ES2367866T3

ES2367866T3 - Métodos para generar resistencia frente a cgmmv en plantas.

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Publication number: ES2367866T3
Application number: ES02711540T
Authority: ES
Inventors: Bernarda Gerharda Johanna Onstenk E.V. Fierens; Michiel Theodoor Jan De Both
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2001-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2011-11-10
Anticipated expiration: 2022-02-08
Also published as: WO2002063019A3; EP1358341A2; EP1358341B1; AU2002230284A1; US20040237136A1; IL157287A; US7459604B2; IL157287A0; WO2002063019A2; ATE510921T1

Abstract

Método para generar resistencia en una planta o en una célula vegetal frente a la infección con el virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV), comprendiendo dicho método transformar dicha planta o célula vegetal con una secuencia de polinucleótido que - tras su transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta; - tras su transcripción en ARN no conduce a la generación de actividad replicasa en dicha planta; y - en el que la secuencia de polinucleótido comprende un promotor, operativamente unido a una primera y una segunda secuencia de ADN que están presentes en una repetición invertida, en la que: - la primera secuencia de ADN comprende una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN homosentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos homosentido de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV que puede infectar a la planta o la célula vegetal; y - dicha primera secuencia de ADN comprende además opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales; - la segunda secuencia de ADN comprende una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100% con el complemento inverso de los al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido; y dicha segunda secuencia de ADN comprende además opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales - en la que la primera y segunda región de ADN están unidas por una secuencia de nucleótidos espaciadora; y - en la que las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar un ARN en horquilla mediante apareamiento de bases entre las regiones que son complementarias.

Description

La presente invención se refiere a un método para generar resistencia frente al virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) en plantas, en particular en plantas que son susceptibles a la infección por CGMMV, tales como especies de la familia Cucurbitaceae.

La invención se refiere además a constructos genéticos adecuados para su uso en dicho método, y a plantas transgénicas resistentes a CGMMV obtenidas mediante dicho método.

Se han conocido durante muchos años métodos de introducción de secuencias de ADN en el genoma de plantas y se han usado ampliamente para alterar las propiedades de variedades de plantas. Tales métodos son entre otros la transformación mediada por Agrobacterium (Horsch et al., 1985; Rogers et al., 1986), la transformación de protoplastos usando electroporación u otras técnicas para introducir moléculas de ADN desnudo en la célula vegetal (Shillito et al. 1985) y bombardeo de partículas para introducir moléculas de ADN desnudo en tejidos o células vegetales (Christou et al., 1994).

Entre las aplicaciones más importantes de la ingeniería genética de plantas están las que tienen como objetivo introducir genes de resistencia en una amplia variedad de patógenos de plantas y plagas de plantas, tales como bacterias, hongos, nematodos, insectos y virus. Muchos ejemplos de resistencia a virus en una amplia variedad de especies de plantas se han descrito a lo largo de las últimas décadas (Wilson et al., 1993). Los diversos métodos para obtener resistencia a virus en plantas a través de la introducción de secuencias génicas se basan o bien en el uso de genes de origen vegetal; en el uso de secuencias/genes derivados del propio patógeno viral (la denominada resistencia derivada de patógenos (Wilson et al., 1993), o bien en el uso de genes de origen aún diferente. Las secuencias que se originan a partir del genoma viral pueden ser secuencias de ADN o bien amplificadas por PCR o bien clonadas obtenidas del genoma de virus de ADN, tales como geminivirus (Kunik et al., 1994) o las secuencias de ADNc obtenidas de los genomas de virus de ARN a través del uso de clonación de ADNc o amplificación por RTPCR.

Los ejemplos de secuencias/genes de virus de ARN que se han usado satisfactoriamente en el diseño por ingeniería genética de resistencia a virus en plantas incluyen:

1.: genes de proteína de cubierta de tobamovirus, cucumovirus, potivirus, potexvirus (Beachy et al., 1990);

2.: genes de ARN polimerasa dependiente de ARN (genes de replicasa) de tobamovirus, cucumovirus, potivirus (Anderson et al., 1992; Donson et al., 1993; Audy et al., 1994);

3.: genes de nucleoproteína de tospovirus (Goldbach y De Haan, 1993; Prins et al., 1994; Vaira et al., 1995);

4.: genes de proteínas de movimiento de tobamovirus y cucumovirus (Cooper et al., 1995).

El virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) es un miembro del grupo de tobamovirus e infecta especies de plantas de la familia Cucurbitaceae: melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria), pero no aparentemente Cucurbita pepo (zapallo, calabaza común, calabacín). El intervalo de huésped del virus se restringe básicamente a miembros de las Cucurbitaceae y/o las especies de diagnóstico Datura stramonium y Chenopodium amaranticolor (Hollings et al., 1975).

Pueden distinguirse varias cepas diferentes serológicamente y por su respuesta en C. amaranticolor y D. stramonium (Hollings et al., 1975). La “cepa tipo” se identificó originalmente en Europa y no provoca normalmente síntomas en el fruto en el pepino. Otra cepa europea, denominada la cepa del mosaico aucuba del pepino, virus 4 del pepino o virus 2A de Cucumis provoca síntomas en el fruto en el pepino. Se conocen varias cepas del Japón. En sandía, la cepa de sandía provoca una enfermedad grave, mientras que la cepa del pepino japonés (también denominada virus del mosaico moteado verde Kyuri) y la cepa Yodo provocan alteraciones en la fruta en el pepino. La cepa CGMMV-C de la India es un patógeno en la calabaza de peregrino e infecciones graves pueden provocar pérdidas de cosechas completas.

En pepino, CGMMV provoca aclaramiento de las venas, un moteado de las hojas de color verde claro a oscuro, formación de ampollas en las hojas y malformación y crecimiento atrofiado, lo que afecta gravemente al rendimiento de frutos. El aislado del este de Europa de la cepa del mosaico aucuba produce un moteado de las hojas de color amarillo brillante y alteración del color del fruto.

CGMMV se transmite a través de la semilla, lo más probablemente a través de infección mecánica por medio de las raíces en suelo contaminado, y a través de contacto con el follaje y manipulación de plantas (Hollings et al., 1975). Las partículas de virus son extremadamente estables y sobreviven varios meses a temperaturas normales. Esta estabilidad, combinada con la muy alta infectividad a través de contacto mecánico del follaje, es responsable de la importancia económica del virus, ya que incluso una o unas pocas plantas infectadas en un invernadero de pepinos pueden provocar en última instancia la infección y la pérdida de la cosecha total. Además, la infección puede no sólo propagarse rápidamente por una cosecha actual, sino también, debido a la fuerte persistencia del virus, afectar a

5 cosechas posteriores. Por tanto, una infección por CGMMV puede requerir la esterilización de todo un invernadero, así como el uso de herramientas y materiales estériles.

Se ha determinado la secuencia completa de sólo un aislado de CGMMV (Ugaki et al., 1991; números de registro de Genbank D12505 y D01188). Este aislado “SH” se había encontrado en plantas de sandía infectadas en el este de 10 Asia. Además, se conoce la secuencia del gen de proteína de cubierta de otro aislado (“W”) obtenido de sandía infectada (Meshi et al., 1983; números de registro de Genbank V01551 y J02054), así como la secuencia del gen de proteína de movimiento de 29 kD de una cepa de sandía (Saito et al., 1988; número de registro de Genbank J04332). La secuencia de nucleótidos del aislado CGMMV-SH muestra una identidad del 55 al 56% con el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el virus del mosaico verde atenuado del tabaco (TMGMV), ambos miembros del grupo

15 de tobamovirus (Ugaki et al., 1991).

Tal como se describe por Ukagi et al., el genoma de CGMMV consiste en una molécula de ARN monocatenario que codifica para al menos cuatro marcos de lectura abiertos, que codifican para proteínas supuestas de 186 kD, 129 kD, 29 kD y 17,3 kD, de las cuales el ORF de 17,3 se sabe que codifica para la proteína de cubierta. En este

20 sentido, Ugaki et al. establecen: “No se han identificado aún in vivo proteínas codificadas por CGMMV excepto la proteína de cubierta”.

El genoma de CGMMV se muestra esquemáticamente en la figura 1. Tal como puede observarse en la misma, el ORF que codifica para la proteína de 186 kD comienza en el mismo sitio que el ORF que codifica para la proteína de

25 129 kD, y se añade un supuesto polipéptido de 57 kD al ORF de 129 kD. La presencia de esta proteína de 57 kD sola no se ha detectado en plantas infectadas. En su lugar, se ha encontrado la proteína de 186 kD, que es el producto de una traducción de ultralectura de las ORF de 129 kD y 57 kD.

Se cree que esta proteína de 186 kD desempeña un papel en la replicación del virus. Además, se cree que el ORF

30 de 129 kD codifica para una función replicasa, mientras que el ORF de 29 kD codifica para una proteína de movimiento.

A continuación en el presente documento, la secuencia de nucleótidos que corresponde al ORF que codifica para la proteína de 129 kD se denominará “secuencia de 129 kD”, la secuencia que corresponde a la proteína de

35 ultralectura de 186 kD se denominará “secuencia de 186 kD” y la secuencia de nucleótidos que corresponde al ORF que codifica para la parte de ultralectura de 57 kD se denominará “secuencia de 57 kD”. Estas secuencias de nucleótidos y las secuencias de proteína correspondientes se facilitan en las listas de secuencias, tal como se describe adicionalmente a continuación.

40 El objeto de la invención era proporcionar un método para proteger plantas, en particular plantas susceptibles a la infección con CGMMV tales como especies de la familia Cucurbitaceae, frente a la infección con CGMMV, y en particular frente a la infección con cepas de CGMMV prevalentes en Europa, tales como las cepas encontradas en el cultivo de pepinos en invernaderos.

45 Objetos adicionales eran proporcionar medios para su uso en dicho método, en particular un constructo genético que puede usarse para transformar plantas o material vegetal de modo que se proporcionen plantas transgénicas resistentes frente a la infección con CGMMV. Objetos adicionales de la invención quedarán claros a partir de la descripción facilitada a continuación en el presente documento.

50 Para estos fines, el solicitante ha investigado la sintomatología y la secuencia de nucleótidos de los genes de proteína de cubierta de 10 cepas europeas de CGMMV, y las ha comparado con la cepa SH descrita por Ugaki et al. Se facilita en la tabla 1 una lista de estas cepas, con su origen geográfico y síntomas en el pepino.

Tabla 1. Lista de aislados de CGMMV recogidos con su origen geográfico y síntomas en el pepino Se encontró que las secuencias para los 10 aislados europeos son altamente homólogas (es decir, homología al nivel de nucleótidos del 97%), y muestran una homología de aproximadamente el 90% (al nivel de nucleótidos) con el aislado de SH. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas de cubierta de cada uno de los

Aislado de CGMMV: Origen geográfico Síntomas en el pepino

1: Este de Europa aclaramiento de las venas, mosaico

2: Este de Europa aclaramiento de las venas, mosaico

3: IPO-DLO, Países Bajos casi sin síntomas

4: Países Bajos débil clorosis de hojas

5: Países Bajos débil clorosis de hojas

6: Proefstation Naaldwijk, Países Bajos Clorosis

7: Rijk Zwaan, Países Bajos Clorosis

8: Israel Clorosis

9: Almería, España manchas cloróticas en las hojas

10: Almería, España débil clorosis de hojas

CGMMV-SH: Japón fuerte mosaico clorótico de las hojas

5 aislados 1-10, así como la cepa SH, se facilitan en las listas de secuencias, tal como se describe adicionalmente a continuación. El árbol fitogenético correspondiente se muestra en la figura 2. Esto muestra que puede considerarse que los aislados europeos constituyen un subgrupo de las especies de CGMMV.

En las listas de secuencias: 10

-SEQ ID no.1 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína replicasa de 129 kD del aislado 4 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.2 facilita la secuencia de aminoácidos de la proteína replicasa de 129 kD del aislado 4 de CGMMV, con 15 el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.3 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de 57 kD del aislado 4 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

20 -SEQ ID no.4 facilita la secuencia de aminoácidos de la proteína replicasa de 57 kD del aislado 4 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.5 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de ultralectura de 186 kD del aislado

4 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525; 25

-SEQ ID no.6 facilita la secuencia de aminoácidos de la proteína de ultralectura de 186 kD del aislado 4 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.7 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 1 de CGMMV, 30 con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.8 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 2 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

35 -SEQ ID no.9 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 3 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.10 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 4 de

CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525; 40

-SEQ ID no.11 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 5 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.12 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 6 de 45 CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-SEQ ID no.13 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 7 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

50 -SEQ ID no.14 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 8 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-: SEQ ID no.15 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 9 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-: SEQ ID no.16 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado 10 de CGMMV, con el ORF de la proteína de cubierta que comienza con el codón ATG en las pb 523-525;

-: SEQ ID no.17 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína replicasa de 129 kD del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID no.18 facilita la secuencia de aminoácidos de la proteína replicasa de 129 kD del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID no.19 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de 57 kD del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID no.20 facilita la secuencia de aminoácidos de la proteína replicasa de 57 kD del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID no.21 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de ultralectura de 186 kD del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID no.22 facilita la secuencia de aminoácidos de la proteína de ultralectura de 186 kD del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID no.23 facilita la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta del aislado SH de CGMMV;

-: SEQ ID nos. 24-40 facilitan las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados en los ejemplos;

-: SEQ ID nos. 41-44 facilitan las secuencias de nucleótidos usadas en el ensamblaje de las secuencias líder usadas en los constructos descritos en los ejemplos;

En las listas de secuencias anteriores, las secuencias de nucleótidos facilitadas son secuencias de ADN, ya que los constructos genéticos de la invención descritos a continuación contendrán o consistirán habitualmente en un ADN. Ya que CGMMV es un virus de ARN, quedará claro para el experto que estas secuencias se producirán en el virus como la secuencia de ARN correspondiente (es decir, sustituyendo T por U). Además, quedará claro para el experto que las secuencias de nucleótidos facilitadas anteriormente pueden ir seguidas, tanto en el virus como también en un constructo de la invención, por un codón de terminación adecuado, es decir TAA/UAA, TAG/UAG o TGA/UGA (no mostrado).

Además, tal como quedará claro para el experto, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta comenzará habitualmente con un codón ATG. Por ejemplo, en SEQ ID NOs 1-16, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta comienza en el codón ATG en las posiciones de bases 523

525. (En la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs 1-16, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cubierta está precedida por otra secuencia de nucleótidos, que codifica por ejemplo para una proteína de movimiento. Por consiguiente, cuando se hace referencia a continuación en el presente documento a cualquier secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs 1-16, esto también incluye explícitamente la secuencia de nucleótidos que comienza en el codón ATG en las posiciones de bases 523-525 de estas SEQ ID).

Por tanto, un fin particular de la invención es proporcionar un método que pueda dotar a las plantas de resistencia frente a todas estas cepas simultáneamente, y más en particular un tipo de resistencia que sea útil desde el punto de vista agronómico, es decir, que pueda usarse para generar una resistencia de una naturaleza extrema y/o que pueda usarse para proteger (cosechas de) plantas que se cultivan en circunstancias en las que la alta infectividad y persistencia de CGMMV puede ser un problema importante, tal como el cultivo de pepinos en invernaderos. Cuando se genera una resistencia de una naturaleza extrema se prefiere que no se toleren niveles de acumulación de ARN viral incluso bajos en las plantas resistentes.

En un aspecto de la presente invención, este problema se soluciona transformando una planta con una secuencia de polinucleótido (por ejemplo como parte de un constructo genético) que puede inducir resistencia frente a CGMMV mediante un mecanismo que desencadena el silenciamiento génico específico de secuencia. La inducción de PTGS (silenciamiento génico postranscripcional) es un método para obtener la regulación por disminución de la expresión génica de genes homólogos a la secuencia de inducción. Se ha empleado anteriormente para regular por disminución transgenes o genes endógenos. La presente invención emplea este principio para el silenciamiento de genes virales y más en particular genes de CGMMV. El mecanismo natural de PTGS no se entiende completamente. Sin embargo, los virus de plantas han evolucionado para superar o suprimir el PTGS con el fin de ser infectivos. Por tanto, la eficacia del PTGS frente a virus no se ha demostrado aún que sea un mecanismo general o extendido. La eficacia del PTGS y conceptos similares dependerá por tanto en gran medida si no principalmente del desarrollo evolutivo de la planta en cuestión así como del virus implicado. El PTGS se considera que es específico de secuencia y se ha especulado que la inducción se produce por formas aberrantes de ARN homólogo a los genes. La forma aberrante de ARN son por ejemplo niveles extremadamente altos. De moléculas de ARN específicas tales como las que aparecen tras la infección viral de células vegetales. Por tanto, parece que el silenciamiento génico específico de secuencia se induce o bien mediante altos niveles de transcripción transgénica o bien mediante la producción de ARN aberrante.

Una de varias formas de inducción de silenciamiento génico específico de secuencia es mediante la expresión en una célula de moléculas de ARN homosentido y antisentido. Estas moléculas de ARN homosentido y antisentido comprenden secuencias de nucleótidos respectivamente homólogas y complementarias a al menos parte de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de interés. En el caso de que el ácido nucleico de interés se derive de un virus, la secuencia de nucleótidos es (parte de) un gen viral, por ejemplo un gen viral que codifica para una proteína de cubierta, un gen de movimiento o un gen de replicasa.

Las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden proporcionarse como una molécula de ARN, por ejemplo en forma de una o más secuencias de repeticiones invertidas. Los ARN homosentido y antisentido puede estar unidos por una secuencia de nucleótidos espaciadora.

Sin querer restringirse a la misma, la teoría es que el ARN homosentido y antisentido pueden formar una molécula de ARN bicatenaria (ARNbc). El ARNbc desencadena posteriormente un mecanismo de degradación de ARN específico de secuencia. Este fenómeno se ha observado en una variedad de organismos, tales como C. elegans, Drosophila y Arabidopsis (véase por ejemplo Chuang, Z, Marcowitz, Proc. Nat acad. Sci 2000, 97, 4985-4990). Alternativamente, el ARNbc provoca una detención híbrida de la traducción de cofactores requeridos para la replicación viral o la hibridación del ARN afecta al apareamiento de bases intramolecular requerido para la replicación viral. En la actualidad y para los fines de la presente invención, no hay preferencia por ningún mecanismo teórico. El uso de silenciamiento génico en relación con la inducción de resistencia a virus se ha descrito anteriormente en varios artículos tales como por Waterhouse et al. en Trends in Plant Science, 1999, 4, 452-457; Kooter et al. en Trends in Plant Science, 1999, 4, 340-347; Andrew Fire en Trends in Genetics 1999, 15, 358; Muskens et al. en Plant Molecular Biology 2000, 43, 243-260.

La presente invención proporciona un método para generar resistencia en una planta o en una célula vegetal o frente a la infección con CGMMV, comprendiendo dicho método al menos la etapa de transformar dicha planta o célula vegetal con una secuencia de polinucleótido que tras su (al menos) transformación en una planta y transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta; preferiblemente tras su (al menos) transformación en una planta y transcripción en ARN la secuencia de polinucleótido no conduce a la generación de (ninguna) actividad replicasa en dicha planta; en el que la secuencia de polinucleótido comprende un promotor, operativamente unido a una primera y una segunda secuencia de ADN, en una repetición invertida, en la que la primera secuencia de ADN comprende un promotor operativamente unido a una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con al menos parte de la secuencia de nucleótidos del CGMMV; y opcionalmente una región de ADN adicional que puede controlar la terminación de la transcripción y/o la poliadenilación en la planta o las células vegetales, mediante lo cual la región de ADN adicional está operativamente unida a la primera región de ADN. La segunda secuencia de ADN comprende una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100% con el complemento inverso de al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido; y opcionalmente una región de ADN adicional que puede controlar la terminación de la transcripción y la poliadenilación en la planta o las células vegetales. Las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar un ARN en horquilla mediante apareamiento de bases entre las regiones que son complementarias. La transformación de la planta con la secuencia de nucleótidos según la invención y la transcripción de la secuencia de nucleótidos en ARN no conduce a la generación de (ninguna) actividad replicasa en dicha planta. La primera y segunda secuencia de ADN están unidas en un ADN recombinante (es decir, un locus) de manera que los ADN se integran juntos en el genoma nuclear de las células vegetales transgénicas.

Con el fin de proporcionar resistencia en la presente invención, la secuencia de nucleótidos derivada del genoma de un virus CGMMV puede ser de una cepa del virus que por sí misma no puede infectar a la planta, pero cuya secuencia es adecuada para la generación de resistencia frente a tobamovirus en general y CGMMV en particular.

La secuencia de polinucleótido según la invención o al menos una parte de la misma puede formar preferiblemente al menos una molécula de ARN bicatenaria mediante apareamiento de bases complementarias de al menos parte de las secuencias de ARN homosentido y antisentido. El polinucleótido según la presente invención puede inducir en general silenciamiento génico inducido por virus o mecanismos similares tal como se describe en el presente documento, dando como resultado la generación de resistencia, preferiblemente resistencia extrema de las células vegetales frente a CGMMV.

La primera y segunda regiones de ADN, que codifican para la molécula de ARN homosentido y antisentido, se derivan de la secuencia de nucleótidos que codifica para la ARN polimerasa dependiente de ARN de CGMMV. En una realización preferida, un fragmento derivado de una secuencia de nucleótidos que codifica para una ARN polimerasa dependiente de ARN, preferiblemente de CGMMV, se clona en orientación de repetición invertida, separada por un fragmento de relleno. La transcripción del fragmento en esta disposición producirá una molécula de ARN que puede formar una estructura en horquilla. Estos constructos se evalúan en el pepino tal como se explicará adicionalmente en los ejemplos a continuación.

El uso de ARNbc en un método para inducir resistencia a virus se ha descrito anteriormente en el documento WO 99/53050. En este caso particular, se transformó tabaco para obtener tabaco transgénico resistente frente al virus Y de patata (PVY). Los experimentos mostraron que la transformación de plantas con constructos específicamente diseñados que contienen una secuencia de proteasa de PVY en sólo una orientación homosentido o sólo una orientación antisentido daba como resultado resistencia a virus en del 4 a aproximadamente el 10% del número total de plantas tratadas. Se encontró una mejora de la resistencia cuando el constructo contenía dicha secuencia de proteasa de PVY tanto en una orientación homosentido como antisentido. El documento WO 99/53050, por tanto, enseña que en plantas de tabaco que ya son susceptibles de volverse resistentes a o bien una secuencia homosentido seleccionada o bien una secuencia antisentido seleccionada de dicha proteasa de PVY sola, la resistencia puede mejorarse modificando los constructos de manera que expresen secuencias de ARN tanto homosentido como antisentido.

Se sabe poco en la actualidad con respecto al mecanismo de defensa frente a virus en la familia Cucurbitaceae. El pepino, como ejemplo de la familia Cucurbitaceae, se sabe que es sumamente susceptible a una amplia variedad de virus y, debido a esta susceptibilidad, se ha usado incluso en ciertos casos como herramienta de diagnóstico para la detección de virus. Se ha planteado la hipótesis de que esto puede deberse al hecho de que los mecanismos de defensa antivirales en la familia Cucurbitaceae no están bien desarrollados. En la técnica, por tanto, no está disponible ningún conocimiento que proporcione orientación al experto de que el mecanismo para conferir resistencia descrito en el caso de infecciones con PVY en tabaco pueda modificarse o transferirse fácilmente a otras plantas, especialmente a la familia Cucurbitaceae sin experimentación excesiva y con expectativas de éxito razonables. Esto se mantiene especialmente en el caso del virus del mosaico moteado verde del pepino, cuya secuencia de nucleótidos se ha puesto a disposición sólo ahora por los presentes solicitantes.

Además, el documento WO 99/53050 no proporciona ninguna revelación o conjunto de enseñanzas que pueda guiar al experto en el proceso de selección de las partes de la secuencia de CGMMV que cuando se transforman en una célula vegetal puedan conferir resistencia a otros virus distintos del virus Y de la patata en general, y a miembros del grupo de virus Tobamovirus en particular. El virus Y de la patata es un miembro del grupo Potivirus, mientras que CGMMV es un miembro del grupo Tobamovirus. Aunque ambos grupos virales se caracterizan por genomas virales que consisten en una única cadena de ARN positiva (significando positiva que la única cadena de ARN codifica para las proteínas virales directamente, en contraposición a proteínas virales que se codifican por una molécula de ARN complementaria sintetizada a partir de la cadena de ARN genómico), emplean estrategias de replicación completamente diferentes. Los Potivirus codifican en su ARN para un único marco de lectura abierto, que tras la infección en células vegetales se traduce en una única poliproteína grande. Esta poliproteína se escinde posteriormente y se procesa para dar las diversas proteínas virales funcionales mediante la actividad proteasa proporcionada por la propia poliproteína. El documento WO 99/53050 enseña el uso de secuencias de nucleótidos homosentido y antisentido derivadas de la parte del genoma de potivirus, que codifica para los dominios proteasa. Por tanto, la degradación específica de secuencia dirigida hacia esta parte particular del genoma de potivirus impedirá al menos la traducción de péptidos con esta actividad proteasa.

Los tobamoviruses en general, y CGMMV en particular, no codifican para proteasas o actividad proteasa. En su lugar, tras la infección de una célula vegetal con estos tipos de virus, el marco de lectura abierto ubicado más en el sentido de 5’ del genoma viral se traducirá en una ARN polimerasa dependiente de ARN funcional (RdRP, también denominada “replicasa”), que, a su vez, puede no sólo replicar todo el ARN genómico viral, sino que más específicamente generará moléculas de ARN subgenómico a partir de la parte en 3’ del genoma viral. Estas moléculas de ARN subgenómico codifican para los marcos de lectura abiertos ubicados más en el sentido de 3’, a partir de los cuales se traducen las proteínas de movimiento y las proteínas de cubierta. En vista de esta estrategia de replicación totalmente diferente en Tobamovirus, la elección de las secuencias de nucleótidos que van a emplearse en los constructos génicos homosentido y antisentido de la presente invención no pueden deducirse a partir del documento WO 99/53050.

Las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden proporcionarse como una única molécula de ARN, en la que la secuencia de ARN homosentido y antisentido pueden estar unidas entre sí a través de una secuencia de nucleótidos espaciadora y pueden formar una molécula de ARN bicatenaria, también denominada estructura en horquilla. Proporcionar ARN homosentido y antisentido en una única molécula tiene la ventaja de que la capacidad para formar una molécula de ARN bicatenario será independiente de las concentraciones de los ARN homosentido y antisentido.

La secuencia de nucleótidos espaciadora está ubicada entre la secuencia de nucleótidos homosentido y antisentido. La secuencia espaciadora se prefiere para la estabilidad de los constructos génicos en el proceso de clonación génica. En ausencia de una secuencia espaciadora de este tipo, la molécula de ARN podrá formar todavía un ARN bicatenario, particularmente si la secuencia de nucleótidos homosentido y antisentido son más largas de aproximadamente 100 nucleótidos y parte de la secuencia de nucleótidos homosentido y/o antisentido se usará para formar la horquilla permitiendo el apareamiento de bases entre las regiones con secuencia de nucleótidos homosentido y antisentido y la formación de un ARN bicatenario. No hay ningún límite de longitud ni requisito de secuencia asociado con la región espaciadora, siempre que estos parámetros no interfieran con la capacidad de las regiones de ARN con la secuencia de nucleótidos homosentido y antisentido para formar un ARN bicatenario. Por tanto, el espaciador puede comprender secuencias artificiales que preferiblemente están diseñadas para ayudar en la formación del bucle. El espaciador, en una realización preferida, comprende un intrón. En una realización preferida, la región espaciadora varía en longitud desde 4 hasta aproximadamente 2000 pb, preferiblemente desde 50 hasta 1500 pb, más preferiblemente desde 100-1250 pb.

En la presente invención de generación de resistencia, preferiblemente resistencia extrema, frente a CGMMV, se prefiere que el constructo genético que se usa para desencadenar el mecanismo de degradación del ARN se forme mediante una secuencia que comprende un promotor, operativamente unido a una primera secuencia de ADN en dirección homosentido, seguido por un espaciador, seguido por una segunda secuencia de ADN en dirección antisentido, seguida opcionalmente por una secuencia de ADN que puede controlar la terminación de la transcripción o la poliadenilación.

El constructo genético de la invención codifica para moléculas de ARN que pueden formar más de una estructura secundaria tal como horquillas o estructuras de tallo-bucle. Preferiblemente, los constructos genéticos de la invención se diseñan de manera que codifican para una molécula de ARN que puede adoptar una estructura secundaria del ARN que tiene la energía libre más baja, preferiblemente en condiciones fisiológicas (tal como puede producirse en la célula). Según la invención, la molécula de ARN que va a producirse en la célula se diseña de tal forma que al menos en su estado de energía libre más baja, que puede asumir en condiciones fisiológicas (dentro de la célula), comprenderá la horquilla deseada.

Tal como se usa en el presente documento “ARN en horquilla” se refiere a cualquier molécula de ARN bicatenario de autohibridación. En su representación más sencilla, un ARN en horquilla consiste en un tallo bicatenario constituido por la hibridación de cadenas de ARN, conectadas mediante un bucle de ARN monocatenario, y también se denomina “ARN de mango de sartén”. Sin embargo, la expresión “ARN en horquilla” también pretende abarcar estructuras de ARN secundarias más complicadas que comprenden secuencias de ARN bicatenario de autohibridación, pero también bucles y protuberancias internas. La estructura secundaria específica adaptada se determinará mediante la energía libre de la molécula de ARN, y puede predecirse para diferentes situaciones usando software apropiado tal como FOLDRNA (Zuker y Stiegler, 1981).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “promotor expresable en plantas” o “promotor” significa una secuencia de ADN que puede controlar (iniciar) la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal que pueda dirigir la transcripción en una célula vegetal, es decir, ciertos promotores de origen viral o bacteriano tales como el CaMV35S, el promotor del virus del trébol subterráneo n.º 4 o n.º 7, o los promotores de genes de ADN-T. Se prefiere usar un promotor que se ha notificado que es activo en pepino por ejemplo, y se prefiere 35S.

La expresión “expresión de un gen” se refiere al proceso en el que una región de ADN que está operativamente unida a regiones reguladoras apropiadas, particularmente a un promotor, se transcribe en un ARN que es biológicamente activo, es decir, que puede interaccionar con otro ácido nucleico que puede traducirse en un polipéptido o proteína. Se dice que un gen codifica para un ARN cuando el producto final de la expresión del gen es ARN biológicamente activo, tal como por ejemplo un ARN antisentido, una ribozima o un producto intermedio de replicación. Se dice que un gen codifica para una proteína cuando el producto final de la expresión del gen es una proteína o un polipéptido.

Tal como se usa en el presente documento, “reducción de la expresión del ácido nucleico diana” se refiere a la comparación de la expresión del ácido nucleico de interés en la célula eucariota en presencia del ARN o genes quiméricos de la invención, con la expresión del ácido nucleico de interés en ausencia del ARN o genes quiméricos de la invención. La expresión en presencia del ARN quimérico de la invención debe ser por tanto inferior a la expresión en ausencia del mismo, preferiblemente de sólo aproximadamente el 25%, particularmente de sólo aproximadamente el 10%, más particularmente de sólo aproximadamente el 5% de la expresión del ácido nucleico diana en ausencia del ARN quimérico, especialmente la expresión debe inhibirse completamente para todos los fines prácticos por la presencia del ARN quimérico o el gen quimérico que codifica para tal ARN. La presente invención proporciona preferiblemente un mecanismo de degradación de ARN específico de secuencia que conduce a la aniquilación esencial del genoma viral.

Un ácido nucleico de interés “puede expresarse”, cuando dicho ácido nucleico, cuando se introduce en una célula huésped adecuada, particularmente en una célula vegetal, puede transcribirse (o replicarse) para producir un ARN, y/o traducirse para producir un polipéptido o una proteína en esa célula huésped.

Tal como se usa en el presente documento “un ácido nucleico de interés” o un “ácido nucleico diana” se refiere a cualquier secuencia de ADN o molécula de ARN particular que puede estar presente en una célula eucariota, particularmente una célula vegetal. El término “gen” significa cualquier fragmento de ADN que comprende una región de ADN (la “región de ADN transcrita”) que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula operativamente unida a regiones reguladoras adecuadas, por ejemplo, un promotor expresable en plantas. Por tanto, un gen puede comprender varios fragmentos de ADN operativamente unidos tales como un promotor, una secuencia líder en 5’, una región codificante y una región en 3’ que comprende un sitio de poliadenilación. Un gen vegetal endógeno para una especie de planta particular (gen vegetal endógeno) es un gen que se encuentra de manera natural en esa especie de planta o que puede introducirse en esa especie de planta mediante mejora genética convencional. Un gen quimérico es cualquier gen que no se encuentra normalmente en una especie de planta o, alternativamente, cualquier gen en el que el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o toda la región de ADN transcrita o con al menos otra región reguladora del gen. Tal como se usa en el presente documento, “identidad de secuencia” con respecto a secuencias de nucleótidos (ADN o ARN), se refiere al número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido entre el número de nucleótidos en la más corta de las dos secuencias. La alineación de las dos secuencias de nucleótidos se realiza mediante el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983) usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización por hueco de 4. El análisis e interpretación asistidos por ordenador de los datos de secuencia, incluyendo la alineación de secuencias tal como se describió anteriormente, pueden realizarse convenientemente usando los programas del Intelligenetics Suite (Intelligenetics Inc., CA). Se indica que las secuencias son “esencialmente similares” cuando tales secuencian tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75%, particularmente de al menos aproximadamente el 80%, más particularmente de al menos aproximadamente el 85%, bastante particularmente de aproximadamente el 90%, especialmente de aproximadamente el 95%, más especialmente de aproximadamente el 100%, bastante especialmente son idénticas. Queda claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.

Se describe una planta resistente a virus, que comprende un primer y un segundo ADN quimérico integrado en el genoma nuclear de al menos algunas de sus células, en la que el primer ADN quimérico comprende un promotor expresable en plantas, operativamente unido a una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN homosentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con al menos parte de la secuencia de nucleótidos del genoma de un virus que puede infectar a la planta, y opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales. El segundo ADN quimérico comprende un promotor expresable en plantas, operativamente unido a una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que incluye al menos 10 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 75% y aproximadamente 100% con el complemento de al menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido, y opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales. Preferiblemente, los al menos 10 nucleótidos comparten identidad de secuencia con parte del genoma viral que codifica para una función replicasa, y más preferiblemente el virus es un CGMMV.

Las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar una región de ARN bicatenario mediante apareamiento de bases entre las regiones que son complementarias. El primer y segundo ADN quimérico se integran o bien en un locus en el genoma nuclear.

En una realización preferida de la invención, la molécula de ARN transcrita a partir del gen quimérico consiste esencialmente en el ARN en horquilla.

En una realización preferida, el orden de la secuencia de nucleótidos homosentido y antisentido en la molécula de ARN no es crítico.

Por tanto, en otras palabras, el ADN quimérico tiene una región de ADN transcrita, que cuando se transcribe, produce una molécula de ARN que comprende una región de ARN que puede formar una estructura de tallo-bucle, en la que una de las secuencias de ARN hibridante de la estructura de tallo-bucle comprende una secuencia, esencialmente similar a al menos parte de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de interés, y en la que la segunda de las secuencias de ARN hibridantes comprende una secuencia esencialmente similar a al menos parte del complemento de al menos parte de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de interés. La molécula de ARN puede comprender más de una estructura en horquilla, que puede diseñarse para reducir la expresión de diferentes ácidos nucleicos de interés.

En una realización preferida, el ácido nucleico de interés, cuya expresión se selecciona como diana para reducirse o cuya degradación se desea, es un ácido nucleico viral, particularmente una molécula de ARN viral, más en particular un tobamovirus, lo más en particular una molécula de ARN de CGMMV que puede infectar una célula eucariota, particularmente una célula vegetal. En una realización preferida, la expresión que va a reducirse es la replicación del virus y/o la degradación del ADN viral. También se prefiere reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad provocados por el virus infeccioso.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana que corresponde a la secuencia de nucleótidos homosentido es parte de una región de ADN que se transcribe, particularmente una región de ADN que se transcribe y se traduce (en otras palabras, una región codificante). Se prefiere particularmente que la secuencia diana corresponda a uno o más exones consecutivos, más particularmente está ubicada dentro de un único exón de una región codificante.

La longitud de la secuencia de nucleótidos homosentido puede variar desde aproximadamente 10 nucleótidos (nt) hasta una longitud que iguala la longitud (en nucleótidos) del ácido nucleico diana. Preferiblemente, la longitud total de la secuencia de nucleótidos homosentido es al menos de aproximadamente 100 nt, especialmente al menos de aproximadamente 150 nt, más especialmente al menos de aproximadamente 200 nt, bastante especialmente al menos de aproximadamente 550 nt. En principio, no hay ningún límite superior para la longitud total de la secuencia de nucleótidos homosentido, más que la longitud total del ácido nucleico diana. Sin embargo, por motivos puramente prácticos (tales como por ejemplo la estabilidad de los genes quiméricos, la facilidad de manipulación de los constructos genéticos) la longitud de la secuencia de nucleótidos homosentido no debe superar preferiblemente 5000 nt, más preferiblemente no debe superar 2500 nt y puede limitarse preferiblemente a aproximadamente 1000 nt.

Se apreciará que cuanto mayor sea la longitud total de la secuencia de nucleótidos homosentido, menos rigurosos serán los requisitos para la identidad de secuencia entre la secuencia de nucleótidos homosentido total y la secuencia correspondiente en el gen diana. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos homosentido total debe tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90%, especialmente de aproximadamente el 95%, más especialmente de aproximadamente el 100%, bastante especialmente debe ser idéntica a la parte correspondiente del ácido nucleico diana. Sin embargo, se prefiere que la secuencia de nucleótidos homosentido incluya siempre una secuencia de aproximadamente 100 nt, bastante especialmente de aproximadamente 150 nt con una identidad de secuencia del 100% con la parte correspondiente del ácido nucleico diana. Preferiblemente, para calcular la identidad de secuencia y diseñar la secuencia homosentido correspondiente, el número de huecos debe minimizarse, particularmente para las secuencias homosentido más cortas.

La longitud de la secuencia de nucleótidos antisentido está determinada en gran medida por la longitud de la secuencia de nucleótidos homosentido, y preferiblemente corresponderá a la longitud de esta última secuencia. Sin embargo, es posible usar una secuencia antisentido que difiera en longitud en aproximadamente el 10%. De manera similar, la secuencia de nucleótidos de la región antisentido está determinada en gran medida por la secuencia de nucleótidos de la región homosentido, y preferiblemente es idéntica al complemento de la secuencia de nucleótidos de la región homosentido. Particularmente con regiones antisentido más largas, es posible sin embargo usar secuencias antisentido con identidad de secuencia inferior con el complemento de la secuencia de nucleótidos homosentido, preferiblemente con una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90%, especialmente con una secuencia de al menos aproximadamente el 95% con el complemento de la secuencia de nucleótidos homosentido. No obstante, se prefiere que las secuencias de nucleótidos antisentido incluyan siempre una secuencia de aproximadamente 100 nt, bastante especialmente de aproximadamente 150 nt con una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% más preferiblemente al menos el 95% y lo más preferido el 100% con el complemento de una parte correspondiente de la secuencia de nucleótidos homosentido. De nuevo, preferiblemente el número de huecos debe minimizarse, particularmente para las secuencias antisentido más cortas. Además, se prefiere también que la secuencia antisentido tenga una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 75% y el 100% con el complemento de la secuencia diana.

El ARN en horquilla formado por la región homosentido y antisentido y la región espaciadora es un ARN en horquilla.

Por “ARN en horquilla artificial” o “estructura de ARN de tallo-bucle artificial”, quiere decirse que tal “ARN en horquilla” no se produce de manera natural en la naturaleza, porque las regiones homosentido y antisentido definidas no se producen de manera natural simultáneamente en una molécula de ARN, o las regiones homosentido y antisentido están separadas por una región espaciadora que es heteróloga con respecto al gen diana, particularmente, la secuencia de nucleótidos del espaciador tiene una identidad de secuencia de menos del 75% con la secuencia de nucleótidos de la secuencia diana, en la ubicación correspondiente 5’ o 3’ de los puntos finales de la secuencia de nucleótidos homosentido. Un ARN en horquilla también puede indicarse como artificial, si no está comprendido dentro de la molécula de ARN con la que normalmente está asociado. Puede concebirse usar según la invención un ADN quimérico cuya transcripción da como resultado una estructura de ARN en horquilla con una secuencia de nucleótidos que se produce de manera natural (que por lo demás cumple los límites expuestos en esta memoria descriptiva) siempre que este ARN en horquilla carezca de las secuencias de ARN circundantes (no implicadas en la formación de la estructura en horquilla).

Aunque se prefiere que la molécula de ARN que comprende el ARN en horquilla no comprenda además una secuencia de intrón, está claro que los genes de ADN quimérico que codifican para tales ARN pueden comprender en su región transcrita uno o más intrones.

Las células vegetales transformadas se usan preferiblemente para la generación de plantas transformadas que pueden usarse además en esquemas de mejora genética convencional para proporcionar más plantas o para introducir la transformación deseada, en la presente invención resistencia frente a CGMMV, en otras variedades de la misma especie de planta o especie relacionada o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas que contienen los genes quiméricos de la invención también se abarcan dentro del alcance actualmente reivindicado.

Tal como se define en el presente documento, con “secuencia de repetición invertida” quiere decirse una secuencia de ADN o ARN que contiene dos secuencias de nucleótidos idénticas en direcciones opuestas (es decir, homosentido y antisentido). Las secuencias de nucleótidos idénticas están divididas por un espaciador. Idéntico en este sentido se considera en cuanto a identidad de secuencia tal como se define en el presente documento. La secuencia de ARN del genoma viral que puede usarse en el diseño de un constructo adecuado para su uso en la presente invención comprende preferiblemente secuencias de nucleótidos que se derivan de secuencias de nucleótidos del virus de interés, en el presente caso CGMMV, que codifican para (parte(s) de) las proteínas replicasas.

También se da a conocer la transformación de una planta con una secuencia de polinucleótido (por ejemplo como parte de un constructo genético) que puede proporcionar a la planta la denominada resistencia frente a CGMMV “mediada por replicasa”. En particular, esta será una secuencia de polinucleótido que

i) se ha derivado de la secuencia de 129 kD, la secuencia de 57 kD, o la secuencia de ultralectura de 186 kD de CGMMV nativo;

ii) tras (al menos) su transformación en la planta y transcripción en ARN (y habitualmente también traducción en la proteína codificada correspondiente) puede proporcionar a la planta resistencia frente a CGMMV; pero

iii) no codifica para ninguna actividad replicasa.

En el caso de la resistencia “mediada por replicasa”, una secuencia de polinucleótido según la invención puede codificar para un polipéptido o una proteína que puede proporcionar a la planta resistencia frente a GCMMV, pero que por sí misma no tiene actividad replicasa, por ejemplo debido a una o más alteraciones en su secuencia de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD, la secuencia de 57 kD y/o la secuencia de ultralectura de 186 kD de CGMMV nativo.

Sin embargo, según una realización específica, la secuencia de polinucleótido puede comprender también, o incluso consistir en, la secuencia de 57 kD nativa.

Se describe un método para generar resistencia en una planta frente a CGMMV, comprendiendo dicho método al menos la etapa de transformar dicha planta con un polinucleótido que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV.

En un aspecto adicional, la invención también se refiere a un método para proporcionar una planta transgénica y/o célula vegetal que es resistente frente a la infección con CGMMV, que comprende al menos la etapa de transformar dicha planta o célula vegetal con una secuencia de polinucleótido que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV.

También se describe un constructo genético adecuado para transformar una planta, comprendiendo dicho constructo al menos una secuencia de polinucleótido que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV, y opcionalmente además elementos de constructos genéticos conocidos per se. La invención también se refiere a una planta, célula vegetal y/o material vegetal que se ha transformado con un constructo genético de la invención.

La invención también da a conocer plantas transgénicas que contienen una secuencia de polinucleótido que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV, y/o que se han dotado de resistencia frente a la infección con CGMMV mediante el método de la invención.

En el contexto de la invención, mediante el “gen de replicasa de CGMMV” quiere decirse la secuencia de 129 kD nativa, la secuencia de 57 kD nativa y/o el producto de “ultralectura” de 186 kD nativo combinado de las secuencia de 129 kD nativa y 57 kD nativa.

Por una secuencia “nativa” quiere decirse cualquier secuencia de ARN que se produzca de manera natural en CGMMV, incluyendo todos los aislados y cepas del mismo, así como cualquier secuencia de ADN que corresponda a estas secuencias de ARN que se producen de manera natural. Los ejemplos de tales secuencias nativas son las secuencias de nucleótidos de 129 kD facilitadas en SEQ. ID no.1 y SEQ. ID no.17, las secuencias de nucleótidos de 57 kD facilitadas en SEQ. ID no.3 y SEQ. ID no.19 y las secuencias de nucleótidos de 186 kD facilitadas en SEQ. ID no.5 y SEQ. ID no.21. Quedará claro para el experto que puede haber variantes que se producen de manera natural (adicionales) de la secuencia de ARN a partir de las que se derivan las secuencias de ADN en las listas de secuencias, y estas (y las secuencias de ADN que corresponden a las mismas) también se incluyen dentro del término “secuencia nativa”.

Por “una secuencia de polinucleótido que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV” en su sentido más amplio quiere decirse una secuencia de polinucleótido que

i) tras su (al menos) transformación en una planta y transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta; y

ii) tras su (al menos) transformación en una planta y transcripción en ARN no conduce a la generación de (ninguna) actividad replicasa en dicha planta (o al menos, cuando conduce a expresión de algo de actividad replicasa, conduce a la expresión de una actividad replicasa que se reduce gravemente en comparación con la expresión del gen nativo que codifica para la replicasa de CGMMV).

En el presente documento, los términos “planta”, “planta transformada” y/o “planta transgénica” incluyen todas las partes o tejidos de una planta de este tipo, incluyendo pero sin limitarse a células individuales de una planta de este tipo. Estos términos también incluyen material de o para una planta de este tipo, tal como material que puede regenerarse en una planta (madura), incluyendo pero sin limitarse a protoplastos y/o tejido calloso, o material que puede cultivarse para dar una planta madura, tal como material de cultivo.

La planta es preferiblemente una planta que es susceptible a la infección con CGMMV, más preferiblemente una planta que pertenece a la familia Cucurbitaceae, tal como melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria).

Se incluyen dentro del término “CGMMV” todas las cepas conocidas del mismo, incluyendo las prevalentes en Europa y Asia. En particular, el método de la invención puede usarse para proteger plantas frente a cepas de GCMMV prevalentes en Europa (incluyendo Israel), tal como las que son un problema en el cultivo de melones y en particular pepinos en invernaderos, aunque la invención no se limita a las mismas.

Al hacer esto, una importante ventaja de la invención es que puede proporcionar protección frente a varias, y preferiblemente todas de (tales) cepas de CGMMV simultáneamente. Otra ventaja de la invención es que proporciona una protección “absoluta” frente a CGMMV, lo que significa que, tras la expresión de una secuencia de polinucleótido que codifica para una replicasa defectuosa en una planta, esencialmente no pueden detectarse partículas virales en la planta (material) transformada. Por tanto, el método de la invención no conduce a un aplazamiento o ralentización de la aparición de los síntomas, tal como puede producirse cuando se usa la denominada resistencia “mediada por proteína de cubierta”. Además, el método de la invención conduce a un alto nivel de resistencia, y también puede tener la ventaja de un efecto de temperatura favorable.

Habitualmente, la “secuencia de nucleótidos que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV” será una secuencia de nucleótidos en la que, en comparación con una secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa nativa correspondiente de CGMMV, se han añadido, sustituido y/o eliminado uno o más nucleótidos. En particular, la “secuencia de nucleótidos que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV puede ser una secuencia de nucleótidos que comprende, y preferiblemente consiste en:

-: una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de 129 kD nativa en la que, en comparación con dicha secuencia nativa, se han añadido, sustituido y/o eliminado uno o más nucleótidos;

-: una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de 186 kD nativa en la que, en comparación con dicha secuencia nativa, se han añadido, sustituido y/o eliminado uno o más nucleótidos, por ejemplo en la parte de la secuencia de 186 kD nativa que corresponde a la secuencia de 129 kD, a la secuencia de 57 kD o ambas;

-: una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de 57 kD nativa;

-: una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de 57 kD nativa en la que, en comparación con dicha secuencia de nucleótidos nativa, se han añadido, sustituido y/o eliminado uno más nucleótidos;

de manera que dicha secuencia de nucleótidos puede, tras su (al menos) transformación en una planta y transcripción en ARN, conferir a dicha planta resistencia frente a la infección con CGMMV, y de manera que dicha secuencia de nucleótidos, tras su (al menos) transformación en una planta y transcripción en ARN, no puede generar (ninguna) actividad replicasa en dicha planta.

Habitualmente, la “secuencia de nucleótidos que codifica para la variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV” codificará para una proteína o un polipéptido, más específicamente una proteína o un polipéptido que:

1) tras expresarse en una planta puede generar resistencia frente a CGMMV en dicha planta; y

2) tras expresarse en una planta no tiene actividad replicasa (o, si tiene algo de actividad replicasa, tiene una actividad replicasa gravemente reducida en comparación con la replicasa de CGMMV nativa).

Una proteína o un polipéptido de este tipo se denominará generalmente a continuación en el presente documento “replicasa defectuosa”; y una secuencia de polinucléotido que codifica para una proteína o un polipéptido de este tipo se denominará “secuencia de polinucleótido que codifica para una replicasa defectuosa”.

Habitualmente, la replicasa defectuosa será un derivado (tal como un análogo, homólogo, variante, mutante, parte, fragmento o combinación de dos o más de tales partes o fragmentos, etc.) de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa, la secuencia de 186 kD nativa y/o la secuencia de 57 kD nativa, en el que, en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nativa correspondiente, se han añadido, sustituido o eliminado uno o más aminoácidos, preferiblemente sustituido o eliminado, más preferiblemente eliminado, conduciendo a la pérdida de actividad replicasa (o al menos una incapacidad para generar actividad replicasa cuando se expresa en la planta).

En particular, la replicasa defectuosa puede ser una proteína o un polipéptido que comprende, y preferiblemente consiste en:

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa, en la que, en comparación con dicha secuencia nativa

-: se han añadido, sustituido o eliminado uno o más aminoácidos, preferiblemente sustituido o eliminado, más preferiblemente eliminado;

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 186 kD nativa, en la que, en comparación con dicha secuencia nativa

-: se han añadido, sustituido o eliminado uno o más aminoácidos, preferiblemente sustituido o eliminado, más preferiblemente eliminado, conduciendo a la pérdida de actividad replicasa;

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 57 kD nativa;

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 57 kD nativa, en la que, en comparación con dicha secuencia nativa, se han añadido, sustituido o eliminado uno o más aminoácidos, preferiblemente sustituido o eliminado, más preferiblemente eliminado;

o cualquier combinación de las mismas, siempre que la proteína o el polipéptido resultante no muestre actividad replicasa, pero todavía pueda, tras su expresión en una planta, generar resistencia frente a CGMMV en dicha planta.

Más en particular, la replicasa defectuosa puede ser una proteína o un polipéptido que comprende, y preferiblemente consiste en:

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa, o a una combinación de dos o más de tales partes o fragmentos;

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 186 kD nativa, o a una combinación de dos o más de tales partes o fragmentos; o

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 57 kD nativa,

de manera que la proteína o el polipéptido resultante no muestra actividad replicasa, pero todavía puede, tras su expresión en una planta, generar resistencia frente a CGMMV en dicha planta.

Una secuencia de aminoácidos “que corresponde a una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 186 kD nativa, o a una combinación de dos o más de tales partes o fragmentos” puede comprender por ejemplo: i) al menos una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa combinada con al menos una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 57 kD nativa (combinación de partes o fragmentos que puede corresponder o no a una secuencia de aminoácidos contigua codificada por la secuencia de 186 kD nativa); ii) al menos una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa combinada con la secuencia de aminoácidos completa codificada por la secuencia de 57 kD nativa, y/o iii) al menos una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa completa combinada con al menos una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 57 kD nativa.

Sin embargo, se sabe que la expresión en una planta de una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de 129 kD completa de la replicasa nativa habitualmente no proporciona resistencia frente a la infección con CGMMV, sino que puede incluso, tras la infección de la planta, promover o facilitar la multiplicación del virus. Por tanto, en una realización, la invención no comprende la expresión en una planta de dicha replicasa, ni el uso de una secuencia de polinucleótido que codifica para una replicasa de este tipo.

Incluso más preferiblemente, la replicasa defectuosa es una proteína o un polipéptido que consiste en:

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a una parte o un fragmento de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 129 kD nativa, o una combinación de dos o más de tales partes o fragmentos; de manera que la proteína o el polipéptido resultante no muestra actividad replicasa, pero todavía puede, tras su expresión en una planta, generar resistencia frente a CGMMV en dicha planta; o

-: una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 57 kD nativa.

Cualquiera de tales partes o fragmentos puede contener también una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos adicionales en comparación con la secuencia nativa, pero esto no se prefiere.

Lo más preferiblemente, la replicasa defectuosa es una denominada “replicasa truncada”, es decir, una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada o bien por la secuencia de 129 kD y/o bien por la secuencia de 186 kD, de la que, en comparación con la secuencia de aminoácidos nativa, faltan uno o más residuos de aminoácido en el extremo carboxilo terminal, de manera que la proteína o el polipéptido resultante no muestra actividad replicasa, pero todavía puede, tras su expresión en una planta, generar resistencia frente a CGMMV en dicha planta. (En el caso de una replicasa truncada basada en la secuencia de 186 kD, esto significa habitualmente que la proteína resultante contendrá la secuencia de aminoácidos completa de la secuencia de 129 kD, así como parte de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de 57 kD (es decir, que es contigua a la secuencia de 129 kD en la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de 186 kD nativa), faltando uno o más aminoácidos en el extremo carboxilo terminal de la parte de 57 kD, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a las mismas).

La secuencia de polinucleótido que codifica para una replicasa truncada de este tipo puede o bien comprender, o bien preferiblemente consistir en, la secuencia de 129 kD o la secuencia de 186 kD nativa completa, respectivamente, en la que se ha introducido un codón de terminación en un sitio deseado, o una secuencia de polinucleótido de la que, en comparación con la secuencia de 129 kD o la secuencia de 186 kD nativa completa, respectivamente, se han eliminado uno o más codones que codifican para los residuos de aminoácido carboxiterminales, es decir, comenzando a partir del extremo 3’ de la(s) secuencia(s) nativa(s).

Tal como se menciona a continuación, se introduce preferiblemente un codón de terminación en la secuencia nativa, en particular en el denominado motivo GDD o en el bucle P. Ejemplos de los mismos son las secuencias de polinucleótido comprendidas en los vectores mostrados en las figuras 3-8, y tal como se describe en la parte experimental.

De nuevo, cualquier replicasa truncada de este tipo puede contener también una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa, pero no se prefiere.

Tal como se mencionó anteriormente, (la secuencia de polinucleótido que codifica para) la replicasa defectuosa es tal que, tras su expresión en una planta o célula vegetal, todavía puede generar resistencia frente a CGMMV en dicha planta. Habitualmente, esto significa que la replicasa defectuosa tendrá al menos una función biológica que permite que la replicasa defectuosa proteja a la planta frente a la infección con CGMMV, tal como por ejemplo regulación por disminución de la replicación viral o interferencia con la replicación del CGMMV de tipo natural, por ejemplo compitiendo con el virus de tipo natural por la maquinaria de replicación en la planta (célula). Quedará claro que con el fin de lograr una función biológica de este tipo, la replicasa defectuosa debe tener habitualmente un cierto nivel mínimo de similitud de aminoácidos con las secuencia de aminoácidos codificadas por las secuencias de 129 kD, 186 kD y/o 57 kD nativas. En cuanto que la replicasa defectuosa es similar a la secuencia de aminoácidos nativa correspondiente, esto puede ser porque contiene, en las posiciones de aminoácido correspondientes, los mismos residuos de aminoácido que la secuencia de aminoácidos nativa, o residuos de aminoácido comparables a la misma. Esto último comprenderá habitualmente las denominadas sustituciones de aminoácidos “conservativas”, que implican por ejemplo sustituir un residuo de aminoácido ácido o básico dado por otro residuo de aminoácido ácido o básico.

Sin embargo, también habrá diferencias en la secuencia de aminácidos entre la replicasa defectuosa y la replicasa nativa (es decir, la proteína de 129 kD, 186 kD o 57 kD), de manera que la replicasa defectuosa ya no proporcionará actividad replicasa. El experto podrá seleccionar alteraciones apropiadas en la secuencia de aminoácidos de la replicasa nativa. Tal como quedará claro para el experto, una única alteración (de aminoácido o nucleótido) puede ser suficiente, o pueden requerirse dos o más de tales alteraciones, dependiendo de la posición y la naturaleza de la(s) alteración/alteraciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de la replicasa nativa.

Si una secuencia de polinucléotido dada codifica para una replicasa defectuosa según la invención, o al menos puede proteger a la planta frente a la infección con CGMMV, puede someterse a prueba simplemente transformando una planta, célula vegetal o material vegetal con un constructo que contiene dicha secuencia de polinucleótido, y exponiendo entonces la planta, célula vegetal, material vegetal y/o planta madura generada a partir de los mismos, a CGMMV en condiciones tales que la infección pueda producirse. Entonces, puede determinarse fácilmente si la secuencia/constructo de polinucleótido puede proteger a la planta, es decir, determinando adecuadamente la presencia del virus, o simplemente mediante la presencia o ausencia de síntomas de la infección por CGMMV.

En general, como mínimo, cuando la replicasa defectuosa contiene cualquier sustitución o inserción de aminoácidos, tendrá una homología de aminoácidos (es decir, identidad en la posición correspondiente) con la proteína replicasa nativa correspondiente de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, sin tener en cuenta las deleciones de aminoácidos, y teniendo en cuenta una inserción de un único aminoácido como una única alteración.

En general, como mínimo, cuando la replicasa defectuosa contiene una o más deleciones de aminoácidos, contendrá habitualmente al menos el 30%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 70% y habitualmente el 80-90%, y puede incluso contener tanto como el 95-99% de la secuencia de aminoácidos de la proteína replicasa nativa correspondiente, sin tener en cuenta ninguna inserción o sustitución de aminoácidos.

Una replicasa truncada basada en la secuencia de 129 kD contendrá habitualmente al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70% y puede contener tanto como el 80-95% de la secuencia de aminoácidos de la replicasa nativa. Una replicasa truncada basada en la secuencia de 186 kD puede contener la proteína de 129 kD completa seguida por uno o más aminoácidos de la secuencia de 57 kD, y habitualmente contiene la secuencia de 129 kD completa seguida por el 1-95%, preferiblemente el 5-50%, de la secuencia de 57 kD.

Las diferencias en la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente pueden ser diferencias en comparación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos facilitadas en SEQ ID 2, 4, 6 y/o 18, 20, 22, y/o en comparación con cualquier variante que se produce de manera natural de estas secuencias de aminoácidos. Estas diferencias son al menos tales que la proteína resultante no corresponde a una proteína nativa/que se produce de manera natural (incluyendo las facilitadas en SEQ ID 2, 4, 6 y/o 18, 20, 22).

Las secuencias de polinucleótido usadas en la invención son tales que codifican para las replicasas defectuosas anteriores. Para este fin, pueden contener los mismos codones que en las posiciones correspondientes en la secuencia de 129 kD, 186 kD y/o 57 kD nativa, o codones equivalentes a los mismos debido a la degeneración del código genético.

La secuencia de polinucleótido que codifica para la replicasa defectuosa puede proporcionarse de una manera conocida per se, por ejemplo partiendo de la secuencia conocida de las secuencias de 129 kD, 57 kD y/o 186 kD nativas, y/o de un ácido nucleico que codifica para dichas secuencias. Habitualmente, esto implicará introducir una o más deleciones, substituciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos, o incluso de uno o más codones en, o en comparación con, la secuencia nativa. Tales deleciones, sustituciones y/o inserciones se denominan conjuntamente a continuación en el presente documento “alteraciones”.

Por consiguiente, la secuencia de polinucleótido que codifica para la replicasa defectuosa puede ser una secuencia que contiene una o más de tales alteraciones en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos facilitadas en SEQ ID 1, 3, 5 y/o 17, 19, 21, y/o en comparación con cualquier variante que se produce de manera natural de estas secuencias de nucleótidos (incluyendo secuencias de ADN que corresponden a las secuencias de ARN tal como se presentan en el virus). Estas diferencias son al menos tales que la proteína codificada por la secuencia de polinucleótido no corresponde a una proteína nativa/que se produce de manera natural (incluyendo las facilitadas en SEQ ID 2, 4, 6 y/o 16, 18, 22).

Además, aparte de las alteraciones mencionadas anteriormente, y en comparación con las secuencias de nucleótidos facilitadas en SEQ ID 1, 3, 5 y/o 17, 19, 21 y/o en comparación con cualquier variante que se produce de manera natural de estas secuencias de ácido nucleico (incluyendo las secuencias de ADN que corresponden a las secuencias de ARN tal como se presentan en el virus), las secuencias de polinucleótido pueden contener además una o más alteraciones que conducen a un codón que codifica para el mismo aminoácido que el codón facilitado para la posición correspondiente en SEQ ID 1, 3, 5 y/o 17, 19, 21, y esto puede incluso conducir a una secuencia completa o totalmente artificial y/o sintética. Además, en comparación con secuencias de nucleótidos facilitadas en SEQ ID 1, 3, 5 y/o 17, 19, 21 y/o en comparación con cualquier variante que se produce de manera natural de estas secuencias de ácido nucleico (incluyendo las secuencias de ADN que corresponden a las secuencias de ARN tal como se presentan en el virus), las secuencias de polinucleótido pueden contener además una o más alteraciones que conducen a una sustitución de aminoácidos conservativa, es decir, tal como se mencionó anteriormente.

Proporcionar una secuencia de polinucleótido que contiene las alteraciones deseadas estará dentro de la experiencia del experto y puede implicar técnicas tales como síntesis de ácido nucleico usando una técnica de síntesis de ácido nucleico automatizada; introducción de mutaciones (puntuales) en un ácido nucleico que comprende las secuencias de 129 kD, 57 kD, y/o 186 kD nativas; y/o el uso de partes o fragmentos que se combinan adecuadamente de las secuencias de 129 kD, 57 kD y/o 186 kD, o cualquier combinación de las mismas. Además, al proporcionar una secuencia de polinucleótido de este tipo, el experto puede tener en cuenta la degeneración del código genético y/o sustituciones de aminoácidos conservativas, tal como se mencionó anteriormente.

Con el fin de proporcionar una secuencia de polinucleótido que codifica para una replicasa truncada tal como se definió anteriormente, se prefiere particularmente una técnica que implica la introducción de un codón de terminación en la secuencia nativa.

Una técnica particularmente preferida de introducción de las alteraciones anteriores, incluyendo codones de terminación, implica el uso de una reacción PCR, en la que se introducen las alteraciones deseadas en la(s) secuencia(s) amplificadas mediante el uso de cebadores modificados, es decir, cebadores que contienen un “apareamiento erróneo” adecuado en comparación con la secuencia de molde, conduciendo a la alteración deseada en la secuencia amplificada. Esta técnica basada en PCR puede usarse también para introducir uno o más sitios de restricción en la secuencia amplificada con el fin de facilitar la clonación de los productos de amplificación en los vectores de transformación deseados.

Tal como se describe adicionalmente en la parte experimental, esto puede implicar una única reacción PCR, pero también puede implicar dos o más reacciones PCR, conduciendo cada una a una parte de la secuencia final pretendida que codifica para la replicasa defectuosa en la que los cebadores (por ejemplo con la alteración deseada) forman los extremos de los fragmentos. Estos fragmentos pueden combinarse entonces, por ejemplo para proporcionar una secuencia de polinucleótido que comprende una combinación de tales fragmentos, y/o reconstituir la secuencia de 129 kD, 57 kD y/o 186 kD completa, que contiene ahora la alteración deseada en comparación con la secuencia nativa, tal como un codón de terminación.

Las reacciones PCR y las etapas adicionales tras la amplificación, tales como la combinación/unión de las secuencias amplificadas, puede llevarse a cabo de manera conocida per se, por ejemplo tal como se describe en la parte experimental y/o usando las técnicas descritas en el documento US-A-4.683.202; Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491 o PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, EE.UU.

Como molde para la reacción PCR, puede usarse una secuencia nucleica que codifica para la secuencia de 129 kD, 57 kD y/o 186 kD nativa, tal como un ADNc derivado de la secuencia de ARN nativa, o un plásmido que contiene tal secuencia, incluyendo los descritos en la parte experimental. El molde usado puede contener ya por sí mismo una o más alteraciones, en comparación con la secuencia nativa correspondiente.

Tal como se mencionó anteriormente, una alteración preferida implica la introducción de un codón de terminación en la secuencia de 129 kD o 186 kD, de manera que, tras su transformación en una planta, la secuencia de polinucleótido así obtenida provoca la expresión de una replicasa truncada. En particular, puede introducirse un codón de terminación de este tipo en una secuencia que corresponde a la secuencia de 129 kD nativa, más en particular a la parte de la secuencia nativa que corresponde al denominado motivo GDD o al denominado bucle P.

La secuencia de polinucleótido que codifica para la replicasa defectuosa está preferiblemente en forma de, por ejemplo, forma parte de y/o se incorpora dentro de, un constructo genético. El constructo genético es preferiblemente un constructo adecuado para la transformación de una planta, célula vegetal y/o material vegetal, tal como un plásmido, cósmido o vector, incluyendo vectores de cointegración o vectores binarios. El constructo genético puede ser ADN o ARN, y es preferiblemente ADNbc.

Preferiblemente, el constructo genético que comprende la secuencia de polinucleótido que codifica para la replicasa defectuosa se combina con el constructo genético que comprende la secuencia de polinucleótido que codifica para la secuencia en horquilla. Dotando a las plantas de estos constructos omnipotentes, puede generarse resistencia frente a diferentes cepas de un virus, preferiblemente el virus CGMMV, dependiendo de la vulnerabilidad de una cepa para un método particular de generación de resistencia.

Un constructo de este tipo puede contener además todos los elementos conocidos para constructos genéticos, y en particular para constructos genéticos destinados a la transformación de plantas, siempre que la presencia de los mismos no interfiera con la resistencia a CGMMV que va a proporcionarse mediante la secuencia de polinucleótido que codifica para la replicasa defectuosa. Algunos ejemplos no limitativos de tales elementos incluyen secuencias líder, terminadores, potenciadores, factores de integración, marcadores de selección, genes indicadores, etc., y los elementos adecuados estarán claros para el experto.

Estos elementos adicionales pueden derivarse o no de plantas, y pueden ser o no homólogos con respecto a la planta que va a transformarse con el constructo de la invención (denominado a continuación en el presente documento “planta diana”). Por ejemplo, los elementos adicionales pueden haberse derivado también de microorganismos, virus, etc., y pueden ser también elementos que están asociados de manera nativa con la secuencia de CGMMV, tal como la secuencia líder de CGMMV nativa (secuencia de UTR en 5’).

Las secuencias de nucleótidos que codifican para estos elementos adicionales pueden haberse aislado y/o derivado de una fuente que se produce de manera natural, por ejemplo como ADNc, y/o de fuentes disponibles conocidas (tales como plásmidos disponibles, etc.), y/o pueden haberse proporcionado de manera sintética usando técnicas de síntesis de ADN conocidas. Por ejemplo, un constructo de la invención contendrá habitualmente un promotor adecuado operativamente unido a la secuencia de polinucleótido que codifica para la replicasa defectuosa o la horquilla, por ejemplo de manera que puede dirigir la expresión de la secuencia de polinucleótido. Pueden elegirse promotores adecuados a partir de todos los promotores constitutivos, inducibles, específicos de tejido u otros que puedan dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos deseada en una planta y/o en parte de una planta, incluyendo tejidos específicos y/o células individuales de la planta. En particular, se usan promotores que son adecuados para su uso en especies de la familia Cucurbitaceae, tal como pepino.

Un promotor específicamente preferido es el promotor de plastocianina. El uso del promotor 35S se prefiere menos, ya que es menos fiable en pepino.

El terminador puede ser cualquier terminador que sea eficaz en plantas. Un terminador particularmente preferido es el terminador nos-3’.

El marcador de selección puede ser cualquier gen que pueda usarse para seleccionar, en condiciones adecuadas tales como el uso de un medio de selección adecuado, plantas, material vegetal y células vegetales que contienen, por ejemplo como resultado de una transformación satisfactoria, el constructo genético que contiene el marcador. Un marcador de selección particularmente preferido es el gen nptII, que puede seleccionarse para usar kanamicina.

El constructo de la invención contiene además preferiblemente una secuencia líder. Puede usarse cualquier secuencia líder adecuada, incluyendo las de origen viral. Preferiblemente, se usa una secuencia líder esencialmente idéntica a la región no traducida en 5’ (UTR en 5’) del genoma de CGMMV. Esta puede derivarse de ARN viral, o puede proporcionarse sintéticamente, por ejemplo tal como se describe en la parte experimental.

Aunque no se prefiere, la invención también abarca constructos que codifican para una fusión de una replicasa defectuosa tal como se mencionó anteriormente, y al menos una secuencia de aminoácidos adicional, tal como una proteína o un polipéptido, o una parte o un fragmento de los mismos. Preferiblemente, la expresión de una replicasa defectuosa como (parte de) una fusión de este tipo no disminuye la actividad biológica deseada (es decir, protección frente a la infección con CGMMV).

El constructo de la invención puede proporcionarse de una manera conocida per se, lo que generalmente implica técnicas tales como restringir y unir ácidos nucleicos/secuencias de ácido nucleico, para lo que se hace referencia a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2ª ed.), vols. 13, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) de F. Ausubel et al, eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987).

Según una realización, el constructo genético está preferiblemente (también) en una forma que puede mantenerse estable o heredarse en un microorganismo, en particular una bacteria, más en particular una bacteria que puede usarse para transformar una planta o material vegetal, tal como Agrobacterium. En un aspecto adicional, la invención también se refiere a un microorganismo de este tipo, en particular una bacteria, más en particular una bacteria que puede usarse para transformar una planta, tal como Agrobacterium, que contiene un constructo genético según la invención.

El constructo genético puede transformarse en la planta, célula vegetal o material vegetal diana mediante cualquier técnica de transformación adecuada conocida per se, incluyendo transformación con Agrobacterium, transformación con ADN “denudado”, por ejemplo a través de bombardeo de partículas o transformación de protoplastos a través de electroporación o tratamiento con PEG.

Ejemplos de vectores adecuados para su uso con Agrobacterium son por ejemplo vectores binarios tales como pBI121 y derivados del mismo; vectores de cointegración tales como pGV1500 y derivados de pBR322. Los sistemas adecuados para la transformación con ADN denudado incluyen vectores de E. coli con alto número de copias, tales como vectores pUC y vectores pBluescript II (SK+).

Tras la transformación, el constructo puede incorporarse por ejemplo en el ADN genómico de la planta, o puede mantenerse/heredarse independientemente en la planta (célula).

En un aspecto adicional, la invención comprende por tanto un método en el que una planta, célula vegetal o material vegetal se transforma con un constructo genético tal como se describió anteriormente.

Este método puede comprender también cultivar el material vegetal o la célula vegetal transformada en una planta madura, y puede comprender también reproducir o multiplicar sexual o asexualmente la planta transformada (y/o la planta madura obtenida a partir del material vegetal o la célula vegetal transformada).

Por tanto, la invención también describe una planta, célula vegetal o material vegetal que se ha transformado con, o más generalmente contiene, un constructo genético tal como se describió anteriormente. Preferiblemente, una planta, célula vegetal o material vegetal de este tipo es resistente frente a la infección con CGMMV tal como se describe en el presente documento.

La invención se refiere además a material de cultivo tal como semilla, tubérculos, raíces, tallos, plántulas etc. para una planta de este tipo, así como a descendientes de una planta de este tipo, obtenidos a través de técnicas de reproducción sexual o asexual. Tal material de cultivo y/o descendientes contienen todavía o han heredado lo más preferiblemente el constructo genético de la invención, y más preferiblemente también son resistentes frente a la infección con CGMMV tal como se describe en el presente documento.

La invención se ilustrará ahora por medio de la siguiente parte experimental no limitativa y por medio de las figuras, en las que:

-: la figura 1 es una representación esquemática del genoma de CGMMV;

-: la figura 2 proporciona un árbol filogenético de la proteína de cubierta (cp) de CGMMV para CGMMV-SH y los diez aislados europeos, usando el método de J. Hein con una tabla de residuos ponderados.

-Las figuras 3 - 10 muestran ejemplos de algunos constructos genéticos preferidos de la invención, es decir los enumerados en la tabla 6 más adelante.

Además, en la parte experimental a continuación en el presente documento, se usaron habitualmente enzimas, kits, etc. según las instrucciones del fabricante y/o usando protocolos bien establecidos, a menos que se indique lo contrario.

Parte experimental

Ejemplo I: Clonación de los genes de proteína de cubierta de 10 aislados de CGMMV

1.: Recogida de los aislados de CGMMV

Para hacer uso de la estrategia de protección mediada por proteína de cubierta (CPMP) frente a CGMMV, es necesario clonar los cistrones de proteína de cubierta de los aislados, que son importantes desde un punto de vista económico. Como la única información de secuencia disponible para CGMMV se deriva de cepas de sandía del Lejano Oriente, se decidió en primer lugar recoger aislados de CGMMV de importantes zonas de cultivo de pepino en Europa y la zona mediterránea. La tabla 1 enumera los aislados recogidos de diversas zonas geográficas. Se propagaron todos los aislados en pepino, y se almacenó el material de hoja infectado a -80°C. En la tabla 1, se enumeran los síntomas obtenidos tras la infección de pepino cv. Hokus.

2.: Diseño de cebadores de PCR

Existe la posibilidad de divergencia de secuencia entre los diversos aislados recogidos, y entre los aislados y las secuencias publicadas de CGMMV-SH y CGMMV-W. Para identificar regiones de nucleótidos con un alto grado de conservación de secuencia, que pudieran servir como base para el diseño de cebadores de PCR, se llevó a cabo un estudio de alineación con secuencias correspondientes de CGMMV-SH, CGMMV-W y de algunos otros miembros relacionados del grupo de tobamovirus: virus del mosaico del cáñamo Sunn (SHMV, una variante de TMV) y virus del moteado atenuado del pimiento (PMMV). Para este fin, se compararon una región de 800 nucleótidos justo en 5’ del cistrón de la proteína de cubierta y una región de 170 nucleótidos que forma el extremo 3’ alejado del genoma viral. En esta alineación de secuencias, se identificaron regiones con suficiente homología de secuencia entre todos los virus comparados. Basándose en estas secuencias, se diseñaron conjuntos de cebadores de PCR, que se enumeran en la tabla 2.

Tabla 2. Diseño de cebadores para la amplificación por RT-PCR de secuencias de proteína de cubierta de aislados de CGMMV.

Cebadores: Secuencia posición en la secuencia de CGMMV-SH

cebadores 5’

97G01: AGGTGTCAGTGGAGAACTCATTGA 5004

97G02: GGCGTTGTGGTTTGTGG 5210

97G03: CTGTAGGGGTGGTGCTACTGT 5248

cebador 3’

97G18: GCCCATAGAAACTTCAACGTC 6370

3. Amplificación de las regiones de proteína de cubierta

A partir de material de hoja de plantas de pepino infectadas con cada uno de los 11 aislados descritos en la tabla 1,

10 se preparó una extracción de ARN total. Usando cada uno de los cebadores 5’ enumerados en la tabla 2 en combinación con el cebador 3’ 97G18, se estableció la transcripción inversa de ARN y amplificación por PCR de ADNc con una temperatura de hibridación de 55°C usando un kit fabricado por Perkin Elmer Cetus. Especialmente en las reacciones con el cebador 5’ 97G03, se obtuvieron productos de amplificación del tamaño correcto para cada una de las 11 muestras de ARN. Se clonaron directamente los productos de amplificación de PCR en el vector de

15 clonación de T/A pCR2.1 y se introdujeron en E. coli cepa INVαF’. Para cada una de las muestras de ARN, se verificó el tamaño correcto del producto clonado (1,12 kb), y se almacenaron los clones a -80°C. Los productos de amplificación de los aislados 1 a 10 de CGMMV clonados en pCR2.1 se designaron como pKG4301 a pKG4310, y el de CGMMV-SH clonado en pCR2.1 se designó como pKG4311.

20 4. Análisis de la secuencia de nucleótidos de los cistrones de proteína de cubierta

Se determinaron las secuencias de los insertos completos de los plásmidos pKG4301 a pKG4310 mediante la lectura en ambos sentidos usando los cebadores de secuenciación m13 directo en m13 inverso. La secuencia del inserto de pKG4311 ya se conocía, puesto que este plásmido contiene un fragmento de ADNc de CGMMV-SH.

25 El análisis de secuencia confirmó que en cada caso, en efecto, se había obtenido y clonado el fragmento correcto de ADNc de CGMMV. Con una excepción, cada fragmento amplificado y clonado de ADNc consistía en 1123 pares de bases, que contenían el cistrón de la proteína de cubierta de CGMMV y una gran parte del cistrón de la proteína de movimiento de CGMMV.

30 Las secuencias clonadas de todos los aislados europeos recogidos (aislados 1 a 10) son homólogas en aproximadamente el 97% entre sí, pero difieren en promedio en el 10% de la secuencia publicada de CGMMV-SH. La comparación de cada secuencia individual reveló, que los aislados 1 y 2, ambos de la Europa del Este, son extremadamente parecidos. Se encontró el mismo alto grado de identidad entre ambos aislados de invernaderos de

35 pepino en los Países Bajos (aislados 4 y 5) y entre ambos aislados obtenidos de la zona de Almería en España (aislados 9 y 10). Ninguna de las secuencias de ADNc era idéntica al 100% a ninguna de las otras, pero las diferencias en la secuencia no son de más de unos cuantos nucleótidos, y algunas veces de sólo un nucleótido en la región codificante del cistrón de la proteína de cubierta. El aislado japonés CGMMV-SH es claramente diferente de cualquiera de los aislados europeos.

40

5. Análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína de cubierta

Basándose en las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura abiertos (ORF) de los cistrones de proteína de cubierta de los 10 aislados, pudo deducirse la secuencia de aminoácidos. En cada una de las secuencias

45 analizadas, el ORF consistía en una región de 486 nucleótidos, que codifica para una proteína de 161 residuos de aminoácidos. La masa molecular predicha de esta proteína es de 17,3 kD, correspondiente a los resultados publicados anteriormente. La homología entre las secuencias de proteína predichas de los diversos aislados es de hasta el 98,1%. Las únicas desviaciones se encuentran para el residuo de aminoácido 19 (habitualmente valina), el residuo 65 (principalmente serina) y el residuo 84 (principalmente leucina).

50 La secuencia de la proteína de cubierta del aislado japonés CGMMV-SH sólo difiere en 1 aminoácido (residuo 65) de la secuencia consenso.

Ejemplo II: Clonación del gen de replicasa de CGMMV

1. Estrategia para la protección mediada por replicasa

5 A modo de ejemplo, se investigaron dos enfoques para la protección mediada por replicasa (RMP) frente a infecciones virales en plantas.

Un enfoque hace uso de genes de replicasa defectuosos en la forma de marcos de lectura abiertos (ORF) truncados, en los que se ha truncado la secuencia en sentido 3’ desde el motivo GDD o se ha alterado a través de 10 mutación.

El otro enfoque hace uso de la expresión de la “ultralectura” de parte del gen de replicasa, es decir la secuencia de 57 kD. Se cree que este ORF no se traduce en la célula vegetal, sino que forma parte de un ORF de “ultralectura” mayor que combina las regiones codificantes tanto del gen de la replicasa de 129 kD como del supuesto gen de la

15 proteína de 57 kD, dando como resultado una proteína de 189 kD. Sin embargo, simplemente la expresión del ORF de la proteína de 57 kD en células vegetales puede dar como resultado una resistencia a la infección extremadamente fuerte tanto mediante partículas virales como ARN viral, que también podría resistir altas temperaturas, así como altas concentraciones de inóculo. Para cualquiera de estos enfoques, o bien debe clonarse el gen de replicasa de CGMMV de longitud completa, o

20 bien deben clonarse las partes constituyentes por separado.

2. Diseño de cebadores

Dada la alta homología de secuencia de los genes de proteína de cubierta de 11 aislados de CGMMV se supuso

25 que las secuencias de los genes de replicasa de los diversos aislados también estarían altamente conservadas. Basándose en la secuencia completa del aislado CGMMV-SH, se diseñaron cebadores para la amplificación por PCR del ORF de 57 kD y del ORF de 129 kD (tablas 3 y 4). Se diseñaron los cebadores de manera que contuviesen sitios de restricción para la futura clonación de los productos de amplificación. Los cebadores 5’ contienen un sitio NcoI situado de manera que coincidirá con el codón de iniciación ATG del ORF amplificado. Los cebadores 3’

30 contienen un sitio SacI en sentido 3’ del codón de terminación.

Tabla 3. Diseño de cebadores para la amplificación por LR-RT-PCR de la secuencia de replicasa de 57 kD de CGMMV.

Cebadores: secuencia posición en la secuencia de CGMMV-SH

cebador 5’

98A88: CCATGGAGAATTCGCTGTATGTCC 3497

cebador 3’

98A86: CGAGCTCTCGACTGACACCTTAC 5001

Tabla 4. Diseño de cebadores para la amplificación por LR-RT-PCR de la secuencia del gen de la replicasa de 129 kD de CGMMV.

Cebadores: secuencia posición en la secuencia de CGMMV-SH

cebadores 5’

98A84: CCATGGCAAACATTAATGAAC 59

98A85: CAACCATGGCAAACATTAATG 56

cebador 3’

98G63: TAACAGGGAGGAAAATATTACG

3. Reacciones en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa de largo alcance

40 A partir de la secuencia conocida de CGMMV-SH se derivó que el tamaño del gen de la proteína de 57 kD es de 1,5 kb. Un tamaño tal está en el límite del intervalo de tamaño que puede amplificarse en una PCR con Taq polimerasa convencional. Para la amplificación de este fragmento de ADNc, y ciertamente para la amplificación del fragmento de ADNc para el gen de la replicasa de 129 kD, debe usarse una polimerasa diferente adecuada para amplificaciones a largo alcance. En estos experimentos, se usó rTth ADN polimerasa.

45 Para la amplificación directa de fragmentos de ADNc a partir de extracciones de ARN total se emplea normalmente un kit de RT-PCR, que combina en una reacción la actividad de la transcriptasa inversa (RT), produciendo una única cadena de ADNc complementaria a la cadena molde de ARN que comienza en un cebador hibridado con el extremo 3’ de las moléculas de ARN, y la actividad de la polimerasa, amplificando la molécula de ADNc monocatenaria así producida en un modo de PCR normal.

Dada la necesidad de usar polimerasa de largo alcance, se intentó combinar la RT con la polimerasa de largo alcance para producir en una reacción productos de amplificación de gran tamaño directamente a partir de extractos de ARN total. Este tipo de reacción se denominó una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa de largo alcance (LR-RT-PCR).

4.: Amplificación por LR-RT-PCR y clonación del gen de la proteína de 57 kD

Usando los cebadores enumerados en la tabla 3 y la LR-RT-PCR descrita anteriormente, se obtuvo un producto de amplificación específico de 1,55 kb a partir de extractos de ARN total de hojas de pepino infectadas con CGMMV-4. Se eligió este aislado, ya que se originó a partir de los cultivos de invernadero de pepino holandés, y por tanto representaría un aislado importante desde el punto de vista económico. Dado que las polimerasas de largo alcance contienen una actividad “de corrección de lectura” y no dejan adiciones de A en los productos de amplificación, como lo hace la Taq polimerasa empleada normalmente en PCR, no fue posible la clonación directa de los productos de amplificación en un vector de TA que albergue las adiciones de A. Por tanto, los productos de amplificación se trataron brevemente con Taq polimerasa, dando como resultado la adición de proyecciones de A en las moléculas de ADN amplificadas. Estas moléculas pudieron clonarse entonces fácilmente en el vector de TA pCR2.1, y se transformaron en E. coli MC1061. Se almacenaron los clones con el tamaño de inserto correcto de 1,5 kb a -80°C y se conocen como pKG4321.

5.: Análisis de secuencia del gen de la proteína de 57 kD

Se determinó la secuencia de nucleótidos del inserto clonado de pKG4321 se determinó mediante secuenciación de doble cadena usando cebadores m13 directo en m13 inverso y posteriores etapas de paseo con cebadores. La codificación de ORF para un supuesto gen de la proteína de 57 kD (SEQ ID no 3) mostró una homología del 90% al nivel de nucleótidos con la correspondiente secuencia del aislado japonés CGMMV-SH (SEQ ID no 19). La secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID no 4) muestra una homología del 98,2% con respecto a la predicha mediante la secuencia CGMMV-SH (SEQ ID no 20).

El motivo GDD característico de los genes de replicasas virales reside en los residuos de aminoácidos 364-366.

6.: Amplificación por LR-RT-PCR y clonación del gen de la replicasa de 129 kD

Usando los cebadores enumerados en la tabla 4 en una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa de largo alcance tal como se describe en el punto 3, se obtuvo un producto de amplificación específico de 3,5 kb que representa el gen de la replicasa de 129 kD viral a partir de ARN total de hojas de pepino infectadas con el aislado 4 de CGMMV (tabla 1). Dado que las polimerasas de largo alcance contienen una actividad “de corrección de lectura” y no dejan adiciones de A en los productos de amplificación, como lo hace la Taq polimerasa empleada normalmente en PCR, no fue posible la clonación directa de los productos de amplificación en un vector de TA que albergue las adiciones de A. Por tanto, los productos de amplificación se trataron brevemente con Taq polimerasa, dando como resultado la adición de proyecciones de A en las moléculas de ADN amplificadas. Estas moléculas pudieron clonarse fácilmente en el vector de TA pCR2.1, y se transformaron en E. coli MC1061. Se almacenaron los clones con el tamaño de inserto correcto de 3,5 kb a -80°C y se conocen como pKG4322.

7.: Análisis de secuencia del gen de la proteína de 129 kD

Se determinó la secuencia de nucleótidos del producto de amplificación clonado en pKG4322 mediante secuenciación de doble cadena usando los cebadores m13 directo en m13 inverso, y una estrategia de paseo con cebadores. La codificación de ORF para el gen de la replicasa de 129 kD (SEQ ID no 1) mostró una homología del 88% al nivel de nucleótidos con la correspondiente secuencia del aislado japonés CGMMV-SH (SEQ ID no 17). El ORF del aislado de invernadero de pepino holandés codifica para una proteína replicasa de 1144 aminoácidos, que tiene un aminoácido adicional en comparación con la cepa CGMMV-SH. La secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID no. 2) muestra una homología del 97,1% con respecto a la predicha mediante la secuencia CGMMV-SH (SEQ ID no 18).

Se encuentran dos motivos GDD en los residuos de aminoácidos 256-258 y 540-542.

8. Mutagénesis dirigida al sitio del ORF de 129 kD

Tal como se explicó anteriormente, un enfoque para obtener RMP en células vegetales era hacer uso de genes de

replicasa truncados o bien en el motivo GDD, o bien truncados en el bucle P del dominio helicasa. Para crear

casetes de expresión génica que llevan tales genes truncados, se siguió un enfoque de mutagénesis dirigida al sitio

5 para introducir codones de terminación en las posiciones requeridas en el ORF. Para este fin, se volvieron a

amplificar varias partes del ORF de replicasa de 129 kD de pKG4322 como molde usando cebadores diseñados

específicamente que incluían sitios de restricción únicos para un futuro nuevo ensamblaje de los productos así

amplificados, así como las mutaciones requeridas en la forma de codones de terminación (tabla 5). Estos codones

de terminación deben garantizar el truncamiento apropiado de la traducción de la proteína. Se diseñaron varios 10 codones de terminación uno después del otro en los tres marcos de lectura en estos cebadores, garantizando así

una mutación deficiente en la traducción eficaz.

Tabla 5. Diseño de cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio del gen de la replicasa de 129 kD de CGMMV.

Cebadores: secuencia

98L99: GAGCTCGGATCCACTAGTAACGGC

98L107: TAGAGCTCTTGAAGCTAAGCAAATTCCG

98L108: TTCAAGAGCTCTAATCACCGAAGACAAAGGC

98L102: GAATTATATCGATTATCTATCGGC

98L103: GATAATCGATATAATTCTTCATCTGCC

98L104: AACTAGTAATTGATGATCTGTTCAAGAAG

98L105: AATTACTAGTTTCCGGAAGCAAGCAGCTCAG

98L106: GCCCTCTAGATGCATGCTCGAG

15 Usando los cebadores 98L103 y 98L104, se amplificó un fragmento de la mitad en sentido 3’ del gen de 129 kD desde el motivo GDD hasta el sitio ClaI, mientras que simultáneamente se introdujeron codones de terminación en el sitio del motivo GDD. Este fragmento clonado en el vector de TA pCR2.1 se denominó pKG4325.

Usando los cebadores 98L105 y 98L106, se amplificó un fragmento correspondiente a la mitad en 5’ del gen de 129

20 kD hasta el motivo GDD, mientras que simultáneamente se introdujo un codón de terminación en el sitio del motivo GDD. Este fragmento clonado en el vector de T/A pCR2.1 se denominó pKG4326.

Sustituyendo un fragmento de XbaI-ClaI de pKG4322 con los productos amplificados combinados de pKG4325 y pKG4326 se reconstituye el ORF de replicasa de 129 kD de longitud completa de pKG4322 con codones de

25 terminación introducidos en el sitio del motivo GDD. Este constructo se denomina pKG 4329.

Usando los cebadores 98L99 y 98L107, se amplificó un fragmento en el extremo en 3’ alejado del gen de 129 kD del bucle P con respecto al extremo del ORF, mientras que simultáneamente se introdujeron codones de terminación en el sitio del bucle P. Este fragmento clonado en el vector de T/A pCR2.1 se denominó pKG4327.

30 Usando los cebadores 98L108 y 98L102, se amplificó un fragmento correspondiente a una parte central del gen de 129 kD desde el motivo GDD hasta el bucle P, mientras que simultáneamente se introdujo un codón de terminación en el sitio del bucle P. Este fragmento clonado en el vector de T/A pCR2.1 se denominó pKG4328.

35 Sustituyendo un fragmento de BamHI-ClaI de pKG4322 con los productos amplificados combinados de pKG4327 y pKG4328 se reconstituye el ORF de replicasa de 129 kD de longitud completa de pKG4322 con codones de terminación introducidos en el sitio del bucle P. Este constructo se denomina pKG4330.

Ejemplo III: Transformación de pepino 40

1. Construcción de una secuencia líder de CGMMV

Para la expresión y estabilidad óptimas de los transcritos de gen de replicasa en células vegetales, se pensaba que era necesario añadir una secuencia idéntica a la región no traducida en 5’ (5’ UTR) del genoma de CGMMV en

45 sentido 5’ desde la secuencia del ORF en el casete de expresión de la planta. Dado que la 5’ UTR de genomas virales contienen ARN sumamente repetitivo, esta secuencia podría no obtenerse mediante amplificación por RTPCR, ya que no podría diseñarse cebadores específicos. En su lugar, se ensambló una región sintética idéntica a la 5’ UTR de CGMMV-SH de las cuatro secuencias de oligonucleótido:

- 97G40 (CTAGAGTTTTAATTTTTATAATTAAACAAA),

97G41 (TCAAAATTAAAAATATTAATTTGTTTGTTGTTGTTG),

97G42 (CAACAACAACAACAACAAACAATTTTAAAACAACAC) y 5 97G43 (TTGTTGTTTGTTAAAATTTTGTTGTGGTAC).

Estos oligonucleótidos se diseñaron de manera que en el exterior de la secuencia correspondiente a la 5’ UTR contienen sitios de restricción para XbaI y NcoI, facilitando así adicionalmente la clonación. La adición de los cuatro 10 oligonucleótidos juntos provocará el ensamblaje espontáneo debido al diseño de extensas regiones de proyección. Usando estos sitios de restricción, se clonó la mezcla ensamblada en un vector de expresión de planta que contenía un promotor de plastocianina de Arabidopsis thaliana (Vorst et al., 1993) y una secuencia de terminación de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982) en un plásmido derivado de pUC19. Este casete de expresión se denominó pKG1315. El casete de expresión completo que consiste en el promotor de plastocianina, la

15 secuencia líder de CGMMV y el terminador nos se eliminó posteriormente de pKG1315 usando HindIII y EcoRI como enzimas de restricción, y se volvió a clonar en los correspondientes sitios de restricción de:

1) un vector de transformación de Agrobacterium de tipo intermedio para sistemas de vector de tipo cointegrado que contienen un casete de gen marcador seleccionable nptII para crear pKG1575, y

20 2) un vector de transformación de Agrobacterium de tipo intermedio para sistemas de vector de tipo cointegrado que no contienen gen marcador seleccionable para crear pKG1110.

2. Construcción de vectores de transformación

25 Se aislaron los tres constructos de replicasa clonados y modificados de pKG4321, pKG4329 y pKG4330 de los plásmidos mediante restricción con BamHI (rellenado con Klenow) y NcoI y se ligaron en los sitios SacI (rellenado con Klenow) y NcoI de cada uno de los dos vectores de transformación pKG1575 y pKG1110, dando como resultado un total de seis vectores de transformación, enumerados en la tabla 6.

30 Tabla 6. Lista de seis vectores de transformación para la expresión en plantas de partes del gen de la replicasa de CGMMV.

Vector: tipo de vector gen de replicasa de CGMMV modificado

PKG4331: Tipo intermedio con nptII ORF de 57 kD

PKG4332: Tipo intermedio con nptII ORF de 129 kD con codón de terminación en el motivo GDD

PKG4333: Tipo intermedio con nptII ORF de 129 kD con codón de terminación en el bucle P

PKG4334: Tipo intermedio ORF de 57 kD

PKG4335: Tipo intermedio ORF de 129 kD con codón de terminación en el motivo GDD

PKG4336: Tipo intermedio ORF de 129 kD con codón de terminación en el bucle P

3. Transformación de pepino

35 Se introdujeron Los vectores de transformación de tipo intermedio pKG4331 y pKG4333 en Agrobacterium tumefaciens cepa GV2260 mediante conjugación triparental. Se seleccionaron los transconjugantes que habían incorporado el vector de tipo intermedio en sus plásmidos Ti a través de recombinación homóloga basándose en resistencia a estreptomicina y espectinomicina y se analizaron para determinar la inserción correcta del vector.

40 Se transformaron plantas de pepino con estas dos cepas de Agrobacterium, así como con una cepa de Agrobacterium que alberga sólo el marcador de selección nptII, usando procedimientos publicados. Se obtuvieron varias plantas transgénicas de pepino. Se transfirieron las plantas a un invernadero para la floración y fijación de la semilla. Se infectaron mecánicamente las plántulas que germinaron a partir de esta semilla R1 con el aislado de CGMMV 1-3 semanas tras la inoculación, se puntuaron las plantas para los síntomas de infección viral, tal como se

45 describe en el ensayo para la tolerancia a la infección viral expuesto en el punto 4. a continuación.

4. Ensayo para la tolerancia a la infección viral

Se infectaron mecánicamente las plántulas que germinaron a partir de esta semilla R1 con el aislado de CGMMV. Se 50 preparó un inóculo nuevo a partir de un extracto de hojas en bruto de plantas de pepino no transgénicas susceptibles cv. Hokus infectadas previamente con este mismo aislado 3 semanas antes. Se usaron plántulas de plantas de pepino no transformadas como controles en el ensayo. Durante 21 días tras la inoculación, se puntuó visualmente el aspecto de los síntomas virales cada 2 días. En este ensayo, se puntúan plantas individuales como que son tolerantes cuando permanecen libres de síntomas visibles durante al menos 7 días, y preferiblemente más

5 de 14 días, y más preferiblemente más de 21 días tras la inoculación.

Se sometieron a ensayo sesenta y cuatro líneas transgénicas independientes, con de 14 a 20 plántulas para cada línea. Las plántulas de control enfermaron todas en el plazo de 9 días tras la inoculación. Varias plántulas en diecisiete de las líneas transgénicas mostraron una clara ausencia de síntomas durante un periodo de tiempo 10 prolongado, y permanecieron libres de síntomas después de 21 días tras la inoculación. De algunas líneas transgénicas, el número de plantas libres de síntomas correspondía a la segregación mendeliana de un transgén presente en un único locus. En una línea de pepino transgénica particular, 4 de 14 plántulas permanecieron libres de síntomas durante el periodo de ensayo, lo que puede indicar que el fenotipo tolerante corresponde al estado homocigoto de un transgén presente en un único locus, aunque, tal como se mencionó anteriormente, la invención

15 no se limita a un mecanismo específico.

Ejemplo IV

1. Construcción de constructo de ARN en horquilla 20

1.1. Organización genómica de CGMMV

El genoma de CGMMV consiste en una molécula de ARN monocatenario que codifica para una proteína de 129 kD con función de replicasa (ARN polimerasa dependiente de ARN), una supuesta proteína de 54 kD, una proteína de

25 movimiento de 29 kD y una proteína de cubierta de 17,3 kD. La presencia de la proteína de 54 kD no se ha detectado en plantas infectadas. Sin embargo, se ha encontrado en su lugar una proteína de 186 kD, que es el producto de una traducción de ultralectura de los marcos de lectura abiertos de 129 kD y 54 kD. También se cree que la proteína de 186 kD desempeña un papel en la replicación viral. La estructura genómica de CGMMV es por tanto muy similar a la de otros miembros del grupo de tobamovirus.

30 Sólo se ha determinado la secuencia completa de un aislado de CGMMV (Ugaki et al., 1991; números de registro Genbank D12505 y D01188). Este aislado “SH” se ha encontrado en plantas de sandía infectadas en Asia Oriental. Además, se conoce la secuencia del gen de la proteína de cubierta de otro aislado (“W”) obtenido a partir de sandía infectada (Meshi et al., 1983; números de registro Genbank V01551 y J02054), así como la secuencia del gen de la

35 proteína de movimiento de 29 kD de una cepa de sandía (Saito et al., 1988; número de registro Genbank J04332). La secuencia de nucleótidos del aislado CGMMV-SH muestra una identidad del 55 al 56% con el virus del mosaico del tabaco (TMV) y virus del mosaico verde atenuado del tabaco (TMGMV), que son ambos otros miembros del grupo de tobamovirus (Ugaki et al., 1991).

40 1.2. Clonación del gen RdRp de CGMMV

En el presente ejemplo de la invención, la secuencia elegida para construir los constructos es la ARN polimerasa dependiente de ARN de CGMMV.

45 a. Diseño de cebadores

Dada la alta homología de secuencia de los genes de proteína de cubierta de 11 aislados de CGMMV se supuso que las secuencias de los genes de replicasa de los diversos aislados también estarían altamente conservadas. Basándose en la secuencia completa del aislado CGMMV-SH, se diseñaron cebadores para la amplificación por

50 PCR del ORF de 54 kD y del ORF de 129 kD (tablas 7 y 8). Se diseñaron los cebadores de manera que contuviesen sitios de restricción para la futura clonación de los productos de amplificación. Los cebadores 5’ contienen un sitio NcoI situado de manera que coincidirá con el codón de iniciación ATG del ORF amplificado. Los cebadores 3’ contienen un sitio SacI en sentido 3’ del codón de terminación.

55 Tabla 7. Diseño de cebadores para la amplificación por LR-RT-PCR de la secuencia de replicasa de 54 kD de CGMMV.

cebadores: secuencia posición en la secuencia de CGMMV-SH

cebador 5’

98A88: CCATGGAGAATTCGCTGTATGTCC 3497

cebador 3’

98A86: CGAGCTCTCGACTGACACCTTAC 5001

Tabla 8. Diseño de cebadores para la amplificación por LR-RT-PCR de la secuencia del gen de la replicasa de 129 kD de CGMMV.

cebadores: secuencia posición en la secuencia de CGMMV-SH

cebador 5’

98A84: CCATGGCAAACATTAATGAAC 59

98A85: CAACCATGGCAAACATTAATG 56

cebador 3’

98G63: TAACAGGGAGGAAAATATTAC

5 b. Reacciones en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa de largo alcance

A partir de la secuencia conocida de CGMMV-SH quedó claro, que el tamaño del gen de la proteína de 54 kD es 1,5 kb. Un tamaño tal está en el límite del intervalo de tamaño que puede amplificarse en una PCR con Taq polimerasa convencional. Para la amplificación de este fragmento de ADNc, y ciertamente para la amplificación del fragmento

10 de ADNc para el gen de la replicasa de 129 kD, debe usarse una polimerasa diferente adecuada para amplificaciones a largo alcance. En estos experimentos, se usó una polimerasa de largo alcance.

Para la amplificación directa de fragmentos de ADNc a partir de extracciones de ARN total, se emplea normalmente un kit de RT-PCR, que combina en una reacción la actividad de la transcriptasa inversa (RT), produciendo una única

15 cadena de ADNc complementaria a la cadena molde de ARN que comienza en un cebador hibridado con el extremo 3’ de las moléculas de ARN, y la actividad de la polimerasa, amplificando la molécula de ADNc monocatenaria así producida en un modo de PCR normal. Dada la necesidad de usar polimerasa de largo alcance, se intentó combinar la RT con la polimerasa de largo alcance para producir en una reacción productos de amplificación de gran tamaño directamente a partir de extractos

20 de ARN total. Este tipo de reacción se denominó una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa de largo alcance (LR-RT-PCR).

c. Amplificación por LR-RT-PCR y clonación del gen de la proteína de 54 kD

25 Usando los cebadores enumerados en la tabla 1 y la LR-RT-PCR descrita anteriormente, se obtuvo un producto de amplificación específico de 1,5 kb a partir de extractos de ARN total de hojas de pepino infectadas con CGMMV-4. Se eligió este aislado, ya que se originó a partir de los cultivos de invernadero de pepino holandés, y por tanto representaría un aislado importante desde el punto de vista económico. Dado que las polimerasas de largo alcance que contienen una actividad “de corrección de lectura” y no dejan adiciones de A en los productos de amplificación,

30 como lo hace la Taq polimerasa empleada normalmente en PCR, no fue posible la clonación directa de los productos de amplificación en un vector de T/A que albergue las adiciones de A. Por tanto, los productos de amplificación se trataron brevemente con Taq polimerasa, dando como resultado la adición de proyecciones de A en las moléculas de ADN amplificadas. Estas moléculas pudieron clonarse entonces fácilmente en el vector de T/A pCR2.1, y se transformaron en E. coli MC1061. Se almacenaron los clones con el tamaño de inserto correcto de 1,5

35 kb a -80°C y se conocen como pKG4321.

d. Análisis de secuencia del gen de la proteína de 54 kD

Se determinó la secuencia de nucleótidos del inserto clonado de pKG4321 mediante secuenciación de doble cadena

40 usando los cebadores m13 directo en m13 inverso. La codificación de ORF para un supuesto gen de la proteína de 54 kD mostró una homología del 90% al nivel de nucleótidos con la correspondiente secuencia del aislado japonés CGMMV-SH. La secuencia de aminoácidos predicha muestra una homología del 98,2% con respecto a la predicha mediante la secuencia CGMMV-SH.

45 El motivo GDD característico de los genes de replicasas virales reside en los residuos de aminoácidos 364-366.

e. Amplificación por LR-RT-PCR y clonación del gen de la replicasa de 129 kD

Usando los cebadores enumerados en la tabla 9 en una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa

50 inversa de largo alcance tal como se describe en el punto 6.2.3, se obtuvo un producto de amplificación específico de 3,5 kb que representa el gen de la replicasa de 129 kD viral a partir de ARN total de hojas de pepino infectadas con el aislado 4 de CGMMV (tabla 1). Dado que las polimerasas de largo alcance que contienen una actividad “de corrección de lectura” y no dejan adiciones de A en los productos de amplificación, como lo hace la Taq polimerasa empleada normalmente en PCR, no fue posible la clonación directa de los productos de amplificación en un vector

55 de T/A que albergue adiciones de A. Por tanto, los productos de amplificación se trataron brevemente con Taq polimerasa, dando como resultado la adición de proyecciones de A en las moléculas de ADN amplificadas. Estas moléculas pudieron clonarse fácilmente en el vector de T/A pCR2.1, y se transformaron en E. coli MC1061. Se almacenaron los clones con el tamaño de inserto correcto de 3,5 kb a -80°C y se conocen como pKG4322.

Tabla 9. Diseño de cebadores para la amplificación por PCR de secuencias diana de CGMMV y secuencias de intrón de plantas, que van a ensamblarse en constructos génicos que codifican para la horquilla.

Cebador: diana restricción añadida secuencia del sitio

cebador 1: 5’ RdRp SacI CGAGCTCATCTCGTTAGTCAGC

cebador 2: 3’ RdRp BamHI GGGATCCACGTCTGGACAGG

cebador 3: 5’ RdRp XbaI CTCTAGAATCTCGTTAGTCAGC

cebador 4: 3’ RdRp BamHI AGGATCCTACACGAACCTATC

cebador 5: 5’ AO3 BamHI AGGATCCATTGCGGTAACACAAC

cebador 6: 5’ A03 BglII TAGATCTATTGCGGTAACACAAC

cebador 7: 3’ AO3 BglII TAGATCTGTGTGATTCTGG

cebador 8: 3’ AO3 BamHI AGGATCCGTGTGATTCTGG

cebador 9: 5’ IV2 BamHI AGGATCCGTGTACGTAAGTTTC

cebador 10: 5’ IV2 BglII TAGATCTGTGTACGTAAGTTTC

cebador 11: 3’ IV2 BglII TAGATCTGTGATACCTGCAG

cebador 12: 3’IV2 BamHI AGGATCCGTGATACCTGCAG

cebador 13: 5’ RdRp SacI CGAGCTCATCTCGTTAGTCAGCTAGC

cebador 14: 3’ RdRp BamHI AGGATCCTTTGTGCCTCTGTACATG

cebador 15: 5’ RdRp XbaI CTCTAGAATCTCGTTAGTCAGCTAGC

cebador 16: 3’ RdRp BamHI AGGATCCATCAACCCTAAATTGAGCC

cebador 17: 5’ RdRp BamHI AGGATCCAGCAGGGAAATAAGTACGC

cebador 18: 3’ RdRp BamHI AGGATCCGGTATGGACAAAATCAGC

cebador 19: 5’ A03 BamHI AGGATCCATTGCGGTAACACAACCTCT C

cebador 20: 3’ AO3 BglII TAGATCTGTGTGATTCTGGAAAAG

cebador 21: 3’ IV2 BglII TAGATCTGTGATACCTGCACATCAAC

cebador 22: 5’ IV2 BamHI AGGATCCGTGTACGTAAGTTTCTGCTTC

cebador 23: 5’ RdRp XbaI CTCTAGAATCTCGTTAGTCAGCTAGC

cebador 24: 3’ RdRp BamHI AGGATCCAGCAGGGAAATAAGTACGC

f. Análisis de secuencia del gen de la proteína de 129 kD

10 Se determinó la secuencia de nucleótidos del producto de amplificación clonado en pKG4322 mediante secuenciación de doble cadena usando los cebadores m13 directo en m13 inverso, y una estrategia de paseo con cebadores. La codificación de ORF para el gen de la replicasa de 129 kD mostró una homología del 88% al nivel de nucleótidos con la correspondiente secuencia del aislado japonés CGMMV-SH. El ORF del aislado de invernadero de pepino holandés codifica para una proteína replicasa de 1144 aminoácidos, que tiene un aminoácido adicional en

15 comparación con la cepa CGMMV-SH. La secuencia de aminoácidos predicha muestra una homología del 97,1% con respecto a la predicha mediante la secuencia CGMMV-SH.

1.3. Clonación de secuencias diana

En un ejemplo particular de la invención, se eligió un fragmento de 489 nt del extremo 5’ del gen RdRP de CGMMV como secuencia diana para la construcción de secuencias homosentido y antisentido separadas por un fragmento “stuffer”. Se aislaron estos fragmentos del ORF clonado de 129 kD de pKG4322 (descrita anteriormente) mediante amplificación por PCR. Se diseñaron cebadores de PCR que correspondían a las partes en 5’ y 3’ de la secuencia diana elegida, e incluían, en la parte en 5’ de las secuencias de cebador, un sitio de restricción adicional para facilitar la clonación de los productos de amplificación.

Se diseñó un conjunto de cebadores (cebador 1 y cebador 2, tabla 9) para amplificar el fragmento diana elegido de 489 pb de pKG4322, mediante lo cual se introdujeron sitios de restricción para SacI (cebador 1) y BamHI (cebador 2) mediante el proceso de PCR en cualquier extremo del fragmento.

Se diseñó un segundo conjunto de cebadores (cebador 3 y cebador 4, tabla 9) para amplificar a partir de pKG4322 la misma secuencia diana de 489 pb de pKG4322 más una secuencia adicional de 332 pb en sentido 3’ de la secuencia diana en el gen RdRP de CGMMV. El cebador 4 y el cebador 5 añadieron sitios de restricción para XbaI y BamHI , respectivamente, en cualquier extremo del fragmento amplificado. Se proporcionan detalles de los cebadores en la tabla 9. Se clonaron los productos de PCR obtenidos mediante amplificación de las secuencias diana usando los cebadores respectivos, en el vector de clonación de T/A pCR2.1, dando como resultado pCG1 (secuencia diana de 489 pb) y pCG2 (fragmento de 821 pb). Se transformó el producto de ligamiento en E. coli MC1061 y se almacenaron a -80°C. Se verificaron las secuencias de los productos de PCR clonados en pCG1 y pCG2 mediante análisis de secuencia y se encontró que correspondían exactamente a la secuencia del ADN molde de pKG4322.

De manera similar, se obtuvo un fragmento de la secuencia diana mediante PCR con el ADN molde de pKG4322 usando los cebadores 13 y 14, que dieron como resultado un producto de amplificación de 398 pb con sitios de restricción para BamHI y SacI en cualquier extremo. Se obtuvo el segundo fragmento de la secuencia diana con ADN de pKG4322 como molde con los cebadores 15 y 16, dando como resultado un producto de amplificación de 698 pb, del que las primeras 398 pb eran idénticas al fragmento obtenido con los cebadores 13 y 14 y que extendieron otros 300 pb en el sentido de 3’. Este producto contenía sitios de restricción para BamHI y XbaI en cualquier extremo. Se clonaron ambos fragmentos en el vector de clonación de T/A pCR2.1 para crear los plásmidos pKG4347 y pKG4349, respectivamente. Se diseñó aún otro conjunto de reacciones de amplificación para obtener mayores fragmentos de la secuencia diana. De manera similar a la descrita anteriormente, se obtuvo un producto de PCR de 805 pb de la secuencia diana con los cebadores 13 y 17 con sitios de restricción para SacI y BamHI en cualquier extremo, y se obtuvo un segundo producto de 1102 pb con los cebadores 15 y 18 y contenía sitios de restricción para BamHI y XbaI en cualquier extremo. La secuencia de las primeras 805 pb del segundo producto de PCR era idéntica a la secuencia del primer producto de PCR, mientras que el segundo producto se extendió para otros 297 pb en el sentido de 3’. Se clonaron ambos fragmentos en el vector de clonación de T/A pCR2.1 para crear los plásmidos pKG4351 y pKG4346, respectivamente.

1.4. Construcción de ARN en horquilla que codifica para vectores de transformación

Los sitios de restricción en los extremos de las secuencias diana amplificadas permitieron la clonación simultánea de ambos fragmentos mediante un ligamiento trilateral en un vector de transformación adecuado tal como pKG1572. Este vector de transformación es un vector de ADN-T de tipo cointegrado para la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, que lleva entre los límites de ADN-T a) el gen marcador seleccionable de planta nptII dirigido por un promotor nos, b) un promotor 35S de CaMV para la expresión constitutiva en plantas, c) un sitio de clonación múltiple, y d) la secuencia de poliadenilación de nos (figura 9). Además, este vector contiene una secuencia de estructura principal homóloga a pBR322, incluyendo el origen de replicación ColE1 para el mantenimiento en E. coli, y el gen marcador seleccionable aadA para la resistencia bacteriana a estreptomicina y espectinomicina.

La presencia de los sitios de restricción para BamHI en ambos extremos 3’ de los productos de PCR permitió la inserción de ambos fragmentos en orientación inversa entre sí en el vector de clonación. Por tanto, se creó un constructo, que incluía la secuencia diana de 489 pb en orientación inversa, separado por un fragmento “stuffer” de 332 pb, que se incluyó en el producto de amplificación generado con los cebadores 3 y 4. Este fragmento “stuffer” se incluye para garantizar la estabilidad de las secuencias de repetición en E. coli. El constructo obtenido mediante el ligamiento trilateral se denominó pCG3 y se transformó en E. coli MC 1061 y se almacenó a -80°C. Se verificó el constructo pCG3 mediante análisis de secuencia.

De manera similar, se insertaron los productos de PCR clonados de pKG4347 y pKG4349 en el vector de transformación pKG1572 en un ligamiento trilateral, dando como resultado la orientación de repeticiones invertidas de las partes idénticas de 398 pb de los productos, separadas por una secuencia “stuffer” de 300 pb. El vector de transformación resultante se denominó pKG4359 (figura 11).

De manera similar, se insertaron los productos de PCR de pKG4351 y pKG4346 en un ligamiento trilateral en el vector de transformación pKG1572 para crear pKG4358 (figura 12), que consistía en repeticiones invertidas de 805 pb de la secuencia diana de CGMMV, separadas por una secuencia “stuffer” de 297 pb. Se transformaron todos los constructos en E. coli MC 1061 y se almacenaron a -80°C.

1.5. Transformación de pepino

Se transfirió posteriormente el vector de transformación pCG3 a la cepa GV2260 inactivada de Agrobacterium tumefaciens mediante conjugación triparental. La cepa GV2260 lleva en su plásmido Ti pGV2260 una secuencia de 3,8 kb de pBR322, homóloga a un fragmento similar de pBR322 que reside en la estructura principal de los vectores de transformación cointegrados tales como pKG1572 y pCG3. Esta secuencia homóloga permite la integración estable del vector de transformación en el plásmido Ti mediante recombinación homóloga.

Se hicieron crecer colonias de Agrobacterium y se subcultivaron sobre estreptomicina y espectinomicina para seleccionar la presencia del vector de transformación integrado. Se sometieron colonias seleccionadas a análisis de transferencia de tipo Southern con el gen marcador seleccionable aadA presente en el vector cointegrado como sonda para verificar acontecimientos de una sola integración en el plásmido Ti. Además, se sometieron las colonias de Agrobacterium a análisis de PCR usando conjuntos de cebadores que pueden amplificar fragmentos solapantes que cubren todo el ADN-T del vector de transformación integrado para verificar la integración correcta en el plásmido Ti del ADN-T completo. Varias colonias de Agrobacterium verificadas de esta manera se denominaron GV2260 (pGV2260::pCG3) y se almacenaron a -80°C.

De manera similar, se transfirieron los vectores de transformación pKG4358 y pKG4359 a Agrobacterium GV2260. Estos se denominaron GV2260 (pGV2260::pKG4358) y GV2260 (pGV2260::pKG4359), respectivamente.

Se introducen constructos que codifican para ARN en horquilla en los genomas de plantas de pepino usando procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium conocidos en la técnica. Brevemente, se inoculan explantes de cotiledón de plántulas jóvenes de pepino germinadas in vitro con una suspensión de una cepa de Agrobacterium que contiene uno cualquiera de los constructos de transformación descritos anteriormente integrados en sus plásmidos Ti. Los explantes, tras de 1 a 5 días de cocultivo con Agrobacterium, se transfieren a placas Petri con medio de regeneración que contiene, además de minerales, vitaminas, azúcares y reguladores del crecimiento vegetal, sulfato de kanamicina en concentraciones de 50 a 300 mg/l como agente selectivo, y se incubaron en cámaras de crecimiento en las condiciones de temperatura y luz apropiadas para el cultivar de pepino específico en estudio. Los explantes de cotiledón producirán, en el transcurso de las siguientes semanas, primordios, que crecen para dar brotes. Cuando los brotes han crecido hasta ser lo suficientemente largos, se transfieren a tarros de vidrio con medio de enraizamiento que contiene el agente selectivo sulfato de kanamicina. Los brotes verdaderamente transformados permanecerán verdes y formarán raíces en este medio, y en última instancia se endurecen, se transplantan a tierra y se transfieren a un invernadero. Preferiblemente se realizan ensayos de resistencia viral con plántulas jóvenes que se originan a partir de cruzamientos entre plantas de pepino maternas transformadas y una línea polinizadora. Los ensayos de resistencia viral pueden llevarse a cabo simplemente mediante inoculación mecánica de las plántulas con un extracto en bruto en tampón fosfato de hojas de una planta de pepino gravemente enferma infectada previamente. Se observa el fenotipo de resistencia 21 días tras la inoculación mediante la ausencia de clorosis de la hoja y crecimiento atrofiado, que se ha vuelto evidente en las plántulas de control no transgénicas. Dependiendo del número de copias integradas independientemente del constructo génico en el genoma de la planta, el número de plántulas resistentes frente al número de plántulas susceptibles corresponderá a una segregación mendeliana.

La resistencia frente a la infección viral obtenida puede expresarse como el grado de tolerancia, puntuando el periodo en número de días tras la infección que lleva que el 50% de las plántulas transformadas en la población infectada muestre síntomas de infección viral. En muchos casos, sin embargo, la resistencia a la infección por CGMMV obtenida mediante constructos de ARN en horquilla es suficientemente eficaz de modo que no se observará una puntuación del 50% de las plántulas transformadas que muestra síntomas en un periodo de varios meses. En tal caso, todas las plántulas que permanecen libres de síntomas 21 días tras la inoculación se puntúan como que son resistentes, y el número de plántulas resistentes del número total de plántulas transformadas infectadas se expresa como un porcentaje de eficacia de resistencia. De esta manera, se evalúan las diferencias en la eficacia de los diversos constructos de ARN en horquilla con corte y empalme de intrones descritos en conferir resistencia viral.

Los ensayos de resistencia viral descritos anteriormente pueden realizarse usando inoculaciones de aislados virales de diferente origen. De esta manera, se muestra que los constructos de ARN en horquilla con corte y empalme de intrones direccionados contra CGMMV son eficaces frente a todos los aislados de CGMMV descritos en la tabla 1, incluyendo el aislado japonés CGMMV-SH, así como frente a aislados de los tobamovirus que infectan cucurbitáceas relacionadas virus del mosaico moteado verde Kyuri (KGMMV) y virus del mosaico moteado del fruto del pepino (CFMMV).

Ejemplo V

2.1. Clonación de secuencias de intrón de plantas

En un segundo ejemplo, se elige un fragmento “stutter” alternativo necesario para el mantenimiento estable de la estructura de repeticiones invertidas en E. coli. En este caso, se hace uso de una secuencia de intrón de planta que puede someterse a corte y empalme tras la transcripción de la secuencia de repeticiones invertidas en células vegetales. La publicación de Smith et al. (Nature 407: 319-320, 2000) describe el uso del intrón 2 del gen PdK de Flaveria como fragmento “stuffer” en constructos de silenciamiento génico para obtener un alto grado de resistencia a infecciones con PVY. Sin embargo, este intrón de Flaveria es muy largo (1,8 kb) y es incierto el corte y empalme correctos de este intrón en células vegetales de Cucumis. En este ejemplo, se emplean dos tipos de intrones de plantas, de los que se ha verificado el corte y empalme correctos en Cucumis. El primer intrón es el intrón IV2 de 188 pb del gen LS-1 de patata, que se encuentra frecuentemente en constructos del gen indicador gusA para obtener la expresión de beta-glucuronidasa en células vegetales con la ausencia simultánea de la expresión de betaglucuronidasa en células bacterianas tales como Agrobacterium tumefaciens. A partir de la experiencia, se sabe que las plantas de pepino y melón expresan correctamente beta-glucuronidasa a partir de constructos génicos introducidos que contienen el gen gusA con el intrón de patata IV2.

El segundo intrón empleado es el intrón de ascorbato oxidasa de Cucumis melo de 532 pb AO3, que mediante su propia naturaleza se sabe que se somete a corte y empalme correctamente en Cucumis melo (plantas de melón y se espera que funcione correctamente en la especie relacionada Cucumis sativus (pepino).

Estas dos secuencias de intrón se obtuvieron mediante amplificación por PCR usando los cebadores, que, en la parte en 5’ de las secuencias de cebador, incluyen un sitio de restricción adicional para facilitar la clonación de los productos de amplificación. Por tanto, se amplificó el intrón de melón AO3 a partir de ADN genómico total de plántulas jóvenes de melón usando los cebadores 5 y 7 (véase la tabla 9), que contiene cada uno un sitio de restricción para BamHI o BglII , respectivamente, en sus extremos 5’.

Una reacción de PCR alternativa para obtener el intrón de melón A03 empleó los cebadores 19 y 20, y produjo un producto de PCR con 546 pb de secuencia de intrón amplificada, que correspondía a la secuencia conocida del intrón A03, y que contenía sitios de restricción para BamHI y BglII en cualquier extremo. Este producto de PCR se clonó en el vector de clonación de T/A pCR2.1 para producir el plásmido pKG4355.

Para someter a prueba el efecto de las secuencias de intrón clonadas en los constructos génicos que codifican para ARN en horquilla, se anticiparon constructos génicos de control, en los que se pusieron las secuencias de intrón en orientación inversa. Para este fin, se diseñó un conjunto de cebadores similar, que consistía en los cebadores 6 y 8, en los que los sitios de restricción para BamHI y BglII estaban invertidos en comparación con los cebadores 5 y 7 (tabla 9). Se clonaron los productos de PCR obtenidos mediante amplificación de la secuencia de intrón AO3 usando dichos conjuntos de cebadores en el vector de clonación de T/A pCR2.1, dando como resultado pCG4 (BamHI-intrón AO3-BglII) y pCG5 (BglII-intrón AO3-BamHI). Se verificaron las secuencias de los productos de PCR clonados mediante análisis de secuencia y se encontró que correspondían exactamente a las secuencias de intrón conocidas.

Se amplificó el intrón de patata IV2 a partir del constructo de vector pKGT-3 que lleva un gen gusA que contiene este intrón con los cebadores 9 y 11 (véase tabla 9), que llevan cada uno un sitio de restricción adicional para BamHI y BglII, respectivamente. También para este intrón, se generó un producto de PCR adicional con BamHI y BglII en las posiciones invertidas a ambos lados del producto de amplificación, usando los cebadores de PCR 10 y 12 (tabla 9). Se clonaron los productos de PCR así obtenidos en el vector de clonación pCR2.1, y se denominaron pCG6 (BamHI-intrón de patata IV2-BglII) y pCG7 (BglII-intrón de patata IV2-BamHI).

Una reacción alternativa para obtener el intrón de patata IV2 para clonación en la orientación correcta empleó los cebadores 21 y 22 en una reacción de PCR con ADN molde de pKG1600, un vector de plásmido que contiene el gen gusA que lleva este intrón. La reacción proporcionó un producto de amplificación con 202 pb de la secuencia del intrón IV2, y que contenía sitios de restricción para BamHI y BglII en cualquier extremo. Se clonó este producto de PCR en el vector de clonación de T/A pCR2.1 para producir el plásmido pKG4353.

2.2. Clonación de intrones en casetes de expresión que codifican para ARN en horquilla

Se volvió a amplificar la secuencia diana de 489 pb del gen RdRP de CGMMV a partir del gen RdRP de CGMMV clonado en el vector pKG4322 mediante PCR usando el cebador 2 y el cebador 3, tal como se describe en el ejemplo IV. Esta reacción de PCR produjo un fragmento que contiene la secuencia diana, que era idéntica al inserto de pCG1 del ejemplo IV, excepto en que el sitio de restricción en 5’ generado en el extremo 5’ del producto de PCR es un sitio de reconocimiento para XbaI en lugar de para SacI. Se clonó el producto de PCR en el vector de T/A pCR2.1 para producir pCG8. Se transformó el producto de ligamiento en E. coli MC1061 y se almacenó a -80°C. Se verificó la secuencia del producto de PCR clonado en pCG8 mediante análisis de secuencia y se encontró que correspondía exactamente a la secuencia del ADN molde de pKG4322.

De manera similar, se volvió a amplificar la secuencia diana de CGMMV de 398 pb a partir de ADN molde de pKG4322 usando los cebadores 23 y 14 para crear sitios de restricción para BamHI y XbaI en cualquier extremo, para facilitar la clonación en constructos de repetición que contienen intrones. Este fragmento de PCR, tras la clonación en el vector de clonación de T/A pCR2.1, se denominó pKG4348.

Aún en otra reacción de PCR similar, se volvió a amplificar una secuencia diana de CGMMV de 806 pb a partir de ADN molde de pKG4322 usando los cebadores 23 y 24 para crear sitios de restricción para BamHI y XbaI en cualquier extremo, para facilitar la clonación en constructos de repetición que contienen intrones. Este fragmento de PCR, tras la clonación en el vector de clonación de T/A pCR2.1, se denominó pKG4350.

Se digirió el vector pCG1 del ejemplo IV con enzimas de restricción SacI y BamHI y se aisló el fragmento que contenía la secuencia diana de 489 pb del gel y se ligó en el vector de transformación pKG1572 (descrito en el ejemplo IV) digerido con las mismas dos enzimas de restricción. Este producto de ligamiento, denominado pCG9, se transformó en E. coli MC1061. Entonces se verificó la estructura correcta de pCG9 mediante análisis de restricción.

A continuación, se aislaron ambas secuencias de intrón de plantas en las orientaciones homosentido y antisentido, clonadas en los vectores pCG4 a pCG7, de sus vectores mediante digestión con BamHI y BglII , y se ligaron en pCG9 digerido con BamHI. Se transformaron los productos de ligamiento en E. coli MC1061. Esta etapa de clonación situó las secuencias de intrón de plantas junto a la secuencia diana de CGMMV de 489 pb en el casete de expresión del vector de transformación. Puesto que las enzimas de restricción BamHI y BglII son isosquizómeros y producen “extremos cohesivos” idénticos, se obtuvieron dos orientaciones de las secuencias de intrón en los productos de ligamiento. Se analizaron las colonias de las cuatro reacciones de clonación mediante digestión con enzimas de restricción, y sólo se conservaron aquellas colonias de las cuatro reacciones para clonación adicional que contenían el único sitio BamHI en una posición entre la secuencia de intrón y el promotor 35S de CaMV. Los productos intermedios de clonación se denominaron pCG10 (intrón homosentido AO3), pCG12 (intrón homosentido IV2), pCG14 (intrón antisentido AO3) y pCG16 (intrón antisentido IV2).

Posteriormente, se aisló del vector la secuencia diana de 489 pb de pCG8 mediante digestión con XbaI y BamHI y se ligó en los vectores pCG10, pCG12, pCG14 y pCG16, cada uno digerido con XbaI y BamHI. Esta etapa de ligamiento produjo los vectores de transformación finales que contenían dos copias de la secuencia diana de 489 pb en orientación inversa entre sí, que codificaban por tanto para una estructura de ARN en horquilla, y separadas entre sí por secuencias de intrón de plantas en orientación homosentido y antisentido. Los productos de ligamiento se denominaron pCG11 (intrón homosentido A03), pCG13 (intrón homosentido IV2), pCG15 (intrón antisentido A03) y pCG17 (intrón antisentido IV2), y se transformaron en E. coli MC1061 y se almacenaron a - 80°C. Se verificó la estructura correcta de los vectores mediante análisis de secuencia. Se ensamblaron los otros productos de amplificación clonados de las secuencias diana y de intrón descritas en este ejemplo de la siguiente manera. Se ligaron simultáneamente el intrón de melón AO3 de pKG4355, como fragmento de BamHI -BglII, y la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 398 pb de pKG4347, como fragmento de BamHI -SacI, en el vector de transformación pKG1572. La posterior inserción de un fragmento de BamHI -XbaI de pKG4348 en el producto de ligamiento produjo el vector de transformación pKG4375 (figura 13), que llevaba repeticiones invertidas de la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 398 pb, separadas por el intrón de melón AO3.

Para crear un constructo similar con las secuencias diana de CGMMV más largas, se ligaron simultáneamente el intrón de melón AO3 de pKG4355, como fragmento de BamHI -BglII, y la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 805 pb de pKG4351, como fragmento de BamHI -SacI, en el vector de transformación pKG1572. La posterior inserción de un fragmento de BamHI -XbaI de pKG4350 en el producto de ligamiento produjo el vector de transformación pKG4377 (figura 14), que llevaba repeticiones invertidas de la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 805 pb, separadas por el intrón de melón A03.

Asimismo, se crearon vectores de transformación con repeticiones invertidas de RdRp de CGMMV separadas por el intrón de patata IV2. Se ligaron simultáneamente el intrón de patata IV2 de pKG4353, como fragmento de BamHI -BglII, y la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 398 pb de pKG4347, como fragmento de BamHI -SacI, en el vector de transformación pKG1572. La posterior inserción de un fragmento de BamHI -XbaI de pKG4348 en el producto de ligamiento produjo el vector de transformación pKG4374 (figura 15), que llevaba repeticiones invertidas de la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 398 pb, separadas por el intrón de patata IV2.

Además, se ligaron simultáneamente el intrón de patata N2 de pKG4353, como fragmento de BamHI -BglII, y la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 805 pb de pKG4351, como fragmento de BamHI -SacI fragmento, en el vector de transformación pKG1572. La posterior inserción de un fragmento de BamHI -XbaI de pKG4350 en el producto de ligamiento produjo el vector de transformación pKG4376 (figura 16), que llevaba repeticiones invertidas de la secuencia diana de RdRP de CGMMV de 805 pb, separadas por el intrón de patata IV2.

Se transformaron todos los constructos en E. coli MC1061 y se almacenaron a -80°C.

2.3. Transformación de pepino

Después de transferir los vectores de transformación a Agrobacterium tumefaciens cepa GV2260 tal como se describe en el ejemplo IV, las plantas de pepino transformadas con estas cepas de Agrobacterium serán resistentes a la infección por CGMMV. En el ejemplo IV, se describe la manera preferida de someter a ensayo la resistencia viral. Se obtiene resistencia a la infección por CGMMV con los cuatro constructos génicos. La eficacia de las secuencias de intrón en orientación homosentido en oposición a los constructos con intrones en orientación antisentido es evidente a partir del alto porcentaje de líneas de pepino que muestran una resistencia extrema a la infección por CGMMV.

Anteriormente en el presente documento, se ha descrito la invención bajo la suposición de que se genera resistencia frente a CGMMV “al nivel de proteína”, es decir que la “secuencia de nucleótidos que codifica para una variante defectuosa del gen de replicasa de CGMMV” codifica para una “replicasa defectuosa”, cuya expresión a nivel celular genera la resistencia deseada frente a CGMMV. Anteriormente en el presente documento, se ha descrito la invención bajo la suposición de que la resistencia a CGMMV también puede generarse a nivel del ARN, por ejemplo la regulación por disminución de la expresión génica debida a homología de secuencia de ARN. Sin embargo, la invención no se limita a ninguna explicación o mecanismo.

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> Keygene N.V.

<120> Métodos para generar resistencia frente a CGMMV en plantas

<130> CGMMV2

<140> BO 44313 PCT

<141> 08-02-2002

<150> EP 01200448.7

<151> 08-02-2001

<160> 68

<170> PatentIn ver. 2.1

<210> 1

<211> 3432

<212> ADN

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la replicasa de 129 kD de CGMMV

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 1144 5 <212> PRT

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

10

<223> Replicasa de 129 kD de CGMMV

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 1503

5

<212> ADN

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino 10 <220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de 57 kD de CGMMV

<400> 3

15

imagen1

<210> 4

<211> 501

20

<212> PRT

<213>: Virus del mosaico moteado verde del pepino 25 <220>

<223> Proteína de 57 kD de CGMMV

<210> 5

<211> 4935

<212> ADN

<213>: Virus del mosaico moteado verde del pepino 10 <220>

imagen2

imagen1

5

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de 186 kDa de CGMMV

<400> 5

15

imagen1

<210> 6

<211> 1645 5 <212> PRT

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

10

<223> Proteína de 186 kD de CGMMV

<400> 6

imagen3

imagen1

<210> 7 5 <211> 1139

<212> ADN

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

10

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 1 de CGMMV 15 <400> 7

imagen1

<210> 8

20

<211> 1139

<212>: ADN 25 <213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 2 de CGMMV

<400> 8

<210> 9

<211> 1139

<212>: ADN 10 <213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

30 5

imagen1

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 3 de CGMMV

15

<400> 9

imagen1

20 <210> 10

<211> 1139

<212> ADN

25

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino 48 <220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 4 de CGMMV

<400> 10

imagen1

10 <210> 11

<211> 1139

<212> ADN

15

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220> 20 <223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 5 de CGMMV

<400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 1139

<212> ADN 5

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220> 10 <223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 6 de CGMMV

<400> 12

imagen3

<210> 13

<211> 1138

20

<212> ADN

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino 25 <220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 7 de CGMMV

<400> 13 <212> ADN

imagen4

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

10

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 8 de CGMMV 15 <400> 14

imagen1

20 <210> 15

<211> 1139

<212> ADN

25

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 9 de CGMMV

<400> 15

imagen1

<210> 16

10

<211> 1139

<212> ADN 15 <213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta del aislado 10 de CGMMV

20

<400> 16 <210> 17

imagen1

<211> 3429 5 <212> ADN

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

<220>

10

<223> Secuencia de ADN que codifica para la replicasa de 129 kD de la cepa SH de CGMMV

<400> 17

imagen3

imagen1

<210> 18

<211> 1143 5

<212> PRT

<213>: Virus del mosaico moteado verde del pepino 10 <220>

<223> Replicasa de 129 kD de la cepa SH de CGMMV

<400> 18

<210> 19

<211> 1503

<212> ADN

<213>: Virus del mosaico moteado verde del pepino 10 <220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de 57 kD de la cepa SH de CGMMV

<400> 19

<210> 20

<211> 501

<212> PRT

<213>: Virus del mosaico moteado verde del pepino 25 <220>

<223> Proteína de 57 kD de la cepa SH de CGMMV

<400> 20

<210> 21

<211> 4932

<212> ADN

<213>: Virus del mosaico moteado verde del pepino 10 <220>

imagen3

imagen1

5

15

imagen1

20

30

imagen1

5

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de 186 kD de la cepa SH de CGMMV

<400> 21

15

imagen1

<210> 22

<211> 1644

5

<212> PRT

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino 10 <220>

<223> Proteína de 186 kD de la cepa SH de CGMMV

<400> 22

15

imagen1

imagen5

<212> ADN

<213> Virus del mosaico moteado verde del pepino

10

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica para la proteína de cubierta de la cepa SH de CGMMV 15 <400> 23

imagen1

<210> 24

20

<211> 24

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G01

<400> 24 aggtgtcagt ggagaactca ttga 24

<210> 25

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G02

<400> 25 ggcgttgtgg tttgtgg 17

<210> 26

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G03

<400> 26 ctgtaggggt ggtgctactg t 21

<210> 27

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G18

<400> 27 gcccatagaa acttcaacgt c 21

<210> 28

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98A88 <400> 28 ccatggagaa ttcgctgtat gtcc 24

<210> 29

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98A86

<400> 29 cgagctctcg actgacacct tac 23

<210> 30

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98A84

<400> 30 ccatggcaaa cattaatgaa c 21

<210> 31

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98A85

<400> 31 caaccatggc aaacattaat g 21

<210> 32

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98G63

<400> 32 taacagggag gaaaatatta cg 22

<210> 33

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L99

<400> 33 gagctcggat ccactagtaa cggc 24

<210> 34

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L107

<400> 34 tagagctctt gaagctaagc aaattccg 28

<210> 35

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L108

<400> 35 ttcaagagct ctaatcaccg aagacaaagg c 31

<210> 36

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L102

<400> 36 gaattatatc gattatctat cggc 24

<210> 37

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L103

<400> 37 gataatcgat ataattcttc atctgcc 27

<210> 38

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L104

<400> 38 aactagtaat tgatgatctg ttcaagaag 29

<210> 39

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L105

<400> 39 aattactagt ttccggaagc aagcagctca g 31

<210> 40

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 98L106

<400> 40 gccctctaga tgcatgctcg ag 22

<210> 41

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G40

<400> 41 ctagagtttt aatttttata attaaacaaa 30

<210> 42

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G41

<400> 42 tcaaaattaa aaatattaat ttgtttgttg ttgttg 36

<210> 43

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G42

<400> 43 caacaacaac aacaacaaac aattttaaaa caacac

<210> 44

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 97G43

<400> 44 ttgttgtttg ttaaaatttt gttgtggtac 30

<210> 45

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 1

<400> 45 cgagctcatc tcgttagtca gc 22

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 2

<400> 46 gggatccacg tctggacagg 20

<210> 47

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 3

<400> 47 ctctagaatc tcgttagtca gc 22

<210> 48

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 4

<400> 48 aggatcctac acgaacctat c 21

<210> 49

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 5

<400> 49 aggatccatt gcggtaacac aac 23

<210> 50

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 6

<400> 50 tagatctatt gcggtaacac aac 23

<210> 51

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 7

<400> 51 tagatctgtg tgattctgg 19

<210> 52

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 8

<400> 52 aggatccgtg tgattctgg 19

<210> 53

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 9

<400> 53 aggatccgtg tacgtaagtt tc 22

<210> 54

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 10

<400> 54 tagatctgtg tacgtaagtt tc 22

<210> 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 11

<400> 55 tagatctgtg atacctgcag 20

<210> 56

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 12

<400> 56 aggatccgtg atacctgcag 20

<210> 57

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 13

<400> 57 cgagctcatc tcgttagtca gctagc 26

<210> 58

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 14

<400> 58 aggatccttt gtgcctctgt acatg 25

<210> 59

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 15

<400> 59 ctctagaatc tcgttagtca gctagc 26

<210> 60

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 16

<400> 60 aggatccatc aaccctaaat tgagcc 26

<210> 61

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 17

<400> 61 aggatccagc agggaaataa gtacgc 26

<210> 62

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 18

<400> 62 aggatccggt atggacaaaa tcagc 25

<210> 63

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 19

<400> 63 aggatccatt gcggtaacac aacctctc 28

<210> 64

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 20

<400> 64 tagatctgtg tgattctgga aaag 24

<210> 65

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador 21

<400> 65 tagatctgtg atacctgcac atcaac26

<210> 66

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 22

<400> 66 aggatccgtg tacgtaagtt tctgcttc 28

<210> 67

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 23

<400> 67 ctctagaatc tcgttagtca gctagc 26

<210> 68

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador 24

<400> 68 aggatccagc agggaaataa gtacgc 26

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para generar resistencia en una planta o en una célula vegetal frente a la infección con el virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV), comprendiendo dicho método transformar dicha planta o célula vegetal con una secuencia de polinucleótido que

-

tras su transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta;

-

tras su transcripción en ARN no conduce a la generación de actividad replicasa en dicha planta; y

-

en el que la secuencia de polinucleótido comprende un promotor, operativamente unido a una primera y una segunda secuencia de ADN que están presentes en una repetición invertida, en la que:

•

la primera secuencia de ADN comprende una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN homosentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos homosentido de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV que puede infectar a la planta o la célula vegetal; y

•

dicha primera secuencia de ADN comprende además opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales;

•

la segunda secuencia de ADN comprende una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100% con el complemento inverso de los al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido; y

•

dicha segunda secuencia de ADN comprende además opcionalmente una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales

•

en la que la primera y segunda región de ADN están unidas por una secuencia de nucleótidos espaciadora; y

•

en la que las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar un ARN en horquilla mediante apareamiento de bases entre las regiones que son complementarias.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV es:

-

la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.1, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.17 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural;

-

la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.5, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.21, o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural;

-

la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.3, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.19 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural
3.

Método según la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV es la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.1, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.17 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural.
4.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de nucleótidos espaciadora comprende un intrón.
5.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una etapa de cultivar la célula vegetal transformada para dar una planta madura.
6.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una etapa de reproducir o multiplicar sexual o asexualmente la planta transformada y/o la planta madura obtenida a partir de la célula vegetal transformada según la reivindicación 5.
7.

Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la planta es una planta que es susceptible a la infección con CGMMV, más preferiblemente una planta que pertenece a la familia Cucurbitaceae, tal como melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria).
8.

Constructo genético adecuado para transformar una planta, comprendiendo dicho constructo al menos una secuencia de nucleótidos que

-

tras su transcripción en ARN genera resistencia frente a la infección con CGMMV en dicha planta; y

-

tras su transcripción en ARN no conduce a la generación de actividad replicasa en dicha planta;

y que comprende opcionalmente elementos adicionales de constructos genéticos conocidos per se; comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos un promotor, operativamente unido a una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que están presentes en una repetición invertida, comprendiendo dicha primera secuencia de ADN una primera región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN homosentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos homosentido de al menos 100 nucleótidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de entre el 90 y el 100% con la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV que puede infectar a la planta o la célula vegetal; y comprendiendo dicha segunda secuencia de ADN una segunda región de ADN que puede transcribirse en una molécula de ARN antisentido con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos, que tiene una identidad de secuencia de entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100% con el complemento inverso de los al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos homosentido, en el que la primera y segunda región de ADN están unidas por una secuencia de nucleótidos espaciadora; comprendiendo además opcionalmente dicha secuencia de nucleótidos una región de ADN implicada en la terminación de la transcripción y el funcionamiento de poliadenilación en células vegetales, en el que las moléculas de ARN homosentido y antisentido pueden formar un ARN en horquilla.
9. Constructo genético según la reivindicación 8, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la replicasa del CGMMV es:

-

la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.1, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.17 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural;

-

la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.5, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.21, o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural;

-

la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia facilitada en SEQ ID no.3, a la secuencia facilitada en SEQ ID no.19 o a la secuencia de nucleótidos de una variante de las mismas que se produce de manera natural.
10.

Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que la secuencia de nucleótidos está bajo el control del promotor de plastocianina.
11.

Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que la secuencia de nucleótidos está precedida por la secuencia líder (5’-UTR) de CGMMV nativa.
12.

Constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-11 en una forma que puede mantenerse o heredarse de manera estable en un microorganismo, en particular una bacteria, más en particular una bacteria que puede usarse para transformar una planta o material vegetal, tal como Agrobacterium.
13.

Microorganismo, en particular bacteria, más en particular una bacteria que puede usarse para transformar una planta, tal como Agrobacterium, que contiene un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-12.
14.

Planta transgénica o célula vegetal, que puede obtenerse o que se obtiene mediante un método según una de las reivindicaciones 1-7, o un descendiente transgénico de una planta de este tipo.
15.

Planta, célula vegetal o material vegetal que se ha transformado con el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 8-12, o un descendiente transgénico de una planta de este tipo.
16.

Planta según la reivindicación 14 ó 15, que es una planta susceptible a la infección con CGMMV, más preferiblemente una planta que pertenece a la familia Cucurbitaceae, tal como melón (Cucumis melo), pepino (C. sativus), sandía (Citrullus vulgaris) y calabaza de peregrino (Lagenaria siceraria).
17.

Material de cultivo tal como semilla, tubérculos, raíces, tallos, plántulas que comprende el constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12 para una planta según la reivindicación 14, 15 ó 16.