CN1869241A - 用植物dna病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法。该植物DNA病毒沉默载体来自于中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，简称为TYLCCNV)的DNA－A及其相伴随的卫星分子——DNAβ，并在DNAβ的βC1基因进行缺失，且在一缺失βC1基因处插入单一多克隆位点。用RT－PCR方法克隆观赏植物叶色、花色相关基因的cDNA片段，如Su、CHS、PDS等基因片段，并插入TYLCCNV病毒沉默载体的多克隆位点构建成观赏植物叶色、花色相关基因的重组病毒沉默载体，该病毒沉默载体通过农杆菌注射接种的方法诱导沉默观赏植物内源叶色、花色相关基因后改变观赏植物的花色、叶色，从而提高了植物的观赏性。
Description
技术领域
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法。具体地说，本发明用中国番茄黄化曲叶病毒的DNA-A及其卫星分子DNAβ构建一种新型的植物DNA病毒沉默载体，利用基因沉默的原理用该构建的病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色。
背景技术
双生病毒是世界范围内广泛发生的一类植物单链环形DNA病毒，在电镜下呈孪生颗粒形态，病毒粒子大小约30×20nm。随着全球气候的变化、贸易的增加和烟粉虱的空前扩展，这类病毒在全世界范围内大面积爆发流行，已在多种作物上引起严重危害。菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)是双生病毒科中的最具经济重要性的一个属，包含100多个独立种，大多begomoviruses包含2个大小相近的单链环状DNA(ssDNA)组分，大小为2.5-3.0kb，称为DNA-A和DNA-B，少数begomoviruses只含有一个组分，即DNA-A。在自然条件下，begomoviruses侵染双子叶植物，均由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，因而也称做粉虱传双生病毒。对于双组分DNA，其DNA-A和DNA-B大部分序列不同，但在非编码区中有约200个核苷酸序列几乎相同(同源性大于95％)，称为共同区(common region，CR)，共同区包含病毒复制、转录起始和包装所需的序列，并有在茎环结构中参与滚环复制起始的9核苷酸序列(TAATATT/AC)。双组分病毒的DNA-A和DNA-B组分对于系统侵染都是必需的，DNA-A至少含有5个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)：在病毒链上编码AV1，在互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。AV1编码的是病毒的外壳蛋白，与病毒的包壳、介体传播及与寄主互作相关；AC1编码病毒复制蛋白(replication-associated protein，Rep)，参与病毒基因组DNA的复制起始；AC2编码转录激活蛋白(Transcriptional activator protein，TrAP)，该蛋白能使DNA-A和DNA-B的病毒链上的基因发生转录激活；AC3编码一个复制增强蛋白(Replication enhancer protein，REn)；AC4编码的蛋白参与复制或转录的调控。DNA-B的病毒链编码BV1、互补链编码BC1，BV1是一个核穿梭蛋白(nuclear shuttle protein，NSP)，它能够促进病毒DNA在细胞核与细胞质之间进行穿梭运动；BC1是一个移动蛋白(movementprotein，MP)，参与病毒的胞间移动和长距离移动。
近年来发现一些单组份双生病毒，如中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)、胜红蓟黄脉病毒(AYVV)、木耳坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)，其DNA-A虽能系统侵染胜红蓟、棉花、番茄，却并不能诱导典型的黄脉或曲叶症状，进一步致病性测定发现，这类单组份病毒需要一种新型环状ssDNA的卫星DNA分子(称为DNAβ)共同侵染才能引起典型症状。DNAβ分子大小约为DNA-A的一半，与双生病毒基因组DNA-A和DNA-B序列几乎无同源性，但其依赖于DNA-A进行复制。DNAβ既能影响DNA-A在寄主植物中的积累，又能改变DNA-A诱导植物产生的症状。DNAβ包裹在病毒粒子中，能被粉虱传播。我国多种begomoviruses，如中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)、烟草曲茎病毒(TbCSV)和赛葵黄脉病毒(MYVV)等，均伴随有DNAβ。通过对DNAβ分子的序列测定分析发现，DNAβ分子变异较大，DNAβ上唯一保守的是其互补链上均编码βC1蛋白。已经克隆并鉴定了中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ分子具有一段非常保守的区域(大约115bp，含有高度保守的复制起始序列TAATATT/AC)，一个相对保守的βC1基因(指SEQ ID NO.1中的566-210nt)，和一段A富含区。其中，βC1基因编码118个氨基酸，决定寄主植物症状的产生，但对于DNAβ本身的复制却并不是必须的。即DNAβ中的βC1基因突变以后DNAβ依然能够复制，而用外源片段替换βC1基因也能够复制，并且外源基因可以利用βC1基因的启动子和终止子得以转录。
基因沉默(Gene silencing)是近年来发现的一种基于核酸水平的高度保守的特异性降解机制。病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)是一种研究植物基因组的强有力的研究工具。它是通过携带植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默而出现表现型突变，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。其主要机制是插入到病毒载体上的植物功能基因随着病毒的复制形成dsRNA的中间体，并被称为Dicer的酶降解成21-23nt的RNA，并与RNAase结合形成复合体，这个复合体特异性地攻击它的同源序列，从而使植物中的同源基因丧失功能，因而可以在植物的表型以及生化特征上研究植物基因组的功能。利用这一方法，我们可以人为地插入编码植物颜色的内源基因，通过沉默机制将其部分或全部沉默，从而改变植物的叶色、花色。本发明根据上述TYLCCNV基因组特点及基因沉默的原理，用TYLCCNV的DNA-A及其DNAβ构建一种新型的植物DNA病毒基因沉默载体，根据基因沉默的原理用该沉默载体改变观赏植物叶色、花色。
发明内容
本发明的目的是提供一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法。方法的步骤如下：
1)提取感染TYLCCNV病毒的烟草植物基因组总DNA；
2)用分子手段构建成TYLCCNV病毒卫星分子DNAβ的缺失βC1并带有单一多克隆位点的侵染性克隆；
3)根据GENBANK报道的观赏植物叶色或花色相关基因的序列设计引物，用RT-PCR方法克隆观赏植物叶色或花色相关基因的170——1200kb的cDNA片段，并将其插入上述TYLCCNV病毒卫星分子DNAβ侵染性克隆的多克隆位点处，构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆；
4)从感染TYLCCNV病毒的烟草植物基因组总DNA中分别用PCR方法克隆0.7拷贝DNA-A和1.0拷贝DNA-A的DNA片段，并插入pGEM-T Vector构建成pGEM-1.7A质粒；从pGEM-1.7A质粒酶切切下1.7拷贝的DNA-A片段并插入含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ侵染性克隆的多克隆位点，构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体；
5)将含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体通过三亲交配的方法导入农杆菌，用该含病毒沉默载体的农杆菌注射接种观赏植物，诱导沉默观赏植物内源叶色或花色相关基因而改变观赏植物的花色或叶色。
所述的构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆的步骤如下：以TYLCCNV-Y10分离物烟草总DNA为模板，根据GENBANK中AJ421621的基因序列设计特异性引物Y10-beta Sub Sal/F：5’-GTCGAC ATA CAT ATA TAT ACG TAT TC-3’与Y10-beta Sub Xba/R：5’-TCTAGA GTT TAT TTG TTG TGG ATG ATA CATG-3’，进行PCR扩增。PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mβ-Sub-SX；根据GENBANK中AJ421621的基因序列设计另一对特异性引物Y10-beta Sub XbaSmaBam/F：5’-TCTAGACCCGGGGGATCCATACATATAT ATACGTATTCAAATATATG-3’与Y10-beta SubEcoR/R：5’-GAATTCG TTTATTTGTTGTGGATG AT-3’，对TYLCCNV-Y10分离物植物总DNA进行PCR扩增。PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到的正向插入的阳性克隆pGEMmβ-Sub-Xba-EcoR经Xba I和Pst I双酶切后插入pGEM-mβ-Sub-SX，得到阳性克隆pGEM-2mβ-Sub，这一克隆经Sal I和EcoR I双酶切后插入到植物表达载体pBinPLUS的Sal I和EcoR I位点，由此构建成TYLCCNV DNAβ侵染性克隆pBinPLUS-2mβ-Sub。该侵染性克隆含有缺失βC1的两个正向重复拷贝的DNAβ，即两个DNAmβ，在两个DNAmβ分子中间缺失βC1位置引入多克隆位点Xba I、Sma I和BamH I。植物叶色或花色基因的cDNA片段插入pBinPLUS-2mβ-Sub的多克隆位点构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆。
构建pGEM-1.7A质粒的步骤如下：以感染TYLCCNV-Y10烟草的总DNA为模板，根据GENBANK中AJ319675的基因序列设计引物Y10PL-S/F：5’-CGTCGACACCTGTTTGGGGATA TGA GAT-3’和Y10FL-E/R：5’-GAA TTC ATG GGG GCC CAA AGG-3’，进行PCR扩增。得到0.7个拷贝的全长DNA-A，PCR产物插入pGEM-T Vector得到克隆pGEM-0.7A；根据GENBANK中AJ319675的基因序列设计全长引物Y10 FL-E/F：5’-GAA TTC TTT AAAGTG CTT TAG-3与Y10 FL-E/R：5’-GAA TTC ATG GGG GCC CAA AGG-3，对TYLCCNV-Y10分离物植物总DNA进行PCR扩增。获得一个全长拷贝的基因组DNA-A，PCR产物经EcoR I酶切后插入pGEM-0.7A的EcoR I位点，得到pGEM-1.7A。
构建含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体步骤如下：从上述pGEM-1.7A质粒上用Sal I酶切切下1.7-拷贝的DNA-A插入含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆的Sal I位点，获得含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体。
本发明的植物基因沉默载体可利用导入的植物内源基因cDNA沉默植物内源基因，从而达到改变观赏植物叶色花色的目的，增加叶色花色种类，提高观赏性，可用于商业用途；本发明的工作量小，构建简易，周期性短，可以进行大规模沉默；由于去除了βC1致病基因，所以不会对植物生长产生危害；同时，本发明的植物基因沉默载体还是一种用反向遗传学研究植物功能基因组非常优良的工具。
附图说明
图1 TYLCCNV-Y10 DNA-A、DNAβ、DNAmβ载体、TYLCCNV病毒沉默载体及重组病毒沉默载体克隆的结构示意图；图中：MCS代表多克隆位点，SCR代表DNAβ的共同区，AC1-AC4代表TYLCCNV互补链上编码的ORF，AV1-AV2代表TYLCCNV病毒链上编码的ORF；
图2 TYLCCNV病毒沉默载体在矮牵牛上诱导叶色、花色基因沉默；图中：A：pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub空载体接种的矮牵牛植株。B：pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-Su521接种的矮牵牛植株。C、E：pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub空载体接种植株的牵牛花。D、F：pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-CHS接种植株并发生CHS沉默表型的牵牛花。
具体实施方式
一.用TYLCCNV-Y10DNA-A与其DNAβ的侵染性克隆构建一种新型的TYLCCNV病毒沉默载体：
1.TYLCCNV-Y10感染植物总DNA的抽提：用液氮研磨TYLCCNV-Y10感病烟草叶片，按每克叶片加入8ml 65℃预热的非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)抽提液[2％CTAB，100mM Tris.Cl pH 8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl，2％(v/v)2-巯基乙醇]，65℃加热1小时，不时搅动；加等体积氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)/抽提，4℃ 10000rpm离心5分钟；取上清加1/10体积、65℃预热的CTAB/NaCl(10％ CTAB，0.7M NaCl)，重复用等体积氯仿/异戊醇抽提一次；4℃ 10000rpm离心5分钟，取上清加入等体积CTAB沉淀液(1％CTAB，50mM Tris·Cl pH 8.0，10mM EDTA pH8.0)，65℃温育至出现沉淀；4℃ 10000rpm离心5分钟，沉淀用3ml高盐TE缓冲液(10mM Tris·Cl pH 8.0，0.1mM EDTA pH8.0，1M NaCl)悬浮，加入1/10体积3M pH5.2 NaAc，2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置1小时；4℃12000rpm离心15分钟，沉淀用70％乙醇洗一次，4℃ 10000rpm离心3分钟，沉淀适度干燥后用150μl ddH2O溶解，加入2μl 10mg/ml RNAase A在37℃消化30分钟即为抽提的植物总DNA。
2.构建TYLCCNV-Y10 DNAβ缺失βC1并带有单一多克隆位点的侵染性克隆
用pBIN19载体(Clontech公司)根据Van Engelen等报道的方法构建pBinPLUS(具体方法见Van Engelen等发表的论文，即pBINPLUS：an improved plant transformation vector based onpBIN19，Transgenic Research，1995，4，288-290)。双生病毒的侵染性克隆需要1.3-2.0个正向重复的全长基因组(含两个双生病毒的共同区序列)。以TYLCCNV-Y10分离物烟草总DNA为模板，根据GENBANK中AJ421621(登录号)的基因序列设计的特异性引物Y10-beta SubSal/F(5’-GTCGAC ATA CAT ATA TAT ACG TAT TC-3’，引入Sal I)与Y10-beta SubXba/R(5’-TCTAGA GTT TAT TTG TTG TGG ATG ATA CATG-3’，引入Xba I)进行PCR扩增。PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总DNA，20umol引物，0.2mmol/L 4×dNTPs，1.5mmol/LMgCL2，50mmol/LKCL，1mmol/L Tris·HCL(pH8.0)，1.2个单位的Pfu DNA聚合酶。反应条件：94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min，循环35次后，72℃延伸10min。PCR产物插入pGEMT-Vector(Promega，Madison，WI，USA)，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mβ-Sub-SX；同时根据GENBANK中AJ421621(登录号)的基因序列设计另一对特异性引物Y10-beta SubXbaSmaBam/F(5’-
TCTAGACCCGGGGGATCC ATA CAT ATA TAT ACG TAT TCA AAT ATATG-3’，引入Xba I、Sma I和BamH I)与Y10-beta Sub EcoR/R(5’-GAATTC GTT TAT TTG TTGTGG AT G AT-3’，引入EcoR I)，对TYLCCNV-Y10分离物植物总DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总DNA，20umol引物，0.2mmol/L 4×dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50mmol/L KCL，1mmol/L Tris·HCL(pH8.0)，1.2个单位的Pfu DNA聚合酶。反应条件：94℃1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min，循环35次后，72℃延伸10min。PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到的正向插入的阳性克隆pGEM mβ-Sub-Xba-EcoR经Xba I和Pst I双酶切后插入pGEM-mβ-Sub-SX，得到阳性克隆pGEM-2mβ-Sub，这一克隆经Sal I和EcoR I双酶切后插入到植物表达载体pBinPLUS，由此构建成TYLCCNV DNAβ侵染性克隆pBinPLUS-2mβ-Sub(图1)。该侵染性克隆含有缺失βC1的两个正向重复拷贝的DNAβ，即两个DNAmβ，在两个DNAmβ分子中间缺失βC1位置引入多克隆位点Xba I、Sma I和BamH I，植物内源基因的cDNA片段可以插入pBinPLUS-2mβ-Sub的多克隆位点构建所需的沉默载体。
3.用TYLCCNV-Y10的DNA-A构建pGEM-1.7A质粒
以感染TYLCCNV-Y10烟草的总DNA为模板，根据GENBANK中AJ319675(登录号)的基因序列设计Y10 PL-S/F(5’-CGTCGA CAC CTG TTT GGG GAT ATG AGAT-3’，引入Sal I位点)和Y10 FL-E/R(5’-GAATTC ATG GGG GCC CAA AGG-3’，含EcoR I位点)引物，进行PCR扩增。PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总DNA，20umol引物，0.2mmol/L 4×dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50mmol/L KCL，1mmol/L Tris·HCL(pH8.0)，1.2个单位的Pfu DNA聚合酶。反应参数为：94℃2min；94℃45sec，55℃45sec，72℃3min，34个循环；最后72℃延伸10min。得到0.7个拷贝的全长DNA-A，PCR产物插入pGEM-T Vector(Promega，不含EcoR I)得到克隆pGEM-0.7A；根据GENBANK中AJ319675(登录号)的基因序列设计全长引物Y10 FL-E/F(5’-GAATTC TTT AAA GTG CTT TAG-3，含EcoR I位点)与Y10FL-E/R(5’-GAATTC ATGGGG GCC CAA AGG-3，含EcoR I位点)，对TYLCCNV-Y10分离物总DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总DNA，20umol引物，0.2mmol/L 4×dNTPs，1.5mmol/LMgCL2，50mmol/L KCL，1mmol/L Tris·HCL(pH8.0)，1.2个单位的Pfu DNA聚合酶。反应参数为：94℃2min；94℃45sec，55℃45sec，72℃3min，34个循环；最后72℃延伸10min。获得一个全长拷贝的基因组DNA-A，PCR产物经EcoR I酶切后插入pGEM-0.7A的EcoR I位点，得到pGEM-1.7A。
4.TYLCCNV病毒沉默载体的构建
pGEM-1.7A经Sal I酶切切下1.7-拷贝的DNA-A插入上述构建的pBinPLUS-2mβ-Sub的Sal I位点，获得TYLCCNV病毒沉默载体pBinPLUS-1.7A+2mβ-Sub，该TYLCCNV病毒沉默载体含有1.7拷贝TYLCCNV DNA-A和含有缺失βC1的两个正向重复拷贝的DNAβ(即两个DNAmβ)，且在两个DNAmβ分子中间缺失βC1位置引入多克隆位点Xba I、Sma I和BamHI。植物叶色、花色基因的cDNA片段可以插入pBinPLUS-2mβ-Sub的多克隆位点构建所需的沉默载体。
二.植物叶色、花色内源基因cDNA片段的克隆及诱导植物叶色、花色基因沉默的TYLCCNV病毒沉默载体的构建
用Trizol提取总RNA，通过RT-PCR方法克隆植物叶色、花色相关基因的cDNA片段(cDNA片段长度170-1200kb)，如Su、CHS、PDS等基因片段，将其连接到测序载体pGEM-TEasy Vector，核酸测序验证其cDNA片段序列的正确性。克隆的植物叶色、花色内源基因cDNA片段插入构建的TYLCCNV病毒沉默载体——pBinPLUS-2mβ-Sub的多克隆位点，构建成含植物叶色或花色内源基因片段的TYLCCNV DNAβ侵染性克隆。从pGEM-1.7A经Sal I酶切切下1.7-拷贝的DNA-A插入含植物叶色或花色内源基因片段的TYLCCNV DNAβ侵染性克隆的Sal I位点，获得含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体
三.沉默观赏植物的叶色、花色基因而改变叶色、花色
将含植物叶色、花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体通过三亲交配的方法导入农杆菌，用含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体的农杆菌注射接种观赏植物。通过TYLCCNV病毒沉默载体诱导沉默观赏植物内源叶色或花色基因而使植物叶色、花色改变，增加观赏植物的观赏性。
实施例1.TYLCCNV病毒沉默载体诱导沉默矮牵牛Su内源叶色基因
(1)RT-PCR方法克隆矮牵牛叶色Su基因cDNA片段
Sulphur gene(Su)基因编码一个在叶绿素合成途径中镁离子螯合酶复合体的关键组分，该基因被沉默后将导致叶绿素合成途径受阻从而导致植物组织变黄。用Trizol提取矮牵牛植物总RNA，以总RNA中的mRNA为模板及Su基因的特异性引物进行RT-PCR扩增Su基因的cDNA片段。以Su521/R(GGATCCTCATAAAATTTCTCAACAACAAG，引入BamH I)作为特异性引物，用Reverse Transcription System kit(Promega公司)反转录合成植物内源基因Su的cDNA片段第一链；然后以Su521/F(TCTAGAGTTGAAAGAGAGGGGATATCAAT，引入XbaI)与Su521/R(GGATCCTCATAAAATTTCTCAACAACAAG，引入BamH I)作为特异性引物用PCR方法从矮牵牛mRNA中扩增到521bp Su基因的cDNA片段。将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列。
(2)含矮牵牛叶色内源基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体的构建
从矮牵牛mRNA中扩增到的521bp Su cDNA片段，经Xba I和BamH I双酶切后插入上述pBinPLUS-2mβ-Sub，构建成pBinPLUS-2mβ-Sub-Su521，通过Sal I从pGEM-1.7A上切下1.7拷贝的TYLCCNV-Y10 DNA-A，插入pBinPLUS-2mβ-Sub-Su521，构建了诱导矮牵牛内源Su基因沉默的病毒沉默载体pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-Su521。
(3)含矮牵牛叶色内源基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体转化农杆菌
含矮牵牛叶色内源基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体的转化是通过三亲交配的方法进入农杆菌宿主细胞，病毒沉默载体需要通过辅助质粒pROK2013(Clontech公司产品)的介导才能进入农杆菌EHA105(Clontech公司)。含上述构建的沉默载体pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-Su521的DH5α接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含Sm(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；含辅助质粒pROK2013的DH5α接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。取含病毒沉默载体的DH5α、EHA105、含pROK2013的DH5α菌液各400μl，颠倒混匀后，6000rpm 30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH2O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，用玻璃涂棒在生长出来的菌斑上蘸一下，随即连续涂布三块含有Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP固体培养基平板，以此得到含有植物内源基因沉默载体的EHA105的单菌落，长出单菌落后用上述矮牵牛Su基因的特异性引物对其进行PCR鉴定，获得含重组植物内源基因沉默载体的EHA105农杆菌。
(4)含Su基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体诱导基因沉默改变矮牵牛的叶色
含pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-Su 521TYLCCNV病毒沉默载体的EHA105农杆菌分别接种4-8叶期矮牵牛。具体接种方法如下，取一支1ml的一次性注射器，吸取含pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-Su521病毒沉默载体的EHA105农杆菌菌液，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划数下，接种植株置于防虫温室，25℃、16hr光照下培养，观察出现的表型。含Su cDNA片段的沉默载体pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-Su521通过农杆菌注射接种矮牵牛大约2周后，矮牵牛新长出的叶片沿叶脉开始黄化，随后向整片叶片扩展，出现典型的Su沉默表型(图2)。在接下来的几周里，新生的茎、腋芽和花萼都出现彻底的黄色症状，这些沉默的表型能够保持2个月以上。
实施例2.TYLCCNV病毒沉默载体诱导沉默矮牵牛CHS内源花色基因
(1)RT-PCR方法克隆矮牵牛花色CHS基因cDNA片段
查尔酮合成酶基因(Chalcone synthase，CHS)基因的沉默可导致原来的深色花变成白色。用Trizol提取矮牵牛植物总RNA，以总RNA中的mRNA为模板以及根据GENBANK登录(AF233638)的CHS基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增CHS基因的cDNA片段。以CHS/R(GGATCC ACA CTG TGG AGG ACA ACA G，引入BamH I)为引物，用Reverse Transcription Systemkit(Promega公司)反转录合成植物内源基因CHS的cDNA片段第一链；然后以CHS/F(TCTAGATGTTCCTGGGCTGATCTC，引入Xba I)与CHS/R(GGATCC ACA CTG TGG AGG ACA ACA G，引入BamH I)为引物用PCR方法从矮牵牛mRNA中扩增出351bp的CHS基因cDNA片段。将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列。
(2)含矮牵牛花色内源基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体的构建
从矮牵牛中扩增出351bp的CHS基因cDNA片段，经Xba I和BamH I双酶切后插入上述构建的pBinPLUS-2mβ-Sub，构建了pBinPLUS-2mβ-Sub-CHS351，通过Sal I从pGEM-1.7A上切下1.7拷贝的TYLCCNV-Y10 DNA-A，插入pBinPLUS-2mβ-Sub-CHS351，构建了CHS基因的病毒沉默载体pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-CHS351。
(3)含矮牵牛花色内源基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体转化农杆菌
含矮牵牛花色内源基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体的转化是通过三亲交配的方法进入农杆菌宿主细胞，病毒沉默载体需要通过辅助质粒pROK2013(Clontech公司产品)的介导才能进入农杆菌EHA105(Clontech公司)。含上述构建的沉默载体pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-CHS351的DH5α接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含Sm(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；含辅助质粒pROK2013的DH5α接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。取含病毒沉默载体的DH5α、EHA105、含pROK2013的DH5α菌液各400μl，颠倒混匀后，6000rpm 30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH2O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，用玻璃涂棒在生长出来的菌斑上蘸一下，随即连续涂布三块含有Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP固体培养基平板，以此得到含有植物内源基因沉默载体的EHA105的单菌落，长出单菌落后用上述矮牵牛CHS基因的特异性引物对其进行PCR鉴定，获得含重组植物内源基因沉默载体的EHA105农杆菌。
(4)含CHS基因片段的TYLCCNV病毒沉默载体诱导基因沉默改变矮牵牛的花色
含CHS基因片段的pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-CHS351病毒沉默载体的EHA105农杆菌接种4-8叶龄期的开纯色花种的矮牵牛(纯红色和纯蓝色品系)植株。具体接种方法如下，取一支1ml的一次性注射器，吸取含pBinPLUS-1.7A-2mβ-Sub-CHS351病毒沉默载体的EHA105农杆菌菌液，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划数下，接种植株置于防虫温室，25℃、16hr光照下培养，观察出现的表型。大约在接种后1个月左右，在接种的矮牵牛中新开的牵牛花上开始出现花色的褪变，原先纯红色牵牛花出现红白相间或者大部分变为白色的牵牛花，纯蓝色的牵牛花也出现类似的表型(图2)，这种表型能够维持到牵牛花凋谢为止。
Claims (4)
1.一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法，其特征在于方法的步骤如下：
1)提取感染TYLCCNV病毒的烟草植物基因组总DNA；
2)用分子手段构建成TYLCCNV病毒卫星分子DNAβ的缺失βC1并带有单一多克隆位点的侵染性克隆；
3)根据GENBANK中观赏植物叶色或花色相关基因的序列设计引物，用RT-PCR方法克隆观赏植物叶色或花色相关基因的170--1200kb的cDNA片段，并将其插入上述TYLCCNV病毒卫星分子DNAβ侵染性克隆的多克隆位点处，构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆；
4)从感染TYLCCNV病毒的烟草植物基因组总DNA中分别用PCR方法克隆0.7拷贝DNA-A和1.0拷贝DNA-A的DNA片段，并插入pGEM-T Vector构建成pGEM-1.7A质粒；从pGEM-1.7A质粒酶切切下1.7拷贝的DNA-A片段并插入含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ侵染性克隆的多克隆位点，构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体；
5)将含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体通过三亲交配的方法导入农杆菌，用该含病毒沉默载体的农杆菌注射接种观赏植物，诱导沉默观赏植物内源叶色或花色相关基因而改变观赏植物的花色或叶色。
2.根据权利要求1所述的一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法，其特征在于所述的构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆的步骤如下：以TYLCCNV-Y10分离物烟草总DNA为模板，以Y10-beta Sub Sal/F：5’-GTC GAC ATA CATATA TATACG TAT TC-3’与Y10-beta Sub Xba/R：5’-TCT AGA GTT TATTTG TTG TGG ATG ATA CATG-3’为特异性引物进行PCR扩增。PCR产物插入pGEMT-Vector，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mβ-Sub-SX；用另一对特异性引物Y10-beta SubXbaSmaBam/F：5’-TCTAGACCCGGGGGATCCATACATATATAT ACGTATTCAAATATATG-3’与Y10-beta Sub EcoR/R：5’-GAATTCGTT TATTTGTTGTGGATG AT-3’，对TYLCCNV-Y10分离物植物总DNA进行PCR扩增。PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到的正向插入的阳性克隆pGEM mβ-Sub-Xba-EcoR经Xba I和Pst I双酶切后插入pGEM-mβ-Sub-SX，得到阳性克隆pGEM-2mβ-Sub，这一克隆经Sal I和EcoR I双酶切后插入到植物表达载体pBinPLUS的Sal I和EcoR I位点，由此构建成TYLCCNV DNAβ侵染性克隆pBinPLUS-2mβ-Sub。该侵染性克隆含有缺失βC1的两个正向重复拷贝的DNAβ，即两个DNAmβ，在两个DNAmβ分子中间缺失βC1位置引入多克隆位点Xba I、Sma I和BamH I。植物叶色或花色基因的cDNA片段插入pBinPLUS-2mβ-Sub的多克隆位点构建成含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆。
3.根据权利要求1所述的一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法，其特征在于所述构建pGEM-1.7A质粒的步骤如下：以感染TYLCCNV-Y10烟草的总DNA为模板，以Y10PL-S/F：5’-CGTCGACACCTGTTTGGGG ATA TGA GAT-3’和Y10FL-E/R：5’-GAA TTC ATG GGG GCC CAA AGG-3’为引物进行PCR扩增，得到0.7个拷贝的全长DNA-A，PCR产物插入pGEM-T Vector得到克隆pGEM-0.7A；以全长引物Y10FL-E/F：5’-GAA TTC TTT AAA GTG CTT TAG-3与Y10FL-E/R：5’-GAA TTC ATG GGGGCC CAA AGG-3，对TYLCCNV-Y10分离物植物总DNA进行PCR扩增，获得一个全长拷贝的基因组DNA-A，PCR产物经EcoR I酶切后插入pGEM-0.7A的EcoR I位点，得到pGEM-1.7A。
4.根据权利要求1所述的一种用植物DNA病毒沉默载体改变观赏植物叶色、花色的方法，其特征在于所述构建含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体步骤如下：从上述pGEM-1.7A质粒上用Sal I酶切切下1.7-拷贝的DNA-A插入含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV DNAβ的侵染性克隆的Sal I位点，获得含植物叶色或花色基因cDNA片段的TYLCCNV病毒沉默载体。
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