CN105462993A - 植物抗病调控基因SlASN2及用途 - Google Patents

植物抗病调控基因SlASN2及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一个植物抗病调控基因，该基因的开放阅读框长1680bp，编码一种天冬酰胺合成酶，由559个氨基酸组成。该基因编码产物包含谷氨酰胺氨基转移酶结构域以及天冬酰胺合酶结构域。本发明阐明了SlASN2基因对植物抗病性的广谱调控作用。本发明提供的基因是优质抗病调控基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病谱广的优点。该基因通过对氮代谢的调节，广泛影响对各类病原物引起的多种病害的抗性。SlASN2基因的过量表达显著增强烟草对病毒病、野火病和菌核病的寄主抗性，以及对水稻白叶枯病菌的非寄主抗性。适用于抗病对象广谱的抗病植物材料和品种的创制和选育。

Description

植物抗病调控基因SlASN2及用途
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一个植物抗病调控基因(SlASN2)及其用途。
背景技术
1、植物基因克隆技术
植物基因克隆方法有很多种，随着基因组序列测定完成的植物物种的增多，基于数据库序列的植物基因克隆方法得到越来越广泛的应用。该方法操作步骤主要包括基于保守序列的引物设计，目的植物组织RNA提取，反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，PCR产物与载体的连接，连接产物的细菌转化，质粒提取，酶切检验，测序分析等。
2、植物转基因技术
用于将外源基因导入目的植物，从而获取携带外源基因的转基因植物。包括基因枪法，农杆菌介导法等。农杆菌介导法包括将目的基因克隆入植物表达载体，表达载体对农杆菌的转化，携带表达载体的农杆菌对目的植物组织的感染，转基因植株的再生以及植株中基因转化和表达情况的检测分析等步骤。
3、植物抗病性检测分析技术
植物病原物包括真菌、卵菌、细菌、病毒和线虫等多种类型。不同类型病原物的接种方法各不相同。对于真菌，能产生分生孢子的，通常以分生孢子悬浮液喷雾接种植物。不产生分生孢子的，则以菌丝块等接种植物。对于卵菌，一般先培养产生大量孢子囊，而后低温培养使之释放游动孢子，最后以游动孢子悬浮液接种植物。对于细菌，常以菌体悬浮液剪叶、针刺、注射等法接种植物。对于病毒，常以提纯的病毒粒子或人工体外转录产物摩擦、注射、或通过昆虫等传播媒介接种植物。对于线虫，常以一定数量的二龄幼虫接触植物根部茎基部或根围土壤中接种植物。多数情况下，接种后需要保持较高的相对湿度，合适的温度和光照条件。接种后按不同时间点连续观察病害发生症状，统计发病率和发病严重度，计算病情指数，采用RT-PCR检测病原物生物量。通过与感病对照植物发病情况的对比分析，明确目标植物的抗病性。
4、植物抗病育种技术
主要可以分为传统抗病育种和通过基因工程抗病育种两大类。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一个植物抗病调控基因，命名为SlASN2，其核苷酸序列如SEQID：1所示，该基因的开放阅读框(ORF)长1680bp，编码一种天冬酰胺合成酶(Asparaginesynthetase)，由559个氨基酸组成，其序列如SEQID：2所示。该基因编码产物包含谷氨酰胺氨基转移酶结构域以及天冬酰胺合酶结构域。本发明阐明了SlASN2基因对植物抗病性的广谱调控作用。SlASN2基因在烟草(Nicotianatabacum)植株中的过量表达增强了植株对病毒病(Tobaccomosaicvirus,Cucumbermosaicvirus)、细菌性野火病(Pseudomonassyringaepv.tabaci)和真菌性菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)的寄主抗性，以及对细菌病原(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的非寄主抗性(具体见实施例2中的说明)。
本发明的另一个目的是提供所述基因在通过创制转SlASN2基因植物来获取广谱抗病材料中的应用。通过以下步骤实现：
(1)SlASN2基因表达结构的构建和获取
将SlASN2基因ORF插入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达。
(2)转化SlASN2基因表达结构的农杆菌的获取
将SlASN2基因表达结构通过电击等方法转化对植物具有强侵染能力的农杆菌菌株。
(3)转SlASN2基因植物的创制和获取
通过农杆菌介导法将SlASN2基因导入目的植物，获取转SlASN2基因的植物。
(4)转SlASN2基因植物纯合系的获取
分别以抗生素抗性和SlASN2基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的含单位点整合的转SlASN2基因的植物纯合系。
(5)广谱抗病的转SlASN2基因植物纯合系的筛选鉴定和获取
以转SlASN2基因植物纯合系为材料，检测分析对由真菌、卵菌、细菌、病毒和线虫等各类病原物引起的病害的抗性，获取广谱抗病的转SlASN2基因植物。
本发明的优点：(1)本发明提供的SlASN2基因是优质抗病调控基因资源，利用SlASN2基因获取的抗病材料具有抗病谱广等优点。抗病育种经常面临获取的材料和品种抗病对象过于单一或狭窄等问题的困扰。本发明提供的SlASN2基因是一个天冬酰胺合成酶基因。该基因通过对氮代谢的调节，广泛影响对各类病原物引起的多种病害的抗性。SlASN2基因的过量表达显著增强烟草对病毒病(Tobaccomosaicvirus,Cucumbermosaicvirus)、细菌性野火病(Pseudomonassyringaepv.tabaci)和真菌性菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)的寄主抗性，以及对细菌病原(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的非寄主抗性。因此，SlASN2基因适用于抗病对象广的抗病植物材料和品种的创制和选育。(2)获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。本发明利用抗病调控基因SlASN2，采用基因工程方法，创制培育广谱、持久抗病植物材料，具有周期短，选育快速等特点。
附图说明
图1为SlASN2基因过量表达的转基因烟草植株显示对TMV病毒抗性的抗病检测分析结果图。
图2为SlASN2基因过量表达的转基因烟草植株显示对菌核病抗性的抗病检测分析结果图。
图3为SlASN2基因过量表达的转基因烟草植株显示对野火病抗性的抗病检测分析结果图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
本发明建立了一套利用发明人克隆的一个优质抗病调控基因SlASN2，采用基因工程技术创制和获取抗病对象广的抗病植物材料的技术体系。主要步骤包括：
1)番茄(Solanumlycopersicum)SlASN2基因的克隆和保存
本发明提供的番茄(Solanumlycopersicum)SlASN2基因通过以下步骤克隆获得。先根据番茄基因组数据库中ASN2序列设计了引物SlASN2-F(5’-ccgagctcatgtgtggaatacttgcaatt-3’，斜体部分为SacⅠ酶切位点)(序列如SEQID：3所示)，以及SlASN2-R(5’-caggtacctcatagttctttaacctcata-3’，斜体部分为KpnⅠ酶切位点)(序列如SEQID：4所示)。采用TRIZOL试剂提取本氏烟叶片总RNA，采用RT-PCR方法扩增获取SlASN2cDNA，通过1％琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收PCR产物，连接pGEM-T载体，热击转化大肠杆菌DH5α，在LB培养基中摇菌培养过夜，提取质粒，采用SacⅠ/KpnⅠ酶切的方法和以SlASN2-F/SlASN2-R为引物对的PCR方法分别检验所提取的质粒是否包含SlASN2基因，最后送公司测序验证，从而成功克隆和获取SlASN2基因cDNA全长序列。
转化了携带有番茄SlASN2基因序列的载体的大肠杆菌，保存于－80℃冰箱。因此，可随时通过活化菌株，提取质粒，通过PCR扩增和酶切，将SlASN2基因亚克隆至目的载体中，用于转基因等研究。
2)SlASN2基因表达结构的构建和获取
对携带有SlASN2基因序列的载体进行SacⅠ/KpnⅠ双酶切，通过电泳和割胶回收SlASN2基因ORF序列，亚克隆入植物表达载体中的强启动子——花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子之后，获取能强烈表达SlASN2基因的植物表达结构。
3)转化SlASN2基因表达结构的农杆菌的获取
将SlASN2基因表达结构通过电击等方法转化对植物具有强侵染能力的农杆菌菌株，获取携带SlASN2基因表达结构的农杆菌。
4)转SlASN2基因植物的创制和获取
通过农杆菌介导法将SlASN2基因导入目的植物。先以携带SlASN2基因表达结构的农杆菌感染目的植物组织外植体。再通过抗性芽的筛选，生根，抗性植株的获取和鉴定等步骤，获取再生的转SlASN2基因植物T0代。
5)转SlASN2基因植物纯合系的筛选鉴定和获取
分别以抗生素抗性和SlASN2基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的单位点整合的转SlASN2基因植物纯合系。
6)广谱抗病的转SlASN2基因植物纯合系的筛选鉴定和获取
以转SlASN2基因植物纯合系为材料，检测分析对由真菌、细菌和病毒等各类病原物引起的病害的抗性，获取广谱抗病的转SlASN2基因植物。
实施例2广谱抗病的转SlASN2基因烟草植株的获取
主要操作步骤包括：
1)SlASN2基因表达结构的构建和获取
对发明人实验室拥有的携带SlASN2基因序列的载体进行SacⅠ/KpnⅠ双酶切，通过电泳和割胶回收SlASN2基因ORF序列，亚克隆入植物表达载体pCHF3中的强启动子——花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子之后，获取能强烈表达SlASN2基因的植物表达结构pCHF3::SlASN2。
2)转化SlASN2基因表达结构的农杆菌的获取
吸取1～2μlSlASN2基因表达结构pCHF3::SlASN2，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-RadGenePulserII电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1mlYEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因SlASN2的存在。获取携带SlASN2基因表达结构的EHA105农杆菌。
3)转SlASN2基因烟草植株的创制和获取
携带SlASN2基因表达结构pCHF3::SlASN2的EHA105农杆菌对烟草组织外植体的感染——烟草种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的叶片切成0.5～1cm大小，作为无菌外植体。先置于含1.0mg/L6-BA的分化培养基预培养2-3d，再转入终浓度为OD6000.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的转基因选择培养基中继续培养。
转SlASN2基因烟草植株的再生——待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测目的基因SlASN2的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。获取再生的转SlASN2基因烟草T0代。
4)转SlASN2基因烟草纯合系的筛选鉴定和获取
将T0代转基因烟草植株上收获的种子进行表面消毒，播种于加有200mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上，筛选出抗性苗，同时对抗性苗采用PCR检测SlASN2基因的存在和表达。收获种子后，播种于同样抗性培养基上，选择抗性与非抗性呈接近3：1比例分离的后代，对该代苗进行同样筛选和分析。选择获取后代没有产生转基因分离现象、并能稳定遗传的单位点整合的转SlASN2基因烟草纯合系。
5)广谱抗病的转SlASN2基因烟草纯合系的筛选鉴定和获取
以转SlASN2基因烟草纯合系为材料，分别接种各类病原物，检测分析转SlASN2基因烟草对这些病害的抗性。检测分析的病原物包括：卵菌类——瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)；真菌类——烟草炭疽病菌(Colletotrichumdestructum)、烟草立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、烟草菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)；细菌类——烟草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)；病毒类——烟草花叶病病毒(Tobaccomosaicvirus，Cucumbermosaicvirus)、烟草脆裂病病毒(Tobaccorattlevirus)、烟草曲叶病病毒(Tobaccoleafcurlvirus)；以及线虫类——烟草根结线虫病(Meloidogyneincognita)等。此外，检测分析转SlASN2基因烟草对引起水稻白叶枯病的病原细菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的非寄主抗性。
通过检测分析对由各类病原物所致病害的抗性，获取抗性水平高、广谱持久抗病的转SlASN2基因烟草。
有关转SlASN2基因烟草纯合系表现对TMV病毒病、菌核病和野火病的抗性检测结果参见图1、图2和图3。图1为SlASN2基因过量表达的转基因烟草植株显示对TMV病毒抗性的抗病检测分析结果图。左图为野生型与SlASN2基因过量表达转基因烟草植株(SlASN2-OE)叶片接种TMV20d后的发病情况。照片显示对照植株表现严重病毒病症状，叶片花叶、皱缩，植株生长受到明显抑制，不能开花，而转基因植株症状则显著减轻，植株能正常开花和形成种子。右图为对病叶中TMV病毒的外壳蛋白基因CP与运动蛋白基因MP的基因表达分析结果。检测结果显示，转基因植株叶片中积累的病毒量显著低于野生型植株。表明SlASN2转基因烟草植株表现出了对TMV的抗性。
图2为SlASN2基因过量表达的转基因烟草植株显示对菌核病抗性的抗病检测分析结果图。核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)是破坏性最强的真菌之一，导致菌核病。图中结果显示，野生型普通烟植株叶片在接种该菌36h后表现出强烈的病害症状，形成直径达1.6cm的病斑。但SlASN2-OE转基因烟草植株叶片表现的症状明显减轻，病斑直径只有约1cm。表明SlASN2转基因烟草植株表现出了对菌核病的抗性。
图3为SlASN2基因过量表达的转基因烟草植株显示对野火病抗性的抗病检测分析结果图。左图为野生型与SlASN2-OE烟草植株叶片接种野火病菌30h后的症状。SlASN2-OE转基因烟草植株表现的坏死比野生型更轻。右图为两种植株接种野火病菌后叶片中病菌菌量的统计分析结果。结果显示，SlASN2-OE转基因烟草叶片中的病菌菌量比野生型低大约0.5个数量级。表明SlASN2转基因烟草植株表现出了对野火病的抗性。

Claims (3)

1.一个植物抗病调控基因，其特征在于，该基因命名为SlASN2，其核苷酸序列如SEQID：1所示，该基因的开放阅读框长1680bp，编码一种天冬酰胺合成酶，由559个氨基酸组成，其序列如SEQID：2所示，该基因编码产物包含谷氨酰胺氨基转移酶结构域和天冬酰胺合酶结构域。
2.权利要求1所述的一种植物抗病调控基因在通过创制转SlASN2基因植物来获取广谱抗病材料中的应用，其特征在于，在通过创制转SlASN2基因烟草纯合系来获得烟草病毒病、菌核病和野火病的抗病材料中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)SlASN2基因表达结构的构建和获取
将SlASN2基因ORF插入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达，
(2)转化SlASN2基因表达结构的农杆菌的获取
将SlASN2基因表达结构通过电击方法转化对植物具有强侵染能力的农杆菌菌株，
(3)转SlASN2基因植物的创制和获取
通过农杆菌介导法将SlASN2基因导入目的植物，获取转SlASN2基因的植物，
(4)转SlASN2基因植物纯合系的获取
分别以抗生素抗性和SlASN2基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的含单位点整合的转SlASN2基因的植物纯合系，
(5)广谱抗病的转SlASN2基因植物纯合系的筛选鉴定和获取
以转SlASN2基因植物纯合系为材料，检测分析对由卵菌、真菌、细菌、病毒和线虫等各类病原物引起的病害的抗性，获取广谱抗病的转SlASN2基因植物。
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Citations (2)

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CN1053641A (zh) * 1990-01-26 1991-08-07 赫彻斯特股份公司 表达原核生物铵依赖性天冬酰胺合成酶的转基因植物
CN102111018A (zh) * 2009-12-23 2011-06-29 三星Sdi株式会社 储能系统及其控制方法

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