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tatgagtgcc ttgagtgggg attactctgc ggcacccacc ccgctataca aatcgtgggc 1140

tctaccatcg tcattaaact tgacgaccca accactgccg ccgcttacag atcggagcta 1200

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ttaattttgc tcggttgtat aaccagcttg atctacaagg gcgcgctaag tctttcagag 1500

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gaaggcgctt tcgcaacgtc gttgaaaact ggaaacagga ttccgatgtc gactttcttt 1800

cccattttca aaagtgcccg taatgatatc tccatactag taggtccacc caactgggaa 1860

ggtctactat cagtcaaagg agctcatttc attacagctg acaaaatcgg caaaggtcct 1920

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ttttggtctt caaagaatct gcttggtgtg cttaaaggct tcccactgga agaggagtgt 2100

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tttgagtcga ccgccgtaaa aggccgcgtc ttctcggacg aagctgtgaa agagctagag 2220

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acaaacggca actccgacat cctcgacgcc gctacaagcg caccaccaat ggacaaaatg 2520

gtcgaacaga tcatcacagc tatggtgggg agaatcaatc tctcggagat agaggagaag 2580

atagtgagca gggtgtctca gaaagccctg cagaagccca aacaaaagaa gcgcggaagg 2640

cgtggaggga agaacaagct aaacagttca cctcctactt caacgcaatc tacaagtggg 2700

gcgcccaaga aggaggctgc cccccaggct tcaggaagtg cgggcacatc ccgcgctact 2760

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gcgcagaagc aagaaagcgc gtgattgaga aaacagtgga ggcatacaaa aattgtgtaa 3000

ctaacgcccc actgtgctcc ctcaaatcca aactggattg ggctggcttt caacaagata 3060

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tggaggatga tatggaggtg aggaatcgcc tgacatttaa taacacccag ctcaccaagc 3660

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ctttacttgc ccaaactgtt cccggtgtgc aaaagagcgg aagttacaat acaagttcct 3780

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tgggggacga tgctctcgaa gctcccaact ccgacctgga ggagtataaa acactaggtt 3900

tcaaagtcga ggtaggtcga gaactcgaat tctgttcaca catcttcaga aatccgaccc 3960

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agcgcctact gatgggcgat tctttctcgt tggtcccgct atccagaaaa ccgcaaagta 5580

taactatact atttcatacg gtgactggac agaccgagac atggaactgg ggctgatcac 5640

cgtggtgctt gatgaacatt tagaaggcac tggttcggct aacagagtgc ggcggccccc 5700

acgggagggc cacacctata tggcctcgcc gcgcgaaccg gaaggaaaac cggttggaaa 5760

taaaccaagg gacgaaaccc cgatacaaac gcaggaaaga caacctgatc aaactccgtc 5820

tgacgacgta tccgatgctg gttcggtaaa cagcggcggc tcaactgagt cgctgcgatt 5880

ggagttcggg gcaaattcag atagtaccta cgatgctaca gtcgatggta cagactggcc 5940

cagaattcct ccaccaaggc acccacctga acctagagtt ttcggcaatt caagaactgt 6000

taccgacttt tctccggaag ccgatctatt agaaaattgg gatgccgaac acttcgaccc 6060

tggttattcc aaagaagatg tcgctgctgc tactattata gcgcacggca gtattcaaga 6120

tgggcgaagt atgttggaga agagagagga aaatgtcaag aacaaaacct cctcctggaa 6180

gcccccgtta cctaaagcgg tgagcccagc catagccaaa ttgcgctcga ttcgcaaatc 6240

ccaacccctc gagggaggga cccttaagaa agatgccact gatggtgtct catctattgg 6300

cagtggttct ctaacaggtg gcacgcttaa gaggaaggta agtattgaag agcgtttact 6360

gcagacctta acaactgagc aaaggctgtg gtacgagaat ttgaagaaaa ctaaccctcc 6420

agctgctacc caatggctgt ttgaatatca gccacctccc caagtagata gaaatatagc 6480

tgaaaagcca tttcaaggga ggaaatgagt cgactcacga cttaaaactg agtgtccgcc 6540

ggacattaag cggaacgaaa gccgaaaggt gattaggctc tcaacgcctg ctagagaccg 6600

tcgaaggacg cgactgtgta gccaggatcc tcttacaggg ttgtgtagtg agctcgaatt 6660

tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc 6720

ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt 6780

aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt 6840

aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt 6900

catctatgtt actagatcgg aattcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taaactatca 6960

gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataat 7020

cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa 7080

ccacaggaga tctcagtaaa gcgctggctg aacccccagc cggaactgac cccacaaggc 7140

cctagcgttt gcaatgcacc aggtcatcat tgacccaggc gtgttccacc aggccgctgc 7200

ctcgcaactc ttcgcaggct tcgccgacct gctcgcgcca cttcttcacg cgggtggaat 7260

ccgatccgca catgaggcgg aaggtttcca gcttgagcgg gtacggctcc cggtgcgagc 7320

tgaaatagtc gaacatccgt cgggccgtcg gcgacagctt gcggtacttc tcccatatga 7380

atttcgtgta gtggtcgcca gcaaacagca cgacgatttc ctcgtcgatc aggacctggc 7440

aacgggacgt tttcttgcca cggtccagga cgcggaagcg gtgcagcagc gacaccgatt 7500

ccaggtgccc aacgcggtcg gacgtgaagc ccatcgccgt cgcctgtagg cgcgacaggc 7560

attcctcggc cttcgtgtaa taccggccat tgatcgacca gcccaggtcc tggcaaagct 7620

cgtagaacgt gaaggtgatc ggctcgccga taggggtgcg cttcgcgtac tccaacacct 7680

gctgccacac cagttcgtca tcgtcggccc gcagctcgac gccggtgtag gtgatcttca 7740

cgtccttgtt gacgtggaaa atgaccttgt tttgcagcgc ctcgcgcggg attttcttgt 7800

tgcgcgtggt gaacagggca gagcgggccg tgtcgtttgg catcgctcgc atcgtgtccg 7860

gccacggcgc aatatcgaac aaggaaagct gcatttcctt gatctgctgc ttcgtgtgtt 7920

tcagcaacgc ggcctgcttg gcctcgctga cctgttttgc caggtcctcg ccggcggttt 7980

ttcgcttctt ggtcgtcata gttcctcgcg tgtcgatggt catcgacttc gccaaacctg 8040

ccgcctcctg ttcgagacga cgcgaacgct ccacggcggc cgatggcgcg ggcagggcag 8100

ggggagccag ttgcacgctg tcgcgctcga tcttggccgt agcttgctgg accatcgagc 8160

cgacggactg gaaggtttcg cggggcgcac gcatgacggt gcggcttgcg atggtttcgg 8220

catcctcggc ggaaaacccc gcgtcgatca gttcttgcct gtatgccttc cggtcaaacg 8280

tccgattcat tcaccctcct tgcgggattg ccccgactca cgccggggca atgtgccctt 8340

attcctgatt tgacccgcct ggtgccttgg tgtccagata atccacctta tcggcaatga 8400

agtcggtccc gtagaccgtc tggccgtcct tctcgtactt ggtattccga atcttgccct 8460

gcacgaatac cagcgacccc ttgcccaaat acttgccgtg ggcctcggcc tgagagccaa 8520

aacacttgat gcggaagaag tcggtgcgct cctgcttgtc gccggcatcg ttgcgccaca 8580

tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc 8640

ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt cttccccgat atcctccctg 8700

atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga 8760

tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc caggtcgccg 8820

tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta aaaaatcata cagctcgcgc 8880

ggatctttaa atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta 8940

ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc tattcgtata gggacaatcc 9000

gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat acagctcgat aatcttttca 9060

gggctttgtt catcttcata ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc 9120

agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct 9180

tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg 9240

ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca 9300

ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt cgatcagttt tttcaattcc 9360

ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga 9420

taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc actgttcctt gcattctaaa 9480

accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg tataacatag 9540

tatcgacgga gccgattttg aaaccacaat tatgggtgat gctgccaact cgagagcggg 9600

ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg 9660

cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag 9720

gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg 9780

acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg 9840

tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg 9900

cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt 9960

cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat 10020

ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt 10080

cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac 10140

acggcttcga cggcgtttct ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg 10200

cgagggcaac cagcccggtg agcgtctagt ggactgatgg gctgcctgta tcgagtggtg 10260

attttgtgcc gagctgccgg tcggggagct gttggctggc tggtggcagg atatattgtg 10320

gtgtaaacaa attgacgctt agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact 10380

ggggtggttt t 10391

Claims (10)

1.一种马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从马铃薯卷叶病毒侵染的发病株中提取植物总RNA，对获得的总RNA进行反转录合成cDNA；

(2)以步骤(1)合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，获得PLRV全基因组序列；

(3)将花椰菜花叶病毒的35S启动子克隆到pCB301载体上，获得含有双35S启动子的pCB301载体；

(4)利用同源重组的方法将PLRV全基因组序列克隆到pCB301载体35S启动子的下游，即得到马铃薯卷叶病毒侵染性克隆。

2.权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，利用随机引物和SEQ ID NO.4所示的引物对获得的总RNA进行反转录；

优选的，所述随机引物的序列为：5'-NNNNNN-3'，N＝G、A、T or C。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，反转录的程序为：将模板RNA、随机引物、SEQ ID NO.4所示的引物和RNase free dH₂O混合，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬间离心；再加入HiScript Ⅱ Buffer、dNTP、Hiscript II ReverseTranscriptase和RNA酶抑制剂；25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min；终止反应。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，利用SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得PLRV1-3161nt片段；利用SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的引物进行PCR扩增，获得PLRV3162-5882nt片段。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：

1)98℃，预变性，30s；

2)98℃，变性，10s；62℃，退火，30s；72℃，延伸，2min；共32个循环；

3)72℃，后延伸，10min。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，利用同源重组的方法分两次将PLRV全基因组序列克隆到pCB301载体35S启动子的下游，即：第一次连接PLRV1-3161nt片段，得到质粒pCB-PLRV₃₁₆₁；第二次将PLRV3162-5882nt片段连接到质粒pCB-PLRV₃₁₆₁上，获得含有PLRV全基因组的侵染性克隆。

7.利用权利要求1-6任一项所述的方法构建的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆。

8.根据权利要求7所述的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆，其特征在于，所述马铃薯卷叶病毒侵染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

9.权利要求8或9所述的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆在使植株获得交叉保护中的应用。

10.一种重组农杆菌菌株，其特征在于，由权利要求8或9所述的马铃薯卷叶病毒侵染性克隆导入到农杆菌中获得。