CN112626110A - 一种tmv侵染性克隆载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法，构建得到的TMV侵染性克隆载体为pCB‑TMV‑SY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为11275bp，可应用于研究TMV与寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等方面。本发明的有益之处在于：构建方法简便、新颖，克服了酶易失活等传统双酶切构建载体方法的缺陷，构建得到侵染性克隆载体只侵染植物，对动物、人体相对安全，为研究基因合成定点突变提供了条件，实现了载体在宿主中高效表达外源蛋白、高效侵染烟草和辣椒等植物的目的，可应用于药效机理研究和效能检测等多个方面。

Description

一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域技术领域，涉及植物病毒侵染性克隆载体构建技术，特别涉及是一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)属于烟草花叶病毒属(genusTobamovirus)成员，TMV的基因组是单链的，编码至少4个开放阅读框(ORF)，包括126kDa和183kDa的复制酶蛋白，30kDa运动蛋白(MP)和17.5kDa外壳蛋白(CP)，该病毒寄主范围广，严重威胁着烟草，番茄，马铃薯等作物的生产，给农业生产造成了重大的经济损失。

植物RNA病毒cDNA侵染性克隆已经作为植物RNA病毒分子实验研究中的一种常用技术。是植物RNA病毒反向遗传学研究的前提和基础，对cDNA侵染性克隆进行点突变，缺失突变或插入突变可以研究病毒的基因编码策略，研究其编码基因的功能，研究基因组上非编码序列对病毒基因组RNA复制和转录的调控等，现今对于植物正义RNA病毒的广泛研究正是得益于cDNA侵染性克隆的成功构建和应用。RNA病毒cDNA侵染性克隆还可以应用于表达载体，开发植物生物反应器等。植物病毒cDNA侵染性克隆载体具有表达时间快，表达量多的特点，比转基因方法在植物体内表达外源基因更方便快捷，而且侵染性克隆的构建可使病毒在体内更加稳定不易突变，比野生型病毒更具稳定性和可重复性，现已广泛应用于药效检测等研究。

现有技术的侵染性克隆构建方式为：分别对载体和片段进行双酶切，之后再将酶切产物进行连接，进而构建获得侵染性克隆载体。这种方法虽然得到了广泛的应用，但是也存在一些无法逾越的技术缺陷，例如，操作过程复杂、繁琐，容易造成操作失误；因不可控因素导致的酶失活问题；容易出现错配，目前的载体收率低等问题。

因此，需要开发一种操作简单、构建效率高，收率高的TMV侵染性克隆载体构建方法，进而实现载体在体外的高效表达，为进一步研究TMV和寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等提供有效的工具。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法，该构建方法设计特异性引物首次通过一步法PCR扩增和同源重组连接的方式，以花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子为基础，以pCB301为载体，通过同源重组的方式插入TMV沈阳分离物全序列TMV-SY构建了 pCB-TMV-SY侵染性克隆载体，该载体为研究TMV和寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等提供了有效的工具。

本发明提供了一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以所述总RNA作为模板进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的所述cDNA为模板，TMV+ 和TMV-为引物，使用Primestar GXL DNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为 6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且所述TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)二元载体pCB301的获得：以含有35S启动子的质粒pCB301作为模板，TMV3-Rb+和TMV5-35S为引物进行PCR扩增，得到长度为4920bp 的DNA片段，即为二元载体pCB301，且所述二元载体pCB301的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的获得：使用连接试剂盒将所述TMV-SY片段和所述二元载体pCB301进行连接，即将所述TMV-SY片段插入所述二元载体pCB301的35S启动子和35S终止子之间，构建得到一种 TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY。

进一步的，步骤(1)中所述反转录过程是利用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒完成的。

进一步的，步骤(1)中所述TMV+的核苷酸序列为5’-GTATTTTTACAACAA TTACC-3’，所述TMV-的核苷酸序列为5’-TGGGCCCCTACCGGGGGTAAC-3’。

进一步的，步骤(2)中所述TMV3Rb+的核苷酸序列为5’-TTACCCCCGGTAGGGGCCCAAAAAAAAAAAAGGGTCGGCATG-3’，所述TMV5-35S的核苷酸序列为5’-GGTAATTGTTGTAAAAATACCCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3’。

进一步的，步骤(3)中所述连接试剂盒为In-Fusion HD Cloning Kits试剂盒。

进一步的，步骤(3)中所述TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的为环状结构，且所述载体pCB-TMV-SY核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为 11275bp。

本发明还提供了一种TMV侵染性克隆载体，所述TMV侵染性克隆载体采用前述任意一种构建方法制备得到。

进一步的，所述TMV侵染性克隆载体具有完成系统侵染的能力，具有稳定性和可重复性。

本发明的有益之处在于：

①本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体为进一步研究TMV与宿主植物的相互作用提供了有效的工具。

②本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体的构建方法为进一步研究 pCB-TMV-SYcDNA克隆的基因合成定点突变TMV的RNA奠定基础。

③本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体利用了表达病毒RNA的载体可以系统地移动的特性，实现了载体在宿主中高效表达外源蛋白的目的。

④本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体稳定不易突变，具可重复性，可高效侵染烟草、辣椒等植物，用途广泛。

⑤本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，相对传统的通过双酶切构建侵染性克隆的方法更为简便、新颖，摆脱了因不可控因素导致的酶失活等问题，操作简单。

⑥本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体只侵染植物，对动物，人体相对安全。

⑦本发明提供的一种TMV侵染性克隆载体可用于药效机理研究和效能检测等多个方面。

附图说明

图1是实施例1中采用本发明的一种TMV侵染性克隆载体的构建方法构建得到一种TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的载体图谱；

图2是实施例2中被pCB-TMV-SY的载体侵染病毒离子的透射电镜效果图；

图3是实施例2中接种pCB-TMV-SY的植株的花叶病症状图；

图4是实施例2中用抗TMV外壳蛋白的单克隆抗体对接种了pCB-TMV-SY 和pCB-TMVfs126的本生烟叶片进行western blot分析结果示意图；

图5是实施例2中的RNA点杂交结果示意图；

图6是实施例2中用Northern印迹杂交技术对TMV-SY接种叶片和上部叶片中提取的RNA的检测结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)实验材料准备：

TMV沈阳分离物(TMV-SY)：从辽宁省沈阳市的烟草品种云烟87中采集；

TRIzol试剂盒：Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；

M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒：Sangon Biotech，中国上海；

Primestar GXL DNA聚合酶：TakaLa Bio.，中国大连

In-Fusion HD Cloning Kits试剂盒：Clontech，中国大连

(2)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂盒从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以总RNA作为模板利用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的cDNA为模板，TMV+和TMV-为引物，使用Primestar GXL DNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且 TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

表1 TMV+和TMV-引物序列表

(3)二元载体pCB301的获得：以含有35S启动子的质粒pCB301作为模板， TMV3-Rb+和TMV5-35S为引物进行PCR扩增，得到长度为4920bp的DNA片段，即为二元载体pCB301，且二元载体pCB301的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；

表2 TMV3Rb+和TMV5-35S引物序列表

(4)TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的获得：使用In-Fusion HD Cloning Kits试剂盒将所述TMV-SY片段和二元载体pCB301进行连接，将 TMV-SY片段插入二元载体pCB301的35S启动子和35S终止子之间，构建得到一种TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY(载体图谱参见图1)，即将 TMV-SY的完整核苷酸序列整合到二元载体pCB301中从而成功构建 pCB-TMV-SY。

实施例2

一种TMV侵染性克隆载体的性能检测及分析，具体包括：系统侵染能力检测，

1.系统侵染能力检测

实验组和对照组准备：实验组采用实施例1制备的一种TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY，对照组采用载体pCB-TMVfs126(pCB-TMVfs126是复制酶缺陷型病毒载体)。

侵染病毒的纯化及电镜观察：从接种了pCB-TMV-SY的农杆菌 N.benthamana中提取和纯化病毒，使用Nano-Drop TM 1000分光光度计(Fisher Scientific，Pittsburgh，USA)测量纯化后病毒离子浓度；调整终浓度至2mg/ml，使用磷钨酸染色法处理纯化后的病毒离子，使用透射电子显微镜HT7700 Exalens (Hitachi,Ltd,Tokyo,Japan)进行观察，透射电镜观察结果参见图2。

侵染对比实验及结果分析：将pCB-TMV-SY和pCB-TMVfs126接种到25℃培养了30天的本生烟叶片中进行后续分析。接种后7天，接种pCB-TMV-SY 的植株有典型的花叶和畸形症状(参见图3)，而接种pCB-TMVfs126的植株没有出现花叶病症状。而后用抗TMV外壳蛋白(TMV-CP)的单克隆抗体进行了 western blot分析，结果表明(参见图4)TMV-CP可从接种pCB-TMV-SY的本生烟叶片和上位叶中检测到，但不能从接种pCB-TMVfs126对照组的本生烟叶片和上位叶中检测到，说明pCB-TMV-SY在接种叶片中具有侵染性，并具有完成系统侵染的能力，而pCB-TMVfs126在接种叶片中不具有侵染性。

2.RNA探针构建及Northern杂交分析

使用地高辛标记的RNA探针，构建了检测TMV-SY正链(pUC-TMV-PP) 和负链(pUC-TMV-NP)探针。从TMV-SY、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)接种的本氏烟叶片和Mock接种的对照叶片中提取总RNA，用 pUC-TMV-PP RNA检测探针进行检测。RNA点杂交结果表明，当RNA总量为 1μg时，可检测到显著的强信号(图5，泳道1)；当TMV-SY RNA稀释至0.1μg 和0.01μg时，可观察到微弱信号(图5，泳道2-3)。未观察到PMMoV、CGMMV 和健康对照组的检测信号(图5，泳道4-6)。用Northern印迹杂交技术对TMV-SY 接种叶片和上部叶片中提取的RNA进行了检测，结果表明，pUC-TMV-PP探针可以特异地检测到TMV-SY正链RNA(gRNA)和CP亚基因组RNA(sgRNA)， pUC-TMV-NP探针可以检测到完整的负链RNA(图6)。以上结果表明，RNA 探针的特异性和灵敏度足以用于TMV的常规分子检测(图5)。本研究构建的 TMV病毒点杂交检测系统是一种高效、简便的病毒RNA杂交系统，适用于大批量病毒的快速检测。而Northern印迹分析可用于定性和定量检测病毒gRNA、 sgRNA和负链RNA的积累，更适用于精确的分子研究。总之，本研究构建的 TMV-SY侵染性克隆和RNA检测系统将为进一步研究TMV-SY的发病机制提供良好的生物学工具。

应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法

<130> 2020.08.03

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gtatttttac aacaattacc aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa ttactattta 60

caattacaat ggcatacaca cagacagcta ccacatcagc tttgctggac actgtccgag 120

gaaataactc cttggtcaat gatctagcaa agcgtcgtct ttacgacaca gcggtcgaag 180

agtttaacgc tcgtgaccgc aggcccaaag tgaacttttc aaaagtaata agcgaggagc 240

agacgcttat tgctacccgg gcatatccag aattccaaat tacattttac aacacgcaaa 300

atgccgtgca ttcgcttgca ggtggattgc gatctttaga actggaatat ctgatgatgc 360

aaattcccta cggatcattg acttatgaca taggcgggaa ttttgcatcg catctgttca 420

agggacgagc atacgtacac tgctgcatgc ccaacctgga cgttcgagac atcatgcggc 480

atgaaggcca gaaagacagt attgaactat acctttctag gctagagaga ggggggaaaa 540

cagtccctaa cttccaaaag gaagcatttg acagatacgc agaaattcct gaggacgctg 600

tctgtcataa tactttccag acatgtgaac atcagccgat gcagcaatca ggcagagtgt 660

acgccattgc gctacacagc atatatgaca tacccgctga tgagttcggg gcggcactct 720

tgaggaaaaa cgtccatacg tgctatgccg ctttccactt ctctgagaac ctgcttcttg 780

aggattcata cgtcaatttg gacgaaatca acgcgtgttt ttcgcgcgat ggagacaaat 840

tgaccttttc ttttgcatca gagagtactc ttaattactg tcatagttat tctaatattc 900

ttaagtatgt gtgcaaaact tacttccctg cctctaatag agaggtttac atgaaggagt 960

ttttagtcac cagggttaac acctggtttt gtaagttttc tagaatagat acttttcttt 1020

tgtacaaagg tgtggcccat aaaagtgtag atagtgagca gttttatact gcaatggaag 1080

acgcatggca ttacaaaaag actcttgcaa tgtgcaacag tgagagaatt ctccttgagg 1140

attcatcatc agttaattac tggtttccca aaatgaggga tatggtcatc gtaccattat 1200

tcgacatttc tttggagact agtaagagga cgcgcaagga agtcttagtg tccaaggatt 1260

tcgtgtttac agtgctcaac cacattcgaa cataccaggc gaaagctctt acatacgcaa 1320

atgttttgtc cttcgtcgaa tcgattcgat cgagggtaat cattaacggt gtaacagcga 1380

ggtccgaatg ggatgtggac aaatctttgt tgcaatcctt gtccatgacg ttttacctgc 1440

atactaagct tgccgttcta aaggatgact tactgattag caagtttagt ctcggttcaa 1500

aaacggtgtg tcagcatgtg tgggatgaga tttcgctggc ttttgggaac gcatttccct 1560

ccgtaaaaga gaggctcttg aacaggaaac ttatcagagt ggcaggtgac gcattagaga 1620

tcagggtgcc tgatctatat gtgactttcc acgacagatt agtgactgag tacaaggcct 1680

ctgtggacat gcctgcgctt gacattagga agaagatgga agaaacggaa gtgatgtaca 1740

atgctctttc ggagttatcg gtgttaaggg agtctgacaa attcgatgtt gatgtttttt 1800

cccagatgtg ccaatctttg gaagttgacc caatgacagc agcgaaggtt atagtcgcgg 1860

tcatgagcaa tgagagcggt ctgactctca catttgaacg acctacagag gcgaatgttg 1920

cgctagcttt gcaagatcaa gagaaggctt cagaaggtgc tttggtagtt acctcgaggg 1980

aagttgaaga accgtccatg aagggttcga tggccagagg agagttacaa ttagctggtc 2040

ttgctggaga tcatccggag tcgtcttatt ctaggaacga ggagatagag tctttagagc 2100

agtttcatat ggcaacggca gattcgttaa ttcgtaagca gatgagctcg attgtgtaca 2160

caggtccgat taaagttcag caaatgaaaa actttatcga tagcctggta gcatcactat 2220

ctgctgcggt gtcgaatctc gtcaagatcc tcaaagatac agctgctatt gaccttgaaa 2280

cccgtcaaaa gtttggagtc ttggatgttg catctaggaa gtggttgatc aaaccaacgg 2340

ccaagagtca tgcatggggt gttgtcgaaa cccacgcgag gaagtatcat gtggcgcttt 2400

tggaatatga tgagcagggt gtggtaacat gcgatgattg gagaagagta gctgtcagct 2460

ctgagtctgt tgtttattcc gatatggcga aactcagaac tctgcgccga ctgcttaaaa 2520

acggtgaacc gcacgtcagt agcgcaaagg ttgttcttgt ggacggagtt ccgggctgtg 2580

gaaaaaccaa agaaattctt tccagggtta attttgatga agatctaatt ctagtacctg 2640

ggaagcaagc tgcggaaatg atcagaagac gtgcgaattc ctcagggatt attgtggcca 2700

cgaaggacaa cgttaaaacc gttgattctt tcatgatgaa ttttggaaaa agcacacgct 2760

gtcagttcaa gagattattc attgatgaag ggttgatgtt gcatactggt tgtgttaatt 2820

ttcttgtggc gatgtcattg tgcgaaattg catatgttta cggagacaca cagcagattc 2880

catacatcaa tagagtttca ggattcccgt acctcgccca ttttgccaaa ttggaagttg 2940

acgaggttga gacacgcaga actactctcc gttgtccagc tgatgtcaca cattatctga 3000

acaggagata tgagggcttt gtcatgagta cttcttcggt taaaaagtct gtttcgcagg 3060

agatggttgg cggagccgct gtgatcaatc cgatctcaaa acccctgcat ggcaagatct 3120

tgacgtttac ccaatcggat aaagaagctc tgctttcaag agggtattca gatgttcaca 3180

ctgtgcatga agtgcaaggc gagacatact ctgatgtttc actagttagg ttaaccccta 3240

caccagtctc catcattgca ggagacagcc cacatgtttt ggttgcattg tcgaggcaca 3300

cctgttcgct caagtactac actgttgtta tggatccttt agttagtatt attagagatc 3360

tagagaaact tagctcgtac ttgttagata tgtataaggt cgatgcagga acacaatagc 3420

aattacagat tgactcggtg ttcaaaggtt ccaatctttt tgtggcagcg ccaaagactg 3480

gtgatatttc tgatatgcag ttttactatg ataagtgtct cccaggtaac agcaccatga 3540

tgaataattt tgatgctgtt accatgaggt tgactgacat ttcattgaat gtcaaagatt 3600

gcatattgga tatgtccaag tctgttgctg cgcctaagga tcagatcaaa ccactaatac 3660

ctatggtacg aacggcggca gaaatgccac gccagactgg actattggaa aatttagtgg 3720

cgatgattaa aaggaacttt aacgcacccg agttgtctgg catcattgat attgaaaaca 3780

ctgcatcttt agttgtagat aagttttttg atagttattt gcttaaggaa aaaagaaaac 3840

caaataaaaa tgtttctttg tttagtagag agtctctcaa tagatggtta gaaaagcaag 3900

aacaggtaac aataggccag ctcgcagatt ttgattttgt ggatttgcca gcagttgatc 3960

agtatagaca catgatcaaa gcacaaccca agcaaaaatt ggacacttca atccaaacgg 4020

agtacccggc tttgcagacg attgtgtacc attcaaaaaa gatcaatgca atatttggcc 4080

cgttgtttag tgagcttact aggcaattac tggacagtgt tgattcgagc agatttttgt 4140

ttttcacaag aaagacacca gcgcagattg aggatttctt cggagatctc gacagtcatg 4200

tgccgatgga tgtcttggag ctggatatat caaaatacga caaatctcag aatgaattcc 4260

actgtgcagt agaatatgag atctggcgaa gattgggttt tgaagatttc ttgggagaag 4320

tttggaagca agggcataga aagaccaccc tcaaggatta taccgcaggt atcaaaactt 4380

gcatctggta tcaaagaaag agcggggacg tcacgacgtt cattggaaac actgtgatca 4440

ttgctgcatg tttggcctcg atgcttccga tggagaaaat aatcaaagga gccttttgcg 4500

gtgacgatag tctgctgtac ttcccaaagg gttgtgagtt tccggatgtg caacactccg 4560

cgaatcttat gtggaatttt gaagcaaaac tgtttaaaaa acagtatgga tacttttgcg 4620

gaaggtatgt aatacatcac gacagaggat gcattgtgta ttacgatccc ctaaagttga 4680

tctcaaaact tggtgctaaa cacatcaagg attgggaaca cttggaggag ttcagaaggt 4740

ctctttgtga tgttgctgtt tcgttgaaca attgtgcgta ttacacacag ttggacgacg 4800

ctgtatggga ggttcataag accgcccctc caggttcgtt tgtttataaa agtctggtga 4860

agtatttgtc tgataaagtt ctttttagaa gtttgtttat agatggctct agttgttaaa 4920

ggaaaagtga atatcaatga gtttatcgac ctgacaaaaa tggagaagat cttaccgtcg 4980

atgtttaccc ctgtaaagag tgtcatgtgt tccaaagttg ataaaataat ggttcatgag 5040

aatgagtcat tgtcagaggt aaaccttctt aaaggagtta agcttattga tagtggatac 5100

gtctgtttag ccggtttggt cgtcacgggc gagtggaact tgcctgacaa ttgcagagga 5160

ggtgtgagcg tgtgtctggt ggacaaaagg atggaaagag ccgacgaggc cactctcgga 5220

tcttactaca cagcagctgc aaagaaaaga tttcagttca aggtcgttcc caattatgct 5280

ataaccaccc aggacgcgat gaaaaacgtc tggcaagttt tagttaatat tagaaatgtg 5340

aagatgtcag cgggtttctg tccgctttct ctggagtttg tgtcggtgtg tattgtttat 5400

agaaataata taaaattagg tttgagagag aaaattacaa acgtgagaga tggagggccc 5460

atggaactta cagaagaagt tgttgatgag ttcatggaag atgtccctat gtcaatcagg 5520

cttgcaaagt ttcgatctcg aaccggaaaa aagagtgatg tccgtaaagg gaaaattagt 5580

agtagtgatc ggtcagtgcc gaacaagaac tatagaaatg ttaaggattt tggaggaatg 5640

agttttaaaa agaataattt aatcgatgat gattcggaga ctactgtcgc cgaatcggat 5700

tcgttttaaa tatgtcttac agtatcacta ctccatctca gttcgtgtac ttgtcatcag 5760

cgtgggccga cccaatagaa ttaattaatt tatgtactaa tgccttagga aaccagttcc 5820

aaacacaaca agctcgaact gtcgttcaaa gacaattcag tgaggtgtgg aaaccttcac 5880

cacaagtaac tgttagattc cctgacagtg actttaaggt gtataggtac aatgcggtat 5940

tagacccgct agtcacagca ctgttaggtg catttgacac tagaaataga ataatagaag 6000

ttgaaaatca ggcgaacccc acgactgccg aaacgttaga cgctactcgt agagtagacg 6060

acgcgacggt ggccataagg agcgctataa ataatttagt agtagaattg atcagaggaa 6120

ctggatctta taatcggagc tctttcgaga gctcttctgg tttggtttgg acctctggtc 6180

ctgcaacttg aggtagtcaa gatgcataat aaataacgga ttgtgtccgt aatcacacgt 6240

ggtgcgtacg ataacgcata gtgtttttcc ctccacttaa atcgaagggt tgtgtcttgg 6300

atcgcgcggg tcaaatgtat atggttcata tacatccgca ggcacgtaat aaagcgaggg 6360

gttcgaatcc ccccgttacc cccggtaggg gccca 6395

<210> 2

<211> 4920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ttacccccgg taggggccca aaaaaaaaaa agggtcggca tggcatctcc acctcctcgc 60

ggtccgacct gggcatccga aggaggacgt cgtccactcg gatggctaag ggagagctcg 120

aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 180

ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 240

atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 300

atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 360

gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattc gatatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc 420

gagggggggc ccggtaccaa aaccacccca gtactttaaa aacgtccgca atgtgttatt 480

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 540

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagtcca 600

ctagagacgc tcaccgggct ggttgccctc gcgctgggct ggcggccgtc tatggccctg 660

caaacgcgcc agaaacgccg tcgaagccgt gtgcgagaca ccgcggccgc cggcgttgtg 720

gatacctcgc ggaaaacttg gccctcactg acagatgagg ggcggacgtt gacacttgag 780

gggccgactc acccggcgcg gcgttgacag atgaggggca ggctcgattt cggccggcga 840

cgtggagctg gccagcctcg caaatcggcg aaaacgcctg attttacgcg agtttcccac 900

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caatcaggct tgcaaagttt cgatctcgaa ccggaaaaaa gagtgatgtc cgtaaaggga 10020

aaattagtag tagtgatcgg tcagtgccga acaagaacta tagaaatgtt aaggattttg 10080

gaggaatgag ttttaaaaag aataatttaa tcgatgatga ttcggagact actgtcgccg 10140

aatcggattc gttttaaata tgtcttacag tatcactact ccatctcagt tcgtgtactt 10200

gtcatcagcg tgggccgacc caatagaatt aattaattta tgtactaatg ccttaggaaa 10260

ccagttccaa acacaacaag ctcgaactgt cgttcaaaga caattcagtg aggtgtggaa 10320

accttcacca caagtaactg ttagattccc tgacagtgac tttaaggtgt ataggtacaa 10380

tgcggtatta gacccgctag tcacagcact gttaggtgca tttgacacta gaaatagaat 10440

aatagaagtt gaaaatcagg cgaaccccac gactgccgaa acgttagacg ctactcgtag 10500

agtagacgac gcgacggtgg ccataaggag cgctataaat aatttagtag tagaattgat 10560

cagaggaact ggatcttata atcggagctc tttcgagagc tcttctggtt tggtttggac 10620

ctctggtcct gcaacttgag gtagtcaaga tgcataataa ataacggatt gtgtccgtaa 10680

tcacacgtgg tgcgtacgat aacgcatagt gtttttccct ccacttaaat cgaagggttg 10740

tgtcttggat cgcgcgggtc aaatgtatat ggttcatata catccgcagg cacgtaataa 10800

agcgaggggt tcgaatcccc ccgttacccc cggtaggggc ccaaaaaaaa aaaagggtcg 10860

gcatggcatc tccacctcct cgcggtccga cctgggcatc cgaaggagga cgtcgtccac 10920

tcggatggct aagggagagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 10980

tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 11040

acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 11100

tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 11160

actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttcgatatca 11220

agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg ggcccggtac caaaaccacc ccagt 11275

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gtatttttac aacaattacc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgggccccta ccgggggtaa c 21

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ggtaattgtt gtaaaaatac ccctctccaa atgaaatgaa c 41

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ttacccccgg taggggccca aaaaaaaaaa agggtcggca tg 42

Claims (8)

1.一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以所述总RNA作为模板进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的所述cDNA为模板，TMV+和TMV-为引物，使用Primestar GXL DNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且所述TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

(2)二元载体pCB301的获得：以含有35S启动子的质粒pCB301作为模板，TMV3Rb+和TMV5-35S为引物进行PCR扩增，得到长度为4920bp的DNA片段，即为二元载体pCB301，且所述二元载体pCB301的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的获得：使用连接试剂盒将所述TMV-SY片段和所述二元载体pCB301进行连接，即将所述TMV-SY片段插入所述二元载体pCB301的35S启动子和35S终止子之间，构建得到一种TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY。

2.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述反转录过程是利用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒完成的。

3.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述TMV+的核苷酸序列为5’-GTATTTTTACAACAATTACC-3’，所述TMV-的核苷酸序列为5’-TGGGCCCCTACCGGGGGTAAC-3’。

4.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述TMV3Rb+的核苷酸序列为5’-TTACCCCCGGTAGGGGCCCAAAAAAAAAAAAGGGTCGGCATG-3’，所述TMV5-35S的核苷酸序列为5’-GGTAATTGTTGTAAAAATACCCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3’。

5.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述连接试剂盒为In-Fusion HD Cloning Kits试剂盒。

6.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的为环状结构，且所述载体pCB-TMV-SY核苷酸序列如SEQID NO.3所示，长度为11275bp。

7.一种TMV侵染性克隆载体，其特征在于，所述TMV侵染性克隆载体采用权利要求1-6所述构建方法制备得到。

8.根据权利要求7所述的一种TMV侵染性克隆载体，其特征在于，所述TMV侵染性克隆载体具有完成系统侵染的能力，具有稳定性和可重复性。

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