DE10102389A1 - Verfahren und Vektoren zur Plastidentransformation höherer Pflanzen - Google Patents

Abstract

Diese Erfindung legt ein Verfahren und entsprechende Vektoren dafür offen, um multizelluläre höhere Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, welche in ihrem Plastom transformiert sind, herzustellen. Dieses Verfahren ist ein Zwei-Schritt-Verfahren, welches die Herstellung von transplastomischen Pflanzen erlaubt, die kein Selektionsmarkergen enthalten. Weiterhin werden neuartige Selektionsmethoden für die Plastidentransformation beschrieben.

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung gehört zum Bereich der pflanzlichen Biotechnologie im Allgemeinen und zu den neuartigen Verfahren zur Plastidentransformation im Speziellen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Nach allgemeinem Kenntnisstand leiten sich die beiden Klassen von Zellorganellen - Plastiden und Mitochondrien - von ursprünglich unabhängigen Prokaryoten ab, die von einem Vorläufer heutiger eukaryotischer Zellen in getrennten Endosymbiose-Vorgängen aufgenommen wurden (Gray, 1991). Als Folge davon enthalten diese Organellen ihre eigene DNA, DNA- Transkripte in der Form von Boten-RNA (mRNA), Ribosomen und wenigstens einige der für eine Decodierung der genetischen Information benötigten tRNA-Moleküle (Marechal-Drouard et al., 1991).

Zwar waren diese Organelle kurz nach der endosymbiotischen Aufnahme noch genetisch autonom, da sie alle für das prokaryotische Leben notwendigen Elemente besaßen. Doch wurde diese Autonomie während der Evolution durch einen Transfer von genetischer Information zum Zellkern hin reduziert. Trotzdem blieb ihren genetischen Kompartimenten genug Komplexität erhalten, um sie zu einem attraktiven Ziel für die Gentechnik werden zu lassen. Das trifft insbesondere für die Plastiden zu, da diese Organellen immer noch ca. 50% der für ihre wichtigste Funktion innerhalb der Pflanzenzelle-Fotosynthese - benötigenden Proteine kodieren. Außerdem kodieren die Plastiden ihre eigenen ribosomalen RNAs, die meisten ihrer tRNAs und die ribosomalen Proteine. Die Gesamtzahl der Gene im Plastom liegt bei etwa 120 (Palmer, 1991). Allerdings wird die überwiegende Mehrheit aller in den Plastiden vorhandenen Proteine vom Zellkern bzw. dem Cytosol importiert.

Plastiden können durch Transformation genetisch verändert werden.

Mit der Entwicklung molekularer Klonierungstechniken gelang es bald, höhere Pflanzen durch Transformation genetisch zu verändern. Die Hauptanstrengungen im Bereich der Pflanzen- Transformation war und ist die Zellkern-Transformation, da sich die Mehrheit aller Gene dort befindet. Im Falle von Arabidopsis thalina, dessen komplette Genomsequenz kürzlich publiziert wurde (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), sind das ca. 26 000 Gene. Die Transformation des Zellkerns konnte einfacher erreicht werden, da biologische Vektoren wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens verfügbar waren, die so verändert werden konnten, dass sie eine effiziente Kern-Transformation ermöglichen (Galvin, 1998). Hinzu kommt, dass der Zellkern fremden Nukleinsäuren direkter zugänglich ist, während die Organellen von zwei Hüll-Membranen umgeben sind, die - allgemein ausgedrückt - für Makromoleküle wie DNA undurchdringbar sind.

Die Möglichkeit Plastiden zu transformieren zu können ist sehr wünschenswert. Denn damit könnte die sehr hohe Gendosis in diesen Organellen, die das Potenzial für außergewöhnlich starke Transgen-Expression trägt, nutzbar gemacht werden. In einer Zelle können nämlich über 10 000 Plastom-Kopien vorhanden sein. Eine weitere attraktive Eigenschaft der Plastiden-Transformation besteht darin, dass Plastiden-kodierte Merkmale nicht über den Pollen übertragen werden können. Folglich wird die potenzielle Gefahr eines unerwünschten Ausbreitens der Transgene auf zu den Transformanten verwandte Wild-Typ Arten stark reduziert. Zu den weiteren potenziellen Vorteilen der Plastidentransformation gehört die Möglichkeit, mehrere Gene gleichzeitig als polycistronisches Operon zu exprimieren, sowie das Ausschalten von Positionseffekten und "gene silencing" (Abschaltung von Genen), die in Folge von Zellkern-Transformationen auftreten können.

Tatsächlich konnten für höhere Pflanzen Methoden entwickelt werden, die die stabile Transformation von Plastiden ermöglichen. Bisher sind zwei unterschiedlich Methoden verfügbar: Beschuss von Geweben - insbesondere Blattgewebe - mit einer Genkanone ("particle gun") (Svab et al., 1990), sowie die PEG (Polyethylen-Glykol) Behandlung von Protoplasten in Anwesenheit eines geeigneten Transformations-Vektors (Koop et al., 1996). Beide Methoden vermitteln ein Eindringen von Plasmid DNA in das Stroma der Plastiden durch zwei Hüllmembranen hindurch.

Ein eklatanter Nachteil aller heute gebräuchlichen Transformationsmethoden für multizelluläre Pflanzen ist die Anwesenheit von Markergenen in der transgenen Pflanze. Die Markergene, die für die Selektion der transgenen Pflanzenzellen vom riesigen Hintergrund der nicht-transformierten Zellen benötigt werden, kodieren für Antibiotika- oder Herbizidresistenz- Gene. Beispiele für plastidäre Resistenz-Gene sind aadA, das eine Resistenz gegen Spectinomycin und Streptomycin vermittelt (Svab & Maliga, 1993) oder nptII, das eine Resistenz gegen Kanamycin vermittelt (Carrer et al., 1993). Da diese Marker zusammen mit den interessierenden Genen ("gene of interest" = GOI) stabil in das Genom integriert werden, bleiben sie auch in den homoplastomischen transgenen Pflanzen erhalten, obwohl sie für die Funktion der interessierenden Gene (GOI) nicht benötigt werden. Diese in den Pflanzen verbleibenden Markergene sind ein Haupt-Kritikpunkt an der Pflanzen-Biotechnologie, da sie theoretisch die Antibiotika-Resistenz von Pathogenen oder die Herbizid-Resistenz von Wildkräutern erhöhen könnten. Die Entwicklung eines Selektionssystems, bei dem in der transgenen Pflanze keine Resistenzgene mehr vorhanden sind, ist deshalb höchst erstrebenswert (Iamtham and Day, 2000).

Ein weiteres Problem bei der Plastidentransformation stellt der Mangel an verfügbaren Selektionsmarkern dar: Das aadA-Gen ist der einzige routinemäßig eingesetzte Selektionsmarker (Heifetz, 2000). Das nptII-Gen ist die einzige Alternative, von der gezeigt wurde, dass sie bei der Plastidentransformation höherer Pflanzen funktioniert (Carrer et al., 1993). Da weder das aadA-Gen noch das nptII-Gen universell eingesetzt werden können, ist die Anzahl von Spezies höherer Pflanzen, die im Plastom transformiert wurden immer noch sehr gering (Heifetz, 2000). Die Plastidentransformation höherer Pflanzen kann bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht seinem tatsächlichen Potenzial entsprechend ausgebeutet werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine einfache und dennoch höchst vielseitiges Verfahren zur Erzeugung von genetisch stabilen in ihrem Plastom transformierten multizellulären Pflanzen, Pflanzen-Organen oder Pflanzen-Geweben, die keine zu ihrer Selektion benötigten Fremdgene wie zum Beispiel Antibiotika- oder Herbizid-Resistenzgene enthalten. Dieses Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung von in ihrem Plastom transformierten multizellulären Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben durch die folgenden Schritte:

• a) Verändern oder Unterbrechen der Funktion eines Gens in einem Plastidengenom, um einen selektierbaren oder erkennbaren Phänotyp zu erhalten,
• b) Abtrennen oder Selektion von Pflanzen oder Zellen, die diesen Phänotyp exprimierende Plastide enthalten,
• c) Transformieren des Plastidengenoms der abgetrennten oder selektierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe mit mindestens einem Transformationsvektor, der über eine Wiederherstellsequenz verfügt, die die Funktion wiederherstellen kann und
• d) Abtrennen oder Selektion der transformierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die über Plastide verfügen, die die wiederhergestellte Funktion exprimieren.

Bevorzugte Ausführungsformen werden in den Unteransprüchen definiert.

Es ist überraschend, dass diese neue Verfahren bei vielzelligen Pflanzen, Pflanzen- Organen oder Pflanzengeweben angewendet werden kann, da diese in jeder Zelle eine Vielzahl von Plastiden enthalten. Dies bedeutet, dass eine Segregation von Genotypen jeweils auf Plastomebene, Plastidenebene und Zellebene erfolgen muss. Es wurde herausgefunden, dass dieses neue Verfahren bei Pflanzengewebe sehr effizient ist, da während des Wachstums Segregation erfolgt. Bei entsprechender Ausführung kann die Abtrennung daher einfach durch optische Überprüfung und manuelle Bearbeitung erfolgen. Im Fall der Inhibitor-unterstützten Selektion (Schritt (b)) kann der Selektion sehr schnell durchgeführt werden, da der Inhibitor bei vielzelligen Pflanzen, Pflanzen-Organen oder Pflanzen-Geweben nicht während der gesamten Regenerations-Prozedur, sondern nur am Anfang eingesetzt werden muss. (Natürlich ist es - wie oben dargestellt - auch möglich, den Einsatz von Inhibitoren ganz zu vermeiden). Dies zeigt die dichte Kopplung der Vielzelligkeit und der Transformationsmethode.

Bei dem in der Erfindung genannten Vorgang der Transformation von Pflanzen-Geweben werden die Auswirkungen einer Veränderung oder Unterbrechung eines Gens, die häufig im Falle isolierter Zellen letal sein können (wenn dieses Gen beispielsweise für Stoffwechselwege von essentieller Bedeutung ist) dadurch abgemildert, dass die einzelne Zelle nicht isoliert ist. Vielmehr ist die Zelle Teil einer Population von Zellen, zwischen denen Metabolite ausgetauscht werden.

Es gibt viele unterschiedliche plastidäre Gene, die für den Zweck dieser Erfindung verändert oder ausgeschaltet werden können. Ein solches Gen sollte für eine plastidäre Funktion in dem Sinne wichtig sein, dass ein Ausfall oder eine Veränderung einen selektierbaren oder erkennbaren Phänotyp hervorbringt. Eine solche Funktion kann jede plastidär kodierte Funktion sein. Vorzugsweise ist diese Funktion direkt oder indirekt an der Fotosynthese beteiligt. Beispiele für Funktionen, die indirekt für die Fotosynthese nötig sind, sind alle für die Transkription und/oder Translation plastidärer Gene nötigen Funktionen. Beispiele für Funktionen, die direkt an der Fotosynthese beteiligt sind, sind alle Proteine die zumindest unter Selektionsbedingungen für die Fotosynthese benötigt werden.

Vorzugsweise sollte der besagte Phänotyp leicht zu erkennen sein. Da die besagte Funktion vorzugsweise direkt oder indirekt mit Fotosynthese zu tun hat, kann ein leicht erkennbarer Phänotyp Pigment-Defizienz - vorzugsweise Chlorophyll-Defiezienz oder veränderte Fluoreszenz - sein. Die transformierte Pflanze kann dann heterotroph kultiviert werden und die transformierten Pflanzen, Pflanzen-Organe oder Pflanzen-Gewebe können abgetrennt oder selektiert werden. Eine solche Abtrennung kann manuell erfolgen, indem transformierte Gewebebereiche optisch identifiziert werden. Selektion kann aufgrund von Resistenz gegen einen Inhibitor erreicht werden, welche auf einem in Schritt (a) des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens eingeführten Resistenzgen beruht. Alternativ kann die Resistenz gegen einen Inhibitor auch die Folge einer veränderten oder inaktivierten Funktion selbst sein.

Nachdem der homoplastomische Zustand aufgrund von Segregation während mehrerer Regenerationszyklen erreicht wurde, wird die transformierte Pflanze, das Pflanzen-Organ oder das Pflanzen-Gewebe zum zweiten Mal transformiert (Schritt (c)), wobei die veränderte oder inaktivierte Funktion wieder hergestellt wird und das Markergen - sofern ein solches vorhanden ist - entfernt wird.

Die transformierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die den wiederhergestellten Phänotyp aufweisen - beispielsweise Fototropismus - werden daraufhin abgetrennt oder selektiert.

Zusätzliche Sequenzen oder interessierende Gene können in Schritt (a) und/oder Schritt (c) eingeführt werden, beispielsweise um ein gewünschtes Gen zu exprimieren, um ein nützliches Merkmal einzubringen oder um jede andere gewünschte Plastom-Modifikation zu erreichen.

Spezielle Beispiele für zu inaktivierende Funktionen stellen "knock outs" von rpoA oder rpoB dar. Diese Gene kodieren für jeweils für die α bzw. β Untereinheit der plastidär kodierten plastidären RNA-Polymerase. Plastiden, denen diese Gene fehlen können keine Fotosynthese betreiben, zeigen einen Albino-Phänotyp und können nicht fototrop wachsen.

Nach einer Wiederherstellung von rpoA oder rpoB während der zweiten Transformationsrunde können die transgenen Pflanzen fototrop im Licht wachsen und sie zeigen einen grünen Phänotyp.

Ein weiteres Beispiel für ein Zielgen bei Schritt (a) stellt die Inaktivierung von ycf3 dar. Unter normalen Licht-Bedingungen ist dieses Gen nicht essentiell (Ruf et al., 1997). Wenn jedoch eine ycf3 "knock out"-Mutante in Starklicht transferiert wird, entwickelt sie einen Albino-Phänotyp und das Wachstum ist unter fotosynthetischen Kulturbedingungen reprimiert. Pflanzen mit wiederhergestelltem ycf3-Gen dagegen können unter Starklicht-Bedingungen fototrop wachsen. In diesem Fall kann der Selektionsdruck bei der zweiten Transformation über die Lichtintensität eingestellt werden.

Deshalb kann die zweite Transformation - im Gegensatz zu dem Beispiel, bei dem rpoA oder rpoB verwendet wurde - mit grünen, normal wachsenden Mutanten durchgeführt werden, wenn diese unter Schwachlicht-Bedingungen wachsen. Der Selektionsdruck kann nach einer Regenerationszeit einfach durch Erhöhen der Lichtintensität verstärkt werden.

Da der Zustand des Pflanzen-Materials kritisch für den Erfolg der Transformation ist, ist diese Methode einer Transformation von Albino-Material überlegen.

Ein weiteres Beispiel für eine zu verändernde oder auszuschaltende Funktion ist die Inaktivierung von petA während der ersten Transformations-Runde (Schritt (a)). petA kodiert eine Untereinheit des Cytochrom b/f Komplexes. petA "knock out"-Mutanten zeigen einen "high chlorophyll fluorescence "-Phänotyp (hcf; "starke Chlorophyll Fluoreszenz") und sind nicht in der Lage Fotosynthese zu betreiben. Deshalb können diese Mutanten auch nicht fototrop wachsen. Das fototrope Wachstum wird wieder hergestellt, wenn petA in der zweiten Transformations-Runde (Schritt (c)) reaktiviert wird.

DEFINITIONEN

Die folgenden Definitionen werden angegeben, um die Bedeutung bestimmter Ausdrücke klarzumachen, die in vorliegender Erfindung benutzt werden.
3'-UTR: transkribierte aber nicht translatierte Region eines (6) Gens, abwärts einer kodierenden Region; in (6) plastidären (6) Genen, dienen die 3'-UTRs unter anderem zur Stabilisierung der mRNA gegen 3' zu 5' exonukleolytischem Abbau;
5'-UTR: transkribierte aber nicht translatierte Region eines (6) Gens, aufwärts einer kodierenden Region; in (6) plastidären (6) Genen, enthält die 3'-UTR Sequenzinformation für die Translations Initiation (Ribosomen Binde Stelle, (6) RBS) in der Nähe seines 3'-Endes;
aadA: (6) kodierende Region von bakterieller Aminoglykosid-adenyl-Transferase, einem häufig benutztem Protein, das die (6) antibiotischen Selektions Inhibitoren Spectinomycin und/oder Streptomycin entgiftet.
Chloroplast: (6) Plastide die Chlorophyll enthält;
Gewünschte(s) Gen (Sequenz): veränderte oder neu eingeführte Sequenz:
der Grund für eine Transformation;
Flanke, flankierende Region: DNA-Sequenz am 5' und 3'-Ende eines Inserts in einem (6) plastidären Transformations (6) Vektor, welche die Integration in das Ziel (6) Plastom von Sequenzen zwischen den Flanken durch doppelt reziproke homologe Rekombination vermittelt. Durch denselben Mechanismus können Sequenzen verändert oder vom Ziel (6) Plastom entfernt werden. Daher legen die Flanken des (6) plastidären (6) Transformations (6) Vektors fest, wo Veränderungen im Ziel (6) Plastom durch Transformation erzeugt werden;
Gen Expression: Prozess bei dem Geninformation in Funktion umgesetzt wird; in (6) Genen die für Polypeptide kodieren, wird für die Genexpression die Aktivität eines (6) Promoters benötigt, der die RNA-Polymerase Aktivität startet und steuert, dies führt zur Bildung einer Messenger RNA, die anschließend in ein Polypeptid übersetzt wird; in (6) Genen, die für RNA kodieren, generiert die Promoter-vermittelte Aktivität der RNA-Polymerase die kodierte RNA.
Gen(e): Nukleotid Sequenz(en), welche für alle Elemente kodiert, die notwendig sind um das unabhängige Funktionieren z. B. Expression sicherzustellen; Gene sind in (6) Operons organisiert, die mindestens eine komplette kodierende Region beinhalten; In (6) Genen die für Polypeptide kodieren sind diese Elemente: (1) ein (6) Promoter, (2) eine 5'-untranslatierte Region ((6) 5'-UTR), (3) eine (6) komplette kodierende Region, (4) eine 3'-untranslatierte Region ((6) 3'-UTR);
in (6) Genen die für RNA kodieren, fehlen der (6) 5'-UTR und der (6) 3'-UTR; in (6) Operons die aus mehr als einer kodierenden Region bestehen, sind zwei aufeinander folgende vollständige (6) kodierenden Regionen durch (6) Spacer getrennt; (6) Promoter, (6)) 5'-UTR und (6) 3'-UTR Elemente werden von allen kodierenden Regionen diese Operons geteilt;
Genom: Komplette DNA Sequenz eines Zellkerns oder einer Zellorganelle;
Gewebe: ein Pflanzengewebe besteht aus einer Anzahl von Zellen mit ähnlicher oder identischer Struktur und Funktion; Zellen in Pflanzengeweben sind über Plasmodesmata verbunden; Beispiele sind: Kallus, Palisaden-Parenchym, Schwamm-Parenchym, Kambium, Epidermis, Mark, Endosperm, Phloem, Xylem etc.
hcf High Chlorophyll Fluorescence; starke Chlorophyll Fluoreszenz; hcf-Mutanten zeigen einen charakteristischen, Fotosynthese defizienten Phänotyp
Heteroplastomische Plastide/Zelle: eine Plastide oder Zelle, die genetisch verschiedene Plastome enthält
Homologe Rekombination: Prozess der zum Austausch, Insertion oder Deletion von Sequenzen führt, aufgrund der Anwesenheit von (6) Flanken mit genügender Sequenz Homologie zur Zielstelle in einem (6) Genom;
Heteroplastomische Plastide/Zelle: eine Plastide oder Zelle, die genetisch einheitliche Plastome enthält
Insertionsstelle: Stelle in einem (6) Plastom, in die neue Sequenzen eingeführt werden; Intergenischer Bereich: Sequenzen zwischen zwei (6) Genen in einem (6) Genom; eine solche Region kann als interoperonischer Bereich oder als intraoperonischer Bereich vorkommen, in letzterem Fall werden sie auch Spacer genannt;
Intragenischer Bereich: Sequenz innerhalb eines (6) Gens;
Intron: Sequenz die eine (6) kodierende Region unterbricht;
Kodierende Region: Nukleotid-Sequenz die Information für a) die Aminosäure-Sequenz eines Polypeptides oder b) die Nukleotide einer funktionellen RNA, enthält; kodierende Regionen können optional von einem oder mehreren (6) Intron(s) unterbrochen sein;
Organ: ein Pflanzenorgan ist eine Struktur, die einer besonderen biologischen Funktion dient und aus einem oder mehreren charakteristischen (6) Geweben besteht; Beispiele sind: Wurzeln, Sproß, Blätter, Blüte, Stamina, Fruchtknoten, Frucht, etc.
Operon: Organisationsstruktur von mehreren (6) Genen
Pflanze(n): Organismus, der (6) Plastiden in seinen Zellen enthält; diese Erfindung bezieht sich besonders auf multizelluläre (6) Pflanzen; das schließt die Gruppe der Nacktsamer (wie Kiefer, Fichte, Tanne) and Bedecktsamer (wie die einkeimblättrigen Nutzpflanzen Mais, Weizen, Gerste, Reis, Roggen, Triticale, Hirse, Zuckerrohr, Spargel, Knoblauch, Palmen und einkeimblättrigen Nicht-Nutzpflanzen, und zweikeimblättrige Nutzpflanzen wie Tabak, Kartoffel, Tomate, Rübsamen, Zuckerrübe, Kürbis, Gurke, Melone, Pfeffer, Citruspflanzen, Aubergine, Weintrauben, Sonnenblume, Soja, Luzerne, Baumwolle usw.), und zweikeimblättrige Nicht-Nutzpflanzen wie auch Farne, Lebermoose, Moose und mehrzellige grüne, rote und braune Algen;
Plastide(n): Organelle(n) mit eigener genetischer Maschinerie in (6) Pflanzen Zellen, die in verschiedenen funktionellen und morphologisch unterschiedlichen Formen vorkommen, z. B. Amyloplasen, (6) Chloroplasten, Chromoplasten, Etioplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Proplastiden etc.;
Plastome: Komplette DNA-Sequenz von (6) Plastiden;
Promoter: Nukleotid Sequenz, die Transkription initiiert und reguliert;
RBS, Ribosomen Binde Stelle: DNA-Sequenz-Element aufwärts des (6) Translation Start Kodons eines (6) kodierenden Bereichs, diese vermittelt Ribosomen Bindung und Translations Initiation vom entsprechenden RNA-Transkript; RBS Elemente sind entweder Teil eines (6) 5'-UTRs oder eines (6) Spacers;
rpoA/B/C: kodierende Region eines plastidären (6) Gens für die plastidär kodierte RNA- Polymerase (PEP)
Selektions Inhibitor: Chemische Verbindung, die Wachstum und Entwicklung von nicht-transformierten Zellen oder Organellen stärker behindert als von Transformierten;
Transformations Vektor: geklontes DNA-Molekül, das hergestellt wurde um (6) Transformation eines (6) Genoms zu vermitteln;
Transformation: Prozess der zum Einführen, Entfernen oder Verändern von DNA-Sequenzen durch Behandlung von (6) Pflanzen oder Pflanzen Zellen einschließlich der Benutzung von wenigstens einem (6) Transformations Vektor, führt;
Transgen: DNA-Sequenz die aus einem (6) Genom in ein anderes überführt wurde;
Translations Start Kodon: Sequenz Element, das die erste Aminosäure eines Polypeptids kodiert;
Translations Stopp Kodon: Sequenz Element, das Abbruch der Translation bewirkt;
uidA: (6) kodierender Bereich bakterieller β-Glucuronidase, einem häufig benutzten Reporter-Protein;
ycf3: (6) kodierender Bereich für ein Protein, das am PSI Zusammenbau beteiligt ist; ycf3- Minus-Mutanten zeigen eine bleichen Phänotyp und eine Wachstumsdepression, wenn sie unter Standard-Lichtbedingungen kultiviert werden (3,5-4 W/m²). Unter Schwachlicht-Bedingungen (0,4-0,5 W/m²) ist der Phänotyp viel schwächer.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC571

Abb. 2 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC554

Abb. 3 ist eine schematische Darstellung von Vector pGEM-rpoA-del

Abb. 4 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC598

Abb. 5 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC553

Abb. 6 ist eine schematische Darstellung von Vector pKCZ-GFP

Abb. 7 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC526

Abb. 8 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC558

Abb. 9 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC558

Abb. 10 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC597, pIC599 und pIC600

Abb. 9 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC597

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Vektoren der vorliegenden Erfindung bieten einen sichtbaren Marker während der Selektion

Für die Plastidentransformation können nur nicht-letale Inhibitor-Konzentrationen verwendet werden, die die Pflanzenzellen nicht abtöten, sondern das Wachstum zu einem gewissen Grad hemmen. Nur eine oder wenige der bis zu 10 000 Plastomkopien pro Zelle sind vermutlich nach dem ursprünglichen Transformationsereignis rekombinant. Würde man die kultivierten Zellen nach der Transformation mit letalen Inhibitor-Konzentrationen behandeln, so wäre es nicht möglich heteroplastomische Zellen zu erhalten, die aufgrund ihrer geringen Kopienzahl an transformierten Plastomkopien nur eine mäßige Resistenz ausprägen. Selektion und Segregation führt zum Auftreten von sowohl Wildtyp als auch transgenem Gewebe. Ein größeres Problem während diese Prozesses besteht darin, zwischen Wildtyp und transgenem Gewebe zu unterscheiden, da die transformierten Plastiden die Wildtyp-Plastiden maskieren können. Khan and Maliga (1999) haben einen fluoreszierenden Antibiotika-Resistenzmarker, der aus den kodierenden Regionen von aadA und GFP bestand verwendet, um die Segregation von Plastidentransformanten im UV-Licht zu verfolgen. In der vorliegenden Erfindung stellen wir einen sichtbaren Marker für transplastomische Gewebe-Bereiche vor, der mit dem nackten Auge nachgewiesen werden kann. Der schrittweise Vorgang des Aussortierens von Wildtyp und rekombinanten Plastiden kann auf einfache Weise überwacht und dadurch beschleunigt werden. Das Auftauchen von grünen Sektoren über dem weißen Hintergrund des mutanten Phänotyps kann sehr einfach detektiert werden.

Vektoren der vorliegenden Erfindung bieten verbesserte Regenerations-Effizienz.

Konventionelle Chloroplastentransformations-Strategien basieren auf der Selektion nach Resistenz gegen einen Inhibitor wie beispielsweise Spectinomycin. Die Inhibitor-Anwendung beginnt nach der Transformation und wird während des gesamten Vorgangs der wiederholten Regenerationsrunden, die zum Erreichen eines homoplastomischen Genotyps notwendig sind, aufrechterhalten. Die Anwendung von Inhibitoren hat den Nachteil, dass sie das Regenerations- Potential vermindert. Die Regeneration von ganzen Pflanzen aus einzelnen Protoplasten oder Blattstückchen ist ein kritischer Schritt bei der Chloroplastentransformation, insbesondere wenn die Methode auf Arten, für etablierte und zuverlässige Regenerationsprotokolle nicht existieren, ausgedehnt wird. Ein großer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, dass Inhibitoren nur für eine kurze Zeitspanne nach der ersten Transformation benützt werden müssen. Durch Verwendung unseres neuartigen Verfahrens kann die Verwendung von Inhibitoren während der wiederholten Regenerationsrunden zur Erreichung des homoplastomischen Zustandes und während des gesamten zweiten Transformationsschrittes vermieden werden.

Vektoren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Herstellung genetisch stabiler Plastom- Transformanten.

Es ist bekannt, dass die homloge Rekombination in den Plastiden mit hoher Frequenz auftritt. Als Folge davon können ungewünschte Rekombinationsereignisse zwischen Regelelementen von Antibiotikaresistenzmarkern und endogenen Regelelementen zu genetischer Instabilität führen (Eibl et al., 1999). Nach dem zweiten Transformationsschritt enthält die Transformante keine Marker-Expressionskassette mehr. Folglich enthalten die endgültigen Transformanten weniger homologe Regionen als konventionelle Plastiden-Transformanten. Die genetische Stabilität der Transformanten wird erhöht und unerwünschter Verlust von Sequenzen wird vermindert (Eibl et al., 1999).

Mit dieser Erfindung wird eine neuartiges Antibiotika-freies und auf der Fotosynthese beruhendes Selektionssystem für die Chloroplastentransformation höherer Pflanzen zur Verfügung gestellt. Das neue System benutzt sichtbare Marker und kann auf der Inaktivierung von Genen wie rpoA, rpoB, ycf3 oder petA, das zu einem bleichen Phänotypen führt, beruhen. In einem zweiten Schritt kann das entsprechende defiziente Gen der mutanten Linie wiederhergestellt werden und dabei eine oder mehrere Transgene inseriert werden. Die resultierende transgene Pflanze kann frei von Antibiotikaresistenz-Genen sein.

Andere mögliche Ziel-Funktionen für Schritt (a) des in der vorliegenden Erfindung vorgestellten Verfahrens sind beliebige andere plastidär kodierte Funktionen, die entweder direkt oder indirekt für die Fotosynthese benötigt werden. Abgesehen von den speziellen unten beschriebenen Anwendungen kann die Inaktivierung und Reaktivierung von zahlreichen in der Fotosynthese involvierten Ziel-Genen (wie beispielsweise psbA) auf entsprechende Weise wie in der Erfindung beschrieben verwendet werden.

Plastidäre Chromosomen kodieren für vier RNA-Polymerase Gene die als rpoA, B, C1 und C2 bezeichnet werden und die den drei RNA-Polymerase "Haupt"-Genen der Eubakterien entsprechen. Die Gene für als rpoB, C1 und C2 sind in einem Operon angeordnet (das durch die Zellkern-kodierte NEP RNA-Polymerase transkribiert wird), während rpoA auf einem großen Gen-Cluster, das hauptsächlich für ribosomale Proteine kodiert, liegt.

Da die Menge an "Sense"-Transkripten des rpoA Gens in PEP (plastdär kodierte RNA- Polymerase) defizienten Mutanten abnimmt (Krause et al., 2000), könnte rpoA von der PEP transkribiert werden.

Die Deletion von rpoA, rpoB oder rpoC1 vom Plastidengenom führt zu einem Pigment defizientem Phänotyp (Allison et al., 1996; De Santis-Maciossek et al., 1999). Die Pigment­ defizienten ΔrpoA, ΔrpoB or ΔrpoC1 Pflanzen (weiße Pflanzen) können nicht fotoautotrophisch wachsen. Wenn sie allerdings auf einem Medium gehalten werden, das Saccharose enthält, um die fehlende Fähigkeit zur Fotosynthese zu kompensieren, zu wachsen sie normal, jedoch mit im Vergleich zu Wildtyp Pflanzen reduzierter Geschwindigkeit.

Von ycf3 wurde kürzlich gezeigt, dass es für die stabile Akkumulation von Fotosystem I (PS I) im Tabak erforderlich ist (Ruf et al., 1997). Eine Unterbrechung diese Gens führt zu einem konditionell Pigment-defizientem Phänotyp im Licht. Homoplastomische ycf3 Pflanzen zeigen bei Regeneration auf Wirkstoff- und Phytohormonfreiem Medium unter Standard- Lichtbedingungen (3.5-4 W/m²) einen vollständig weißen Phänotyp, während der Phänotyp unter Schwachlichtbedingungen (0.4-0.5 W/m²) viel schwächer (hellgrün) ausgeprägt ist.

Ein anderer bekannter mutanter Pflanzen Phänotyp, wird als hcf (high chlorophyll fluorescence) bezeichnet. Dieser Phänotyp beruht auf einer Mutation in der Expression und/oder Prozessierung von Genen, die in die Fotosynthese involviert sind (entweder bei Zellkern­ kodierten oder bei Plastiden-kodierten Genen; Bock et al. 1994; Monde et al., 2000; Monde et al., 2000b). Diese Mutanten zeigen einen charakteristischen Fotosynthese defizienten Phänotyp: verschlechtertes Wachstum unter Gewächshausbedingungen, hellgrüne Blätter und "high chlorophyll fluorescence" (starke Chlorophyll Fluoreszenz; rote Fluoreszenz) unter UV- Beleuchtung.

Hcf tritt auf, wenn der fotosynthetische Elektronentransport blockiert wird ("Elektronen Rückstau"). Eine Möglichkeit, einen hcf Phänotyp herbeizurufen besteht darin, das plastidäre petA-Gen zu inaktivieren. Es kodiert für eine Untereinheit des im fotosynthetischen Elektronentransport verwickelten Cytochrom b/f Komplexes.

Unter Ausnützung des Pigment- oder Fotosynthese defizienten Phänotyps von z. B. Δrpo, Δycf3 or ΔpetA Pflanzen kann eine zweite Transformationsrunde durchgeführt werden: dabei werden die Pigment defizienten Transformanten der ersten Runde als Substrat verwendet um gleichzeitig die ausgeschaltete Funktion wiederherzustellen, den Selektionsmarker der ersten Runde zu entfernen (sofern ein solcher verwendet wurde) und optional, interessierende Sequenzen zu inserieren. Indem ein entsprechendes Wildtyp-Gen in das Plastom der Pigment­ defizienten Mutanten eingebracht wird, erhält man wieder grüne Pflanzen. Deshalb werden solche sekundären Transformanten die Fähigkeit zu fotosynthetischem Wachstum wiedererlangen und zudem einen grünen Phänotyp und/oder - im Falle des hcf Phänotyps - normale Chlorophyll Fluoreszenz zeigen.

Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um transformierte Gewebe zu selektieren. Folglich ist in diesem zweiten Schritt keine Antibiotika-Selektion nötig. Noch wichtiger jedoch ist, dass der Selektionsmarker, der für die erste Transformations-Runde verwendet wurde, in der zweiten Runde entfernt wird und Marker-freie transplastomische Pflanzen entstehen.

Die Plastidentransformation beruht auf homologer Transformation. Dies kann durch die Verwendung von flankierenden Regionen (von ausreichender Homologie zu den Zielbereichen im Plastom) auf dem Transformationsvektor erreicht werden, wie es in diesem Wissenschaftsbereich wohlbekannt ist. Bei der vorliegenden Erfindung kann die Transformation mit jeder in der Wissenschaft allgemein bekannten Methode durchgeführt werden. Derzeit gibt es zwei solcher allgemein bekannter Methoden, nämlich die "particle gun" Transformation ("Teilchenbeschuss", "Genkanone") und die PEG vermittelte Transformation. In der vorliegenden Erfindung wird die "particle gun"-Transformation bevorzugt.

Beide Schritte (a) und (c) des in der Erfindung beschriebenen Prozesses können auch durch Ko-Transformation, d. h. unter Verwendung von mehr als einem Transformations-Vektor, erreicht werden.

Die Verfahren der Erfindung können bei jeder vielzelligen Pflanze angewandt werden, vorzugsweise bei einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Nutzpflanzen. Spezielle Beispiele für Nutzpflanzen sind in dem Kapitel "Definitionen" unter dem Stichwort "Pflanzen" aufgeführt.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten die Funktion eines plastidären Gens in Schritt (a) zu verändern oder zu unterbrechen, solange ein selektierbarer oder erkennbarer Phänotyp damit erzeugt wird. Zu den Beispielen gehören eine teilweise oder vollständige Deletion der kodierenden Region des entsprechenden Gens oder eines für die Expression des entsprechenden Gens benötigten funktionellen Elementes, wie zum Beispiel Promoter, 5'-UTR, 3'-UTR und Start-Kodon. Die Funktion dieser Elemente kann auch verändert oder unterbrochen werden durch: Insertion einer fremden Sequenz in diese Elemente oder in die kodierende Region, durch vollständigen oder teilweisen Austausch dieser Elemente durch eine fremde Sequenz oder durch das Einfügen eines Stopp-Kodons in die kodierende Region.

Die oben erwähnten Mittel können auch kombiniert werden. Wenn ein Resistenzmarker in Schritt (a) eingeführt wird, so wird das Marker Gen vorzugsweise als die entsprechende Fremd-Sequenz verwendet. In Schritt (a) kann gleichzeitig jede zusätzliche interessierende Sequenz inseriert werden.

Schritt (a) des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens kann vorzugsweise durch genetische Transformation erreicht werden. In einer alternativen Ausführungsform kann Schritt (a) auch durch spontane oder induzierte Mutation auftreten oder hätte durch eine solche auftreten können.

Dies bedeutet, dass eine Pflanze (oder Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe), die für Schritt (c) dieser Erfindung verwendet wird, eine natürliche Mutante sein kann oder aber eine transgene Pflanze, die nicht entsprechend dieser Erfindung oder zum Zwecke dieser Erfindung - der hauptsächlich in der Herstellung einer transgenen Pflanze, die frei von einem Markergen ist, liegt - erhalten wurde.

In Schritt (b) des Prozesses dieser Erfindung werden Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die Plastiden haben, welche den interessierenden Phänotyp exprimieren, abgetrennt oder auf einem Medium selektiert, welches heterotrophes Wachstum unterstützt.

Die Selektion kann durchgeführt werden, indem ein in Schritt (a) eingeführtes selektierbares Markergen und ein geeignetes Antibiotikum oder ein Inhibitor verwendet wird.

Alternativ können die neuartigen Verfahren dieser Erfindung, die Fotosystem I Akzeptor Herbizide verwenden (wie unten genauer beschrieben) angewandt werden. In letzterem Fall muss in Schritt (a) keine Resistenzgen eingeführt werden. Wie oben beschrieben müssen Inhibitoren oder Antibiotika nur für einen kurzen Zeitraum nach der ersten Transformation eingesetzt werden um die Segregation zu unterstützen und die Verwendung eines solchen Agens kann sogar vollständig vermieden werden. Nach Wachstum und mehreren Zellteilungen führt die Segregaation zur Bildung von Bereichen, die sich in der Menge an vorhandenem Pigment oder in der Fluoreszenz unterscheiden. Gewebe von solchen Bereichen wird manuell abgetrennt und für weitere Regenerationszyklen eingesetzt.

In Schritt (c) des Prozesses dieser Erfindung wird das Plastom einer Pflanze, die im vorangehenden Schritt erhalten wurde, mit einem Vektor transformiert, der eine wiederherstellende Sequenz enthält, welche in der Lage ist, die in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Funktion wieder herzustellen. Diese Wiederherstellung kann mit verschiedenen Mitteln erfolgen, abhängig davon wie die Veränderung oder Unterbrechung in Schritt (a) durchgeführt wurde. Inserierte Sequenzen können entfernt werden, ausgetauschte Sequenzen können noch einmal mit durch die ursprüngliche, vollständig funktionelle Sequenz ersetzt werden und deletierte Sequenzen können wieder eingeführt werden. Gleichzeitig können ein in Schritt (a) eingeführtes Resistenzgen entfernt oder seine Funktion zerstört werden und eine zusätzliche genetische Modifikation des Plastoms durchgeführt werden oder eine zusätzliche Funktion eingeführt werden. Zu den Beispielen gehören das Einbringen einer zusätzlichen Sequenz oder interessierenden Gens, das Einbringen mehrerer Gene, das Eliminieren einer bestehenden Funktion oder Sequenz etc.

In Schritt (d) werden Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, welche Plastiden enthalten, die die entsprechende wiederhergestellte Funktion exprimieren, abgetrennt oder auf einem Antibiotikum-freiem Medium selektiert. Die Selektion kann durch zumindest teilweise fototrophes Wachstum erreicht werden und die transformierten Pflanzen sind durch den wiederhergestellten Phänotyp erkennbar. Nach Wachstum führt die Segregation zur Bildung von Bereichen, die sich in der Menge an Pigment unterscheiden. Grüne Bereiche werden manuell abgetrennt und für weitere Regenerationszyklen eingesetzt.

Bei dieser Erfindung werden für Schritt (d) vorzugsweise mixotrophe Bedingungen angewandt. Dies bedeutet, dass der Kohlenhydratgehalt des Mediums so weit wie möglich herabgesetzt wird, so dass Plastiden die transformierte Plastome enthalten und Zellen, die transformierte Plastiden enthalten, welche ihre Fähigkeit zur Fotosynthese wiedererlangt haben, im Starklicht einen Wachstumsvorteil haben. Solche mixotrophen Bedingungen können Schritt (d) beschleunigen.

Ausführungsform 1 Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung der rpoA- oder rpoB-Gene beruht

Für die gezielte Unterbrechung der Funktion von rpoB kann der rpoB-Promoter und das Start-Codon beispielsweise durch den aadA-Marker oder ein anderes Markergen ersetzt werden.

Beschossenes Gewebe kann im Falle des aadA-Markers unter vorübergehender Selektion auf Spectinomycin-haltigem Medium regeneriert werden. Transformanten weisen einen Antibiotikum-resistenten und im Licht anfangs grünen Phänotyp auf, solange sie noch heteroplastomisch sind. Diese primären Transformanten enthalten eine Mischung aus Wild-Typ und transformierten Genomen. Das grüne, heteroplastomische Material wird auf nicht-selektives Medium übertragen. Segregation führt zum Auftreten von weißen, gemischten und grünen Bereichen. Material dieser weißen Bereiche kann mehreren zusätzlichen Regenerationszyklen auf nicht-selektivem Medium unterworfen werden, um homoplastomisch mutierte Transformanten zu erhalten.

Bei der zweiten Transformation können die homoplastomischen ΔrpoB Pflanzen mit einem Vektor transformiert werden, welcher so entworfen wurde, dass das rpoB-Gen wiederhergestellt wird, das Markergen entfernt wird und vorzugsweise ein oder mehrere interessierende Gene dabei gleichzeitig eingeführt werden. Das behandelte Gewebe kann unter Selektion auf Saccharose-reduziertem Medium (Antibiotikum-frei) im Starklicht regeneriert werden. Transformanten, die einen grünen Phänotyp zeigen und in der Lage sind fotoautotroph zu wachsen, können selektiert werden.

Eine Unterbrechung und Wiederherstellung des rpoA-Gens kann auf eine vergleichbare Weise erreicht werden.

Ausführungsform 2 Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung des ycf3-Gens beruht

Die Unterbrechung des ycf3-Gens kann erreicht werden, indem das 5'-Regelelement und das erste Exon des ycf3-Gens durch eine Markergen wie den aadA-Marker ersetz wird. Der Transformationsvektor kann in Tabakplastiden beispielsweise mit der "biolistischen Methode" (Verwendung einer Genkanone; "particle gun") oder durch Verwendung der PEG-vermittelten Transformation eingebracht werden. Das beschossene Gewebe (im Falle der biolistischen Transformation) wird unter Selektion auf einem Medium, welches einen Inhibitor oder ein Antibiotikum enthält (Spektinomycin im Falle des aadA-Gens) regeneriert. Transformanten zeigen Inhibitor-Resistenz und unter Standard-Lichtbedingungen (3,5-4 W/m²) einen anfangs grünen Phänotyp, solange sie noch heteroplastomisch sind.

Diese primären Transformanten enthalten normalerweise eine Mischung aus Wild-Typ und transformierten Chloroplasten-Genomen. Nach einer Übertragung auf Antibiotikum-freies Medium führt die Segregation zum Auftreten von gelb-weißen und grünen Bereichen (unter Standard-Lichtbedingungen; siehe oben). Material der weißen Bereiche kann mehreren zusätzlichen Regenerationszyklen auf nicht-selektivem Medium unterworfen werden, um homoplastomisch mutierte Transformanten zu erhalten. Neben ihrem bleichen, beinahe weißen Phänotyp im Licht zeigen die Mutanten vermindertes Wachstum. Um ausreichend Material für den zweiten Transformationsschritt zu erhalten, kann die mutierte Pflanzenlinie in Schwachlicht- Bedingungen überführt werden. Unter diesen Bedingungen (0,4-0,5 W/m²) zeigen die Pflanzen einen viel schwächer ausgeprägten Phänotyp und können eine ausreichende Menge an Spendermaterial - beispielsweise für eine "particle gun"-Transformation (Genkanone) - hervorbringen.

Bei dieser zweiten Transformation werden die homoplastomischen Δycf3-Pflanzen mit einem Vektor transformiert, welcher so entworfen wurde, dass das ycf3-Gen wiederhergestellt wird, das Markergen entfernt wird und vorzugsweise ein oder mehrere interessierende Gene dabei gleichzeitig eingeführt werden. Das beschossene Gewebe kann unter Selektion auf Saccharose-reduziertem Medium (Antibiotikum-frei) im Starklicht regeneriert werden. Transformanten, die einen normalen grünen Phänotyp zeigen und in der Lage sind fotoautotroph zu wachsen, können selektiert werden.

Ausführungsform 3 Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung des petA-Gens beruht

Für eine gezielte Unterbrechung des petA-Gens kann die codierende Region durch ein Markergen, beispielsweise den aadA-Marker ersetz werden.

Beschossenes Blattgewebe (im Falle der biolistischen Transformation) kann unter Selektion auf Antibiotikum-haltigem Medium regeneriert werden. Transformanten zeigen Antibiotikum-Resistenz und anfangs einen normalen grünen Phänotyp im Licht, solange sie noch heteroplastomisch sind. Diese primären Transformanten enthalten eine Mischung aus Wild- Typ und transformierten Chloroplasten-Genomen. Nach einer Übertragung auf Antibiotikum­ freies Medium kann die Segregation zum Auftreten von Bereichen führen, die den hcf-Phänotyp zeigen, welcher unter UV-Beleuchtung erkannt werden kann. Material der mutierten Bereiche kann mehreren zusätzlichen Regenerationszyklen auf nicht-selektivem Medium unterworfen werden, um homoplastomisch mutiertes Material zu erhalten.

Bei der zweiten Transformation werden die homoplastomischen ΔpetA-Pflanzen durch Beschuss mit einem Vektor transformiert, welcher so entworfen wurde, dass das petA-Gen wiederhergestellt wird, das Markergen entfernt wird und vorzugsweise ein oder mehrere interessierende Gene dabei gleichzeitig eingeführt werden. Das beschossene Gewebe kann unter Selektion auf Saccharose-reduziertem Medium (Antibiotikum-frei) im Starklicht regeneriert werden. Transformanten, die einen normalen grünen Phänotyp zeigen und in der Lage sind fotoautotroph zu wachsen, können selektiert werden.

Ausführungsform 4 Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung des petA-Gens beruht, wobei die Inaktivierungs-Mutanten mittels eines neuartigen Verfahrens selektiert werden

Dieses Verfahren kann bei alle Mutanten angewandt werden, die Fotosynthese-defekt sind. Vergleichbar zu Ausführungsform 3 kann die Selektion der Plastidentransformanten auf der Inaktivierung und Reaktivierung des petA-Gens beruhen. Allerdings kann die Selektion der petA-Mutanten auf einem Medium durchgeführt werden, das ein Herbizid enthält, welches für seine Wirkung aktive Fotosynthese benötigt, wie beispielsweise das Herbizid Paraquat. Jede vollständige Inaktivierung des petA-Gens kann im Vergleich zum Wild-Typ in der mutierten Pflanzenlinie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber einem solchen Herbizid führen.

Als wichtige Konsequenz ergibt sich daraus, dass das Einführen von einem Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenzmarker während des ersten Transformationsschrittes vermieden werden kann.

Vektoren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit, neuartige Funktionen während des ersten oder zweiten Transformationsschrittes einzuführen.

Interessierende Gene können während des ersten oder während des zweiten Transformationsschrittes oder in beiden Schritten eingeführt werden. Deshalb können mehrere Gene oder funktionelle Operons in die Zielpflanze eingebracht werden. Unter anderem ist dies von hoher Bedeutung für die Erzeugung neuer metabolischer Wege in transplastomen Pflanzen, da dabei eine bedeutende Anzahl neuartiger Gene und/oder Regulationsfaktoren in das Plastom integriert werden müssen.

Ebenso können gewünschte Sequenzen eingebracht oder entfernt werden, beispielsweise um das Muster der plastidären Genexpression zu verändern.

Vektoren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit Selektionsmarker wiederzuverwenden.

Eine weitere Anwendung der in dieser Erfindung beschriebenen zwei-Schritt-Strategie ist die Möglichkeit, den gleichen Selektionsmarker für eine weitere Transformation wiederzuverwenden, nachdem dieser beim zweiten Schritt aus dem Genom entfernt wurde. Danach kann dieser wieder entfernt werden und der Vorgang kann wiederholt werden. Dies bietet Möglichkeiten für die Insertion einer potenziell unbegrenzten Anzahl von Genen oder funktionellen Operons in das Plastidengenom unter Verwendung des gleichen Selektionsmarkers. Dies ist ein wichtiger Schritt, um den Mangel an Selektionsmarkern für die Plastiden-Gentransformation zu überwinden.

Vektoren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit interessierende Sequenzen an unabhängigen (Plastom-)Loci zu inserieren.

Durch die Verwendung der unterschiedlichen Kombinationen der beschriebenen Verfahren (beispielsweise Ausführungsform 1, 2 und 3 unter Verwendung von jeweils rpoA, ycf3 and petA als Zielorte) können die interessierenden Gene in verschiedene Zielorte des Plastoms eingebracht werden. Die hier beschriebenen Verfahren werden auch unter Verwendung von Inaktivierung und Reaktivierung von anderen zur Fotosynthese in Beziehung stehenden Zielgenen funktionieren, wie z. B. psbA. Folglich gibt es zahlreiche potenzielle Zielorte. Unter Verwendung der homologen Rekombination können neuartige Funktionen auch an von den Markergenen unabhängigen Stellen eingeführt werden.

Vektoren dieser Erfindung bieten neuartige Selektionsverfahren.

Das aadA-Gen ist der einzige Selektionsmarker, der routinemäßig eingesetzt wird (Heifetz, 2000) und das nptII-Gen, welches Resistenz gegen Kanamyzin vermittelt, ist die einzige Alternative, von der gezeigt wurde, dass sie bei der Plastidentransformation höherer Pflanzen funktioniert (Carrer etal., 1993). Die Vektoren dieser Erfindung überwinden den Mangel an selektierbaren Markergenen. Zu den hier beschriebenen neuartigen Selektions- Inhibitoren für die Plastidentransformation gehören Paraquat, Morphamquat, Diquat, Difenzoquat und Cyperquat. Diese Substanzen gehören zur Gruppe der "Fotosystem I Akzeptor Herbizide" (Hock & Elsner, 1995). Sie sind keine Inhibitoren von Fotosystem I, sondern werden von Fotosystem I anstelle von Ferredoxin und NADP reduziert. Die Autooxidation der reduzierten Inhibitoren erzeugt dann Sauerstoffradikale, die sehr toxisch sind. Die Toxizität dieser Herbizide hängt deshalb von Licht und Sauerstoff ab. Wenn der Elektronentransport durch Fotosystem I entweder durch die Deletion eines essentiellen Gens für Fotosystem I oder für den Cytochromb/f-Komplex (z. B. petA) unterbrochen wird, so sind diese mutierten Pflanzen resistenter gegen "Fotosystem I Akzeptor Herbizide" (wie z. B. Paraquat) als Wild-Typ Pflanzen. Solche Herbizide können deshalb geeignete Selektionsmittel für das Ausschalten ("knock out") dieser Gene sein. Jeder Albino wird gegenüber diesen Inhibitoren unempfindlich sein; deshalb könnte auf diese Weise auf jede Deaktivierung hin, die zu Fotosynthese-Defizienz führt, selektiert werden.

BEISPIELE

Die Erfindung wird im folgenden durch den Verweis auf folgende detaillierte Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen nur zum Zweck der Illustration und sind nicht als Beschränkung gedacht, solange dies nicht anders angegeben ist. Standard Techniken für rekombinante DNA und molekulare Klonierung, die hierbei benutzt werden sind hinlänglich bekannt und werden bei Ausubel, 1999, Maniatis et al., 1989 und Silhavy et al., 1984 beschrieben.

Beispiel 1 Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung des rpoB Gens

Konstruktion von Transformationsvektor pIC571, der zur Inaktivierung des plastidär kodierten rpoB Gens verwendet werden kann.

Blattmaterial von Tabak Pflanzen wurde in Anwesendheit von flüssigem Stickstoff zerkleinert und Gesamt-DNA (Nicotiana tabacum L. var. petit havanna) mit Hilfe des Qiagen 'DNeasy Plant Mini Kit' isoliert.

Auf diese Weise isolierte genomische DNA kann als Vorlage zur Amplifikation der Plastom-Region 'rpoB-trnA7' mittels PCR verwendet werden. Dazu wurde das folgende Primer- Paar verwendet: p38 5'-AAG ATG AAC CTG TTC CCA TG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 25967-25986; die Nukleotid-Positionen entsprechen der Gene Bank Accession Number Z00044.1) und p39 5'-CAC TTC TTC CCC ACA CTA CG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 29616-29597). Für die PCR wurde die Taq-Polymerase (Sigma) verwendet und folgendes PCR Programm: 60 sec bei 95°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 60 sec bei 55°C, 240 sec bei 72°C, 32 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min.

Das PCR Produkt wurde mittels Gelelektrophorese analysiert und eine Bande der erwarteten Größe 3.65 kb detektiert. Dieses Fragment wurde in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert, der pCR rpoB01 bezeichnet wurde. Die korrekte Sequenz wurde mittels Sequenzierung bestimmt (Toplab; München).

Zur Inaktivierung des rpoB-Operons wurde als selektierbarer Marker die aadA Kassette ins Plastom integriert, wobei es die 5'-upstream Region und den Translationsstart des rpoB Gens ersetzt (Aval Fragment = 699 bp; Plastom Sequenz 27508-28206). Als Vorraussetzung für die Klonierung wurde eine zusätzliche AvaI Restriktionsschnittstelle in der 'multiple cloning site' des pCR rpoB01 Vektors entfernt. Dies wurde dadurch erreicht, dass das Plasmid mit XhoI geschnitten wurde, gefolgt von einer Auffüllreaktion unter Verwendung der Klenow Polymerase und Nukleotiden. Der lineare Vektor wurde nun religiert und in kompetente Bakterien transformiert. Der entstandene Vektor pCR rpoB ΔXhoI enthält nun nur die beiden oben erwähnten AvaI Schnittstellen.

Das Plasmid pCR rpoB ΔXhoI wurde mit AvaI verdaut und das größere der beiden resultierenden Fragmente (6861 bp and 699 bp) aus einem Agarose Gel mit Hilfe des Qiagen 'gel extraction kit' gereinigt. Die 'sticky ends' des 6861 bp Fragments wurden in 'blunt ends' mit Hilfe der Klenow Polymerase und Nukleotiden umgewandelt. Um Selbstligation zu verhindern wurde das DNA Fragment mit 'calf alkaline phosphatase' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) behandelt.

Schließlich wurde die aadA Expressionskassette (1412 bp, als SmaI Fragment) aus dem Vektor pUC16SaadA-Sma (Koop et al., 1996) isoliert und in das AvaI linearisierte 6861 bp Fragment ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in Bakterien transformiert. Plasmide resultierender Bakterienklone wurden analysiert, um die Orientierung des aadA Inserts zu bestimmen. 7 positive Klone zeigten eine Insertion der aadA Expressionskassette in der selben Leserichtung wie das rpoB Gen. Dieses Plasmid wurde als pIC571 (pCR rpoB aadA-I) (Abb. 1) bezeichnet. Größere Mengen an Plasmid-DNA wurden unter Verwendung des Qiagen 'plasmid maxiprep kit' isoliert.

Erste Transformation und Selektion homoplastomischer ΔrpoB Mutanten

PEG vermittelter transmembraner DNA Transfer in Protoplasten ist eine reproduzierbare Methode zur Transformation von Plastiden in höheren Pflanzen (Golds et al., 1993; O'Neill et al., 1993). Die Regeneration von Protoplasten wurde kürzlich optimiert, wie in Dovzhenko et al., 1998 beschrieben.

A. Protoplasten-Isolation

Blätter 3 Wochen alter Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. petit havanna) werden in ca. 1 mm lange Streifen geschnitten und übernacht mit 0,25% Cellulase R10 und 0,25% Macerozyme R10 (Yakult, Honsha Japan) gelöst in F-PIN Medium inkubiert. Nach Standard Filtrations-, Flotierungs- und Sedimentations-Prozedur (Koop et al., 1996) werden die Protoplasten in Transformations Medium resuspendiert, die Gesamtmenge an Protoplasten bestimmt und die Dichte auf 5 × 10⁶ Protoplasten pro ml eingestellt.

F-PIN Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): KNO₃ (1012 µg/ml), CaCl₂.2H₂O (440 µg/ml), MgSO₄.7H₂O (370 µg/ml), KH₂PO₄ (170 µg/ml), NH₄-Succinat (10 ml of 2 M stock), EDTA-Fe(III).Na-Salz (40 µg/ml), KJ (0,75 µg/ml), H₃BO₃ (3 µg/ml), MnSO₄ H₂O (10 µg/ml), ZnSO₄ 7H₂O (2 µg/ml), Na₂MoO₄ 2H₂O (0,25 µg/ml), CuSO₄ 5H₂O (0,025 µg/ml), CoCl₂ 6H₂O (0,025 µg/ml), Inositol (200 µg/ml), Pyridoxin-HCl (2 µg/ml), Thiamin-HCl (1 µg/ml), Biotin (0,02 µg/ml), Nicotin Säure (2 µg/ml), BAP (1 µg/ml), NAA (0,1 µg/ml), Polypuffer 74 (10 ml), Saccharose (~ 130 000 µg/ml).

Transformations Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): MgCl₂.6H₂O (3050 µg/ml), MES (1000 µg/ml), Mannit (~ 80 000 µg/ml).

B. Plastiden Transformation und Protoplasten Einbettung

50 µg DNA (Transformationsvektor pIC571), 7 µl F-PCN, und 100 µl (500 000 Zellen) Protoplasten Suspension werden zu 125 µl 40% PEG Lösung zugegeben, vorsichtig vermischt und für 7.5 min. inkubiert. Dann werden 125 µl of F-PCN zugegeben, gemischt und für 2 min inkubiert. Nachdem das Volumen auf 3 ml mit F-PCN aufgefüllt ist, werden 3 ml F-Alginat Medium zugegeben. Die Alginat Einbettung in dünne Schichten erfolgt durch das Auftropfen der Protoplasten-Alginat Mischung auf Polypropylen Netze, die auf der Oberfläche von Ca²⁺ Medium Platten liegen. Nach Erstarrung des Alginats werden die Netze vom Ca²⁺ Medium entfernt, zum Equilibrieren umgedreht in flüssiges F-PCN Medium gelegt (2 × 10 ml, je 30 min) und dann in neue Petrischalen mit 2 ml F-PCN Medium transferiert. Die eingebetteten Protoplasten werden für die ersten 20 Stunden in Dunkelheit inkubiert gefolgt vom gewöhnlichen 16 h Tag/8 h Nacht Rhythmus.

F-PCN Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): KNO3 (1012 µg/ml), CaCl2. 2H2O (440 µg/ml), MgSO4. 7H₂O (370 µg/ml), KH2PO4 (170 µg/ml), NH4-succinate (10 ml of 2 M stock), EDTA-Fe(III). Na-Salz (40 µg/ml), KJ (0,75 µg/ml), H3BO3 (3 µg/ml), MnSO4. H₂O (10 µg/ml), ZnSO4.7H2O (2 µg/ml), Na2MoO4.2H2O (0,25 µg/ml), CuSO4.5H2O (0,025 µg/ml), CoCl2.6H2O (0,025 µg/ml), Inositol (200 µg/ml), Pyridoxin-HCl (2 µg/ml), Thiamin-HCl (1 µg/ml), Biotin (0,02 µg/ml), Nicotin Säure (2 µg/ml), BAP (1 µg/ml), NAA (0,1 µg/ml), Polypuffer 74 (10 ml), Saccharose (~ 20 000 µg/ml), Glucose (65 000 µg/ml).

F-Alginat Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): MES (1370 µg/ml), MgSO4 .7H₂O (2500 µg/ml), MgCl2.6H2O (2040 µg/ml), Mannit (~ 77 000 µg/ml), Alginat (24 000 µg/ml).

Ca2+-Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): MES (1950 µg/ml), CaCl2.2H2O (2940 µg/ml), Mannit (~ 82 000 µg/ml), Agar, gereinigt (10 000 µg/ml).

Eine Woche nach der Einbettung der transformierten Protoplasten werden die Netze auf RMOP Festmedium mit je 500 µg/ml Spectinomycin und Streptomycin übertragen (siehe Bespiel 3). Alle 3 Wochen werden dann im folgenden die Netze auf frisches Medium transferiert bis keine weiteren grünen Regenerate erscheinen. Erste Regenerate erscheinen nach etwa 5 Wochen und werden dann einzeln in Petrischalen auf Medium gesetzt. Wie erwartet zeigten erste ΔrpoB Transformanten Spectinomycin Resistenz und einen grünen Phänotyp unter Normallicht Bedingungen im heteroplastomischen Zustand. Um transformierte plastidäre DNA Moleküle zu vermehren und Wildtyp Genome zu reduzieren, wurden transformierte Linien auf RMOP Medium ohne Spectinomycin transferiert. Nach 3 bis 5 Wochen zeigten sich weiße Sektoren. Material von diesen weißen Sektoren wurde weiter auf nicht-selektivem Medium für 5 Regenerations-Zyklen kultiviert, um ein homoplastomisches Stadium zu erreichen. Die dabei heranwachsenden Linien zeigten einen weißen Phänotyp. Diese transplastomischen Linien wurden zum Wurzeln auf VBW Medium (fest) transferiert, um Pflanzen für die zweite Transformation heranzuziehen.

Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot

Blattmaterial von ΔrpoB transplastomischen Pflanzen und Wildtyp Pflanzen wurde in Anwesendheit von flüssigem Stickstoff zerkleinert und Gesamt-DNA (Nicotiana tabacum L. var. petit havanna) mit Hilfe des Qiagen 'DNeasy Plant Mini Kit' isoliert.

Plastidäre Transformanten wurden mit Hilfe von PCR analysiert. Gesamt DNA wurde von verschiedenen Linien transplastomischer Pflanzen isoliert, die als Template eingesetzt werden konnte. Dabei wurden 2 Sets von Primern eingesetzt: oFCH59 5'-TGCTGGCCG TACATTTGTACG-3' (bindet in der 5' Region der aadA kodierenden Sequenz) und oFCH60 5'- CACTACATTTCGCTCATCGCC-3' (bindet in der 3' Region der aadA kodierenden Sequenz) wurden eingesetzt, um die Anwesendheit des aadA Gens zu zeigen. Die Primer oFCH60 und p42 5'-ATTTGTAGTAGAAGGTAATTGC-3' (entspricht im Tabak Plastom der Sequenz 29081- 29102) wurden verwendet, um eine korrekte Integration ins Plastom nachzuweisen. Ein weiterer Nachweis der korrekten Integration ins Plastom und des homoplastomischen Genotyps kann durch DNA Gel Blot Analysen durchgeführt werden. Für DNA-Gel-Blot-Analysen wurde Genomische DNA von steril angezogenen Pflanzen verwendet. Im Detail wurde wie folgt vorgegangen: 3 µg Gesamt DNA pro zu analysierender Linie wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG Easy Hyb Buffer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein 398 bp großes SmaI/HindIII Fragment verwendet, welches aus dem Vektor pCR rpoB01 herausgeschnitten und über Gelelektrophorese gereinigt wurde. Die Markierung erfolgt mit Hilfe des DIG 'probe labeling kit' (Roche).

Konstruktion des Transformationsvektors pIC554 zur Rekonstitution des rpoB Gens

Als Nachweis für die Verwendung dieses Selektionssystems wurde ein Transformationsvektor konstruiert, der die Deletion des rpoB Gens wiederherstellt und gleichzeitig eine neue Marker Restriktionsschnittstelle einbringt. Diese zusätzliche Schnittstelle dient der Unterscheidung zwischen rekombinanten plastidären Genomen bezüglich dieser Plastom-Region und potenziellen Resten an Wildtyp Plastom-Kopien (für den Fall, dass die mutanten Linien noch nicht komplett homoplastomisch sind).

Das Plasmid pIC571 (pCR rpoB01) wurde mit XmaI verdaut, und die Enden dieses linearen Fragments wurden mit Hilfe der Klenow Polymerase und Nukleotiden in 'blunt ends' umgewandelt. Dieses Fragment wurde religiert und in Bakterien transformiert. Plasmid DNA bakterieller Klone wurde isoliert und auf die Abwesendheit der SmaI Restriktionsschnittstelle hin untersucht. DNA eines korrekten Klons pIC554 (pCR rpoB01-ΔSmaI; Abb. 2) wurde isoliert und für die Plastiden Transformation eingesetzt.

Die singuläre SmaI Restriktionsschnittstelle von Vektor pIC571 erlaubt einfache Einschritt-Klonierungen jedes Fremd-Gens zum Zweck der Expression in Plastiden.

Plastidentransformation von ΔrpoB Mutanten und Selektion homoplastomischer Linien

Das Ziel der zweiten Transformation ist es, das rpoB Gen funktionstüchtig wiederherzustellen (inklusive Translationsstart), die aadA Kassette zu entfernen und gleichzeitig eine neue Marker Restriktionsschnittstelle einzubringen. Junge Blätter steriler homoplastomischer ΔrpoB Mutanten herangewachsen auf VBW Medium wurden mit Plasmid pIC554 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und diese auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker (3 g Saccharose/Liter) transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Potenzielle Transformanten zeigten einen grünen Phänotyp und sind in der Lage, fotoautotroph zu wachsen. Um einen homoplastomischen Zustand zu erreichen, wurden mehrere Regenerations-Zyklen auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker durchgeführt. Homoplastomische Linien wurden zur Wurzelbildung auf B5 Medium transferiert.

Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot nach der zweiten Transformation

Gesamt DNA von steril herangewachsenen transplastomischen Linien wurde für die DNA Gel Blot Analyse eingesetzt.

Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 µg Gesamt DNA pro zu analysierender Linie wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und SmaI gleichzeitig verdaut und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG Easy Hyb Buffer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein 398 bp großes SmaI/HindIII Fragment verwendet, welches aus dem Vektor pCR rpoB01 herausgeschnitten und über Gelelektrophorese gereinigt wurde. Die Markierung erfolgt mit Hilfe des DIG 'probe labeling kit' (Roche). Diese Sonde sollte bei zweifach transformierten Linien an einem 3629 bp großes Fragment hybridisieren. Dies wäre der klare Nachweis, dass das rekombinante Fragmente des Transformationsvektors in das Plastom integriert wurde. Das entsprechende Wildtyp Fragment hingegen besitzt eine Größe von nur 1628 bp. Eine Hybridisierungsbande bei 3629 bp zeigt ebenfalls an, dass die aadA Marker Kassette entfernt wurde.

Um die Entfernung der aadA Marker Kassette zu zeigen, kann ein zweiter Blot gemacht werden (wobei nach der ersten Hybridisierung der Blot gestrippt wurde), bei dem ein 480 bp Fragment als Sonde verwendet wird. Als Sonde wurde ein Fragment des aadA Gens eingesetzt, amplifiziert mit den Primern oFCH59 und oFCH60 (siehe oben). Für die PCR wurde der DIG 'labeling reaction kit' in Anlehnung an das Hersteller Protokoll verwendet.

Beispiel 2 Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung des rpoA Gens

Konstruktion von Transformationsvektor pGEM rpoA-del, der zur Inaktivierung des plastidär kodierten rpoA Gens verwendet werden kann.

Die Region des Tabak Chloroplasten Genoms (entsprechend den Plastom Nukleotiden 79401-82470), die auch rpoA kodierende Sequenz enthält, wurde per PCR amplifiziert, wobei genomische DNA isoliert aus Tabak Blattgewebe als Template eingesetzt wurde und die Taq- Polymerase (Qiagen) verwendet wurde. Dabei wurde das folgende Primerpaar eingesetzt: p78 5'-Sph I-TTAGTAACAAGCAAACCTTG-3'(bindet zu den Plastom Nukleotiden 79401- 79420), und p77 5'-Sma I-TAATTACTGAATCGCTTCCCA-3' (bindet zu den Plastom Nukleotiden 82470-82450).

Folgendes PCR Programm wurde verwendet: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 2 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das entstandene PCR Fragment wurde in den pGEM-T Vector (Promega) ligiert. Im folgenden wurde die gesamte kodierende Sequenz des rpoA Gens (entsprechend den Plastom Nukleotiden 80455-81468) herausgeschnitten mittels DraI/ScaI Verdau. Das chimäre aadA Gen wurde als SmaI Fragment aus dem Vektor pUC16SaadA (detaillierte Beschreibug siehe Koop et al., 1996) ausgeschnitten und anstelle des rpoA Gens integriert. Das aadA Gen kann dann als Marker für die Selektion von plastidären Transformanten verwendet werden. Ein Klon, der das aadA Gen in entgegengesetzter Richtung wie das rpoA Gen integriert hat, kann als Transformationsvektor pGEM-rpoA-del (Abb. 3) verwendet werden. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.

Erste Transformation und Selektion homoplastomischer ΔrpoA Mutanten

Junge Blätter steril angezogener Tabak Pflanzen (Kultivierung siehe Beispiel 1) wurden mit Plasmid pGEM-rpoA-del beladenen Goldpartikeln beschossen unter Verwendung der 'particle gun' (Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die beschossenen Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und auf diese auf festes RMOP Medium mit 500 µg/ml Spectinomycin transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3- wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Erste ΔrpoA Transformanten zeigten einen Spectinomycin-resistenten, grünen Phänotyp unter Normallicht Bedingungen im heteroplastomischen Zustand. Um einen homoplastomischen Zustand zu erreichen, wurden die Transformanten 3 Regenerations-Zyklen auf RMOP ausgesetzt. Segregation an Blättern führt zu weißen und grünen Sektoren. Blattmaterial von weißen Sektoren wurde für weitere Regenerations-Zyklen auf nicht-selektivem RMOP Medium eingesetzt, um den homoplastomischen Zustand zu erreichen. Homoplastomische transformierte Linien wurden zur Wurzelbildung auf VBW Medium transferiert (Aviv und Galun, 1985; siehe Beispiel 1).

Analyse potenzieller Transformanten mittels Southern Blot

Gesamt DNA von steril herangewachsenen transplastomischen Linien wurde für die DNA-Gel-Blot-Analyse eingesetzt.

Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 µg Gesamt DNA pro zu analysierender Linie wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein geeignetes DNA Fragment verwendet, mit Hilfe dessen man zwischen Wildtyp und transformierten Plastomen unterscheiden kann. Diese Sonde wurde mittels QIAquick 'Gel Extraction Kit' (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt, Digoxigenin markiert (Roche 'DIG DNA Labelling Kit') und konnte so für die Hybridisierung eingesetzt werden.

Konstruktion des Transformationsvektors pIC554 zur Rekonstitution des rpoA Gens

Zur Demonstration des beschriebenen Selektionssystems, mit Hilfe dessen jedes interessierende Gen ins Plastom integriert werden kann, wurde ein Transformationsvektor konstruiert, mit Hilfe dessen die Deletion der rpoA kodierenden Sequenz aufgehoben wird und gleichzeitig das GUS Gen als neuer Marker integriert wird.

Dieser Vektor enthält die rpoA kodierenden Sequenz und das GUS Gen, flankiert von den 5'- und 3'-homologen Sequenzen, die aus dem Tabak Plastom per PCR amplifiziert wurden. Dafür wurden die folgenden Primer eingesetzt: oFCH112 5'-Nco I-TACTATTAT TTGATTAGATC-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 81471-81490), oFCH113 5'-SmaI-TAA TTACTGAATCGCTTCCCA-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 82470-82450), und oFCH114 5'-Sph I-TTAGTAACAAGCAAACCTTG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 79401-79420), oFCH137 5'-Pst I-ATCACTAGTTGTAGGGAGGGATCCATGGTTCGA GAGAAAGTAAC- 3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 81468-81449). Das amplifizierte 5' homologe Fragment (Plastome Nukleotiden 81471-82470) entspricht den 1000 bp stromaufwärts zum rpoA Startcodon. Das amplifizierte 3' homologe Fragment (Plastom Nukleotide 79401-81468) enthält die ribosomale Bindestelle (RBS), die kodierende Region des rpoA Gens und 1054 Nukleotide downstream zum rpoA Stopcodon. Die beiden 5'/3' homologen Fragmente wurden in das Plasmid pUC16SRBSuidA3'rbcL (Koop et al., 1996) kloniert, das nun Transformationsvektor pIC598 genannt wurde (Abb. 4). Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.

Plastiden Transformation von ΔrpoA Mutanten und Selektion homoplastomischer Linien

Das Ziel der zweiten Transformation ist es, die rpoA kodierende Sequenz funktionstüchtig wiederherzustellen, die aadA Kassette zu entfernen und gleichzeitig das GUS Gen als neuen Marker einzubringen. Junge Blätter steriler homoplastomischer ?rpoA Mutanten herangewachsen auf VBW Medium wurden mit Plasmid pIC598 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und diese auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker (3 g Saccharose/Liter) transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3- wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Potenzielle Transformanten zeigten einen grünen Phänotyp und sind in der Lage, fotoautotroph zu wachsen. Um einen homoplastomischen Zustand zu erreichen, wurden mehrere Regenerations-Zyklen auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker durchgeführt. Homoplastomische Linien wurden zur Wurzelbildung auf BS Medium transferiert.

Analyse der Transformanten mittels Southern Blot nach der zweiten Transformation

Gesamt DNA von steril herangewachsenen transplastomischen Linien wurde für die DNA-Gel-Blot-Analyse eingesetzt.

Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 µg Gesamt DNA pro zu analysierender Linie wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein geeignetes DNA Fragment verwendet, mit Hilfe dessen man zwischen Wildtyp und transformierten Plastomen unterscheiden kann. Diese Sonde wurde mittels QIAquick 'Gel Extraction Kit' (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt, mit Digoxigenin markiert (Roche 'DIG DNA Labelling Kit') und konnte so für die Hybridisierung eingesetzt werden.

Beispiel 3 Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung des ycf3 Gens

Konstruktion von Transformationsvektor pIC553, zur gezielten Inaktivierung des ycf3 Gens. Die Region des Tabak Chloroplasten Genoms, die auch den ycf3 Leserahmen enthält, wurde per PCR amplifiziert, wobei genomische DNA isoliert aus Tabak Blattgewebe als Template und die Taq-Polymerase (Qiagen) eingesetzt wurden. Dabei wurde das folgende Primerpaar eingesetzt: oFCH63 (5'-GAAGTTTCTTTCTTTGCTACAGC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 45033-45053) und oFCH64 (5'-GAATTACCAAACCATTTGACCC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 47667-47647).

Folgendes PCR Programm wurde verwendet: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 2 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte Fragment wurde in den pGEM-T Vector (Promega) ligiert und dieses Plasmid als Transformationsvektor pIC517 bezeichnet. Das erste Exon und die 5' regulatorischen Elemente von ycf3 wurden durch BbrPI/Bst11071 Verdau herausgeschnitten. Bst11071 schneidet 373 bp stromaufwärts des ycf3 Startcodons (Nukleotid Position 46266). Die BbrPI Restriktionsschnittstelle ist in Intron 1 von ycf3 lokalisiert (nahe am Ende des ersten Exons). Das chimäre aadA Gen wurde als SmaI Fragment aus dem Vektor pUC16SaadA (detaillierte Beschreibug siehe Koop et al., 1996) ausgeschnitten und anstelle von Teilen des ycf3 Gens integriert. Das aadA Gen kann dann Marker für die Selektion von plastidären Transformanten verwendet werden. Ein Klon, der das aadA Gen in entgegengesetzter Richtung wie das ycf3 Gen integriert hat, kann als Transformationsvektor pIC553 (Abb. 5) verwendet werden. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.

Elektrotransformation von E.coli Zellen

Herstellung elektrokompetenter Zellen: 1 L LB-Medium (1% (G/V) Casein Hydrolysat, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 0,5% (G/V) NaCl) wird 1 : 100 mit einer frischen Übernacht-Kultur von E. coli JM109 Zellen (Promega, Madison, WI, USA) angeimpft. Die Zellen werden bei 37°C unter Schütteln bei 220 upm bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bei 600 nm wachsen gelassen. Die Zellen werden für 20 Min. auf Eis gekühlt und 15 Min zentrifugiert (4000 upm, 4°C). Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in 1 L eiskaltem, sterilem 10% (V/V) Glycerin resuspendiert. Die Zellen werden zweimal wie oben beschrieben zentrifugiert und das Pellet wird in 2 ml eiskaltem, sterilem 10% (V/V) Glycerin resuspendiert. Diese Suspension wird in Aliquots von 80 µl eingefroren und bei -80°C gelagert.

Elektrotransformation unter Benutzung des Bio-Rad (Hercules, CA, USA) "Micro Pulser Elektroporators": Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. 40 µl der Zellsuspension werden mit 2 µl der Ligationsmischung vermischt und in eine sterile 0,2 cm Küvette (Bio-Rad) übertragen. Die Suspension wird auf den Boden geschüttelt und die Küvette in den Küvetten Schlitten gestellt. Der Küvetten Schlitten wird in die Kammer geschoben und die Zellen werden bei 2,5 kV gepulst. Die Küvette wird aus der Kammer entnommen und die Zellen werden in 1 ml SOC-Medium (2% (G/V) Casein Hydrolysat, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM Glukose) suspendiert. Die Suspension wird für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt und 100 µl der Suspension werden auf LB-Platten, die 150 mg/l Ampicillin enthalten ausplattiert.

Erste Transformation und Selektion homoplastomischer Δycf3 Mutanten

Tabak Samen (Nicotiana tabacum cv. petit havanna) werden oberflächensterilisiert (1 Min in 70% Ethanol, 10 Min in 5% Dimanin C, Bayer, Leverkusen, Deutschland), 3 mal für 10 Min. in sterilem H₂O gewaschen und auf B5 Medium (siehe unten) ausgebracht. Pflanzen werden bei 25°C in einem 16 h Tag/8 h Nacht Zyklus angezogen (0.5-1 W/m², Osram L85W/25 Universal-White Fluoreszenz Lampen).

6 Blätter von 4 Wochen alten, steril angezogenen Nicotiana tabacum Pflanzen werden geschnitten und auf RMOP Medium (Herstellung siehe unten) ausgebracht. 35 µl einer Goldsuspension (0.6 Mikron, Biorad, München; 60 mg/ml Ethanol) werden in ein steriles Eppendorf Cup (Treff, Fisher Scientific, Ingolstadt, Deutschland) überführt, durch Zentrifugation gesammelt und mit 1 ml sterilem H₂O gewaschen. Das Gold Pellet wird in 230 µl sterilem H₂O and 250 µl 2.5 M CaCl₂ resuspendiert und 25 µg DNA (Transformationsvektor pIC553) wird zugegeben. Nach sorgfältiger Resuspendierung der Mischung werden 50 µl 0.1 M Spermidin zugegeben, gemischt und 10 Min. auf Eis inkubiert. Dann wird die Goldsuspension durch Zentrifugation (1 Min., 10000 upm) gesammelt und zweimal mit 600 µl Ethanol (100%, p.A.) gewaschen. Das Gold wird durch Zentrifugation (1 Min., 10 000 upm) gesammelt und abschließend in 72 µl Ethanol (100%, p. A.) resuspendiert. Ein Macrocarrier wird in den Macrocarrier-Halter eingesetzt und 5,4 µl der Goldsuspension werden aufgebracht. Der Beschuss wird mit einem Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He Biolistic particle delivery system unter folgenden Parametern durchgeführt:

• - Berstscheibe 900 psi
• - Helium Druck 1100 psi
• - Vakuum 26-27 inches Hg
• - Macrocarrier auf oberstem Einschub
• - Blattstück auf drittem Einschub

6 Blattstücke werden mit jeweils 5,4 µl Goldsuspension beschossen. Nach dem Beschuss werden die Blattstücke für 2 Tage bei 25°C auf RMOP Medium inkubiert.

Zwei Tage nach dem Beschuss werden die Blattstücke in kleine Teile (ca. 3 × 3 mm) geschnitten und auf festes RMOP Medium, das 500 µg/ml Spectinomycin enthält übertragen. Nach zwei Wochen werden die Blattstücke nochmals geschnitten, dann alle 3 Wochen bis keine weiteren Regenerate mehr erscheinen. Grüne Regenerate werden gesammelt und auf einzelne Platten ausgebracht. Erste Δycf3 Transformanten zeigten einen Spectinomycin-resistenten, grünen Phänotyp unter Normallicht Bedingungen im heteroplastomsichen Zustand. Um einen homoplastomischen Zustand zu erreichen, wurden die Transformanten 3 Regenerations-Zyklen auf RMOP ausgesetzt. Segregation an Blättern führt zu weißen und grünen Sektoren. Blattmaterial von weißen Sektoren wurde für weitere Regenerations-Zyklen auf nicht-selektivem RMOP Medium eingesetzt, um den homoplastomischen Zustand zu erreichen. Homoplastomische transformierte Linien wurden zur Wurzelbildung auf VBW Medium transferiert (Aviv und Galun, 1985; siehe Beispiel 1) und unter Schwachlicht Bedingungen gehalten, um den typischen Δycf3 Mutanten Phänotyp sichtbar zu machen (schwach grüne Blätter).

RMOP (pH 5.8 mit KOH): NH₄NO₃ (1650 µg/ml), KNO₃ (1900 µg/ml), CaCl₂ × 2H₂O (440 µg/ml), MgSO₄ × 7H₂O (370 µg/ml), KH₂PO₄ (170 µg/ml), EDTA-Fe(III)Na-Salz (40 µg/ml), KI (0.83 µg/ml), H₃BO₃ (6.2 µg/ml), MnSO₄ × H₂O (22.3 µg/ml), ZnSO₄ × 7H₂O (8.6 µg/ml), Na₂MoO₄ × 2H₂O (0.25 µg/ml), CuSO₄ × 5H₂O (0.025 µg/ml), CoCl₂ × 6H₂O (0.025 µg/ml), Inositol (100 µg/ml), Thiamin-HCl (1 µg/ml), Benzylaminopurin (1 µg/ml), Naphthalinessigsäure (0.1 µg/ml), Saccharose (30 000 µg/ml), Agar, gereinigt (8000 µg/ml).

B5 (pH 5.7 mit KOH): KNO₃ (2500 µg/ml), CaCl₂ × 2H₂O (150 µg/ml), MgSO₄ × 7H₂O (250 µg/ml), NaH₂PO₄ × H₂O (150 µg/ml), (NH₄)₂SO₄ (134 µg/ml), EDTA-Fe(III)Na (40 µg/ml), KI (0.75 µg/ml), H₃BO₃ (3 µg/ml), MnSO₄ × H₂O (10 µg/ml), ZnSO₄ × 7H₂O (2 µg/ml), Na₂MoO₄ × 2H₂O (0.25 µg/ml), CuSO₄ × 5H₂O (0.025 µg/ml), CoCl₂ × 6H₂O (0.025 µg/ml), Inositol (100 µg/ml), Pyridoxin-HCl (1 µg/ml), Thiamin-HCl (10 µg/ml), Nikotinsäure (1 µg/ml), Saccharose (20 000 µg/ml), Agar, gereinigt (7000 µg/ml).

VBW (pH 5.8 mit KOH): NH₄NO₃ (1650 µg/ml), KNO₃ 1900 (µg/ml), CaCl₂?2H₂O (440 µg/ml), MgSO₄?7H₂O (370 µg/ml), KH₂PO₄ (170 µg/ml), EDTA-Fe(III)Na (40 µg/ml), KI (0.83 µg/ml), H₃BO₃ (6.2 µg/ml), MnSO₄?H₂O (22.3 µg/ml), ZnSO₄?7H₂O (8.6 µg/ml), Na₂MoO₄ × 2H₂O (0.25 µg/ml), CuSO₄ × 5H₂O (0.025 µg/ml), CoCl₂?6H₂O (0.025 µg/ml), Inositol (100 µg/ml), Pyridoxin-HCl (0.5 µg/ml), Thiamin-HCl (1 µg/ml), Glycin (2 µg/ml), Nicotin Säure (0.5 µg/ml), Indolylessigsäure (2 µg/ml), Kinetin (0.2 µg/ml), Saccharose (30 000 µg/ml), Casein Hydrolysat (500 µg/ml), Agar, gereinigt (7000 µg/ml),

Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot

Plastiden Transformanten wurden mit Hilfe der PCR Methode identifiziert. Gesamt DNA isoliert von 40 unabhängigen Regeneraten wurde dabei als Template für separate PCR Reaktionen eingesetzt. Die Methode der DNA Isolation war wie folgt: 100 mg frisches Tabak Blattmaterial wurde zerkleinert (2 × 1 min bei 25 Hz) in 200 µl AP1 Puffer ('DNeasy plant mini kit', QIAGEN)/1 µl Reagenz DX (Antischaum, QIAGEN) unter Verwendung des 'mixer mill MM 300' (Retsch) in 1.5 ml Eppendorf Cups tube mit einem 3 mm 'tungsten carbide bead' 5 Sets von Primerpaaren (Sequenzen siehe Tabelle 1) wurde verwendet: oFCH59/oFCH60; oFCH52/oFCH53; oFCH52/oFCH60; oFCH53/oFCH59; oFCH60/oFCH27 wurden für die Analyse transplastomer Pflanzen eingesetzt. Primerpaar oFCH52/oFCH53 sollte ein Amplifikationsprodukt von 900 bp im Fall von Wildtyp Plastom liefern und ein Produkt von 1700 bp im Fall von transformierten Plastom. Primerpaar oFCH59/oFCH60 sollte ein Amplifikationsprodukt von 480 bp liefern, wenn die Linie transformiert ist und kein Produkt bei nicht transformierten Linien. Ebenfalls sollten die Primerpaare oFCH52/ oFCH60 und oFCH53/oFCH59 nur Amplifikationsprodukte (867 bp and 1368 bp) im Fall von transformierten Pflanzen liefern. Mit Hilfe der Primerkombination oFCH60/oFCH27 kann die korrekte Integration ins Plastom nachgewiesen werden, wenn das Amplifikationsprodukt 2541 bp beträgt.

Tabelle I

Die PCR Ergebnisse zeigten 24 Linien mit korrektem Integration des aadA Gens ins Plastom, wobei der Zustand im ersten Regenerationszyklus noch heteroplastomisch war. Diese Resultate zeigten sich auch in der phänotypischen Erscheinung bestätigt, die einen Pigmentmangel aufwies, der mit der Deletion des ycf3 Gens im Zusammenhang steht.

Homoplasmie konnte mittels Southern Blot nachgewiesen werden: Gesamt DNA von steril herangewachsenen transplastomischen Linien wurde für die DNA Gel Blot Analyse eingesetzt. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 µg Gesamt DNA pro zu analysierender Linie wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 80 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert.

Für die Herstellung der DIG markierten Hybridisierungssonde wurde Plasmid pIC522 (siehe unten) als Template für die Amplifikation eines 520 bp Fragments, wobei folgende Primer eingesetzt wurden: oFCH69 (5'-CATTGGAACTGCTATGTAGGC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 47149-47169) und oFCH64 (5'-GAATTACCAAACCATTTGACCC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 47667-47647). Für diese PCR wurde das 'PCR DIG Probe Synthesis Kit' von Roche verwendet. Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 35 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte Fragment wurde mittels QIAquick 'Gel Extraction Kit' (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt und konnte so für die Hybridisierung eingesetzt werden.

Ein Hybridisierungssignal bei 2998 bp zeigt transformierte Plastome an, ein Signal bei 2198 bp zeigt Wildtyp Plastome an. Das Resultat des Southern Blots zeigte keine Wildtyp Banden in allen 10 getesteten mutanten Linien.

Konstruktion des Transformationsvektors pICS26 zur Rekonstitution des ycf3 Gens

Transformationsvektor pIC526 wurde für die Transformation von mutanten Δycf3 Linien mit dem Ziel hergestellt, das ycf3 Gen zu rekonstituieren und gleichzeitig die aadA Kassette zu entfernen und das GFP Gen ins Plastom zu inserieren.

Die Region des Tabak Chloroplasten Genoms, die das erste Exon und die 5' regulatorischen Elemente des ycf3 Gens (571 bp) enthält, wurde von genomischer Gesamt DNA per PCR amplifiziert. Dafür wurde das folgende Oligonukleotid Paar als Primer verwendet: oFCH48 5'-SmaI-DraI-KpnI-GTGTTTTTCTCCTCGTAAGAC-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 46070-46090) und oFCH49 5'-SmaI-BamHI-BbrPI-NheI-CCGTTA TGTACACAAAATTG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 46637-46618). Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte Fragment wurde mit SmaI verdaut und in das Plasmid pIC517 (Konstruktion siehe oben) kloniert, das mit BbrPI und Bst1107I verdaut wurde. Ein Klon mit dem Plasmid, das das erste Exon und die 5' regulatorischen Elemente des ycf3 Gens in der korrekten Orientierung enthält wurde als pIC522 bezeichnet. Dieser Klon enthält ein plastidäres DNA Fragment mit 5 zusätzlichen Restriktionsschnittstellen.

Die kodierende Sequenz des GFP Gens wurde von Plasmid pKCZ-GFP (Abb. 6) per PCR amplifiziert, wobei folgende PCR Primer verwendet wurden: oFCH25 (5'-CTAGCT AGCTTATTTGTATAGTTCATCCAT-3' und oFCH26 (5'-TCCCCCGGGGCCGTCGTT CAATGAGAATGG-3'). Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte GFP Fragment wurde mit SmaI and NheI verdaut und in Vektor pIC522 kloniert, der BbrPI and NheI verdaut wurde. Der entstandene Vektor wurde pIC526 (Abb. 3) genannt. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.

Plastiden Transformation von ?ycf3 Mutanten und Selektion homoplastomischer Linien

Das Ziel der zweiten Transformation ist es, die ycf3 kodierende Sequenz funktionstüchtig wiederherzustellen, die aadA Kassette zu entfernen und gleichzeitig das GFP Gen als neuen Marker einzubringen. Junge Blätter steriler homoplastomischer ?ycf3 Mutanten herangewachsen auf VBW Medium unter Schwachlicht Bedingungen wurden mit Plasmid pIC526 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm), diese auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker (3 g Saccharose/Liter) transferiert und unter Schwachlicht Bedingungen kultiviert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Potenzielle Transformanten zeigten einen grünen Phänotyp und sind in der Lage, fotoautotroph zu wachsen. Um einen homoplastomischen Zustand zu erreichen, wurden mehrere Regenerations-Zyklen auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker durchgeführt. Homoplastomische Linien wurden zur Wurzelbildung auf B5 Medium transferiert und unter Staklicht Bedingungen kultiviert.

Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot nach der zweiten Transformation

Plastidäre Transformanten wurden mit Hilfe von PCR analysiert. Gesamt DNA verschiedener Linien transplastomischer Pflanzen, die einen grünen Phänotyp und fotoautotroph wuchsen, wurde isoliert und als Template eingesetzt. Dabei wurden folgende Primer verwendet: oFCH76 (5'-GTAGCAATCCATTCTAGAAT-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 46269-46288) and oFCH53 (5'-GACTATAGTTAATGGATACTC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 46812- 46792). Das PCR Ergebnis sollte ein Amplifikationsprodukt von 540 bp bei Wildtyp Plastomen ergeben, 1400 bp bei Linien, die eine korrekte Integration in der zweiten Runde haben und kein Amplifikationsprodukt bei unveränderten Erstrunden Transformanten (da die p76 Bindestelle deletiert wurde).

Homoplasmie konnte mittels Southern Blot nachgewiesen werden: Gesamt DNA von steril herangewachsenen transplastomischen Linien wurde für die DNA Gel Blot Analyse eingesetzt. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: Gesamt DNA junger Blättern von Linien aus dem vierten Regenerationszyklus herangewachsen unter Starklicht Bedingungen wurde isoliert, mit AvaI geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 80 Minuten auf einen X- OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert.

Die verwendete Sonde ist die gleiche wie die für den Nachweis von Δycf3 Mutanten (detaillierte Beschreibung siehe oben). DNA von Wildtyp Plastomen zeigen ein Signal bei 1212 bp, ein Signal bei 2015 bp zeigt eine korrekte Integration ins Plastom in der zweiten Transformationsrunde. Ein Signal von 6852 bp erscheint im Fall von unveränderten Erstrunden Transformanten.

Um die Entfernung der aadA Marker Kassette zu zeigen, kann ein zweiter Blot gemacht werden (wobei nach der ersten Hybridisierung der Blot gestrippt wurde), bei dem ein 480 bp Fragment als Sonde verwendet wird. Als Sonde wurde ein Fragment des aadA Gens eingesetzt, amplifiziert mit den Primern oFCH59 und oFCH60 (siehe Beispiel 1). Für die PCR wurde der 'DIG labeling reaction kit' in Anlehnung an das Hersteller Protokoll verwendet.

Beispiel 4 Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung eines Fotosynthese-Gens

Konstruktion von Transformationsvektor pIC558, der zur Inaktivierung des plastidär kodierten petA Gens verwendet werden kann

Alle Klonierungen wurden nach Standardprotokollen durchgeführt (Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4^th edition).

Der Transformationsvektor pIC558 beinhaltet die aadA-Kassette (pUC16S aadA Sma vollst, Koop et al., 1996) umgeben von zwei flankierende Sequenzen (Tabak Plastiden-DNA). Diese beiden homologen Flanken entsprechen den DNA-Se 13171 00070 552 001000280000000200012000285911306000040 0002010102389 00004 13052quenzen der 5' und 3' Bereiche des petA Gens; die aadA-Kassette ersetzt im transgenen Plastom die Sequenz des petA Gens und 300 bp des direkt anschließenden 3' Bereichs.

Beide flankierenden Fragmente werden mittels PCR amplifiziert, wofür die folgenden Primer verwendet werden: OSK13 (5'-GGAATTCCATATGGTATAAAACTCATGTGTGTAAGAAA-3') und oSK14 (5'-TCCCCCGGGGGTCCAATCATTGATCGCGAAA-3'), mit Hilfe derer NdeI/Smal Restriktionsschnittstellen erzeugt werden, und oSK15 (5'-TTCCCCGGGTTCTAAATAGAAAG AAAGTCAAATTTG-3') und oSKl6 (5'-CATGCATGCGAATGAATAAGATTCTCTTAGCTC-3'), mit derer Hilfe SmaI/SphI Restriktionsschnittstellen erzeugt werden. Folgendes Programm wird für die PCR verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 1.5 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Die PCR Fragmente (linke/rechte Flanke) und die aadA-Kassette werden mit den entsprechenden Enzymen verdaut und in einem Schritt in den Vektor pUC19 kloniert, der NdeI/SphI verdaut wird. Das entstandene Plasmid (Vektor pIC558) kann über Restriktionsanalysen und Sequenzierung auf Richtigkeit hin überprüft werden.

Der Plastiden-Transformationsvektor pIC558 ist in Abb. 8 und 9 abgebildet.

Konstruktion der Transformationsvektoren pIC597, pIC599 und pIC600 zur Wiederherstellung des petA Gens.

Das Ziel der zweiten Transformation ist es, das inaktivierte petA Gen wiederherzustellen und gleichzeitig ein neues Gen (uidA oder aphA-6, eventuell nptII) ins Plastom zu integrieren. Demzufolge werden das petA Gen und eine Genkassette (inklusive 5'/3' Regel-Elemente) zwischen die flankierenden Sequenzen kloniert. Der resultierend Vektor (pIC597, mit uidA- Kassette) enthält die selben flankierenden Fragmente wie Vektor pIC558, das petA Gen und die uidA-Kassette.

Als erster Schritt der Klonierung wird ein ~ 2.2 kb langes DNA Fragment mittels PCR amplifiziert, welches die linke Flanke (1 kb), das petA Gen (962 bp) und 300 bp des 3' Bereichs. Dazu werden folgende Primer verwendet: oSK13 (5'-GGAATTCCATATGGTATA AAACTCATGTGTGTAAGAAA-3') und oSK71 (5'-TCCCCCGGGTAGAAAACTATTGATACGTCTTATGG-3'), mit Hilfe derer NdeI/SmaI Restriktionsschnittstellen an die Enden angehängt werden. Für diese PCR wird folgendes PCR Programm verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 3 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das resultierende PCR Fragment und die rechte Flanke (Vektor pIC558) werden zusammen in pUC19 kloniert. Dieser Vektor (pIC651 oder 'petA + 1 kb5' + 1,3 kb3") enthält 1 kb petA 5' Bereich, das petA Gen und 1,3 kb des petA 3' Bereichs, was der Plastom Sequenz 63.335- 66.597 von Nicotiana tabacum entspricht.

Als neues Gen, welches neu ins Plastom integriert werden soll, wird entweder das uidA Gen (Koop et al., 1996), oder das aphA-6 Gen (Vektor pSK.KmR, Bateman and Purton, 2000) oder das nptII Gen (Töpfer et al., 1987) verwendet. Diese Gene werden als Gen-Kassetten mit den entsprechenden regulatorischen 5'/3' Elemente kloniert. Die uidA-Kassette (als SmaI- Fragment) stammt aus dem Vektor pIC562 ('pUCI6SRBSuidA3'rbcL', Koop et al., 1996). Das aphA-6 und nptII Gen werden je in den Vektor pIC562 kloniert, wobei sie jeweils das uidA Gen ersetzen. Nach dieser Zwischenklonierung können die aphA-6-Kassette und die nptII-Kassette als SmaI- Fragment isoliert werden. Diese SmaI- Fragment (uidA-Kassette, aphA-6-Kassette, npt II-Kassette) werden in den petA 3' Bereich (300 bp downstream zu petA) kloniert. Der resultierende Vektor wird 'petA-cure-plasmids' genannt (pIC597 mit uidA; pIC599 mit aphA-6; pIC600 mit nptII).

Die Konstrukte werden mittels Restriktionsanalysen und Sequenzierung auf Richtigkeit hin untersucht.

Eine schematische Abbildungen der drei Vektoren ist in Abb. 10 zu sehen. Der Transformationsvektor pIC597 ist in Abb. 11 abgebildet.

Erste Transformation und Selektion homoplastomischer ΔpetA Mutanten

Die Plastiden Transformation mit Vektor pIC558 unter Verwendung der Particle Gun und die Selektion potenzieller Transformanten wird durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben. PEG vermittelte Plastiden Transformation mit Vektor pIC558 und die Selektion potenzieller Transformanten wird durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Zweite Transformation und Selektion wiederhergestellter, homoplastomischer ΔpetA Mutanten

Die Plastiden Transformation mit den Vektoren pIC597, pIC599 und pIC600 unter Verwendung der Particle Gun wird durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben. PEG vermittelte Plastiden Transformation mit den Vektoren pIC597, pIC599 und pIC600 wird durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Selektion potenzieller Transformanten wird durchgeführt

• a) auf RMOP Medium mit reduziertem Zuckergehalt (0,3%). Transformanten mit wiederhergestelltem petA Gen sollten in der Lage sein, die durch Fotosynthese gewonnene Energie zum Wachstum zu verwenden.
• b) auf RMOP Medium mit Kanamycin als Selektions-Mittel (die Genprodukte von aphA-6 und nptII entgiften Kanamycin).

Ebenfalls sollten zweifach transformierte Pflanzen einen reduzierten hcf (high chlorophyll fluorescence)-Phänotyp während mehrmaliger Regenerations-Zyklen aufweisen.

Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot nach der ersten Transformation

Für die Isolation von DNA aus Pflanzenmaterial, die PCR Analyse und den Southern Blot werden Standard Protokolle verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Bestimmung des aadA Gens in Transformanten können die Primer oFCH59-aadA480-li and oFCH60-aadA480-re verwendet werden. Um fest zu stellen, ob das aadA Gen ins Plastom integrierte, können die Primer oFCH60-aadA480-re and oSK116-petA-re (5'-AAAATAGATTCATTAGT CCGATACC-3') verwendet werden. Primer oSK116-petA-re bindet stromaufwärts (außerhalb) der 5' flankierenden 5' Flanke. Für diese PCR wird folgendes PCR Programm: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 3 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min.

Erste PCR Resultate ergaben, dass 12 Spectinomycin-resistente Linien von der ersten Transformation das aadA Gen an der richtigen Stelle im Plastom integriert hatten. Weitere Tests und Southern Blot Analysen werden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot nach der zweiten Transformation

Für die Isolation von DNA aus Pflanzenmaterial, die PCR Analyse und den Southern Blot werden Standard Protokolle verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Bestimmung des uidA Gens die Primer oSM61-GUS-N (5'-TCACACCGATA CCATCAGCG-3') and oSM62-GUS-C (5'-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3') können verwendet werden. Um die korrekte Integration ins Plastom zu bestimmen, können die Primer oSM61-GUS-N (5'-TCACACCGATACCATCAGCG-3') and oSK138-petA-3'-re (5'-AATCGTAACCAGTCTCTACTGG-3') verwendet werden. Für die PCR wird folgendes PCR Programm verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 3 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min.

Für die Detektierung des aphA-6 Gens und des nptII Gens werden genspezifische Primer verwendet. Um die korrekte Integration ins Plastom nachzuweisen, wird ein genspezifischer Primer und der Primer oSK138-petA-3' verwendet.

Southern Blot Analysen werden durchgeführt, wie in Standard Protokollen und in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 5 Selektion auf Paraquat-Toleranz hin Pflanzentransformation und Selektion auf Paraquat-Toleranz hin

4 Blattstücke wurden jeweils mit 1 µg pIC558 (Abb. 8) wie in Beispiel 4 beschrieben transformiert. Nach dem Beschuss wurden die Blattstücke für zwei Tage bei 25°C auf RMOP- Medium inkubiert.

Zwei Tage nach dem Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke (ca. 3 × 3 mm) geschnitten, auf frisches RMOP-Medium transferiert und für 10 Tage im Dunklen bei 25°C inkubiert. Dann wurden die Blattstücke erneut geschnitten, auf frisches Medium, das 5 mg/l Paraquat enthielt übertragen und für 10 Tage im Licht bei 25°C inkubiert. Dann wurden die Blattstücke erneut geschnitten, auf frisches Medium, das 8 mg/l Paraquat enthielt übertragen und für 12 Tage im Licht bei 25°C inkubiert. Grüne Regenerate von der Unterseite wurden abgetrennt und auf einzelne Platten, die RMOP mit 8 mg/l Paraquat enthielten übertragen. Die Linien wurden wiederholten Zyklen von Sprossregenerationen unterworfen, indem sie in kleine Blattstückchen geschnitten wurden, welche neue Regenerate auf RMOP-Medium mit 8 mg/l Paraquat bilden.

Molekulare Analyse potenzieller Plastidentransformanten durch Southern-Analyse

3 µg pflanzlicher gesamt-DNA pro untersuchter Pflanze werden mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und auf einem TBE-Agarosegel (1%) aufgetrennt. Die DNA wird denaturiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Hybond-N+, Amersham) wie in Ausubel et al., 1999 beschrieben, übertragen. Der Filter wird mit Digoxigenin markierten Sonden in DIG Easy Hyb Puffer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert. Die Hybridisierunssignale werden unter Verwendung des DIG Luminiscent Detection Kit (Roche) nachgewiesen. Die Membran wird auf einem X-OMAT LS-Film bei Raumtemperatur exponiert.

Ein Fragment, das für eine Unterscheidung zwischen Wild-Typ und transformiertem Plastom geeignet ist, wird unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Hilden, Germany) über ein Gel gereinigt, unter Verwendung des Roche DIG DNA Labelling mit Digoxigenin markiert und für die Hybridisierung verwendet.

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Claims (29)

1. Verfahren zur Herstellung von in ihrem Plastom transformierten multizellulären Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben durch die folgenden Schritte:

• a) Verändern oder Unterbrechen der Funktion eines Gens in einem Plastidengenom, um einen selektierbaren oder erkennbaren Phänotyp zu erhalten,
• b) Abtrennen oder Selektion von Pflanzen oder Zellen, die diesen Phänotyp exprimierende Plastide enthalten,
• c) Transformieren des Plastidengenoms der abgetrennten oder selektierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe mit mindestens einem Transformationsvektor, der über eine Wiederherstellsequenz verfügt, die die Funktion wiederherstellen kann und
• d) Abtrennen oder Selektion der transformierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die über Plastide verfügen, die die wiederhergestellte Funktion exprimieren.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Transformation von Schritt (c) die Funktion wiederherstellt und in Verbindung damit mindestens eine weitere Funktion einführt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Transformation von Schritt (c) die Funktion wiederherstellt und in Verbindung damit eine gewünschte weitere genetische Modifizierung des Plastidengenoms verursacht.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Transformation von Schritt (c) zusätzlich eine bereits existierende Funktion eliminiert.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verändern oder Zerstören von Schritt (a) durch spontane oder induzierte Mutation erreicht wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verändern oder Unterbrechen von Schritt (a) durch genetische Transformation erreicht wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die genetische Transformation gleichzeitig das Einführen von mindestens einer weiteren Sequenz für mindestens eine weitere Funktion bewirkt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die weitere Funktion eine Inhibitorresistenzfunktion ist und Schritt (b) in Gegenwart des entsprechenden Inhibitors durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Inhibitor in Schritt (b) nur anfänglich zugesetzt wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Schritte (a) und (b) einen trophischen Typ verändern oder unterbrechen und die Schritte (c) und (d) den trophischen Typ wiederherstellen.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der wiederhergestellte trophische Typ Phototrophie ist.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei Schritte (c) und (d) eine in den Schritten (a) und (b) eingeführte Inhibitorresistenz oder -unempfindlichkeit aufheben.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der (die) in Schritt (a) benutzte(n) Vektor(en) eine Sequenz aufweist (aufweisen), die zu einer Plastidsequenz des Wirtes für eine homologe Rekombination ausreichend homolog ist.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Pflanze, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe in Schritt (b) heterotroph aufgezogen oder kultiviert wird/werden.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Verändern oder Unterbrechen von Schritt (a) einen Phänotyp mit einem Pigmentmangel bewirkt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Pigmentmangelphänotyp Chlorophyllmangel ist.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein im Plastom codiertes Plastiddgen ist, das für die Transkription oder die Translation essentiell ist, insbesondere eine RNA Polymerase.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein rpoA oder rpoB Plastidgen ist.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der in Schritt (a) erhaltene Phänotyp in Abhängigkeit von den äußeren Wachstumsbedingungen zwischen zwei oder mehreren Erscheinungen wechseln kann.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein ycf3 Plastidgen ist, was bei Standardlichtbedingungen zu einem gelbweißen Phänotyp und bei schwachen Lichtbedingungen zu einem hellgrünen Phänotyp führt.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein Plastidgen ist, das durch Verändern oder Unterbrechen zu einem Phänotyp mit starker Chlorophyllfluoreszenz führt, vorzugsweise petA.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei in Schritt (b) ein Inhibitor benutzt wird, der zu seiner Wirksamkeit aktive Photosynthese benötigt.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei der Inhibitor Paraquat, Morphamquat, Diquat, Difenzoquat und/oder Cyperquat ist.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei in Schritt (d) photomixotrophe Bedingungen benutzt werden.

25. Vektor zur Transformation eines Plastidgenoms einer multizellulären Pflanze oder deren Zellen, der eine Wiederherstellsequenz umfasst, die eine von dem Plastidgenom codierte unterbrochene Funktion wiederherstellen kann, sowie mindestens eine Sequenz, die zu einem Sequenzabschnitt des zu transformierenden Plastidgenoms homolog ist, so dass die Wiederherstellung der unterbrochenen Funktion durch homologe Rekombination geschieht.

26. Der Vektor von Anspruch 25, der mindestens eine weitere Sequenz zum Einführen mindestens einer weiteren Funktion aufweist.

27. Der Vektor von Anspruch 25 oder 26, der ferner eine Sequenz aufweist, die eine gewünschte zusätzliche genetische Modifizierung des Plastidgenoms bewirkt.

28. Der Vektor gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die homologen Sequenzen so angeordnet sind, dass ein vorbestimmter Sequenzabschnitt des Plastidgenoms eliminiert werden kann.

29. Multizelluläre Pflanze, Pflanzengewebe oder Samen, die gemäß dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 24 erhalten werden können.