CN113355353A - 四组分bsmv超表达棉花基因载体的应用及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用及构建方法，BSMV超表达载体在建立棉花亚细胞定位标记系的应用，BSMV侵染棉花介导的超表达载体的构建方法步骤为：构建Ti瞬时表达载体；基于Ti瞬时表达载体，构建BSMV超表达载体。本发明的四组分BSMV超表达棉花载体所得到的亚细胞定位标记体系荧光信号更强，利用BSMV超表达棉花基因载体侵染棉花所获得的定位结果更为清晰明了，在不同植物组织中能够检测到定位信息。

Description

四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用及构建方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到一种四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用及构建方法。
背景技术
棉花及其他作物，由于生长周期长、遗传转化难度大、转基因材料获取困难等因素，严重制约了其基因功能的研究。目前有关棉花基因功能的研究仍多在易转化的模式植物拟南芥中完成，而这种异源系统并不能准确反映出目的基因在棉花生长发育过程中的功能。确定基因的亚细胞定位，在亚细胞水平上对基因的亚细胞及组织定位进行长时段、不同生长条件下的动态研究，已成为解析基因功能的重要组成部分。在模式植物如拟南芥、水稻等中，为了能够长时间、多组织地进行基因亚细胞水平研究，一些稳定的转基因亚细胞荧光标记系被创建。由于棉花遗难度大，在棉花材料中超表达棉花基因、研究基因表达产物的亚细胞定位及功能仍有很大的技术限制。因此，建立一种可以不依赖遗传转化的基因超表达研究方法，将为棉花基因定位研究以及功能解析提供便利。
大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)是一种常用于VIGS的RNA病毒，在单子叶植物和双子叶植物中都有应用。BSMV基因组由三条正单链RNA组成，分别是pCaBS-α、pCaBS-β和pCaBS-γ。之前已有研究发现，BSMV三组分载体系统可以用于外源基因的超表达，但成功表达的基因都比较小。2018年初，来自加拿大的Cheuk和Houde报道了一种新的BSMV系统超表达系统，他们将BSMV基因组的γ组分重构成了γ1和γ2两个亚组分，这使得该系统的装载能力大大提升，并且提供了两个外源基因的插入位点。当重组的BSMV载体经农杆菌介导进入植物细胞后，病毒的表达系统介导重组病毒RNA在植物细胞内合成，进一步复制以后扩散到发育和分生组织，甚至到生殖细胞系中。植物病毒载体具有侵染能力强，复制性和移动性强，转化后不整合，以及存活时间长等特点，非常符合转化简单和长时间超表达目标基因的技术要求，但限于载体的承载能力有限，现有植物病毒载体多被用于小体积基因(<1kb)的超表达(VOX，Virus-mediated Overexpression)，或被用于投送基因的部分片段以诱发病毒介导的基因沉默(VIGS，Virus InducedGene Silencing)。一种四组分BSMV(Barleystripemosaicvirus)载体被改造出来，这种四组分BSMV能够侵染多种单、双子叶植物，并可在植物体内长时间超表达大片段目标基因(～2.2kb)，极大地简化植物基因超表达研究。但是，该系统是否能够侵染棉花并超表达棉花目的基因还尚未研究。
探究未知蛋白质的功能，往往需要了解该蛋白在细胞中的定位情况，因此，建立一套相应植物的细胞器定位标记载体是十分必要的。拟南芥、苜蓿、水稻等植物中已有相应标记系的存在，而棉花由于其材料的复杂性、特殊性，使得转基因棉花很难再生，因此，我们以棉花原生质体为对象进行相关研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用及构建方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：BSMV超表达载体在建立棉花亚细胞定位标记系的应用。
本发明的BSMV超表达载体包括pCaBS-γ2:PIP2:GFP、pCaBS-γ2:MT:GFP、pCaBS-γ2:NU:GFP、pCaBS-γ2:ER:GFP、pCaBS-γ2:TP:GFP、pCaBS-γ2:PL:GFP、pCaBS-γ2:GB:GFP、pCaBS-γ2:PR:GFP。
四组分BSMV超表达载体的构建方法的步骤为：
S1，构建Ti瞬时表达载体
S11，棉花内源性基因的克隆：选择8个长度、大小不同、在不同细胞器的基因，分别为GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP，根据内源性基因序列设计其全长引物，含酶切位点KpnI和XbaI，进行PCR扩增；
S12，回收目的片段，将胶回收产物和T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；
S13，以验证成功的连接有目的片段的T载体为模板进行PCR扩增；
S14，将S13的PCR产物进行电泳并回收目的片段，将回收的PCR产物和含GFP基因的pCAMBIA-1300载体同时进行双酶切，反应条件为37℃水浴酶切3小时，将酶切产物进行纯化并回收目的片段和空载体，并将目的片段和空载体进行连接；
S15，将S14得到的连接产物进行大肠杆菌DH5α感受态转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒，对已测浓度的质粒进行双酶切验证，根据电泳结果判断酶切条带大小，将酶切验证正确的质粒进行测序，并于-80℃保存；
S16，农杆菌的转化和筛选：将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，并通过PCR结果挑选出验证正确的单克隆，在-80℃保存菌液，并将单克隆在新的YEB固体培养基上划线4℃留存，获得Ti瞬时表达载体；
S2，基于Ti瞬时表达载体，构建BSMV超表达载体
S21，内源性基因与GFP融合体的克隆：以S1构建好的瞬时表达载体为模板，以内源性基因及GFP融合片段为目的片段设计LIC引物，在前后引物的5’端分别加入AAGGAAGTTTAA及CGGGCC AGCCACCGCCACCAGT形成LIC引物；
S22，将PCR产物电泳并进行胶回收；
S23，pCaBS-γ2用ApaI单酶切使之线性化后并纯化回收；
S24，将S22、S23两个反应体系在22℃反应30min后，75℃水浴20min使酶失活，将10ng处理后的载体与100ng处理后的目的片段涡旋混合均匀，加热至66℃反应2min，然后室温放置10min左右使混合液降至室温，加入1μL T4连接酶及1μL T4 buffer进行连接1h，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α细胞中，通过菌落PCR筛选菌落，并通过测序验证是否正确插入；
S25，大肠杆菌DH5α转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒及酶切验证，获得BSMV超表达载体。
2、根据权利要求1所述的四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用及构建方法，其特征在于，所述的步骤S11中GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP的正、反引物为：
GhPM-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGACTAAGGATATTGAGACCACGG
GhPM-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAAGCATTGCTCCTGAAAGATCCAAGG
GhMT-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCAGCTCGTAGAATCTCTTC
GhMT-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGACAACCATGCTGGATTCTTCAAAGG
GhNU-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGAACCACAACCCGCAATCC
GhNU-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAATTCCTCTCTAGAAGCGGGATCG
GhER-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGAAGAACACTGAAAGACTCGCC
GhER-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGA TACATCAAATCTCAATGCTAGGGC
GhTP-GFP的正向引物序列为：CGATGGATCCATGCCGATCAGAAACATAGCAG
GhTP-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAATAATCGGTGGTTGGGAGCTGCTCG
GhPL-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGAGGTTTTATCTTCTTCGTCTTC
GhPL-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGATGTACCAGATCCTATAAGTGTGTGG
GhGB-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGCGAGGAGTAGATCATCGTCAT
GhGB-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGACAGTAGTAGTATCCCAAGCAGGTAG
GhPR-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCGTTTCCAGTAGTCGATACCG
GhPR-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAACTTCATTCTTTTGCGGACCTCGT。
本发明的有益效果：
(1)本发明的四组分BSMV超表达载体所得到的亚细胞定位标记体系荧光信号更强，利用病毒载体侵染棉花所获得的定位结果更为清晰明了，在不同植物组织中能够检测到定位信息。
(2)本发明的四组分BSMV超表达载体能够共表达两个及以上目的基因，两个细胞器定位信号的存在表明已经成功建立了基于BSMV超表达系统的亚细胞定位双标记系，将有助于棉花基因功能的分析，从而加快棉花功能基因的研究。
附图说明
图1是四组分BSMV系统载体示意图。
图2是载体构建酶切验证结果。
图3瞬时载体构建PCR验证结果。
图4是点状细胞器在棉花原生质体中的荧光定位。
图5是片状细胞器在棉花原生质体中的荧光定位。
图6是pCaBS-γ2:GFP病毒载体的PCR验证。
图7是pCaBS-γ2:PIP2:GFP病毒载体的PCR验证。
图8是pCaBS-γ2:MT:GFP病毒载体的PCR验证。
图9是病毒侵染植株与野生型植株子叶和根中GFP基因的半定量结果。
图10是病毒侵染植株与野生型植株子叶和根中GFP的表达量。
图11是土培期、水培期、4-6叶真叶期棉花生长情况。
图12是真叶期棉花真叶(左)和子叶(右)的紫外灯下荧光情况。
图13是RT-PCR检测各组分表达。
图14是种子吸涨法投送BSMV四组分载体可系统侵染棉花。
图15是种子吸涨法投送BSMV四组分载体可表达大片段外源基因。
图16是超表达病毒载体连接PCR验证结果。
图17是点状细胞器在棉花子叶及根中的荧光情况。
图18是片状细胞器在棉花子叶及根中的荧光情况。
图19是光漂白实验过程图。
图20是光漂白后不同时间下不同通道的荧光强度。
图21是漂白叶绿体3个点的信号强度
图22是GFP在不同时间下不同通道的荧光信号。
图23是GhClpC与GFP在不同时间下不同通道的荧光信号。
图24是GFP、CHLO、PMT在不同时间、序列下的荧光强度对比。
图25是PIP2标记和GB标记在同一细胞中的共表达。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本实施例参照Mario Houde 2017构建了四组分BSMV系统为pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γ1、pCaBS-γ2，pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γ来源于中国农业大学李大伟教授馈赠，pCaBS-γ1、pCaBS-γ2可根据现有文献自行构建。
本实施例的四组分BSMV超表达载体的构建方法的步骤为：
S1，构建Ti瞬时表达载体
S11，棉花内源性基因的克隆：选择8个长度、大小不同、在不同细胞器的基因，分别为GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP，
GhPM-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGACTAAGGATATTGAGACCACGG
GhPM-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAAGCATTGCTCCTGAAAGATCCAAGG
GhMT-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCAGCTCGTAGAATCTCTTC
GhMT-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGACAACCATGCTGGATTCTTCAAAGG
GhNU-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGAACCACAACCCGCAATCC
GhNU-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAATTCCTCTCTAGAAGCGGGATCG
GhER-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGAAGAACACTGAAAGACTCGCC
GhER-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGA TACATCAAATCTCAATGCTAGGGC
GhTP-GFP的正向引物序列为：CGATGGATCCATGCCGATCAGAAACATAGCAG
GhTP-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAATAATCGGTGGTTGGGAGCTGCTCG
GhPL-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGAGGTTTTATCTTCTTCGTCTTC
GhPL-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGATGTACCAGATCCTATAAGTGTGTGG
GhGB-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGCGAGGAGTAGATCATCGTCAT
GhGB-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGACAGTAGTAGTATCCCAAGCAGGTAG
GhPR-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCGTTTCCAGTAGTCGATACCG
GhPR-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAACTTCATTCTTTTGCGGACCTCGT
根据内源性基因序列设计其全长引物，含酶切位点KpnI和XbaI，使用Taq酶对棉花中的PIP2及MT基因进行PCR扩增，其体系如表1所示，
表1为PCR反应系统
Figure BDA0003101740240000061
设置PCR仪的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃(Tm-3)退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃终延伸10min，反应终止后电泳检测条带大小与目标基因长度的正确性，PCR产物在-20℃保存。
S12，回收目的片段的胶，参考庄盟生物公司的微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒进行凝胶回收操作，将胶回收产物和T载体连接，连接反应体系如表2所示，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；
表2为胶回收产物和T载体连接系统
Figure BDA0003101740240000071
加入各组分并用移液枪充分吹打混匀后，于16℃反应3小时。
S13，以验证成功的连接有目的片段的T载体为模板进行PCR扩增。
S14，将S13的PCR产物进行电泳并回收目的片段，将回收的PCR产物和含GFP基因的pCAMBIA-1300载体同时进行双酶切，反应条件为37℃水浴酶切3小时，将酶切产物进行纯化并回收目的片段和空载体，空载体为pCAMBIA-1300，为瞬时表达载体，并将目的片段和空载体进行连接；
S15，将S14得到的连接产物进行大肠杆菌DH5α感受态转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒，对已测浓度的质粒进行双酶切验证，根据电泳结果判断酶切条带大小，将酶切验证正确的质粒进行测序，并于-80℃保存；
S16，农杆菌的转化和筛选：将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，并通过PCR结果挑选出验证正确的单克隆，在-80℃保存菌液，并将单克隆在新的YEB固体培养基上划线4℃留存，获得Ti瞬时表达载体；
S2，基于Ti瞬时表达载体，构建BSMV超表达载体
S21，内源性基因与GFP融合体的克隆：以S1构建好的Ti瞬时表达载体为模板，以内源性基因及GFP融合片段为目的片段设计LIC引物，在前后引物的5’端分别加入AAGGAAGTTTAA及CGGGCC AGCCACCGCCACCAGT形成LIC引物；
S22，将PCR产物电泳并进行胶回收；
S23，pCaBS-γ2用ApaI单酶切使之线性化后并纯化回收；
S24，将S22、S23两个反应体系在22℃反应30min后，75℃水浴20min使酶失活，将10ng处理后的载体与100ng处理后的目的片段涡旋混合均匀，加热至66℃反应2min，然后室温放置10min左右使混合液降至室温，加入1μL T4连接酶及1μL T4 buffer进行连接1h，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α细胞中，通过菌落PCR筛选菌落，并通过测序验证是否正确插入；
S25，大肠杆菌DH5α转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒及酶切验证，获得BSMV超表达载体，BSMV超表达载体包括pCaBS-γ2:PIP2:GFP、pCaBS-γ2:MT:GFP、pCaBS-γ2:NU:GFP、pCaBS-γ2:ER:GFP、pCaBS-γ2:TP:GFP、pCaBS-γ2:PL:GFP、pCaBS-γ2:GB:GFP、pCaBS-γ2:PR:GFP。
为了验证BSMV超表达载体在建立棉花亚细胞定位标记系的应用，采用以下试验方法进行验证：
实验一、Ti瞬时表达载体验证8个棉花细胞器标记基因的亚细胞定位。
异源表达对于理解和阐明蛋白功能会有一定的影响，因此建立棉花亚细胞定位基因表达体系的时候，通过blast分析，如表3所示，筛选并克隆出8个可能分别定位于细胞核(NU)、内质网(ER)、质膜(PM)、线粒体(MT)、液泡膜(TP)、质体(PL)、高尔基体(GB)以及过氧化物酶体(PR)的棉花内源基因，以消除异源表达可能带来的风险。
表3为8个棉花细胞器标记基因的功能介绍
Figure BDA0003101740240000081
首先，将8个棉花内源基因分别插入pCAMBIA1300-GFP载体中构成瞬时表达载体。如图2-3所示，酶切出来的目的条带大小与PCR的目的条带大小同设计的可获得的基因片段大小是一致的，其中图2的酶切结果的第3列为GFP空载对照，表明目的基因与载体已经成功连接，测序结果也验证连接成功，即瞬时表达载体构建成功。将已构建成功的载体通过PEG介导的转化法转入棉花叶片原生质体中，并通过激光共聚焦显微镜进行观察。结果表示不同细胞器的形态大小不同，其定位结果所显示的荧光信号也是不同的，根据形态结构差异我们将其分为两类，一类为点状细胞器，包括过氧化物酶体、线粒体、高尔基体和细胞核，如图4所示；另一类则是片状细胞器，包括质膜、液泡膜、内质网和质体，如图5所示。
尽管能够得到与细胞器相一致的定位结果，但是由于叶绿体自发荧光带来的干扰，获得的荧光效果并不显著，确认了筛选出的8个标记基因的可行性和准确性。
实验二、四组分BSMV棉花基因载体侵染棉花并在棉花中超表达大片段目的基因
如图6-8所示，将承载不同大小目的基因的BSMV为：pCaBS-γ2:GFP病毒载体、pCaBS-γ2:PIP2:GFP病毒载体、pCaBS-γ2:MT:GFP病毒载体匀浆通过种子吸涨法侵染棉花种子7天，如图9-10所示，正常培养一周后进行目的基因的qPCR定量测定，对野生型、PIP2病毒载体与GFP融合体侵染植株、MT与GFP融合体侵染植株的根及叶分别提取了RNA，反转录成cDNA后以qPCR-GFP-F/qPCR-GFP-R为引物，以cDNA为模板进行了实时荧光定量PCR和半定量PCR分析，其中半定量PCR以UBQ7为内参基因，结果显示与野生型相比，两组实验组均能检测到GFP的存在，且根中GFP积累量均比子叶中多，同时发现随着病毒载体插入片段大小的增加，其GFP表达量也会有明显的降低。
如图11所示，观察棉花在土培期、水培期、4-6叶真叶期生长情况，发现病毒液浸泡棉花种子并不会对棉花生长产生影响。如图12所示，在4-6叶真叶期都能检测到微弱的荧光信号。如图13所示，提取棉花叶片RNA，RT-PCR结果显示相较于WT植株和不带目的基因GFP的对照组BSMV:0植株，只有pCaBS-γ2:GFP能检测到GFP的表达，说明BSMV系统能够实现棉花中GFP的超表达。
如图14所示，为了更清楚的了解BSMV系统侵染棉花的可行性，进一步探究了GFP的表达情况。图14中A表示：使用B-100AP高强度手持紫外灯对整株棉花幼苗进行检测，以相同苗龄的不含有GFP的病毒侵染植株为对照，结果显示与不含GFP的对照组叶片在紫外灯照射下全为红色相比，在病毒侵染后的插入有GFP的实验组植株叶片有不均匀的黄绿色荧光出现。图14中B表示：采用同样的方法对病毒液处理的尚未发芽的棉花种子也进行了观察，在其根尖处同样发现了荧光差异。为了进一步确定实验组中的确有GFP存在，图14中C、D表示：在荧光显微镜下进一步观察了其茎组织及子叶的荧光信号，发现实验组荧光信号明显多于且强于对照组。综上所述，表明四组分BSMV融合表达载体通过种子吸涨法系统侵染棉花植株的可行性，并且目的基因还能在根、茎、子叶中都有表达。
如图15所示，图15中A为种子吸涨法投送pCaBS-γ2:PIP2:GFP系统侵染棉花，GFP荧光质膜定位，图中左侧为叶片细胞侵染，右侧为根系细胞侵染，图15中B为种子吸涨法投送pCaBS-γ2:MT:GFP系统侵染棉花，GFP荧光线粒体定位，图中左侧为叶片细胞侵染，右侧为根系细胞侵染，结果发现在根、子叶中均能检测到荧光定位信号。因此，四组分BSMV载体可系统侵染并超表达大分子片段基因，且插入的最大的基因片段达2340bp。
实验三、四组分BSMV超表达棉花基因载体能够快速建立棉花亚细胞定位标记系。
如图16所示，以试验一中的8个瞬时表达载体为基础，分别构建了对应的BSMV超表达载体，利用烟草进行病毒扩繁后，收集病毒液，通过种子吸涨法侵染棉花种子7天，转正常培养一周后，经过简单的组织压片，采取种子吸涨法将获得的含有不同组分的病毒液侵染棉花萌发种子，得到成株后取根尖、子叶下表皮进行压片，使用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图17所示，细胞核、过氧化物酶体、线粒体及高尔基体都呈现点状分布，无论根或子叶中，细胞核均为一个相对较大的圆形，且在一个细胞中仅存在一个，多数情况下都是偏向细胞一侧。过氧化物酶体则都较为散乱的分布在细胞各处，且基本上都为圆点状。线粒体在根及子叶中呈现的形状有所不同，根中多数为小且圆点状，而子叶中会有扁长状出现，且数量更多，高尔基体情况与线粒体类似，也是子叶中数量较多且多数为扁长状，根中数量较少且为点状。如图18所示，质体、内质网、质膜和液泡膜的荧光信号基本都是片状分布。质体的荧光信号充斥于整个细胞之中，但在子叶中主要分布在叶绿体上，其余部位有少量且较浅的荧光强度，根部荧光信号则偏向细胞一边；内质网则无论是根中还是子叶中均是散布在细胞中呈不规则的网状荧光信号；质膜及液泡膜荧光信号在根与子叶中相似，膜上一圈荧光信号包围整个细胞，不同的是液泡膜的膜定位信号部分位置会向中间凹陷，而质膜均匀分布在整个细胞膜上。
上述结果与利用棉花叶肉原生质体所得到的亚细胞定位结果一致，同时与通过棉花瞬时表达系统所获得的结果相比，利用BSMV超表达载体侵染棉花所获得的定位结果更为清晰明了，能在不同组织中得到定位结果。
在棉花的根和叶组织中清晰地检测到了8个标记基因的准确荧光定位信号，成功克服了瞬时表达信号不强和叶绿体自发荧光污染的问题，通过长时间曝光处理、以及高光淬灭-恢复实验发现，考虑到病毒载体的移动性和复制性以及病毒液侵染种子的方法特异性，推测BSMV系统能长时间检测目的基因的亚细胞定位。为了方便进行研究，选择了定位于质体的标记GhBASS5基因。如图19所示，首先对GhBASS5-GFP的其中一个叶绿体上的部分定位信号进行光漂白，从而得到了部分淬灭、部分保留的叶绿体荧光信号，随后恢复正常并观察光漂白的位置的荧光信号的变化。如图20所示，不同于叶绿体自发荧光的逐渐减弱直至消失，在GFP信号中，未进行漂白的部分其GFP信号有所减弱，但是光漂白的位置GFP信号似乎有所增强。为了更准确的表现出这一结果，选择光漂白位置的3个点并对其具体的荧光信号值进行数据统计，如图21所示，GFP荧光强度随着时间增长的确有所恢复，叶绿体自发荧光强度会随着时间逐渐变为0。因此病毒的不断复制和移动使GhBASS5-GFP能不断产生并进入植物体内进行表达，从而能够源源不断地提供GFP蛋白，这就是GFP荧光信号能够得到恢复的原因。同时，考虑到叶绿体自发荧光为红色，可以假设CHLO这一通道为另一功能基因与荧光蛋白RFP的融合，当进行胁迫处理时，各通道荧光强度变化就能阐明两功能基因是否发生互作。
如图22-23所示，对整个细胞的GhBASS5-GFP信号进行时间序列分析，结果发现，随着观察时间的延长，叶绿体的自发荧光逐渐减弱直至消失，GFP荧光信号的减弱则相对较慢，在350s时仍有较强的荧光信号。为了进一步探究不同时间序列下荧光信号强度的详细变化。选择4个研究对象对GFP、CHLO、PMT(Bright)三种荧光强度进行了数据统计，结果显示：白场(PMT)荧光强度基本稳定在30-35；叶绿体自发荧光(CHLO)初始强度为100左右，远低于GFP信号，且其强度值会随着时间的延长快速减弱并在360s左右变为0而基本消失；如图24所示，而GFP信号初始的190左右的荧光强度使其定位结果能够清楚的显示出来，而随着时间的推移，其强度虽然整体有减弱趋势，但依旧能够维持在170左右，显示出GFP荧光信号的稳定性。
通过光漂白实验和时间序列分析，发现BSMV超表达系统介导的棉花亚细胞定位标记系支持长时间、不同处理条件下棉花基因的亚细胞定位动态研究。因为BSMV病毒的持续复制和移动能够使GFP蛋白也能得到不断地补充，这也为在细胞中长时间的研究基因功能提供了基础。通过BSMV超表达系统在棉花根及叶组织中检测到相对应的各个细胞器的荧光信号，由此，基于BSMV超表达系统的一套棉花亚细胞定位标记体系初步建立。
实验四、四组分BSMV超表达棉花基因载体能够在棉花中进行两个或两个以上基因的共表达。
蛋白共定位研究需要原生质体的共转化或转基因植物的帮助。在水稻中，将融合有红色荧光蛋白的线粒体来源的OsAPX5和OsAPX6载体分别导入GFP融合的线粒体标记的转基因植物的原生质体中，2016年公开文献题目《A set of GFP-based organelle markerlines combined with DsRed-based gateway vectors for subcellular localizationstudy in rice》，出自Plant Molecular Biology，本实验的实验结果与以上文献记载的拟南芥原生质体和烟草BY2细胞进行比较分析的实验结果是一致的，从而验证了水稻细胞器定位系统的可靠性。与水稻一样，紫花苜蓿、玉米、棉花等许多植物也是需要模式材料或转基因材料的协助。但是，异源表达可能无法如实反映不同植物物种中的天然的亚细胞定位情况。
本实验中，如图25所示，将定位于高尔基体上的GhMAN1-GFP中的绿色荧光蛋白替换为红色荧光蛋白RFP(mCherry)，形成GhMAN1-RFP，随后使用GhMAN1-RFP和GhPIP2-GFP两种病毒液进行了实验，结果可以在根和叶中清楚地在同一细胞中观察到高尔基体(GB)的点状分布和质膜(PIP2)的网状分布，两个细胞器定位信号的存在表明已经成功建立了基于BSMV超表达系统的亚细胞定位双标记系。因此，推测此套病毒载体亦可用于棉花的蛋白质共定位研究，这也将有助于棉花基因功能的分析，从而加快棉花功能基因的研究。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用，其特征在于，BSMV超表达载体在建立棉花亚细胞定位标记系的应用。
2.根据权利要求1所述的四组分BSMV超表达棉花基因载体的应用，其特征在于，所述的BSMV超表达载体包括pCaBS-γ2:PIP2:GFP、pCaBS-γ2:MT:GFP、pCaBS-γ2:NU:GFP、pCaBS-γ2:ER:GFP、pCaBS-γ2:TP:GFP、pCaBS-γ2:PL:GFP、pCaBS-γ2:GB:GFP、pCaBS-γ2:PR:GFP。
3.一种四组分BSMV超表达棉花基因载体的构建方法，其特征在于，四组分BSMV超表达载体的构建方法的步骤为：
S1，构建Ti瞬时表达载体
S11，棉花内源性基因的克隆：选择8个长度、大小不同、在不同细胞器的基因，分别为GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP，根据内源性基因序列设计其全长引物，含酶切位点KpnI和XbaI，进行PCR扩增；
S12，回收目的片段，将胶回收产物和T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；
S13，以验证成功的连接有目的片段的T载体为模板进行PCR扩增；
S14，将S13的PCR产物进行电泳并回收目的片段，将回收的PCR产物和含GFP基因的pCAMBIA-1300载体同时进行双酶切，反应条件为37℃水浴酶切3小时，将酶切产物进行纯化并回收目的片段和空载体，并将目的片段和空载体进行连接；
S15，将S14得到的连接产物进行大肠杆菌DH5α感受态转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒，对已测浓度的质粒进行双酶切验证，根据电泳结果判断酶切条带大小，将酶切验证正确的质粒进行测序，并于-80℃保存；
S16，农杆菌的转化和筛选：将测序正确的质粒转化农杆菌GV3101，并通过PCR结果挑选出验证正确的单克隆，在-80℃保存菌液，并将单克隆在新的YEB固体培养基上划线4℃留存，获得Ti瞬时表达载体；
S2，基于Ti瞬时表达载体，构建BSMV超表达载体
S21，内源性基因与GFP融合体的克隆：以S1构建好的瞬时表达载体为模板，以内源性基因及GFP融合片段为目的片段设计LIC引物，在前后引物的5’端分别加入AAGGAAGTTTAA及CGGGCC AGCCACCGCCACCAGT形成LIC引物；
S22，将PCR产物电泳并进行胶回收；
S23，pCaBS-γ2用ApaI单酶切使之线性化后并纯化回收；
S24，将S22、S23两个反应体系在22℃反应30min后，75℃水浴20min使酶失活，将10ng处理后的载体与100ng处理后的目的片段涡旋混合均匀，加热至66℃反应2min，然后室温放置10min左右使混合液降至室温，加入1μL T4连接酶及1μL T4 buffer进行连接1h，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α细胞中，通过菌落PCR筛选菌落，并通过测序验证是否正确插入；
S25，大肠杆菌DH5α转化，挑选单菌落摇菌并提取质粒及酶切验证，获得BSMV超表达载体。
4.根据权利要求3所述的四组分BSMV超表达棉花基因载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤S11中GhPM-GFP、GhMT-GFP、GhNU-GFP、GhER-GFP、GhTP-GFP、GhPL-GFP、GhGB-GFP、GhPR-GFP的正、反引物为：
GhPM-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGACTAAGGATATTGAGACCACGG
GhPM-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAAGCATTGCTCCTGAAAGATCCAAGG
GhMT-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCAGCTCGTAGAATCTCTTC
GhMT-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGACAACCATGCTGGATTCTTCAAAGG
GhNU-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGAACCACAACCCGCAATCC
GhNU-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAATTCCTCTCTAGAAGCGGGATCG
GhER-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGAAGAACACTGAAAGACTCGCC
GhER-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGA TACATCAAATCTCAATGCTAGGGC
GhTP-GFP的正向引物序列为：CGATGGATCCATGCCGATCAGAAACATAGCAG
GhTP-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAAATAATCGGTGGTTGGGAGCTGCTCG
GhPL-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGAGGTTTTATCTTCTTCGTCTTC
GhPL-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGATGTACCAGATCCTATAAGTGTGTGG
GhGB-GFP的正向引物序列为：CGCGGATCCATGGCGAGGAGTAGATCATCGTCAT
GhGB-GFP的反向引物序列为：TGCTCTAGACAGTAGTAGTATCCCAAGCAGGTAG
GhPR-GFP的正向引物序列为：CGAGGATCCATGGCGTTTCCAGTAGTCGATACCG
GhPR-GFP的反向引物序列为：GCATCTAGAACTTCATTCTTTTGCGGACCTCGT。
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