JPS63276492A - オクトピンシンターゼ遺伝子エンハンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明の分野は植物の分子生物学の領域に属し。

組換えＤＮＡ技術による植物の遺伝子工学に関する。

本発明は植物発現遺伝子（Ｔ−ＤＮＡのオクトピンシン
ターゼ遺伝子）の上流側非転写領域に由来するＤＮＡ配
列の同定と特徴付けについて述べている。

このヌクレオチド配列は、単子葉植物および双子葉植物
の両方に対し１組換えＤＮＡを含むその組織において、
近傍に、好ましくは下流に存在する植物発現遺伝子の転
写を活性化または増大させ得る。

転写活性化因子は植物においてその近傍に存在する遺伝
子の発現レベルを増大させるのに有用である。これは、
特に該遺伝子と該遺伝子に関連するプロモーターとが異
種の植物種から誘導されている場合に有用である。従っ
て２本発明は植物の遺伝子工学によって経済的または研
究的に価値のある新規な表現型を発現させることを容易
にする。

（従来の技術） 真核細胞の遺伝子については、転写の開始を支配し、遺
伝子の発現を調節または調整するＤＮ＾配列因子に関す
る理解が増大している。以下の考察はＲＮＡポリメラー
ゼ■によって転写される遺伝子に適用される。プロモー
ターは、　　ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始し１次い
でタンパク合成が進行し得るシグナルを含む遺伝子の始
点にあるＤＮＡ配列部分である。真核細胞のプロモータ
ーは複雑であり、転写開始部位に対して約３０ｂｐ上流
付近にあるＴＡＴＡボックス共通配列と、しばしば約７
５ｂｐ上流にあるＣＡＡＴボックス共通配列、または＋
１として定義されるキャップ部位を包含する成分から構
成されている（Ｒ，ＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＰ、Ｃ
ｈａｍｂｏｎ　（１９８１）。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５０：３４９−３８
３；　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）　。

「植物の遺伝子工学Ｊ　、　Ｔ、Ｋｏｓｕｇｅ、　Ｃ，
Ｐ、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ。

およびＡ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒｍ、ｐｐ、２１１−２
２７）　、植物では。

Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）がＡＧＧＡボックスと名
付け、キャップ部位から同様の距離に位置する共通配列
によって、このＣＡＭＴボックスを置き換えることがで
きる。５゛非転写領域にある別のＤＮＡ配列は、遺伝子
発現の調整に影響すると考えられている。環境の刺激（
例えば、照明または栄養源の利用性あるいは不利な条件
（熱シ式ツク、嫌気生活、または重金属の存在を含む）
）に応答して遺伝子発現に影響を与えるＤＮＡ配列が存
在する。発生の間に遺伝子発現を制御するかまたは組織
特異的に遺伝子発現を制御するＤＮ＾配列も存在する。

他のＤＮＡ配列は近傍に存在する遺伝子の全発現レベル
を上昇させることが見い出されている；このような配列
は。

動物の系では“エンハンサ−゛と名付けられている。酵
母では、“上流活性化配列゛と呼ばれる類億の刺激配列
が知られており、この配列もしばしば調節情報を有する
ようである。プロモーターは。

通常、対応する遺伝子のコード領域の始点に対して、５
゛側すなわち上流に位置している。転写の調節または絶
対的なレベルに影響を及ぼすすべての補助的因子を包含
する領域は、　１００ｂｐより少ないかまたは１　ｋｂ
ｐ程度の塩基から構成されている。

ＫｈｏｕｒｙおよびＧｒｕｓｓ（１９８３）、　Ｃｅ１
ｌ　３３：３１３−３１４によって定義されているよう
に、エンハンサ−は真核細胞における１組のプロモータ
ー因子の１つであり、近傍の遺伝子に対する位置および
方向に比較的依存せずに転写効率を増大させる。プロト
タイプのエンハンサ−は、　ＳＶ４０における７２ｂｐ
の繰り返し配列内に見い出される。このエンハンサ−は
転写開始部位から１００ｂｐを越える下流に位置し。

ｅＴｅ司μスＧという共通コア配列を有する。一般に、
動物または動物ウィルスのエンハンサ−は。

いずれの方向に１　ｋｂｐ程度離れていても機能し。

しかも遺伝子の５゛側または３゛側のいずれに位置して
も機能し得る。この配列の特色は、一般的に数回繰り返
して述べられている。エンハンサ−は弱いプロモーター
を有する遺伝子を研究するために動物ウィルス系で用い
られている（Ｆ、Ｌｅｅら（１９８１）。

Ｎａｔｕｒｅ　２９４：２２８−２３２；　Ａ、Ｈｕａ
ｎｇら（１９８１）、　Ｃｅ１ｌ　２１：２４５−２５
５）。動物のエンハンサ−における共通コア配列と相同
性を有する植物遺伝子由来の配列が存在する。しかしな
がら、これら配列の機能的役割は明らかにされていない
。このような相同性が見い出されている１例はエンドウ
マメのレグミン遺伝子の場合である。この遺伝子の５゛
側には配列５”−ＣＣＡＣＣＴＣＣ−３′が転写開始部
位に対して約−１８０位に見られる。この配列は動物の
場合の配列全体に対して約８０％の相同性を示す（Ｇ、
Ｌｙｃｅｔｔら（１９８４）　。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２：４４９３
−４５０６）　６同様の配列が見られる他の２例は、ト
ウモロコシのＡｄｈ１遺伝子および担垣２遺伝子の５゛
側隣接領域に存在する。

これらの場合には、注目すべき配列はＣＡＣＣＴＣＣで
あり、担庸２に対しては約−１７０位、そしてル功１に
対しては一２００位に見られる（Ｅ、Ｄｅｎｎｉｓら（
１９８５）　。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３ニア２７−
７４３；およびり、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎら（１９８５）
、　　ｒ植物ゲノムの分子形態と機能Ｊ　、　Ｖａｎν
ｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ、　Ｌ、Ｇｒｏｏｔ＋　およ
びＴ、Ｈ，Ｈａｌｌｌ、プレナムプレス、ニューヨーク
）。

酵母の上流活性化配列（ＵＡＳ）は動物のエンハンサ−
とは少し異なった性質を有する。動物のエンハンサ−と
同様に、酵母のＵＡＳは、いずれの方向で挿入された場
合にも機能するが、転写開始部位に対して３゛側に配置
された場合には転写を活性化することはできない（Ｌ、
ＧｕａｒｅｎｔｅおよびＥ、１Ｉｏａｒ（１９８４）、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　　８１ニア８６０−７８６４　；およびに、５ｔｒ
ｕｈｌ　（１９８４）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８１ニア８６５−７８６９）　、
いくつかの酵母のプロモーター因子に対する活性化領域
の配列が知られており、少なくとも２つの場合には、　
ＳＶ４０エンハンサ−共通コア配列に対して相同性を有
することが示されているＣＢ、　Ｅｒｒｅｄｅら（１９
８５）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８２：５４２３−５
４２７．およびＧ、Ｒｏｅｄｅｒら（１９８５）、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
　８２：５４２８−５４３２　）。これらの配列に関連
して、細胞が特定のＵＡＳに依存して刺激（例えば、栄
養状態または交配型）に応答し得るという情報も存在す
る。

上流配列の特色が下流の転写活性を調節する別の場合は
、熱シラツク因子の場合である。熱シヨツク因子は酵母
からヒトおよび植物の生物体において温度上昇によるス
トレスに対する応答を制御する。ショウジヨウバエでは
、この特色に対する共通配列は５’　−ＣＴＧＧＡＡＴ
−ＴＴＣＴＡＧＡ−３’　（Ｈ，ＰｅｌｈａｍおよびＭ
、Ｂｉｅｎｚ　（１９８２）、　　’細菌からヒトまで
に対する熱ショック」、コールドスプリングハーバ−ラ
ボラトリ−、ｐｐ、４３−４８）　ｏ　Ｄ、Ｒｏｃｈｅ
ｓｔｅｒ　ら（１９８６）ＥＭＢＯＪ、　５　：４５１
−４５８．はトウモロコシの炉頭７０熱ショック遺伝子
の５′側に依存する２つの配列を同定しており、これら
配列は共通配列に対して部分的な相同性を有する：　５
’−ＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡ−３’および５
’−ＣＣＣＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡ−３’。

最近、植物の調節因子に関心が寄せられている；組織特
異性、および光と嫌気的条件に対する応答性を伴うと提
案されている配列が存在し、いくつかの高度に発現され
る遺伝子の５゛側にエンハンサ一様の配列が存在すると
仮定されている。エンハンサ一様の配列に関する１つの
報告は、　Ｊ、０ｄｅｌｌら（１９８５）、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　　３１３：８１０−８１２であり、カリフラワー
モヂイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ遺伝子の５゜非
転写領域の範囲について記載されている。該領域はリポ
ータ−遺伝子の発現を促進するのに必要である。−１０
５〜−４６位の領域にある配列を調べることによって、
　ＣＡＡＴボックス様の配列、逆反復領域、および動物
におけるエンハンサ−のコア配列に類似した配列が明ら
かになった。この動物のエンハンサ一様配列が活性の原
因であることは示されていない。ＣａＭＶの宿主範囲は
アブラナ科の植物に限定されるが、３５Ｓプロモ一ター
全体がタバコで機能することが知られている（Ｊ、０ｄ
ｅｌｌら（１９８５）（前出）　、　Ｍ、Ｂｅｖａｎら
（１９８５）ＥＭＢＯＪ、　４　：１９２Ｌ１９２６）
。

交差発現の研究に関する文献が増加しているが。

これら文献では、ある植物種の遺伝子の異種における発
現について調べられている。交差発現に関する初期の報
告は、　　Ｎ、Ｍｕｒａｉら（１９８３）、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ２２２　：　４７６−４８２　）の報告である。

彼らはヒマワリ（１１ｅｌｉａｎｔｈｕｓ）の組織にお
けるＰｈａｓｅｏｌｕｓ　　烈ｎ肛旦り、のコアゼオワ
ンタンパクの発現を報告した。このタンパクはＴ−ＤＮ
Ａプロモーターとそれ自身のプロモーターの制御下にあ
る融合タンパクである。

Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎらは続いて、コアゼ
オリンプロモーターと構造遺伝子がタバコで機能するこ
と。

および異種の宿主における組繊特異的な発現が天然のエ
ンドウマメの宿主における発現と同様であることを報告
した（Ｃ，Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら（１９
８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　８２：　３３２０−３３２４　）。

Ｗ、Ｇｕｒｌｅｙら　（１９８６）、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ
　Ｂｉｏｌ、　６　：５５９−５６５；およびＫｅｙら
、　　ＥＰＯ特許出願番号Ｎｏ、８５３０２５９３．０
　（１９８５年４月１２日出願）には、ヒマワリの腫瘍
細胞におけるダイズの熱シヨツク遺伝子の発現について
記載されている；この遺伝子は、熱による誘導に正確に
応答して強く転写された。この遺伝子は３゜２ｋｂの上
流ＤＮＡを有するので、おそらくそれ自身のプロモータ
ーによって伝えられるシグナルに応答して転写されたの
であろう。

別の例は、　Ｊ、Ｊｏｎｅｓら（１９８５）、　ＥＭＢ
ＯＪ、　４　：２４１１−２４１８の場合である。ペチ
ュニアのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク由来のプロモ
ーターがオクトピンシンターゼ遺伝子（部組）に融合さ
れた。このプロモーターは、ノーザンおよびサザーンハ
イプリダイゼーションの実験における検出に対して唯一
の配列を与えた。これらの研究者たちは、再生した同種
（ペチュニア）および異種（タバコ）の形質転換植物体
の両方において転写が起こることを見い出した。振リポ
ーター遺伝子活性は検出されなかったが、これはおそら
くこの構築物がｏｃｓポリペプチドのアミノ末端におい
て３つのアミノ酸置換を有する翻訳産物を与えるからで
ある。

双子葉宿主植物において単子葉植物のプロモーターから
開始される転写に関して最初に報告された証拠は、　Ｍ
、ＭａＬｚｋｅら（１９８４）、　ＥＭＢＯＪ、　３　
：１５２５−１５３１から得られる。トウモロコシのゼ
インＺ４遺伝子がクローン化され、Ｔｉプラスミド由来
のベクターによってヒマワリの茎の小片（ｓｔｅｍｌｅ
ｔ　）に導入された。ゼインｍＲＮＡは小麦の胚芽系に
おいて翻訳され得るが、形質転換されたヒマワリのカル
スの抽出物中にゼインタンパクを検出することはできな
かった。

単子葉植物と双子葉植物の境界を越えた発現に関する第
２のこのような報告は、　Ｇ、Ｌａｍｐｐａら（１９８
５）　。

Ｎａ　ｔｕｒｅ担ニア５０−７５２の報告である。主要
なりロロフィルａ／ｂ結合タンパクをコードする小麦の
遺伝子ｗｈＡ８１．６がＴ−ＤＮＡ含有ベクターにクロ
ーン化され、そしてペチ工ニアとタバコの両方に導入さ
れた。転写レベルでの発現は、小麦におけるように。

双子葉植物宿主において光誘導性でありかつ組織特異的
であると決定された。実際の外来タンパクの合成に関す
るデータは与えられなかった。

Ｄ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ　ら　（１９８６）、　ＥＭＰ
ＩＯＪ、　５　：４５１−４５８も双子葉植物における
トウモロコシのプロモーターの発現を検出した。用いら
れたトウモロコシのプロモーターはハイブリッド加注７
０遺伝子のものであった。樽１７０は、細菌からヒトま
での生物体におけるように、トウモロコシにおいて熱シ
ョックに応答して誘導される１組のタンパクの１つであ
る。遺伝子を導入されたペチュニアでは、トウモロコシ
のＡｄｈ７０　ｍＲＮＡは熱ストレスに応答してのみ合
成された。

実際の植物調節配列に関する１つの研究は１Ｍ。

Ｔｉｍｋｏら（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　３１８：
５７９−５８２の研究である。エンドウマメのｍｌ）Ｃ
３５５３，６（リブロース１．５ビス−ホスフェートカ
ルボキシラーゼの小サブユニット）の転写開始部位に対
して、５′側における−９７３〜−９０位のＤＮＡの広
がりが、遺伝子を導入されたタバコ植物を光照射した後
に、リポータ−遺伝子の誘導レベルを増大させることが
見い出された。刺激効果は、　−９７３〜−９０位の部
分をいずれの方向で挿入した場合にも観察されたが；　
リポータ−遺伝子の３゛側に挿入した場合には、高いレ
ベルの遺伝子発現は促進されなかった。　Ｊ、Ｓｉｍｐ
ｓｏｎら（１９８５）、　ＥＭＢＯＪ、土：　２７２３
−２７２９は、酵素のリポータ−を用いて、エンドウマ
メのクロロフィルａ／ｂ結合タンパクＡＢ８０遺伝子の
上流配列の効果を研究した。彼らは、　４００ｂｐの上
流配列が光誘導性と組織特異性の両方に対して必要な情
報を有すること、およびさらに上流の配列が遺伝子発現
の絶対的レベルを決定する際に含まれることを見い出し
た。配列データを示す図には、動物のエンハンサ−のコ
ア共通配列に対して多少の相同性を有する６ｂｐの強調
して表示された部分、　ＴＧＧＡＴＡがあり。

転写開始部位に対して約−２３０位に存在する。いずれ
の報告にも１機能的な活性を有する特定のヌクレオチド
配列に関する決定的なデータは示されていない。

ＨＪａｕｌｅｎら（１９８６）、　ＥＭＢＯＪ、　５　
：Ｌ８は、カルコンシンターゼの光誘導性について、こ
の遺伝子の５゛側非転写領域をリポータ−遺伝子と融合
させることによって研究した。１．２ｋｂｐの５”ＤＮ
Ａは光誘導性と最大の発現とを与えたが、　−１２００
〜−３５７位の欠失体は低い発現を与えた。しかし、光
誘導応答は報告されなかった。これらの著者は、この配
列ヲ調べて、−６６１位と一５６４位との間の領域に４
７ｂｐの反復配列を見い出した；この領域には、動物の
エンハンサ−の共通コア配列５’　−ＧＴＧＧＴＴＡＧ
−３’に対して良く一致する配列が含まれる。植物にお
ケルコの配列のエンハンサ−活性は示されていない。

光誘導および組織特異性に関連したシス活性配列に関す
るかなり詳細な考察は、　Ｒ，Ｆｌｕｈｒら（１９８６
）　。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：１１０６−１１１２に与えら
れた。彼らは。

エンドウマメのｒｂｃＳ−Ｅ９遺伝子の５゛側の−１０
５９〜−２位領域が光誘導性と組織特異的発現を与える
こと、および−３５２〜−２位領域が遺伝子を導入され
たペチュニアでは正常な発現を与えるが、カルスではか
なり低レベルの発現しか与えないことを示した。光応答
は５”ＤＮＡの−３７〜−２位領域が存在する場合にの
み誘導された。関連するｒｂｃＳ−３Ａ遺伝子由来の５
゛側−４１０〜＋１５位領域は組織特異性と光誘導とを
与えた。配列の機能をさらに詳細に吟味する試みにおい
て、彼らは、　−３２７〜−４８位の断片を、エンハン
サ−のないＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター−リポータ−
遺伝子系に融合した；この断片はいずれの方向で挿入さ
れた場合にも光誘導と組織特異性とを与えた。ｒｂｃＳ
−Ｅ９由来の−３１７〜−８２位の断片も同様の結果を
与えた。また、配列分析によって、　ＳＶ４０のエンハ
ンサ−に類似した領域が示された。この著者°らはＤＮ
Ａのこれら上流領域が光誘導性の転写エンハンサ−の性
質を有すると主張している；これら領域内の特定のＤＮ
Ａ配列は同定されなかった。著者らは、７つの配列決定
されたｒｂｃＳ上流領域の分析に関する考察を続けた。

この領域には、　ＳＶ４０のエンハンサ−のコア共通配
列と酵母のＴＶエンハンサ−とに類似した配列が見い出
された。これらの配列決定された遺伝子には。

エンドウマメだけでなく　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａおよびダ
イズに由来するものも含まれた。Ｇ、Ｍｏｒｅｌｌｉら
（１９８５）　。

Ｎａｔｕｒｅ　３１５：２００−２０４には、双子葉植
物の光調節遺伝子に対する調節配列が報告された。この
配列は：５”−ＣＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＧＣ（またはＡ
）−３゜である。

Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋　　ｔｕ＋ｗｅｆａｃｉ
ｅｎｓの２つのＴ−ＤＮＡ遺伝子は充分に特徴付けられ
ている。ｏｃｓ遺伝子はオクトピンシンターゼをコード
し、オクトピン型Ｔｉプラスミド（例えば、　ｐＴｉＡ
ｃｈ５　基よびｐＴｉ１５５５９）によって運ばれる。

ツバリンシンターゼに対する遺伝子は」匹であり、ツバ
リン型Ｔｉプラスミド上に存在する。ｏｃｓと那但の両
方、およびその５゛側隣接領域は配列決定されている（
１１．ＤｅＧｒｅｖｅら（１９Ｂ２）　。

Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、土：４９９−５１
１；　Ｍ、Ｂｅｖａｎら（１９８３）　。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１：３６９−
３８５；　Ａ、Ｄｅｐｉｃｋｅｒら（１９８２）、Ｊ、
Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、上：５６１−５７３）
　、これら遺伝子の両方が植物組繊で発現することは構
成的であり９組織特異性は存在しないようである（Ｌ。

Ｏｔ　ｔｅｎ　ら（１９８１）、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ、　１８３：２０９−２１３）　。

Ｔ−ＤＮＡの５゛非転写領域におけるエンハンサ一様活
性に関するデータは公表されていない。しかし。

Ｃ，Ｋｏｎｃｚら（１９８３）、ＥＭＢＯＪ、　２　：
１５９７−１６０３は、　　−２９４位と一１７０位と
の間の領域がｏｃｓの完全な発現に必要であることを示
した。」競に対する配列は、動物および動物ウィルスの
エンハンサ−が公知となった後に＋　Ｈ，ＤｅＧｒｅｖ
ｅら（１９８３）、　（前出）によって公表された。著
者らは、この遺伝子のＴＡＴＡボックス様配列色配列側
におけるポリアデニル化シグナルの存在に注目したが、
調節に対して重要性を有する可能性のある配列について
は全（注目しなかった。彼らは、おそら（ｏｃｓプロモ
ーターがＴ−ＤＮＡの端部に近接しているために、玉の
転写レベルに影響を与える植物の隣接配列が存在し得る
と示唆している。

」匹遺伝子を最大限に発現させるのに必要な５゛配列の
範囲に関する文献には矛盾するデータが存在する。Ｃ０
Ｋｏｎｃｚら（１９８３）、　（前出）は、ル硯遺伝子
を最大限に発現させるのに必要なすべてのシグナルが転
写開始部位の上流２６１ｂｐ内に存在するというデータ
を提出した。これとは対照的に、　Ｃ，Ｓｈａｗら（１
９８４）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅａ、　
１２ニア８３１−７８４６は。

−８８位よりさらに上流の配列がコランコニの葉および
茎の試験系における」匹の発現には必須ではないことを
示した。Ｇ、Ａｎら（１９８６）　＋　Ｍｏ１．Ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ。

別３　：２４５−２５０は、　ＴＡＴＡボックス（−２
６〜−１９位）およびＣＡＡＴボックス（−７８〜−７
０位）を含む厖臣上流ＤＮＡ領域が充分な転写に必要で
あること、および−１３０位と一１０１位との間の配列
がタバコにおける発現に絶対必要であることをご（最近
立証している。ダイレクトリピート配列およびインダイ
レクトリピート配列が、この出版物中に示されている：
欠失分析は、一対のダイレクトリピート配列＜−１７１
〜−１６１位および−１３７〜−１２７位）と一対のイ
ンバーチイツトリピート配列（−１４８〜−１４１位お
よび−１１４〜−１０６位）とが下流の遺伝子の発現レ
ベルを調節し得ることを示唆している。

組換えＤＮＡを植物組織に導入するのに利用し得るいく
つかの技術が存在する。これらの技術は。

組換えＤＮＡを植物ゲノムへ安定に一体化するか。

あるいはゲノムへの取り込みを必要としない過渡的発現
系において操作された遺伝子の活性を測定するためのも
のである。細菌から植物へのＴ−ＤＮＡに依存した代表
的なりローニングベクター系は。

以下の文献に記載されている：　Ｇ、Ａｎ（１９８６）
、　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、８１：８６−９１；　
Ｇ、Ａｎら（１９８５）、　ＥＭＢＯＪ、土：２７７−
２８４；　Ｌ、Ｈ６ｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（
１９８３）、　ＥＭＢＯＪ。

’ｌ　：９３７−９９５；　１，１ｅｒｒｅｒａ−Ｅｓ
ｔｒｅｌｌａら（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ。

３０３：２０９−２１３；およびり、Ｈｅｒｒｅｒａ−
Ｅｓｔｒｅｌ　ｌａら（１９８５）　。

「植物の遺伝子工学、、１　＋　Ｊ　、）Ｉ　、Ｄｏｄ
ｄｓ　Ｑ　＋　二：ｓ−−ヨ一り：ケンブリッジ大学出
版会＋　ｐｐ、６３−９３゜Ｔ−ＤＮＡベクターは細菌
から植物への移動に頼っているが。

こノ移動はハ９あ脛匡吐四　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓお
よびそれに存在するＴｉプラスミドによってトランスに
供給される機能を用いている。一般に、　Ｔ−ＤＮＡが
媒介する移入は、ゲノムへの安定な一体化がもたらされ
るように行われる。このような系は主として双子葉植物
において有用である。なぜなら、釦皿−ｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍの宿主範囲が双子葉植物（Ｍ、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａ
ｇｕおよびＪ、５ｃｈｅｌｌ（１９８２）　Ｃｕｒｒ、
Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

９６：２３７−２５４；　Ｍ、ＤｅＣｌｅｅｎｅおよび
Ｊ、Ｄｅｌｅｙ　（１９７６）。

Ｂｏｔ　Ｒｅｖ、４２：３８９−４６６）および少数の
非穀物類双子葉植物（Ｊ、−Ｐ、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅ
ｎｓら（１９８４）、　ＥＭＢＯＪ。

３　：３０３９−３０４１；　Ｇ、ｔｌｏｏｙｋａａａ
−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、　（１９８５）　。

Ｎａｔｕｒｅ　３１ユニ７６３−７６４）に限定される
と考えられているからである。組換えＴ−ＤＮＡの研究
に対して最も広範囲に用いられる植物の宿主モデルは、
双子葉植物のヒマワリ、ペチュニア、およびタバコであ
る。アグロインフエクションの技術は、　Ｔ−ＤＮＡ含
有ベクターを導入し得る単子葉植物の範囲を拡張してい
る（Ｎ、Ｇｒｉｍｓｌｅｙら（１９８６）、　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：３２８２−３２８６
）　。

Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが媒介するＤＮＡ移入シス
テムに代わるものが知られており、単子葉植物および双
子葉植物の両方のプロトプラストに対してＤＮＡを組み
込むためのエレクトロポレーション（Ｍ、Ｆｒｏｍ＋ｍ
ら（１９８５）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ　８２：５８２４−５８２８）　。

およびポリエチレングリコール（Ｊ、Ｐａｓｚｋｏｗｓ
ｋｉら（１９８４）、　ＥＭＢＯＪ、　　３　：２７１
？−２７２２）またはカルシウムイオンによって媒介さ
れるプロトプラストのＤＮＡ分子による直接的な形質転
換が含まれる。Ｔ−ＤＮＡに依存せずに組換えＤＮＡを
導入する別の手段は。

植物の細胞核へのＤＮＡのマイクロインジェクションで
ある（Ａ、Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

２０２　：１７９−１８５）　、これらの技術は最初の
ＤＮＡ受容体として植物細胞のプロトプラスト（細胞壁
のない形）を用いる；プロトプラストに関する公知の操
作によって、細胞または組織培養物、あるいは最終的に
再生された形質転換植物体が得られる。

このような代替方法を用いることによって、異種の遺伝
子を導入することのできる植物の範囲が広がる。Ｐａｓ
ｚｋｏｗｓｋｉら（前出）は、ゲノムへの一体化がＴ−
ＤＮＡ配列が存在しなくても起こり得ることを示してい
る。

本特許出願の主題は、　Ｔ−ＤＮＡにおけるｏｃｓ　遺
伝子の５”非転写隣接領域に由来するヌクレオチド配列
：５’　−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ−３’の
同定である。この配列は植物発現プロモーターによって
進行する下流の遺伝子の発現を活性化する。この配列は
植物転写活性化因子の第１成分と名付けられている。植
物転写活性化因子は、この成分のみからなるか、あるい
はこの成分を含む大きなりＮＡ分子であり得る。また、
該因子は以下に述べる第２成分をも含み得る。植物にお
いてエンハンサ一様活性を有するこの機能的な第１成分
は。

プロトタイプの動物エンハンサ−のコア共通配列に対し
て相同性を有する配列を持たない。組換えＤＮＡ構築物
は、上記の配列を含む合成オリゴヌクレオチド、あるい
は細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（二は）リポータ−遺伝子を有するトウモロコシの
嫌気的調節アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈｌ）プ
ロモーターの５゛側に位置する屋上法領域の適当な断片
で遺伝子操作されている。これらの両方の場合に、圓酵
素活性の嫌気的誘導は形質転換されたタバコ植物におい
て得られた。転写活性化因子を有さない類似の構築物は
、與またはル埴１がリポータ−遺伝子として働く場合に
は、タバコにおいて検出し得る発現を与えなかった。転
写活性化因子の機能性は。

トウモロコシの培養細胞またはＮ１ｃｏｔｉａｎａ　　
Ｎ憇−複ｖＩ互ｆｏｌｉａ−の培養細胞における過渡的
発現分析によっても決定された。このようにして、転写
活性化因子が単子葉植物および双子葉植物の両方におい
て機能する能力が立証された。

（以下余白） （発明の要旨） 本発明は、植物において下流遺伝子の発現を増大または
活性化する転写活性化因子の単離および特徴付けを行う
ものである。この因子は、アグロバクテリウム　ツメフ
ァシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ　）由来のＴ−ＤＮＡのオクトピンシンター
ゼ（部１）遺伝子の上流非転写隣接領域内に１本来存在
する配列として見い出される。この植物で活性な転写活
性化因子の本質的な主要成分（第１成分）は、（５゛−
＾ＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ−３’　）である同
定ＤＮＡ配列を有する。この配列の逆配列も効果的であ
り、ここではこの逆配列も固定配列と呼ぶ。

この固定配列に対して約５０％またはそれ以上の相同性
を有する配列、そして好ましくは約７５％またはそれ以
上の相同性を有する配列も植物転写活性化因子として機
能し得る。下流の転写を活性化するのに必要かつ充分で
あるこのような配列は、これらの配列の天然源において
使用するか、またはこれらの配列の天然源から得られた
ものとして使用し得る。あるいは、　ＤＮＡオリゴヌク
レオチド化学合成についての公知技術を用いて上記ＤＮ
Ａ配列を生成し得る。さらに転写活性化因子の天然源に
おいて第２の成分が見い出されており、該成分は固定配
列５”−ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３’を有する。こ
の配列の逆配列も効果的であり、ここではこの逆配列も
固定配列と呼ぶ。固定配列に対して約５０％またはそれ
以上の相同性、そして好ましくは７５％またはそれ以上
の相同性を有する配列は、同様の機能性を有する。この
第２の成分は植物の転写活性化に必要ではないが、下流
遺伝子の発現の増大レベルに効果を与え得る。

本発明の主な目的は、植物組織で作用する転写活性化因
子を提供することにある。この転写活性化因子は、植物
が発現し得る構造遺伝子の転写レベルを調節する。この
成分は転写開始部位の上流に配置されるのが好ましく、
その位置はプロモーター遺伝子のＴＡＴＡボックスの５
゛側すぐ上流（例えば、約−４０ｂｐ　）から転写開始
部位の５゛側約１５００ｂｐまでのいずれの位置でもよ
い。理想的には、構造遺伝子の発現レベルが転写活性化
因子によって増大するように、転写活性化因子はプロモ
ーター配列の５”側約１ｏｏｂｐと約３００ｂｐとの間
に位置すべきである。転写活性化因子は、制御すべき遺
伝子の上流に配置するのが好ましいが、該遺伝子の下流
にも配置し得る。下流に配置した場合、効果の割合はよ
り小さくなる。

転写活性化因子は、配列（５’−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣ
ＴＴＡＣＧＴ−３’　）からなる本質的な第１の成分、
またはこの配列に約５０％〜１００％、好ましくは約７
５％〜１００％の相同性を有する配列を含有する。この
相同性を有する配列は９本来存在する配列の成分として
用いられるか、または化学合成物質として用いられる。

このような配列は、与えられた方向およびその逆方向で
効果的である。

転写活性化因子には第２の任意の成分があり得る。この
成分は、　ＤＮＡ配列５゛〜ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ
−３’と同一であるか、またはこの第２の成分に約５０
％。

好ましくは約７５％〜１００％の相同性を有する配列で
ある。第２の成分は、好ましくは上記転写活性化因子の
第１の成分の約５ｏｏｂｐ以内に配置され。

理想的には該第１の成分の約２０ｂｐから約１００ｂｐ
以内に配置される。この成分は与えられた方向およびそ
の逆方向の両方で効果的である。第２の成分は第１の成
分の５゛側あるいは３′側のいずれにも配置し得るが、
与えられた方向では、第２の成分は第１の成分の３゛側
にあることが好ましい。

両方の成分からなる転写活性化因子は、第１の成分がこ
の第２の成分の５°側にあるという本来存在する方向と
同様に、その逆方向も効果的である。

この転写活性化因子は単子葉および双子葉植物で同様に
機能する。

本発明のさらなる目的は、植物の転写活性化因子、植物
で発現可能なプロモーター、および植物で発現可能な構
造遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子を提供することであ
る。ここで、構造遺伝子は転写活性化因子およびプロモ
ーターの調節制御下に置かれている。

本発明の第３の目的は、特にプロモーターおよび構造遺
伝子が２発現させようとする植物組織以外の起源から得
られる場合に、植物で発現可能な遺伝子の植物組織にお
ける発現レベルを増大させる方法を提供することである
。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、遺伝子の転写レベルを活
性化または促進し得る植物転写活性化因子を含み、該植
物転写活性化因子は、　５’−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴ
ＴＡＣＧＴ−３”およびその逆配列でなる群から選択さ
れる固定配列に対して約５０〜１００％の相同性を有す
る配列を含む。

本発明の他の組換えＤＮＡ分子は、上記配列と。

５°−ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３’およびその逆配
列でなる群から選択される第２の固定配列に対して約５
０〜１００％の相同性を有する配列を包含する第２の成
分と。

を含む。

本発明のさらに他の組換えＤＮＡ分子は、上記ＤＮＡ分
子を、（ａ）植物発現プロモーター；および（ｂ）植物
発現構造遺伝子と組み合わせて含み、該遺伝子は上記転
写活性化配列と該植物発現プロモーターとの調節制御下
に配置されている。

植物組織において植物発現遺伝子の発現を促進させる本
発明の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）５’−Ａ
ＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ−３’およびその逆配
列でなる群から選択される固定配列に対して約５０〜１
００％の相同性を有する配列を含む転写活性化因子を。

該転写活性化因子が該遺伝子の発現を調節するように挿
入すること；および（ｂ）該組換えＤＮＡ分子を植物組
織に導入すること。

第１図は、アグロバクテリウム　ツメファシェンス由来
Ｔ−ＤＮＡのオクトピンシンターゼ遺伝子５′側の非翻
訳領域からの１７６ｂｐ断片ＤＮＡ配列を示す。

植物活性な転写活性化因子の第１の成分と同定される１
６ｂｐの配列は、枠で囲みＡで示す。転写活性化因子の
第２の成分と同定される１２ｂｐの配列は。

枠で囲みＢで示す。

第２図は、植物活性な転写活性化因子の第１の成分を有
するオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。

第３図は、　ｐＡｄＣＡＴプラスミド１〜６系および該
プラスミドに含有される転写活性化因子／プロモーター
／構造遺伝子／ポリアデニル化シグナル複合体の成分を
示す。これらのプラスミドの構築は。

実施例に記述したようなりＮＡ組換え技術により行った
。制限部位は以下の文字で表わす：　Ｂ、　　Ｂａ’ｍ
旧；Ｅ、　　ＥｃｏＲＩ；　ｌｉｐ、　ＨｇＨ’ｆＪ：
　ＲＶ、　１ＥｃｏＲＶ；　　Ｐ、　Ｐｓｔｌ。

括弧内の文字はＰｏ１ｌのクレノー断片で充填した部位
である；部得＝オクトピンシンターゼ；倶猜＝ツバリン
シンターゼ；回エクロラムフエニコールアセチルトラン
スフェラーゼ。ｏｃｓＤＮＡのヌクレオチド調製物はＲ
，Ｂａｒｋｅｒら　（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ。

２　：３３５−３５０から、そしてＣａＭＶ３５５　Ｄ
ＮＡのヌクレオチド調製物はＡ、Ｆｒａｎｋら　（１９
８０）、Ｃｅ１ｌ　２１：２８５−２９４から調製した
。

（発明の構成） 本発明の明細書および特許請求の範囲における使用の趣
旨または範囲に関する曖昧さを取り除（ために、以下の
定義を提供する。

「発現」は、タンパク生産のための組換えＤＮＡ分子に
含まれる構造遺伝子の転写および翻訳を意味する。

「転写活性化因子（ＴＡＥ）　Ｊという用語は＋　ｏｃ
ｓ５’側の非転写領域で最初に発現され、下流遺伝子の
発現レベルを増大させる能力に関係があるＤＮＡ配列を
意味する。この機能性因子の本質的な第１の配列成分は
ヌクレオチド配列５’　−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡ
ＣＧＴ−３゜と同定されており、該配列の逆配列、およ
び該配列または該配列の逆配列に約５０％またはそれ以
上。

好ましくは７５％またはそれ以上の相同性を有する配列
を包含する。これらのＤＮＡ配列は、植物において方向
に依存しない形で、’ｍ＜の遺伝子の転写を促進（増大
）または活性化し得る。　ＴＡＢは、好ましくはプロモ
ーターＴＡＴＡボックスのすぐ上流から転写開始部位５
′側約１５００ｂｐまで配置され、理想的には転写開始
部位５゛側約５０ｂｐと約５００ｂｐとの間に配置され
る。ＴＡＢは任意である第２の成分として、　ＤＮＡ配
列５’　−ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３’　、該配列
の逆配列、あるいは該配列または該配列の逆配列の約５
０％またはそれ以上、そして好ましくは約７５％または
それ以上の相同性を有する配列を含有し得る。

これらの成分は、第１成分の好ましくは約５００ｂｐ以
内、より好ましくは約２０〜ＩＱＯｂｐ以内に配置され
る。ＴＡＢは、上記配列を含有する化学的に合成された
オリゴヌクレオチドとして、または該配列を含有する天
然由来のＤＮＡ断片として用いられ得る。

「プロモーター」は、転写の開始を指令する構造遺伝子
の５°末端の配列を意味する。プロモーター配列は下流
の構造遺伝子の発現を行うために必要であるが、いつも
充分であるとは限らない。プロモーターそれ自身は、天
然由来または合成といった２つ以上の起源から得られる
断片の合成物であり得る。真核生物のプロモーターは、
　ｍＲＮＡの５゛末端の位置（ｃａｐ部位、＋１）から
°約１０〜３０ｂｐ　　５’側の、標準的な形の５”−
ＴＡＴ＾＾−３°　（ＴＡＴＡボックス）に相同性を有
するＤＮＡ配列の存在により一般に認められる。ＴＡＴ
Ａボックスの約３０ｂｐ　５’側に他のプロモーター成
分配列がしばしば見い出され、該配列は標準的な形の５
°−ＣＣＡＡＴ−３°に相同性を有するＤＮＡ配列の存
在により確認される（Ｒ，Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈおよび
Ｐ、Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、５０：３４９−３８３）。植物において
は、　ＡＧＧＡボックスとして知られている代わりの配
列が存在し得る。ＡＧＧＡボックスは、ＧＮＧＩ−リプ
レットの周囲にアデノシン残基が対称的に配置している
ためにこう呼ばれる（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）、　ｒ植物の遺伝子操作
Ｊ　、　Ｔ、Ｋｏｓｕｇｅ。

Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、およびＡ、ｌｌｏｌｌａｅｎｄ
ｅｒ編、プレナムプレス、　ｐｐ、２１１−２２７）。

「ポリアデニル化シグナル」は、　ｍＲＮＡのプロセッ
シングを行い得るいかなる核酸配列をも意味しており、
一般にｍＲＮＡ前駆体の３゛末端にポリアデニル酸類を
付加することによって特徴付けられる。

ポリアデニル化シグナルＤＮＡ断片はそれ自身、天然由
来または合成のい（つかの起源から得られる断片の合成
物、およびゲノムＤＮＡまたはａｉＲＮＡから得られた
ｃＤＮＡ由来であり得る。ポリアデニル化シグナルは１
通常、標準的な形である５’　−ＡＡＴＡＡ−３’に相
同性があることにより確認される。しかし。

距離の変動９部分的な“読み過し”、および多数の標準
的タンデム配列は珍しくない（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇら、
（前出））。標準的な“ポリアデニル化シグナル°°は
、ポリアデニル化そのものではなく、実際には転写を終
結させるものであると認識すべきである（Ｃ，Ｍｏｎｔ
ｅｌｌ　ら（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０５　：６
００−６０５）　。

「構造遺伝子」は、タンパク、ポリペプチド。

またはこれらの一部をコードするＤＮＡ断片を含有する
遺伝子部分を意味しており、おそらくリポソーム結合部
位および／または翻訳開始コドンを含むが、少な（とも
転写開始を指令する配列の５“側の１つの成分を欠いて
いる。構造遺伝子は、植物細胞内、または該遺伝子が導
入される位置に通常は全く見い出されない遺伝子であり
得る。このような場合、この遺伝子は「異種構造遺伝子
」と呼ばれる。異種構造遺伝子は、細菌のゲノムまたは
エピソーム、真核生物の核ＤＮＡまたはプラスミドＤＮ
Ａ　、　ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ　、または化学合成
されたＤＮＡを包含する。当該技術分野に公知のいずれ
の起源からでも全体または部分として得られうる。

さらに、構造遺伝子は、ｌまたはそれ以上の修飾を含み
得るということがさらに予期される。この修飾は、コー
ド断片において、あるいは発現生産物の生物学的活性ま
たは化学的構造１発現率または発現の制御方法に影響し
うる非翻訳領域においてのいずれかにおけるものである
。このような修飾は、１またはそれ以上のヌクレオチド
の変異。

挿入、欠失、および置換を包含するが、これに限定され
ない。構造遺伝子は、連続したコード配列を構成し得る
。または、適当な植物機能性のスプライス連結で結合し
ている１またはそれ以上のイントロンを含有し得る。構
造遺伝子は、天然由来または合成の多数の起源から得ら
れる断片の合成物であり得る。構造遺伝子は融合タンパ
クも生産し得る。ＴＡＲ／プロモーター／構造遺伝子／
ポリアデニル化シグナル複合体を有する組換えＤＮＡ分
子の植物組織への導入は、　　ＴＡＥｌｉ制御下にある
天然由来の遺伝子の追加されたコピーから得られた構築
物と同様に、構造遺伝子およびそのプロモーターが同じ
種類の植物から得られたものではないような構築物を含
むということが予期される。

「植物組織」は、植物の分化組織および未分化組織を包
含する。この組織は、根、シュート、葉。

花粉５種子、クラウンゴールのような腫瘍組織。

および胚やカルスのような培養されている植物細胞の凝
集物の種々の形態物を包含するが、これに限定されない
。植物組織は植物体または器官、あるいは細胞培養物で
あり得る。

「由来」は、ここでは“〜から採取した”または“°〜
から得た゛を意味する。

「化学的に合成した」は、　ＤＮＡ配列に関して。

ヌクレオチド成分をインビトロで組み立てたということ
を意味する。ＤＮＡの用手法での化学合成は。

よく確立された方法を用いて達成し得る（すなわち、　
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８３）＋　　’ＤＮＡおよ
びＲＮＡ配列決定の方法論Ｊ　、　Ｗｅｉｓｓｍａｎ　
（Ｗ）　＋　プラエガーパプリッシャーズにューヨーク
）第１章）。あるいは、自動化学合成は多くの市販され
ている入手可能な機械の１つを用いて達成し得る。

「１１節制御」は、転写開始部位上流の配列因子により
遺伝子発現を調整することを意味する。調整は転写のオ
ン／オフスイッチとなるか、あるいは遺伝子の発現レベ
ルを変化させ得る。遺伝子を配列因子の調節制御下に置
くということは、遺伝子がスイッチをオンまたはオフに
されるように。

あるいは遺伝子の発現レベルが測定しうる程度変化する
ように、遺伝子を配列因子に充分に近づけて配置するこ
とを意味する。本発明においては。

エンハンサ−配列は構造遺伝子の約１５００ｂｐ以内。

および該遺伝子の上流に配置されるのが好ましい。

（以下余白） 「相同性」とは、ここで用いられているように。

ヌクレオチド配列の同一性を意味する。

要約すると、転写活性化因子の同定および特徴付けは以
下の一般的な段階を包含する２１５部１遺伝子の上流側
隣接領域（−２９４〜−１１６）に由来の１７６ｂｐ　
ＤＮＡ断片を、それがトウモロコシのアルコールデヒド
ロゲナーゼ１　（Ａｄｈ　１　）プロモーターの上流側
に挿入される構成でクローニングする。遺伝子を導入さ
れたタバコ宿主におけるこのプロモーターからの発現は
、この」亜由来の断片の存在には依存しなかった。この
ことは、この断片が転写活性化能力を有することを示し
ている。

２、更胆由来のＤＮＡ断片の転写活性化能力が下流のプ
ロモーター配列に対する方向性に依存しないことを示す
。

３、部慢由来の断片のヌクレオチド配列を分析し。

次の２つのパリンドローム配列の存在を明らかにする：
　５’−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ−３”およ
び５’　−ＧＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３’　。

４、四４由来の断片に対して欠失分析を行い、１６ｂｐ
パリンドロ一ム配列の存在が下流のプロモーターの転写
を活性化するのに必要であることをｆ！認する。これに
より、配列５’　−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ
−３’が転写活性化因子の第１成分として確立される。

１２ｂｐパリンドローム（第２成分）を除去しても転写
の活性化はそれほど減少しない。

５、合成オリゴヌクレオチドとして挿入された１６ｂｐ
パリンドロ一ム配列（第１成分）が下流のプロモーター
からの転写を活性化するのに充分であり、従って構造遺
伝子の発現を促進することを示す。

６．１６ｂｐ転写活性化因子が他のプロモーターの発現
を増大させ得ることを示す。

７．１６ｂｐ転写活性化因子が双子葉植物だけでな（単
子葉植物においても活性を有することを示す。

遺伝子操作によって改変され、転写活性化因子および下
流のプロモーターの制御下で構造遺伝子を発現する植物
組織を生産するためには１本発明の開示に関する特定の
教示内容が当該分野で公知の様々な技術および手段と組
み合わされる。たいていの場合、全工程の各段階には別
の手段が存在する。これら手段の選択は、転写活性化因
子／プロモーター／構造遺伝子／ポリアデニル化シグナ
ルという組み合わせ（発現複合体）の導入および安定な
維持に対するベクター系の選択；改変されるべき植物種
および所望の再生計画；そして用いられるべき特定の構
造遺伝子のような可変因子に依存する。これらのすべて
の因子は当業者が所望の結果を得るために選択して使用
し得る別の工程段階を提供する。例えば、転写活性化因
子を得る出発点は１本発明の応用ではｐＴｉＡｃｈ５に
よって例証されるが、他のオクトピン型Ｔｉプラスミド
の相同的１）ＮＡ配列または種々の起源に由来の相同的
ＤＮＡ配列は、転写活性化因子を有するＤＮ＾を操作す
る手順に対して適当な改変がなされる限り２代用するこ
とができる。同様に、コ遺伝子由来のポリアデニル化シ
グナルは、他の起源に由来の機能性シグナルに、やはり
手順を適当に改変することによって置き換えることがで
きる。構造遺伝子または他の配列の相同性は、当該分野
でよく理解されているように、これら核酸が適度に厳密
な条件下でクロスハイブリダイゼーションするｔｍ　力
比ヨって９通常の当業者が同定し得る。本発明の応用で
利用されるかまたは開示されている配列内にわずかな変
化が存在し得ることは理解される。これらの変化は９通
常の当業者が転写活性化配列、プロモーター因子、構造
遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを使用し得る標
準的技術によって決定することができる。トウモロコシ
のＡｄｈｌから嫌気的に誘導されたプロモーターの使用
は、プロモーター因子を有する他のＤＮＡ部分によって
置き換え得る。外来遺伝子を植物細胞に安定に挿入し、
改変された細胞を取り扱う改良された手段が開発されて
いるので１通常の当業者はこれらの別の工程段階を選択
して所望の結果を得ることができる。

このような手段には、エレクトロポレーション。

マイクロインジェクション、およびＤＮＡ直接転移法が
含まれるが、これらの方法には限定されない。

これらの技術によってＤＮＡを導入し得る植物細胞の範
囲が拡張される。遺伝子操作された植物を得るための好
ましい実施態様の残りの段階には、　ＴＡＥ／プロモー
ター／構造遺伝子／ポリアデニル化シグナルの組み合わ
せを、　Ｔ−ＤＮＡ含有ベクターに挿入すること、およ
び組換えＤＮＡを植物細胞に転移させることが含まれる
。ここで、改変されたＴ−ＤＮＡは植物ゲノムの一部と
して安定に一体化される。

インビトロで培養し、結果的に全植物体に再生する技術
も包含されるが、これら技術には形質転換された植物細
胞を選択し、検出する段階が含まれる。導入された遺伝
子を最初に形質転換された株から商業的に受容され得る
品種に転移させる手順は当業者に公知である。

遺伝子の発現を調整する配列の多くの例が知られている
。いくつかの場合２例えば一般的なアミノ酸制御活性化
タンパクＧＣＮ４に対する認識配列の６ｂｐコア配列の
場合には、配列が保存されていることが１機能を果たす
ためには重要である。他の系では、この要求は、それほ
ど厳密ではない。機能を維持しながら配列が拡散するよ
うな先例としては、６つのショウジ田つバエ熱ショック
遺伝子垣徂２６８および炉律２７の５”末端に存在する
熱シヨツク因子（ＨＳＥ）配列がある。ここで、１４個
の塩基のうち、それぞれ７個および９個がＨＳＥ共通配
列と一致する。４つの他の熱シヨツク遺伝子を比較した
ところ、共通配列に対する相同性は、１４個の塩基のう
ち１１〜１３個の塩基に及んでいる（）１．Ｐｅｌｈａ
ｍおよびＭ、Ｂｉｅｎｚ　（１９８２）、　　’細菌か
らヒトまでに対する熱シ’ａｙりＪ　＋Ｍ、Ｓｃｈｌｅ
ｓｉｎｇｅｒ、　Ｍ、Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ。

およびＡ、Ｔｉ５ｓｉｅｒｅｓ　ｌ＋　　コールドスプ
リングハーバ−ラボラトリ−、ｐｐ、４３−４８）。ま
た、理想的な１１ｓＥ配列はパリンドロームであるが、
対をなしてステム−ループ構造をとり得るこれら６つの
遺伝子の前部に存在する実際の）ＩＳＥに含まれる塩基
数は変化する。機能性は維持されるが、配列の拡散が存
在する別の場合は、環状−３’、５’−アデノシン−リ
ン酸（ｃＡＭＰ）　−ｃＡＭＰレセプタータンパク複合
体を結合するＬｃｏｌｔのＤＮＡ配列の場合である。Ｄ
ＮＡ結合部位が統計的に分析され、全長１６ｂｐにわた
って見い出された９ｂｐの共通配列（５’−ＡＡ−ＴＧ
ＴＧＡ−Ｔ−−−−Ｃ−３”）が得られている。研究さ
れた６つのプレ遺伝子部位においては、９個の塩基のう
ち８個が各々の場合の共通配列と一致した（Ｒ，Ｅｂｒ
ｉｇｈｔ（１９８２）、　　ｒ分子構造と生物活性Ｊ　
、Ｊ、Ｇｒｉｆｆｉｎおよび−、Ｄａｕｘｌ＋　ニュー
ヨーク：エルセピア−サイエンスパブリッシングカンパ
ニー、　ｐｐ、９ｌ−９９）。バタテリオファージλの
リプレッサーが結合する１１個の半部位の配列分析によ
ると、共通配列との一致は９個の塩基のうち９個から５
個程度の塩基に及んでいた（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら（
１９７５）、　Ｃｅ１ｌ　５：１０９−１１３）。ここ
では、転写活性化因子内の第一機能成分として同定され
た１６ｂｐ配列に対して、約５０％またはそれ以上、好
ましくは約７５％またはそれ以上の相同性を有するＤＮ
Ａ配列が、近傍の、好ましくは下流の構造遺伝子の発現
レベルを増大または活性化するように機能すると述べて
いる。当業者に明らかなように、上記第一成分に対して
所定の百分率の相同性を有する種々の構築物の有効性は
。

転写活性化因子の第一成分のｔ６ｂｐ固定配列内におけ
る所定の塩基の位置が変化するにつれて変動し得る。異
なる構築物の相対的な有効性は、当該分野に公知の部位
特異的変異処理技術を用いた実験を行うことなく容易に
確かめることができる。特定の異なる塩基を有するオリ
ゴヌクレオチドを合成して１６ｂｐパリンドロ一ム配列
と置き換えることができるので２個々の塩基に関する位
置の重要性を決定し得る。また、他の公知技術もより無
秩序な変異体に対して用いることができる（Ｍ、Ｓｍ１
ｔｈ（１９８５）、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１
９：４２３−４６２に講評されている）。１６ｂｐパリ
ンドロ一ム配列の約半分が下流における転写を活性化す
るの充分であることは。

公知の分子生物学的技術９例えば適当な８ｂｐオリゴヌ
クレオチドを合成して挿入することによって示し得る。

本発明の主要な特徴は、その好ましい実施Ｂ様では、挿
入された異種のプロモーターおよび異種の構造遺伝子を
有する組換えプラスミドである。

この構造遺伝子の転写発現は転写活性化因子によって促
進され、転写は下流のポリアデニル化シグナルに応答し
て終了する。この転写活性化因子はプロモーターの５゛
側にあると最も効果的であること、およびこの活性配列
は転写開始部位の約１５００ｂｐ上流とプロモーターの
ＴＡＴＡ配列のすぐ５゛側との間に位置すべきであるが
、その方向性は機能性に対しては重要ではないというこ
とが確定している。

転写活性化因子−プロモーター複合体によって最も強く
影響を受けるためには、構造遺伝子は該複合体の３′側
に挿入されなければならない。（少数の公知のプロモー
ターは双方向性の調節を行うが。

この場合には該プロモーターのいずれの側も下流と考え
得る。）タンパクのアミノ末端を最終的にコードする構
造遺伝子の部分は該遺伝子の５゛末端であるが、カルボ
キシル末端付近のアミノ酸をコードする末端部分は該遺
伝子の３”末端と呼ばれる。

構造遺伝子の５”末端はＴＡＥ−プロモーター複合体の
３′末端に近接して位置するのが最良である。ポリアデ
ニル化シグナルはコード配列の３゛末端の下流に正確な
方向で位置しなければならない。他に考慮すべきことは
１発現複合体の機能因子間の距離である。これらの距離
に関しては、実質的な変化が存在するようである１従っ
て、距離に関する必要条件は機能性によって最も良く記
述される。

第１近似として１機能因子間の距離が、該機能因子の誘
導された遺伝子における距離に類似している場合には２
合理的な作動可能性を得ることができる。融合タンパク
を導く構築物の場合における付加的な必要条件は、２つ
の遺伝子または断片の連結を、この２つのコード配列が
同じ読み取り枠内に存在するように行う必要があるとい
うことである。このような必要条件は当該分野でよく理
解されている。この必要条件の例外は、ある遺伝子から
誘導されたコード配列がイントロンによって他方の遺伝
子のコード配列から分離されている場合である。この場
合、コード配列は適合するスプライス部位によって境界
付けられていなければならない。イントロンのスプライ
ス部位は、このイントロンが転写後スプライシングによ
って除去された後の融合の際に両方の遺伝子に対して正
確な読み取り枠が確立されるような位置になければなら
ない。発現または発生の調節に関する割合の差は、所定
の遺伝子が種々の転写活性化因子−プロモーター複合体
の制御下で挿入される場合に観察され得る。

好ましい実施態様では、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（９μ）リポータ−遺伝子が転写活
性化因子−プロモーター複合体の３゛側にあるＢａｍＨ
１部位で発現プラスミドに挿入されている。通常の当業
者に明らかなように１発現複合体の成分は、インビトロ
における操作に便利な天然に存在するかまたは構築され
た制限部位で連結し得る。制限断片の適合し得えない末
端は連結するために平滑末端に変換するか、あるいはリ
ンカ−またはアダプターの付加によって修飾し得る。

主として考慮すべきことは、接合部における配列が転写
および翻訳の機能性を維持していることである。

（実施例） 以下の実施例は単に本発明を例証することを目的として
おり１本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ない。

これら実施例では９分子生物学、植物組織における組換
えＤＮＡ操作、そして形質転換された植物の培養および
再生に関する当業者に公知であり。

利用し得る多くの技術を利用している。酵素については
、市販品が人手でき、業者の推奨する方法または当該分
野に公知の他の変法に従って用いられる。試薬、緩衝液
および培養条件も当該分野に公知である。標準的な分子
生物学的手法が記載されている文献には以下のものが含
まれるｓ　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）　　ｒ分子
クローニング」、コールドスプリングハーバ−ラボラト
リ−、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク；　
Ｗｅ　（ｍ）（１９７９）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８ＨＷｕら　（１）　（１９８３）
　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｓｏｌ、旧設および１０１　；　
ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏ１ｄａｖｅ　（［）　Ｍｅ
ｔｈ。

Ｅｎｚｙ＋＋ｏ１．６５：　Ｍｉｌｌｅｒ　（Ｗ）　（
１９７２）　’分子遺伝学における実験」、コールドス
プリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハ
ーバ−、ニューヨーク、　ＯｌｄおよびＰｒ１ａ＋ｒｏ
ｓｅ（１９８１）　’遺伝子操作の原理」、カリフォル
ニア大学出版会、バークレー：　５ｃｈｌｅｉｆおよび
Ｗｅｎｓｉｎｋ　（１９８２）　’分子生物学における
実際的方法」；　Ｇｌｏｖｅｒ（＆１ｉｉｉ）　（１９
８５）　　「ＤＮＡクローニング」、第１巻および第２
巻、　ＩＲＬプレス、オックスフォード、　ＵＫ；　Ｈ
ａｍｅｓおよび旧ｇｇｉｎｓ（＆：）　（１９８５）　
ｒ核酸ハイブリダイゼーション」。

ＩＲＬプレス、オックスフォード、　ＵＸ；　５ｅｌｌ
ｏ−およびＨｏ１ｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）　’遺伝
子工学：原理と方法」。

第１巻〜第４巻、プレナムプレス、ニューヨーク。

これらの文献は特に参照文献としてここに採用する。使
用されている略語および命名法は、当該分野では標準的
であると思われ、ここに引用されたような専門雑誌で一
般的に用いられている。

（以下余白） 次層ｌ江上 本実施例はトウモロコシのＡｄｈ１嫌気的誘導プロモー
ターの制御下でリポータ−遺伝子の発現を調べるための
クローニング、形質転換および分析方法について述べる
。単子葉および双子葉の宿主（例えば、トウモロコシお
よびタバコ）の両方でこの系を用いることにより、転写
を活性化する活性を有する挿入配列を検出し得る。

トウモロコシのＡｄｈ　１嫌気的誘導プロモーターは、
ゲノミッククローンｐｌｓ、１　（Ｅ、　Ｄｅｎｎｉｓ
ら（１９８４）　。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１２：３９
８３−４０００）から」し！旧および）Ｉｉｎｄｌ［［
で消化することによって調製された。

損壊１プロモーター断片は、　　ＡＴＧ翻訳開始コドン
の５゛側１２００ｂｐと３゛側２０５ｂｐとを含んでい
る。この断片は、　ＢａｍＨＥおよび１（ｉｎｄＩ［で
同様に消化されているｐＢＲ３２２に連結した。このプ
ロモーター断片は。

ＡＴＧコドンの１１ｂｐ３’側の唯一のＳａｃ　■部位
で切断することによって短＜　Ｌ、　Ｔ４　ＤＮＡポリ
メラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて
欠失させた０次いで、　Ｓｌヌクレアーゼ消化を行い、
一本鎖末端を除去し、ポリメラーゼＩのクレノー断片で
修復し、平滑末端にした。合成１１ｉｎｄｌＩ［リンカ
−を加えて、プラスミドを再環化させ、いくつかの無作
為に選択した標本を配列決定のためにＭ１３にサブクロ
ーン化した。プラスミドｐＡｄｌは、　　＋１０６位。

翻訳開始コドンのへから２ｂｐ上流、およびキャップ部
位に対して５°方向に一１０９４位まで及ぶプロモータ
ー断片を欠失していた。

」　ボ１アデニル　ジグ　ルのクローニング植物のポリ
アデニル化シグナルはツバリンシンターゼ遺伝子の３゛
非翻訳領域から誘導された。このシグナルはｐＬＧＶ２
３８２（７）１．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＰｓｔｌＩｒ片ト
して得られた（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（
１９８３）、　ＥＭＢＯＪ、　２　：９８７−９９５）
。この断片は、は辺Ｒ１およびカ匹■で切断したｐＡｄ
ｌに連結し、５゛勿旧位はポリメラーゼＩのクレノー断
片で充填し、そしてＨｉｎｄＩ１１部位は合成リンカ−
を用いてＢａｍ１１１部位に変換し。

プラスミドｐＡｄ２を得た。

１」　クロームフェニコールアセチルトランスフｐＮＯ
ｓｃＡＴ４　（１１，１ｌｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ
ｌａ＋私信）は、　ｐＢＲ３２５のクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する（Ｆ、　
Ｂｏｌｉｖａｒ　（１９７８）、　Ｇｅｎｅ４　：１２
１−１３６）。（ｐＮＯ３ｃＡＴ４の構築では、胚匹遺
伝子の〕Ｉ末端がリンカ−を付加することによって勧口
ＩＩ末端に変換された）。ｐＮＯ３ｃＡＴ４は膣旧で切
断し、」旦を含む断片を取り出した。この断片はＢａｍ
１ｌｌで切断されたｐＡｄ２に連結した。得られたプラ
スミドは唯一のＳａｌ　１部位で切断し；この部位は適
当なリンカ−を用いて３ｎ部位に変換し。

ｐＡｄｃａｔ　１を得た。このｐＡｄｃａｔ　ｌでは、
担１ｈｌプロモーター、リポータ−遺伝子、および下流
ポリアデニル化シグナルは互いに正しい配向性を有する
ように組み立てられている。発現複合体を含むＰｓｔｌ
断片をシルＩ切断ｐＵｃ８に挿入することによって。

ｐＡｄｃａ　ｔ２が構築された。

はり遺伝子の別の起源は、　５ａｕ３Ａ切断ｐＢＲ３２
５である；房収遺伝子は５６ｂｐの５゛非翻訳配列を有
する断片上に存在し、　　Ｂａｍ１ｌｌ切断ｐＡｄ２で
連結し得る。第３の別の起源は、　ｐＢＲ３２５の適当
なｍ＋断片を単離して影倶ＩＩＩリンカ−を付加したも
のである。

バイナリ−ベクターｐＧＡ４７２　（Ｇ　、＾ｎら（１
９８５）、　ＥＭＢＯＪ、　４：２７７−２８４）は、
　Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＡ、　ｔｕｎ＋ｅｆａｃｉｅｎ
ｓの両方で複製させることができ、かつ三組交雑交配に
より細菌細胞間を移動させ得るＴ−ＤＮＡ含有ベクター
である（Ｇ、　Ｄｉｔｔａら（１９８０）、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７７：７３４７−７
３５１）　、このベクターはＴｉプラスミドの作用によ
ってアグロバクテリウム宿主から植物中へトランス移動
し得る。Ｔｉプラスミドは、そのＴ−ＤＮＡによってゲ
ノムへの安定な一体化を促進する。　ｐＡｄｃａｔｌは
各プラスミドの唯一のＩｎ部位における同時一体化によ
ってｐＧＡ４７２に挿入された。ｐＡｄｃａ　ｔ　２は
唯一のＢｉｎｄＩ１１部位において２つのプラスミドを
接合させることによって同様に導入された。これら組換
えプラスミドは。

Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて選抜され１次いで植物組織へ転
移させるために、　Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｌ
８Ａ４４０４株に導入した。

ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ　（ＭＳ）培地（
Ｔ、　ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＦ、　Ｓｋｏｏｇ（１
９６２）、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、　１５：
４７３−４９７）における組織培養で生育しているＮｉ
ｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ　３８の葉を、乾燥を防ぐために液体ＭＳ培地中で
小片（ｌｃｌａ）に切断し、形質転換しているアグロバ
クテリウム株の懸濁液に加えた。この細菌はＹＭ勾配（
Ｊ、Ｅｌｌｉｓら（１９７９）　。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ、１５：
３１１−３１９）によって前培養し２次いで１０　ｍｌ
の各ＭＳ液体培地に再懸濁させた。２０分後、感染した
葉片をＭＳ寒天培地に移し。

２５°Ｃにて２４時間インキュベートした。次いで、こ
れら葉片を滅菌水で洗浄し、ＭＳ９シュート誘導培地（
ＭＳ培地、１ｆｆｉ中に０．５■のインドール酢酸。

１．０ｍｇのベンジルアミノプリン、１００■の硫酸カ
ナマイシン、５００■のセホタキシムを含有する）に移
した。シュートが１〜２ｃｍの大きさになれば。

同様の抗生物質を含ｔＪ−ＭＳ培地に移した。根を形成
した植物はカナマイシン選抜によって維持した。

」」　　ノ　−　　れた　バコにおけるクロラムフ分析
に用いた植物組織は、遺伝子導入植物の若葉、または遺
伝子導入植物の葉片から培養を開始したカナマイシンを
含む培地上のシュート培養物のいずれかであった。植物
材料はアルゴン雰囲気下、２８°ＣにてＭＳ寒天培地上
でインキュベートすることによって嫌気的に作製した；
誘導には１８時間で充分であることが見い出された。

分析は、抽出緩衝液が０．１％システィン−１１ｃＩお
よび０．１％アスコルビン酸を含有すること以外は、　
）ｌｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら　（１９８３）
、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：２０９〜２１３によって
述べられたように行った。組織の各１μｇを１μ８の抽
出緩衝液で抽出し、遠心分離によって澄明にした。次い
で、　５０μ！の上清に０，２μＣｉの１４ｃｍクロラ
ムフェニコール（アメルシ十ム）を添加し１次いで１ｍ
ＭのアセチルＣｏ＾を加えて３７°Ｃにて３０分間イン
キュベートした。反応液の酢酸エチル抽出液をエバポレ
ーションによって濃縮し１次いでシリカゲルプレート上
でクロロホルム−メタノール（９５：　５　）によりク
ロマトグラフした。ゲルプレートにはフルオア（ｆｌｕ
ｏｒ　；１−メチル−ナフタレン中の０．４％ｐｐｏ　
）を噴霧し、−８０°Ｃにて１６時間オートラジオグラ
フした。

Ｚｅａ　　ｓａｇ　ｃ、ｖ、　Ｂｌａｃｋ　Ｍｅｘｉｃ
ａｎ　５ｈｅｅｔ　Ｘ　ｌｌ−１１の）Ｕ濁細胞系列（
ｐ、（：ｈｏｕｒｅｙおよびり、　Ｚｕｒａｗｓｋｉ（
１９８１）、　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ
、　５９：３４１−３４４）を２６°Ｃにて修正ＭＳ培
地で培養した（Ｃ，ＧｒｅｅｎおよびＲ１Ｐｈ１ｌｌｉ
ｐｓ　（１９７５）、　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、１５：４１
７−４２１）　、プロトプラストをｌ、　ｐ□ｔｒｙｋ
ｕｓら（１９７９）、　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　５４：２０９−２１４のプロトコルに従
って単離し。

そして以前に述べられたように（Ｅ、　Ｈｏｗａｒｄら
、　（１９８７）Ｐｌａｎｔａ）、エレクトロポレーシ
ョン用に調製した。

エレクトロポレーションを行うために、　　１００μｇ
のプラスミドＤＮＡは、０．２Ｎマンニトールを含有す
るＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１０ｍＭ　ＨＥＰＨＳ、　ｐ
Ｈ７，２，１５０ｍＭＮａＣ１）中のｌｄプロトプラス
ト（３Ｘ１０’ｉｄ）と混合した（Ｍ、Ｆｒｏｍｎ＋ら
（１９８５）　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。

ＵＳＡ録：　５８２２−５８２８　）。これら細胞に、
４５°Ｃの熱シジックを５分間与え、氷上で５分間イン
キュベートし２次いで氷上でコンデンサ放電型エレクト
ロポレーション装置を用いて２５０ｖの単一５Ｑｍｓｅ
ｃパルスによりエレクトロポレーションを行った。氷上
でさらに１０分間インキュベートした後、これら細胞は
ＰＣＭ　（ＣｈｏｕｒｅｙおよびＺｕｒａｗｓｋｉ　（
前出））で１０倍に希釈した。

」ｊ　−九ヱニー’−’ｒ　　の゛パ　・八　＼エレク
トロポレーションに続いて、プロトプラストの試料は２
つに分割され；一方は好気的（２０％酸素、大気条件）
にインキュベートされ、他方は嫌気的（５％酸素／９５
％窒素）にインキュベートされた。両方の場合、インキ
ュベーションは暗所で２６°Ｃにて２０時間行われた。

次いで、各りの細胞を遠心分離によって採取し、２５０
μ！の０．２５　トリス−ＣＩ　（ｐＨ７，５）に再懸
濁し、音波処理を施し。

そしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ酵素活性について分析した。基質と反応生成物を酢酸
エチルで抽出し、報告されているように薄層クロマトグ
ラフィーで分離した（Ｃ，Ｇｏｒｗａｎら（１９８２）
、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２　：１０４
４−１０５１）　、クロマトグラムはフルオログラフィ
ーを行い、スポットは以前に述べられたように液体シン
チレーションカウンターで計数することによって定量化
した（Ｈｏｗａｒｄら、　１９８７　（前出））。

各プラスミド構築物は、２〜５回の独立したエレクトロ
ポレーション実験で分析した。プロトプラスト調製物と
エレクトロポレーションの効率とが変動するため、プラ
スミドｐＡｄｈＣＡＴを用いて測定される非特異的なバ
ックグラウンド生成物を減算した後、　ｐＡｄｈＣＡＴ
の嫌気的発現に対して１という値を与えるように結果を
規格化した（ｌｌｏｗａｒｄら。

１９８７　（前出））。

ｐＡｄｃａｔ　１はキャップ部位に対して一１０９４位
と＋１０６位との間に見い出されるトウモロコシのプロ
モーター配列を含み、　ｐＡｄｃａｔ　２は−１４０〜
＋１０６位にトウモロコシのプロモーターＤＮＡを含ん
でいた。これら２つのプラスミドのいずれかが、タバコ
において嫌気的な遺伝子発現を促進し得るシス作用性の
調節配列を有すれば１回酵素活性は嫌気的誘導期間の後
に増大するはずである。ｐＡｄｃａ　ｔｌ−バイナリ−
ベクターで形質転換された１４の植物はいずれも、タバ
コのバックグラウンドレベルを越える嫌気生活依存のｃ
ａｔ活性を示さなかった。

同様に、　ｐＡｄｃａｔ　２で形質転換された２９の植
物はいずれも、嫌気的に誘導された圓活性を示さなかっ
た。トウモロコシのＡｄｈｌプロモーター活性は。

」Ｕリポータ−遺伝子系を用いて双子葉植物種のＮ１ｃ
ｏｔｉａｎａ　　ｔａｂａｃｕｍでは検出することがで
きないというのが結論であった。

これら構築物をトウモロコシのプロトプラストにおける
過渡的発現の実験で試験すると１匹Ｉ酵素活性が容易に
検出され、嫌気的に誘導されることが見い出された。従
って、担唐１プロモーター配列は同種系において転写開
始を行うのに充分であるようである。異種であるタバコ
の系においては活性が存在しないので、ｐＡｄｃａｔ　
１およびｐＡｄｃａｔ　２ヘクターは、トウモロコシの
Ａｄｈ　１プロモ一ター配列の５゛側に挿入された転写
活性化因子に対するプローブとして用いられ得る。

本実施例では、凹の５゛領域における転写活性化の活性
を発見するに至ったクローニング手順について詳しく述
べる。

２」　−Ｆ′　　　　　のクローニングＴｉプラスミド
ｐＴｉＡｃｈ５　（Ｇ、　ｄｅ　Ｖｏｓ　ら（１９８１
）　。

Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：２４９−２５３）をＨｃｏＲＩ
およびＢａｇ旧で消化し、」の５”非転写領域を有する
２、５３ｋｂ断片を取り出した。影υｔ１１部位はｏｃ
ｓ転写開始部位に対して一１１６位に存在し、この断片
はＥｃｏ旧部位へ向かって５゛方向に伸びている。この
断片をＥｃｏＲＩ−Ｂａ＋ｓＨＩ消化ｐＵｃ８に挿入し
た。得られたキメラはＰｓｔｌで直線状にし、カルＩ切
断ｐ＾ｄｃａ　ｔ２に連結してｐＡｄｃａｔ３ヲ得た。

ＯＣＳの５゛非転写領域はトウモロコシのＡｄｈ　１配
列の一１４０〜＋１０６位の部分の５”側に挿入される
。

ｐＡｄｃａｔ３構築物はタバコの細胞に導入された；再
生した形質転換植物体の組繊を調製し、実施例１で述べ
たよっに分析した。試験した少なくとも６〜９の植物体
には、嫌気生活によって」１酵素活性を誘導した。Ｓｌ
マツピング法による実験によって、転写がＡｄｈｌａ域
内の正常なキャップ部位で開始されることを確認した。

従って、」遺伝子の５°側隣接領域内に見い出される１
またはそれ以上の配列が、タバコ宿主におけるトウモロ
コシの栖１プロモーターの転写を活性化し得ると結論さ
れた。

酵素活性の絶対的レベルがかなり変化すること。

およびサザーンハイブリダイゼーションによる実験によ
って組換え配列を有することが示された遺伝子導入植物
体には、活性が検出し得ないものが存在することは注目
すべきことである（本研究；Ｊ、　Ｊｏｎｅｓら（１９
８６）、　（前出））。従って、所望の組換え表現型に
ついていくつかの遺伝子導入植物体を分析することが重
要である；統計的に有効であるためには、２０〜３０の
標本数が推奨される。

」−１葱しエニー′　　　　　　　　の　　　利コ１本
実施例は凹遺伝子の５′側隣接領域内に転写活性化因子
を位置付けする段階について述べる。

１６ｂｐのパリンドローム配列５’−ＡＣＧＴＡＡＧＣ
ＧＣＴＴＡＣＧＴ−３′がタバコのモデル系においてＡ
ｄｈ　１に促進された転写を活性化するのに充分である
と同定された。

」ユ　−２の１７６ｂ　　　への館　・し・ｐＡｄｃａ
ｔ　３をＢａｇ旧および街＋３１１で切断し、　１７６
ｂｐ断片を取り出した。この断片は凹転写開始部位に対
して一２９２位から一１１６位にまで及んでいる。

この断片を精製し、　４狸１１１およびＣ１ａｌで消化
されているｐＢＲ３２２と連結してｐＯｃｓｌを得た。

（ｐＯｃｓｌは因子含有ＤＮＡの起源として役立ち、ま
た次の操作に対してプロモーター／外来構造遺伝子／ポ
リアデニル化シグナル複合体を挿入する受容ベクターと
して役立ち得る。）　　ｐＯｃｓｌの小さなＥｃｏＲｌ
　−Ｂａａ旧断片をｐｕｃａに挿入し２次いでｐＡｄｃ
ａ　ｔｌのＰｓｔｌ断片を挿入してｐＡｄｃａｔ　５を
得た。ｐＡｄｃａｔ　６は以下のように構築された：　
ｐＯｃｓＩ　ＤＮＡをＰｓｔｌおよびＢｃｏＲ［で切断
し２次いでクレノー断片で処理し。

そしてＰｓｔｌリンカ−に連結した。Ｐｓｔｌで消化し
。

過剰のリンカ−を除去した後、　ｐＡｄｃａｔ　１の１
１０断片を挿入した。この断片は」肚遺伝子の一部を有
しており、正しい方向で挿入された場合には。

最初のシルＩ　　ＥｃｏＲＩ消化によってｐＯｃｓｌの
■遺伝子に生じた欠失を補填した。この断片はＡｄｈ１
プロモーターの上流の工４５゛領域に、　ｐＡｄｃａｔ
５に対して逆方向に配置された。このプラスミドの５ａ
ｌ１部位にｌ罰ｄｌｌ［リンカ−を挿入してｐＡｄｃａ
ｔ６を得た。

ｐＡｄｃａｔ６はバイナリ−ベクターに連結し得る。

ｐＡｄｃａｔ５誘導体およびｐＡｄｃａｔ　６誘導体を
タバコに導入し、形質転換した植物体組織を嫌気的誘導
ユ旦酵素活性について分析した。ｐＡｄｃａｔ５で形質
転換された２１の植物体のうちの１０．およびｐＡｄｃ
ａ　ｔ６で形質転換された１７の植物体のうちの１１が
誘導ｃａｔ酵素活性を発現した。従って、　１７６ｂｐ
断片はトウモロコシのＡｄｈ１プロモーターからの転写
を活性化し得る。この活性化は鋤１プロモーター領域に
対するこの断片の方向性には依存しない。これらプラス
ミドがエレクトロポレーションによって導入されたトウ
モロコシのプロトプラストについても同様の結果が得ら
れた。

−あλ　調節令　の可　　のある　１のゝ」遺伝子の５
′側非転写領域の公表されているヌクレオチド配列を、
調節機能の部位を示す二次構造を有する可能性のある領
域について分析した。

コンピュータ分析によって相補的な対称性（ｄｙａｄｓ
ｙｍｍｅｔｒｙ）を有する２つの領域が示された。１６
ｂｐのパリンドローム（５’−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴ
ＴＡＣＧＴ−３’　）は−１９４位から一１７９位に、
そして１２ｂｐのパリンドローム（５’　−ＧＡＴＧＴ
ＴＡＡＣＡＴＣ−３’　”）は−１４９位から一１３８
位の領域に見い出された。次いで、これら２つの配列を
転写の活性化における役割について試験するための実験
を計画した。

■ゞ　な−２大　　西　し１習・番 るための１７６ｂ　　　の １７６ｂｐの」皿ＩＩ　−Ｂａｍ旧断片の５゛欠失およ
び３゛欠失は、　Ｈ５Ｂ　Ｉｆ　（５’欠失体の場合）
またはＢａｍＨＩ（３゛欠失の場合）のいずれかで切断
した後、　Ｂａ１３１ヌクレアーゼで消化することによ
って作製した。

Ｓ１ヌクレアーゼ、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノー断片で処理し、連結し、そして形質転
換した後、」印から誘導された断片を上述のように切断
し、サブクローニングし、そして配列決定することによ
り欠失の終点を決定した。次いで１％型から誘導され適
切に欠失させた断片を機能分析のためにｐＡｄｈＣＡＴ
−１００に連結した。ｐＡｄｈＣＡＴ−１００はｐＡｄ
ｈＣＡＴ−１４０から調製した。ｐＡｄｈＣＡＴ−１０
０はｐＵｃ１９にＡｄｈｌプロモーターの一１４０位か
ら＋１０６位、以１コード配列、および」並３゛ポリア
デニル化シグナルを含んでいる。ｐＡｄｈＣＡＴ−１４
０は」懸」で切断し２Ｂａ１３１で消化し、　ＤＮＡポ
リメラーゼｌのクレノー断片で充填・修復し、そして５
ａｌｌリンカ−を付加す、ることによって修飾した。　
Ｓａｔ　Ｉ　−ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、低融点アガロ
ースゲル電気泳動を行った後に断片を精製し、　ｐＵｃ
１９にサブクローニングし。

そして終点を決定するために配列決定を行った後。

続いて倶庚１領域プラスミドのサブクローニングを行う
ことによってｐＡｄｈＣＡＴ−１００を構築した。転写
活性化因子を付加しなければ、　ｐＡｄｈＣＡＴ−１０
０はトウモロコシまたはタバコのいずれかのプロトプラ
ストにおいて、バックグラウンドレベルのリポータ−遺
伝子活性を有するだけである。」競の５°領域の１７６
ｂｐ　」凹１１−　Ｂａａ旧断片を挿入することによっ
て、トウモロコシのプロトプラストにおいてｐＡｄｈＣ
ＡＴ−１４０で観察された活性に匹敵する活性が回復さ
れる。

欠失させた一連のプラスミドをトウモロコシおよびタバ
コの両方のプロトプラストにエレクトロポレーションで
導入し、リポータ−遺伝子発現の活性化について過渡的
発現で分析した。−２８０位にまで及ぶ５゛欠失と一２
０７位にまで及ぶ５゛欠失とは完全なエンハンサ一様活
性を有したが。

−１６８位にまで及ぶ５゛欠失は完全な活性のわずか一
部を有するだけであった。−１５９位で終了する５°欠
失体は活性を持たなかった。１組の３゛欠失も転写活性
化活性の喪失について分析した。シ復旧部位から一１４
４位、−１５７位、および−１７８位に及。

ぶ３゛欠失は、すべて本質的に完全な活性を有した。−
２０３位までの３′欠失体はリポータ−遺伝子を発現さ
せなかった。従って、このような欠失変異体の組から一
２０７位と一１７８位との間のＤＮＡ領域が特定された
。このＤＮＡ領域は下流の遺伝子を発現させるのに必要
である。１６ｂｐのパリンドローム配列が存在するのは
この領域内である。−１６８位とＢａｍＨ１部位との間
には転写活性化の低い活性が存在するようである：　１
２ｂｐのパリンドローム配列が２％型から誘導された断
片のこの部分内にある。

Ｕ、ｉ　Ａ　１６ｂパ１ンドローム　１の八　と゛１６
ｂｐパリンドローム配列は自動ＤＮＡシンセサイザー、
モデル３８０Ａ　（アプライドバイオシステムズ。

フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて化学的に
合成された。ｐＡｄｈＣＡＴ−１００に挿入されたオリ
ゴヌクレオチドの実際の配列は、　５’−ＧＧＡＴＣＣ
ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣ−３’
である。（得られたパリンドロームが合計２８ｂｐに及
ぶことは注目すべきことである。）この構築物はエレク
トロポレーションによってトウモロコシとタバコの両方
のプロトプラストに導入し、過渡的発現系において転写
活性化について分析した。」活性の活性化の大きさは、
ユ競から誘導された塩υ■−現υＨ１断片で観察された
大きさとそれほど異ならなかった。影１旧末端とＥｃｏ
ＲＩ末端とを有する合成オリゴヌクレオチドを用いても
同様の結果が得られた。この合成オリゴヌクレオチドの
構成中にはパリンドロームの延長はなかった。従って、
欠失分析の結果と合成オリゴヌクレオチドの結果とを考
慮すると、転写活性化因子の第１成分は、　１６ｂｐパ
リンドロ一ム配列５’−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣ
ＧＴ−３’内に存在するようである。

」」　−２−の１　に　　るｍ １６ｂｐパリンドロームは、　ｐＡｄｃａｔ５の転写開
始部位の約２００ｂｐ　５°側に位置するか、またはＴ
ＡＴＡボックスの約１７５ｂｐ　５’　側に位置する。

転写活性化因子とキャップ部位との間隔を増大させる効
果を２つの新規な構築物を用いて試験した。　ｐＢＲ３
２２の小さな影υＨＩ−呈吐Ｉ断片を一部胆から誘導さ
れた断片とル止１から誘導されたプロモーター断片との
間に挿入し、パリンドロームとキャップ部位との間隔を
約４Ｔ５ｂｐに増大させた。転写の開始に対するシグナ
ルからの距離がこのような場合には、転写活性化能が約
２５％減少した。第２の構築物は１部組から誘導された
断片とＡｄｈｌから誘導された断片との間に挿入された
。　Ｔｎ９０３の約１２００ｂｐ断片を含んでいた；従
って、この場合の間隔は約１４００ｂｐであった。この
距離では転写活性化活性のわずか一部を検出することが
できただけである。

舶坊１プロモーターのキャップ部位に対してパリンドロ
ーム配列を近接させて配置することは９部１から誘導さ
れた断片を一連の５“欠失Ａｄｈ１プロモ一ター断片に
融合させることによって達成された。

ｐＡｄｈＣＡＴ−９９（４１ｂｐ欠失）の発現レベルは
、　ｐＡｄｈＣＡＴ５の発現レベルに匹敵した。この場
合には、転写活性化因子とキャップ部位との間隔は約ｚ
ｏｏｂｐから約１６０ｂｐに減少した。凹から誘導され
た断片をＡｄｈｌプロモーターの５”欠失体の一３５位
に融合させることによって、　ｐＡｄｈＣＡＴ−３５を
得た。この場合。

キャップ部位と転写活性化因子との間隔は約９５ｂｐに
減少した。転写活性化と調節は維持された。

復原１プロモーターのＴＡＴＡボックスおよびキャップ
部位を欠失させた場合には、」から誘導された断片はｃ
ａｔリポータ−遺伝子の発現を活性化しなかった。すな
わち、これらの実験で用いた。」並から誘導された断片
は、内因性のプロモーター活性を持たなかった。

（発明の要約） 植物における遺伝子の発現を増大または活性化するよう
に作用するＤＮＡ部分について述べられ。

そして特徴付けられている。これらの転写活性化因子は
、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｏ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ
−ＤＮＡにおけるオクトピンシンターゼ遺伝子（部徂）
の上流側非転写隣接領域に由来するＤＮＡ配列を含む、
このＯＣ３転写活性化因子は、固定配列５’　−ＡＣＧ
ＴＡＡＧＣＧＴＴＡＣＧＴ−３゜を有する第１の必須成
分を含む。固定配列５’　−ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ
−３’を有する第２の非本質的な成分は。

遺伝子発現のレベルに寄与する。本発明によれば。

植物転写活性化因子および植物においてその制御下で発
現可能な遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子が提供される。

ここに記述されている転写活性化因子。

およびそれを含むＤＮＡ分子は、植物組織における遺伝
子発現のレベルを増大させる方法に有用である。

４、　゛　　の　　　な量　■ 第１図はＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓに由来のＴ−ＤＮＡにおけるオクトピンシン
ターゼ遺伝子の５′非転写領域から誘導された１７６ｂ
ｐ塩連■／脂狸旧断片のＤＮＡ配列を表す図；第２図は
植物活性な転写活性化因子の第１成分を有するＢａｇ旧
／貼υＩＨ合成オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を表す
図；第３図は一連のｐＡｄｃａ　ｔプラスミド１〜６と
、転写活性化因子／プロモーター／構造遺伝子／ポリア
デニル化シグナル複合体に含まれる成分を表す図である
。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、遺伝子の転写レベルを活性化または促進し得る植物
   転写活性化因子を含む組換えＤＮＡ分子であって、 該植物転写活性化因子が、５′−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣ
   ＴＴＡＣＧＴ−３′およびその逆配列でなる群から選択
   される同定配列に対して約５０〜１００％の相同性を有
   する配列を含む、組換えＤＮＡ分子。 ２、前記同定配列に対して約７５〜１００％の相同性を
   有する配列を含む特許請求の範囲第１項に記載の組換え
   ＤＮＡ分子。 ３、前記同定配列に対して１００％の相同性を有する配
   列を含む特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分
   子。 ４、特許請求の範囲第１項に記載の前記配列と、５′−
   ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３′およびその逆配列でな
   る群から選択される第２の固定配列に対して約５０〜１
   ００％の相同性を有する配列を包含する第２の成分と、
   を含む組換えＤＮＡ分子。 ５、前記第２の成分が前記第２の同定配列に対して約７
   ５〜１００％の相同性を有する特許請求の範囲第４項に
   記載の組換えＤＮＡ分子。 ６、前記第２の成分が前記第２の同定配列に対して１０
   ０％の相同性を有する特許請求の範囲第４項に記載の組
   換えＤＮＡ分子。 ７、特許請求の範囲第１項に記載の前記配列に対して１
   ００％の相同性を有する配列と、 ５′−ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３′およびその逆配
   列でなる群から選択される配列に対して１００％の相同
   性を有する第２の成分とを含む特許請求の範囲第４項に
   記載の組換えＤＮＡ分子。 ８、前記植物転写活性化因子がＴ−ＤＮＡから誘導され
   る特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ９、前記転写活性化因子がＴ−ＤＮＡのオクトピンシン
   ターゼ遺伝子における５′非転写領域から誘導される特
   許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 １０、前記植物転写活性化因子が化学的に合成されてい
   る特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 １１、特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子を、（
   ａ）植物発現プロモーター；および （ｂ）植物発現構造遺伝子 と組み合わせて含む組換えＤＮＡ分子であって、該遺伝
   子が前記転写活性化配列と該植物発現プロモーターとの
   調節制御下に配置されている組換えＤＮＡ分子。 １２、前記プロモーターおよび前記構造遺伝子が同じ遺
   伝子から誘導される特許請求の範囲第１１項に記載の組
   換えＤＮＡ分子。 １３、前記プロモーターおよび前記構造遺伝子が異なる
   遺伝子から誘導される特許請求の範囲第１１項に記載の
   組換えＤＮＡ分子。 １４、前記植物転写活性化因子がＴ−ＤＮＡから誘導さ
   れる特許請求の範囲第１１項に記載の組換えＤＮＡ分子
   。 １５、前記植物転写活性化因子がオクトピンシンターゼ
   遺伝子から誘導される特許請求の範囲第１４項に記載の
   組換えＤＮＡ分子。 １６、前記植物転写活性化因子が化学的に合成されてい
   る特許請求の範囲第１１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 １７、前記転写活性化因子が、前記プロモーターのＴＡ
   ＴＡボックスの５′末端と前記植物発現遺伝子の転写開
   始部位から約１５００ｂｐ５′側との間に位置する特許
   請求の範囲第１１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 １８、前記植物発現プロモーターおよび前記植物発現遺
   伝子が嫌気的調節遺伝子から誘導される特許請求の範囲
   第１２項に記載の組換えＤＮＡ分子。 １９、前記プロモーターおよび前記遺伝子がアルコール
   デヒドロゲナーゼ（￥Ａｄｈ￥）遺伝子から誘導される
   特許請求の範囲第１８項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２０、前記プロモーターおよび前記遺伝子がトウモロコ
   シの￥Ａｄｈ￥１遺伝子から誘導される特許請求の範囲
   第１８項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２１、前記プロモーターおよび前記構造遺伝子がエンド
   ウマメから誘導される特許請求の範囲第１９項に記載の
   組換えＤＮＡ分子。 ２２、植物組織における転写に対して活性な前記プロモ
   ーターが￥Ａｄｈ￥遺伝子から誘導され、前記構造遺伝
   子が酵素をコードし、そして該酵素の活性が植物組織に
   おいて定量化され得る特許請求の範囲第１３項に記載の
   組換えＤＮＡ分子。 ２３、前記定量可能な酵素がクロラムフェニコールアセ
   チルトランスフェラーゼである特許請求の範囲第２２項
   に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２４、前記プロモーターがカリフラワーモザイクウィル
   スから誘導され、前記構造遺伝子が酵素をコードし、そ
   して該酵素の活性が植物組織において定量化され得る特
   許請求の範囲第１３項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２５、前記定量可能な酵素がクロラムフェニコールアセ
   チルトランスフェラーゼである特許請求の範囲第２４項
   に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２６、前記構造遺伝子がバチルス　スリンジェンシス（
   ￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥）
   の殺虫毒素をコードする特許請求の範囲第１３項に記載
   の組換えＤＮＡ分子。 ２７、前記転写活性化因子が第２の成分をさらに含み、
   該第２の成分が、前記植物発現プロモーターの５′側に
   位置する５′−ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣ−３′および
   その逆配列でなる群から選択される第２の同定配列に対
   して約５０〜１００％の相同性を有する配列から本質的
   になり、そして特許請求の範囲第１項に記載の前記ＤＮ
   Ａ分子の同定配列の約１ｂｐと約５００ｂｐとの間に位
   置する特許請求の範囲第１１項に記載の組換えＤＮＡ分
   子。 ２８、前記両因子がＴ−ＤＮＡから誘導される特許請求
   の範囲第２７項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２９、前記両因子がオクトピンシンターゼ遺伝子から誘
   導される特許請求の範囲第２８項に記載の組換えＤＮＡ
   分子。 ３０、前記両因子が化学的に合成されている特許請求の
   範囲第２７項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３１、前記転写活性化因子が前記プロモーターおよび前
   記構造遺伝子の３′側に位置する特許請求の範囲第１１
   項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３２、植物組織において植物発現遺伝子の発現を促進さ
   せる方法であって、 （ａ）５′−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴ−３′
   およびその逆配列でなる群から選択される同定配列に対
   して約５０〜１００％の相同性を有する配列を含む転写
   活性化因子を、該転写活性化因子が該遺伝子の発現を調
   節するように挿入すること；および （ｂ）該組換えＤＮＡ分子を植物組織に導入することを
   包含する方法。 ３３、前記植物組織が単子葉植物に由来する特許請求の
   範囲第３２項に記載の方法。 ３４、前記植物組織がトウモロコシに由来する特許請求
   の範囲第３３項に記載の方法。 ３５、前記植物組織が双子葉植物に由来する特許請求の
   範囲第３２項に記載の方法。 ３６、前記植物組織がタバコに由来する特許請求の範囲
   第３５項に記載の方法。 ３７、前記組換えＤＮＡ分子がエレクトロポレーション
   によって前記植物組織に導入される特許請求の範囲第３
   ２項に記載の方法。 ３８、前記組換えＤＮＡ分子がマイクロインジェクショ
   ンによって前記植物組織に導入される特許請求の範囲第
   ３２項に記載の方法。 ３９、前記組換えＤＮＡ分子がＴ−ＤＮＡを媒介とする
   移入によって前記植物組織に導入される特許請求の範囲
   第３２項に記載の方法。 ４０、前記転写活性化因子が、５′−ＧＡＴＧＴＴＡＡ
   ＣＡＴＣ−３′およびその逆配列でなる群から選択され
   る配列に対して約５０〜１００％の相同性を有する配列
   をも含む特許請求の範囲第３７項に記載の方法。