实施例3:FKBP5基因突变对NF-κB、Akt信号通路影响
1、构建表达野生型及突变型FKBP5蛋白的真核表达载体
pcDNA3.1载体购自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)公司。通过设计引物,在FKBP5基因CDS序列的5’端引入BamH I酶切位点,3’端引入EcoR I酶切位点。引物序列如下:上游5’-GGATCCATGACTACTGATGAAGGTG-3’;下游5’-GAATTCTCATACGTGGCCCTCAGGTT-3’。使用该引物,以野生型或突变型FKBP5基因CDS序列为模板扩增目的片段。使用通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司),回收并纯化PCR产物。
纯化的PCR产物连接至pMD18-T(Takara,Tokyo,Japan)连接载体上,经转化、涂板筛选、菌落PCR鉴定连接有野生型或突变型FKBP5基因CDS序列的阳性克隆。扩增阳性pMD18-T载体并测序,序列正确的质粒使用BamH I和EcoR I(Fermentas,Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)限制性内切酶酶切,并回收包含有野生型或突变型FKBP5基因CDS序列的酶切产物。将所得酶切产物与事先使用BamH I和EcoR I限制性内切酶酶切为线性的pcDNA3.1载体进行连接,经转化、涂板筛选、菌落PCR鉴定成功连接野生型或突变型FKBP5基因CDS序列的pcDNA3.1载体的阳性菌落。扩增阳性菌,提取质粒,即为实验所需能够表达野生型或突变型FKBP5蛋白的真核表达载体。
真核表达载体的图谱如图3所示。
2、荧光素酶报告基因检测
将野生型pcDNA3.1-FKBP5质粒、突变型pcDNA3.1-FKBP5质粒、pcDNA3.1质粒(空载体对照,购自Invitrogen)分别与PGL4.32[luc2p/NF-κB-RE/Hygro]质粒(购自Promega(Madison,WI,USA))和PRL-TK质粒(购自Promega(Madison,WI,USA))共转染到HEK293细胞(购自美国ATCC细胞库(Manassas,VA,USA))内,获得野生型组、突变型组和空载体对照组细胞,通过检测各转染组细胞的荧光素酶活性(luciferase assay)反应NF-κB的转录启动活性。
HEK293细胞质粒转染及荧光素酶报告基因检测方法:
将HEK293细胞密度调整至2×105细胞/ml,接种到96孔全白酶标板中,每孔100μl细胞悬液,共接种9孔。野生型组(pcDNA3.1-FKBP5(V55))、突变型组(pcDNA3.1-FKBP5(L55))以及对照组(pcDNA3.1)各设置3个复孔。
细胞培养24小时后弃掉板内培养基,每孔加opti-MEM转染培养基75μl。将质粒以及Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)转染试剂按照以下稀释比稀释(每孔用量):
将稀释后的质粒和转染试剂混合,室温孵育10min后加入相应的孔内,放入孵箱培养4小时。转染4小时后换液,用DMEM完全培养基继续培养细胞24小时。
转染24小时后,向96孔板内加入TNF-α因子活化HEK293细胞,终浓度20ng/ml。活化4小时候,裂解细胞并检测胞内荧光强度。
使用Dual-Glo荧光素酶分析系统试剂盒检测荧光素酶活性,该试剂盒购自Promega(Madison,WI,USA)。简要操作步骤如下:将荧光素酶缓冲液全部加入到荧光素酶底物中,颠倒混匀,配制成荧光素酶试剂。计算stop&Glo试剂用量,并将终止试剂和Glo试剂以1:100稀释比稀释配制所需stop&Glo试剂。
每孔加入75μL荧光素酶试剂,室温孵育10min。使用EnSpireTM多模式板阅读仪读取并记录萤火虫荧光强度。继续向每孔中加入stop&Glo试剂75μL,混匀后室温孵育10min。使用EnSpireTM多模式板阅读仪读取并记录海肾荧光强度。
将所测萤火虫荧光值与海肾荧光值相比较,即为每一实验组的相对荧光素酶活性,反应各组NF-κB转录因子的转录启动活性。荧光素酶活性分析显示,野生型组、突变型组及空载体对照组HEK293细胞的相对荧光素酶活性分别为:野生型组10.52±0.83,突变型组11.20±0.78,空载体对照组8.79±0.67。其中野生组与突变组之间相对荧光素酶活性无统计学差异,p=0.3624;野生组与突变组相对荧光素酶活性均高于对照组(野生组VS对照组:10.52±0.83 VS 8.79±0.67,p=0.0479;突变组VS对照组:11.20±0.78 VS 8.79±0.67,p=0.0152;图5)。说明转染FKBP5后,NF-κB转录启动活性增高。但是,V55L突变不影响FKBP5蛋白对NF-κB转录启动活性的调控作用。
3、NF-κB核转位检测
将野生型pcDNA3.1-FKBP5质粒、突变型pcDNA3.1-FKBP5质粒、pcDNA3.1质粒分别转染到HEK293细胞内,通过蛋白免疫印迹实验检测各转染组细胞活化前后胞核与胞质蛋白中p65的量以及胞质蛋白中IκB的量,反应NF-κB核转位水平。
结果如图5所示。图中所示对照组为不加刺激的对照组,TNF-α组为实验组。Cyt代表胞浆蛋白样品,Nuc代表胞核蛋白样品,H3指组氨酸-H3。由图可见,胞浆内IκB在细胞活化后降解。同时,经TNF-α活化后,可见P65在胞质蛋白内总量下降,在胞核蛋白内总量上升,说明P65蛋白由胞质转移到了胞核。三组之间IκB降解程度以及P65核转位水平无明显差异,说明FKBP5对NF-κB核转位水平并无明显调控作用,同时FKBP5V55L突变不影响FKBP5对NF-κB核转位的调控作用。可以看出,经TNF-α活化后,野生型组与突变型组HEK293细胞中,P65核转位水平及IκB降解水平无明显差异(图5),说明该突变不影响NF-κB核转位水平。
4、Akt Ser473磷酸化水平检测
将野生型pcDNA3.1-FKBP5质粒、突变型pcDNA3.1-FKBP5质粒、pcDNA3.1质粒分别转染到HEK293细胞内。转染后的细胞血清饥饿24小时,使用脂多糖(LPS)刺激活化。提取活化后细胞的总蛋白,经蛋白免疫印迹实验检测细胞内Akt Ser473位点磷酸化水平,研究野生型及突变型FKBP5对Akt磷酸化的调节作用有无差异。
结果显示,野生型组或突变型组HEK293细胞,其FKBP5表达水平明显上升,证明质粒转染成功,目的蛋白质FKBP5过表达(图6.A)。野生型组HEK293细胞在经过LPS活化后,其Akt ser473位点磷酸化水平低于空载体对照组,p=0.0412,说明FKBP5过表达后降低Aktser473位点磷酸化水平;野生型组与突变型组相比,野生型组Akt ser473位点磷酸化水平低于突变型组,p=0.0075,证实V55L突变体FKBP5蛋白增高Akt ser473位点磷酸化(图6.B、C)。
实施例4:FKBP5基因突变对小鼠破骨细胞影响及表型研究
1、FKBP5 c.163G>C点突变C57BL/6小鼠构建及鉴定
点突变小鼠构建策略:a.ES打靶载体设计和构建。由赛业生物科技有限公司构建含有引入了c.163G>C点突变的同源臂序列、loxP位点以及新霉素筛选标签(Neo cassette)的ES打靶载体。b.打靶载体电转ES细胞、筛选阳性克隆。将构建好的打靶载体电转至C57BL/6 ES细胞(赛业生物科技有限公司)内,利用新霉素抗性筛选阳性细胞并通过PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳、sanger测序以及southern blot等鉴定阳性电转克隆。c.ES显微注射。将阳性ES细胞显微注射到囊胚中,然后将显微注射后的囊胚回送到代孕鼠(C57BL/6小鼠,来源于赛业生物科技有限公司,鼠龄9-10周)输卵管或者子宫中,最终获得嵌合体小鼠。d.F1代小鼠繁殖。将得到的嵌合体小鼠和cre小鼠(来自赛业生物科技有限公司,鼠龄8-9周)进行交配繁殖,并进行基因型鉴定,其中带有目的基因点突变且已成功敲除新霉素抗性的F1代杂合子小鼠即为实验所需FKBP5V55L点突变杂合子小鼠。小鼠打靶及构建策略见图7所示。对F1代杂合子小鼠后代进行分析。
小鼠基因型鉴定:通过sanger测序和PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。
Sanger测序法引物序列:
上游:5’-CCTCGAGGCATGCGATAATCTAGCT-3’
下游:5’-GGCAAATGGCTTCTTTCTGTCATG-3’
测序方法同前文所述人FKBP5基因测序方法。测序鉴定的图谱如图14所示。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳法引物序列:
上游:5’-TGTGTACCTTTGCCTGCTCATGA-3’
下游:5’-CCAGAGCAAGGCAAAAGGATCACT-3’
如图15所示,使用该引物扩增的PCR产物,不同基因型小鼠所得产物长度不同。野生鼠:195bp;杂合鼠:195bp、320bp;纯合鼠:320bp。因此,根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果可以判定小鼠基因型。如图所示,第13/14/19泳道样本来自野生小鼠,第2/3/5/6/7/8/9/12/17/18/20/22泳道样本来自杂合小鼠,而第4/10/11/15/16/21泳道样本来自纯合突变鼠。
根据多重鉴定结果,获得杂合鼠和纯合鼠,对这些小鼠进行后续试验。
2、小鼠破骨细胞分化及功能研究
分离培养FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠骨髓来源的单核/巨噬细胞系细胞(bone marrow-derived monocyte/macrophage cells,BMM):
脱颈处死7-8周大小实验小鼠,游离其股骨和胫骨。剪去股骨和胫骨两端软骨,露出骨髓腔。使用2ml无菌注射器将骨髓细胞吹至一个15ml离心管内,离心收集骨髓细胞。向骨髓细胞沉淀中加入1mlα-MEM(invitrogen)培养基重悬细胞,并加入3倍体积红细胞裂解液裂解红细胞。离心,收集细胞。使用α-MEM完全培养基(含10%FBS)将细胞密度调整为1×107/10ml并接种到100mm平皿内,每皿接种10ml细胞悬液。培养基中加入终浓度为5ng/ml的M-CSF因子,接种好的细胞置于细胞培养箱中培养。
12-16小时后,收集平皿内未贴壁的悬浮细胞。收集得到的悬浮细胞用α-MEM完全培养基重新悬起并计数,按照1.5×105个/孔的细胞密度接种到48孔板内,每孔接种体积为0.25ml。培养基中加入终浓度为30ng/ml的M-CSF因子,继续培养3d。换液,弃掉悬浮细胞,所得贴壁细胞即为小鼠骨髓来源单核/巨噬细胞(BMM)。
小鼠BMM诱导破骨细胞分化及TRAP染色鉴定:
48孔板中单核/巨噬细胞继续加M-CSF及RANKL因子诱导分化。每孔加入含有M-CSF(30ng/ml)以及不同浓度的RANKL(0、30ng/ml、70ng/ml、150ng/ml)因子的α-MEM完全培养基250μl,培养6-7天。使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(货号:387A,sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)进行TRAP染色。操作步骤严格按照试剂盒所附说明书进行。破骨细胞鉴定方法:胞核≥3个,TRAP染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞。
TRAP染色结果显示,当RANKL诱导浓度较低(30ng/ml),野生鼠和纯合突变鼠骨髓来源单核巨噬细胞分化为破骨细胞的数量较少,且两组之间无显著差异(野生组VS突变组:17.0±4.2 VS 33.5±14.8;p=0.3468);而当RANKL诱导浓度增高(70ng/ml、150ng/ml)后,两组破骨细胞数目均明显上升,且突变组所形成的破骨细胞数目显著多于野生组(70ng/ml,野生组VS突变组:42.7±7.6 VS 72.2±13.2;p=0.0284;150ng/ml,野生组VS突变组:55.7±22.1 VS 130.3±23.5;p=0.0162)。TRAP染色结果图及破骨细胞数目统计分别见图8、9。
陷窝吸收实验:
牛骨切片购自贵州医科大学,规格为50μm厚、60*40mm大小正方形骨片。牛骨切片保存于含有100IU双抗的PBS缓冲液中,4℃保存。切片在使用前需用超声清洗三次。取实验所需的牛骨切片,置于PBS缓冲液中,100Hz/min频率超声三次,每次5分钟。超声清洗后的切片用75%酒精冲洗一遍,然后浸泡在75%酒精内大于2小时。将切片取出,置于48孔板内,开盖照紫外灭菌,切片每一面照紫外1小时。种板前,将灭菌后的骨片置于48孔板内,加入α-MEM培养基,放到37℃培养箱内2小时,饱和切片。
分离培养FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠BMM,并接种在牛骨切片上。加入含有RANKL(100ng/ml)、M-CSF(50ng/ml)的α-MEM完全培养基,诱导细胞分化。每隔两天换液,培养6-7天后进行甲苯胺蓝染色。染色步骤如下:将骨片置于2.5%戊二醛固定液固定7min,然后用0.25M氨水溶液超声清洗骨片,超声频率100Hz/min,每次5min,共清洗3次。清洗后的切片经系列乙醇脱水(70%乙醇,5min;75%乙醇,5min;80%乙醇,5min;90%乙醇,5min;95%乙醇,5min;100%乙醇,5min;100%乙醇,10min),自然晾干。1%甲苯胺蓝染液室温染色3-4min,蒸馏水清洗后光镜下观察骨片陷窝吸收情况并拍照。使用image pro plus软件,计算陷窝吸收面积。统计10倍物镜下每视野内陷窝吸收面积。
如图10所示,牛骨切片骨陷窝形成实验证实,每低倍镜视野下(40×)突变鼠破骨细胞形成的吸收陷窝面积大于野生鼠破骨细胞形成的陷窝面积(野生组VS突变组:4.73±1.02VS 8.29±0.66;p=0.0071;图10)。说明在体外实验中,FKBP5V55L点突变小鼠破骨细胞骨吸收活性高于野生组。
3、小鼠表型研究
取10个月大FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠股骨及胫骨并固定。固定后的标本使用西门子Inveon micro-CT检测仪扫描。扫描结果使用仪器自带Inveon AcquisitionWorkplace和Inveon Research Workplace平台进行成像及骨吸收参数分析。
小鼠股骨micro-CT检测骨小梁参数分析结果显示,突变组小鼠股骨骨小梁吸收模式增强。分析参数包括:相对骨体积(Bone volum/Total volum,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular Number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular Thinckness,Tb.Th)、骨小梁分离度(Trabecular Spacing,Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Trabecular Bone Pattern factor,TBPf)。其中突变组小鼠BV/TV、Tb.N以及Tb.Th减少(野生鼠VS突变鼠:BV/TV:0.1401±0.0277 VS 0.08±0.0219,p=0.0037;Tb.N:3.4393±0.5322 VS 2.2073±0.3871,单位1/mm,p=0.0020;Tb.Th:0.0406±0.0024 VS 0.0361±0.0036,单位mm,p=0.0359),同时Tb.Sp和TBPf增加(野生鼠VS突变鼠:Tb.Sp:0.2561±0.0479 VS 0.4279±0.0815,单位mm,p=0.0018;TBPf:20.60±1.50 VS 25.50±2.61,单位1/mm,p=0.0035),见图11。说明突变组小鼠股骨骨小梁吸收模式增强,该结果与破骨细胞体外分化及吸收能力检测结果相符。然而,突变组与野生组小鼠之间股骨皮质厚度无显著差异,见图11。
股骨2D平面图显示,与野生小鼠相比较,突变小鼠的骨小梁较细、骨小梁之间空隙较多,与上述参数分析结果相呼应(图12)。股骨皮质内侧未见明显的吸收陷窝。股骨远端与胫骨连接处3D重构图显示,部分突变小鼠股骨远端外侧骨皮质出现疑似吸收陷窝(箭头所示),野生组小鼠未见(图13)。以上结果再次反映FKBP5突变小鼠骨吸收模式增强,FKBP5突变小鼠出现疑似paget样表型。
结论:
Paget骨病是一种以局部骨组织异常增生为特点的慢性骨代谢性疾病。其主要的病理改变为破骨细胞异常,包括病变部位破骨细胞数量增多,破骨细胞体积增大,细胞核数量增多,患者外周血单核细胞破骨细胞分化能力增强等。Paget骨病致病原因包括遗传因素和环境因素,其中遗传致病因素在paget骨病发生中具有重要的作用。本发明中,通过对一个汉族paget骨病家系进行基因分析,确认了一个新的位于FKBP5基因的点突变(c.163G>C)与paget骨病发病相关。通过测序分析,明确了该突变为新发现的单核苷酸突变,而不是单核苷酸多态性。同时突变功能预测分析显示该突变极有可能影响FKBP5蛋白的功能。细胞实验证实该突变显著影响FKBP5对Akt信号通路的调控作用,增加Akt第473位丝氨酸磷酸化水平。动物实验证实FKBP5V55L突变能够增加小鼠BMM体外破骨细胞分化能力以及破骨细胞骨吸收能力。同时FKBP5V55L突变增加小鼠体内破骨细胞活性,使之小梁骨吸收模式增加,并呈现paget样骨病表型。综上,本发明有力地证实了FKBP5V55L突变通过增加破骨细胞分化及骨吸收能力,参与paget骨病发病。因此,本发明发现的FKBP5基因突变称为检测paget骨病的一个新的标志,为疾病的提前诊断和治疗提供依据。
附:SQSTM1、TNFRSF11A、TNFRSF11B、OPTN、VCP、CSF1以及DCSTAMP基因外显子序列PCR扩增及测序用引物序列见下列表格。
SQSTM1引物:
外显子 |
引物 |
序列(5’-3’) |
外显子1 |
1-F |
GCAATGAAGAGAGGGGTCAG |
|
1-R |
TTGGTCACCACTCCAGTCAC |
外显子2 |
2-F |
GAGCACTCACCTTCCAGGAG |
|
2-R |
CAAATTGCTGACCCCTTCAT |
外显子3-4 |
3-4-F |
AAACAGACACAGGGACTGGGAAC |
|
3-4-R |
CCTGACAACCATCACAAAAGAGAAC |
外显子5 |
5-F |
GATGTCCGGGTTAAAGGTCA |
|
5-R |
GGCAACAAATCCTCACCAGT |
外显子6 |
6-F |
GTAGTCTCCACAGGCCAAGC |
|
6-R |
ATGCACACGTGCAGTTAAGG |
外显子7 |
7-F |
TTAAAGTCACGCTGGGAACC |
|
7-R |
CCTTCTGTTTGTGTCGCTGA |
外显子8 |
8-F |
TACAGGGAAAGCAGGTCCAC |
|
8-R |
CTGCCCTAAATGGCTTCTTG |
TNFRSF11A引物:
外显子 |
引物 |
序列(5’-3’) |
外显子1 |
1-F |
GCGGAGACCGGACCAAGGA |
|
1-R |
AGTTTCCCTCCGCTTGCCCT |
外显子2 |
2-F |
ACCTAGTTTTATCCAGAAAGAG |
|
2-R |
GAGTGACAGACATTACCACCTG |
外显子3 |
3-F |
GGGTGCAATTTTTGTTGCTG |
|
3-R |
ACAGAGGCCTTGGGGATCTAA |
外显子4 |
4-F |
GAAGTGCGAGGAGGAACTTG |
|
4-R |
TGAAGAACCTAAGCCGAGGA |
外显子5 |
5-F |
GGTTCCATAACTCACTGCTGGGGTC |
|
5-R |
GAAGTTCCTGTCACACATAGGGCTG |
外显子6 |
6-F |
GATTCAAATGTCCAAGAAGGCG |
|
6-R |
ACATTATTAGTTACCCCCAATCCAG |
外显子7 |
7-F |
GGTGGGGACTGTCACTTCTGCTA |
|
7-R |
GCTTACAAGTCATCCGTTTCCTG |
外显子8 |
8-F |
GGGACTGTAGTTAATCATGTTG |
|
8-R |
TCAATATGTGACTAGGATGGC |
外显子9 |
9-F |
AAAGTTCCATAGTCAGTTTTCCATC |
|
9-R |
AGCTTCCTCCTTCCTAAATGGT |
外显子10 |
10-F |
AACCTTCCTCTCGGCAGACCCT |
|
10-R |
GGATTGCTTGAGCCCAGGAGTTA |
TNFRSF11B引物:
外显子 |
引物 |
序列(5’-3’) |
外显子1 |
1-F |
TTTTTTTCCCCTGCTCTCCCAG |
|
1-R |
CCGGGCACCCGTCGGCTGGCCCAGG |
外显子2 |
2-F |
CCACTGTGTTCCTTTCTCCTT |
|
2-R |
GCTGCACATTGACACGTACC |
外显子3 |
3-F |
GTTAAGAGGGCATCTGCTGG |
|
3-R |
ATGATACTACAAAATCGTAC |
外显子4 |
4-F |
ATCCAATTGTTGAGTAAATC |
|
4-R |
AACTAAACATACATGCAGTCT |
外显子5 |
5-F |
GATGTGAACACTTATCTGGG |
|
5-R |
AATAATGTCATTTATATAGT |
OPTN引物:
VCP引物:
CSF1引物:
DCSTAMP引物:
外显子 |
引物 |
序列(5’-3’) |
外显子1 |
1-F |
TCATTTCAACAGCTCTCTTCATCTT |
|
1-R |
TCTTTTCTCTTTTGCCCTCACTC |
外显子2 |
2-F |
AGAGGTTGATTCATGGTGATGTG |
|
2-R |
AGGGAGACTGTCGGGGTATAGGG |
外显子3 |
3-F |
TTTTGTAGTCAGTCTACCACCAT |
|
3-R |
GATAAACCATGAGAAGTACCTGT |
外显子4 |
4-F |
AAAGAAGGGATAGAGTAAAAAAA |
|
4-R |
ATCAGCATTCAAATCACAGAGTT |
外显子5 |
5-F |
GAAGACCAACATAACCCACAAAA |
|
5-R |
GAGCAGGGAGAAAAGAGACCATT |
参考文献:
1.Tiegs,R.D.(1997)Paget's disease of bone:indications for treatmentand goals of therapy.Clin Ther 19,1309-1329;discussion 1523-1304
2.van Staa,T.P.,Selby,P.,Leufkens,H.G.,Lyles,K.,Sprafka,J.M.,andCooper,C.(2002)Incidence and natural history of Paget's disease of bone inEngland and Wales.J Bone Miner Res 17,465-471
3.Albagha,O.M.,Visconti,M.R.,Alonso,N.,Langston,A.L.,Cundy,T.,Dargie,R.,Dunlop,M.G.,Fraser,W.D.,Hooper,M.J.,Isaia,G.,Nicholson,G.C.,del PinoMontes,J.,Gonzalez-Sarmiento,R.,di Stefano,M.,Tenesa,A.,Walsh,J.P.,andRalston,S.H.(2010)Genome-wide association study identifies variants at CSF1,OPTN and TNFRSF11A as genetic risk factors for Paget's disease of bone.NatGenet 42,520-524
4.Wuyts,W.,Van Wesenbeeck,L.,Morales-Piga,A.,Ralston,S.,Hocking,L.,Vanhoenacker,F.,Westhovens,R.,Verbruggen,L.,Anderson,D.,Hughes,A.,and VanHul,W.(2001)Evaluation of the role of RANK and OPG genes in Paget's diseaseof bone.Bone 28,104-107
5.Chung,P.Y.,Beyens,G.,de Freitas,F.,Boonen,S.,Geusens,P.,Vanhoenacker,F.,Verbruggen,L.,Van Offel,J.,Goemaere,S.,Zmierczak,H.G.,Westhovens,R.,Devogelaer,J.P.,and Van Hul,W.(2011)Indications for a geneticassociation of a VCP polymorphism with the pathogenesis of sporadic Paget'sdisease of bone,but not for TNFSF11(RANKL)and IL-6 polymorphisms.Mol GenetMetab 103,287-292
6.Chung,P.Y.,Beyens,G.,Boonen,S.,Papapoulos,S.,Geusens,P.,Karperien,M.,Vanhoenacker,F.,Verbruggen,L.,Fransen,E.,Van Offel,J.,Goemaere,S.,Zmierczak,H.G.,Westhovens,R.,Devogelaer,J.P.,and Van Hul,W.(2010)The majorityof the genetic risk for Paget's disease of bone is explained by geneticvariants close to the CSF1,OPTN,TM7SF4,and TNFRSF11A genes.Hum Genet 128,615-626
7.Chung,P.Y.,and Van Hul,W.(2012)Paget's disease of bone:evidence forcomplex pathogenetic interactions.Semin Arthritis Rheum 41,619-641
8.Ralston,S.H.(2008)Pathogenesis of Paget's disease of bone.Bone 43,819-825
9.Neale,S.D.,Smith,R.,Wass,J.A.,and Athanasou,N.A.(2000)Osteoclastdifferentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease ishypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D(3)and RANKL.Bone 27,409-416
10.Nakashima,T.,Hayashi,M.,and Takayanagi,H.(2012)New insights intoosteoclastogenic signaling mechanisms.Trends Endocrinol Metab 23,582-590
11.Li,L.,Lou,Z.,and Wang,L.(2011)The role of FKBP5 in canceraetiology and chemoresistance.Br J Cancer 104,19-23
12.Pei,H.,Li,L.,Fridley,B.L.,Jenkins,G.D.,Kalari,K.R.,Lingle,W.,Petersen,G.,Lou,Z.,and Wang,L.(2009)FKBP51 Affects Cancer Cell Response toChemotherapy by Negatively Regulating Akt.Cancer Cell 16,259-266
SEQ ID NO.1:(CDS序列)
ATGACTACTGATGAAGGTGCCAAGAACAATGAAGAAAGCCCCACAGCCACTGTTGCTGAGCAGGGAGAGGATATTACCTCCAAAAAAGACAGGGGAGTATTAAAGATTGTCAAAAGAGTGGGGAATGGTGAGGAAACGCCGATGATTGGAGACAAAGTTTATCTCCATTACAAAGGAAAATTGTCAAATGGAAAGAAGTTTGATTCCAGTCATGATAGAAATGAACCATTTGTCTTTAGTCTTGGCAAAGGCCAAGTCATCAAGGCATGGGACATTGGGGTGGCTACCATGAAGAAAGGAGAGATATGCCATTTACTGTGCAAACCAGAATATGCATATGGCTCGGCTGGCAGTCTCCCTAAAATTCCCTCGAATGCAACTCTCTTTTTTGAGATTGAGCTCCTTGATTTCAAAGGAGAGGATTTATTTGAAGATGGAGGCATTATCCGGAGAACCAAACGGAAAGGAGAGGGATATTCAAATCCAAACGAAGGAGCAACAGTAGAAATCCACCTGGAAGGCCGCTGTGGTGGAAGGATGTTTGACTGCAGAGATGTGGCATTCACTGTGGGCGAAGGAGAAGACCACGACATTCCAATTGGAATTGACAAAGCTCTGGAGAAAATGCAGCGGGAAGAACAATGTATTTTATATCTTGGACCAAGATATGGTTTTGGAGAGGCAGGGAAGCCTAAATTTGGCATTGAACCTAATGCTGAGCTTATATATGAAGTTACACTTAAGAGCTTCGAAAAGGCCAAAGAATCCTGGGAGATGGATACCAAAGAAAAATTGGAGCAGGCTGCCATTGTCAAAGAGAAGGGAACCGTATACTTCAAGGGAGGCAAATACATGCAGGCGGTGATTCAGTATGGGAAGATAGTGTCCTGGTTAGAGATGGAATATGGTTTATCAGAAAAGGAATCGAAAGCTTCTGAATCATTTCTCCTTGCTGCCTTTCTGAACCTGGCCATGTGCTACCTGAAGCTTAGAGAATACACCAAAGCTGTTGAATGCTGTGACAAGGCCCTTGGACTGGACAGTGCCAATGAGAAAGGCTTGTATAGGAGGGGTGAAGCCCAGCTGCTCATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTGAGAAAGTGCTGGAAGTAAACCCCCAGAATAAGGCTGCAAGACTGCAGATCTCCATGTGCCAGAAAAAGGCCAAGGAGCACAACGAGCGGGACCGCAGGATATACGCCAACATGTTCAAGAAGTTTGCAGAGCAGGATGCCAAGGAAGAGGCCAATAAAGCAATGGGCAAGAAGACTTCAGAAGGGGTCACTAATGAAAAAGGAACAGACAGTCAAGCAATGGAAGAAGAGAAACCTGAGGGCCACGTATGA
SEQ ID NO.2:(mRNA序列)
AGAACAAACTCCTACCTCTGTTTGCAACTAAGAGTTACATCCCCCATGCCAAGACCTTCCGAGGCGTCCCAGAGGGGGAAATTCCTCGCTGCCGGACTGCGCCCACCCTTGAGGACCTCACATTCTCTTTGGGCAGAGCGGAAGCCAGACAGAGACAGGGACTACGAAGCGACAATCCCCAGCCCTGTGTGTGCAAGGAGCCCCCGAGGGGCAGGCAGCCACGCTGCAGAAGGCTAGACTCTCCGACCCCCAGGGAGCCTGGTGTGGGCTGCAGGGACAGAACGCTTCTCAGAGGAGGTTCTCTACTTAAAAGACAATGACTACTGATGAAGGTGCCAAGAACAATGAAGAAAGCCCCACAGCCACTGTTGCTGAGCAGGGAGAGGATATTACCTCCAAAAAAGACAGGGGAGTATTAAAGATTGTCAAAAGAGTGGGGAATGGTGAGGAAACGCCGATGATTGGAGACAAAGTTTATCTCCATTACAAAGGAAAATTGTCAAATGGAAAGAAGTTTGATTCCAGTCATGATAGAAATGAACCATTTGTCTTTAGTCTTGGCAAAGGCCAAGTCATCAAGGCATGGGACATTGGGGTGGCTACCATGAAGAAAGGAGAGATATGCCATTTACTGTGCAAACCAGAATATGCATATGGCTCGGCTGGCAGTCTCCCTAAAATTCCCTCGAATGCAACTCTCTTTTTTGAGATTGAGCTCCTTGATTTCAAAGGAGAGGATTTATTTGAAGATGGAGGCATTATCCGGAGAACCAAACGGAAAGGAGAGGGATATTCAAATCCAAACGAAGGAGCAACAGTAGAAATCCACCTGGAAGGCCGCTGTGGTGGAAGGATGTTTGACTGCAGAGATGTGGCATTCACTGTGGGCGAAGGAGAAGACCACGACATTCCAATTGGAATTGACAAAGCTCTGGAGAAAATGCAGCGGGAAGAACAATGTATTTTATATCTTGGACCAAGATATGGTTTTGGAGAGGCAGGGAAGCCTAAATTTGGCATTGAACCTAATGCTGAGCTTATATATGAAGTTACACTTAAGAGCTTCGAAAAGGCCAAAGAATCCTGGGAGATGGATACCAAAGAAAAATTGGAGCAGGCTGCCATTGTCAAAGAGAAGGGAACCGTATACTTCAAGGGAGGCAAATACATGCAGGCGGTGATTCAGTATGGGAAGATAGTGTCCTGGTTAGAGATGGAATATGGTTTATCAGAAAAGGAATCGAAAGCTTCTGAATCATTTCTCCTTGCTGCCTTTCTGAACCTGGCCATGTGCTACCTGAAGCTTAGAGAATACACCAAAGCTGTTGAATGCTGTGACAAGGCCCTTGGACTGGACAGTGCCAATGAGAAAGGCTTGTATAGGAGGGGTGAAGCCCAGCTGCTCATGAACGAGTTTGAGTCAGCCAAGGGTGACTTTGAGAAAGTGCTGGAAGTAAACCCCCAGAATAAGGCTGCAAGACTGCAGATCTCCATGTGCCAGAAAAAGGCCAAGGAGCACAACGAGCGGGACCGCAGGATATACGCCAACATGTTCAAGAAGTTTGCAGAGCAGGATGCCAAGGAAGAGGCCAATAAAGCAATGGGCAAGAAGACTTCAGAAGGGGTCACTAATGAAAAAGGAACAGACAGTCAAGCAATGGAAGAAGAGAAACCTGAGGGCCACGTATGACGCCACGCCAAGGAGGGAAGAGTCCCAGTGAACTCGGCCCCTCCTCAATGGGCTTTCCCCCAACTCAGGACAGAACAGTGTTTAATGTAAAGTTTGTTATAGTCTATGTGATTCTGGAAGCAAATGGCAAAACCAGTAGCTTCCCAAAAACAGCCCCCCTGCTGCTGCCCGGAGGGTTCACTGAGGGGTGGCACGGGACCACTCCAGGTGGAACAAACAGAAATGACTGTGGTGTGGAGGGAGTGAGCCAGCAGCTTAAGTCCAGCTCATTTCAGTTTCTATCAACCTTCAAGTATCCAATTCAGGGTCCCTGGAGATCATCCTAACAATGTGGGGCTGTTAGGTTTTACCTTTGAACTTTCATAGCACTGCAGAAACCTTTAAAAAAAAAATGCTTCATGAATTTCTCCTTTCCTACAGTTGGGTAGGGTAGGGGAAGGAGGATAAGCTTTTGTTTTTTAAATGACTGAAGTGCTATAAATGTAGTCTGTTGCATTTTTAACCAACAGAACCCACAGTAGAGGGGTCTCATGTCTCCCCAGTTCCACAGCAGTGTCACAGACGTGAAAGCCAGAACCTCAGAGGCCACTTGCTTGCTGACTTAGCCTCCTCCCAAAGTCCCCCTCCTCAGCCAGCCTCCTTGTGAGAGTGGCTTTCTACCACACACAGCCTGTCCCTGGGGGAGTAATTCTGTCATTCCTAAAACACCCTTCAGCAATGATAATGAGCAGATGAGAGTTTCTGGATTAGCTTTTCCTATTTTCGATGAAGTTCTGAGATACTGAAATGTGAAAAGAGCAATCAGAATTGTGCTTTTTCTCCCCTCCTCTATTCCTTTTAGGGAATAATATTCAATACACAGTACTTCCTCCCAGCATTGCTACTGCTCAGCTTCTTCTTTCATTCTAATCCTTGCTATTAAGAATTTAAGACTTGTGCTTACAATATTTTTGACCTGGAGTGGATCTATTTACATAGTCATTTAGGATCCATGCAGCTTTTTTTGTCTTTTTAAGATTATTGGCTCATAAGCATATGTATACTGGTTTATGGAACTTTATTTACACTCCTCTATCATGCAAAAAAATTTTGACTTTTTAGTACTAAGCTTAATTTTTAAAAACAAAATCTGTAGGGTTGACAAATAAATAGTTGCTCTTCTACACTAGGGGTTTCACCTGCAGGTTTGACACGCAGTTGCTCGCTTTTCCTGCCCTGTCAAGCTTCTCTGTTCTGGCGTGAGTTGTGAAAGAGTTGAAGACAGCTTCCCATGCCGGTACACAGCCAGTAGCCTAAATCTCCAGTACTTGAGCTGACCATTGAACTAGGGCAAGTCTTAAATGTGTACATGTAGTTGAATTTCAGTCCTTACGGGTAAACAGATTGAGCATGGCTCTCTATTCCCTCAGCCTAAGAAACACTCATGGGAATGCATTTGGCAACCCAAGGAACCATTTGCTTAAACCTGGAACATCTCACCTTTTTAAATCCTAAAAAACACTGGCAGTTATATTTTAAATTAGTTTTTATTTTTATGATGGTTTTATCAAAAGACTTTTATTATTAGATTGGGACCCCCTTCAAACCTAAAAATCAAGTTATTTCCTTTTATAATACTTTTCTTCCCCATGGAACAAATGGGATCAATTTGTGAGTTTTTTCCTTTAATGATAACTAAAATCCCTCTAATTTCTCATTTATGCTTTTGTCTTTTTTATGAAATATTTCTTTTAAAAGCCCCAGTCTCACCTACGAAATATGAAGAGCAAAAGCTGATTTTGCTTACTTGCTAAACTGTTGGGAAAGCTCTGTAGAGCATGGTTCCAGTGAGGCCAAGATTGAAATTTGATACTAAAAAGGCCACCTAGCTTTTTGCAGATAACAAACAAGAAAGCTATTCCAAGACTCAGATGATGCCAGCTGTCTCCCACGTGTGTATTATGGTTCACCAGGGGGAACTGGCAAAAGTGTGTGTGGGGAGGGGAAGGGTGTGTGAGTGGTTCTGAGCAAATAACTACAGGGTGCCCATTACCACTCAAGAAGACACTTCACGTATTCTTGTATCAAATTCAATAATCTTAAACAATTTGTGTAGAAGTCCACAGACATCTTTCAACCACCTTTTAGGCTGCATATGGATTGCCAAGTCAGCATATGAGGAATTAAAGACATTGTTTTTAAAAAAAAAAAATCATTTAGATGCACTTTTTTGTGTGTTCTTTAAATAAATCCAAAAAAAATGTGACTTCCAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:3:(基因组序列)
AAAATAAATACACTGGATTTTACAGTAGTTAAATACTTTACTAGAAAACAAGTTATTCAGTATCATATCAAGCAGTGCAATGATACTCATGTTTTTTACAGATAGACTATGTTTCAAATAATAGGAAATGTAACCTGTTTTACCAGGAAATTGGGCTTTCTGAAAATAAACAAGCAGAATCTAGTCAGGAGCTAATGTTTTTAGCAAAGGAGGGAAATAAAATTACACCTTTGAAGCTTTGCTTAAGCTTCTTTTTGAATATTTTAAAAGTCCACCATTCTTTCTGGTCTAAGTCCGTGTGTATATGGACTAGCTCACAAGCCTGTGTTAGAGAGTTTAGTGTCGGGCGCGGTGGCTCATGCTTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGAGCACGGAGGCGCACGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTCAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGTGCCATTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGGGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGTTTACTGTCAAAATATAGGGCATTAAACCAATGAACAGGATTTATTGGTTAATTCTTTGAAGGAATAAATAGTGCGATTAGCAATAAAAGTAGATATAACATAAAAGACAAGTTGGTAAAGGACAGTTTTCTAACAATGAGTTATTGTGAGGAATGAAGGGAGGCATTAGAAAGAATGGATAATAGTATATTTGCATATCTGCCTGGATGTCTTGGGATGGACTGTGTGACCTTTTTATTCTCTGATTACAAGTAAAAAGTTTGACCTCCTTTTTCTTAATGTTTGTCTTTTCTAGATTGTCAAAAGAGTGGGGAATGGTGAGGAAACGCCGATGATTGGAGACAAAGTTTATCTCCATTACAAAGGAAAATTGTCAAATGGAAAGAAGTTTGATTCCAGTCATGATAGAAATGAACCATTTGTCTTTAGTCTTGGCAAAGGTAAGAGGGTATTTTTTTGAGTTGTGTTTTACTTAGCTTTATTACTATTTGTAATATATAGGAGCAGAGGATTCTATCCTTTCTAAAAGTAAAGAAATTTTAGAGTAGTAGTACTCAAAGAATGGTCTGAGAATCCCTAGGGCTCTCTGAGATCTTTTTAGGGGGTCCCAAATGTCATTTATTTTCATAACAATACTAAGATATTATTTGCCATTTTACTGTATTGACATTTATTTGCACTGATGGTACAAAAGCTGCAGTTGTAAAAAAACTGCTGGTTCCTTAACACAAATCAAGGCAGTGGTAACCAGCTGTTCCAGTAGTCATGGTATTTTCCACTGCCACTCCTTCACTATTTACATAAGGGAAAAAGCTAGTTTCACGTAAAAATGTCCTGATAAAGCAGTAAAAATTATTAGTTTTATTGAAACCCAATCTTTGAGTTTCACATCACTTTGATATTCTGTGACAGAAAGGGAAGCACGTGTAGAGCACTTCTGTCCCCCAAAGTATGATGGTTGTCTCAAGGAAAAGTACTTGTGCTCTTGTTTTAGTTGAGATCTGAACTAACTGCATTTATTTCATGAGATACCATTTTTACTTGAAAGGGCAAATCTGATTATGCAGACTTGATTCAGTATTTGGCAGGTGTTTTTCTGAGAATGAATGGAGTAAGTCTGTCACTTCAAGGAAAAACAACTGACAATGTTTTTTGCCATTAAGTTTTCAAGTAAAAATTATAGTTTAGGAGAACTCCTATTTGCCACTGTGGGCTTATTTGCCACTGTGGGCTTGACAGCTTCCGAAGACTTTTCTGATGAGATTGGTGGGTATTAATGAATGTGGTTTTAAATATACAATGAAATGTGTCCACATTTGGAAGATCTGTATAACTAAGAATGAATATTTTCTC
SEQ ID NO.4
MTTDEGAKNNEESPTATVAEQGEDITSKKDRGVLKIVKRVGNGEETPMIGDKVYLHYKGKLSNGKKFDSSHDRNEPFVFSLGKGQVIKAWDIGVATMKKGEICHLLCKPEYAYGSAGSLPKIPSNATLFFEIELLDFKGEDLFEDGGIIRRTKRKGEGYSNPNEGATVEIHLEGRCGGRMFDCRDVAFTVGEGEDHDIPIGIDKALEKMQREEQCILYLGPRYGFGEAGKPKFGIEPNAELIYEVTLKSFEKAKESWEMDTKEKLEQAAIVKEKGTVYFKGGKYMQAVIQYGKIVSWLEMEYGLSEKESKASESFLLAAFLNLAMCYLKLREYTKAVECCDKALGLDSANEKGLYRRGEAQLLMNEFESAKGDFEKVLEVNPQNKAARLQISMCQKKAKEHNERDRRIYANMFKKFAEQDAKEEANKAMGKKTSEGVTNEKGTDSQAMEEEKPEGHV
SEQ ID NO.7
ATTGTCAAAAGAGTGGGGAATGGTGAGGAAACGCCGATGATTGGAGACAAAGTTTATCTCCATTACAAAGGAAAATTGTCAAATGGAAAGAAGTTTGATTCCAGTCATGATAGAAATGAACCATTTGTCTTTAGTCTTGGCAAA
SEQ ID NO.8
ATTAAACCAATGAACAGGATTTATTGGTTAATTCTTTGAAGGAATAAATAGTGCGATTAGCAATAAAAGTAGATATAACATAAAAGACAAGTTGGTAAAGGACAGTTTTCTAACAATGAGTTATTGTGAGGAATGAAGGGAGGCATTAGAAAGAATGGATAATAGTATATTTGCATATCTGCCTGGATGTCTTGGGATGGACTGTGTGACCTTTTTATTCTCTGATTACAAGTAAAAAGTTTGACCTCCTTTTTCTTAATGTTTGTCTTTTCTAGATTGTCAAAAGAGTGGGGAATGGTGAGGAAACGCCGATGATTGGAGACAAAGTTTATCTCCATTACAAAGGAAAATTGTCAAATGGAAAGAAGTTTGATTCCAGTCATGATAGAAATGAACCATTTGTCTTTAGTCTTGGCAAAGGTAAGAGGGTATTTTTTTGAGTTGTG