ES2551318T3 - Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas - Google Patents

Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas Download PDF

Info

Publication number
ES2551318T3
ES2551318T3 ES09734624.1T ES09734624T ES2551318T3 ES 2551318 T3 ES2551318 T3 ES 2551318T3 ES 09734624 T ES09734624 T ES 09734624T ES 2551318 T3 ES2551318 T3 ES 2551318T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
plant
dna
plants
sequence
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09734624.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Alexander Vainstein
Amir Zuker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Danziger Innovations Ltd
Original Assignee
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Danziger Innovations Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem, Danziger Innovations Ltd filed Critical Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Application granted granted Critical
Publication of ES2551318T3 publication Critical patent/ES2551318T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Método de generación de variación genotípica en un genoma de una planta, comprendiendo el método introducir en la planta al menos un vector de expresión del virus del cascabeleo del tabaco (TRV) que codifica para al menos una nucleasa quimérica que comprende un dominio de unión a ADN, una nucleasa y una señal de localización para un orgánulo que contiene ADN, en el que dicho dominio de unión a ADN media en el direccionamiento específico de dicha nucleasa al genoma de la planta, y en el que una secuencia de ácido nucleico de dicho vector de expresión de TRV carece de la secuencia 2b expuesta en SEQ ID NO: 43, generando de ese modo variación genotípica en el genoma de la planta.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E09734624
27-10-2015
Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o mostrados a modo de ejemplo mediante los ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ponerse en práctica o llevarse a cabo de diversas maneras. Además, debe entenderse que la fraseología y terminología empleadas en el presente documento son con fines de descripción y no deben considerarse limitativas.
Al poner en práctica algunas realizaciones de la presente invención, los presentes inventores han concebido una herramienta eficaz para generar variación genotípica en plantas usando vectores virales que codifican para polipéptidos quiméricos diseñados para generar roturas bicatenarias específicas de secuencia en el genoma de la planta. Como se indicó en la sección de antecedentes, la formación de DSB puede usarse para generar de manera pasiva (mediante el sistema de reparación de las plantas) o de manera activa (es decir, inserción dirigida de secuencias de ácido nucleico heterólogas) variación genotípica. Lo mencionado anteriormente corrobora más allá de cualquier duda el valor de las presentes herramientas en la generación de variaciones genómicas.
Como se ilustra en la sección de ejemplos a continuación, los presentes inventores han construido vectores de expresión de virus del cascabeleo del tabaco (TRV) modificados. Estos vectores se usaron satisfactoriamente para introducir y expresar genes foráneos de tamaños equivalentes a los genes quiméricos de la presente invención (por ejemplo GUS) en tejidos meristemáticos de diferentes plantas (por ejemplo Petunia, N. benthamiana y N. tobaccum, por ejemplo figuras 8A-G, figuras 9A-B y figuras 11A-F). Los presentes inventores tuvieron éxito a la hora de expresar genes heterólogos en plastidios de cloroplasto y mitocondria (figuras 15A-G y figuras 16A-K, respectivamente). Además, los presentes inventores tuvieron éxito a la hora de coexpresar en plantas dos genes heterólogos (por ejemplo DsRed y GFP) y específicamente en diferentes compartimentos vegetales (por ejemplo citosol, cloroplastos o núcleo) usando vectores virales de algunas realizaciones de la invención (véanse por ejemplo las figuras 17A-D y 18A-L). De manera importante, los presentes inventores han generado nucleasas de dedos de zinc (ZFN) que se unen a y escinden específicamente secuencias diana no codificantes de petunia (figuras 20-22), secuencias genómicas de fitoeno desaturasa (PDS) de petunia (figuras 23 y 28B) o secuencias genómicas de flavanona 3 beta-hidroxilasa (FHT) de petunia. Por consiguiente, estas nucleasas quiméricas y estos vectores virales pueden servir como herramientas potentes en el campo de las tecnologías transgénicas de agricultura.
Por tanto, según un aspecto de la presente invención se proporciona un método de generación de variación genotípica en un genoma de una planta. El método comprende introducir en la planta al menos un vector de expresión viral que codifica para al menos una nucleasa quimérica que comprende un dominio de unión a ADN, una nucleasa y una señal de localización nuclear, en el que el dominio de unión a ADN media en el direccionamiento específico de la nucleasa al genoma de la planta, generando de ese modo variación genotípica en el genoma de la planta.
Tal como se usa en el presente documento, el término “planta” se refiere a plantas completas, partes de las mismas (por ejemplo, hoja, raíz, fruto, semilla) o células aisladas de las mismas (poblaciones homogéneas o heterogéneas de células).
Tal como se usa en el presente documento, la frase “células vegetales aisladas” se refiere a células vegetales que se derivan de tejidos de células vegetales disgregados o cultivos de células vegetales.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “cultivo de células vegetales” se refiere a cualquier tipo de células vegetales nativas (que se producen de manera natural), líneas celulares vegetales y células vegetales modificadas genéticamente, que no están ensambladas para formar una planta completa, de modo que al menos una estructura biológica de una planta no está presente. Opcionalmente, el cultivo de células vegetales de este aspecto de la presente invención puede comprender un tipo particular de una célula vegetal o una pluralidad de diferentes tipos de células vegetales. Debe indicarse que opcionalmente los cultivos vegetales que presentan un tipo particular de célula vegetal pueden derivarse originalmente de una pluralidad de diferentes tipos de tales células vegetales.
Según estas realizaciones de la invención se concibe cualquier planta comercial o científicamente valiosa. Una planta adecuada para su uso con el método de la invención puede ser cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea incluyendo, pero sin limitarse a, maíz, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, cacahuete, guisante, lenteja y alfalfa, algodón, colza, canola, pimiento, girasol, patata, tabaco, tomate, lechuga, crisantemos, arabidopsis, brócoli, repollo, remolacha, quinua, espinaca, pepino, calabaza, sandía, judías, hibisco, ocra, manzana, rosa, fresa, chile, ajo, cebollas, sorgo, berenjena, eucalipto, pino, un árbol, una planta ornamental, una hierba perenne y un cultivo de forraje, plantas coníferas, musgo, algas, así como otras plantas enumeradas en www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae.
Por consiguiente, las familias de plantas pueden comprender Alliaceae, Amaranthaceae, Amarillidaceae, Apocynaceae, Asteraceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Campanulaceae, Caryophillaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Gramineae, Hyacinthaceae, Labiatae, Leguminosae-Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Phytolaccaceae, Poaceae, Pinaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tropaeolaceae, Umbelliferae y Violaceae.
10
5
15
25
35
45
55
E09734624
27-10-2015
Tales plantas incluyen, pero no se limitan a, Allium cepa, Amaranthus caudatus, Amaranthus retroflexus, Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana, Arachis hipogaea, Artemisia sp., Avena sativa, Bellis perennis, Beta vulgaris, Brassica campestris, Brassica campestris ssp. Napus, Brassica campestris ssp. Pekinensis, Brassica juncea, Calendula officinalis, Capsella bursa-pastoris, Capsicum annuum, Catharanthus roseus, Cheiranthus cheiri, Chenopodium album, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium foetidum, Chenopodium quinoa, Coriandrum sativum, Cucumis melo, Cucumis sativus, Glicina max, Gomphrena globosa, Gossypium hirsutum cv. Siv’on, Gypsophila elegans, Helianthus annuus, Hyacinthus, Hyoscyamus niger, Lactuca sativa, Lathyrus odoratus, Linum usitatissimum, Lobelia erinus, Lupinus mutabilis, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon pimpinellifolium, Melilotus albus, Momordica balsamina, Myosotis silvatica, Narcissus pseudonarcissus, Nicandra physalodes, Nicotiana benthamiana, Nicotiana clevelandii, Nicotiana glutinosa, Nicotiana rustica, Nicotiana silvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana edwardsonii, Ocimum basilicum, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris, Phytolacca americana, Pisum sativum, Raphanus sativus, Ricinus communis, Rosa sericea, Salvia splendens, Senecio vulgaris, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Solanum pimpinellifolium, Spinacia oleracea, Stellaria media, ajenjo dulce, Trifolium pratense, Trifolium repens, Tropaeolum majus, Tulipa, Vicia faba, Vicia villosa y Viola arvensis. Otras plantas que pueden infectarse incluyen Zea maize, Hordeum vulgare, Triticum aestivum, Oryza sativa y Oryza glaberrima.
Según una realización específica de la presente invención, la planta comprende una Petunia hybrida.
Según otra realización específica de la presente invención, la planta comprende una Nicotiana tabacum.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “variación genotípica” se refiere a un proceso en el que un nucleótido o una secuencia de nucleótidos (al menos 2 nucleótidos) se altera o se muta de manera selectiva en un sitio genómico predeterminado, también denominado mutagénesis. El sitio genómico puede ser un sitio genómico codificante o no codificante (por ejemplo, promotor, terminador, sitio de corte y empalme, poliA). Esta alteración puede ser el resultado de una deleción de ácido(s) nucleico(s), una inserción aleatorizada de ácido(s) nucleico(s), introducción de un ácido nucleico heterólogo que porta una secuencia deseada, o recombinación homóloga tras la formación de una rotura bicatenaria (DSB) de ADN en el gen diana. La variación genotípica según las presentes enseñanzas puede ser transitoria tal como se explica más detalladamente a continuación en el presente documento. La variación genotípica según las presentes enseñanzas se efectúa normalmente mediante la formación de DSB, aunque la presente invención también contempla la variación de una única cadena. La variación genotípica puede estar asociada con variación fenotípica. Por tanto, la naturaleza dirigida al sitio o específica de secuencia de las presentes enseñanzas puede usarse para diseñar específicamente una variación fenotípica.
Como se mencionó anteriormente en el presente documento, el método según este aspecto de la presente invención se efectúa introduciendo en la planta al menos un vector de expresión viral que codifica para al menos una nucleasa quimérica que comprende un dominio de unión a ADN, una nucleasa y una señal de localización nuclear.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “nucleasa quimérica” se refiere a un polipéptido quimérico sintético que forma un único marco de lectura abierto y media en la escisión de ADN de una manera específica de secuencia.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “dominio de unión a ADN” se refiere a una secuencia de aminoácidos nativa o sintética tal como de un motivo de proteína que se une a ADN bi o monocatenario con afinidad por una secuencia específica o un conjunto de las mismas (es decir sitio diana).
En la generación de nucleasas quiméricas puede emplearse cualquier dominio de unión a ADN que reconozca la secuencia de unión a ADN deseada con suficiente especificidad.
Los ejemplos de dominios de unión a ADN incluyen, pero no se limitan a, hélice-vuelta-hélice (pfam 01381), dominio de cremallera de leucina (ZIP), dominio de hélice alada (WH), dominio de hélice-vuelta-hélice alada (wHTH), hélicebucle-hélice y dominio de dedo de zinc.
Por tanto, en la técnica se conocen una variedad de tales dominios de unión a ADN. En una realización a modo de ejemplo de la presente invención, el dominio de unión a ADN es un dominio de unión de dedo de zinc (por ejemplo, pfam00096).
El dominio de dedo de zinc tiene una longitud de 30 aminoácidos y consiste en una hélice de reconocimiento y una lámina beta bicatenaria. El dominio también contiene cuatro ligandos separados de manera regular para zinc (o bien histidinas o bien cisteínas). El ión Zn estabiliza la estructura tridimensional del dominio. Cada dedo contiene un ión Zn y reconoce un triplete específico de pares de bases de ADN.
Los dominios de dedo de zinc pueden modificarse mediante ingeniería para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada. Cada dedo de zinc individual (por ejemplo Cys2/His2) entra en contacto principalmente con tres pares de bases consecutivos de ADN de manera modular [Pavletich et al., Science (1991) 252:809-817; Berg et al., Science (1996) 271:1081-1085]. Manipulando el número de dedos de zinc y la naturaleza de los residuos de aminoácido críticos que entran en contacto directamente con ADN, pueden desarrollarse y seleccionarse dominios de unión a ADN con especificidades novedosas [véase, por ejemplo, Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
11
imagen9
imagen10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E09734624
27-10-2015
Además, el aminoácido aromático fenilalanina puede sintetizarse en cloroplastos a partir del producto intermedio prefenato: por medio de arogenato mediante la actividad de prefenato aminotransferasa o por medio de fenilpiruvato mediante la actividad de prefenato deshidratasa [Jung et al. (1986). Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 7231-7235; Rippert et al. (2009) Plant Physiol. 149(3): 1251-1260].
Además, la actividad nitrito reductasa y acetolactato sintetasa de la célula también está ubicada en los plastidios. Se encontró que los plastidios contienen sólo parte de la actividad glutamina sintetasa, aspartato aminotransferasa y triosafosfato dehidrogenasa total en la célula [Miflin B (1974) Plant Physiol. 54(4): 550-555]. El cloroplasto también está implicado en el metabolismo de metionina en plantas, los cloroplastos son autónomos para la síntesis de metionina de novo y pueden importar S-adenosilmetionina del citosol [Ravanel et al. (2004). J. Biol. Chem. 279 (21): 22548-22557].
De manera similar, las mitocondrias comprenden papeles clave en las rutas metabólicas celulares, catalizando una o varias etapas en estas rutas (por ejemplo la síntesis de las vitaminas folato y biotina, de la coenzima distinta de vitamina lipoato, de la cardiolipina difosfatidilglicerol. Aunque las mitocondrias carecen de acetil-CoA carboxilasa, contienen el equipamiento enzimático necesario para transformar el malonato en las dos unidades constructivas principales para la síntesis de ácidos grasos: proteína portadora de malonil-acilo y acetil-acilo (ACP).
La esterilidad masculina citoplásmica (CMS) en plantas, caracterizada por la supresión de la producción de polen viable y por la herencia no mendeliana de este rasgo, está asociada con una disfunción mitocondrial. Los factores determinantes genéticos para la esterilidad masculina citoplásmica residen en el genoma mitocondrial. El fenotipo CMS afecta esencialmente a los órganos productores de polen debido a la alta demanda de energía por parte de este tejido. Por tanto, una disfunción mitocondrial afectará drásticamente a la producción de polen, mientras que otros órganos vegetales pueden superar las consecuencias de la disfunción mitocondrial.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “dominio de localización” se refiere a una señal de localización que facilita el transporte de las nucleasas quiméricas al orgánulo que contiene ADN.
La señal de localización puede ser, por ejemplo, una señal de localización nuclear (NLS), tal como una secuencia de aminoácidos predominantemente básicos corta, que se reconoce por receptores específicos en los poros nucleares. En otras realizaciones a modo de ejemplo, la señal de localización para un orgánulo que contiene ADN puede ser una señal de localización mitocondrial (MLS) o una señal de localización de cloroplasto (CLS).
Puede emplearse esencialmente cualquier NLS, ya sea una NLS sintética o que se produce de manera natural, siempre que la NLS sea una que sea compatible con la célula diana (es decir, célula vegetal).
Aunque con el presente documento se comentan las señales de localización nuclear, las presentes enseñanzas no pretenden restringirse a estas señales de localización, ya que cualquier señal dirigida a un orgánulo que contiene ADN está abarcada por las presentes enseñanzas. Tales señales se conocen bien en la técnica y pueden recuperarse por el experto en la técnica.
Las señales de localización nuclear que pueden usarse según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, NLS de antígeno T grande de SV40, el dominio M9 ácido de hnRNP A1, la secuencia KIPIK en el represor de la transcripción de levadura Mat2 y las señales complejas de U snRNP, NLS de tabaco y NLS de arroz.
Las señales de localización de mitocondria que pueden usarse según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, la señales de transición de la subunidad de ATPasa beta [ADNc que codifican para las presecuencias mitocondriales de -ATPasa de Nicotiana plumbaginifolia (nucleótidos 387-666)], la chaperonina mitocondrial CPN60 [ADNc que codifican para las presecuencias mitocondriales de CPN-60 de Arabidopsis thaliana (nucleótidos 74186] y COX4 [los primeros 25 codones de COX4 de Saccharomyces cerevisiae que codifican para la secuencia de direccionamiento mitocondrial].
Según una realización específica de la presente invención, la señal de localización puede comprender una señal de localización de mitocondria, tal como el péptido señal de la subunidad de ATPasa beta (ATP-) (SEQ ID NO: 139).
Las señales de localización de cloroplasto que pueden usarse según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, las señales de transición del péptido de tránsito asociado a la subunidad pequeña de ribulosa-1,5bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (ats1A), la señal de transición de LHC II, así como las regiones N-terminales de los ORF de SIG2 y SIG3 de A. thaliana. Véase también http://wwwdotspringerlinkdotcom/content/p65013h263617795/.
Alternativamente, la secuencia de localización de cloroplasto (CLS) puede derivarse de un viroide [Evans y Pradhan (2004) documento US 2004/0142476 A1]. El viroide puede ser un viroide Avsunviroiae, por ejemplo, un viroide de la mancha de sol del aguacate (ASBVd), un virus del mosaico latente del melocotonero (PLMVd), un viroide de la mota clorótica de Chrysanthemum (CChMVd) o un viroide latente de la berenjena (ELVd).
Según una realización específica de la presente invención, la señal de localización puede comprender una señal de localización de cloroplasto, tal como la subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa del péptido de tránsito (Rssu) (SEQ ID NO: 138).
14
imagen11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E09734624
27-10-2015
Biol. 90:205-214]. La cepa de virus del cascabeleo del tabaco TCM, obtenida originalmente del tulipán, está estrechamente relacionada serológicamente con el serotipo holandés del virus del oscurecimiento precoz del guisante [Robinson et al., J. Gen. Virol. (1987) 68:2551-2561]. Además, hay también especies monocotiledóneas susceptibles a TRV, como por ejemplo Avena sativa (familia Poaceae) [Cadman y Harrison, Ann. appl. Biol. (1959) 47:542-556].
Cuando el virus es un virus de ADN, pueden hacerse modificaciones adecuadas al propio virus. Alternativamente, el virus puede clonarse en primer lugar en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN foráneo. Entonces puede cortarse el virus del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, puede unirse un origen de replicación bacteriano al ADN viral, que entonces se replica por la bacteria. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de la cubierta que encapsidará el ADN viral. Si el virus es un virus de ARN, el virus se clona generalmente como ADNc y se inserta en un plásmido. El plásmido se usa entonces para producir todas las construcciones. El virus de ARN se produce entonces replicando la secuencia viral del plásmido y traduciendo los genes virales para producir la(s) proteína(s) de cubierta que encapsidan el ARN viral.
La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión en plantas de secuencias de ácido nucleico exógenas no virales tales como las incluidas en el constructo de la presente invención se demuestra mediante las referencias anteriores así como en la patente estadounidense n.º 5.316.931, Dawson, W. O. et al. (1989). A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology 172, 285-292; French, R. et al. (1986) Science 231, 1294-1297; y Takamatsu, N. et al. (1990). Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Lett 269, 73-76.
En una realización, se proporciona un ácido nucleico viral de plantas en el que la secuencia codificante de proteína de la cubierta nativa se ha delecionado de un ácido nucleico viral, una secuencia codificante de proteína de la cubierta viral de plantas no nativa y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia codificante de proteína de la cubierta no nativa, que puede expresarse en el huésped vegetal, empaquetar el ácido nucleico viral de plantas recombinante, y garantizar una infección sistémica del huésped mediante el ácido nucleico viral de plantas recombinante se ha insertado. Alternativamente, el gen de proteína de la cubierta puede inactivarse mediante inserción de la secuencia de ácido nucleico no nativa dentro del mismo, de modo que se produce una proteína. El ácido nucleico viral de plantas recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo puede replicar o expresar genes o secuencias de ácido nucleico adyacentes en el huésped vegetal y no pueden recombinarse entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativas (foráneas, heterólogas) adyacentes al promotor subgenómico viral de plantas nativo o a los promotores subgenómicos virales de plantas nativo y no nativo si se incluye más de una secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico no nativas se replican o se expresan en la planta huésped bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.
En una segunda realización, se proporciona un ácido nucleico viral de plantas recombinante como en la primera realización excepto porque la secuencia codificante de proteína de la cubierta nativa se coloca adyacente a uno de los promotores subgenómicos de proteína de la cubierta no nativos en lugar de una secuencia codificante de proteína de la cubierta no nativa.
En una tercera realización, se proporciona un ácido nucleico viral de plantas recombinante en el que el gen de proteína de la cubierta nativa está adyacente a su promotor subgenómico y uno o más promotores subgenómicos no nativos se han insertado en el ácido nucleico viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados pueden replicar o expresar genes adyacentes en un huésped vegetal y no pueden recombinarse entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Pueden insertarse secuencias de ácido nucleico no nativas adyacentes a los promotores virales de plantas subgenómicos no nativos de modo que dichas secuencias se replican o se expresan en la planta huésped bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.
En una cuarta realización, se proporciona un ácido nucleico viral de plantas recombinante como en la tercera realización excepto porque la secuencia codificante de proteína de la cubierta nativa se reemplaza por una secuencia codificante de proteína de la cubierta no nativa.
Los vectores virales se encapsidan por las proteínas de la cubierta codificadas por el ácido nucleico viral de plantas recombinante para producir un virus vegetal recombinante. El ácido nucleico viral de plantas recombinante o virus vegetal recombinante se usa para infectar plantas huésped apropiadas. El ácido nucleico viral de plantas recombinante puede replicarse en el huésped, diseminarse de manera sistémica en el huésped, y transcribir o expresar gen(es) foráneo(s) (ácido nucleico aislado) en el huésped para producir la proteína deseada, es decir, la nucleasa quimérica y opcionalmente otras secuencias de ácido nucleico codificantes o no codificantes heterólogas.
Un vector de expresión viral que comprende un ácido nucleico que codifica para una nucleasa quimérica está unido operativamente a una o más secuencias reguladoras transcripcionales mediante lo cual la secuencia codificante está bajo el control de señales de transcripción para permitir la producción o síntesis de la nucleasa quimérica. Tales secuencias reguladoras transcripcionales incluyen secuencias promotoras, potenciadores y sitios de unión de transcripción.
16
imagen12
imagen13
imagen14
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E09734624
27-10-2015
aproximadamente 1 mes de edad). La infección de savia de plantas que se hacen crecer in vitro también puede llevarse a cabo haciendo pasar en primer lugar la savia a través de un filtro de 0,22 m y después se lesionan los tallos de plantas que se propagan mediante cultivo tisular y se infectan usando jeringa y aguja o mediante vacío. Para la infección de semillas (por ejemplo monocotiledóneas), pueden incubarse semillas con la savia durante el hinchamiento y la formación de brotes (durante aproximadamente de 1 a 2 semanas).
Una planta completa transgénica, callos, tejido o célula vegetal pueden identificarse y aislarse seleccionando o examinando el material vegetal modificado por ingeniería para detectar rasgos codificados por los genes marcadores presentes en los vectores de expresión virales. Por ejemplo, la selección puede realizarse haciendo crecer el material vegetal modificado por ingeniería en medios que contienen una cantidad inhibidora del antibiótico o herbicida frente al cual el constructo génico transformante confiere resistencia. Además, también pueden identificarse plantas transgénicas y células vegetales examinando para detectar las actividades de cualquier gen marcador visible (por ejemplo, GFP o GUS) que puede estar presente en los vectores de expresión virales. Tales metodologías de selección y examen las conocen bien los expertos en la técnica.
También pueden emplearse métodos físicos y bioquímicos para identificar plantas transgénicas o células vegetales que contienen constructos génicos insertados. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, análisis por transferencia de tipo Southern o amplificación por PCR, transferencia de tipo Northern, ensayos enzimáticos, electroforesis en gel de proteínas, técnicas de inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitación, o inmunoensayos ligados a enzimas. También pueden usarse técnicas adicionales, tales como hibridación in situ, tinción enzimática e inmunotinción, para detectar la presencia o expresión de los genes heterólogos en órganos y tejidos específicos de plantas. Los métodos para realizar todos estos ensayos los conocen bien los expertos en la técnica.
A continuación se proporcionan otras referencias que pueden usarse para implementar las enseñanzas de la presente invención: Agrobacterium delivery of a Ti plasmid harboring both the ZFNs and a donor DNA construct [Cai et al. (2009) Plant Mol Biol. Aceptado: 14 de diciembre de 2008].
Los métodos, nucleasas quiméricas y vectores mencionados anteriormente pueden usarse para generar variación genotípica en plantas.
La siguiente sección proporciona aplicaciones no limitativas para generar una variación de este tipo.
Por tanto, pueden usarse nucleasas quiméricas de la presente invención para generar una firma de ácidos nucleicos insertados al azar de una manera específica de la secuencia, también denominado en el presente documento marcaje. Esta firma puede usarse como “marca genética”. Este término se usa en el presente documento de manera distinta del término común “marcador genético”. Mientras que este último término se refiere a variaciones genéticas que se producen de manera natural entre individuos en una población, el término marca genética tal como se usa en el presente documento se refiere específicamente a variabilidad genética artificial (generada por el ser humano), detectable, que puede heredarse.
La DSB se dirige normalmente a regiones no codificantes (secuencia distinta de marco de lectura abierto) para no afectar al fenotipo de la planta (por ejemplo para el marcaje). Sin embargo, el marcaje también puede dirigirse a una región codificante. Una marca genética de alta calidad se selecciona de manera única para el genoma de la planta y resiste la variación de secuencia que puede introducirse a lo largo de las generaciones.
Para algunos fines, por ejemplo, reguladores, puede ser deseable marcar plantas distribuidas comercialmente con marcas públicamente conocidas, para permitir a las autoridades reguladoras identificar fácilmente la marca, para identificar al fabricante, distributor, dueño o usuario del organismo marcado. Para otros fines puede ser ventajoso el secretismo. Esto último es cierto, por ejemplo, para evitar un intento de modificar genéticamente la marca genética de un acontecimiento de gran importancia protegido por leyes de propiedad intelectual.
Por tanto, un organismo protegido por propiedad intelectual que también está sujeto a regulación se marcará genéticamente, según una realización útil de la presente invención, mediante (a) al menos una secuencia de ADN única que se conoce por el público; y (b) al menos una secuencia de ADN única que no se conoce, al menos no como marca genética, por el público.
Para introducir una secuencia heteróloga (por ejemplo, codificante o no codificante), en primer lugar se generarán DSB en ADN vegetal tal como se describe en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen bien que la integración de ADN foráneo se produce con alta frecuencia en estos sitios de rotura del ADN [Salomon et al., EMBO J (1998) 17: 6086-6095; Tzfira et al., Plant Physiol (2003) 133: 1011-1023; Tzfira et al., Trends Genet (2004)
20: 375-383, Cai et al. (2009) Plant Mol Biol. Aceptado: 14 de diciembre de 2008]. Una vez presente en la célula diana, por ejemplo en plásmidos episomales, el ADN foráneo puede separarse del plásmido mediante corte usando la misma ZFN usada para generar DSB en el ADN vegetal. El ADN foráneo liberado del plásmido episomal se incorporará entonces en el ADN celular mediante proteínas de unión de extremos no homólogos (NHEJ) vegetales. Las DSB también pueden conducir a un direccionamiento génico basado en recombinación homóloga (HR) potenciada en células vegetales (Puchta et al. Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93: 5055-5060).
20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E09734624
27-10-2015
Tal como se menciona, las presentes enseñanzas pueden usarse para generar variación genotípica. Por tanto, las nucleasas quiméricas de las presentes enseñanzas pueden diseñarse para generar DSB en regiones codificantes o no codificantes de un locus de interés para introducir el gen heterólogo de interés. Tales alteraciones en el genoma de la planta pueden conducir por consiguiente a adiciones o alteraciones en la expresión génica de la planta (descrito en detalle anteriormente en el presente documento) y en características fenotípicas de la planta (por ejemplo color, aroma, etc.).
Adicionalmente pueden usarse nucleasas quiméricas para generar variación genotípica mediante desactivación de la expresión génica. Por tanto pueden diseñarse nucleasas quiméricas para generar DSB en regiones codificantes o no codificantes de un locus de interés para generar una mutación sin sentido o de cambio de sentido. Alternativamente, pueden usarse dos pares de nucleasas quiméricas para escindir una secuencia entera del genoma, desactivando de ese modo la expresión génica.
También pueden usarse nucleasas quiméricas de la presente invención para generar variabilidad introduciendo mutaciones no específicas en el genoma de la planta. Esto puede lograrse mediante el uso de ADN restrictasas no específicas o Fok1 no riguroso.
Como alternativa, las nucleasas quiméricas de la presente invención pueden usarse para combatir infecciones por patógenos de plantas.
Por tanto, la presente invención considera un método de tratamiento de una infección de una planta por un patógeno. El método comprende introducir en la planta al menos un vector de expresión que codifica para al menos una nucleasa quimérica que comprende un dominio de unión a ADN y una nucleasa, en el que el dominio de unión a ADN media en el direccionamiento de la nucleasa al genoma del patógeno, previniendo o tratando de ese modo una infección de una planta por un patógeno.
Tal como se usa en el presente documento un “patógeno de plantas” se refiere a un organismo que provoca una enfermedad en la planta infectada. Los organismos que provocan enfermedad infecciosa incluyen hongos, oomicetos, bacterias, virus, viroides, organismos similares a virus, fitoplasmas, protozoos, nematodos y plantas parásitas.
Dado que se desea la completa destrucción del ADN del patógeno, la nucleasa quimérica se diseña para escindir tantos sitios de secuencia en el ADN del patógeno como sea posible. Por tanto, pueden seleccionarse como diana secuencias de repetición. Adicional o alternativamente se seleccionan como diana varias secuencias distintas suficientes para inducir degradación del ADN del patógeno.
Según algunas realizaciones de este aspecto de la presente invención, la nucleasa quimérica se diseña para escindir el ADN del patógeno pero no el de la planta. Con este fin, la nucleasa quimérica se diseña carente de una señal de localización, de tal manera que la nucleasa quimérica es activa en el citoplasma que comprende el ADN del patógeno (por ejemplo, virus) pero no en el de la planta.
Alternativamente, la nucleasa puede diseñarse para escindir secuencias que son específicas para el patógeno pero están ausentes en el genoma de la planta. Esto puede lograrse usando análisis mediante bioinformática de rutina tal como mediante el uso de software de alineación, por ejemplo, Blast (http://wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/blast/Blastdotcgi).
Una lista no limitativa de patógenos virales para plantas que pueden seleccionarse como diana usando las enseñanzas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a especie: virus del oscurecimiento precoz del guisante (PEBV), género: Tobravirus. Especie: virus de la mancha anular de la pimienta (PepRSV), género: Tobravirus. Especie: virus del mosaico de la sandia (WMV), género: Potyvirus y otros virus del género Potyvirus. Especie: virus del mosaico del tabaco (TMV), género Tobamovirus y otros virus del género Tobamovirus. Especie: virus X de la patata (PVX), género Potexvirus y otros virus del género Potexvirus. Por tanto las presentes enseñanzas consideran la selección como diana de virus de ARN así como de ADN (por ejemplo Geminivirus o Bigeminivirus). Los virus Geminiviridae que pueden seleccionarse como diana incluyen, pero no se limitan a, bigeminivirus del mosaico de Abutilon, bigeminivirus de la vena amarilla de Ageratum, bigeminivirus del mosaico de calico de la judía, bigeminivirus del mosaico dorado de la judía, bigeminivirus del mosaico de la vena amarilla de bhendi, bigeminivirus del mosaico africano de la yuca, bigeminivirus del mosaico indio de la yuca, bigeminivirus chino del tomate, bigeminivirus de la hoja corrugada de algodón, bigeminivirus del rizado de la hoja de algodón, bigeminivirus del mosaico de la vena amarilla de crotón, bigeminivirus del mosaico amarillo de dólico, bigeminivirus del mosaico de euforbia, bigeminivirus del mosaico amarillo de la judía espárrago, bigeminivirus del mosaico de Jatropha, bigeminivirus del mosaico dorado de la judía de Lima, bigeminivirus del rizado de la hoja del melón, bigeminivirus del mosaico amarillo de la judía mungo, bigeminivirus del rizado de la hoja de la ocra, bigeminivirus de huasteco del pimiento, bigeminivirus de Tejas del pimiento, bigeminivirus del mosaico amarillo de la patata, bigeminivirus del mosaico de Rhynchosia, bigeminivirus del mosaico dorado de Serrano, bigeminivirus de rizado de la hoja de la calabaza, bigeminivirus de rizado de la hoja del tabaco, bigeminivirus de rizado de la hoja del tomate australiano, bigeminivirus del mosaico dorado del tomate, bigeminivirus de rizado de la hoja indio del tomate, bigeminivirus de la hoja corrugada del tomate, bigeminivirus de moteado del tomate, bigeminivirus de rizado de la
21
imagen15
imagen16
imagen17
imagen18
5
10
15
20
25
30
E09734624
27-10-2015
C (PEBV-sgP R)
TAGAATTCTCGTTAACTCGGGTAAGTGA (SEQ ID NO: 3)
D (P19-F)
AAACTCGAGATGGAACGAGCFATACAAGGAA (SEQ ID NO: 4)
E (P19-R)
AAACCCGGGAGAGTCTGTCTTACTCGCCTTCT (SEQ ID NO: 5)
F (5’-PEBV-sgP-F)
AAGAGCTCGAGCATCTTGTTCTGGGGTT (SEQ ID NO: 6)
G (GFPuv-3’-SmaI)
ACCCGGGTTATTTGTAGAGTTCATCCATGCCA (SEQ ID NO: 7)
H (DsRFP-F-HpaI)
AGTTAACGAGATGGCCTCCTCCGAGA (SEQ ID NO: 53)
I (DsRed2-R-SacI)
TAGAGCTCTCACAGGAACAGGTGGTGGC (SEQ ID NO: 54)
J (T2A-F-BamHI)
K (T2A-NLS-Fprimero)
L (R-FokI SacI)
AAGAGCTCTTAGGATCCAAAGTTTATCTC (SEQ ID NO: 57)
M (DsRFP-R-BamHI)
AGGATCCCAGGAACAGGTGGTGGC (SEQ ID NO: 58)
N (EGFP-F-XhoI)
A TCT CGA GTG AGC AAG GGC GA (SEQ ID NO: 59)
O (EGFP-R-SacI)
AGAGCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATG (SEQ ID NO: 60)
NLS (mayúsculas)
atggtgCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCtctcgag (SEQ ID NO: 61)
P (2sg F1 Sma)
CCCGGGATTTAAGGACGTGAACTGTGT (SEQ ID NO: 62)
Q (dsRed R678 Sma)
CCCGGGTCACAGGAACAGGTGGT (SEQ ID NO: 63)
R (gen de unión de NLS)
AGTTAACGAGATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGT (SEQ ID NO: 64)
S (FokI-m-R-SacI)
AAGAGGTCTTAaGATCCAAAGTTTATCTC (SEQ ID NO: 65)
T (FokI-m-R-SmaI)
ACCCGGGTTATCCAAAGTTTATCTCGCCGT (SEQ ID NO: 66)
U (F-QEQ-ZFN)
AACTCGAGAAAAACTGCGGAACGGA (SEQ ID NO: 67)
V (Rssu tp-F-HpaI)
AGTTAACGAGATGGCTTCTATGATATCCTCT (SEQ ID NO: 68)
W (ATP--tp-F-HpaI)
AGTTAACGAGATGGCTTCTCGGAGG (SEQ ID NO: 69)
Clonación de vectores virales de pTRV2 que permiten el direccionamiento de productos génicos a plastidios
Para generar EGFP dirigida a cloropasto, los inventores amplificaron un fragmento de PCR que contenía el péptido de tránsito de la subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (Rssu) de guisante (n.º de registro de GenBank X00806, nucleótidos 1086-1259, SEQ ID NO: 138) fusionado a EGFP con los cebadores V y O (véase la tabla 1, anteriormente) usando el plásmido pTEX-Rssu-GFP descrito anteriormente por Bezawork [Tesis M.Sc de Bezawork (2007), presentada ante Agricultural Research Organization, Volcani center y la Facultad de Agricultura] como molde. Se clonó el producto de PCR, tras obtener extremos romos con Hpal, en el sentido de 3’ con respecto a sgP en pTRV2-2b-sgP para producir pTRV2-2b-sgP-Rssu-EGFP.
Para generar EGFP dirigida a mitocondria, los inventores amplificaron un fragmento de PCR que contenía un péptido señal de la subunidad beta de ATPasa de Nicotiana sylvestris (ATP-) (n.º de registro de GenBank U96496, nsatp2.1.1, nucleótidos 12 a 167, SEQ ID NO: 139) fusionado a EGFP con los cebadores W y O (véase la tabla 1, anteriormente) usando el plásmido pTEX-ATP-GFP descrito anteriormente por Bezawork [Bezawork (2007), citado anteriormente] como molde. Se clonó el producto de PCR, tras obtener extremos cormos con HpaI, en el sentido de 3’ con respecto a sgP en pTRV2-2b-sgP para producir pTRV2-2b-sgP-ATP-EGFP.
Inoculación de plantas con vectores de TRV
Se prepararon Agrobacterium tumefaciens (cepa AGLO) transformada con pTRV1, pTRV2 y derivados de pTRV2 tal como se describió anteriormente [Liu et al., Plant J (2002) 30: 415-429]. Se hizo crecer el cultivo de Agrobacterium durante la noche a 28ºC en medio LB complementado con kanamicina 50 mg/l y acetosiringona (A.S.) 200 M. Se recogieron las células y se resuspendieron en tampón de inoculación que contenía MES 10 mM, A.S. 200 M y MgCl2 10 mM a una DO600 de 10. Tras 3 horas adicionales de incubación a 28ºC, se mezclaron las bacterias con el pTRV1 con las bacterias que contenían los derivados de pTRV2 a una razón de 1:1. Cuando estuvo implicada una coinfección de más de un pTRV2, las agrobacterias con pTRV1 eran siempre el 50% en la mezcla. Se usaron 200400 l de la mezcla de agrobacterias para la inyección en el tallo. También se inyectaron agrobacterias en la superficie del brote expuesta tras la retirada de los meristemos apicales.
Otra opción para infección fue infiltración en hojas usando una jeringa sin aguja: se descargó el contenido de agrobacterias de la jeringa en la superficie raspada de la hoja. Para la infección de plantas con TRV, sin el uso de agrobacterias, en primer lugar se inoculó N. benthamiana o N. clevelandii (el huésped habitual para TRV) con pTRV1 y pTRV2 o sus derivados. Aproximadamente de 15 a 21 días tras la infección (dpi), se recogieron las hojas de plantas (como fuente de infección de savia preparada recientemente) y se extrajo la savia en tampón fosfato 20 mM (pH-6,8) mediante mortero y mano de mortero.
26
imagen19
imagen20
imagen21
imagen22
imagen23
imagen24
imagen25

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES09734624.1T 2008-04-21 2009-04-21 Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas Active ES2551318T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7128808P 2008-04-21 2008-04-21
US71288P 2008-04-21
PCT/IL2009/000432 WO2009130695A2 (en) 2008-04-21 2009-04-21 Plant viral expression vectors and use of same for generating genotypic variations in plant genomes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2551318T3 true ES2551318T3 (es) 2015-11-18

Family

ID=41217213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09734624.1T Active ES2551318T3 (es) 2008-04-21 2009-04-21 Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8791324B2 (es)
EP (2) EP2268129B1 (es)
CN (2) CN102089433B (es)
AU (1) AU2009239333A1 (es)
BR (1) BRPI0907261A2 (es)
CA (1) CA2721372A1 (es)
DK (1) DK2268129T3 (es)
ES (1) ES2551318T3 (es)
HK (1) HK1201872A1 (es)
MX (1) MX2010011511A (es)
WO (1) WO2009130695A2 (es)
ZA (1) ZA201007414B (es)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2551318T3 (es) 2008-04-21 2015-11-18 Danziger Innovations Ltd. Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas
SG171789A1 (en) 2009-01-09 2011-07-28 Temasek Life Sciences Lab Ltd Functional analysis of jatropha curcas genes
WO2011048600A1 (en) * 2009-10-21 2011-04-28 Danziger Innovations Ltd. Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection
BR112012012588B1 (pt) 2009-11-27 2019-03-26 Basf Plant Science Company Gmbh Endonuclease, método para recombinação homóloga de polinucleotídeos e método para mutação direcionada de polinucleotídeos
WO2012168910A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Basf Plant Science Company Gmbh Nuclease fusion protein and uses thereof
WO2013050611A1 (en) 2011-10-07 2013-04-11 Basf Plant Science Company Gmbh Method of producing plants having increased resistance to pathogens
WO2013050593A1 (en) 2011-10-07 2013-04-11 Basf Plant Science Company Gmbh Method of producing plants having increased resistance to pathogens
WO2013050318A1 (en) 2011-10-07 2013-04-11 Basf Plant Science Company Gmbh Method of producing plants having increased resistance to pathogens
WO2013053711A1 (en) 2011-10-10 2013-04-18 Basf Plant Science Company Gmbh Method of producing plants having increased resistance to pathogens
WO2013053686A1 (en) 2011-10-10 2013-04-18 Basf Plant Science Company Gmbh Method of producing plants having increased resistance to pathogens
EP2612918A1 (en) 2012-01-06 2013-07-10 BASF Plant Science Company GmbH In planta recombination
US20150225734A1 (en) * 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
CN103146743B (zh) * 2012-11-18 2015-01-07 西北农林科技大学 一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法
US10883111B2 (en) 2014-11-27 2021-01-05 Danziger Innovations Ltd. Nucleic acid constructs for genome editing
EP3283501B1 (en) 2015-04-16 2023-01-04 William Marsh Rice University Stoichiometric tuning of nucleic acid hybridization probes by auxiliary oligonucleotide species
GB201617109D0 (en) * 2016-10-07 2016-11-23 Rothamsted Res Ltd Vectors and methods for protein expression in plants
CN107130020B (zh) * 2017-04-28 2020-05-26 山东大学 包含163g＞c突变的fkbp5基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用
US11512287B2 (en) * 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
BR112019026622A2 (pt) * 2017-06-16 2020-06-30 Sangamo Therapeutics, Inc. disrupção direcionada de receptores de célula t e/ou hla
CN111304240B (zh) * 2020-03-25 2022-02-08 山东农业大学 基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法
JP2024514696A (ja) 2021-04-21 2024-04-02 浙江大学 マイナス鎖ｒｎａウイルスベクター及び形質転換を必要としない植物ゲノム編集方法
CN113736820A (zh) * 2021-08-20 2021-12-03 华中农业大学 一种可视报告基因及其载体的应用
CN114606246A (zh) * 2022-02-10 2022-06-10 华南农业大学 一种trv载体介导病毒诱导菜心整株基因沉默的方法
CN114369614B (zh) * 2022-02-25 2025-02-11 江苏省中国科学院植物研究所 一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体、沉默体系及其构建方法和应用
CN116144696A (zh) * 2023-03-22 2023-05-23 大连工业大学 一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法
WO2024208914A1 (en) * 2023-04-03 2024-10-10 Swiftpharma Bv Trans-complementary vector system for highly efficient heterologous gene expression in plants
CN119955818B (zh) * 2025-04-10 2025-06-10 云南省农业科学院经济作物研究所 一种工业大麻双分体病毒基因及其应用

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
CA1192510A (en) 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
JPS6054684A (ja) 1983-09-05 1985-03-29 Teijin Ltd 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
GB8608850D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
JPS6314693A (ja) 1986-07-04 1988-01-21 Sumitomo Chem Co Ltd 植物ウイルスｒｎａベクタ−
ATE108828T1 (de) 1987-02-09 1994-08-15 Lubrizol Genetics Inc Hybrides rns-virus.
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5474896A (en) 1992-05-05 1995-12-12 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
DE69332763T2 (de) 1992-12-30 2004-03-18 Biosource Genetics Corp., Vacaville Virale amplifikation rekombinanter boten-rna in transgenen pflanzen
FR2701960B1 (fr) * 1993-02-26 2002-09-13 Gene Shears Pty Ltd Polyribozyme apte à conférer, aux plantes, une résistance aux virus et plantes résistantes produisant ce polyribozyme.
US5530191A (en) * 1994-03-24 1996-06-25 Rutgers, The State University Of New Jersey Method for producing cytoplasmic male sterility in plants and use thereof in production of hybrid seed
US6326166B1 (en) 1995-12-29 2001-12-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA-binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
WO1999025853A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
US6300133B1 (en) * 1998-01-16 2001-10-09 Large Scale Biology Corporation RNA transformation vectors derived from an uncapped single-component RNA virus
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
DE69942334D1 (de) 1998-03-02 2010-06-17 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US6800748B2 (en) * 2001-01-25 2004-10-05 Large Scale Biology Corporation Cytoplasmic inhibition of gene expression and expression of a foreign protein in a monocot plant by a plant viral vector
JP2005500061A (ja) 2001-08-20 2005-01-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｎｎについての亜鉛フィンガー結合ドメイン
AU2003222018A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-29 Yale University Tobacco rattle virus vectors and related compositions and methods
EP1581610A4 (en) * 2002-09-05 2009-05-27 California Inst Of Techn USE OF CHIMERIC NUCLEASES TO STIMULATE GEN-TARGETING
WO2004040973A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 New England Biolabs, Inc. Organellar targeting of rna and its use in the interruption of environmental gene flow
US20060292682A1 (en) * 2004-07-22 2006-12-28 Hawkins Lynda K Addition of transgenes into adenoviral vectors
CA2615532C (en) 2005-07-26 2016-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
CA2651499C (en) 2006-05-25 2015-06-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for ccr-5 gene inactivation
US8624080B2 (en) 2006-05-29 2014-01-07 Icon Genetics Gmbh Plant virus-based inducible expression system
EP2044204B1 (en) 2006-06-07 2014-04-30 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Plant expression constructs and methods of utilizing same
BRPI0812233B1 (pt) 2007-06-05 2022-10-04 Bayer Cropscience Ag Processos para troca de uma sequência de dna-alvo no genoma de uma célula de planta ou planta por uma sequência de dna de interesse, e vetor de dna
ES2551318T3 (es) 2008-04-21 2015-11-18 Danziger Innovations Ltd. Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas
WO2011048600A1 (en) 2009-10-21 2011-04-28 Danziger Innovations Ltd. Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection

Also Published As

Publication number Publication date
EP2268129A2 (en) 2011-01-05
CN104263751A (zh) 2015-01-07
CN102089433B (zh) 2014-08-13
US20140331360A1 (en) 2014-11-06
DK2268129T3 (en) 2015-09-28
MX2010011511A (es) 2011-06-09
ZA201007414B (en) 2011-09-28
EP2268129A4 (en) 2011-11-16
BRPI0907261A2 (pt) 2019-09-24
AU2009239333A1 (en) 2009-10-29
HK1201872A1 (en) 2015-09-11
EP2936976A1 (en) 2015-10-28
WO2009130695A3 (en) 2010-07-22
US8791324B2 (en) 2014-07-29
US20110126317A1 (en) 2011-05-26
CA2721372A1 (en) 2009-10-29
WO2009130695A2 (en) 2009-10-29
EP2268129B1 (en) 2015-06-17
CN102089433A (zh) 2011-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2551318T3 (es) Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas
Chen et al. Cloning of the papaya ringspot virus (PRSV) replicase gene and generation of PRSV-resistant papayas through the introduction of the PRSV replicase gene
CN115216486A (zh) 一种负链rna病毒载体及无需转化的植物基因组编辑方法
US20190203223A1 (en) Phytophthora resistant plants belonging to the solanaceae family
WO2016125143A1 (en) Mdmv based vector for gene expression and silencing
CN104232682A (zh) 一种过表达gma-miR156b培育高产株型植物的方法
US9476060B2 (en) Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection
US20230030612A1 (en) Solanaceous plant and solanaceous plant cell having resistance to tomato spotted wilt virus, and method for producing solanaceous plant
CN111944844A (zh) 提高颠茄中托品烷生物碱含量的方法
KR20250093214A (ko) Tobacco rattle virus 기반 벡터를 이용한 고추 유전자 편집 방법
ES2367866T3 (es) Métodos para generar resistencia frente a cgmmv en plantas.
Miki et al. Transgenic tobacco: gene expression and applications
CN106834313B (zh) 人工优化合成的Pat#基因与重组载体以及改变作物抗性的方法
CN105063070B (zh) 一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用
KR102280018B1 (ko) 십자화과 작물에서 유용 유전자의 기능 분석을 위한 RaMV 유래의 재조합 VIGS 벡터 및 이의 용도
WO2020051283A1 (en) Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture
Bhatti et al. Agrobacterium mediated tobacco transformation with rice FAE gene and segregation analysis of T1 generation
CN102443601A (zh) 一种玉米遗传转化方法
CN116789785A (zh) 长雄蕊野生稻高产、高光效基因FarL1及其应用
Chaudhary et al. Genetic transformation of Vigna species: current status and future perspectives
CN105462993A (zh) 植物抗病调控基因SlASN2及用途
Cho et al. Field Performance and Morphological Characterization of Transgenic Codonopsis Ianceolata Expressing y-TMT Gene.
IL225584A (en) Viral vectors for expression in plants and their use to create genotypic variation in the plant genome
Wong et al. Defensins in Legumes
CN107267534A (zh) 人工优化合成的Mat基因与重组载体以及改变作物抗性的方法