CN101139614B - 植物dna病毒卫星沉默载体及其构建和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物DNA病毒卫星沉默载体及其构建和使用方法。该植物DNA病毒卫星沉默载体来源于烟草曲茎病毒相伴随的卫星分子——DNA1，并在DNA1的Rep开放阅读框下游引入了单一的多克隆位点。本发明还提供了利用该植物DNA病毒卫星沉默载体进行植物功能基因组研究的方法。用RT-PCR方法克隆植物目的基因的cDNA片段，并插入DNA1病毒卫星沉默载体的多克隆位点构建成含有植物目的基因的重组病毒卫星沉默载体。该重组病毒卫星沉默载体和中国番茄黄化曲叶病毒的DNA-A通过农杆菌注射接种植物，诱导沉默植物的目的基因后使植物的表型发生改变，并利用实时荧光定量RT-PCR技术对目的基因的表达量进行检测从而确定该基因的功能。
Description
技术领域
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种植物DNA病毒卫星沉默载体及其构建和使用方法。
背景技术
基因沉默(Gene silencing)是近年来发现的一种基于核酸水平的高度保守的特异性降解机制。病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)是一种利用基因沉默的原理研究植物基因组的强有力的研究工具。它利用反向遗传学的方法，通过携带植物基因cDNA的病毒在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默而出现表现型突变，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。其主要机制是插入到病毒载体上的植物基因随着病毒的复制形成dsRNA的中间体，并被称为Dicer的酶降解成21-23nt的RNA，并与RNAase结合形成复合体，这个复合体特异性地切割它的同源序列，从而使植物中的同源基因丧失功能，因而可以在植物的表型以及生化特征上研究植物基因组的功能。利用这一方法，我们可以人为在病毒载体上插入植物的功能基因，通过沉默机制将其部分或全部沉默，从而改变植物的表型。VIGS比起传统的基因筛选过程研究基因组功能更优越，在于它周期性短以及成本较低，一般构建重组载体到接种植物进行功能鉴定只需几个星期时间，因此可以大规模进行基因组序列或EST序列的功能鉴定，并且它还能鉴定一些用传统方法无法鉴定的基因，因此这种技术在很短的时间内就得到了广泛的应用(Burch-Smith TM，et al.，2004，Plant J39：734-746)。
到目前为止，已经有一些病毒被成功的改造成基因沉默的载体，其中包括RNA病毒，DNA病毒以及一些病毒卫星分子。但是由于有些病毒寄主范围较窄，有些在植株上产生严重的病毒症状，有些RNA病毒容易被植物降解而不能产生持续的基因沉默表型等因素的限制，真正能大范围用于功能基因研究的病毒载体还很少，寻找能够克服这些缺点的优良的病毒基因沉默载体一直是当今植物学家研究的热点(Robertson D，2004，Annu Rev Plant Biol55：495-519)。
双生病毒是世界范围内广泛发生的一类植物单链环形DNA病毒，在电镜下呈孪生颗粒形态，病毒粒子大小约30×20nm。随着全球气候的变化、贸易的增加和烟粉虱的空前扩展，这类病毒在全世界范围内大面积爆发流行，已在多种作物上引起严重危害。菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)是双生病毒科中的最具经济重要性的一个属，包含200多个独立种，大多begomoviruses包含2个大小相近的单链环状DNA(ssDNA)组分，大小为2.5-3.0kb，称为DNA-A和DNA-B，少数begomoviruses只含有一个组分，即DNA-A。近年来发现的一些单组份双生病毒，如胜红蓟黄脉病毒和木耳坦棉花曲叶病毒等，其DNA-A虽能系统侵染胜红蓟和棉花，却并不能诱导典型的黄脉或曲叶症状，进一步研究发现，这类单组份病毒需要一种新型的卫星DNAβ分子共同侵染才能引起典型症状。DNAβ大小为辅助病毒DNA的一半(约1.3-1.4kb)，只编码一个症状调节因子(βC1蛋白)，是该类单组份双生病毒诱发典型症状所必需的。目前在亚洲、非洲多个国家的单组份双生病毒上都发现了DNAβ，已形成一类新型的双生病毒/DNAβ病害复合体(Mansoor S，et al.，2003，Trends Plant Sci8：128-134)。
随着研究的深入，近年来发现在单组份双生病毒如：胜红蓟黄脉病、棉花曲叶病及秋葵曲叶病株中发现了另一类单链环状DNA分子，称为DNA1，DNA1大小约1.3-1.4kb，与双生病毒DNA-A及DNA-β分子没有序列同源性。DNA1包含一个茎环结构和类似矮缩病毒科病毒(nanovimses)的九核苷酸序列TAGTATTAC；编码一个类似nanoviruses的复制酶(Rep)，因而DNA1能自我复制，但依赖双生病毒进行包装、运动和传毒；在Rep的下游含一个大小为180nt-200nt的A-rich区；DNA1不能单独侵染植株，总是与双生病毒/DNAβ病害复合体相伴随，但是对病毒的致病性几乎没有影响，其生物学功能还不清楚(Briddon RW，et al.，2004，Virology324：462-474)。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物DNA病毒卫星沉默载体及其构建和使用方法。
该植物DNA病毒卫星沉默载体是含有两个正向重复拷贝的烟草曲茎病毒DNA1分子的侵染性克隆，并在两个DNA1分子中间复制酶开放阅读框下游位置引入多克隆位点XbaI、SmaI和BamHI。
所述的烟草曲茎病毒DNA1分子，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
植物DNA病毒卫星沉默载体的构建方法步骤如下：
1)提取感染烟草曲茎病毒的烟草植物基因组总DNA，以该总DNA为模板，以DNA1XSB：5’-TCTAGACCCGGGATCCGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3和DNA1K：5’-GGTACCGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’为特异性引物进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XSBK；
2)以提取的总DNA为模板，用另一对特异性引物，DNA1S：5’-GTCGACGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3和DNA1X5’-TCTAGAGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到的正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XS，pGEM-mDNA1XS经XbaI和SalI双酶切后插入pGEM-mDNA1XSBK，得到阳性克隆pGEM-2mDNA1；
3)该重组克隆经SalI和KpnI双酶切后插入到植物表达载体pBINPLUS的SalI和KpnI位点，由此构建成病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1。
植物DNA病毒卫星沉默载体在植物功能基因组中的使用方法包括如下步骤：
1)根据目的基因在GENBANK中的基因序列设计带有酶切位点的引物，用RT-PCR方法扩增植物目的基因的cDNA片段，并克隆到pGEM T-Vector进行测序确认，然后利用酶切、连接分子手段将其插入病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1的多克隆位点处，构建成含目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体；
2)带有含目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体和TYLCCNV侵染性克隆pBINPLUS-1.7A通过三亲交配的方法分别导入EHA105农杆菌，用含有目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体和pBINPLUS-1.7A的农杆菌混合溶液注射接种4—6叶充分展开的苗龄期的植株，诱导沉默植物目的基因，观察植物表型的改变；
3)在目的基因cDNA片段两侧核酸区域设计引物，利用实时定量RT-PCR技术检测沉默植株中目的基因mRNA的含量，对沉默的目的基因进行表达量的分析，根据基因表达量表型的变化确定该基因的功能。
本发明的植物基因沉默载体可利用导入的植物转基因或内源基因cDNA沉默植物基因，从而改变植物的表型，进而达到研究植物基因功能的目的，相对于已有的基因沉默载体有以下优点：本发明的工作量小，构建简易，周期性短，可以进行大规模沉默；本发明来源于DNA病毒，相对于RNA病毒卫星沉默载体，能够产生更持续的沉默表型，有利于基因沉默的研究；本发明能够沉默生长点基因，能够弥补其它载体不能沉默此种基因的不足；由于载体本身不带有致病基因，所以不会对植物生长产生危害；载体本身没有病毒症状，便于沉默表型的观察；沉默效率高，更有利于功能基因的研究；因此本发明的植物基因沉默载体是一种用反向遗传学研究植物功能基因组非常优良的工具。
附图说明
图1Rep代表DNA1的复制酶开放阅读框，A-rich代表A富含区，Gene代表克隆到沉默载体上的各个目的基因片断；LB代表pBINPLUS载体的左臂，RB代表pBINPLUS载体的右臂。
图2DNA1病毒卫星沉默载体在转基因本氏烟诱导GFP基因沉默；图中：A：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1空载体接种的转GFP本氏烟植株，B：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-GFP170接种并诱发沉默的转GFP本氏烟植株。
图3DNA1病毒卫星沉默载体在烟草和番茄诱导Su基因沉默；图中：A，C，E，G，I：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1空载体接种的本氏烟、普通烟、三生烟、心叶烟、番茄植株，B，D，F，H：pBINPLUS-1.7A与pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351接种并诱发沉默的本氏烟、普通烟、三生烟、心叶烟植株，J：pBINPLUS-1.7A与pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351接种并诱发沉默的番茄植株。
图4DNA1病毒卫星沉默载体在本氏烟诱导PCNA基因沉默；图中A：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1空载体接种的本氏烟植株，B：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350接种并诱发沉默的本氏烟植株。
图5A：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1空载体接种植株的牵牛花，B：pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-CHS350接种植株并发生CHS沉默表型的牵牛花。
图6接种的各个目的基因在分别在不同植株上的基因沉默效率，GFP基因代表接种pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-GFP170相对于对照植株99.84％的GFP基因被沉默；Su基因代表接种pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-Su351相对于对照植株96.25％的Su基因被沉默；PCNA基因代表接种pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350相对于对照植株86.02％的PCNA基因被沉默；CHS基因代表接种pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-CHS350相对于对照植株85.14％的CHS基因被沉默；
具体实施方式
本发明根据上述双生病毒基因组特点及病毒诱导的基因沉默的原理，用烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus，简称为TbCSV)DNA1构建一种植物DNA病毒卫星沉默载体，根据基因沉默的原理利用该沉默载体进行植物功能基因的研究。
采用下面的非限制性实施例对本发明作进一步描述。实施例1描述了病毒卫星沉默载体的构建步骤和方法，实施例2-5利用具有代表性的植物基因如：GFP为转基因，Su为植物内源叶色基因，PCNA为植物的生长点基因，CHS为植物的花色基因描述了利用此病毒卫星沉默载体进行功能基因研究的步骤和方法。以下的实例是用来描述本发明，而不是限制本发明。
实施例1构建TbCSV DNA1带有单一多克隆位点的病毒卫星沉默载体
抽提TbCSV感染烟草植物的总DNA[Murray MG et al.，1987，EMBO J，6：3901～3907]，因为双生病毒的侵染性克隆需要1.3-2.0个正向重复的全长基因组(含两个双生病毒的共同区序列)。以TbCSV烟草植物总DNA为模板，根据SEQID NO.1的基因序列设计的特异性引物以DNA1XSB
(5’-TCTAGACCCGGGATCCGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3’引入XbaI，SmaI和BamHI酶切位点)和DNA1K
(5’-GGTACCGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’引入KpnI酶切位点)对TbCSV烟草植物总DNA进行PCR扩增，同时根据SEQ ID NO.1基因序列设计另一对特异性引物，DNA1S(5’-GTCGACGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3’引入SalI酶切位点)和DNA1X(5’-TCTAGAGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’引入XbaI酶切位点)为特异性引物对TbCSV烟草植物总DNA进行PCR扩增PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总DNA，20μmol引物，0.2mmol/L4×dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50mmol/L KCL，1mmol/L Tris·HCL(pH8.0)，1.2个单位的Pfu DNA聚合酶。反应条件：94℃1min，50℃1min，72℃1min，循环35次后，72℃延伸10min。PCR产物分别插入pGEM T-Vector(Promega，Madison，WI，USA)，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XSBK和
pGEM-mDNA1XS。pGEM-mDNA1XS经XbaI和SalI双酶切后mDNA1XS片断插入pGEM-mDNA1XSBK，得到阳性克隆pGEM-2mDNA1，这一克隆经SalI和KpnI双酶切后插入到植物表达载体pBINPLUS(该载体的构建见Transgenic
Research，1995，4,288-290)的SalI和KpnI位点，由此构建成TbCSV DNA1病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1。该病毒卫星沉默载体含有两个正向重复拷贝的DNA1分子，在两个DNA1分子中间复制酶开放阅读框下游位置引入多克隆位点XbaI、SmaI和BamHI(图1)。植物目的基因的cDNA片段可以插入pBINPLUS-2mDNA1的多克隆位点构建所需的重组病毒卫星沉默载体。
实施例2植物转基因或内源基因cDNA片段的克隆
提取16C植株(转GFP本氏烟，文献见Voinnet and Baulcombe，1997，Nature，389：553)、本氏烟、番茄和矮牵牛总RNA(Johansen，LK，and Carrington，JC，2001，Plant Physiol，126：930-938)，以总RNA中的mRNA为模板及各个基因的特异性引物进行两步法RT-PCR扩增目的基因cDNA片段。具体方法如下：利用ReverseTranscription System kit(Promega公司)合成第一链的cDNA。DEPC处理的Eppendorf管中RNA5μl，Olige dT primer1μl，Rnase free H2O5μl，70℃水浴10min；依次加入5×cDNA buffer4μl，0.1mol/L DTT2μl，10mM dNTP1μl，Rnase inhibitor1μl，42℃水浴2min后加1μl M-MLV42℃50min，然后70℃15min灭活反转录酶，即合成了合成转基因植物基因的cDNA第一链。然后以GFPF(5’-TGGATCCTTGACTTCAGCACGTGTC-3’引入BamHI酶切位点)和GFPR(5’-TCTAGATGGCCAACACTTGTCACTAC-3’引入XbaI酶切位点)作为特异性引物用PCR方法从16C植株mRNA中扩增到170bp GFP基因的cDNA片段GFP170(SEQIDNO.2)；以SuF(5’-GGATCCTCTAGACAGGGCAGAGTCAAGGGAGG-3’引入XbaI酶切位点)和Su351R(5’-GGATCCTGGATCTGAATTGAACGGATC-3引入BamHI酶切位点)作为特异性引物用PCR方法从烟草和番茄mRNA中扩增到351bp的烟草Su基因的cDNA片段NbSu351(SEQ ID NO.3)和番茄Su基因的cDNA片段ToSu351(SEQIDNO.4)；以PCNAF(5’-TCTAGAATTACTCTCAAGGCTGACG-3’引入XbaI酶切位点)和PCNAR(5’-TGGATCCACACTGGCTCATTCATCTCTA-3’引入BamHI酶切位点)作为特异性引物用PCR方法从本氏烟mRNA中扩增到350bpPCNA基因的cDNA片段PCNA350(SEQ ID NO.5)；以CHS/F(TCTAGA TGT TCC TGG GCT GATCTC，引入XbaI)与CHS/R(GGATCCACACTGTGGAGGACAACAG，引入BamHI)为引物用PCR方法从矮牵牛mRNA中扩增出350bp的CHS基因cDNA片段CHS350(SEQ ID NO.6)。PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总cDNA，20μmol引物，0.2mmol/L4×dNTPs，1.5mmol/L MgCL2，50mmol/L KCL，1mmol/LTris·Hcl(pH8.0)，1.2个单位的PfuDNA聚合酶。反应参数为：94℃2min，94℃45sec，X℃45sec(X代表各个引物对的退火温度)，72℃3min，34个循环；最后72℃延伸10min。将得到的各个cDNA片段连接到测序载体pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列(由测序公司完成)。
实施例3含植物转基因、植物目的基因片段的DNA1重组病毒卫星沉默载体的构建
从16C植株mRNA中扩增到并经过测序验证过的170bp GFP cDNA片段GFP170(SEQ ID NO.2)，从本氏烟和番茄mRNA中扩增到并经过测序验证过的351bp本氏烟Su cDNA片段NbSu351(SEQ ID NO.3)和番茄Su cDNA片段ToSu351(SEQ ID NO.4)，从本氏烟mRNA中扩增到并经过测序验证过的350bpPCNA cDNA片段PCNA350(SEQ ID NO.5)和矮牵牛mRNA中扩增到并经过测序验证过的351bp CHS cDNA片段CHS351(SEQ ID NO.6)，经XbaI和BamHI双酶切后分别插入病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1，构建成诱导16C植株、烟草、番茄和矮牵牛植物基因沉默的pBINPLUS-2mDNA1-GFP170、pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351、pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351、pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350和pBINPLUS-2mDNA1-CHS351的重组病毒卫星沉默载体，并将其热激转化进入大肠杆菌的细胞。
实施例4含目的基因片段的DNA1重组病毒卫星沉默载体和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，简称为TYLCCNV)侵染性克隆pBINPLUS-1.7A转化农杆菌
含目的基因片段的DNA1重组病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1-GFP170、pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351、pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351、pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350、pBINPLUS-2mDNA1-CHS351和含有1.7拷贝TYLCCNV DNA-A的pBINPLUS-1.7A(Cui et al.，2004，J Virol，78(24)：13966-13974)的转化是通过三亲交配的方法进入农杆菌宿主细胞，具体方法如下：病毒卫星沉默载体需要通过辅助质粒pROK2013(Clontech公司产品)的介导才能进入农杆菌EHA105(Clontech公司)。含上述构建的重组病毒卫星沉默载体和pBINPLUS-1.7A的DH5α接种5ml含卡那霉素(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含链霉素(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；含辅助质粒pROK2013的DH5α接种5ml含卡那霉素(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。取含病毒卫星沉默载体的DH5α、EHA105、含pROK2013的DH5α菌液各400μl，颠倒混匀后，6000rpm30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH2O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，用玻璃涂棒在生长出来的菌斑上蘸一下，随即连续涂布三块含有卡那霉素(50mg/ml)和链霉素(50mg/ml)的YEP固体培养基平板，以此得到含有植物内源基因沉默载体的EHA105的单菌落，用上述目的基因和TYLCCNV DNA-A的特异性引物对其进行PCR鉴定，获得含重组植物基因沉默载体pBINPLUS-2mDNA1-GFP170、pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351、pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351、pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350、pBINPLUS-2mDNA1-CHS351和含有1.7拷贝TYLCCNV DNA-A的pBINPLUS-1.7A的EHA105农杆菌。
实施例5含目的基因片段的DNA1重组病毒卫星沉默载体诱导基因沉默改变植株的表型
含有pBINPLUS-2mDNA1-GFP170、pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351、pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351、pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350和pBINPLUS-2mDNA1-CHS351的各个重组病毒卫星沉默载体分别与含有1.7拷贝TYLCCNV DNA-A的pBINPLUS-1.7A的EHA105农杆菌混合。分别接种4—8叶期16C植株、烟草、番茄、本氏烟和矮牵牛。具体操作方法如下，含pBINPLUS-2mDNA1-GFP170、pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351、pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351、pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350和pBINPLUS-2mDNA1-CHS351的病毒卫星沉默载体与含有1.7拷贝TYLCCNVDNA-A的pBINPLUS-1.7A的EHA105农杆菌分别在5ml含卡那霉素(50mg/ml)和链霉素(50mg/ml)的YEP液体培养基培养，28℃下200rpm振荡培养48小时至OD值为1左右。将各个重组基因沉默载体的农杆菌菌液分别和pBINPLUS-1.7A(EHA105)菌液等量混合。接种植株选用4—6叶充分展开苗龄期为宜。具体接种方法如下：取一支1ml的一次性注射器，吸取菌液，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划数下，接种植株置于25℃隔离温室培养。通过农杆菌注射接种转GFP本氏烟pBINPLUS-2mDNA1-GFP170和pBINPLUS-1.7A大约10天后，16C植株新长出的叶片在紫外灯下沿叶脉开始出现红色荧光，随后向整片叶片扩展，在接下来的几周里，整株都出现绿色荧光消失转而出现红色荧光症状(图2)，这种沉默的表型能够一直维持到植物的整个生理周期；通过农杆菌注射分别接种烟草(本氏烟Nicotiana benthamiana、心叶烟N.glutinosa、三生烟N.tabacum Samsun、普通烟N.tabacum)pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351和pBINPLUS-1.7A以及番茄pBINPLUS-2mDNA1-ToSu351和pBINPLUS-1.7A大约两周后，烟草和番茄新长出的叶片沿叶脉开始黄化，随后向整片叶片扩展，在接下来的几周里，新生的茎、腋芽和花萼都出现彻底的黄色症状，这些沉默的表型能够保持2个月以上(图3)；通过农杆菌注射接种本氏烟pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350和pBINPLUS-1.7A大约两周后，接种大约1个月后，所有接种植株顶部终止伸长，新长出的大部分叶片因为向基生长或没有顶端生长而出现畸形并且短而无叶柄(图4)，植物发生沉默以后腋芽的生长也受到抑制而成簇状，这些PCNA被沉默的植株直到死亡也不能恢复生长；通过农杆菌注射接种矮牵牛pBINPLUS-2mDNA1-CHS351和pBINPLUS-1.7A大约1个月左右，在接种的矮牵牛中新开的牵牛花上开始出现花色的褪变，原先纯蓝色牵牛花出现蓝白相间或者大部分变为白色的牵牛花(图5)，这种表型能够维持到牵牛花凋谢为止。
实施例6利用实时荧光定量RT-PCR技术检测被沉默基因的表达量，根据基因表达量的和表型变化确定该基因的功能。
提取pBINPLUS-2mDNA1-GFP170、pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351、pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350和pBINPLUS-2mDNA1-CHS351重组病毒卫星沉默载体分别与pBINPLUS-1.7A以及作为对照的空载体pBINPLUS-2mDNA1和pBINPLUS-1.7A接种过的16C植株、本氏烟和矮牵牛叶片和的叶片总RNA(Johansen，LK，and Carrington，JC，2001，Plant Physiol，126：930-938)，以总RNA中的mRNA为模板合成第一链cDNA。具体方法如下：利用Reverse TranscriptionSystem kit(Promega公司)第一步合成第一链的cDNA。DEPC处理的Eppendorf管中RNA5μl，Olige dT primer1μl，Rnase free H2O5μl，70℃水浴10min；依次加入5×cDNA buffer4μl，0.1mol/L DTT2μl，10mM dNTP1μl，Rnase inhibitor1μl，42℃水浴2min后加1μl M-MLV42℃50min，然后70℃15min灭活反转录酶，即合成了合成转基因植物基因的cDNA片段第一链。利用SYBRpremixex Taq(Takara，Japan)试剂盒在MJ Research Opticon TM2实时荧光系统(MJResearch，American)进行荧光实时定量PCR。以GFP的特异性引物GFPRTF
5′-TTTTCAAAGATGACGGGAACTACA-3′和GFPRTR5′-GGACAGGTAATGGTTGTCTGGTAA-3′扩增GFP片断GFPRT(SEQ IDNO.7)，同时利用本氏烟的看家基因Actin特异性引物NbActinF5′-AGGCTGTTCTTTCCCTCTATGC-3′和NbActinR5′-CAACTTCTCCTTCACATCCCTAAC-3′扩增Actin片断NbActin(SEQ IDNO.8)作为内参基因的表达水平，同时将以上两对引物的扩增产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列。将测序正确的质粒按10的倍数稀释成0.05fg/μl-500pg/μl的8个梯度制作标准曲线对GFP基因的表达量进行检测；以引物SuRTF5′-GCTTCTACACCCTTGTCTTCTCG-3′和SuRTR5′-CCCCTATCACCCATTATCATCAC-3′扩增Su片断NbSuRT(SEQ ID NO.9)，同时利用引物NbActinF5′-AGGCTGTTCTTTCCCTCTATGC-3′和NbActinR5′-CAACTTCTCCTTCACATCCCTAAC-3′扩增本氏烟的看家基因Actin片断NbActin(SEQ ID NO.8)作为内参基因的表达水平，同时将以上两对引物的扩增产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列。将测序正确的质粒按10的倍数稀释成0.05fg/μl-500pg/μl的8个梯度制作标准曲线对Su基因的表达量进行检测；以引物PCNARTF5′-GAACTGGTGAACGATGCGAAC-3′和PCNARTR5′-TCAAACATGAAAGTGACGGTGTC-3′扩增PCNA片断PCNART(SEQ IDNO.10)，同时利用引物NbActinF5′-AGGCTGTTCTTTCCCTCTATGC-3′和NbActinR5′-CAACTTCTCCTTCACATCCCTAAC-3′扩增本氏烟的看家基因Actin片断NbActin(SEQ ID NO.8)作为内参基因的表达水平，同时将以上两对引物的扩增产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列。将测序正确的质粒按10的倍数稀释成0.05fg/μl-500pg/μl的8个梯度制作标准曲线对PCNA基因的表达量进行检测；以引物CHSRTF5′-GTCTAAATGCTTCCTCAAGGCTCT-3′和CHSRTR5′-GAGGCACGGTTCTTCGGTTAG-3′扩增CHS片断CHSRT(SEQ ID NO.11)，同时利用引物PhActinF5′-GTGTTGGACTCTGGTGATGGTG-3′和PhActinR5′-CAATGGAGGAACTGCTCTTGG-3′扩增矮牵牛的看家基因Actin片断PhActin(SEQ ID NO.12)作为内参基因的表达水平，同时将以上两对引物的扩增产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega公司)，并用DNA自动测序仪测定验证其基因核苷酸序列。将测序正确的质粒按10的倍数稀释成0.05fg/μl-500pg/μl的8个梯度制作标准曲线对CHS基因的表达量进行检测。实时荧光定量PCR的反应体系为SYBRpremix ex Taq 10μl，上游引物(20μm)0.4μl，下游引物(20μm)0.4μl，DNA模板1μl，ddH2O9.2μl，反应程序为94℃2min；96℃10sec，60℃15sec，72℃20sec，80℃3sec，Plate Read，39个循环；72℃延伸10min，Meltingcurve analysis 65-90℃0.2℃/Read，1s hold；最后72℃延伸10min。实验数据通过SAS8.0软件进行分析后得出利用pBINPLUS-1.7A与pBINPLUS-2mDNA1-GFP170沉默载体沉默16C植株后，其GFP表达量相对于对照植株下降了99.84％；利用pBINPLUS-1.7A与pBINPLUS-2mDNA1-NbSu351沉默本氏烟的Su基因，其表达量相对于对照植株下降了96.25％；利用pBINPLUS-1.7A与pBINPLUS-2mDNA1-PCNA350沉默载体沉默本氏烟的PCNA基因，其表达量相对于对照植株下降了86.02％；利用pBINPLUS-1.7A和pBINPLUS-2mDNA1-CHS351的病毒卫星沉默载体沉默矮牵牛CHS基因，其表达量相对于对照植株下降了85.14％(图6)。
结合实例2-5，我们可以得出所研究的目的基因的功能如下：GFP能够产生一种荧光蛋白，转GFP基因的本氏烟因为荧光蛋白的存在而使得整个本氏烟在紫外光谱下发出绿色荧光该基因沉默后不能表达GFP的本氏烟因为叶绿素的存在而在紫外波长下发出红色荧光，；Su基因编码一个在叶绿素合成相关的关键组分，该基因被沉默后将导致叶绿素合成途径受阻从而导致植物组织变黄；PCNA编码和生长点相关的基因，PCNA基因的沉默导致了植物生长受阻，顶端生长被抑制；CHS编码与花色形成相关的基因，CHS基因的沉默导致植物花色的改变；这与前人利用其他方法所报道的结果一致(GFP，文献见Voinnet and Baulcombe，1997，Nature，389：553；Su，文献见Koncz C et al.，1990EMBO J9：1337-1346；PCNA，文献见Kelman Z1997Oncogene14：629-640；CHS，文献见Napoli C et al.，1990Plant Cell2：279-289)。但相对于传统方法，此发明工作量小，构建简易，周期性短，可以进行大规模功能基因组研究，因此本发明的植物DNA病毒卫星沉默载体是一种用反向遗传学研究植物功能基因组非常优良的工具。
由前面的描述来看，除了本文所说明和描述的外，对于本发明的各种应用对本领域技术人员来说是浅显易懂的。
序列表
SEQ ID NO.1信息：
(I)序列特征：
(A)长度：1348碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：DNA
(III)序列描述：SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2信息：
(I)序列特征：
(A)长度：170碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：GFP cDNA片段GFP170
(III)序列描述：SEQ ID NO.3：
SEQ ID NO.3信息：
(I)序列特征：
(A)长度：351碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：本氏烟Su cDNA片段NbSu351
(III)序列描述：SEQ ID NO.4：
SEQ ID NO.4信息：
(I)序列特征：
(A)长度：351碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：番茄Su cDNA片段ToSu351
(III)序列描述：SEQ ID NO.4：
SEQ ID NO.5信息：
(I)序列特征：
(A)长度：350碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(III)序列描述：SEQ ID NO.5：
SEQ ID NO.6信息：
(I)序列特征：
(A)长度：350碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：矮牵牛CHS cDNA片段CHS350
(III)序列描述：SEQ ID NO.6：
SEQ ID NO.7信息：
(I)序列特征：
(A)长度：311碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：GFP cDNA片段，位于SEQ ID NO.3旁侧，用于检测GFP的表达量
(III)序列描述：SEQ ID NO.7：
SEQ ID NO.8信息：
(I)序列特征：
(A)长度：239碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：本氏烟actin cDNA片段，看家基因作为表达内参
(III)序列描述：SEQ ID NO.8：
SEQ ID NO.9信息：
(I)序列特征：
(A)长度：323碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：本氏烟Su cDNA片段，位于SEQ ID NO.4旁侧，用于检测Su的表达量
(III)序列描述：SEQ ID NO.9：
SEQ ID NO.10信息：
(I)序列特征：
长度：251碱基
类型：核酸
链性：单链
拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
说明：本氏烟PCNA CDNA片段，位于SEQ ID NO.6旁侧，用于检测PCNA的表达量
(III)序列描述：SEQ ID NO.10：
SEQ ID NO.11信息：
(I)序列特征：
(A)长度：251碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：矮牵牛CHS cDNA片段，位于SEQ ID NO.7旁侧，用于检测CHS的表达量
(III)序列描述：SEQ ID NO.11：
SEQ ID NO.12信息：
(I)序列特征：
(A)长度：256碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑：线性
(II)分子型：cDNA
(A)说明：矮牵牛actin cDNA片段，位于SEQ ID NO.7旁侧，看家基因作为表达内参
(III)序列描述：SEQ ID NO.12：
Claims (3)
1.一种植物DNA病毒卫星沉默载体，其特征在于，它是含有两个正向重复拷贝的烟草曲茎病毒DNA 1分子的侵染性克隆，并在两个DNA 1分子中间的复制酶开放阅读框下游位置引入多克隆位点XbaI、SmaI和BamHI；所述的烟草曲茎病毒DNA 1分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的植物DNA病毒卫星沉默载体的构建方法，其特征在于构建步骤如下：
1)提取感染烟草曲茎病毒的烟草植物基因组总DNA，以该总DNA为模板，以DNA1XSB：5’-TCTAGACCCGGGATCCGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3和DNA1K：5’-GGTACCGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’为特异性引物进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XSBK；
2)以提取的总DNA为模板，用另一对特异性引物，DNA1S：5’-GTCGACGAGTATAAATACGTTAATTTTGC-3和DNA1X：5’-TCTAGAGTATTTAGTCCAAATACTCGTCGC-3’进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM T-Vector，筛选得到的正向插入的阳性克隆pGEM-mDNA1XS，pGEM-mDNA1XS经XbaI和SalI双酶切后插入pGEM-mDNA1XSBK，得到阳性克隆pGEM-2mDNA1；
3)重组克隆pGEM-2mDNA1经SalI和KpnI双酶切后插入到植物表达载体pBINPLUS的SalI和KpnI位点，由此构建成病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1。
3.一种如权利要求1所述的植物DNA病毒卫星沉默载体的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
1)根据目的基因在GENBANK中的基因序列设计带有酶切位点的引物，用RT-PCR方法扩增植物目的基因的cDNA片段，并克隆到pGEM T-Vector进行测序确认，然后利用酶切、连接分子手段将其插入病毒卫星沉默载体pBINPLUS-2mDNA1的多克隆位点处，构建成含目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体；
2)带有含目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体和中国番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆pBINPLUS-1.7A通过三亲交配的方法分别导入EHA105农杆菌，用含有目的基因cDNA片段的重组病毒卫星沉默载体和pBINPLUS-1.7A的农杆菌混合溶液注射接种4-6叶充分展开的苗龄期的植株，诱导沉默植物目的基因，观察植物表型的改变；
3)在目的基因cDNA片段两侧核酸区域设计引物，利用实时定量RT-PCR技术检测沉默植株中目的基因mRNA的含量，对沉默的目的基因进行表达量的分析，根据基因表达量表型的变化确定该基因的功能。
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