CN104349665A - 具有高种子生产力的环境应激抗性植物及生成该植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有对环境应激的高抗性和高种子生产力的植物，更具体地，涉及一种经转化的植物，其被遗传修饰为过表达多腺苷酸结合蛋白(PABN)基因且具有增强的环境应激抗性和增强的种子生产力。

Description

具有高种子生产力的环境应激抗性植物及生成该植物的方法
发明领域
本发明涉及一种具有高环境应激抗性和高种子生产力的植物，以及生成该植物的方法。
发明背景
干旱或盐引起的环境应激显著影响植物生长。还有，冷冻应激导致植物中的严重细胞损伤。结果，这类环境应激显著影响着作物生产力(productivity)。因此，已进行了多种类型的致力于赋予作物以环境应激抗性的研究和开发。
最近数年来，经由植物转化技术生成了其中导入多种基因的转基因植物。例如，报道了其中导入合成氨基酸脯氨酸的酶基因的植物变得对干旱或盐应激耐受，这是因为由脯氨酸提供的渗透调节功能(非专利文献1)。还报道了通过导入调节应激应答的转录因子。还报道了通过导入调节应激应答的转录因子基因可以激活应激应答，而且可对植物赋予干旱、盐和低温应激抗性(非专利文献2)。披露了通过过表达编码RNA结合蛋白的基因，可以进一步生成具有低温应激抗性的转基因植物(专利文献1)。
然而，转录因子基因的过表达导致由该转录因子基因诱导的所有基因的过表达。结果，即使所得植物获得环境应激抗性，有时也会观察到对生长的不利影响(例如植物矮小)(非专利文献3)。因此，期待发现赋予环境应激抗性且不因其过表达而导致不利影响的新基因以及转基因表达技术中的改进。
世界范围内的许多人以谷物作为主食，改进其生产力是一项至关重要的目的。已进行了对谷物植物赋予环境应激抗性的尝试，但还期望开发出除了环境应激抗性以外还具有高生产力的谷物植物。
引用列表
专利文献
专利文献1：JP 2007-282542A
非专利文献
非专利文献1:Kishor P,Hong Z,Miao GH,Hu C和Verma D.,Plant Physiol.,August 1995；108(4):1387-1394
非专利文献2:Liu Q,Kasuga M,Sakuma Y,Abe H,Miura S,Yamaguchi-Shinozaki K和Shinozaki K.,Plant Cell,August 1998,10(8):1391-406；Jaglo-Ottosen K.R.,Gilmour S.J.,Zarka D.G.,Schabenberger O.,Thomashow M.F.,Science,April 3,1998；280(5360):104-6
非专利文献3:Liu Q,Kasuga M,Sakuma Y,Abe H,Miura S,Yamaguchi-Shinozaki K和Shinozaki K.,Plant Cell,August 1998；10(8):1391-406
发明概述
本发明要解决的问题
本发明的根本问题是提供具有高环境应激抗性和种子生产力的植物。
用于解决问题的手段
发明人进行了大量研究以解决上述问题。结果，他们发现了通过将PABN基因导入植物中能有效地增强环境应激抗性和种子生产力两者。这导致本发明的完成。
具体地，本发明包括以下项。
[1]一种经转化的植物，具有增强的环境应激抗性和增强的种子生产力，该植物被遗传修饰为过表达多腺苷酸结合蛋白(polyadenylate-binding protein,PABN)基因。
[2]依照[1]的经转化植物，其中已经导入以下PABN基因(a)至(f)的至少一种:
(a)包含如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列的基因；
(b)包含在严格条件下与由SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；
(c)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列；
(d)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含自如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性；
(e)包含与如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列有85％或更高同一性的核苷酸序列且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；和
(f)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含与如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列有90％或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性。
[3]依照[1]或[2]的经转化的植物，其中所述环境应激抗性是盐应激抗性、干旱应激抗性、和/或冷冻应激抗性。
[4].依照[1]至[3]中任一项的经转化的植物，其为谷物植物或含油种子植物。
[5]一种用于增强植物的环境应激抗性和种子生产力两者的方法，包括将多腺苷酸结合蛋白(PABN)基因导入植物细胞中并选择其中环境应激抗性和种子生产力得到增强的经转化植物。
6.依照[5]的方法，其中所示PABN基因是以下(a)至(f)的至少一种：
(a)包含如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列的基因；
(b)包含在严格条件下与由SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；
(c)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列；
(d)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含自如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性；
(e)包含与如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列有85％或更高同一性的核苷酸序列且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；和
(f)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含与如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列有90％或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性。
[7]依照[5]或[6]的方法，其中所述环境应激抗性是盐应激抗性、干旱应激抗性、和/或冷冻应激抗性。
[8].依照[5]至[7]中任一项的方法，其中所述植物为谷物植物或含油种子植物。
本说明书包括在日本专利申请No.2012-052018中披露的内容，本申请要求对其的优先权。
本发明的效果
本发明能提供具有高环境应激抗性和高种子生产力的植物。
附图简述
图1显示了在高盐浓度生长的导入AtPABN的经转化拟南芥(Arabidopsisthaliana)(即PABN过表达植物)和野生型株的关于盐应激抗性的实验的结果。图1A显示野生型株的结果而图1B显示PABN过表达植物的结果。
图2显示了在干旱条件下生长的导入AtPABN的经转化拟南芥(即PABN过表达植物)和野生型株的关于干旱应激抗性的实验的结果。图2A显示野生型株的结果而图2B显示PABN过表达植物的结果。
图3显示了在冷冻条件下生长的导入AtPABN的经转化拟南芥(即PABN过表达植物)和野生型株的关于冷冻应激抗性的实验的结果。图3A显示野生型株的结果而图3B显示PABN过表达植物的结果。
图4显示的图指示从导入AtPABN的经转化拟南芥(即PABN过表达植物)和野生型株获得的每个植物的种子数(种子生产力)。左边条显示野生型株的结果而右边条显示PABN过表达植物的结果。
图5显示的照片显示了导入AtPABN的经转化拟南芥植物(即PABN过表达植物)和野生型株的外观。
图6显示用于土壤杆菌(Agrobacterium)转化的载体的结构，该载体包含小麦PABN基因(TaPABN1或TaPABN2基因)。
图7显示的图指示导入TaPABN-过表达植物(T1代)中的基因的表达分析(RT-PCR)的结果。
图8显示的图指示TaPABN-过表达植物(T1代)的关于盐应激抗性的实验结果。
发明详述
用于实施本发明的实施方案
下文详细描述了本发明。
1.本发明的经转化的植物及其生成
本发明涉及一种经转化植物，其被遗传修饰为过表达PABN基因。依照本发明的经转化植物具有增强的环境应激抗性和种子生产力。
依照本发明的经转化的植物可以包含导入植物中的PABN基因。这类经转化植物亦称为转基因植物。
1)PABN基因及其产生
PABN基因编码多腺苷酸结合蛋白(PABN)。在本发明中，PABN基因可以是拟南芥PABN基因(AtPABN基因；亦称为"AtPABN1")，或者它可以编码来自另一植物物种的PABN且对应于AtPABN基因的基因。例如，PABN基因可以来自小麦。在本发明中，PABN基因还可以是那些基因中任一个的变体。本发明中使用的PABN基因可以自多种生物来源的任一种分离，所述生物包括植物、动物、细菌和真菌。例如，PABN基因优选来自谷物植物(grain plant)或产油种子植物。
一个来自拟南芥的PABN基因(即AtPABN基因)的例子是包含如SEQ IDNO:1中所示核苷酸序列的基因。如SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列编码包含如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白质。
一个来自小麦的PABN基因的例子是包含如SEQ ID NO:3或5中所示核苷酸序列的基因。如SEQ ID NO:3中所示核苷酸序列编码包含如SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的蛋白质，而如SEQ ID NO:5中所示核苷酸序列编码包含如SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的蛋白质。
进一步地，依照本发明的PABN基因可以是包含在严格条件下与由SEQID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因。
依照本发明的PABN基因可以是编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列。或者，该基因可以是编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含自如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个(2至9，优选2至5)氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性。
或者，依照本发明的PABN基因可以是包含与如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列有85％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，且特别优选98％或更高(例如99％或更高)同一性的核苷酸序列且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因。还有，依照本发明的PABN基因可以是编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含与如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列有至少90％或更高，优选95％或更高，更优选97％或更高，且进一步优选98％或更高(例如99％或更高)同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性。
依照本发明，术语“严格条件”指以下条件，在该条件下彼此具有至少85％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，且特别优选98％或更高(例如99％或更高)序列同一性的两个核酸之间形成特异性核酸杂交体，而具有比上述水平低的水平的同一性的核酸之间不形成杂交。更具体地，例如在严格条件下，反应条件包括15至750mM，优选50至750mM，且更优选300至750mM的钠盐浓度；25℃至70℃，且更优选55℃至65℃的温度；和甲酰胺浓度为0％至50％，且更优选35％至45％。在严格条件下，在杂交后，优选以15至600mM，优选50至600mM，且更优选300至600mM的钠盐浓度；和在50℃至70℃，优选55℃至70℃，更优选60℃至65℃的温度清洗滤纸(filter)。
术语“基因”用于本文可以指DNA或RNA。DNA的例子包括基因组DNA和cDNA，而RNA涵盖mRNA等。依照本发明的PABN基因除了PABN基因的开放阅读框的序列以外，还可以包含不翻译区(UTR)或转录调控区的序列。
依照本发明的PABN基因是否编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质可通过将包含其中掺入的这类基因的表达载体在合适的宿主中表达并检查所表达蛋白质的多腺苷酸结合活性来确定。可依照常规技术来检查蛋白质的多腺苷酸结合活性。一个具体的例子是用于检测RI标记的多核苷酸的结合的技术(Sachs,A.B.和R.D.Kornberg,1985,Nuclear Polyadenylate-Binding Protein,Mol.Cell.Biol.,5:1993-1996)。
依照常规技术，本领域技术人员能使用如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列或已知的PABN基因序列从自细胞提取的基因组DNA或RNA(包括mRNA)获得依照本发明的PABN基因。
例如，将通过常规逆转录技术从mRNA(依照常规技术从生物体的组织或细胞(例如植物叶)提取)合成的cDNA用作模板，使用基于已知PABN基因的核苷酸序列设计的引物实施PCR扩增。如此，可以获得包含PABN基因的DNA片段。
可以经由例如定点诱变修饰包含PABN基因的所得DNA片段的核苷酸序列。可以通过已知技术，如Kunkel方法或Gapped双链体方法，或与其等同的技术将突变引入DNA。诱变可使用定点诱变试剂盒，如Express试剂盒(TAKARA BIO INC.)或LA PCRTM in vitro Mutagenesis Series试剂盒(TAKARA BIO INC.)实施。
可依照常规技术将如上文描述地获得的包含PABN基因的DNA片段克隆到载体中。当将PABN基因通过土壤杆菌方法导入植物中时，优选将PABN基因克隆到基于土壤杆菌衍生的质粒的载体(例如二元载体)中，该载体能经由土壤杆菌将靶基因导入植物。优选使用的载体的例子包括基于pBI、pPZP和pSMA的载体。尤其优选使用基于pBI的二元载体或中间载体，且例子包括pBI121、pBI101、pBI101.2和pBI101.3载体。二元载体是能在大肠杆菌(Escherichia coli)和土壤杆菌中复制的穿梭载体。通过用携带二元载体的土壤杆菌细菌来感染植物，可将夹在载体的LB序列和RB序列(边界序列)之间的DNA区(即T-DNA)纳入植物基因组(EMBO Journal,10(3),697-704,1991)。当使用二元载体质粒时，可将PABN基因插入二元载体的LB序列和RB序列之间的位点中。或者，可将PABN基因掺入基于pUC的载体如pUC18、pUC19或pUC9载体中以直接将靶基因导入植物。还可以使用植物病毒载体，如花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)(CaMV)、菜豆金黄花叶病毒(Beangolden mosaic virus)(BGMV)、或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)(TMV)。
为了将PABN基因插入载体中，例如首先将纯化的DNA用适宜的限制酶切割，并插入适宜的载体DNA的限制酶位点或多克隆位点中，与该载体连接。需要PABN基因以使得该基因在靶植物中过表达的方式纳入载体中。为此，优选将PABN基因在载体中启动子或增强子的下游掺入。
对于“启动子”，可以使用任何具有调控其下游基因在植物细胞中表达的功能的启动子。例如，启动子可以以特异于植物的特定组织或特定发育阶段的方式诱导表达(即组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子)，它可以恒定地诱导在任何植物组织中在任意发育阶段的表达(即组成型启动子)，或者它可以在特定诱导物的存在下诱导表达(即诱导型启动子)。启动子可以源自或不源自植物。特定的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合酶基因启动子(Pnos)、玉米来源的遍在蛋白启动子、稻来源的肌动蛋白启动子、和烟草来源的PR蛋白启动子。增强子的一个例子是用于改进靶基因的表达效率的增强子区且包含CaMV35S启动子中的上游序列。
除了PABN基因以外，载体还优选包含终止子、多A添加信号、5'-UTR序列、标志基因等。可以使用终止子，其为终止由启动子诱导的基因转录的序列。其例子包括胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、章鱼碱合酶(OCS)基因终止子、和CaMV 35S RNA基因终止子。标志基因的例子包括卡那霉素抗性基因、艮他霉素抗性基因、万古霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、zeocin抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因和氨苄青霉素抗性基因。
2)生成被遗传修饰为过表达PABN基因的植物
在本发明中，可通过将上文获得的PABN基因导入植物以产生经转化植物来生成被遗传修饰为过表达PABN基因的植物。或者，在本发明中，可将增强内源性PABN基因在植物中表达的突变引入植物的基因组中。例如，可将会诱导更高水平表达的突变引入植物中内源性PABN基因的启动子中。
在本发明中，其中要过表达PABN基因的植物可以是单子叶或双子叶植物。单子叶植物的例子包括但不限于，属于禾本科(Gramineae)的植物如稻、大麦、小麦、玉米、甘蔗、结缕草、高粱、小米(Setaria italica)、和紫穗稗(Echinochloa esculenta)；百合科(Liliaceae)如芦笋(Asparagus officinalis)、百合属植物(Lilium)、洋葱(Allium cepa)、韭菜(Allium tuberosum)和Etythroniumjaponicum；和姜科(Zingiberaceae)如生姜(Zingiber officinale)、蘘荷(Zingibermioga)和姜黄(Curcuma longa)。双子叶植物的例子包括但不限于，属于十字花科(Brassicaceae)的植物如拟南芥、甘蓝(Brassica oleracea)、油菜(rapeseed)、花椰菜(cauliflower)、椰菜(broccoli)和日本萝卜(Japanese radish)；茄科(Solanaceae)如番茄、茄子、马铃薯和烟草；豆科(Leguminosae)如大豆、豌豆、菜豆(bean)和苜蓿(alfalfa)；葫芦科(Cucurbitaceae)如黄瓜、西瓜(melon)和南瓜；伞形科(Umbelliferae)如胡萝卜、芹菜和鸭儿芹(Cryptotaenia japonica)；菊科(Compositae)如莴苣；锦葵科(Malvaceae)如棉花和秋葵；藜科(Chenopodiaceae)如甜菜和菠菜；桃金娘科(Myrtaceae)如桉树和丁香；以及杨柳科(Salicaceae)如杨树。由于依照本发明的经转化植物具有改进的种子生产力，本发明中另外还优选使用谷物植物或含油种子植物作为其中要过表达PABN基因的植物。在本发明中，术语“谷物植物”指产生可食用种子的植物，且这类植物通常属于禾本科。谷物植物的例子包括小麦、大麦、黑麦等，以及稻和玉米。术语“含油种子植物”指产生含油种子，即具有高油和脂肪含量且用作生产油的起始材料的种子的植物。含油种子植物的例子包括油菜、芝麻、大豆、花生、红花和棉花。
可通过通用植物转化技术将PABN基因导入植物中，所述技术包括土壤杆菌方法、颗粒枪方法(particle gun method)、电穿孔、聚乙二醇(PEG)方法、微注射和原生质体融合方法。这些植物转化技术详细记载于普通教科书，如"New Edition,Experimental Protocols for Model Plants,Genetic Techniques toGenomic Analysis"(在Isao Shimamoto和Kiyotaka Okada的监督下，2001Shujunsha Co.,Ltd.)和文献如Hiei Y.等,"Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA."Plant J.,1994,6,271-282，以及Hayashimoto,A.等,"Apolyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production offertile transgenic rice plants.,"Plant Physiol.,1990,93,857-863。
在使用土壤杆菌方法的情况中，可将PABN基因掺入适用于土壤杆菌方法的载体中，可依照常规技术(例如冻融)将所得植物表达载体导入适宜的土壤杆菌菌株(例如根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens))，并且可将所得细菌菌株接种到植物中用于感染。如此，可将PABN基因掺入植物细胞基因组中。
土壤杆菌方法的例子包括多种技术，如将土壤杆菌细菌接种到原生质体中，其接种到组织或细胞培养物中，或其直接接种到植物中(即植物内(inplanta)方法)。当使用原生质体时，可通过以下方法将原生质体用土壤杆菌感染，该方法牵涉与包含Ti质粒的土壤杆菌细菌共培养或该方法牵涉与原生质球土壤杆菌细菌的融合(即原生质球方法)。当使用组织或细胞培养物时，可将靶植物的无菌培养的叶切片(叶盘)或愈伤组织用土壤杆菌感染。依照植物内方法，可将土壤杆菌直接接种到植物的种子或部分(例如芽)中以感染植物。
生长用土壤杆菌感染的植物(在感染愈伤组织等的情况中，通过常规技术来再生植物)以产生种子，收集所得种子，并对从其获得的植物进行两次或更多次自交。然后，通过选择纯合形式的携带PABN基因的经转化植物，可以获得包含其中导入的PABN基因的经转化植物。
或者，当通过颗粒枪方法将基因导入植物中时，例如依照制造商指示使用基因转移装置(例如PDS-1000，BIO-RAD)以将用包含PABN基因的DNA片段包被的金属颗粒轰击到样品中，由此将该基因导入植物细胞中以获得经转化的目的细胞。一般地，轰击优选以约450psi至2,000psi的压强，在离靶物约4cm至12cm的距离实施。依照常规植物组织培养技术在选择培养基中培养其中已导入PABN基因的经转化细胞，在再分化培养基(含有植物激素，如生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯或芸苔素，以适宜的浓度)中培养存活的细胞。如此，可以再生其中已导入PABN基因的经转化植物。
优选将导入的PABN基因掺入依照本发明的经转化植物的植物基因组中。或者，所述经转化植物可以携带PABN基因，例如以包含其的表达载体。
还优选确认导入的PABN基因在一般条件(例如在25℃)下在所得经转化植物中表达。
在本发明的背景中，术语“经转化植物”涵盖“T0代”，其为通过用土壤杆菌感染经由转化处理获得的刚再分化的植物，而且还涵盖“T1代”，其为从T0代植物的种子生长的子代；“T2代”和其进一步的后代植物。
依照本发明的经转化植物可以包含以杂合形式或优选以纯合形式导入其基因组中的PABN基因。依照本发明的经转化植物还涵盖其中PABN基因导入植物的仅一些细胞中的植物(即嵌合植物)。然而，更优选经转化植物在所有植物细胞中均携带导入的PABN基因。
本发明的经转化植物指以下任一种：全植物、植物器官(如根、茎、叶、花瓣、种子或果实)、植物组织(如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部或维管束)、和培养的植物细胞(如愈伤组织)。
在如上文描述地已导入PABN基因的经转化植物中，所述PABN基因是过表达的。术语“PABN基因的过表达”用于本文意指PABN基因表达水平被检测为显著超过相应植物的野生型株中的内源性PABN基因的表达水平。例如，当在来自经转化植物的生物样品的蛋白质提取物中测量的多腺苷酸结合活性显著高于在来自未经转化植物生物样品的蛋白质提取物中的多腺苷酸结合活性时，确定PABN基因是过表达的。
如上文描述所获得的被遗传修饰为过表达PABN基因的经转化植物(通常为其中导入PABN基因的经转化植物)具有增强的环境应激抗性和增强的种子生产力。
2.评估环境应激抗性和种子生产力
依照本发明的经转化植物具有增强的环境应激抗性。具体地，依照本发明的经转化植物优选具有以下至少一种：盐应激抗性、干旱应激抗性和冷冻应激抗性。
盐应激抗性是使得植物甚至在高盐浓度能以更高生存力生长的能力。盐应激抗性可通过，例如以高浓度(例如，在未经转化的植物不能生存或其将以低于5％的生存率存活的高盐浓度)向培养基中添加盐，使植物生长达给定的时间段，然后测定植物的生存率来评估。例如，可将植物在用NaCl(200mM)补充的MS培养基中生长一周，然后测定其生存率。依照本发明的经转化植物在盐应激条件下能以比未经转化的植物优选高5％或更高，更优选高10％或更高，进一步优选高30％或更高，仍进一步优选高50％或更高(例如60％或更高)的生存率存活，尽管生存率不限于上述水平。
干旱应激抗性是使得植物甚至在低水分含量的情况下能以更高生存力生长的能力。干旱应激抗性可通过，例如降低培养基中的水分含量(例如，通过将水分含量降低至未经转化植物不能生存或其将以低于5％的生存率存活的水平)，使植物生长达给定的时间段，然后测定植物的生存率来评估。依照本发明的经转化植物在干旱应激条件下能以比未经转化的植物优选高5％或更高，更优选高10％或更高，进一步优选高30％或更高，仍进一步优选高50％或更高(例如70％或更高)的生存率存活，尽管生存率不限于上述水平。
冷冻应激抗性是使得植物甚至在冷冻温度也能以更高生存力生长的能力。冷冻应激抗性可通过，例如降低培养温度至低于0℃(例如，通过将培养温度降低至未经转化植物不能生存或其将以低于5％的生存率存活的温度)，使植物生长达给定的时间段，然后测定所得生存率来评估。依照本发明的经转化植物在冷冻应激条件下能以比未经转化的植物优选高5％或更高，更优选高10％或更高，进一步优选高30％或更高的生存率存活，尽管生存率不限于上述水平。
可依照例如下文实施例中描述的方法来评估这些环境应激抗性。环境应激抗性由PABN基因过表达引起(例如，由PABN基因导入引起的增加的表达水平)。
依照本发明的经转化植物具有增强的种子生产力。不管是否对其施加环境应激，依照本发明的经转化植物均能以高产率产生种子。依照本发明的经转化植物能以比未经转化植物增加10％或更高，优选20％或更高，更优选30％或更高，进一步优选40％或更高的种子数来产生种子。
可依照例如下文实施例中描述的方法来评估种子生产力。依照本发明的经转化植物的高种子生产力由PABN基因过表达引起(例如，由PABN基因导入引起的增加的表达水平)。
因此，本发明涉及一种用于生成如上文描述的具有增强的环境应激抗性和增强的种子生产力两者的经转化植物的方法，和一种用于增强植物的环境应激抗性和种子生产力的方法，特征在于PABN基因过表达(例如，通过将PABN基因导入植物)。更具体地，本发明提供一种用于增强植物的环境应激抗性和种子生产力的方法，其包括例如将PABN基因导入植物细胞中，在需要时再生植物，并选出其中环境应激抗性和生产力得到增强的经转化植物。
依照本发明的方法，可通过PABN基因过表达在植物中增强环境应激抗性(如盐应激抗性、干旱应激抗性和冷冻应激抗性)和种子生产力两者，而不形成不利的性状，如矮小。如此，本发明的方法是非常有利的。
实施例
下文中参照以下实施例更详细地描述了本发明，不过本发明的技术范围不限于这些实施例。
实施例1：产生导入PABN的经转化拟南芥
1.cDNA合成
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)自拟南芥(Columbia-0)的莲座叶提取总RNA。使用获得的RNA，用PCR Core试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA。
2.从cDNA分离AtPABN基因区段
使用上文合成的cDNA作为模板，用下面显示的正向和反向引物实施PCR。
正向引物:5'-AAACCTTCCCTTCTTTCCCG-3'(SEQ ID NO:7)
反向引物:5'-TCAGTACGGTCTGTAGCGCA-3'(SEQ ID NO:8)
这些正向和反向引物设计为扩增AtPABN基因(AtPABN1；At5G51120)的已知核苷酸序列(GenBank登录号NM_001203582)的从5’UTR到终止密码子的区域。PCR在50μl反应系统中进行。PCR反应溶液通过混合0.2μl的Ex TaqDNA聚合酶(5单位/μl,TAKARA BIO INC.)、5μl的10x聚合酶缓冲液(含有MgCl2)、2.5μl的2.5mM dNTP溶液、0.1μl的每种引物(10pmol/μl)、和上文合成的2μl cDNA(约1μg/μl)来制备，且将反应溶液的总量用Milli-Q水调整为50μl。PCR条件和反应循环数在下表1中汇总。
表1
在完成PCR后，通过电泳检查PCR产物，且观察到预测长度(约700个核苷酸)的核酸片段的扩增。使用pGEM-Teasy Vector Systems(Promega)对获得的片段进行克隆，并获得多个阳性克隆。使用BigDye Terminator v1.1Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems)和ABI DNA测序仪(3130DNA Sequencer)对这些阳性克隆中含有的DNA插入测序。将测定的核苷酸序列相比于上文所述的已知AtPABN基因的已知序列进行分析，由此验证克隆的DNA插入是AtPABN基因(拟南芥PABN基因)。获得的AtPABN基因ORF的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:1，且由其编码的蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2。
3.使用土壤杆菌将AtPABN基因导入拟南芥
将如上文所述分离的AtPABN基因以有义方向插入基于Ti的载体pBI121载体(Clonetech)中CaMV35S启动子的下游。
一开始，将如上文所述通过将AtPABN基因插入pGEM-Teasy载体制备的质粒用XhoI和SacI处理以制备XhoI-SacI片段。将所得含有AtPABN基因的XhoI-SacI片段以有义方向连接到经XhoI和SacI消化的pBI 121载体中。将所得核酸构建体经由冻融转化到土壤杆菌(GV3101/Pmp-90)中(Hofgen等,Storageof competent cells for Agrobacterium transformation,Nucleic Acids Res.,October 25,1998；16(20):9877)。为了选出经转化的土壤杆菌菌株，在含有50mg/l卡那霉素(用于卡那霉素抗性)和100mg/l艮他霉素(用于艮他霉素抗性)的YEP培养基上筛选进行基因转移的土壤杆菌菌株。将选定的菌落培养在含有卡那霉素和艮他霉素的5ml YEP培养基中达20至24小时，接种到含有卡那霉素和艮他霉素的100ml YEP培养基中，并培养直至O.D.600达到0.80。将细菌培养溶液在室温以5000x g离心10分钟。将沉淀的细菌细胞在50ml花滴落培养基(Floral dropping medium)中裂解。将裂解物注射到拟南芥芽中3至5次。将经土壤杆菌注射的植物置于塑料袋中并允许在22℃在黑暗中过夜生长。次日，将植物转移到在22℃长日照条件。自用细菌注射植物后3天开始对植物给水。实验中使用的培养基的组成显示于表2和3。
表2
表3
*1000x MS维生素(1L)：100g肌醇、2g L-甘氨酸，
0.5g烟碱酸、0.5g的吡哆醇HCl和0.5g硫胺HCl
4.选择导入AtPABN的经转化植物
从已如上文描述转化和生长的拟南芥获得种子，并在灭菌溶液(70％乙醇和0.5％Triton X-100)中灭菌30分钟，然后进一步在100％乙醇中灭菌2分钟。之后，将种子播种到含有50mg/l卡那霉素和200mg/l万古霉素的MS培养基中。观察到从培养基中的种子正常生长的植物(即T1代)之间的自花传粉得到的T2代植物显示经转化植物和野生型株之间3:1的分离比。另外，选出携带纯合形式的转基因的T3代植物。该实验中使用的培养基的组成显示于表4。
表4
*1000x MS维生素(1L)：100g肌醇、2g L-甘氨酸，
0.5g烟碱酸、0.5g的吡哆醇HCl和0.5g硫胺HCl
在选出的导入AtPABN的经转化植物中，基于药物抗性基因的表达确认转基因的表达，其指示经转化植物过表达PABN基因。
实施例2：评估环境应激抗性
1.关于盐应激抗性的实验
将上文制备的导入AtPABN的经转化拟南芥植物(PABN过表达的植物)和野生型拟南芥株(Columbia-0)的种子(各25)播种到MS培养基(2％蔗糖，8％琼脂；pH 5.7至5.8)中。允许种子在22℃在连续光照条件下生长一周，转移至补充有NaCl(200mM)的MS培养基，然后允许在22℃在连续光照条件下生长4天。之后，测定其生存率。
关于盐应激抗性的实验的结果显示于图1。没有一个野生型株存活(生存率：0％)，而导入AtPABN的经转化拟南芥植物(图中的"PABN")以60％的生存率存活。这表明盐耐受性(盐应激抗性)在过表达PABN基因的经转化植物中显著改善。
2.关于干旱应激抗性的实验
将上文制备的导入AtPABN的经转化拟南芥植物(PABN过表达的植物)和野生型拟南芥株(Columbia-0)的种子(各48)播种到MS培养基(2％蔗糖，8％琼脂；pH 5.7至5.8)中。允许种子在22℃在连续光照条件下生长10天。之后，将植物转移至土壤(培养土：蛭石(vermiculite)＝3:1)，并允许在22℃在短日照条件下生长(在光照中10小时而在黑暗中14小时)。在开始土壤上的培养后第3天和第4天不施水，在第5天再次开始给水。在开始土壤上的培养后第10天测定生存率。
图2显示关于干旱应激抗性的实验结果。野生型株显示2％的生存率，而过表达PABN的植物(图中的"PABN")显示比野生型植物显著更高的生存率(即79％)。这表明干旱耐受性(干旱应激抗性)在过表达PABN基因的经转化植物中显著改善。
3.关于冷冻应激抗性的实验
将上文制备的导入AtPABN的经转化拟南芥植物(PABN过表达的植物)和野生型拟南芥株(Columbia-0)的种子(各12)播种到MS培养基(2％蔗糖，8％琼脂；pH 5.7至5.8)中。允许种子在22℃在连续光照条件下生长2周，将植物转移至土壤(培养土：蛭石＝1:2)，然后允许在22℃在短日照条件下生长(在光照中8小时而在黑暗中16小时)1周。之后，将种子在短日照条件下在4℃低温条件化1周。随后，将经转化植物置于程序化的冷冻器中并在-2℃培养1小时。出于冰核形成目的，用自来水喷洒经转化植物，随后用下列程序将其降温：每2小时将温度降低1℃直至-14℃，然后在4℃培养12小时。之后，将植物在22℃在短日照条件下培养1周并测定植物的生存率。
图3显示关于冷冻应激抗性的实验结果。没有一个野生型株存活(生存率：0％)，而过表达PABN的植物(图中的"PABN")显示比野生型植物显著更高的生存率(即33.3％)。这表明冷冻应激抗性在过表达PABN基因的经转化植物中显著改善。
实施例3：评估种子生产力
测试AtPABN基因转染对种子生产力的影响。将上文制备的导入AtPABN的经转化拟南芥植物(PABN过表达的植物)和野生型拟南芥株(Columbia-0)的种子播种到MS培养基(2％蔗糖，8％琼脂；pH 5.7至5.8)中。允许种子在22℃在长日照条件(光照中16小时而黑暗中8小时)下生长约1个月。这些生长条件是一般性条件，其包括未加入环境应激如盐、干旱或冷冻应激。在种子生长后，收集种子，并测定每植物产生的总种子数。
图4显示结果。种子数每植物对于野生型株为500个种子。相比之下，在PABN-过表达植物(图中的"PABN")中获得788个种子，其比野生型株的高1.46倍。在PABN-过表达植物中刺激花茎分支(Scape branching)且长角果(silique)的数目增加(图5)。该结果指示PABN基因以显著程度刺激种子形成并增强种子生产力。
实施例4：用小麦PABN基因生成经转化的小麦
以下文描述的方式生成经转化的小麦植物，其中过表达AtPABN基因的两种小麦直系同源基因TaPABN1基因(GenBank登录号：AK331378)和TaPABN2基因(GenBank登录号：AK335747)。
1.cDNA合成
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)自小麦(Triticum aestivum，栽培种：Yumechikara)的幼叶提取总RNA。使用获得的RNA，用PCR Core试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA。
2.从cDNA分离小麦PABN基因区段
使用上文合成的cDNA作为模板，用下面显示的正向和反向引物经由PCR扩增每种基因。
用于TaPABN1扩增的引物集
TaPABN1正向引物:5'-GATTCGGTTTCTAGCTCAGC-3'(SEQ ID NO:9)
TaPABN1反向引物:5'-GCCACAACTTAGTAGAAGGG-3'(SEQ ID NO:10)
用于TaPABN2扩增的引物集
TaPABN2正向引物:5'-TTAGATCGGAGAGAGACGGC-3'(SEQ ID NO:11)
TaPABN2反向引物:5'-TTCATGGAAGCCTCGTCCTC-3'(SEQ ID NO:12)
这些正向和反向引物集各自设计为扩增两种基因(TaPABN1和TaPABN2)的从5’UTR到终止密码子的区域。PCR在50μl反应系统中进行。PCR反应溶液通过混合0.2μl的Ex Taq DNA聚合酶(5单位/μl,TAKARA BIO INC.)、5μl的10x聚合酶缓冲液(含有MgCl2)、2.5μl的2.5mM dNTP溶液、0.1μl的每种引物(10pmol/μl)、和上文合成的2μl cDNA(约1μg/μl)来制备，且将反应溶液的总量用Milli-Q水调整为50μl。此处采用实施例1中显示于表1的PCR条件和反应循环数。
在完成PCR后，通过电泳检查PCR产物，且观察到预测长度(约650个核苷酸)的核酸片段的扩增。使用pGEM-Teasy Vector Systems(Promega)对获得的片段进行克隆，并获得多个阳性克隆。使用BigDye Terminator v1.1Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems)和ABI DNA测序仪(3130DNA Sequencer)对这些阳性克隆中含有的DNA插入测序。将测定的核苷酸序列相比于上文所述的TaPABN1和TaPABN2的核苷酸序列进行分析，由此验证克隆的DNA插入是TaPABN1和TaPABN2。获得的TaPABN1ORF的核苷酸序列显示于SEQ IDNO:3，且由其编码的蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4。还有，获得的TaPABN2基因ORF的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:5，且由其编码的蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:6。
3.使用土壤杆菌将小麦PABN基因导入小麦
将含有小麦PABN基因(上文TaPABN1基因或TaPABN2基因之一)的片段用限制酶BamHI和KpnI从通过将小麦PABN基因插入pGEM-Teasy载体制备的质粒切割，并将所得片段插入到二元载体pUBIN-ZH2的多克隆位点中的酶切割位点中。二元载体pUBIN-ZH2具有包含在花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合酶终止子之间的潮霉素抗性基因的盒，以及包含玉米遍在蛋白基因启动子(Plant physiology,Volume 100,1992,pp.1503-1507)和胭脂碱合酶终止子之间的多克隆位点的基因表达盒，其在pPZP202的T-DNA区内(P.Hajdukiewicz,Z.Svab和P.Maliga,1994,Plant Molecular Biology,25:989-994)。如此，产生用于土壤杆菌转化的两种载体类型，每种包含相应的小麦PABN基因(图6)。
将土壤杆菌菌株(LBA4404)用获得的相应转化载体经由冻融转化(Hofgen等,Storage of competent cells for Agrobacterium transformation,Nucleic Acids Res.,October 25,1998；16(20):9877)。另外，小麦(栽培种：Yumechikara)的转化用如上文描述的所获土壤杆菌的任一种实施。小麦转化经由如日本专利申请No.2005-513739中记载的植物内转化技术实施。
4.选出小麦PABN的经转化植物
使用植物DNAzol试剂(Life Technologies)从如上文描述的经转化小麦获得的T1代植物提取基因组。使用提取的基因组作为模板，使用下面显示的正向和反向引物进行基因组PCR。反向引物在胭脂碱合酶终止子上设计。
用于TaPABN1检测的引物集
TaPABN1正向引物:5'-GATTCGGTTTCTAGCTCAGC-3'(SEQ ID NO:9)
TaPABN1反向引物:5'-ATAATCATCGCAAGACCGGC-3'(SEQ ID NO:13)
用于TaPABN2检测的引物集
TaPABN2正向引物:5'-TTAGATCGGAGAGAGACGGC-3'(SEQ ID NO:11)
TaPABN2反向引物:5'-ATAATCATCGCAAGACCGGC-3'(SEQ ID NO:13)
PCR在50μl反应系统中进行。PCR反应溶液通过混合0.2μl的Ex TaqDNA聚合酶(5单位/μl,TAKARA BIO INC.)、5μl的10x聚合酶缓冲液(含有MgCl2)、2.5μl的2.5mM dNTP溶液、0.1μl的每种引物(10pmol/μl)、和上文合成的2μl cDNA(约1μg/μl)来制备，且将反应溶液的总量用Milli-Q水调整为50μl。此处采用实施例1中显示于表1的PCR条件和反应循环数。
通过以上文所述方式实施的基因组PCR来选择其中已导入小麦PABN基因的经转化植物。另外，迫使经转化植物自花授粉，收集种子，并选出以纯合形式携带小麦PABN基因的经转化小麦植物。
实施例5：确认经转化小麦的T1代植物中转基因的表达
(1)从T1转化体提取RNA并合成cDNA
在微型管中收集T1代经转化植物的叶(第一片和第二片叶)，并使用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)通过依照试剂盒所附的说明书的规程提取总RNA。使用1μg提取的总RNA，使用High Capacity RNA-to-cDNATM试剂盒(Applied Biosystems)经由逆转录合成cDNA。
(2)确认T1代植物中转基因的表达(经由RT-PCR)
使用实施例5(1)中制备的1μl cDNA溶液经由PCR确认转基因表达。PCR在表1中显示的条件下进行，只不过从变性步骤到延伸步骤的循环数变成30。使用下面显示的引物实施PCR。
TaPABN1RT-PCR正向引物:5’-GATTCGGTTTCTAGCTCAGC-3'(SEQID NO:14)
TaPABN1RT-PCR反向引物:5’-GCCACAACTTAGTAGAAGGG-3'(SEQ ID NO:15)
TaPABN2RT-PCR正向引物:5’-TTAGATCGGAGAGAGACGGC-3'(SEQ ID NO:16)
TaPABN2RT-PCR反向引物:5’-TTCATGGAAGCCTCGTCCTC-3'(SEQID NO:17)
如图7显示的，在其中导入TaPABN1或TaPABN2基因的T1代中产生表达该转基因的植物(即过表达TaPABN1或TaPABN2的株)。经由序列分析确认通过PCR获得的片段是TaPABN基因片段。
实施例6：评估导入TaPABN基因的小麦的生产力
测试TaPABN基因的导入对种子生产力的影响。将上文制备的导入TaPABN的小麦(TaPABN2过表达株)和野生型小麦株的各个植物(种子)播种到培养土壤中，然后允许种子在22℃在长日照条件(光照中16小时而黑暗中8小时)下生长约1个月。这些生长条件是一般性条件，其包括未加入环境应激如盐、干旱或冷冻应激。在种子生长后，测定每植物的分支(branching)数(即分支茎的总数)。当分支数目增加时，可以预期每个植物的穗(spike)数目增加和增加的产率。
表5显示结果。每单个植物的分支的平均数在野生型株中为3.4(n＝16)，而在TaPABN2过表达的株中为5.4(n＝8)，其比野生型株的数目大1.58倍。这表明TaPABN2基因以显著水平刺激分支并将种子生产力增强了50％或更高。
表5
TaPABN过表达的经转化株和野生型株的每个植物的分支的平均数(括号中的值代表标准偏差)
TaPABN2过表达的株 野生型株
5.4(±0.77) 3.4(±0.52)
实施例7：导入TaPABN2的小麦的关于盐应激抗性的实验
允许导入TaPABN2的小麦植物(TaPABN2过表达的株)和野生型小麦株的种子(各10个)在无菌水中发芽，然后允许在22℃在长日照条件下生长3天。之后，允许植物在含有NaCl(400mM)的无菌水中在22℃长日照条件下生长2天。将植物转移至培养土，允许生长，并在7天后进行生存率的测定。
图8显示在盐应激抗性实验后植物的照片。4个野生型株存活(生存率：40％)，而6个TaPABN2过表达的植物存活(生存率：60％)。该结果证明盐耐受性(盐应激抗性)在过表达TaPABN2基因的经转化植物中改善。
实施例8：生成导入AtPABN的经转化小麦
以与实施例4中所述相同的方式生成导入AtPABN的经转化的小麦植物，只不过将实施例1中获得的拟南芥PABN基因(即AtPABN基因)用作转基因。
使用基因组PCR选出其中已导入AtPABN基因的经转化植物。另外，迫使经转化植物自花授粉，收集种子，并选出以纯合形式携带AtPABN基因的经转化小麦植物。
与实施例1中生成的导入PABN的经转化拟南芥植物一样，这种经转化的小麦具有增强的环境应激抗性(盐应激抗性、干旱应激抗性和冷冻应激抗性)和种子生产力。
本文中引用的所有公开出版物、专利和专利申请均通过提述完整并入本文。
工业适用性
本发明适用于生产和培养具有高环境应激抗性和高种子生产力的植物。无序列表文本
SEQ ID NO:7至17显示引物。

Claims (8)

1.一种经转化的植物，具有增强的环境应激抗性和增强的种子生产力，该植物被遗传修饰为过表达多腺苷酸结合蛋白(PABN)基因。
2.依照权利要求1的经转化的植物，其中已经导入以下PABN基因(a)至(f)的至少一种：
(a)包含如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列的基因；
(b)包含在严格条件下与由SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；
(c)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列；
(d)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含自如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性；
(e)包含与如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列有85％或更高同一性的核苷酸序列且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；和
(f)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含与如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列有90％或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性。
3.依照权利要求1或2的经转化的植物，其中所述环境应激抗性是盐应激抗性、干旱应激抗性、和/或冷冻应激抗性。
4.依照权利要求1至3中任一项的经转化的植物，其为谷物植物或含油种子植物。
5.一种用于增强植物的环境应激抗性和种子生产力两者的方法，包括将多腺苷酸结合蛋白(PABN)基因导入植物细胞中并选出其中环境应激抗性和种子生产力得到增强的经转化的植物。
6.依照权利要求5的方法，其中所述PABN基因是以下(a)至(f)的至少一种：
(a)包含如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列的基因；
(b)包含在严格条件下与由SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；
(c)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列；
(d)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含自如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性；
(e)包含与如SEQ ID NO:1，3或5中所示的核苷酸序列有85％或更高同一性的核苷酸序列且编码具有多腺苷酸结合活性的蛋白质的基因；和
(f)编码以下蛋白质的基因，该蛋白质包含与如SEQ ID NO:2，4或6中所示的氨基酸序列有90％或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸结合活性。
7.依照权利要求5或6的方法，其中所述环境应激抗性是盐应激抗性、干旱应激抗性、和/或冷冻应激抗性。
8.依照权利要求5至7中任一项的方法，其中所述植物为谷物植物或含油种子植物。
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