DE10236001A1 - Transformation von Plastiden unter Verwendung modularer Vektoren - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/8214—Plastid transformation
Abstract
Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die im Plastom transformiert sind. Das Verfahren umfasst: DOLLAR A (a) Einführung eines ersten und einen zweiten DNA-Moleküls in die Plastiden von Pflanzen, wobei DOLLAR A das erste DNA-Molekül eine erste Region, die homolog zu einer Region auf dem Plastom ist, um eine Integration ins Plastom zu dirigieren, und eine erste gewünschte Sequenz enthält, und DOLLAR A das zweite DNA-Molekül eine zweite Region, die homolog zu einer Region auf dem Plastom ist, um eine Integration in das Plastom zu dirigieren, und eine zweite gewünschte Sequenz enthält, DOLLAR A wobei ein Sequenzsegment der ersten gewünschten Sequenz homolog zu einem Sequenzsegment der zweiten gewünschten Sequenz ist, und DOLLAR A (b) Selektion von Transformanten, die eine stabil in das Plastom integrierte Integrationssequenz enthalten, wobei die Integrationssequenz mindestens einen Teil der ersten und mindestens einen Teil der zweiten gewünschten Sequenz als kontinuierliche Sequenz enthält.
Description
- BEREICH DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung gehört zum Bereich der pflanzlichen Biotechnologie im Allgemeinen und zu neuartigen Verfahren und Vektoren zur Plastidentransformation im Speziellen. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur genetischen Transformation pflanzlicher Plastiden, Vektoren für diesen Prozess sowie Pflanzen oder Pflanzenzellen, die anhand der Methode gewonnen werden können.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Nach allgemeinem Kenntnisstand leiten sich die beiden Klassen von Zellorganellen – Plastiden und Mitochondrien – von ursprünglich unabhängigen Prokaryoten ab, die von einem Vorläufer heutiger eukaryotischer Zellen in getrennten Endosymbiose-Vorgängen aufgenommen wurden (Gray, 1991). Als Folge davon enthalten diese Organellen ihre eigene DNA, DNA-Transkripte in der Form von Boten-RNA (mRNA), Ribosomen und wenigstens einige der für eine Decodierung der genetischen Information benötigten tRNA-Moleküle (Marechal-Drouard et al., 1991).
- Zwar waren diese Organelle kurz nach der endosymbiotischen Aufnahme noch genetisch autonom, da sie alle für das prokaryotische Leben notwendigen Elemente besaßen. Doch wurde diese Autonomie während der Evolution durch einen Transfer von genetischer Information zum Zellkern hin reduziert. Trotzdem blieb ihren genetischen Kompartimenten genug Komplexität erhalten, um sie zu einem attraktiven Ziel für die Gentechnik werden zu lassen. Das trifft insbesondere für die Plastiden zu, da diese Organellen immer noch ca. 50 der für ihre wichtigste Funktion innerhalb der Pflanzenzelle – Fotosynthese – benötigenden Proteine kodieren. Außerdem kodieren die Plastiden ihre eigenen ribosomalen RNAs, die meisten ihrer tRNAs und die ribosomalen Proteine. Die Gesamtzahl der Gene im Plastom liegt bei etwa 120 (Palmer, 1991). Allerdings wird die überwiegende Mehrheit aller in den Plastiden vorhandenen Proteine vom Zellkern bzw. dem Cytosol importiert.
- Plastiden können durch Transformation genetisch verändert werden Mit der Entwicklung molekularer Klonierungstechniken gelang es bald, höhere Pflanzen durch Transformation genetisch zu verändern. Die Hauptanstrengungen im Bereich der Pflanzen-Transformation war und ist die Zellkern-Transformation, da sich die Mehrheit aller Gene dort befindet. Im Falle von Arabidopsis thaliana, dessen komplette Genomsequenz kürzlich publiziert wurde (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), sind das ca. 26.000 Gene. Die Transformation des Zellkerns konnte einfacher erreicht werden, da biologische Vektoren wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens verfügbar waren, die so verändert werden konnten, dass sie eine effiziente Kern-Transformation ermöglichen (Galvin, 1998). Hinzu kommt, dass der Zellkern fremden Nukleinsäuren direkter zugänglich ist, während die Organellen von zwei Hüll-Membranen umgeben sind, die – allgemein ausgedrückt – für Makromoleküle wie DNA undurchdringbar sind.
- Die Möglichkeit Plastiden zu transformieren zu können ist sehr wünschenswert. Denn damit könnte die sehr hohe Gendosis in diesen Organellen, die das Potenzial für außergewöhnlich starke Transgen-Expression trägt, nutzbar gemacht werden.
- Eine weitere attraktive Eigenschaft der Plastiden-Transformation besteht darin, dass Plastiden-kodierte Merkmale nicht über den Pollen übertragen werden können. Folglich wird die potenzielle Gefahr eines unerwünschten Ausbreitens der Transgene auf zu den Transformanten verwandte Wild-Typ Arten stark reduziert. Zu den weiteren potenziellen Vorteilen der Plastidentransformation gehört die Möglichkeit, mehrere Gene gleichzeitig als polycistronisches Operon zu exprimieren, sowie das Ausschalten von Positionseffekten und "gene silencing" (Abschaltung von Genen), die in Folge von Zellkern-Transformationen auftreten können.
- Tatsächlich konnten für höhere Pflanzen Methoden entwickelt werden, die die stabile Transformation von Plastiden ermöglichen. Bisher sind zwei unterschiedlich Methoden verfügbar: Beschuss von Geweben – insbesondere Blattgewebe – mit einer Genkanone ("particle gun") (Svab et al., 1990), sowie die PEG (Polyethylen-Glykol) Behandlung von Protoplasten in Anwesenheit eines geeigneten Transformations-Vektors (Koop et al., 1996). Beide Methoden vermitteln ein Eindringen von Plasmid DNA in das Stroma der Plastiden durch zwei Hüllmembranen hindurch.
- Konventionelle Methoden zur Plastidentransformation beruhen üblicherweise auf der Selektion auf eine Insertion einer Antibiotikaresistenzmarker-Kassette in das Plastom hin, wie zum Beispiel eine Expressionskassette, welche das aadA-Gen enthält (welches für das Enzym Aminoglykosid-Adenyltransferase kodiert) und welche Resistenz gegen Inhibitoren wie Spectinomycin oder Streptomycin (
US5877402 ) verleiht oder aphA-6 (das für das Enzym Aminoglykosid Phosphotransferase A-6 kodiert), welches Resistenz gegen Kanamycin (Huang et.al., 2002) verleiht. - Eine alternaive Methode Selektion zu erreichen besteht darin ein vollständiges, vorhandenes plastidäres Gen durch ein mutiertes Gen zu ersetzen, welches Resistenz gegen einen Selektions-Inhibitor verleiht (
US5451513 ). - Diese Selektionsmarkergene werden benötigt, um die transgenen Pflanzenzellen vor dem großen Hintergrund nicht-transformatierter Zellen zu selektieren und sie kodieren für Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene.
- Das Selektionsmarkergen oder das mutierte plastidäre Gen liegt in dem Integrationsbereich, welcher von homologen Bereichen flankiert ist, die Plastomintegration steuern. Die Selektion der Plastidentransformanten wird dann erreicht, indem das transformierte Pflanzenmaterial auf einem Medium, welches den geeigneten Inhibitor enthält, kultiviert wird.
- Da diese Marker zusammen mit den interessierenden Genen ("gene of interest" = GOI) stabil in das Genom integriert werden, bleiben sie auch in den homoplastomischen transgenen Pflanzen erhalten, obwohl sie für die Funktion der interessierenden Gene (GOI) nicht benötigt werden. Diese in den Pflanzen verbleibenden Markergene sind ein Haupt-Kritikpunkt an der Pflanzen-Biotechnologie, da sie theoretisch die Antibiotika-Resistenz von Pathogenen oder die Herbizid-Resistenz von Wildkräutern erhöhen könnten. Die Entwicklung eines Selektionssystems, bei dem in der transgenen Pflanze keine Resistenzgene mehr vorhanden sind, ist deshalb höchst erstrebenswert (lamtham and Day, 2000).
- Konventionelle Methoden zur Plastidentransformation werden in Heifetz, 2000 und Koop et al. dargestellt.
- Plastidentransformationsvektoren enthalten üblicherweise ein oder oder mehrere interessierende Gene, welche von zwei Bereichen aus der Insertionsstelle flankiert sind. Die flankierenden Bereiche sind für die stabile Insertion der hergestellten Sequenzen in das Plastom durch homologe Rekombinations-Ereignisse nötig (
US5877402 ,US5451513 ). - Zur Herstellung der Transformationsvektor-Moleküle ist jedoch ein beträchtlicher Klonierungsaufwand nötig, der durch die große Anzahl an unterschiedlichen Fragmenten erzeugt wird: Zwei Flanken, ein Markergen, ein oder mehrere interessierende Gene und Regelelemente, wie Promotor, 5'-UTR, 3'-UTR oder Spacer-Elemente.
- Die Klonierung von Transformationsvektoren ist in solchen Fällen problematisch, in denen zumindest eines der klonierten Gene toxische Auswirkungen auf die zur Klonierung benutzen Bakterien hat. Darüber hinaus ist die Anwendung der äußerst erstrebenswerten Möglichkeit der Koexpression mehrerer eingebrachter Gene durch die Gesamtgröße des zur Transformation verwendeten Plasmides eingeschränkt.
- Eine Hauptproblem Plastidentransformation zu erreichen besteht in der hohen Kopienzahl des Plastoms. Nach dem Transfer der Vektor-DNA in die Plastiden rekombinieren nur eine oder wenige Kopien der eingebrachten Moleküle mit dem Plastom. Deshalb wird anfänglich nur ein geringer Anteil rekominanter Plastommoleküle vor einem großen Hintergrund von Wildtyp Plastommolekülen erzeugt ("heteroplastomischer Zustand"). Durch einen sehr zeitaufwändigen, unter selektivem Druck durchgeführten Selektionsvorgang ist es möglich die ursprünglichen Wildtyp-Kopien des Plastoms zu eliminieren und einen "homoplastomisch rekombinanten Zustand" zu erreichen, welcher durch die alleinige Anwesenheit rekombinanter Plastommoleküle charakterisiert ist. Das Erreichen des homoplastomischen Zustandes wird durch mehrere Regenerations-Zyklen auf selektivem Medium, welches einen geeigneten Inhibitor enthält, unterstützt. Normalerweise sind 3 bis 5 solcher Zyklen nötig, um den homoplastomisch rekombinanten Zustand zu erreichen. Die Anwesenheit verbleibender Wildtyp-Plastom-Kopien kann durch molekulare Analyse wie beispielsweise PCR oder "Southern Hybridisierung" überwacht werden. Da für einen Regenerationszyklus mehrere Wochen benötigt werden, bedarf es mehrerer Monate, um homoplastomische Plastidentransformanten zu erzeugen.
- Ein Ziel der Erfindung ist es deshalb ein neuartiges, effizientes, schnelles und höchst vielseitiges Verfahren zu genetischen Transformation von Plastiden bereitzustellen, mittels dem genetisch stabile transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen hergestellt werden können.
- Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es ein Verfahren zur genetischen Transformation von pflanzlichen Plastiden bereitzustellen, welches eine deutliche Reduktion der Anzahl von Regenerationszyklen, die benötigt werden um homoplastomische Pflanzen zu erzeugen, ermöglicht.
- Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es ein Verfahren zur genetischen Transformation von pflanzlichen Plastiden bereitzustellen, welches die Expression mehrerer interessierender Gene erlaubt ("ploycistronische Expression").
- Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es Vektoren bereitzustellen, welche auf eine modulare Weise benützt werden können und welche dadurch den Klonierungsaufwand verringern und die Gasamtgröße der Plasmide reduzieren.
- Ein weiteres Ziel ist es Vektoren bereitzustellen, welche die Klonierung solcher Sequenzen erlauben, die eine toxische Wirkung auf die zur Klonierung benutzten Bakterien haben.
- Ein weiteres Ziel ist es ein Verfahren bereitzustellen, welches die Erzeugung von Transformanten erlaubt, bei denen in der endgültigen Pflanze oder Pflanzenzelle keine Resistenzmarker enthalten sind.
- ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Die oben erwähnten Ziele werden durch das in Anspruch 1 angegebene Verfahren erreicht. Bevorzugte Ausführungen werden in den Unteransprüchen definiert.
- Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass es möglich ist, transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, welche in ihrem Plastom transformiert sind, herzustellen, indem in die pflanzlichen Plastiden mindestens zwei DNA-Moleküle eingebracht werden, welche überlappende Sequenzen enthalten und die in der endgültigen transgenen Pflanze zu einer zusammenhängenden Integrationssequenz führen. Das Verfahren dieser Erfindung weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber konventionellen Plastidentransformationsverfahren auf. Diese Vorteile werden unten aufgeführt.
- Das Verfahren beinhaltet das Einführen eines ersten und eines zweiten DNA-Moleküls in die Plastiden von zu transformierenden Pflanzen. Diese DNA-Moleküle, welche als Vektor verwendet werden, können nacheinander, d.h. in zwei getrennten Schritten, oder gleichzeitig, d.h. in einem ein-Schritt-Verfahren eingeführt werden. Es ist weniger zeitaufwändig und daher vorzuziehen die genannten zwei DNA-Moleküle in einem ein-Schritt-Verfahren einzubringen, beispielsweise indem eine Mischung der genannten DNA-Moleküle verwendet wird. Um die genannten DNA-Moleküle einzubringen können bekannte Transformationsmethoden benutzt werden (siehe unten).
- Der Aufbau der genannten zwei DNA-Moleküle ist für das Verfahren dieser Erfindung von zentraler Bedeutung. Das genannte erste DNA-Molekül enthält einen ersten Bereich, welcher zu einem Bereich des Plastoms homolog ist, um die Plastomintegration zu steuern und es enthält eine erste interessierende Sequenz. Das genannte zweite DNA-Molekül enthält einen zweiten Bereich, welcher zu einem Bereich des Plastoms homolog ist, um die Plastomintegration zu steuern und es enthält eine zweite interessierende Sequenz. Daher ist für jedes DNA-Molekül ein zu einem Bereich des Plastoms homologer Bereich ausreichend. Vorzugsweise enthält das genannte erste oder zweite DNA-Molekül nur einen zu einem Bereich des Plastoms homologen Bereich, um die Plastomintegration zu steuern. Noch vorzugsweiser enthalten beide der genannten ersten oder zweiten DNA-Moleküle nur einen zu einem Bereich des Plastoms homologen Bereich, um die Plastomintegration zu steuern.
- Die genannten homologen Bereiche dirigieren die Integration jedes DNA-Moleküls an eine gewünschte Stelle im Plastom. Die erste und zweite homologe Region zusammen bestimmen die Art und Weise der DNA-Modifikation (z.B. Insertion, Deletion) durch das Verfahren der Erfindung. In einer vorzugsweisen Ausführung besteht das Ziel des Verfahrens der Erfindung darin eine Integrationssequenz in das Plastom einzubringen ohne weitere Plastom-Modifikationen (wie eine Deletion von Plastomsequenzen) durchzuführen. Vorzugsweise entsprechen die genannten homologen Bereiche des ersten und zweiten DNA-Moleküls zusammen einer zusammenhängenden Plastomsequenz. Im Allgemeinen sind die genannten homologen Bereiche von den Plastomen der zu transformierenden Pflanzenart abgeleitet. Solange ausreichend Homologie für die homologe Rekombination gewährleistet ist, können die homologen Bereiche von anderen Pflanzenarten abgeleitet sein, vorzugsweise jedoch von nahe verwandten Pflanzenarten.
- Die Länge eines jeden homologen Bereiches zur Plastomintegration kann über einen großen Bereich variieren, solange die Rekombinationsfrequenz ausreichend ist. Jeder homologer Bereich kann eine Länge zwischen 100 und 5000 bp (Basenpaare) haben. Üblicherweise nimmt die Rekombinationsfrequenz ab, wenn die Länge des homologen Bereiches verkürzt wird. Deshalb sollte die Länge vorzugsweise mindestens 200 bis 300 bp sein. Noch vorzugsweiser ist die Länge zwischen 500 und 2000 bp, am vorzugweisesten ist sie zwischen 500 und 1000 bp.
- Die genannten interessierenden Sequenzen können jede in das Plastom zu integrierende Nukleotidsequenz haben. Als typisches Beispiel enthalten die genannten interessierenden Sequenzen ein zu exprimierendes Gen.
- Die genannte erste und zweite interessierende Sequenz kann jeweils ein Fragment eines zu exprimierenden Gens enthalten, wobei das genannte Gen in der genannten Integrationssequenz zusammengesetzt wird. Die Erfindung ist in dieser Hinsicht äußerst vielseitig. Vorzugsweise jedoch unterscheiden sich die genannten ersten und zweiten interessierenden Bereiche.
- Die genannte erste interessierende Sequenz enthält eine Sequenz-Segment, welche homolog zu einem Sequenz-Segment der genannten zweiten interessierenden Sequenz ist. Dadurch ist dieses homologe Segment ein überlappender Bereich der genannten ersten und zweiten interessierenden Sequenz. Das homologe Sequenz-Segment ermöglicht die Rekombination der genannten ersten und zweiten interessierenden Sequenz in einer Weise, dass eine Integrationssequenz im Plastom gebildet wird, wobei die genannte Integrationssequenz mindestens einen Teil der genannten ersten und mindestens einen Teil der genannten zweiten interessierenden Sequenz als zusammenhängende Sequenz enthält.
- Das Sequenz-Segment in einer interessierenden Sequenz ist vorzugsweise am distalen Ende der interessierenden Sequenz (bezüglich der genannten homologen Bereiche, welche die Plastomintegration steuern) positioniert.
- Als Minimalanforderung müssen die genannten ersten und zweiten interessierenden Sequenzen das genannte homologe Sequenz-Segment enthalten, d.h. eine Sequenz, welche von ausreichender Homologie ist um homologe Rekombination zwischen den genannten ersten und zweiten interessierenden Sequenzen zu ermöglichen.
- Vorzugsweise sind die homologen Sequenz-Segmente der ersten und zweiten interessierenden Sequenz identisch.
- Die genannte erste und zweite interessierende Sequenz kann identisch sein, was zu einer Integrationssequenz führt, die aus der genannten interessierenden Sequenz besteht. In diesem speziellen Fall kann jede interessierende Sequenz als aus dem genannten homologen Sequenz-Segmente bestehend betrachtet werden. Dieser spezielle Fall ist keine vorzugsweise Ausführung der Erfindung. Vorzugsweise enthält die genannte erste oder zweite interessierende Sequenz zusätzlich zum homologen Sequenz-Segment eine (weitere) Sequenz. Noch vorzugsweiser enthalten jede der genannten ersten oder zweiten interessierenden Sequenzen zusätzlich zum homologen Sequenz-Segment eine (weitere) Sequenz, wobei die genannten zusätzlichen Sequenzen in den genannten ersten oder zweiten interessierenden Sequenzen unterschiedlich sind.
- Die Rekombination zwischen den genannten überlappenden Bereichen (homologe Sequenz-Segmente) kann innerhalb des Plastoms stattfinden um die genannte Integrationssequenz zu bilden. Diese Integrationssequenz beinhaltet vorzugsweise Teil-Sequenzen aus der ersten und zweiten interessierenden Sequenz. Falls diese ersten oder zweiten interessierenden Sequenzen jeweils ein interessierendes Gen enthalten, so kann eine Integrationssequenz gebildet werden, die aus zwei interessierenden Genen besteht. Deshalb kann das Verfahren der Erfindung genutzt werden, um eine gewünschte Integrationssequenz aus der genannten ersten oder zweiten interessierenden Sequenz zusammenzubauen. Der Zusammenbau der Integrationssequenz kann genutzt werden, um in den Plastiden eine neue Funktion zu erzeugen, welche auf einem der beiden genannten interessierenden Sequenzen alleine nicht vorhanden ist. Beispielsweise können ein interessierendes Gen, welches aus einer kodierenden Sequenz und aus verschiedenen Regelelementen besteht, zu einer funktionellen Einheit in der genannten Integrationssequenz zusammengebracht werden. Weiterhin kann eine kodierende interessierende Sequenz in der genannten ersten interessierenden Sequenz mit einem Promotor oder anderen Regelelementen kombiniert werden, welche von der genannten zweiten interessierenden Sequenz zur Verfügung gestellt werden (oder umgekehrt). Auf diese Weise kann eine regulatorische Sequenz, welche eine gewünschte Expression der genannten kodierenden Sequenz bewirkt, selektiert oder gesucht werden.
- Das Verfahren der Erfindung kann das Einbringen von ein oder mehreren zusätzlichen DNA-Molekülen (zusätzlich zu den genannten ersten oder zweiten DNA-Molekülen) in die genannten pflanzlichen Plastiden beinhalten. Diese(s) diese zusätzliche(n) DNA-Moleküle) enthalten zusätzliche interessierende Sequenzen. Falls ein drittes DNA-Molekül eingebracht wird, sollte dieses dritte DNA-Molekül vorzugsweise ein Sequenz-Segment enthalten, welches zu einem Sequenz-Segment der genannten ersten interessierenden Sequenz homolog ist und (ein weiteres) Sequenz-Segment, welches zu einem Sequenz-Segment der genannten zweiten interessierenden Sequenz homolog ist. Dieses dritte DNA-Molekül hat vorzugsweise keinen homologen Bereich für die Plastom-Integration.
- Nach der Transformation werden solche Transformanten selektiert, welche die gewünschte Integrationssequenz enthalten. Die Selektion wird typischerweise durch einen Inhibitor oder durch ein Antibiotikum unterstützt, gegen das die Transformanten aufgrund eines Markergens resistent sind.
- Die Selektion kann weiterhin darin bestehen, die Segregation von transformierten und nichttransformierten Bereichen zu ermöglichen (z.B. bei Blättern). Transformanten oder transformierte Sektoren können durch molekulare Analyse, wie beispielsweise PCR oder "Southern Blotting", identifiziert werden. Weiterhin können Transformanten oder transformierte Sektoren phenotypisch, beispielsweise mittels der Expression eines Transgens, identifiziert werden. Ein Transgen kann beispielsweise durch "Westen Blotting", durch eine charakteristische enzymatische Aktivität oder durch eine andere charakteristisch Eigenschaft (wie optische Eigenschaften, speziell fluoreszierende Eigenschaften) detektiert werden.
- Ein Markergen zur Selektion von Transformanten kann in das Plastom mit der genannten ersten oder zweiten interessierenden Sequenz eingebracht werden. Wie oben erwähnt, kann ein Markergen auch als Fragmente mit der genannten ersten und zweiten interessierenden Sequenz eingebracht und zu einer funktionellen Form in der genannten Integrationssequenz kombiniert werden.
- Eine wichtige Ausführung des Verfahrens der Erfindung erlaubt Marker-freie transplastomische Pflanzen herzustellen. Dies kann erreicht werden, indem ein selektierbares Markergen in einem der genannten DNA-Moleküle außerhalb einer Sequenzeinheit enthalten ist, welche aus dem genannten, zu einem Bereich des Plastoms homologen Bereich und der genannten homologen Sequenz besteht. Eine solche Positionierung des Markergens erlaubt den Verlust des genannten Markergens im Laufe der stattfindenden Rekombinationsereignisse. Ein selektierbares Markergen kann in der beschriebenen Weise in dem genannten ersten oder zweiten DNA-Molekül enthalten sein oder in beiden der genannten ersten oder zweiten DNA-Moleküle. Die Positionierung des genannten Markergens außerhalb der erwähnten Sequenzeinheit bewirkt im Laufe der in der Erfindung ins Auge gefassten Rekombinationsereignisse eine Exzission des Markergens aus dem Plastom und ermöglicht so Marker-freie transplastomische Pflanzen. Für eine fachkundige Person ist es offensichtlich, dass der Inhibitor oder das Antibiotikum, welches für das verwendete Markergen eingesetzt wird, nur vorübergehend bei der Selektion in Schritt (b) appliziert wird. Zu einem späterem Zeitpunkt wird das Antibiotikum aus dem Medium weggelassen um den Verlust des Markergens (oder der Markergene) durch von duplizierten Sequenzen (welche während der Vektorintegration entstanden sind) vermittelten Rekombinationsereignissen zu erlauben.
- In einer speziellen Ausführung des Verfahrens zur Herstellung Marker-freier transplastomischer Pflanzen ist ein selektierbares Markergen in ein erstes und ein zweites Fragment aufgespalten, wobei das genannte erste Fragment in dem genannten ersten DNA-Molekül außerhalb einer ersten Sequenzeinheit eingebaut wird und das genannte zweite Fragment in dem genannten zweiten DNA-Molekül außerhalb einer zweiten Sequenzeinheit eingebaut wird. Die genannte erste Sequenzeinheit besteht aus dem genannten ersten homologen Bereich und der genannten ersten interessierenden Sequenz. Die genannte zweite Sequenzeinheit besteht aus dem genannten zweiten homologen Bereich und der genannten zweiten interessierenden Sequenz.
- Das Verfahren der Erfindung kann bei allen Pflanzen angewandt werden. Vorzugsweise wird es bei multizellulären Pflanzen angewandt. Am vorzugsweisesten wird das Verfahren der Erfindung bei Nutzpflanzen angewandt. Beispiele für Nutzpflanzen werden bei den Definitionen aufgeführt.
- Die Erfindung bietet weiterhin einen "kit-of-parts", der aus einem ersten und zweiten DNA-Molekül, wie oben beschrieben, besteht.
- Die Erfindung bietet weiterhin ein DNA-Molekül zur Plastidentransformation, welches einen zu einem Bereich des Plastoms homologen Bereich enthält, der die Plastomintegration dirigiert, sowie eine interessierende Sequenz. Weiterhin wird eine Bibliothek von DNA-Molekülen – entsprechend den hier beschriebenen – angeboten, wobei jedes der genannten DNA-Molekülen eine andere interessierende Sequenz enthält. Außerdem werden Pflanzen oder Pflanzenzellen, die mit den genannten DNA-Molekülen des genannten "kit-of-parts" oder mit den genannten DNA-Molekülen transformiert wurden, zur Verfügung gestellt.
- Vorteile des Verfahrens der Erfindung
- Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um interessierende Sequenzen wie beispielsweise Gene oder Regelelemente in das Plastom einzubringen oder um Mutationen wie beispielsweise Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen (in das Plastom) einzubringen. Das Verfahrens der Erfindung erlaubt die Erzeugung transplastomischer Pflanzen, wobei der homoplastomische Zustand nach weniger Zyklen erreicht werden kann, als dies mit den dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren möglich ist. Je nach der speziellen Ausführung können homoplastomische Pflanzen nach 0 bis 4 Regenerationszyklen, vorzugsweise nach 2 Regenerationszyklen und noch vorzugsweiser nach einem Regenerationszyklus erhalten werden. In speziellen Ausführungen wird der homoplastomische Zustand bei primären Transformanten ohne Regenerationszyklus erhalten. Deshalb erlaubt das Verfahren der Erfindung eine enorme Reduktion des Zeitaufwandes um homoplastomisch transplastome Pflanzen zu erhalten. Die Ursache für diese überraschende Verbesserung der Effizienz ist derzeit unklar. Im Vergleich zur konventionellen Plastidentransformation ist die hier beschriebene Methode schneller, da weniger Schritte nötig sind, um homoplastomische Pflanzen zu erhalten.
- Die Methode erlaubt die Verwendung kleinerer Transformationsvektoren, für die die Klonierung einfacher zu bewerkstelligen ist als dies bei konventionellen Plastidentransformationsvektoren der Fall ist.
- Die Methode befreit die Plastidentransformation von jeder Begrenzung in der Anzahl oder Größe der einzubringenden Sequenzen, da eine unbegrenzte Anzahl von Transformationsvektoren mit überlappenden Sequenzen verwendet werden kann.
- Die Methode befreit die Plastidentransformation von jeder Begrenzung, die durch Sequenzen auferlegt ist, welche für die zur Klonierung verwendeten Bakterien toxisch sind, da die toxischen Sequenzen in zwei unterschiedliche Vektormoleküle kloniert werden können, dergestalt dass jedes von ihnen alleine – selbst wenn sie in eine Proteinsequenz exprimiert werden sollten – nicht toxisch sein kann.
- Darüber hinaus erlaubt die hier beschriebene Methode die Verwendung kombinatorischer Vektor-Bibliotheken, wobei die Vektoren der Bibliothek unterschiedliche interessierende Sequenzen enthalten.
- Die Methode kann angewandt werden um Transformanten zu erzeugen, wobei die endgültige Pflanze keinerlei Resistenzmarker-Gene enthält.
- Jeder der oben angegebenen Gesichtspunkte dieser neuen Methode bietet im Vergleich zur konventionellen Plastidentransformation beträchtliche Vorteile. Zusammengenommen stellt das Verfahren und die Vektoren dieser Erfindung generell einen enormen Fortschritt hinsichtlich Geschwindigkeit, Verwendbarkeit und Flexibilität der Plastidentransformation dar.
- DEFINITIONEN
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3' -UTR: transkribierte aber nicht translatierte Region eines (>) Gens, abwärts einer codierenden Region; in (>) plastidären (>) Genen
5'-UTR: transkribierte aber nicht translatierte Region eines (>) Gens, aufwärts einer codierenden Region; in (>) plastidären (>) Genen, der 5'-UTR enthält die Sequenzinformation für die Translations Initiation (Ribosomen Binde Stelle, (>) RBS) in der Nähe seines 3'-Endes;
aadA: (>) codierende Region von bakterieller Aminoglykosid-adenyl-Transferase, einem häufig benutztem Protein, das die (>) antibiotischen Selektions Inhibitoren Spectinomycin und/oder Streptomycin entgiftet.
aphA-6 (>) codierender Bereich der bakteriellen Aminoglykosid-Phosphotransferase A-6; ein
Protein, welches den antibiotischen (->) Selektionsinhibitor Kanamycin entgiftet Chloroplast: (>) Plastide, die Chlorophyll enthält;
Codierende Region: Nukleotid-Sequenz die Information für a) die Aminosäure-Sequenz eines Polypeptides oder b) die Nukleotide einer funktionellen RNA, enthält; codierende Regionen können optional von einem oder mehreren (>) Intron(s) unterbrochen sein;
Flanke, flankierende Region: DNA-Sequenz am 5' und 3'-Ende eines Inserts in einem (>) plastidären Transformations (>) Vektor, welche die Integration in das Ziel (>) Plastom von Sequenzen zwischen den Flanken durch doppelt reziproke homologe Rekombination vermittelt. Durch denselben Mechanismus können Sequenzen verändert oder vom Ziel (>) Plastom entfernt werden. Daher legen die Flanken des (>) plastidären (>) Transformations (>) Vektors fest, wo Veränderungen im Ziel (>) Plastom durch Transformation erzeugt werden;
Gen Expression: Prozess bei dem Geninformation in Funktion umgesetzt wird; in (>) Genen die für Polypeptide codieren, wird für die Genexpression die Aktivität eines (>) Promoters benötigt, der die RNA-Polymerase Aktivität startet und steuert, dies führt zur Bildung einer Messenger RNA, die anschließend in ein Polypeptid übersetzt wird; in (>) Genen, die für RNA codieren, generiert die Promoter-vermittelte Aktivität der RNA-Polymerase die codierte RNA.
Gen(e): Nukleotid Sequenz(en), welche für alle Elemente codiert, die notwendig sind um das unabhängige Funktionieren z.B. Expression sicherzustellen; Gene sind in (>) Operons organisiert, die mindestens eine komplette codierende Region beinhalten;
In (>) Genen die für Polypeptide codieren sind diese Elemente: (1) ein (>) Promoter, (2) eine 5'-untranslatierte Region ((>) 5'-UTR), (3) eine (>) komplette codierende Region, (4) eine 3'- untranslatierte Region ((>) 3'-UTR); in (>) Genen die für RNA codieren, fehlen der (>) 5'-UTR und der (>) 3'-UTR; in (>) Operons die aus mehr als einer codierenden Region bestehen, sind zwei aufeinander folgende vollständige (>) codierenden Regionen durch (>) Spacer getrennt; (>) Promoter, (>) ) 5'-UTR und (>) 3'-UTR Elemente werden von allen codierenden Regionen diese Operons geteilt;
Genom: Komplette DNA Sequenz eines Zellkerns oder einer Zell-Organelle;
GFP: (green fluorescent protein) grünes fluoreszierendes Protein
Homologe Rekombination: Prozess der zum Austausch, Insertion oder Deletion von Sequenzen führt, aufgrund der Anwesenheit von (>) Flanken mit genügender Sequenz Homologie zur Zielstelle in einem (>) Genom;
Interessierendes Gen: veränderte oder neu eingeführte Sequenz:
der Grund für eine Transformation;
Interessierende Sequenz: veränderte oder neu eingeführte Sequenz:
der Grund für eine Transformation; falls das Einbringen einer Sequenz nicht beabsichtigt sein sollte, so kann die Länge der interessierenden Sequenz Null sein, d.h. es kann von Interesse sein, keine interessierende Sequenz zu haben. In der vorliegenden Erfindung hat eine interessierende Sequenz eines als Vektor verwendeten DNA-Moleküls mindestens ein Segment, welches zu einem Sequenz-Segment eines anderen als Vektor benutzten DNA-Moleküls homolog ist.
Intron: Sequenz die eine (>) codierende Region unterbricht;
Operon: Organisationsstruktur von mehreren (>) Genen, die einen Promoter teilen;
Pflanze(n): Organismus, der (>) Plastiden in seinen Zellen enthält; diese Erfindung bezieht sich besonders auf multizelluläre (>) Pflanzen; das schließt die Gruppe der Nacktsamer (wie Kiefer, Fichte, Tanne) and Bedecktsamer (wie die einkeimblättrigen Nutzpflanzen Mais, Weizen, Gerste, Reis, Roggen, Triticale, Hirse, Zuckerrohr, Spargel, Knoblauch, Palmen und einkeimblättrigen Nicht-Nutzpflanzen, und zweikeimblättrige Nutzpflanzen wie Tabak, Kartoffel, Tomate, Rübsamen, Zuckerrübe, Kürbis, Gurke, Melone, Pfeffer, Citruspflanzen, Aubergine, Weintrauben, Sonnenblume, Soja, Luzerne, Baumwolle usw.), und zweikeimblättrige Nicht-Nutzpflanzen wie auch Farne, Lebermoose, Moose und mehrzellige grüne, rote und braune Algen;
Plastide(n): Organelle(n) mit eigener genetischer Maschinerie in (>) Pflanzen Zellen, die in verschiedenen funktionellen und morphologisch unterschiedlichen Formen vorkommen, z.B. Amyloplasen, (>) Chloroplasten, Chromoplasten, Etioplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Proplastiden etc.;
Plastome: Komplette DNA-Sequenz von (>) Plastiden;
Promoter: Nukleotid Sequenz, die Transkription initiiert und reguliert; RBS, Ribosomen Binde Stelle: DNA-Sequenz-Element aufwärts des (>) Translation Start Kodons eines (>) codierenden Bereichs, diese vermittelt Ribosomen Bindung und Translations Initiation vom entsprechenden RNA-Transkript; RBS Elemente sind entweder Teil eines (>) 5'-UTRs oder eines (>) Spacers;
Selektions Inhibitor: Chemische Verbindung, die Wachstum und Entwicklung von nicht-transformierten Zellen oder Organellen stärker behindert als von Transformierten;
Transformations Vektor: geklontes DNA-Molekül, das hergestellt wurde um (>) Transformation eines (>) Genoms zu vermitteln;
Transformation: Prozess der zum Einführen, Entfernen oder Verändern von DNA-Sequenzen durch Behandlung von (>) Pflanzen oder Pflanzen Zellen einschließlich der Benutzung von wenigstens einem (>) Transformations Vektor, führt;
Transgen: DNA-Sequenz die aus einem (>) Genom in ein anderes überführt wurde;
uidA: (>) codierender Bereich bakterieller β-Glucuronidase, einem häufig benutzten Reporter-Protein; - KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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1 Vereinfachtes Schema der Rekombinationsereignisse bei konventioneller Plastiden Transformation: Die Integration der Transformationsvektorsequenzen ins Plastom geschieht über zwei homologe Rekombinationsereignisse, die von den homologen Flanken vermittelt werden. Die entsprechende Wildtypregion des Plastoms wird in den Transformationsvektor übertragen. -
2 Vorgeschlagenes Modell der Rekombinationsereignisse bei konventioneller Plastiden Transformation nach unseren Erkenntnissen: die erste homologe Rekombination über die linke oder rechte Flanke führt zu einer vorübergehenden (reversiblen) Insertion des kompletten Transformationsvektors wobei die entsprechenden flankierenden Sequenzen verdoppelt werden. Eine zweite homologe Rekombination über die entsprechende rechte oder linke Flanke führt zu einem Herausfallen der verdoppelten Sequenzen. Die entsprechende Wildtypregion des Plastoms wird in den Transformationsvektor übertragen. -
3 PCR-analyse von Tabak Transformanten, die mit pKCZ transformiert wurden, nach bis zu drei Regenerationszyklen (Referenzbeispiel). Gel A (Zyklus 0), Gel B (Zyklus 1), Gel C (Zyklus II) und Gel D (Zyklus III) zeigen die Produkte, die mit den Primern oSH3 und oSH58, welche spezifisch für den Nachweis der kompletten pKCZ Integration sind, erhalten wurden. - Gel E zeigt dass mit der Primerkombination oFCH60 und oSH58 alle Zyklus-III Linien immer noch die aadA Selektionskassette enthalten, selbst wenn nicht mehr alle das komplette Vektorinsertionsereignis enthalten (siehe Beispiel
1 ). -
4 Vorgeschlagenes Modell der Rekombinationsereignisse bei der Benutzung von modularen Vektoren nach vorliegender Erfindung (Vektor1 und Vektor2 ). Der erste Integrationsschritt ist entweder für Vektor1 oder Vektor2 gezeigt. Der nachfolgende zweite Integrationsschritt in des Plastom welches bereits Vektor2 enthält ist nur für Vektor1 gezeigt (rechts). Der zweite Integrationsschritt in des Plastom welches bereits Vektor1 enthält, geschieht mit Vektor2 in gleicher Weise (nicht gezeigt). Nach der vollständigen Vektor Integration beider Vektoren wird das endgültige transformierte Plastom (unten gezeigt) durch Deletionsereignisse von homologen wiederholten Elementen, erhalten. -
5 Schema, das die homologe Region von Vektor1 (hprl) und von Vektor2 (hpr2) welche die Plastom Integration durch homologe Rekombination leitet. Hpr steht für homologe Plastom Region. Weiterhin ist die Sequenz von Interesse in beiden Vektoren gezeigt (weiße und vertikal gestrichelte Box). Die vertikal gestrichelten Boxen (genannt olr für überlappende Region) stellt ein Sequenzteil besagter ersten Sequenz von Interesse (soi) dar, der homolog zu einem Sequenzteil besagter zweiter Sequenz von Interesse (soi). Diese homologen Sequenzteile oder überlappenden Regionen erlauben Rekombination Vektor2 und Vektor1 im Plastom. Innerhalb der Sequenz von Interesse sind die homologen Sequenzteile vorzugsweise am entgegengesetzten Ende der hpr Sequenz angeordnet. Unten ist das erhaltene Transplastom mit den Integrationssequenz gezeigt. -
6 Schema, das die Benutzung eines weiteren Vektors (Vektor3 ) zusätzlich zu besagtem ersten und besagtem zweiten Vektor der Erfindung zeigt. Vektor3 enthält keine homologe Region für die Plastomintegration. Vektor3 hat zwei homologe Bereiche oder überlappende Regionen (vertikal gestrichelten Boxen). Eine überlappende Region (olr1) ist homolog zu einem homologen Sequenzteil von Vektor1 . Die andere überlappende Region (olr2) ist homolog zu einem homologen Sequenzteil von Vektor2 . olr1 und olr2 sind vorzugsweise nicht identisch. Hpr, homologe Plastom Region; soi Sequenz von Interesse; olr, überlappende Region. -
7 Schema, das die Herstellung von markerfreien transplastomischen Pflanzen zeigt. Vektor2 enthält ein selektierbares Markergen außerhalb der Sequenzeinheit, die aus der homologen Region und der Sequenz von Interesse, besteht. Integration von Vektor1 und Vektor2 führt zu einem Transplastom nach der Einfügung von Vektor1 und2 , das durch vorübergehende Anwendung des geeigneten Antibiotikas selektiert werden kann. Rekombination über die verdoppelten Elemente führt zu einer Entfernung von Sequenzen, die das Markergen enthalten. Hpr, homologe Plastom Region; soi Sequenz von Interesse; olr, überlappende Region. -
8 Konventioneller Plastiden Transformations Vektor pKCZ. aadA, Aminoglykosidadenyl-transferase; INSL, N. tabacum Plastom Sequenz von Bp 131106–132277; INSR, N. tabacum Plastom Sequenz von Bp 132278-133396; APr, ß-Laktamase. -
9 Modularer Plastiden Transformations Vektor pICF742. aadA, kodierende Sequenz für Aminoglykosid-adenyl-transferase; LpsbA, 5'-UTR des N. tabacum psbA Gens; Prpl32, Promotor des N. tabacum rpl32 Gens; INSR, N. tabacum Plastom Sequenz von Bp 132279– 133390; APr, β-Laktamase. -
10 Modularen Plastiden Transformations Vektor pICF743. aadA, kodierende Sequenz für Aminoglykosid-adenyl-transferase; Talpha, alpha Operon Terminator aus E. coli; INSL, N. tabacum Plastom Sequenz von Bp 131106-132277; APr, β-Laktamase. -
11 Primerbindestellen für die PCR-analyse von Tabak Transformanten aus der Kotransformation von pICF742 und pICF743. A, Primerpaar A; B Primerpaar B; C, Primerpaar C. -
12 PCR-analyse von Tabak Transformanten aus der Kotransformation von plCF742 und plCF743. 1, Linie1 ;2 Linie2 ; A, Primerpaar A; B Primerpaar B; C, Primerpaar C; linke drei Spuren, Kontrollen ohne DNA Zugabe. -
13 Southern Blot von Tabak Transformanten aus der Kotransformation von pICF742 und pICF743. A und C, Restriktion mit Bsp1201; B, Restriktion mit AccIII. 1-5 Linie 1-5; M, Karkerspur (von oben: 10 kBp, 8 kBp, 6 kBp, 5 kBp, 4 kBp, 3 kBp, 2,5 kBp, 1,5 kBp, 1 kBp); WT Wildtyp Kontrolle. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungen
- Bei der Benutzung von konventionellen Transformationsvektoren wird eine hohe Anzahl von Regenerationszyklen benötigt um homoplastomische Transformanten zu erzeugen Konventionelle Transformationsvektoren beinhalten üblicherweise eine Integrationssequenz, bestehend aus einem selektierbaren Markergen, einem oder mehreren Genen von Interesse und Regelelemente wie Promotoren, 5'-UTRs, 3'-UTRs oder Abstandhalter, die in Wildtyp Pflanzen nicht vorhanden ist. In dem Vektor ist die Integrationssequenz von zwei Sequenzen flankiert, die homolog zu dem Zielplastom ist und daher die Position der Plastomintegration festlegt. Insertion der Integrationsregion in das Zielplastom wird durch doppelt reziproke homologe Rekombinationsereignisse erreicht. Ein vereinfachtes Modell schlägt vor, dass die Integration über zwei homologe Rekombinationsereignisse, ein Ereignis an jeder Flanke, stattfindet (
1 ). Wie auch immer, der tatsächliche molekulare Prozess ist schwierig zu verfolgen und mag komplexer über Zwischenstufen verlaufen. Experimentelle Daten, die in unserem Labor erhalten wurden, legen nahe, dass ein erstes Rekombinationsereignis, das von einer der beiden Flanken vermittelt wurde, zu einer Integration des vollständigen Transformationsvektors führt, wobei die flankierende Sequenz verdoppelt wird (2 ). Tatsächlich konnte die Integration des ganzen zirkulären Plasmidvektors mittels PCR und Southern Hybridisierungsanalyse gezeigt werden (3 ). Zu einem anderen Zeitpunkt kann ein zweites Rekombinationsereignis entweder eine Umkehrung der ersten Integration hervorrufen. Alternativ führt eine zweite Rekombination zwischen den beiden anderen verdoppelten flankierenden Sequenzen zu einem Ausschneiden von sowohl dem Plasmid Rückgrat als auch der dublizierten Fragmente, wobei die integrierende Sequenz im Plastom verbleibt (2 ). - Bei der Benutzung von konventionellen Plastiden-Transformationsvektoren dauert es mehrere Monate um homoplastomische Plastidentransformanten zu erzeugen, weil bis zu 5 Regenerationszyklen notwendig sind. Eine bestimmte Anzahl von Zellgenerationen ist notwendig um eine heteroplastomische Zelle in eine homoplastomische durch Segregation umzuwandeln. Segregation in die gewünschte Konfiguration von Plastomen wird durch das Anlegen von Selektionsbedingungen erreicht.
- Die Vektoren dieser Erfindung enthalten nicht mehr als eine homologe Region Im Gegensatz zu konventionellen Plastidentransformationsmethoden zeigt diese Erfindung einen Prozess zur Herstellung transplastomischer Pflanzen oder Pflanzenzellen in dem wenigstens zwei unterschiedliche Typen von DNA Molekülen (z.B.
- Transformationsvektoren) vorzugsweise gleichzeitig, in Plastiden eingebracht werden. Eine homologe Region um die Plastomintegration zu steuern ist ausreichend für jeden der besagten Vektoren, vorzugsweise enthält jeder Vektor nicht mehr als eine homologe Region um die Plastomintegration zu steuern. Weiterhin enthält jeder Vektor eine Sequenz von Interesse die vorzugsweise nicht in der Wildtyppflanze vorhanden ist. Die Sequenzen von Interesse besagter Vektoren werden eine Integrationssequenz in den erhaltenen transplastomischen Pflanzen ergeben.
- Die Integrationssequenz kann fremde Gene wie ein Markergen oder andere Sequenzen von Interesse enthalten. Das Markergen kann jedes Gen sein, das Resistenz gegen einen Inhibitor vermittelt, wie ein Antibiotika Resistenzgen wie aphA-6 oder ein Herbizid Resistenzgen wie bar oder ein sichtbares Marken Gen wie GFP.
- Beispiele für Sequenzen von Interesse sind alle Gene die für ein nützliches Protein wie Proinsulin, Interferon, Humanes Serum Albumin, Humane Wachstumsfaktoren, Peptide die als Impfstoff dienen (wie z.B. Impfstoff gegen Hepatitis B), kodieren oder deren Expression vermitteln oder Gene für technische Enzyme. Wie auch immer, die gebildete Integrationssequenz mag auch in der Deletion von Plastidensequenzen bestehen um z.B. spezielle Mutanten zu erzeugen.
- In dem Verfahren dieser Erfindung werden wenigstens zwei DNA Moleküle (z.B. Vektoren) in Plastiden eingebracht, wobei jedes eine homologe Region enthält, die den Integrationsort festlegt. Vorzugsweise besitzt besagtes erstes oder zweites DNA Molekül nicht mehr als eine homologe Region die den Integrationsort festlegt. Noch bevorzugter besitzt weder besagtes erstes noch besagtes zweites DNA Molekül nicht mehr als eine homologe Region die den Integrationsort festlegt. Dies schließt nicht die Benutzung von Elementen in der Sequenz von Interesse aus, die Homologie zu Plastom Sequenzen wie Promotoren oder Regelelemente oder anderen Plastomsequenzen aufweisen. Wenn solche Elemente, die homolog zu Plastidensequenzen sind, in der Sequenz von Interesse verwendet werden, können diese im Prinzip auch als Plastom Integrationssequenzen dienen, was zu unerwünschten Integrationsereignissen führt. Solche unerwünschte Integrationsereignisse können in vielen Fällen unproblematisch sein, z.B. wenn sie nicht zu stabilen Transformanten führen oder nicht zu Transformanten die mit dem verwendeten Selektionsmarker selektiert werden können. Weiterhin können unerwüschte Transformanten durch molekulare Analyse z.B. der Integrationssequenz gefunden werden.
- Elemente, die homolog zu Plastidensequenzen sind vorzugsweise deutlich kürzer als die homologen Regionen für die Plastomintegration. Diese Maßnahme erzielt normalerweise eine deutlich niedrigere Rekombinationsanzahl für besagte homologe Elemente als für besagte homologe Regionen. Alternativ werden Elemente, die homolog zu Plastidensequenzen sind vorzugsweise von Plastomsequenzen genommen die weit von der gewünschten Integrationsstelle des DNA Moleküls entfernt ist um unerwünschte Rekombinationsereignisse zu verhindern.
- Die mindestens zwei unterschiedlichen Vektor Moleküle werden entweder gleichzeitig oder in zwei oder mehreren unterschiedlichen Transformationsschritten eingebracht. Gleichzeitige Transformation von mindestens zwei Typen von Molekülen wird Kotransformation genannt. Nach der Kotransformation von mindestens zwei Vektormolekülen erscheinen die ersten Regenerate, die Plastiden mit der gewünschten Plastommodifikation enthalten, nach ca. 3 Wochen von Kultivation unter geeigneten Selektions und Anzuchtbedingungen, abhängig von der angewendeten Transformationsmethode. Die Methode der Kotransformation kann bei jeder Transformationsmethode angewendet werden, die geeignet ist Plastidentransformanten zu erzeugen. Beispiele für solche geeigneten Transformationsmethoden sind biolistische Transformation, PEG-vermittelte Transformation, andere Transformationsmethoden, die chemische Substanzen benutzen oder elektrisches Feld vermittelte Transformation von Nukleinsäuren.
- Alternativ können die mindestens zwei Vektormoleküle in separaten Transformationsschritten verwendet werden. Aufeinanderfolgende Transformation in mindestens zwei Transformationsschritten führt zum selben Integrationsergebnis wie bei der Kotransformation beobachtet.
- Wenn ein dritter Vektor zusätzlich zu besagtem ersten oder zweitem DNA Molekül benutzt wird, muss der dritte Vektor keine homologen Sequenzen aus dem Zielplastom enthalten, solange die Sequenzen von Interesse der Vektoren eine überlappende Region enthalten die für eine Rekombination ausreichend ist. Das trifft auch zu wenn mehr als drei Vektoren benutzt werden.
- Fragmente des Markergens können sich auf verschiedenen Vektoren befinden, wobei das Markergen durch den Rekombinationsprozess zusammengesetzt wird.
- Die Vektoren dieser Erfindung erlauben die Herstellung von transplastomischen Pflanzen in sehr kurzer Zeit
- Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass es mit der hier beschriebenen Methode möglich ist homoplastomische Plastidentransformanten nach nur zwei Regenerationszyklen zu erzeugen. Vorzugsweise ist sogar ein Regenerationszyklus ausreichend. In viele Fällen waren die Regenerate, die nach der Transformation von Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen erhalten wurden, homoplastomisch ohne dass ein Regenerationszyklus durchgeführt wurde. Im Gegensatz zu konventionellen Plastidentransformationszyklen war es möglich homoplastomische Pflanzen nach der sehr kurzen Zeit von nur wenigen Wochen zu erhalten. Daher bietet die hier beschriebene Erfindung eine enorme Beschleunigung des Prozesses und eine drastische Reduzierung der für Gewebekultur notwendigen Arbeit.
- Homoplastomische Transformanten enthalten keine Wildtypplastome. Die Anwesenheit von Wildtyp Plastomen kann durch Methoden wie Southern Hydridisierung oder PCR Analyse überwacht werden. In transplastomischen Pflanzenmaterial, welches aus primären Regeneraten gewonnen wurde die nach der Transformation von Pflanzenmaterial oder Pflanzenzellen erschienen, wurde routinemäßig eine Southern Analyse durchgeführt um rekombinante Plastome zu identifizieren und verbleibende Wildtyp Plastome nachzuweisen. 40 % des untersuchten Materials dieser primären Regenerate enthielt keinerlei verbleibende Wildtyp Plastome. Wildtyp Plastome konnten aus den anderen Regeneraten in einem einzeln Kultivierungsschritt entfernt werden, während bis zu 5 Kultivierungsschritte bei konventionellen Transformationsvektoren benötigt wurden.
- Ein hypothetischer Mechanismus für die Einführung von fremden Sequenzen nach dieser Erfindung ist in
4 dargestellt. Nach diesem Modell rekombiniert einer der beiden Vektor Moleküle welche eine homologe Region enthalten mit der entsprechenden Plastomsequenz. Das homologe Rekombinationsereignis führt zur Integration des kompletten Vektors inklusive des Plasmid Rückgrats. Es führt auch zu einer Verdopplung der homologen Region. Dieser Prozess ist reversibel und kann in einem Ausschneiden der rekombinaten Sequenz durch homologe Rekombination resultieren solange der Prozess nicht durch ein anderes Rekombinationsereignis stabilisiert ist. Wenn die Integrationssequenz einen selektierbaren Marker enthält, der exprimiert werden kann, tendiert der Vektor dazu integriert zu bleiben solange Selektionsdruck ausgeübt wird. In der Abwesenheit von Selektionsdruck, ist das Plastom mit einem integrierten Vektor hochgradig instabil. Ein zweites Rekombinationsereignis kann allerdings zur Integration von mindestens einem zweitem Molekül führen. Wenn das andere Molekül eine andere homologe Region enthält kann eine Rekombination mit dem entsprechenden Bereich des Plastoms erfolgen. Alternativ ist es auch möglich, dass die Rekombination durch eine andere wiederholte Sequenz wie das Vektorrückgrat oder den überlappenden Bereich der Moleküle vermittelt wird. Der zweite Rekombinationsschritt kann zwischen dem freien ersten Vektor und dem integrierten zweiten Vektor stattfinden (gezeigt in4 ) oder zwischen dem freien zweiten Vektor und dem integrierten ersten Vektor (in4 nicht gezeigt) oder zwischen dem integrierten ersten Vektor und dem integrierten zweiten Vektor die sich auf unterschiedlichen Plastommolekülen befinden (in4 nicht gezeigt). Vektor Moleküle die keine homologe Plastidenregion enthalten können nur mit anderen wiederholten Sequenzen rekombinieren. In jedem Fall wird die Integration des kompletten zweiten Vektors erfolgen. In Fällen in denen mehr als zwei Vektor Moleküle benutzt werden, werden alle Moleküle über eine der homologen Regionen integrieren. Nach der Integration von den verschiedenen Molekülen ins Plastom ist eine Vielzahl von sekundären intramolekularen Rekombinationen zwischen irgendwelchen der wiederholten Bereiche, möglich. Als Folge davon werden alle wiederholten Bereiche eliminiert. Das Endergebnis dieser verschiedenen Rekombinationsereignisse wird eine zusammenhängende Rekombinationsregion hergestellt, die als Integrationssequenz bezeichnet wird. - Die Vektoren dieser Erfindung können in einem kombinatorischen Ansatz eingesetzt werden
- Expression in Plastiden ist für einen breiten Bereich von verschiedenen Anwendungen die von veränderter Nahrungszusammensetzung bis zu Hochexpression von Pharmazeutika in Pflanzen reicht, einsetzbar. Für diesen Zweck ist es notwendig ein Set von austauschbaren Promotoren und Regelelementen zu erhalten, die sich in Stärke und Expressionsmuster unterscheiden. Dies erlaubt die Herstellung von Expressionsvektoren für verschiedenste Zwecke (schwache, starke, konstitutive oder regulierbare Expression usw.). Die Elemente sollten austauschbar sein um den Expressionsgrad zu ändern. In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Promotoren, 5'-UTRs und 3'-UTRs von verschiedenen Genen zu benutzen weil dies interne Rekombinationen in denen das eingefügte Gen mit endogenen Genen über identische 5'- und 3'-UTRs ausgetauscht wird, verhindert. Auf der anderen Seite wechselwirken 5'- und 3'-UTR manchmal miteinander und legen zusammen die Translationsaktivität fest. Es ist daher nicht immer möglich den Effekt einer bestimmten Kombination abzuschätzen. Modulare Vektoren dieser Erfindung, die nur das 5'- oder 3'-Regelelement beinhalten erlauben einen einfachen und schnellen Weg verschiedene Regelelemente miteinander zu kombinieren um die gewünschte Expressionskassette in der Integrationssequenz zu erzeugen. Vektoren mit verschiedenen Elementen können in Bibliotheken bevorratet werden und nach Gutdünken kombiniert werden. Weiterhin kann, wenn die optimale Kombination von verschiedenen Elementen nicht bekannt ist, eine Mischung von verschiedenen Regelelementen auf verschiedenen Vektoren für die Transformation benutzt werden. Die Expressionskassette mit den gewünschten Eigenschaften ist dann durch Selektion von Transformanten mit den gewünschten Eigenschaften erhalten werden, bei Bedarf gefolgt von einer molekularen Analyse.
- Die Vektoren dieser Erfindung vermeiden überflüssige Klonierungsarbeit
- Konventionelle Plastiden Transformationsvektoren beinhalten üblicherweise ein selektierbares Markergen, das für die Selektion der Transformanten benötigt wird, ein oder mehrere Gene von Interesse und Regelelemente wie Promotoren, 5'-UTRs, 3'-UTRs oder Abstandselemente. Es bedarf eines beträchtlichen Aufwands um diese hochkomplexen Plasmide die viele verschiedene Elemente beinhalten, herzustellen. Wie auch immer, es werden in verschiedenen Transformationsvektoren viele identische Elemente benutzt. Mit der Methode dieser Erfindung ist es möglich einen Vektor herzustellen, der diese identischen Elemente, wie eine homologe Region, ein Selektionsmarkergen und Regelelemente in einem Molekül enthält. Der mindestens zweite andere Transformationsvektor beinhaltet die verschiedenen Sequenzen von Interesse, die ins Plastom eingefügt werden sollen. Die Kombination des ersten Vektormoleküls mit einem anderen geigneten Vektors, der die gewünschten Sequenzen enthält vermindert die Komplexität der Plasmide und daher den Aufwand diese Moleküle herzustellen.
- Die Vektoren dieser Erfindung sind kleiner als konventionelle Plastiden Transformationsvektoren und erlauben daher die Insertion von mehr Sequenzen von Interesse
- Die Herstellung von Transformationsvektoren ist häufig durch Größenbeschränkungen eingeschränkt. Konventionelle Plastiden Transformationsvektoren beinhalten üblicherweise zwei homologe Regionen, ein selektierbares Markergen und Regelelemente. Daher kann nur eine beschränkte Anzahl von zusätzlichen Sequenzen eingefügt werden. Es ist allerdings vorteilhaft komplexe metabolische Stoffwechselwege in Plastiden zu entwerfen, was von der Expression von mehreren verschiedenen Enzymen abhängt. Da die Vektoren dieser Erfindung weniger obligatorische Sequenzen beinhalten als konventionelle Vektoren, ist es möglich längere Sequenzen von Interesse einzufügen. Zusätzlich können mehr als zwei Transformationsvektoren mit überlappenden Regionen verwendet werden um noch größere Integrationssequenzen einzufügen, die in den Plastiden zusammengesetzt werden.
- Die Vektoren dieser Erfindung vermeiden Probleme die von toxischen Effekten mancher Sequenzen in den zur Klonierung benutzten Bakterien herrühren
- Gentechnik kann das Potential von Pflanzen als selbstvermehrende Fabriken für die Herstellung einer großen Anzahl von organischen Substanzen nutzen. Es wurde gezeigt, dass ein ökonomischer und umweltfreundlicher Herstellungsweg von Substanzen wie Enzyme, Diagnostika oder Therapeutika in Pflanzen möglich ist.
- In manchen Fällen haben allerdings die in Pflanzen einzubringenden Gene toxische Effekte auf die Bakterien, die zur Klonierung verwendet werden. In diesen Fällen ist die Herstellung von Transformationsvektoren eingeschränkt. Ein Beispiel für eine Sequenz mit toxischen Effekten auf Bakterien ist das Gen HbsAg das für das Oberflächenantigen des Hepatitis B Virus kodiert. Die Expression dieses Gens in Pflanzenplastiden wäre vorteilhaft weil es eine Quelle für einen Hepatitis Impfstoff darstellen würde. Die Klonierung des vollständigen Gens inklusive der Regelelemente die in konventionellen Transformationsvektoren benutzt werden ist eingeschränkt, da plastidäre Regelelemente auch in Bakterien aktiv sind. Bei der Benutzung von Vektoren dieser Erfindung ist es möglich die die vollständige Expressionskassette eines Gens wie HbsAg auf zwei Moleküle aufzuspalten so dass keiner der Vektoren alleine eine exprimierbare Kassette enthält. Durch die Benutzung dieses Ansatzes wird der beschränkende Effekt von Genen die toxisch auf Bakterien wirken, überwunden.
- Die Vektoren dieser Erfindung erlauben die Herstellung von Markerfreien Pflanzen
- Eine Methode um Plastidentransformanten zu erhalten die kein Resistenzmarkergen enthalten ist sehr wünschenswert um die unerwünschte Verbreitung des Markergens in die Umwelt zu vermeiden. Konventionelle Plastiden Transformationsvektoren beinhalten üblicherweise ein selektierbares Markergen, das für die Selektion der Transformanten benötigt wird. Das Resistenzmarkergen befindet sich in der Integrationssequenz des Transformationsvektors und führt zu einer stabilen Integration des Resistenzmarkergens in der fertigen Pflanze.
- Durch die Verwendung des Prozesses und der Vektoren, die in dieser Erfindung beschrieben werden ist es möglich ein solches Resistenzmarkergen außerhalb der Sequenzeinheit bestehend aus der homologen Region und der Sequenz von Interesse zu platzieren. Nach der Transformation erfolgt eine Integration des kompletten Transformationsvektors (
2 ), was zu einer vorübergehenden Einfügung des Selektionsmarkers ins Plastom führt. Das Rekombinationsereignis führt zu einer Verdopplung der homologen Region. Transformierte Zellen können in diesem Zeitraum auf einem Medium das den geeigneten Inhibitor enthält selektiert werden. Sobald das Pflanzenmaterial auf ein Inhibitor-freies Medium übertragen wird, verschwindet der Selektionsdruck um die komplette Vektorintegration beizubehalten. Weitere Rekombinationsereignisse (wie in4 gezeigt), die durch die vorher erzeugten verdoppelten homologen Regionen vermittelt werden, führen zu einer Entfernung des Selektionsmarkergens. Folglich trägt die fertige Pflanze nicht mehr das Resistenzmarkergen, welches für die Selektion der Transformanten benutzt wurde. - Das Resistenzmarkergen kann auch in zwei oder mehrere überlappende Fragmente geteilt werden, wobei sich jedes auf einem anderen Vektor befindet, wodurch die Resistenz nur vermittelt wird wenn die Fragmente zu dem kompletten exprimierbaren Markergen rekombinieren.
- Bevorzugte Ausführungen der Erfindung werden nun genauer beschrieben.
- Ausführung 1: Kotransformation von zwei Vektoren
- Plastiden werden gleichzeitig mit besagtem ersten und besagtem zweiten DNA Molekül, hier als modulare Vektoren bezeichnet (
5 ) transformiert. Vektor1 (besagtes erstes DNA Molekül) enthält eine Region, die homolog zu einer Plastiden Region (besagte erste homologe Region) ist. Die Integration der Sequenzen von Interesse sollte abwärts dieser Plastom Region erfolgen. Die homologe Region hat typischerweise eine Länge von 500 bis 1000 Bp. Wenn gewünscht, können auch kürzere oder längere Sequenzen verwendet werden. Auf Vektor1 ist die erste Sequenz von Interesse abwärts dieser homologen Region angeordnet. Der aufwärtige Teil der Integrationssequenz ist in der ersten Sequenz von Interesse abwärts der homologen Region enthalten. - Vektor
2 (besagtes zweites DNA Molekül) enthält eine Region die homolog zu einer Plastomregion (besagte zweite homologe Region) ist. Die Integration der Sequenzen von Interesse sollte aufwärts dieser Plastom Region erfolgen. Die homologe Region hat typischerweise auch eine Länge von 500 bis 1000 Bp. Auf Vektor2 ist die zweite Sequenz von Interesse aufwärts dieser homologen Region angeordnet. Der abwärtige Teil der Integrationssequenz ist in der zweiten Sequenz von Interesse aufwärts der homologen Region enthalten. - In dieser bevorzugten Ausführung sind die beiden homologen Regionen der beiden Vektoren nebeneinander ohne dazwischenliegende Sequenzen auf dem Plastom vorhanden. Ein Sequenzteil der abwärtigen Region besagter ersten Sequenz von Interesse auf Vektor
1 ist homolog zu einem Sequenzteil der aufwärtigen Region der zweiten Sequenz von Interesse auf Vektor2 . Diese homologen Sequenzteile werden auch als überlappende Region bezeichnet. Typischerweise hat dieses homologe Sequenzteil eine Länge von 500 bis 1000 Bp. Nach den Rekombinationsereignissen, die in dieser Ertindung beschrieben wurden, ergibt die Kotransformation dieser beiden Vektoren eine kontinuierliche Integrationssequenz, die zwischen den beiden Plastom Regionen, die als homologe Regionen verwendet wurden, eingebaut ist. Typischerweise enthält jeder der Vektoren nur einen Teil der Integrationssequenz. - Es wurde gezeigt, dass Rekombinationen auch mit längeren oder kürzeren homologen Regionen stattfinden, aber eine Länge von 500 bis 1000 Bp ist ausreichend für eine effektive Rekombination und kann einfach durch Standard PCR Techniken hergestellt werden.
- Das Markergen für die Selektion der Transformanten kann in zwei Fragmenten auf den beiden Vektoren vorhanden sein, d.h. ein Fragment auf jedem Vektor. Das Markergen kann auf verschiedene Weisen in zwei Fragmente aufgespalten werden. Nicht einschränkende Beispiele für eine solche Aufspaltung sind:
- a) Der Promoter und
5'-UTR sind auf Vektor
1 enthalten. Die kodierende Sequenz ist in der überlappenden Region von Vektor1 und Vektor2 enthalten. Der 3'-UTR ist auf Vektor2 enthalten. - b) Der Promoter, 5'-UTR und der 5'-Teil der kodierenden Sequenz
sind auf Vektor
1 enthalten. Der mittlere Teil der kodierenden Sequenz ist in der überlappenden Region von Vektor1 und Vektor2 enthalten. Der 3'-Teil der kodierenden Sequenz und 3'-UTR sind auf Vektor2 enthalten. - Wenn die homologen Regionen auf den Vektoren so gewählt sind, dass die Integrationssequenz, die ins Plastom eingebaut wird von einem endogenen Promoter transkribiert wird, dann ist es nicht notwendig einen Promoter vor den Markergenen einzuschließen. Neben dem Markergen können zusätzliche Gene von Interesse in jeder der Sequenzen von Interesse auf Vektor
1 oder Vektor2 oder beiden enthalten sein. - Ausführung 2: Kotransformation von fragmentierten Genen auf zwei Vektoren
- Da Plastiden und Bakterien ähnliche Expressionssysteme besitzen, ist es manchmal schwierig oder sogar unmöglich Plastidentransformationsvektoren in E. coli zu klonieren, wenn Gene enthalten sind deren Produkte toxisch für E. coli sind. Dieses Problem kann gelöst werden indem solche Gene in 2 oder mehrere Fragmente gespalten werden wie es für das Markergen in Ausführung 1 beschrieben wurde. Auf jedem Vektor ist das toxische Gen als unvollständiges Gen oder nicht toxisches Fragment enthalten. Plastiden werden gleichzeitig mit zwei modularen Vektoren transformiert, wie in Ausführung
1 beschrieben, wobei sich das vollständige funktionelle Gen von Interesse in den Plastiden bildet. - Ausführung 3: Kotransformation von drei Vektoren
- Für manche Zwecke ist es vorteilhaft die Integrationssequenz die zur stabilen Plastidentransformation benötigt wird auf drei Vektoren zu verteilen (
6 ). Nicht einschränkende Beispiele sind: Einfügen einer sehr langen Integrationssequenz (z.B. Gencluster), Serienherstellung von Transformationsvektoren usw. - Vektor
1 enthält eine erste Region die homolog zu einer Plastomregion ist und eine erste Sequenz von Interesse abwärts davon. Die Integration der Integrationssequenz sollte abwärts dieser Plastom Region erfolgen. Abwärts dieser ersten homologen Region ist der aufwärtige Teil der Integrationssequenz in der ersten Sequenz von Interesse angeordnet. - Vektor
2 enthält eine zweite Region die homolog zu einer Plastomregion ist und eine zweite Sequenz von Interesse. Die Integration der Integrationssequenz sollte aufwärts dieser Plastom Region erfolgen. Aufwärts dieser homologen Region ist der abwärtige Teil der Integrationssequenz in der zweiten Sequenz von Interesse angeordnet. Wie in Ausführung1 beschrieben sind die homologen Sequenzen typischerweise 500 bis 1000 Bp lang, aber nicht auf diese Länge beschränkt. - Vektor
3 enthält eine dritte Sequenz von Interesse deren aufwärtiger Teil homolog zur Sequenz von Interesse von Vektor1 ist und deren abwärtiger Teil homolog zur Sequenz von Interesse von Vektor2 ist. Vektor3 kann oder kann nicht die komplette Integrationssequenz enthalten, die ins Plastom eingebaut werden soll. - Ausführung 4: markerfreie transplastomische Pflanzen
- Wenn das Markergen außerhalb Region, die für die Integration vorgesehen ist, angeordnet ist, wird das Markergen in den vollständigen Vektor Integrationszwischenstufen vorhanden sein. (
7 ). Wenn der Selektionsdruck entfernt wird, wird das Markergen zusammen mit der Vektorsequenz entfernt. Die homologe Plastidensequenz und die Sequenzen von Interesse sind wie in Ausführung 1 beschrieben, angeordnet. Im Gegensatz zu Ausführung 1 ist das Markergen nicht in der Sequenz von Interesse enthalten. Stattdessen ist es anderswo auf Vektor1 oder Vektor2 enthalten. Vorzugsweise ist das Markergen von der Einheit bestehend aus der homologen Region und der Sequenz von Interesse durch Vektor Sequenz getrennt. Vorzugsweise enthalten Vektor1 und Vektor2 jeweils ein Markergen in dieser Weise wobei diese Markergene unterschiedlich sind z.B. aadA und aphA6. Die Selektion wird dann mit einer Kombination der beiden entsprechenden Antibiotikas durchgeführt z.B. 500 mg/l Spektinomycin und 25 mg/l Kanamycin. Alternativ kann ein Fragment des Markergens auf Vektor1 enthalten sein und ein weiteres Fragment des Markergens auf Vektor2 , wobei sich beide Fragmente außerhalb der oben definierten Einheit befinden. Es ist eine Vorraussetzung dass dann beide Fragmente einen homologen Teil (überlappende Region) teilen, was die Rekombination beider Fragmente zu einem kompletten funktionsfähigen Markergen nach der Einfügung der beiden Vektoren ins Plastom, erlaubt. Da nur ein Teil der möglichen Rekombinationen funktionsfähigen Marker liefert, erhält der Selektionsdruck diejenigen Zwischenprodukte, die besagten funktionsfähigen Marker enthalten. Wenn der Selektionsdruck entfernt wird, wird das Markergen zusammen mit den verbleibenden Vektorsequenzen durch Rekombination der wiederholten Vektorsequenzen entfernt. - BEISPIELE
- In dieser Erfindung benutzte molekularbiologische Methoden sind hinlänglich bekannt und z.B. bei Sambrook et al. (1989) Molecular cloning und bei Ausubel et al. (1999) Short protocols in Molecular Biology beschrieben.
- Beispiel 1: PCR-analyse der kompletten Vektor Integration (über eine Flanke) in das Plastid Genom.
- Plastidentransformationsvektor pKCZ
- PKCZ ist ein konventioneller Plastidentransformationsvektor in dem der Selektionsmarker zwischen die beiden Flanken, die für die homologe Rekombination benutzt werden, kloniert ist. Der Vektor wurde entworfen um eine neutrale Insertion zwischen trnR und trnN in dem umgekehrten Wiederholungsbereich des Tabak Plastiden Genoms einzuführen (Zou, 2001). PKCZ umfasst zwei flankierende Sequenzen für die homologe Rekombination (entsprechend der Nicotiana tabacum Plastom Sequenz 131106-132277 und 132278-133396, in der GenBank Nr. Z00044) und eine aadA Plastiden Expressionskassette unter der Kontrolle des 16S rRNA Promoters (Koop et al., 1996). Eine schematische Zeichnung des Plasmid Konstrukts ist in
8 gezeigt. - Herstellung von primären Transformanten und anschließende Selektion auf homoplastomische Linien
- Partikel-Kanonen vermittelte Plastiden Transformation und nachfolgende Selektion wurden wie bei Mühlbauer et al., 2002 beschrieben, durchgeführt. Die Selektion der Transformanten basierte auf der Resistenz gegen die Antibiotika Spektinomycin/Streptomycin, die durch das aadA Genprodukt vermittelt wurde. Um das transformierte Plastidengenom zu vermehren und Wildtyp Genome zu eliminieren wurden die primären Transformanten (Zyklus 0) mehreren Runden von Regeneration (ausgehend von kleinen Blattstückchen) auf Selektionsmedium, das Spektinomycin enthielt, unterworfen (hier als Zyklus-I, Zyklus-II usw. bezeichnet).
- Analyse der primären Transformanten mittels PCR
- Platiden Transformanten (Zyklus-0) wurden mittels PCR identifiziert, wobei Gesamt-DNA die mit dem Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert wurde, verwendet wurde. Um die Anwesenheit von aadA nachzuweisen wurden die Primer oSH81 (5'-CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC-3') und oFCH60 (5'-CACTACATTTCGCTCATCGCC-3') eingesetzt. Das PCR Programm war wie folgt: 3 Min. bei 94°C, 1 Zyklus; 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 55°C, 2 Min. bei 72°C, 30 Zyklen; letzte Verlängerung bei 72 °C für 10 Min. Dieses Ergebnis zeigte, dass von 54 untersuchten Linien (6 beschossene Blätter) 48 das erwartete Amplifikationsprodukt von 504 Bp ergaben. Um die korrekte Integration der aadA Kassette im Tabak Plastom zu überprüfen wurden die Primer oSH58 (5'-TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3') und oFCH60 (5'-CACTACATTTCGCTCATCGCC-3') eingesetzt. Primer oSH58 befindet sich außerhalb (abwärts) der rechten Flanke von pKCZ im Tabak Plastome und kann in Kombination mit oFCH60 nur dann das erwartete Produkt von 2106 Bp ergeben, wenn die aadA Expressions Kassette zwischen trnR und trnN in der umgedrehten Wiederholung integriert ist. Das PCR Programm war wie folgt: 5 Min. bei 94°C, 1 Zyklus; 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 55°C, 3,5 Min. bei 72°C, 35 Zyklen; letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 Min. Alle 48 in der aadA PCR positiven Linien zeigten das erwartete rechte Flanke – aadA Produkt von 2106 Bp. Zehn der Zyklus-0 Transformanten (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:4, 2:5, 2:6 und 2:7) wurden zur weiteren Analyse ausgewählt.
- PCR Analyse der Transformanten die vollständig intearierten Vektor enthalten
- Normalerweise erfolgt die Bildung von stabilen Plastiden Transformanten über zwei gleichzeitige Rekombinationsereignisse zwischen der linken und rechten Flanke des transformierenden Moleküls und des Plastoms (wie in
1 dargestellt). Ein alternativer Mechanismus ist in2 dargestellt. Hier findet die komplette Integration des Vektors zunächst über die Rekombination von nur einer Flanke (entweder links oder rechts) mit dem Plastom statt, woraus ein hypothetisches instabiles Zwischenprodukt entsteht. Weitere zusätzliche Rekombinationsereignisse können dann zwischen den verdoppelten Flanken in diesem Molekül stattfinden um entweder zur Wildtyp Situation oder zur stabil integrierten aadA-Kassette zu führen. Um diese Möglichkeit zu testen wurde eine PCR mit den Primern oSH3 (5'-GGCATCAGAGCAGATTG-3') und oSH58 (5'- TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3')durchgeführt. Rimer oSH3 befindet sich im Rückgrat des Vektors pKCZ (pUC18) und Primer oSH58 befindet sich außerhalb (abwärts) der rechten Flanke von pKCZ im Tabak Plastom. Ein Produkt von 2638 Bp kann nur dann mit diesen beiden Primern erhalten werden, wenn die Integration des kompletten pKCZ wie in2 dargestellt, stattgefunden hat. Kein PCR Produkt der erwarteten Größe wird vom Wildtyp Plastom Fragment (umfasst die linke und rechte Flanke) erhalten werden da die Bindestelle für oSH3 nicht vorkommt. Das PCR Programm war wie folgt: 5 Min. bei 94°C, 1 Zyklus; 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 55°C, 3,5 Min. bei 72°C, 35 Zyklen; letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 Min. Neun der 10 Zyklus-0 Transformanten zeigten ein PCR Produkt von 2,6 kBp, was mit der kompletten Integration von pKCZ ins Plastiden Genom in diesen Linien, übereinstimmt (3A ). Kein Produkt mit der richtigen Größe wurde in der Wildtyp Kontrolle oder in der Probe 1:1 erhalten. Da die komplette Integration von pKCZ in der Bildung eines instabilen Zwischenprodukts resultiert, ist zu erwarten dass im Laufe der Zeit zusätzliche Rekombinationsereignisse zwischen den verdoppelten Flanken dieses Moleküls entweder zur Wildtyp Situation oder zur stabil eingefügten aadA Kassette führen werden. Da solche DNA Proben von dem Zyklus-I und Zyklus-II Pflanzenmaterial hergestellt wurde, wurde es mittels PCR mit den Primern oSH3 und oSH58 untersucht. Wenn das in2 dargestellte Model richtig ist, sollte die Wahrscheinlichkeit die 2638 Bp Bande mit den Primern oSH3 und oSH58 zu amplifizieren mit jedem Regenerations Zyklus unter Selektion abnehmen. Die Ergebnisse legen nahe, dass dies tatsächlich der Fall ist, da nur 5 der 10 untersuchten Zyklus-I Linien ein starkes PCR Produkt mit der richtigen Größe ergaben (3B ). Weiterhin war in Zyklus-II die Anzahl der Linien die klare Amplifikation der erwarteten 2638 Bp Bande zeigten weiter reduziert. - Das in
2 dargestellte Model sagt ebfalls vorher, dass alle Zyklus-II Linien, die negativ in Bezug auf komplette Vektor Integration waren, weiterhin ein PCR Signal für die stabil integrierte aadA Kassette zeigen sollten, aufgrund der vorher beschriebenen molekularen Umlagerungen. Um die Integration der aadA Kassette ins Tabak Plastom zu zeigen, wurden die Primen oSH58 (5'-TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3') und oFCH60 (5'-CACTACATTTCGCTCATCGCC-3') benutzt. Das PCR Programm war wie folgt: 5 Min. bei 94°C, 1 Zyklus; 45 Sek. bei 94°C, 45 Sek. bei 55°C, 3,5 Min. bei 72°C, 35 Zyklen; letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 Min. Alle10 der Zyklus-II Transformanten zeigten das erwartete rechte Flanke aadA Produkt von 2106 Bp (3D ), was mit dem in2 dargestellten Szenario übereinstimmt. - Beispiel 2: Herstellung von überlappenden modularen Vektoren
- Der modulare Vektor pICF742 (
9 ) besteht aus der rechten flankierenden Region homolog zum Tabak Plastom, dem rpl32 Promoter aus Tabak, dem Tabak psbA-5'-UTR und dem aadA Marker Gen. - Die rechte flankierende Region wurde aus Tabak Plastiden DNA (Bp 132279 bis Bp 133390) mit den modifizierenden Primern
5' -TGGAGCTCGAATTGCCGCGAGCAAAGATATTAATG -3' und 5'-TACGAATTCAAGAGAAGGTCACGGCGAGAC-3', die eine Sacl Erkennungssequenz am 5'-Ende und eine EcoRl Erkennungssequenz am 3'-Ende einfügen, amplifiziert. Das PCR Produkt wurde gereinigt und mit Sacl und EcoRi geschnitten und in das Plasmid pUC18 ligiert, das mit denselben Enzymen geschnitten wurde. Der rp132-Promotor wurde aus Tabak Plastiden DNA (Bp 113917 bis Bp 114055) mit den modifizierenden Primern5' -GACCCTGCAGGCAAAAAATCTCAAATAGCC -3' und 5'- CGGGATCCGATTTTTCTTTAGACTTCGG-3', die eine Pstl Erkennungssequenz am 5'-Ende und eine BamHl Erkennungssequenz am 3'-Ende einfügen, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit den modifizierenden Primern5' - CGGGATCCGATTTTTCTTTAGACTTCGG-3' and 5'- CGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCCGTCGACCCTGCAGGCAAAAAATCTC-3' reamplifiziert um einen neuen Multiklonierungsbereich der eine Sacl Schnittstelle enthält am 5'-Ende einzufügen. Das resultierende PCR-Product wurde mit BamHl und Sacl geschnitten und in den ebenso geschnittenen Vektor pUC18 der die rechte flankierende Region enthält, ligiert. Die psbA-5'-UTR wurde aus Tabak Plastiden DNA (komplementär zu Bp 1598 bis Bp 1680 des N. tabacum Plastoms) mit den modifizierenden Primern 5'-CGGGATCCAAAAAGCCTTCCATTTTCTATTT-3' and 5'-TTGCAGCCATGGTAAAATCTTGGTTTATT-3', die eine BamHI Erkennungssequenz am 5'-Ende und eine Ncol Erkennungssequenz am 3'-Ende einfügen, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Ncol und BamHI geschnitten. Die aadA sequenz aus E. coli wurde von Plasmid pFaadAll (Koop et al., 1996) mit den modifizierenden Primern 5'-TGAATTCCCATGGCTCGTGAAGCGG-3' und 5'-GGTGATGATGATCCTTGCCAACTACCTTAGTGATCTC -3', die eine Ncol Erkennungssequenz am 5'-Ende einfügen, amplifiziert. Das PCR Produkt wurde mit den Primern5' - TGAATTCCCATGGCTCGTGAAGCGG-3' und 5'-GCTCTAGATTAGTGATGATGGTGATGATGATCCTTGCC-3' reamplifiziert, um einen His-Tag und eine Xbal Erkennungssequenz am 3'-Ende einzufügen. Das PCR Produkt wurde mit Ncol und Xbal geschnitten. Der pUC18-Vektor, der die rechte flankierende Region, and den rpl32-Promotor enthielt, wurde mit BamHI und Xbal geschnitten und mit dem geschnittenen psbA-5'-UTR und dem geschnittenen aadA ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit Xbal und Ndel geschnitten um den restlichen pUC18 Multiklonierungsbereich zu entfernen. Das geschnittene Plasmid wurde auf einem Agarose-Gel gereinigt. Die Bande bei 4600 Bp wurde ausgeschnitten, gereinigt und die Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Das Plasmid wurde dann religiert und ergab pICF742. Der modulare Vektor pICF743 (10 ) besteht aus der linken flankierenden Region, die homolog zum Tabak Plastom ist, dem alpha-Operon Terminator aus E. coli und dem aadA Marken Gen. - Der Multiklonierungsbereich von pUC18 zwischen Pael und Sapl wurde entfernt und durch einen neuen Multiklonierungsbereich der (von 5' nach 3') BamHI, Kpnl, Xbal und Ncol enthält, ersetzt. Die linke flankierende Region wurde aus Tabak Plastiden DNA (Bp 131106 bis Bp 132277 des N. tabacum Plastoms) mit den modifizierenden Primern 5'-GATGGATCCTTGCTGTTGCATCGAAAGAG -3' und 5'-CACTGGTACCCGGGAATTGTGACCTCTCGGGAGAATC -3', die eine BamHI Erkennungssequenz am 5'-Ende und eine Kpnl Erkennungssequenz am 3'-Ende einfügen, amplifiziert. Das PCR Produkt wurde gereinigt und mit BamHI und Kpnl geschnitten und in das Plasmid pUC18 mit dem neuen Multiklonierungsbereich ligiert, das mit denselben Enzymen geschnitten wurde. Das resultierende Plasmid wurde mit Kpnl und Xbal geschnitten. Der geschnittene Vektor wurde mit dem einzelsträngigen Oligonukleotid
5' - GATGTCTAGAAGCAACGTAAAAAAACCCGCCCCGGCGGGTTTTTTTATACCCGTAGTATCC - CCAGCGGCCGCGGTAC-3' das für den alpha-Operon Terminator aus E. coli kodiert, ligiert. Der komplementäre Strang wurde mit Taq-Polymerase aufgefüllt, mit Ncol und Xbal gescnitten und religiert. Der resultierende Vektor wurde mit Ncol und Xbal geschnitten und mit dem aadA PCR-Produkt von pICF742 ligiert woraus Vektor pICF743 resultierte.
- 12,5 μg von Vektor pICF742 und 12,5 μg von Vektor pICF743 wurden gemischt, auf Gold-Partikel aufgebracht und in N. tabacum Plastiden mittels Teilchen Beschuss transformiert wie bei Mühlbauer et al., 2002 beschrieben. Selektion der Transformanten basierte auf der Resistenz gegen Spectinomycin/Streptomycin die durch das aadA Genprodukt vermittelt wird. Um die transformierten Plastid Genome zu amplifizieren und Wildtyp Genome zu eliminieren wurden die primären Transformanten (ausgehend von kleinen Blattstückchen) mehreren zusätzlichen Runden von Regenerationen auf Selektionsmedium mit Spectinomycin unterworfen (hier als Cyclus-I, Cyclus-II usw. bezeichnet).
- Zwei Spectinomycin/Streptomycin resistente Calli von Cyclus 0 wurden mittels PCR analysiert um die Transformation zu bestätigen. Drei verschiedene Primen Paare wurden benutzt (
11 ) - A) 5'-CAGACTAATACCAATCCAAGCC-3' (bindet außerhalb der linken flankierenden Region im N. tabacum Plastom) und 5'-CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC-3' (bindet im Markengen).
- B) 5'-CACTACATTTCGCTCATCGCC-3' (bindet im Markergen) und 5'-TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3' (bindet außerhalb der rechten flankierenden Region im N. tabacum Plastom)
- C) 5'-CATCAATACCTCGGTCTAG-3' (bindet in der linken flankierenden Region) und 5'-ACACATAGTATGCCCGGTC-3' (bindet in der rechten flankierenden Region).
- Die PCR ergab mit allen drei Primern Amplifikate, was beweißt, dass die Integration von beiden Vektoren zu einer zusammenhängenden integrierten Region führt. (
12 ). Die berechneten Amplifikatgrößen sind 2139 Bp (A), 2035 BP (B) und 1450 Bp (C), was gut mit den beobachteten Größen übereinstimmt. Bemerkenswerterweise ist mit dem Primerpaar C kein Wildtyp Signal (290 Bp) sichtbar, was darauf hinweißt, dass selbst in so einem frühen Stadium keine Nichttransformante vorkommt. - Fünf Spectinomycin/Streptomycin resistente Kalli aus Zyklus 0 und Zyklus 1 wurden anschließend in drei unabhängigen Souther Blot Experimenten untersucht (
13 ). Zwei Linien zeigten ausschließlich die Anwesenheit von korrekt integriertem aadA Gen (Spur1 und Spur3 : 3,8 kBp für die Bsp120I Restriktion und 6,7 kBp für die Acclll Restriktion). Eine Spur (Spur2 ) zeigte das integrierte aadA Gen und ein zusätzliches Signal (4,9 kBp für die Bsp120I Restriktion und 3,5 kBp für die Acclll Restriktion) das einem Rekombinationszwischenprodukt entspricht. Zwei Spuren (Spur4 und Spur5 ) zeigten Signal des Rekombinationszwischenprodukts (4,9 kBp für die Bsp120I Restriktion) und das Wildtyp Signal (2,6 kBp für die Bsp1201 Restriktion). Dieses Ergebnis zeigt, dass zwei von 5 untersuchten Linien den homoplastomischen Integrationsstatus sehr schnell erreichten. - Referenzen:
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US5877402 ) - (
US5451513 ) - SEQUENZPROTOKOLL
-
Claims (21)
- Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die am Plastom transformiert sind, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einführen eines ersten und eines zweiten DNA-Moleküls in die Plastide von Pflanzen, wobei das erste DNA-Molekül eine erste Region, die homolog zu einer Region auf dem Plastom ist, um eine Integration ins Plastom zu dirigieren, und eine erste gewünschte Sequenz enthält, und das zweite DNA-Molekül eine zweite Region, die homolog zu einer Region auf dem Plastom ist, um eine Integration in das Plastom zu dirigieren, und eine zweite gewünschte Sequenz enthält, wobei ein Sequenzsegment der ersten gewünschten Sequenz homolog zu einem Sequenzsegment der zweiten gewünschten Sequenz ist, und (b) Selektion von Transformanten, die eine stabil in das Plastom integrierte Integrationssequenz enthalten, wobei die Integrationssequenz mindestens einen Teil der ersten und mindestens einen Teil der zweiten gewünschte Sequenz als kontinuierliche Sequenz enthält.
- Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste und das zweite DNA-Molekül in die Plastide der Pflanze mittels Kotransformation eingeführt werden.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die erste und die zweite gewünschte Sequenz verschieden sind.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste und die zweite gewünschte Sequenz zusätzlich zu dem Sequenzsegment jeweils eine weitere Sequenz enthalten.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein oder mehrere weitere DNA-Moleküle in die Plastiden der Pflanze eingeführt werden zusätzlich zu dem ersten und dem zweiten DNA-Molekül, wobei das/die weitere(n) DNA-Moleküle) zusätzliche gewünschte Sequenzen enthalten.
- Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das eine zusätzliche DNA-Molekül ein Sequenzsegment enthält, das zu einem Sequenzsegment der ersten gewünschten Sequenz homolog ist, und ein Seqzenzsegment, das zu einem Seqzenzsegment der zweiten gewünschten Sequenz homolog ist.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die erste und/oder die zweite und/oder eine zusätzliche gewünschte Sequenz ein oder mehrere gewünschte Gene oder Fragmente eines gewünschten Gens enthält.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein gewünschtes Gen in zwei oder mehr Fragmente gespalten wird und die erste und/oder die zweite und/oder die zusätzliche gewünschte Sequenz ein Fragment des gewünschten Gens enthält, und wobei das gewünschte Gen aus den zwei oder mehr Fragmenten bei der Bildung der Integrationssequenz zusammengesetzt wird.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das gewünschte Gen ein Selektionsmarkergen ist.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das erste oder das zweite DNA-Molekül ein Selektionsmarkergen außerhalb einer Sequenzeinheit enthält, die aus der zu einer Region des Plastoms homologen Region und der gewünschten Sequenz besteht, um den Verlust des Selektionsmarkergens zu ermöglichen.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein Selektionsmarkergen in ein erstes und ein zweites Fragment gespalten wird, wobei das erste Fragment in das erste DNA-Molekül außerhalb einer ersten Sequenzeinheit eingefügt wird und das zweite Fragment in das zweite DNA-Molekül außerhalb einer zweiten Sequenzeinheit eingefügt wird, wobei die erste Sequenzeinheit aus der ersten homologen Region und der ersten gewünschten Sequenz besteht und wobei die zweite Sequenzeinheit aus der zweiten homologen Region und der zweiten gewünschten Sequenz besteht.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Selektionsmarkergen aphA-6 ist.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das erste DNA-Molekül nur eine Region enthält, die homolog zu einer Region des Plastoms ist, um die Integration in das Plastom zu dirigieren.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das erste und das zweite DNA-Molekül je nur eine Region enthält, die homolog zu einer Region des Plastoms ist, um die Integration in das Plastom zu dirigieren.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die erste und die zweite homologe Region zusammen einer kontinuierlichen Sequenz auf dem zu transformierenden Plastom entsprechen.
- Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei homoplastomische transgene Pflanzen aus den Transformanten regeneriert werden.
- Kit umfassend ein erstes und ein zweites DNA-Molekül wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 definiert.
- DNA-Molekül zur Plastidentransformation, das eine gewünschte Sequenz und eine zu einer Region eines Plastoms homologe Region enthält, um die Integration in das Plastom zu dirigieren.
- Bibliothek von DNA-Molekülen gemäß Anspruch 18, wobei jedes der DNA-Moleküle eine andere gewünschte Sequenz enthält.
- Pflanze oder Pflanzenzellen, die mit den DNA-Molekülen des Kits von Anspruch 17 oder mit den DNA-Molekülen von Anspruch 18 transformiert sind.
- Pflanze, Pflanzenzelle oder Samen, die mit dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 16 erhalten wurden.
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