MXPA05001401A

MXPA05001401A - Transformacion de plastidios utilizando vectores modulares.

Info

Publication number: MXPA05001401A
Application number: MXPA05001401A
Authority: MX
Inventors: Christian Eibl
Original assignee: Icon Genetics Ag
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2005-06-03
Also published as: DE60322543D1; US20060117400A1; EP1527185B1; ATE403004T1; AU2003255350B2; WO2004015115A1; EP1527185A1; US7528292B2; JP4384037B2; AU2003255350A1; CA2495545A1; JP2005534329A; ES2311116T3; DE10236001A1

Abstract

Se describe un procedimiento para generar plantas transgenicas o celulas vegetales transformadas en su plastoma, que comprende: (a) introducir en los plastidios vegetales una primera molecula de ADN y una segunda molecula de ADN, en donde la primera molecula de ADN contiene una primera region homologa a una region del plastoma para detectar la integracion del plastoma y una primera secuencia de interes, y la segunda molecula de ADN contiene una segunda region homologa a una region del plastoma para dirigir la integracion del plastoma y una segunda secuencia de interes, por lo que el segmento de secuencia de la primera secuencia de interes es homologo a un segmento de secuencia de la segunda secuencia de interes, y seleccionar transformantes que tienen una secuencia de integracion integrada de manera estable en el plastoma, por lo que la secuencia de integracion contiene por lo menos una porcion de la primera y por lo menos una porcion de la segunda secuencia de interes, como una secuencia continua.

Description

TRANSFORMACIÓN DE PLASTIDIOS UTILIZANDO VECTORES MODULARES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con biotecnología vegetal en general, y más particularmente con un procedimiento y vectores para transformación de plastidios (también denominados como plastos, plás idas o plastidos) de plantas. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento de transformación genética; de plastidios vegetales, vectores para el procedimiento y plantas o células vegetales que se obtienen o que se pueden obtener de acuerdo con el procedimiento de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN De acuerdo con el ' conocimiento aceptado generalmente, dos clases de organelos celulares, es decir, plastidios y mitocondrias se derivan de procariotas inicialmente independientes que fueron captados en un predecesor de las células eucarioticas actuales por sucesos endosimbióticos separados (Gray, 1991) . Como una consecuencia, estos organelos contienen su propio ADN, los transcritos de ADN en forma de AUN mensajero, ribosomas y por lo menos parte de los ARNt necesarios que se requieren para la descodificación de información genética (Merechal-Drouard et al., 1991). Mientras que poco después de la captación endosimbiótica estos organelos eran genéticamente autónomos dado que contenían todos los elementos necesarios para generar vida procariótica, esta autonomía se redujo durante la evolución por . transferencia de la información genética al núcleo de las células. No obstante, su información genética es de complejidad suficiente para hacer que los organelos celulares resientes sean un objetivo atractivo para la tecnología de genes. Este es particularmente el caso con plastidios, debido a que estos organelos aún codifican aproximadamente 50% de las proteínas que se requieren para su función principal dentro de la célula vegetal, la fotosíntesis. Los plastidios también codifican sus ARN ribosómicos, la mayor parte de su ARNt y las proteínas ribosómicas . En total, el número de genes en el plastoma está en el intervalo de 120 (Palmer, 1991). La mayor parte de las proteínas que se encuentran en los plastidios, no obstante, son importadas del compartimiento genético nuclear/citosólico .

Los plastidios pueden ser transformados genéticamente Con el desarrollo de tecnologías de clonación molecular general,, ahora se ha vuelto posible modificar genéticamente plantas superiores por transformación. El énfasis principal en la transformación vegetal se realizó y aún se encuentra en la transformación nuclear, dado que la mayor parte de los genes, aproximadamente 26,000 en el caso de Arabidopsis thaliana, cuya secuencia completa recientemente se ha publicado (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000) se encuentra en el núcleo de la célula. La transformación nuclear es más fácil de llevar a cabo dado que se encuentra disponibles vectores biológicos tales como Agrohacterium tumefaciens, el cual puede ser modificado para habilitar eficazmente la transformación nuclear (Galvin, 1998) . ' Además, el núcleo es accesible más fácilmente a ácidos nucleicos extraños, mientras que los organelos están rodeados por dos membranas de envoltura que, hablando de manera general, no son permeables a macromoléculas tales como ADN. Una capacidad de los plastidios transformantes es altamente deseable dado que puede hacer uso de altas dosificaciones de genes en estos organelos que generen el potencial de expresión extremadamente alto de concentraciones de transgenes. Además, la transformación de plastidios es atractiva debido a que los rasgos codificados por los plastidios no son transmisibles por el polen;, y por lo tanto se reducen en gran medida los riesgos potenciales de un escape inadvertido de un transgen a sus parientes silvestres de ' plantas transgénicas . Otras ventajas potenciales de la transformación de plastidios incluyen la factibilidad de expresión simultánea de genes múltiples como una unidad policistrónica y la eliminación de efectos de posición y bloqueo de la expresión de genes que pueden resultar después de la transformación nuclear. Los métodos que permiten la transformación estable de los plastidios en realidad se pueden desarrollar para plantas superiores. Hasta ahora están disponibles dos métodos diferentes, es decir, el bombardeo con partículas de los tejidos, en particular tejidos de hoja (Svab et al., 1990) y el tratamiento de protoplastos con polietilenglicol (PEG) en presencia de vectores de transformación adecuados (Koop et al., 1996) . Ambos métodos median la transferencia de ADN plasmídico a través de dos membranas de envoltura en el estroma de los organelos. Los métodos convencionales para transformación de plastidios habitualmente se basan en la selección para la inserción de un cassette marcador de · resistencia a antibióticos en el plastoma tal como un cassette de expresión que contenga el gen aadA (que codifica para la encima aminoglucósido adeniltransferasa) el cual confiere resistencia a inhibidores como " espectinomicina o estreptomicin (US5877402) o aphÁ-6 (que codifica para la enzima aminoglucósido fosfotransferasa A-6) , el cual confiere resistencia a canamicina (Huang et al., 2002). De manera alternativa, se obtiene la selección al sustituir un gen de plastidio residente completo por un gen mutante el cual confiere resistencia a inhibidores de selección (US5451513) . Estos genes marcadores de selección que se necesitan para la selección de células vegetales transgénicas de un amplio fondo de células no transformadas que codifican para resistencia a antibióticos o a herbicidas. El gen marcador de selección del gen para plastidio mutante se incluye en la región de integración, la cual es flanqueada por regiones homologas dirigidas a la integración del plastoma. La selección para los transformantes de plastidios después se obtiene al cultivar el material vegetal transformado en un medio que contiene el inhibidor apropiado. Dado que estos genes marcadores se integran de manera estable en el genoma junto con los genes de interés, permanecerán en las plantas transgénicas homoplastómicas aunque . no se requiera para la función de los "genes de interés. Estos genes marcadores remanentes son el tema principal de critica de la biotecnología vegetal . La construcción de - un sistema de selección el cual no resulte en un gen de resistencia en las plantas transgénicas, por lo tanto resulta altamente deseable (lamtham and Day, 2000)..

La tecnología convencional de transformación de plastidios se describe en Heifetz, 2000 y Koop et al., 1296. La , transformación de vectores plastidios habitualmente contienen uno o más genes de interés flanqueados por dos regiones del sitio de inserción, los cuales son necesarios para introducción estable de las secuencias sometidas á ingeniería dentro del plastoma por sucesos de recombinación homólogos (US5877402, US5451513) . No obstante se necesita trabajo de clonación sustancial para generar las moléculas vectoras de transformación las cuales contengan una gran- cantidad de fragmentos diferentes: dos flancos, un gen marcador, uno o más genes de interés y elementos reguladores tales como elementos promotores, 5 ' -UTR, 3 ' -UTR o separadores. La clonación de los vectores de transformación resulta problemática en casos en donde (por lo menos uno de) los genes clonados tiene un efecto tóxico sobre la bacteria utilizada para clonación. Además, utilizando el potencial altamente deseable para coexpresar una serie de transgenes introducidos se limita por el tamaño total del plásmido transformante . Una complicación mayor al . obtener una transformación .de plastidios es el alto número de copias del plastoma. Después de la transferencia del ADN vector en . los plastidios únicamente muy pocas copias de las moléculas introducidas se recombinarán con el plastoma. Por lo tanto, inicialmente sólo una proporción pequeña de las moléculas de plastoma recombinantes se generan en el fondo de la amplia mayoría de las moléculas de plastoma de tipo silvestre ("estado heteroplastómico" ) . Por un procedimiento de consumo de tiempo de segregación bajo presión selectiva es posible eliminar las copias del tipo silvestre originales del plastoma y obtener un "estado recombinante homoplastómico" que está caracterizado por la sola presenci de moléculas de plastoma recombinantes . La obtención del estado homoplastómico es soportado por varios ciclos de regeneración sobre un medio selectivo que contiene los antibióticos apropiados. Habitualmente 3 - 5 de tales ciclos son necesarios para obtener el estado recombinante homoplastómico. La presencia de copias remanentes de plastoma de tipo silvestre puede ser monitoreada por análisis molecular como PCR o hibridación Southern. Dado que se requieren varias semanas para un ciclo de regeneración, se necesitan varios meses para generar transformantes de plastidios homoplastómicos . Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento de transformación genética de plastidios vegetales novedoso, eficaz, rápido y altamente versátil, por medio del cual se pueda elaborar plantas transgénicas o células vegetales genéticamente estables. Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento de transformación genética de plastidios vegetales el cual permita una reducción significativa en el número de ciclos de regeneración necesarios para obtener plantas homoplastómicas . Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento de transformación genética de plastidios vegetales el cual permita la expresión genes múltiples de interés (expresión policistrónica) . Un objetivo adicional es proporcionar vectores los cuales pueden ser utilizados de un modo modular, y de esta manera reducir el trabajo de clonación y el tamaño total de las" moléculas plasmídicas . Un objetivo adicional es proporcionar vectores los cuales permitan la clonación de secuencias que tienen efectos tóxicos sobre bacterias utilizadas para clonación. Un objetivo adicional es proporcionar un método que permita la generación de transformantes los cuales no presenten un gen marcador de resistencia en la planta o la célula vegetal finales.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN Los objetivos anteriores se obtienen por un procedimiento de generación de plantas transgénicas o células vegetales transformadas en su plastoma, que comprende : (a) introducir en los plastidios vegetales una primera molécula , de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde : la primera molécula de ADN contiene una primera región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma y un primera secuencia de interés, y la segunda molécula de ADN contiene una segunda región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma y una segunda secuencia de interés, por lo que un segmento de secuencia de la primera secuencia de interés es homólogo a un segundo segmento de la segunda secuencia de interés, (b) seleccionar transformantes que tienen una secuencia de integración integrada de manera estable en el plastoma, por lo que la secuencia de integración contiene por lo menos una porción de la primera y por lo menos una porción de la segunda secuencia de interés, como una secuencia continua. Las modalidades preferidas se definen por las reivindicaciones dependientes . Se ha encontrado sorprendentemente que es posible generar plantas'' transgénicas .o' células vegetales transformadas en sus plastomas al introducir en los plastidios vegetales por lo menos dos moléculas de ADN que contienen secuencias superpuestas, las cuales resultan en una secuencia de integración continua en la planta transplastómica final . El procedimiento de la invención presenta varias ventajas importantes con respecto a los procedimientos convencionales de transformación de plastidios. Estas .'ventaj as se indican en lo siguiente. El procedimiento de la invención comprende introducir una primera y una segunda moléculas de ADN en plastidios de una planta que va a ser transformada. Estas moléculas de ADN, las cuales se" utilizan como vectores, se pueden introducir de manera consecutiva, es decir, en dos etapas separadas, ¦ o simultáneamente, es decir, en un procedimiento de una etapa. Es menos laborioso y por lo tanto se prefiere introducir las. dos moléculas de ADN en un procedimiento de una sola etapa, por ejemplo mediante la utilización de una mezcla de tales moléculas de ADN. Para introducir tales moléculas de ADN, se pueden' utilizar métodos de transformación conocidos (véase abajo) . El diseño de las moléculas de ADN es de importancia central para el procedimiento de la invención. La primera molécula de ADN contiene una primera región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma y una primera secuencia de interés . La segunda molécula de ADN contiene una segunda región homologa a una. región del píastoma para dirigir la integración del plastoma y una segunda secuencia de interés. Por lo tanto, una región homologa a una región del plastoma es suficiente para cada molécula de ADN. Preferiblemente, la primera o la segunda molécula de ADN contiene únicamente una región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma. De manera más preferible, la primera y segunda moléculas de ADN contiene ambas, únicamente una región homologa a una región de plastoma para dirigir la integración del plastoma. Las regiones homologas dirigen la integración de cada molécula de ADN a un sitio deseado del. plastoma. La primera y segunda regiones homologas determinas juntas, el tipo de modificación de ADN (por ejemplo inserción, supresión) del plastoma por el procedimiento de la invención. En una modalidad preferida, el objetivo de realizar el procedimiento de la invención es introducir una secuencia de integración en el plastoma sin ninguna modificación adicional del plastoma como una supresión de las secuencias del plastoma. Preferiblemente, las regiones homologas de la primera y segunda moléculas de ADN corresponden juntas a una secuencia continua de plastoma.

Generalmente, dichas regiones homologas se derivan de plastomas de las especies vegetales que van a ser transformadas . :En la medida en que se garantice homología suficiente para recombinación homologa, las regiones homólogas pueden ser derivadas de otras especies vegetales, no obstante, de manera preferible, a partir de especies vegetales relacionadas estrechamente. La longitud de cada región homologa para la integración del plastoma puede variar en un intervalo amplio en la medida en que sea suficiente la frecuencia de recombinación. Cada región homologa puede tener una longitud de entre 100 y 5000 pares de bases. Habitualmente, la frecuencia de recombinación disminuye conforme disminuye la longitud de las regiones homólogas. Por lo tanto, la longitud preferiblemente es de por lo menos 200 a 300 pares de bases. De manera más preferible, la longitud está entre 500 y 2000 pares de bases, y de manera mucho más preferible entre 500 y 1000 pares de bases. Tales secuencias de interés pueden contener cualquier secuencia nucleotídica que se va a integrar en el plastoma. Como un ejemplo típico, las secuencias de interés contienen un gen que se va a expresar. La primera y la segunda secuencias ¦ de interés pueden contener . cada una un fragmento de un gen que se va a expresar, por lo que el gen se ensambla en la secuencia de integración. A este respecto la invención es altamente versátil. No obstante, de manera preferible, la primera y segunda secuencias de interés son diferentes. La primera secuencia de interés contiene un segmento de secuencia que es homólogo a un segmento de secuencia de la segunda secuencia de interés. Por lo tanto, este segmento homólogo es una región que se superpone de la primera y segunda secuencia de interés . El segmento de secuencia homólogo permite la recombinación de la primera y segunda secuencia de interés de manera tal que la secuencia de integración se conforma en el píastoma,, por lo que la secuencia de integración contiene por lo menos una porción de la primera y por lo menos una porción de la segunda secuencia de interés como una secuencia continua (véase figura 5) . El segmento de secuencia en una secuencia de interés preferiblemente se coloca en el extremo distal de la secuencia de interés con respecto a la región homologa que dirige la integración del plastoma. . Como un requerimiento mínimo, la primera y segunda secuencias de interés contienen cada una, un segmento de secuencia homólogo es decir, una secuencia que es de homología suficiente para permitir al recombinación homologa entre la primera y segunda secuencia de interés . Preferiblemente, el segmento de secuencia homólogo de la primera y de la segunda secuencia de interés son idénticos.

El segmento de secuencia puede ser o puede contener una secuencia (o una parte de la misma) involucrada en la expresión de un AR o una proteina. Tal egmento de - secuencia puede ser o puede contener una secuencia involucrada en regular la transcripción o traducción de una secuencia codificante (por ejemplo un promotor, una secuencia 5' o 3' no · traducida, un sitio de unión- de' ribosoma, etcétera o partes del mismo). Además, el segmento de secuencia puede ser o puede contener una secuencia codificante (o una parte del mismo) de una proteina que se va a expresar. En los casos mencionados antes, el segmento de secuencia de la primera secuencia de interés y el segmento de secuencia de la segunda secuencia de interés preferiblemente son idénticos con el fin de no alterar la ' función de regulación de la secuencia codificante. De manera alternativa, el segmento de secuencia puede tener el único propósito de permitir la recombinación entre la primera y segunda secuencias de interés para formar . la secuencia de integración y puede no estar involucrada en la expresión de un ARN o una proteína. Uno o varios de tales segmentos de secuencia típicamente son partes del transplastoma de la planta transgénica o de las . células vegetales generadas de acuerdo con la invención (véanse figura 6 y 6) . Tal segmento de secuencia puede ser parte de una unidad de transcripción, por lo que se pueden volver parte de un transripto formado a partir de la unidad de transcripción. Si el segmento de secuencia (o una parte del mismo) no se desea en tal transcrito (por ejemplo, ¦ si el '" segmento de secuencia interrumpe una secuencia codificante que codifica para una proteína que se va a expresar) , la parte no deseada se puede eliminar por corte mediante empalme de AR . En este caso, se puede incluir un intrón, de manera notable un intrón autoempalmante como un intrón del grupo I o del grupo II, dentro del segmento de secuencia para eliminar por empalme ' las partes no deseadas. Los intrones autoempalmantes de muchas fuentes y su uso en la ingeniería genética se conocen en la técnica. La primera secuencia de interés puede proporcionar una ·¦ parte 5' del intrón, y la segunda secuencia de interés puede proporcionar una parte 3 ' del intrón, por lo que el intrón funcional se puede ensamblar cuando se forma la secuencia de integración. La primera y segunda secuencias de interés pueden ser idénticas, lo que lleva, a una secuencia de integración que consiste de la secuencia de interés. En este caso limitante, cada secuencia de interés se puede considerar que consiste de un segmento de secuencia homólogo. Este caso limitante no es un caso preferido de la invención. Preferiblemente, la primera o segunda secuencia de interés contienen una secuencia además del segmento de secuencia - homólogo. De manera más preferible, cada una de la primera y segunda secuencia de interés contienen una secuencia además del segmento de secuencia homólogo, por lo que las secuencias adicionales en la primera y la segunda secuencia de interés son diferentes. La recombinación entre las regiones que se superponen (segmentos de secuencia homólogos) de los vectores se puede llevar a cabo dentro del plastoma para formar la secuencia de interés. La secuencia de interés preferiblemente comprende porciones de secuencia de la primera y de la segunda secuencia de interés. Si la primera y la segunda secuencia de interés contienen cada una un gen de interés, se puede formar una secuencia de integración que comprenda dos genes de interés. De esta manera, el procedimiento de la invención se puede utilizar para ensamblar una' secuencia de integración , deseada desde la primera y la segunda secuencia de interés. El ensamblado de la secuencia de integración se puede utilizar para generar en los plastidios una función nueva que no estaba presente en una de las secuencias de interés sola. Como un ejemplo, un gen de interés que consiste de -una secuencia codificante y de varias secuencias reguladoras se puede ensamblar en una forma funcional en la secuencia de integración. Además, una secuencia codificante de interés en la primera secuencia de interés se puede combinar con un promotor u - - otras secuencias reguladoras que se proporcionan con una segunda secuencia de interés (o viceversa) . De esta manera, una secuencia reguladora que da lugar a una expresión deseada de la secuencia codificante se puede seleccionar para ser cribada. Además, se puede - ensamblar en la secuencia de integración una secuencia codificante para expresar una protexna de interés, por medio de la cual la primera y segunda secuencias de interés (y opcionalmente las secuencias de interés adicionales de vectores posteriores) proporcionan, cada uno, una parte de la secuencia codificante para la secuencia de integración. Se pueden utilizar los xntrones autoempalmantes para obtener el marco de lectura correcto de la proteína que se va a expresar a nivel de ARN mensajero. El procedimiento de la invención puede comprender introducir una o más moléculas adicionales de ADN en los plastidios vegetales además de la primera y segunda moléculas de ADN. Una o varias de las moléculas de ADN adicionales comprenden una o varias secuencias adicionales de interés. Si se introduce una tercera molécula de ADN, la tercera molécula de ADN preferiblemente contiene un segmento de secuencia homólogo a un segmento de secuencia de la primera secuencia de interés y un segmento de secuencia homólogo a la segunda secuencia de interés. La tercera molécula de ADN preferiblemente no tiene una región homologa para la integración del plastoma. Después de la transformación, los transformantes se seleccionan de manera que contienen la secuencia de integración deseada. La selección típicamente es soportada por un inhibidor o antibiótico en el que los transformantes son resistentes debido a un gen marcador. La selección puede comprender además permitir la segregación de sectores transformados y no transformados (por ejemplo en las hojas) . Los sectores transformantes o transformados se pueden identificar por análisis molecular, por ejemplo PCR y transferencia Souther. Además, los transformantes o sectores transformados se pueden identificar fenotípicamente, por ejemplo por la expresión de un transgen. Un transgen se puede detectar, por ejemplo, por transferencia Western, por una actividad enzimática característica o. or otra propiedad característica como una propiedad óptica, notablemente fluorescente. Se puede introducir en un plastoma con la primera y segunda secuencia de interés un gen marcador para seleccionar transformantes . Como se indica en lo anterior, la primera o la segunda secuencia de interés pueden proporcionar un fragmento de un gen marcador a la secuencia de integración y la segunda secuencia de interés puede proporcionar otro f agmento del gen marcador, por lo que los fragmentos se combinan en un gen marcador funcional en la secuencia de integración. Preferiblemente, la primera secuencia de interés contiene una parte 5' de un gen marcador y la segunda secuencia de interés contiene una parte 31 del gen marcador. La secuencia de integración después puede contener al gen. marcador de manera que pueda ser expresado. Esta modalidad permite la selección para integración de ambos vectores y la recombinación para formar la secuencia de integración. Se pueden obtener plantas transgénicas o células vegetales libres de marcador seleccionable en el proceso de la invención al diseñar la primera y segunda secuencia de interés de la primera y segunda molécula de ADN, respectivamente, de manera que el gen . marcador seleccionable en la secuencia de integración está flanqueado por elementos de secuencia homólogos entre si para permitir el corte del gen marcador por recombinación homologa, de manera similar a lo descrito por lamtham y Day (Nature Biotechnol . (2000) 18, 1172-1176. En esta modalidad, la primera secuencia de interés puede contener, hacia el extremo 51 de una parte 51 del gen marcador, un elemento de secuencia homólogo a un elemento de secuencia que se localiza hacia el extremo 31 de una parte 3 ' del gen marcador sobre la segunda secuencia de interés, por lo que los elementos de secuencia permiten el corte por recombinación homologa de una parte de la secuencia de integración que comprende la parte 5 ' o la 3 ' del gen marcador. El corte del gen marcador típicamente requiere la liberación de presión de selección del gen marcador, contra el que se proporciona resistencia. Cada una de la primera y segunda secuencia de interés pueden contener . un gen marcador completo. No obstante, de manera preferible, la primera secuencia de interés puede contener la parte 5' del gen marcador y la segunda secuencia de interés puede contener la parte 31 del gen marcador, por lo que ni la parte 5' ni la parte 3' son capaces de conferir resistencia en ausencia de la parte- 3 ' o la parte 5', respectivamente. ' Como un ejemplo, la parte 5' puede ser: un promotor, secuencias 5' no traducidas y la secuencia codificante del gen marcador. La parte 31 puede ser: la secuencia codificante del gen marcador y las secuencias 3 ' no traducidas . La invención proporciona una modalidad adicional que permite producir plantas transplastómicas libres de marcador. Esto se puede obtener al incluir un gen marcador seleccionable en una de las molécula de ADN fuera de una unidad de secuencia que consiste de la región homologa a una región del plastoma -y la secuencia .de interés. Tal determinación de un gen marcador permite la pérdida del gen marcador en el curso de los sucesos de recombinación que se llevan a cabo. Se puede incluir un gen marcador seleccionable en la primera y segunda molécula de ADN de la manera descrita, o en la primera y segunda molécula de ADN. Si se incluye un gen marcador seleccionable en la primera y segunda molécula de ADN, estos ^ genes marcadores seleccionables pueden ser iguales o pueden ser genes marcadores seleccionables diferentes. La colocación del gen marcador fuera de la unidad de secuencia resulta en el corte del . gen marcador eliminándolo del píastoma en el curso de los sucesos de recombinación considerados en esta invención, lo que vuelve a las plantas transplastomicas libres del marcador susceptible. Es evidente para una persona experta en la técnica que el inhibidor o el antibiótico, para el gen marcador utilizado se aplica únicamente de manera transitoria en la selección de la etapa (b) . En una etapa posterior, se elimina del medio el antibiótico con el fin de permitir la pérdida de uno o varios de los genes marcadores por sucesos de recombinación homologa mediados por secuencias duplicadas, las cuales se han generado durante la integración del vector. En una modalidad específica del procedimiento de producción de plantas transplastomicas sin marcador, un gen marcador seleccionable se divide en un primero y un segundo fragmentos, por lo que el primer fragmento se incorpora en la primera molécula de ADN fuera de una primera unidad de secuencia y el segundo fragmento se incorpora en la segunda molécula de ADN fuera de una . segunda unidad de secuencia. La primera unidad de secuencia consiste de una primera región homologa y la primera secuencia de interés. La segunda unidad de secuencia consiste de la segunda región homologa y la segunda secuencia de interés. El procedimiento de la invención se puede aplicar a todas las plantas. De manera preferible, se aplica a plantas multicelulares. De manera más preferible, el procedimiento de la invención se aplica a plantas de cosecha. Los ejemplos de plantas de cosecha se proporcionan en las definiciones. La invención proporciona además un equipo de partes que comprende una primera y una segunda molécula de ADN como se definen en la presente. La invención además proporciona una molécula de ADN para transformación de plastidios que contiene una región homologa a una región de un plastoma para dirigir la integración del plastoma y una secuencia de interés. Además, se proporciona una biblioteca de moléculas de ADN como se define en' la presente, por medio de la cual cada una de las moléculas de ADN contiene una secuencia diferente de interés. Tal biblioteca se puede generar al clonar una mezcla de secuencias de ADN de interés en un vector que contiene una región homologa a una región de un plastoma para dirigir la integración del plastoma. La biblioteca se puede mantener al transformar las molécula de ADN en células como células bacterianas (por ejemplo de E. coli) o células, vegetales. Además, las plantas o células vegetales transformadas con dichas molécula de ADN del equipo de partes o con la molécula de ADN de la invención, se suministran. La invención también se relaciona con células vegetales y plantas que se obtienen o que se "pueden obtener por el procedimiento de la invención.

Ventajas del procedimiento de la invención El procedimiento que se describe en la presente se puede aplicar para introducir secuencia de interés tales como genes o elementos reguladores o para introducir mutaciones tales como mutaciones, inserciones o supresiones puntuales en el plastoma. El procedimiento, de la invención' permite generar plantas transplastómicas , por lo que se puede adquirir un estado homoplastómico después de menos ciclos de regeneración en comparación con los procedimientos de la técnica anterior. Dependiendo de la modalidad particular, las plantas homoplastómicas se pueden obtener después de 0 a 4 ciclos de regeneración, preferiblemente después de 2 ciclos, y de manera más preferible después de 1 ciclo de regeneración. En' modalidades especiales, el estado homoplastómico se obtiene eñ transformantes primarios sin un ciclo de regeneración.. De esta manera, el procedimiento de la invención permite una reducción enorme en el tiempo necesario para obtener plantas ' transplastómicas homoplastómicas . Las razones para esta mejora en la eficiencia sorprenden actualmente no está clara. En comparación con la transformación convencional de plastidios, el método que se describe en la presente es más rápido, debido a que son necesarias menos etapas para obtener plantas homoplastómicas. El método permite el uso de vectores de transformación más · pequeños para los cuales la clonación es más sencilla que en el caso de vectores de transformación de plastidios convencionales. El método proporciona la transformación de plastidios desde cualquier limitación respecto al número o tamaño de secuencias que se van a introducir, debido a que se puede utilizar una cantidad ilimitada de vectores de transformación con secuencias superpuestas. Los métodos generan transformación de plastidios a partir de cualquier limitación impuesta por secuencias, las cuales son tóxicas para las bacterias utilizadas para clonación, debido a que las secuencias tóxicas se pueden clonar en dos molécula vectoras diferentes de manera tal que cada una de ellas por separado puede no ser tóxica, incluso si se expresa' en una secuencia proteínica. Además, el método descrito en la presente permite el uso de bibliotecas de vectores combinacionales en donde los vectores de la biblioteca contienen secuencias diferentes de interés . El " método se . puede aplicar para generar transformantes, por lo que la planta final no presenta ningún gen marcador de resistencia. Cualquiera de los aspectos mencionados en lo anterior de este método nuevo proporciona ventaja sustancial en comparación con la transformación convencional de plastidios. Tomados juntos, los procedimientos y vectores de esta invención constituyen un enorme progreso tanto en velocidad, capacidad de uso y flexibilidad de la transformación de plastidios en general.

DEFINICIONES 3'-ÜTR: región transcrita pero no traducida de (->) gen, corriente debajo de una (->) región codificante; 5'-UTR: región transcrita pero no traducida de un (->) gen, hacia el extremo 5 ' de una (->) región codificante; en (->) genes (->) de plastidios, el 5 ' -UTR contiene información de secuencia para inicio de traducción (sitio de unión de ribosomas, (->) RBS) cercano a su extremo 31 y; aadA: (->) región codificante de una aminoglucósido adeniltransferasa bacteriana, una protexna utilizada frecuentemente, que destoxifica los antibióticos (->) inhibidores de selección espectinomicina o estreptomicina,- aphA-6 (->) región codificante de una aminoglucósido fosfótransferasa bacteriana A-6, una proteina que destoxifica el (->) inhibidor de selección de antibiótico: canamicina: cloroplasto: (->) plastidios (plasto, plástida o plástido) que contiene clorofila; región codificante: secuencia nucleotídica que contiene la información para: a) la secuencia de aminoácidos de un polipeptido, o b) los nucleótidos de un ARW funcional; las regiones codificantes opcionalmente - están interrumpidas por uno o más (->) intrones; flanco, región flanqueante: secuencias de ADN en los extremos 5' y 3' de los insertos en un (->) vector de (->) transformación de un (->) plastidio convencional, los cuales median la integración en el (->) plastoma objetivo de secuencias entre los flancos mediante (->) recombinación homologa recíproca doble. Mediante el mismo mecanismo, se pueden modificar o eliminar secuencias del (->) plastoma objetivo. De esta manera, los flancos del (->) vector de (->) transformación del (->) plastidio determinan cuales cambios en el (->) píastoma objetivo se generan por (->) transformación; . expresión de gen: procedimiento que cambia la información de secuencia en función: en (->) genes que codifican para polipéptidos , la expresión del gen requiere la actividad de un (->) promotor, el cual inicia y dirige la actividad de ARN polimerasa, lo que lleva a la formación de un AR mensajero, el cual posteriormente se traduce en un polipéptido; en los (->) genes que codifican para ARN, la actividad mediada por un (->) promotor del ARN polimerasa genera el ARN codificado; gen: una o varias secuencias nucleotidicas que codifican para todos los elementos los cuales se requieren para asegurar la función, por ejemplo expresión independientemente; los genes están organizados en (->) operones, los cuales contienen por lo menos una (->) región codificante completa; en (->) genes que codifican para polipéptidos, estos elementos son: (1)', un (->) promotor, (2) una región 5' no traducida (->) 5 ' -UTR) , (3) una (->) región codificante completa, (4) una región 31 no traducida (->) 3 ' -UTR) ; en los (->) genes que codifican para ARN, se han perdido la 5 'UTR y la (->) 3' -UTR;. en (->) operones que consisten de más de una (->) región codificante, 2 (->) regiones codificantes completas subscuentes están separadas por un (->) separador y los elementos (->) promotor, (->) 51 -UTR y (->) 3 ' -XJTR son compartidos por las (->) regiones codificantes de dicho (->) operón; un fragmento de un gen pierde total o parcialmente por lo menos uno de los elementos que se incluyen en la lista anterior de un gen. gen de interés: secuencia modificada o recién introducida: el propósito de un intento de (->) transformación; genoma: secuencia completa de ADN de núcleo de una célula o de un organelo celular; GFP: proteína fluorescente verde recombinación homologa: procedimiento que genera un cambio, inserción o supresión de secuencias debido a la presencia de uno o más (->) flancos con homologa de secuencia suficiente para un sitio objetivo en un (->) genoma ,- intrón: secuencia que interrumpe una (->) región codificante; operón: estructura organizacional de varios (->) genes que comparten un promotor; planta: uno varios organismos que contienen (->) plastidios en sus células; esta invención se relaciona particularmente con (-·>) plantas multicelulares; estas incluyen el grupo de las gimnospermas (tales como coniferas, abetos y pinos, etcétera) y angioespermas (tales como monocotiledonias, como cosechas de maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, Triticale, ' sorgo, caña de azúcar, espárragos, ajos, árboles de palma, etcétera y monocotiledonias que no son de cosecha así como cosechas de dicotiledonias de tabaco, papa, tomate, colza, remolacha de azúcar, calabaza, pepino, melón, pimienta, especies cítricas, berenjena, uva, girasol, frijol de soya, alfalfa, algodón, etcétera) y " dicotiledonias que no son cosecha así como heléchos, hepáticas, musgos y algas verdes multicelulares, rojas y cafés; plastidios: organelos con su propia máquinaria genética en células (->) vegetales que se presenta en diversas formas funcional y morfológicamente diferente, por ejemplo aminoplastos, (->) cloroplastos , cromoplastos , etioplastos, gerontoplastos, leucoplastos, proplastidios , etcétera; plastoma: secuencia completa de ADN del (->) plastidio; promotor: secuencia nucleotídíca funcional para iniciar y regular la transcripción; RBS, sitio de unión ribosómico: elemento de secuencia de ADN hacia el extremo 5' del (->) codón de inicio de traducción de una (->) región codificante, que media la unión de ribosomas y el inicio de traducción del transcrito de ARN respectivo; los elementos RBS son parte de los (->) 51 -UTR o de los (->) separadores: inhibidor de selección: compuesto químico que reduce el crecimiento y desarrollo de células no transformadas o de organelos más fuertes que el de los transformados ; secuencia de interés: secuencia modificada o recién introducida de cualquier longitud: el propósito de un intento de (->) transformación; si la introducción de una secuencia no se pretende, la longitud de la secuencia de interés puede ser cero, es decir, puede ser de interés no tener una secuencia de interés . En la presente invención, una secuencia de interés de una molécula de ADN utilizada como vector tiene por lo menos un segmento de secuencia homólogo a un segmento de secuencia de otra molécula de ADN utilizada como un vector. vector de transformación: molécula de ADN clonada que se genera para mediar la' (->) transformación de un (->) genoma; transformación: procedimiento que lleva a la introducción, el corte o la modificación de las secuencias de ADN por tratamiento de (->) plantas o de células vegetales que incluyen el uso de por lo menos un (->) vector de transformación; transgen: secuencia de ADN derivada de un (->) genoma introducido en otro; uidA: (->) región codificante de la ß-glucuronidasa bacteriana, una proteína indicadora utilizada con frecuencia.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema simplificado de los sucesos de recombinacion en la transformación convencional de plastidios: la integración de las secuencias vectoras de transformación en el plastoma se lleva a cabo por dos sucesos de recombinación homólogos mediados por dos flancos homólogos . La región de tipo silvestre correspondiente del plastoma se transfiere al vector plasmídico. La figura 2 presenta un modelo sugerido de sucesos de recombinación en la transformación plastídica convencional en base en nuestras observaciones: la primera recombinación homologa vía el flanco izquierdo o derecho genera una inserción transitoria (reversible) de la totalidad del vector de transformación que genera una duplicación de la secuencia flanqueante respectiva. Una segunda recombinación homologa vía el flanco derecho o izquierdo, respectivamente, genera el corte de las secuencias duplicadas. La región de tipo silvestre correspondiente del plastoma se transfiere al vector plasmídico. La figur 3 presenta el análisis por PCR de transformantes de - tabaco transformados con pKCZ después de hasta tres ciclos de regeneración (ejemplo de referencia) . Gel A (ciclo 0) , Gel B (ciclo I) , Gel C (ciclo II) y Gel D (ciclo III) muestran los productos que se obtienen utilizando los cebadores oSH58 y oSH58 los cuales son específicos para detectar integración completa de pKCZ. Gel E ilustra que con la combinación de cebador 0FCH6O y oSH58 todos los tipos de líneas del ciclo III aún contienen el cassette de selección aadA aunque no todos presentan sucesos de inserción de vector completo (véase ejemplo 1) . La figura 4 presenta un modelo sugerido de sucesos de recombinación mediante la utilización de vectores modulares, de acuerdo con la invención (vector 1 y vector 2) . La primera etapa de integración se muestra ya sea para el vector 1 o el vector 2. La segunda etapa de integración siguiente se muestra únicamente para el vector 1 (a la derecha) en la región de plastoma que ya contiene el vector 2. La segunda etapa de integración del vector 2 en la región del plastoma que ya contiene el vector 1 (no mostrada) procede de una manera análoga. Después de integración de vector completa de ambos vectores, el plastoma transformado final (parte inferior) se obtiene por sucesos de supresión de elementos repetitivos homólogos.

La figura 5 muestra un esquema que presenta la región homologa del vector 1 (hpr 1) y del vector 2 (hpr 2) para dirigir la integración del plastoma por recombinación homologa. El término hpr indica región de plastoma homologa. Además, la secuencia de interés en ambos vectores se muestra (rectángulos blancos mas rectángulos con diagonales verticales) . los rectángulos con diagonales verticales (denominados oír por región de superposición) representan un segmento de secuencia de la primera secuencia de interés (soi) que es homologa a un segmento de secuencia de la segunda secuencia de interés (soi) . Estos segmentos de secuencia homólogos o regiones superpuestas permiten la recombinación del vector 2 y del vector 1 en el plastoma. Dentro de las secuencias ' de interés, los segmentos de secuencia homólogos preferiblemente se colocan alejados de las secuencias hpr. En la parte inferior, se muestra el ·. transplastoma obtenido que contiene la secuencia de integración. La figura 6 presenta un esquema que muestra el uso de un vector adicional (vector 3) además del primero y segundo vectores de la invención. El vector 3 no necesita contener una región homologa para integración en el plastoma. El vector 3 tiene dos segmentos homólogos o regiones superpuestas (rectángulos .con diagonales verticales) . Una región superpuesta (olrl) comparte homología con un segmento de la secuencia homologa del vector 1. La . otra región superpuesta (olr2) comparte homología con un segmento de secuencia homólogo del vector 2. olrl y olr2 preferiblemente no son idénticos, hpr, región de plastoma homologa; soir secuencia de interés; oír, región superpuesta. La figura 7. presenta un esquema que muestra la producción de plantas trarisplastómicas sin marcador. El vector 2 contiene un gen marcador selecciónatele fuera de la unidad de secuencia que consiste de la región homologa y la secuencia de interés. La integración del vector 1 y del vector 2 genera el transplastoma después de inserción del vector 1 y 2 , que se puede seleccionar al aplicar de manera transitoria el antibiótico adecuado. La recombinación vía los elementos duplicados genera el corte de las secuencias que incluyen un gen marcador; hpr, región de plastoma homólogo; soi, secuencia de interés; oír, región de superposición. La figura 8 presenta un vector de transformación plastídico convencional pKCZ. aadA., aminoglucósido adeniltransferasa; INSL, secuencia de plastoma para N. tabacum de pares ce bases 131106-132277; INSR, secuencia de plastoma de N. tabacum de los pares de bases 132278-133396; APr, ß-lactamasa. La figura 9 muestra un vector de transformación de plastidio modular pICF742. aadA, secuencia codificante para aminoglucósido adeniltransferasa; LpsbA, 5'UTR del gen psbA de N. tabacum; PrpI32, promotor del gen rpI32 de N. tabacum; INSR, secuencia de plastoma de N. tabacum de los pares de bases 132279-133390; APr, ß-lactamasa. La figura 10 presenta un vector de transformación de plastidio modular pICF743. aadA secuencia codificante para aminoglucósido adeniltransferasa; Ta, terminador de operón a de E. coli; INSL, secuencia de plastoma de N. tabacum de pares de bases 131106-132277; APr, ß-lactamasa. La figura 11 presenta los sitios de unión de cebador para análisis por PCR de transformantes de tabaco a partir de la cotransformación de pICF742 y pICF743. A, par cebador A; B, par cebador B; C, par cebador C. La figura 12 presenta el análisis por PCR de transformantes de tabaco a partir de la cotransformación de PICF742 y plCF743. 1, línea 1; 2, linea 2, A, par cebador A; B, par cebador B; C, par cebador C; los tres carriles de la izquierda, control sin ADN. La figura 3 presenta la transferencia Southern de transformantes de tabaco a partir de la cotransfomación de pICF742 y de pICF743. A y C, restricción con Bsp 1201; B, restricción con'AccIII. 1-5, línea 1-5; M, carril marcador (desde la parte superior; 10 kb, 8 kg, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2.5 kb, 1.5 kb, 1 kb) ; WT, control de tipo silvestre.

La figura 14 presenta la traducción basada en el vector de transformación plastídico pICF986. aadA His Tag, aminoglucósido adeniltransíerasa con C terminal His Tag; INSL, secuencia de plastoma de N. taJbacum complementaria a los pares de bases '534 a pares de bases 1336; INSR, secuencia de plastoma de N. tabacum complementaria a los pares de bases 155370 a pares de bases 533; APr, ß-lactamasa; T7G10 sitio de unión ribosómico del gen 10 del fago T7; RBS, sitio de unión ribosómico sintético; uidA, ß-glucuronidasa . La figura 15 presenta la traducción modular basada en el vector de transformación plastídico pICF1033. INSL, secuencia de plastoma de N- tabacum complemen aria a pares de bases 534 a pares de bases 1336; AP , ß-lactamasa; T7G10, sitio de unión ribosómico del gen 10 del fago T7; uidA (fragmento N) , secuencia que codifica para la parte N terminal de 373 aminoácidos de ß-glucuronidas . La .figura 16 " presenta . la traducción modular basada en vector de transformación plastid.ico pICF1034. aadA His Tag, aminoglucósido adeniltransferasa con C terminal His Tag; INSR, secuencia de plastoma de N. tabacum complementaria a los pares de bases y 155370 a pares de bases 533; APr, ß-lactamasa; T7G10, sitio de unión ribosómico del gen 10 del fago T7; RBS, sitio de unión ribosómico sintético; uidA, ß-glucuronidasa .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Y MODALIDADES PREFERIDAS Cuando se utilicen vectores de transformación plastídicos convencionales se requieren una gran cantidad de ciclos de regeneración para obtener transformantes homoplastómicos. Los vectores de transformación de plástidios convencionales habitualmente contienen una secuencia de integración la cual no está presente en la planta de tipo silvestre y que contiene un gen marcador seleccionable, uno o más genes de interés y elementos reguladores tales como promotores, 5 ' -UTR, 31 -UTR o elementos separadores. En el vector, la secuencia de integración está flanqueada por dos secuencias homologa al plastoma objetivo y de esta manera dirigen la posición de la integración del plastoma. La inserción de la región de integración dentro del plastoma objetivo se obtiene por sucesos de recombinación homologa recíproca doble. Un modelo simplificado sugiere que la integración se produce via dos sucesos de recombinación homólogos, un suceso en cada flanco (figura 1) . No obstante, el procedimiento molecular real es difícil de supervisar y puede involucrar intermediarios más complejos. Los datos experimentales obtenidos en nuestro laboratorio sugieren que este primer suceso de recombinación mediado por uno de los dos flancos lleva a la integración de un vector de transformación completo y, por lo tanto duplica la secuencia flanqueante (figura 2) . En realidad, la integración del vector plasraídico circular completo se puede demostrar por PCR y análisis de hibridación Southern (figura 3) . En un punto diferente en el tiempo un segundo suceso de recombinación puede causar una inversión de la primera integración. De manera alternativa, una segunda recombinación entre otras dos secuencias flanqueantes duplicadas provoca el corte tanto de la estructura principal plasmídica como de los fragmentos duplicados lo que genera la integración de la secuencia en el plastoma (figura 2) . Utilizando los vectores de transformación de plastidios convencionales se requieren varios meses para obtener transformantes de plastidios homoplastómicos debido a que son necesarios hasta 5 ciclos de regeneración. Se requiere cierta cantidad de generaciones de células para convertir las. células heteroplastómicas en células homoplastómicas por segregación. La segregación en la configuración deseada de los plastomas es impulsada por aplicación de las condiciones selectivas.

Los vectores de esta, invención contienen un máximo de una región homologa En contraste con los métodos convencionales de transformación de plastidios, esta invención describe un - . - procedimiento para producir plantas o células vegetales transplastómicos , en el cual se introducen por lo menos dos tipos diferentes de moléculas de ADN (por ejemplo, vectores de transformación) en plastidios, de manera preferible simultáneamente. Una región homologa para dirigir la integración del plastoma es suficiente para cada uno de los vectores, preferiblemente cada vector contiene un máximo de una región homologa para dirigir la integración del plastoma. Además, cada vector contiene una secuencia de interés que preferiblemente no está presente en la planta de tipo silvestre. Las secuencias de interés de tales vectores resultarán en una secuencia de integración en la planta transplastómica que se obtenga. La secuencia de integración puede contener genes extraños tales como un gen marcador u otras secuencias de interés . El gen marcador puede ser un gen que confiera resistencia contra un inhibidor tal como un gen de resistencia a antibiótico aphA-6 o un gen de resistencia a herbicida como bar o un gen marcador- visible como GFP. Los ejemplos de las otras secuencias de interés son cualquier gen que codifique o que sea capaz de expresar una proteína útil como proinsulina, interferón, albúmina sérica bovina, factores de crecimiento humanos, péptidos que funcionen como vacunas (tales como una vacuna contra hepatitis B) o genes para enzimas técnicas. No obstante, la secuencia de integración se puede generar y también puede consistir de una supresión de secuencias de plastidios, por ejemplo con el fin de generar mutantes específicos. En el procedimiento de la invención se liberan en el plastidios por lo menos dos molécula de ADN (por ejemplo vectores) , cada uno contiene una región homologa que define el sitio de integración del plastoma. Preferiblemente, la primera o la segunda moléculas de ADN no tienen más de una región ' homologa para dirigir la integración del plastoma. De manera más preferible, ni la primera ni la segunda moléculas de ADN tienen más de una región homologa para dirigir la integración del plastoma. Esto no excluye el uso de elementos en las secuencias de interés que tengan homología por secuencias de plastoma como promotores o elementos reguladores u otras secuencias de plastidios. Si tales elementos homólogos a las secuencias de plastidios se utilizan en una secuencia de interés, en principio también pueden actuar como secuencias de integración de plastoma lo que genera sucesos de integración no deseados. Tales sucesos de integración no deseados en muchos casos pueden no ser problemáticos, por ejemplo, si no generan transformantes estables o transformantes que se puedan seleccionar por el marcador seleccionable utilizado. Además, los transformantes no deseados se pueden detectar por análisis molecular, por ejemplo de la secuencia de integración. Los elementos homólogos a las secuencias de plastidios preferiblemente son significativamente más cortos que las regiones homologas para integración del plastoma. Esta medida generalmente genera una frecuencia de recombinación significativamente menor para tales elementos homólogos en comparación con las regiones homologas . De manera alternativa, tales elementos homólogos a las secuencias de plastidios preferiblemente se toman de secuencias de plastoma que se localizan alejadas del sitio de integración deseado de la molécula de ADN para impedir los sucesos de recombinación no deseados. Por lo menos dos moléculas de vector diferentes son liberadas simultáneamente en dos o más etapas de transformación diferentes. La transformación simultánea de por lo menos dos tipos de moléculas se denomina cotransformación. Después de la cotransformación de por lo menos dos moléculas vectores, los primeros regenerados que contienen plastidios con la modificación deseada de plastoma aparecen después de aproximadamente 3 semanas de cultivo bajo condiciones adecuadas de selección y cultivo, dependiendo del método de transformación aplicado. El método de cotransformación se puede utilizar con cualquier método de transformación el cual sea adecuado para generación de transformantes de plastidios. Los ejemplos de método de transformación de plastidios adecuados son la transformación- biolística, la transformación mediada por PEG, otros métodos de transfección que utilizan agentes químicos o la tranfección de ácidos nucleicos mediada por campo eléctrico. De manera alternativa, por lo menos dos moléculas vectoras se pueden aplicar en etapas de transformación separadas. La transformación consecutiva por al menos dos etapas de transformación genera los mismos resultados de integración observados durante la cotransformación. Si se utiliza un tercer vector además de la primera y segunda moléculas de ADN, el tercer vector no necesita contener secuencia homologa alguna derivada del plastoma objetivo, en la medida en que las secuencias de interés de los vectores contengan una región de superposición suficiente para recombinación. Los mismo es válido si se utilizan más de tres vectores. Los fragmentos del gen marcador se pueden ubicar en vectores diferentes, por lo que el gen marcador se ensambla por procedimientos de recombinación.

Los vectores de esta invención permiten la generación de plantas homoplastómicas en un tiempo muy breve De manera sorprendente se ha encontrado que utilizando el método que se describe en la presente es posible recuperar transformantes de plastidios homoplastómicos después de sólo dos ciclos de regeneración. Preferiblemente, incluso es suficiente un ciclo de regeneración. En muchos casos, los regenerados recuperados después de transformación del tejido vegetal o de las células vegetales son homoplastómicos incluso sin que se lleve a cabo un ciclo de regeneración alguno . En contraste con los vectores de transformación de plastidios convencionales, es posible obtener plantas homoplastómicas después de un período muy corto de únicamente varias semanas. Por lo tanto, la invención que se describe en la presente proporciona una enorme aceleración del procedimiento y una reducción notable del trabajo que se necesita para cultivo de tejido. Los transformantes homoplastómicos no contienen ningún plastoma de tipo silvestre. La presencia de plastomas de tipo silvestre se puede supervisar por métodos tales como hibridación Southern o análisis por PCR. En el ¦ material vegetal transplastómico recuperado de regenerados primarios los cuales aparecen después de transformación de tejido o células vegetales, se realiza un análisis Southern de rutina para identificar plastomas recombinantes y para detectar los plastomas de tipo silvestre remanentes. 40% del material analizado de este regenerado primario no contiene ningún plastoma de tipo silvestre remanente. Los plastomas de tipo silvestre se pueden eliminar de los otros regenerados en únicamente una etapa de subcultivo, mientras que se necesitan hasta 5 ciclos de subcultivo utilizando vectores de transformación convencionales . En la figura 4 se describe un mecanismo hipotético para la introducción de secuencias extrañas de acuerdo con esta invención. De acuerdo con ese modelo, una de las dos moléculas vectoras la cual contiene una región homologa se recombina con la secuencia de plastoma respectiva. El suceso de recombinación homologa genera la integración del vector completo que incluye la estructura principal plasmídica. También genera una duplicación de la región homologa. Este procedimiento es reversible y puede resultar en el corte de la secuencia recombinante por recombinación homologa mediada por las regiones homologa duplicadas a menos que el procedimiento se estabilice por otro suceso de integración. Si la secuencia de integración contiene un gen marcador seleccionable el cual se puede expresar, el vector tenderá a permanecer integrado si se aplica presión selectiva. En ausencia de presión selectiva alguna, el plastoma con un vector integrado es altamente inestable. No obstante, un segundo suceso de recombinación puede generar la integración de por lo menos otra molécula. Si la otra molécula contiene otra región homologa, se puede presentar una recombinación con la región homologa respectiva del plastoma. De manera alternativa, también es posible que la recombinación esté mediada por cualquier otra secuencia repetida tal como la estructura principal del vector o la región de superposición de las moléculas. El segundo suceso de recombinación se puede presentar entre el primer vector libre y el segundo vector integrado (que se muestra en la figura 4) o entre el segundo vector libre y el primer vector integrado (que no se muestra en la figura 4) o entre el primer vector integrado y el segundo vector integrado que se localiza en moléculas de plastoma diferentes (que no se muestran en la figura 4) . Las moléculas de vector que no contienen una región de plastidio homologa se pueden recombinar únicamente con las otras secuencias repetidas. En cualquier caso, aparecerá una integración de la totalidad de la segunda molécula vector. En los casos en donde se utilizan más de dos moléculas vector, la totalidad de las moléculas se integrarán por una de las regiones homologas. Después de la integración de las diferentes moléculas en el plastoma, es posible una amplia serie de recombinaciones intramoleculares secundarias entre cualquiera de las secuencias repetidas. Como una consecuencia, se eliminará la totalidad de las regiones repetidas. El resultado final de estos diversos sucesos de recombinación es la generación de una región recombinante continua denominada como una secuencia de integración.

Los vectores de esta invención se pueden utilizar en un enfoque combinacional La expresión en.. plastidios es útil para una amplia gama de propósitos diferentes que varían desde la composición nutriente modificada hasta expresión de alto nivel de sustancias farmacéuticas en plantas . Para dicho propósito, es necesario obtener un conjunto de promotores intercambiables y elementos reguladores que difieren tanto en fuerza como en patrón de expresión. Esto permite construir vectores de expresión para propósitos diferentes (expresión débil, fuerte, constitutiva o regulada, etcétera) . Los elementos pueden ser intercambiables para modificar el nivel de expresión. Para muchos casos es favorable utilizar promotores, 5 ' -UTR y 3 ' -UTR de diferentes genes debido a que excluye las recombinaciones internas en donde el gen insertado se intercambia con un gen endógeno por medio de los 5' y 3' -UTR. Por otra parte, algunas veces los 5' y 3 ' -UTR interactúan y juntos determinan actividades de traducción. Por lo tanto, no siempre es posible calcular el efecto de una combinación particular. Los vectores modulares de esta invención contienen únicamente los elementos reguladores 51 ó 31 y permiten una manera fácil y rápida de combinar diferentes elementos reguladores y de esta manera generar el cassette de expresión deseado en la secuencia de integración. Los vectores con diferentes elementos se pueden mantener en bibliotecas y se pueden combinar a voluntad. Además, si no se conoce la combinación óptima de elementos diferentes, se puede utilizar para la transformación una mezcla de diferentes elementos reguladores sobre diferentes vectores, el cassette de - expresión con las propiedades deseadas después se obtiene por selección el transformante con las propiedades deseadas, opcionalmente seguido por análisis molecular.

Los vectores de esta invención evitan el trabajo de clonación excesivo Los vectores de transformación de plastidios convencionales habitualmente contienen un gen marcador seleccionable necesario para la selección de los transformantes, uno o más genes de interés y elementos reguladores tales como promotores, 5!-UTR, 3 ' -UTR o elementos separadores. Se necesita un esfuerzo sustancial para generar estos plásmidos altamente complejos que consisten de muchos elementos diferentes. No obstante, en diferentes vectores de transformación se utilizan muchos elementos idénticos. Utilizando el método de esta invención es posible construir un vector que contenga estos elementos idénticos, tal como una región homologa, un gen marcador de selección y elementos reguladores en una molécula. Por lo menos un vector de transformación presenta las secuencias diferentes de interés que se van a introducir en el plastoma. La combinación de la primera molécula vectora con cualquier otro vector adecuado que contenga cualquiera de las secuencias deseadas reduce la complejidad de los plásmidos y en consecuencia el esfuerzo para construir estas moléculas .

Los vectores de esta invención son más pequeños que los vectores de transformación de plastidios convencionales y por lo tanto permiten la- inserción de más secuencias de interés La construcción de vectores de transformación con frecuencia está limitada por limitaciones de tamaño de inserto. Los vectores de transformación convencionales de plastidios habitualmente contienen dos regiones homologas, un marcador seleccionable y elementos reguladores . Por lo tanto se puede introducir sólo un número limitado de secuencias adicionales. No obstante, puede ser deseable someter a ingeniería las vías metabolicas complejas en los plastidios, lo que depende de la expresión de varias enzimas diferentes . Dado que los vectores de la invención contienen menos secuencias obligatorias en comparación con los vectores convencionales, es posible insertar secuencias de interés más grandes. Además, se pueden utilizar más de dos vectores de transformación con regiones superpuestas con el fin de introducir secuencias de integración incluso más grandes las cuales se ensamblan en los plastidios.

Los vectores de esta invención evitan los problemas derivados de los ef ctos tóxicos de algunas secuencias sobre las bacterias que se utilizan para clonación La ingeniería genética puede utilizar el potencial de las plantas como fábricas autorreproducibles para la producción de una gran cantidad de sustancias orgánicas . Se ha demostrado que la producción económica y ambientalmente amigable de sustancias, enzimas, elementos de diagnóstico y terapéuticos en las plantas es posible. No obstante, en algunos casos los genes que se van a introducir en las plantas pueden tener efectos tóxicos sobre las bacterias utilizadas para clonación. En estos casos, se limita la construcción del vector de transformación. Un ejemplo de una secuencia que tiene efectos tóxicos sobre las bacterias es el gen HbsAg que codifica para el antígeno de superficie del virus de hepatitis B. La expresión del gen en plastidios vegetales puede ser deseable, debido a que constituye una fuente para una vacuna, por ejemplo contra hepatitis. No obstante, la clonación del gen completo que incluye a los elementos reguladores utilizados en vectores de transformación convencionales está limitado debido a que los elementos reguladores del plastidios también están activos en la bacteria. Utilizando los vectores de esta invención es posible dividir el cassette de expresión completo de un gen como HbsAg entre dos moléculas de manera tal que ninguno de los vectores contenga, solo, un cassette expresable. Utilizando dicho enfoque, los efectos limitantes de los genes tóxicos para bacterias se eliminan.

Los vectores de esta invención permiten la generación de plantas sin marcadores de resistencia Un método para obtener transformantes de plastidios los cuales carecen de genes marcadores de resistencia resulta altamente deseable con el fin de evitar dispersión no deseada del gen marcador al ambiente. Los vectores de transformación de plastidios convencionales habitualmente contienen un gen marcador de resistencia adecuado el cual es necesario para la selección de los transformantes. El marcador de resistencia se _ encuentra en la secuencia de integración del vector de transformación y genera una integración de plastoma estable del gen de resistencia en la planta final. Utilizando los procedimientos y vectores que se describen en esta invención es posible colocar tales genes marcadores de resistencia fuera de la unidad de secuencia que consiste de la región homologa y la secuencia de interés. Después de la transformación se produce una integración del vector de transformación completo (figura 2) lo que genera la inserción transitoria del marcador de selección en el plastoma. El suceso de recombinación genera una duplicación de la región homologa. Las células transformadas se pueden seleccionar sobre un medio que contenga el inhibidor apropiado durante esta etapa. Tan pronto como el material vegetal se transfiere a medios sin inhibidor se libera la presión selectiva para el mantenimiento de la integración del vector completo. Los sucesos de recombinación adicionales (como se describen en la figura 4) mediados por las regiones homologas duplicadas generadas previamente llevan a una eliminación del gen marcador de selección. En consecuencia, la planta final no presenta el gen marcador de resistencia para selección de los transformantes. El gen marcador de resistencia también se puede dividir en dos o más fragmentos que se superponen, cada uno localizado en un vector diferente, por lo que la resistencia es mediada únicamente si los fragmentos se recombinan hasta el gen marcador expresable completo. En algunas modalidades de la invención, se puede utilizar el empalme de intrones para procesar un transcrito primario para obtener un transcrito secundario deseado, por ejemplo para traducción correcta de una proteína de interés. Para este propósito, una parte 5' de un intrón se puede incluir en la primera secuencia de interés, y una parte 31 de un intrón se puede incluir en la segunda secuencia de interés (o viceversa) , por lo que se forma un intrón funcional ante la conformación de la secuencia de integración y la transcripción en plastidios . Tales partes de intrón 5' y 3' se pueden derivar de un intrón natural o de derivados del mismo. Los intrones autoempalmantes como los intrones del grupo I y del grupo II tienen la capacidad de empalmarse a si mismos fuera del pre-AR m. Ambos intrones, tanto del grupo I como del grupo II, son capaces de empalmarse (que incluyen el empalme trans) en sistemas artificiales (Been et al., 1986, Cell, 47, 207-216; Jacquier et al., 1986, Science, 234, 1099-1194; Jarrell et al., 1988, Mol. Cell Biol . 8, 2361-2366). El empalme trans también, se encuentra para intrones del grupo II en genes divididos de cloroplastos (Kohchi et al., 1988, Nucí. Acids Res., 3-6, 10025-10036) y para un intrón del grupo I en un gen dividido artificial en Escherichia coll (Galloway-Salvo et al., 1990, J. Mol. Biol., 211, 537-549). Los intrones del grupo I fueron descubiertos por primera vez en el AR r de Tetrahymena thermophila (Cech, T.R. , 1990, Annu. Rev.

Biochem. , 5_9, 543-568). Requieren una U en la secuencia objetivo inmediatamente 5' al sitio de separación y unen 4-6 nucleótidos en el lado 5" del sitio de separación.

Existen más de 75 miembros conocidos de este grupo hasta ahora. Se encuentran también en mitocondrias tanto de hongos como de plantas (Richard & Dujon, 1997, Curr.

Genet., 32, 175-181; Cho et al., 1998, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA, 95, 14244-14249), cloroplastos (Turmel et al. 1993, J. Mol. Biol. 232, 446-46), fago T4 (Galloway et al., 1990, J. Mol. Biol., 211, 537-549), algas verdeazules u otros organismos. Las ribozimas sometidas a ingeniería en base a los intrones de Tetrahymena del grupo I (documento de E.U.A. 6,015,794; Ayre et al., 1998, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA, 96_, 3507-3512) o el empalme trans mediado por intrón del grupo II (Mikheeva & Jarrell, 1996, Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 93, 7486-7490; E.U.A. 5,498,531) se puede utilizar para la presente invención. Ahora se describirán con detalle las modalidades preferidas de la invención.

Modalidad 1: Cotransformación de dos vectores Los plastidios se transforman simultáneamente con una primera y una segunda moléculas de ADN denominadas como vectores modulares (figura 5) . El vector 1 (la primera molécula de ADN) contiene una región homologa a una región de plastoma (primera región homologa) . La integración de las secuencias de interés se puede llevar a cabo hacia el extremo 3' de esta región de plastoma. La región homologa típicamente tiene una longitud de 500 a 1000 pares de bases. Si es deseable, también se pueden utilizar secuencias más cortas o más grandes. En el vector 1, la primera secuencia de interés se localiza hacia el extremo 3' de esta región homologa. La parte hacia el extremo 5' de la secuencia de integración está contenida en la primera secuencia de interés, hacia el extremo 3' de esta región homologa. El vector 2 (la segunda molécula de ADN) contiene una región homologa a una región de plastoma (la segunda región homologa) . La integración de secuencias de interés se puede llevar a cabo hacia el extremo 5 ' de esta región de plastoma. Esta región homologa típicamente también tiene una longitud de 500 a 1000 pares de bases. En el vector 2, la segunda secuencia de interés se localiza hacia el extremo 5' de esta región homologa. La parte hacia el extremo 3 ' de la secuencia de integración está contenida en la segunda secuencia de interés, hacia el extremo 5' de esta región homologa. En esta modalidad preferida, las dos regiones homologas de los dos vectores están presentes una cercana a la otra sobre el plastoma sin secuencias intermedias. Un - - segmento de secuencia de la región hacia el " extremo 31 de la primera secuencia de interés en el vector 1 es homologa a un segmento de secuencia de la región hacia el extremo 51 de la segunda secuencia de interés en el vector 2. Este segmento de secuencia homólogo también se denomina como región de superposición. Típicamente, este segmento de secuencia homologa tiene una longitud de 500 a 1000 pares de bases. Después de los sucesos de recombinación descritos en la invención, la cotransformación de los dos vectores resulta en una secuencia de integración continua integrada entre las dos regiones de plastoma utilizadas como regiones homologas. Típicamente, cada vector únicamente contiene una parte de la secuencia de integración. Se ha demostrado que la recombinación también se lleva a cabo con regiones homologas más grandes o más cortas, pero una longitud de 500 a 1000 pares de bases es suficiente para recombinación eficaz y se puede amplificar fácilmente con procedimientos estándar de PCR. El gen marcador para seleccionar transformantes se puede ubicar como dos fragmentos sobre los dos vectores, es decir, un fragmento sobre cada vector. El .gen marcador se puede dividir en dos fragmentos de diversas maneras . Los ejemplos no limitantes para dicha división son: a) El promotor y el 51 -UTR se localizan sobre el vector 1. La secuencia codificante se localiza sobre la - - región de superposición del vector 1 y el vector 2. El 3 ' -UTR se localiza sobre el vector 2. b) El promotor 5 ' -UTR y la parte 51 de la secuencia codificante se localizan sobre el vector 1. La parte media de la secuencia codificante se localiza sobre la región superpuesta del vector 1 y del vector 2. La parte 3' de la secuencia codificante y 31 -UTR se localizan sobre el vector 2. Si las regiones homologa sobre los vectores se seleccionan de manera que la integración de la secuencia se integra en una región de plastoma transcrita por un promotor endógeno, no es necesario incluir un promotor en la parte frontal del gen marcador. Además del gen marcador, se pueden incluir uno o varios genes adicionales de interés en las secuencia de interés del vector 1 o del vector 2 o en ambas .

Modalidad 2: Cotransformación de los genes f agmentados en dos vectores Dado que los plastidios y las bacterias tienen sistemas de expresión similares, algunas veces es difícil o incluso imposible clonar vectores de transformación de plastidios en E. coli si los genes están involucrados en los productos de gen en los cuales son tóxicos para E. coli. Este problema se resuelve al dividir tal gen en dos o más fragmentos, como se describe para el gen marcador en la modalidad 1. Sobre cada vector, el gen tóxico está presente como un. gen completo o un fragmento que no es tóxico. Los plastidios después se transforman simultáneamente con dos vectores modulares, como se describe en la modalidad 1, después de lo cual el gen completo funcional de interés se reensambla dentro de los plastidios.

Modalidad 3: Cotransformación de 3 vectores Para algunos propósitos resulta ventajoso distribuir una secuencia de integración necesaria para una transformación estable de un plastidio en 3 vectores (figura 6) . Los ejemplos no limitantes son: inserción de secuencias de integración muy largas (grupos de genes) , construcción en serie de vectores de transformación, etcétera. El vector 1 contiene una primera región homologa a la región de plastoma y una primera secuencia de interés hacia el extremo 3' de la misma. La integración de la secuencia de integración se puede llevar a cabo hacia el extremo 3' de esta región de plastoma. Hacia el extremo 31 de la primera región homologa, la parte hacia el extremo 5' de la secuencia de integración está presente en la primera secuencia de interés. El vector 2 contiene una segunda región homologa a la región de plastoma y una segunda secuencia de interés . La integración de la secuencia de integración se puede llevar a cabo hacia el extremo 5 ' de esta región de plastoma. Hacia el extremo 5' de esta región homologa, la parte hacia el extremo 31 de la secuencia de integración se present en la segunda secuencia de interés. Como se describe para la modalidad 1, las secuencias homologa típicamente tienen una longitud de 500 a 1000 pares de bases, pero no se limitan a esta longitud. El vector 3 contiene una tercera secuencia de interés, la parte hacia el extremo 5' de la cual es homólogo a la secuencia de interés del vector 1 y la parte hacia el extremo 31 es homólogo a una secuencia de interés del vector 2. El vector 3 puede o no contener la secuencia de integración completa la cual se puede integrar en el plastoma.

Modalidad 4: plantas transplastómicas sin marcador seleccionable Si el gen marcador seleccionable se localiza fuera de la región diseñada para integración, el gen marcador estará presente en los intermediarios de integración de vector completo (figura 7) . Cuando se libera la presión de selección, el gen marcado es cortado junto con las secuencias vectoras. Las secuencias de plastidios homólogos, y las secuencias , de interés se distribuyen como se describe en la modalidad 1. Contrario a la modalidad 1, el gen marcador no se incluye en- la secuencia de interés. En vez de esto, se localiza en otra parte sobre el vector 1 o el vector 2. Preferiblemente, el gen marcador se separa de la unidad que consiste de la región homologa la secuencia de interés por secuencias vectoras. Preferiblemente, el vector 1 y el vector 2 contienen cada uno un gen marcador de esta manera, por lo que estos genes marcadores son diferentes, por ejemplo aadA ' y aphAG . La selección después se lleva a cabo mediante la utilización de una combinación de los dos antibióticos respectivos, por ejemplo 500 mg/1 de espectinomicina + 25 mg/1 de canamicina. De manera alternativa un fragmento de un gen marcador se localiza en el vector 1 y el otro fragmento del gen marcador se localiza en el vector 2, por lo que ambos fragmentos están fuera de la unidad definida en lo anterior. Es un requisito entonces que ambos fragmentos compartan un segmento homólogo (una región de superposición) la cual permita la recombinación de ambos fragmentos para ensamblar un gen marcador funcional completo después de la inserción de ambos vectores en el plastoma. Dado que únicamente una fracción de los posibles sucesos de recombinación proporciona un marcador funcional, la presión de selección mantiene a los intermediarios que contienen el marcador funcional . Cuando se retira la presión de selección, el gen marcador junto con las secuencias de vector remanentes se retirarán por recombinación debido a las secuencias vectoras repetitivas.

Modalidad 5: plantas transplastómicas sin marcador seleccionable Las plantas sin marcador' de resistencia se pueden obtener mediante la utilización de vectores modulares los cuales contienen un elemento 5 ' de f ecuencia homólogo del gen marcador de resistencia sobre la primera molécula de AD y 3 ' del gen marcador de resistencia sobre la segunda molécula de ADN, mientras que el gen marcador de resistencia o un fragmento del mismo está presente sobre la primera y segunda moléculas de ADN. Después de los sucesos de recombinación que se describen en la figura 4, el gen marcador de resistencia flanqueado por dos elementos de secuencia homólogos se inserta dentro del plastoma. La presencia del marcador de selección en la secuencia de inserción se puede mantener por presión selectiva. Cuando el material vegetal se transfiere a un medio sin inhibidor, se libera la presión selectiva para el' mantenimiento del gen marcador de resistencia. Un suceso de recombinación adicional mediado por los dos elementos de secuencia homólogos puede generar el corte de un gen marcador de selección. En consecuencia, la planta final no presenta el gen marcador de resistencia utilizado para selección de los transformantes . El procedimiento de la invención preferiblemente se lleva a cabo con plantas de cosechas las cuales incluyen gimnoespermas (tales como conifera, abeto, pino, etcétera) y angioespermas . Las angioespermas son las más preferidas. Las angioespermas incluyen plantas monocotiledonias como maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, tritical, sorgo, caña de azúcar, espárrago, ajo, árboles de palma, etcétera y plantas dicotiledonia como tabaco, papa, tomate, colza, remolacha de azúcar, calabaza, pepino, melón, pimienta, especies cítricas,, berenjenas, uvas, girasol, frijol de soya, alfalfa, algodón, etcétera, las más preferidas son las solanáceas (por ejemplo papa, tomate, pimienta, berenjena y tabaco) .

EJEMPLOS Los métodos de biología molecular utilizados en esta invención son bien, conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, por Sambrook et al. (1989) molecular cloning y por Ausubel et al (1999) Short protocols in Molecular Biology.

Ej emplo 1 : Análisis por PCR de la integración del vector completo (vía un flanco) en el genoma del plastidio Transformación del Plastidio con el vector pKCZ El vector pKCZ es un vector de transformación de plastidio convencional en donde el marcador de selección se clona entre los dos flancos utilizados para recombinación homologa. El vector es designado para realizar una inserción neutra entre trnR y tra en la región repetida invertida del genoma del plastidio de tabaco (Zou, 2001) . El vector pKCZ comprende dos secuencias flanqueantes para recombinación homologa (que corresponden a las secuencias de plastoma de Nicotiana tabacum 31106-132277 y 132278-133396, de acuerdo con GenBank número de acceso Z00044) y un cassette de expresión de plastidio aadA bajo el control del promotor de ARNr 16s (koop et al., 1996) . En la figura 8 se muestra un dibujo esquemático del constructo del plásmido.

Generación de transformantes primarios y selección subsecuente para líneas homoplastómicas La transformación del plastidio mediada por pistola de partículas y la selección subsecuente se llevan a cabo como se describe en Mühlbauer et al, 2002. La selección de transformantes se basa en la resistencia a los antibióticos espectinomicina/estreptomicina, conferida por el producto del gen del aadA. Con el fin de amplificar los genomas transformados de plastidio y eliminar los genomas de tipo silvestre, los transformantes primarios (ciclo-0) se someten a varias rondas adicionales de regeneración (para explantes de hojas pequeñas) en medio selectivo que contiene espectinomicina (aquí denominado como ciclo-I, ciclo-II, etc) . - Análisis de transformantes primarios por PCR Los transformantes de plastidios (ciclo-0) se identifican por PCR utilizando ADN total aislado con el equipo DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania) . Para determinar la presencia del gen aadA, se utilizan los cebadores 0SH8I (5 ¦ -CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC-3 ' ) y 0FCH6O (5'-CACTACATTTCGCTCATCGCC-31 ) . El programa de PCR es el siguiente: 3 min a 94°C, 1 ciclo; 45 seg a 94°C, 45 seg a 55°C, 2min a 72°C, 30 ciclos; extensión final a 72°C durante 10 min. Los resultados muestran que las 48 líneas de 54 analizadas (6 hojas bombardeadas) proporcionan el producto de amplificación esperado de 504 pares de bases. Para demostrar la integración completa' del cassette aadA dentro del plastoma del tabaco se utilizaron los cebadores OSH58 (5 ' -TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3 ' ) y 0FCH6O (5 ' -CACTACATTTCGCTCATCGCC-3 ' ) . El cebador oSH58 se localiza fuera (hacia el extremo 5 ' ) el flanco derecho de pKCZ en el plastoma del tabaco y en combinación con 0FCH6O únicamente puede proporcionar el producto esperado de 2106· pares de bases ante la integración del cassette de expresión aadA entre trnR y tmN en la secuencia repetida invertida. El programa de PCR es como sigue: 5 min a 94°C, 1 ciclo; 45 seg a 94°C, 45 seg a 55°C, 3.5 min a 72°C, 35 ciclos; extensión final a 72 °C durante 7 min. La totalidad de las 48 lineas positivas por PCR para aadA muestran el producto esperado de aadA en el flanco derecho de 2106 pares de bases . Se seleccionan para análisis adicional 10 de los transformantes de ciclo- 0 (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:4, 2:5 2:6 y 2:7) .

Análisis por PCR de los transformantes que contienen vectores completamente integrados Normalmente, se considera' que la producción de transformantes de plastidios estables se produce vía dos sucesos de recombinación simultáneos que se producen entre los flancos izquierdo y derecho de la molécula transformante del plastoma ( como se muestra en la figura 1) . En la figura 2 se presenta un mecanismo alternativo. Aquí, la · integración completa del vector ocurre primero, vía recombinación con un flanco únicamente (ya sea izquierdo y derecho) con el plastoma, lo que resulta en la generación de un intermediario inestable hipotético. Los sucesos de recombinación adicionales subsecuentes después se pueden llevar a cabo entre los flancos duplicados en esta molécula para generar ya sea una situación de tipo silvestre un cassette de aadA integrado de manera estable. Con el fin de probar esta posibilidad, se realiza PCR utilizando los cebadores oSH3 (51 -GGCATCAGAGCAGATTG-31 ) Y Osh58 (5 ' -TATTCCGACTTCCCCAGAGC-31 ) . El cebador oSH3 se localiza dentro de la estructura principal del vector de pKCZ (pUC18) y el cebador oSH58 se localiza fuera (corriente abajo) del flanco derecho de pKCZ en el plastoma del tabaco. Un producto de 2638 pares de bases únicamente se puede obtener con estos dos cebadores cuando ha ocurrido la integración completa de pKCZ, como se muestra en la figura 2. No se obtendrá producto de PCR del tamaño esperado a partir del fragmento de plastoma tipo silvestre (que comprende los flancos izquierdo y derecho), dado que está ausente el sitio de unión para oSH3. El programa de PCR es como sigue: 5 min a 94°C, 1 ciclo; 45 seg a 94°C, 45 seg a 55°C, 3.5 min a 72°C, 35 ciclos; extensión final a 72 °C durante 7 min. Nueve de los 10 transformantes de ciclo-0 analizados muestran un producto de PCR de 2.6 kb, el cual puede ser consistente con la integración completa de pKCZ en el genoma del plastidio dentro de estas líneas (figura 3A) . No se observa un producto de tamaño correcto en el control de tipo silvestre o en la muestra 1:1. Dado que la integración de pKCZ resulta en la formación de un intermediario inestable, debe esperarse que con un incremento adicional en el tiempo, : los sucesos de recombinación entre los flancos duplicados en esta molécula llevarán ya sea a una situación de tipo silvestre o a un cassette aadA integrado de manera estable. Dado que tales muestras de ADN preparadas a partir del material vegetal del ciclo-I y ciclo-II se analizan por PCR con los cebadores oSH3 y oSH58. Si el modelo que se presenta en la figura 2 es correcto, la probabilidad de amplificar la banda de 2638 pares de bases con los cebadores oSH3 y oSH58 se debe reducir con cada ciclo de regeneración en la selección. Los resultados sugieren que este es en realidad el caso dado que únicamente 5 de las 10 líneas de ciclo-I analizadas proporcionan un producto PCR fuerte del tamaño esperado (figura 3B) . Además, en el ciclo-II, el número de líneas que muestran amplificación clara dé la banda esperada de 2638 pares de bases se reduce aún más. El modelo que se presenta en la figura 2 también muestra que la totalidad de las- líneas de ciclo-II las cuales son negativas para la integración completa del vector aún deben mostrar señales de PCR consistentes con un cassette aadA integrado de manera estable a los rearreglo moleculares descritos previamente. Para demostrar la intégración del cassette aadA dentro de los cebadores del plastoma del tabaco se utilizaron los cebadores oSH58 (51-TATTCCGACTTCCCCAGAGC-31 ) y Ofch60 (5 ' - CACTACATTTCGCTCATCGCC-3) . El programa de PCR es como sigue: 5 mi a 94°C, 1 ciclo; 45 seg a 94°C, 45 seg a 55°C, 3.5 min a 72 °C, 35 ciclos; extensión final a 72 °C durante 7 min. La totalidad de los 10 transformantes de ciclo-II mostraron el producto esperado aadA en el flanco derecho de 2106 pares de bases (figura 3D) lo cual puede concordar con el escenario que se muestra en la figura 2.

Ej emplo 2 : Construcción de vectores moleculares superpuestos El vector modular pICF742 (figura 9) comprende la región flanqueante derecha homologa al plastoma de tabaco, el promotor rpl32 de tabaco, el psbA-5'-UTR de tabaco y el gen marcado aadA. ' La región flanqueante derecha se . amplifica a partir del ADN de plastidio para tabaco (pares de base 132279 a 133390 del plastoma de N. tabaco) con cebadores modificantes 5' - T G G A G C T C G A A T T G C C G C G A G C A A, A G A T A T T A A ? G - . 31 y 51 -TACGAATTCAAGAGAAGGTCACGGCGAGAC-3 ' , lo que introduce un sitio de reconocimiento SacI en el extremo 51 y un sitio de reconocimiento Eco I en el extremo 3 ' . El producto de PCR se purifica y digiere con SacI y EcoRI y se liga en el plásmido pUC18 el cual se digiere con las mismas enzimas. El promotor rpl32 ' se amplifica a partir del ADN del plastidio de tabaco (pares de bases 113917 a pares de bases 114055 del plastoma de N. tabaco) con los cebadores de modificación 5 ' - GACCCTGCAGGCAAAAAATCTCAAATAGCC-31 y 5 ' -CGGGATCCGATTTTTCTTTAGACTTCGG-3 ' , lo que introduce un sitio de reconocimiento de PstI en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento BamHI en .el extremo 3'. El producto de PCR se ' reamplifica con cebadores modificantes 5 ' -CGGGATCCGATTTTTCTTTAGACTTCGG-3' y 5'- CGAGCTCCGCGGTGGCGGCCCGTCGACCCTGCAGGCAAAAAATCTC-3 ' para introducir un sitio de clonación múltiple nuevo que contiene un sitio de reconocimiento SacI en el extremo 5 ' . El producto resultante de PCR se digiere con BamHI y SacI y se liga en un vector pUC18 limitado de manera similar que contiene la región flanqueante derecha. El psbA-5'-UTR se amplifica a partir del ADN de plastidio de tabaco (complementario a las pares de bases 1598 -pares de bases 1680 plastoma de N. tabaco) con cebadores modificantes 5' -C G G G A T C C A A AA A G C C T T C C A T T T T C T A T T T - 3' y 5 ' -TTGCAGCCATGGTAAAATCTTGGTTTATT-3 ' que introducen un sitio · de reconocimiento BamHI en el extremo 5 ' y un sitio de reconocimiento en Ncol en el extremo 31. El producto de PCR se digiere con Ncol y BamHI . La secuencia de aadA de E, coli se amplifica del plásmido pFaadAII (Koop et el., 1996) con el cebador modificante 5'-TGAATTCCCARGGCTCGTGAAGCGG-3 ' y 5'- GGTGATGATGATCCTTGCCAACTACCTTAGTGATCTC-31 que introduce un sitio de reconocimiento Ncol en el extremo 51. El producto de PCR se amplifica con los cebadores 5* - T G A A T T C C C A T G G C T C G T G A A G C G G - 3' y 5' -GCTCTAGATTAGTGATGATGGTGATGATGATCCTTGCC-3 ' para introducir una etiqueta His y un sitio de reconocimiento Xbal en el extremo 31. El producto PCR se digiere con Ncol y Xbal . El vector pUC 18 que contiene la región flanqueante derecha y el promotor rpl32 se digiere con BamHI y Xbal y se liga con psbA-5'UTR digerido y el aadA digerido. El plásmido resultante se digiere con Xbal y Ndel para separar el sitio de multiclonación pUC18 remanente. El plásmido digerido se purifica en un gel de agarosa. Se extrae la banda de 4600 pares .de bases purificada y los extremos se rellenan con polimerasa lenow. El plásmido después se vuelve a ligar, lo que resulta en pICF742. El vector modular pICF743 (figura 10) comprende la región flanqueante izquierda homologa al plastoma del tabaco, el terminador de operon o¡ de E. coli y el gen marcador aadA.

El sitio de multiclonación de pUC18 entre Pael y SapI se elimina y se sustituye por un sitio' de multiclonación nuevo que consiste (desde 5" hasta 3') de BamHI , Kpnl, Xbal y Ncol. La región flanqueante izquierda se amplifica a partir del ADN del plastidio del tabaco (pares de bases 131106 a pares de bases 132277 del plastoma de N. tabaco) con cebadores modificantes 5 ' GATGGATCCTTGCTGTTGCATCGAAAGAG -3' y 5·- CACTGGTACCCGGGAATTGTGACCTCTCGGGAGAATC-31 , que introduce un sitio de reconocimiento BamHI en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento Kpnl en el extremo 31. El producto de PCR se purifica y digiere con BamHI y Kpnl y se liga en el plásmido pUC18 con un sitio de multiclonación nuevo, el cual se digiere con las mismas enzimas. El plásmido resultante se digiere con Kpnl y Xbal . El vector digerido se liga con el oligonucleótido de cadena sencilla 5 ' -GATGTCTAGAAGCAACGTAAAAAAACCCGCCCCGGCGGGTTTTTTTATACCCGTAGTAT CCCCAGCGGCCGCGGTAC-3 ' , que codifica para el terminador de operon oc de E. coli. La cadena complementaria se rellena con polimerasa Taq, se digiere con" Xbal y se vuelve a ligar. El vector resultante se digiere con Ncol y Xbal y se liga con el producto de PCR de aadA desde pICF742, lo que resulta en el vector pICF743. Se mezclan 12.5 ]ig del vector pICF742 y 12.5 ]iq del vector pICF743, se cargan en partículas de oro y se transforman en plastidios de N. tabaco mediante bombardeo por partículas, como se describe en Mühlbauer et al, 2002. La selección de transformantes' se basa en la resistencia a los antibióticos espectinomicina/estreptomicina, conferida por el producto del gen aadA. Con el fin de amplificar los genomas de plastidio transformados y de eliminar los genomas de tipo silvestre, los transformantes primarios (ciclo-0) se someten a varias rondas adicionales de regeneración (a partir de explantes de hojas pequeñas) sobre medio selectivo que contiene espectinomicina (aqui designado como ciclo-I, ciclo-II etc) . Se analizan dos callos resistentes a espectinomicina/estreptomicina del ciclo-0 mediante PCR para verificar la transformación. Se utilizan tres pares de cebadores diferentes (figura 11) : A) .5 ' -CAGACTAATACCAATCCAAGCC-31 (unión fuera la región flanqueante izquierda en el plastoma de N. tabaco) y 5 ' -CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC-3 ' (unión en el gen marcador) . B) 5 ' -CACTACATTTCGCTCATCGCC-31 (unión en el gen marcador) y 5 ' -TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3 ' (unión fuera de la región flanqueante derecha en el plastoma de N. tabaco) C) 51 -CATCAATACCTCGGTCTAG-3 ' (unión en la región ¦flanqueante izquierda) y 5 'ACACATAGATATGCCCGGTC-31 (unión en la región flanqueante derecha) . En la prueba de PCR con la totalidad de los tres cebadores muestra amplificados, lo que demuestra la integración de ambos vectores que resulta en una región integrada continua (figura 12) . Los tamaños amplificados calculados son de 2139 pares de bases (A) , 2035 pares de bases (B) y 1450 pares de bases (C) lo que coincide bien con los tamaños observados. De manera notable, no es visible una, señal de tipo silvestre (290 pares de bases) con el par cebador C, lo que indica que incluso en dicha etapa temprana no está presente el material no transformado . Después se analizan 5 callos resistentes a espectinomicina/estreptomicina a partir del ciclo-0 y ciclo-I en tres experimentos de transferencia Southerm independientes (figura 13) . Dos lineas muestran la presencia de únicamente el gen aadA integrado correcto completo (línea 1 y linea 3:3.8 kb para restricción de Bspl20I y 6.7 kb para restricción AccIII) . Una linea (línea 2) muestra el gen aadA integrado y una señal adicional (4.9 kb para la restricción Bspl20I y 3.5 kb para la restricción AccIII) que corresponde a una recombinación intermedia. Dos líneas (línea 4 y línea 5) muestran la señal de recombinación intermedia (4.9 kb para la restricción Bspl20I) y la señal de tipo silvestre (2.6 kb para la restricción Bspl20I) . Este resultado indica que dos de las 5 líneas analizadas alcanzan el estado de integración plastómico dentro de un tiempo muy corto.

Ej emplo 3 : Construcción de vectores basados en traducción modular superpuesta Los vectores basados en traducción no contienen elementos promotores propios sino que se basan en elementos promotores endógenos del plastoma hacia el extremo 5' del sitio de integración deseado. Este ejemplo presenta dos vectores modulares (pICF1033 y pICF1034) los cuales combinados sustituyen a un vector basado en traducción (pICF986) el cual no puede ser construido pese a varios intentos, debido al alto nivel de expresión en E, coli. El sitio de unión ribosómico (T7G10) utilizado media la expresión alta en plastidios así como en E. coli. Aunque los vectores no contienen elementos promotores de plastidio, la región flanqueante izquierda necesaria para recombinación homologa contiene elementos de secuencia los cuales tienen actividad promotora en E. coli. ' Contrario a pICF986 (figura 14) , los dos vectores modulares pICF1033 (figura 15) y pICF1034 (figura 16) se pueden construir sin problemas. Dado que el vector modular que contiene la región flanqueante izquierda (pICF1033) no contiene el gen completo que se va a expresar, este vector modular evita la expresión elevada problemática en E.coli.

El vector modular pICF1033 contiene la región homologa flanqueante izquierda para el plastoma de tabaco, el sitio de unión ribosómico del gen 10 del fago T7 y la parte N terminal del gen indicador uidA. La región flanqueante izquierda se amplifica a partir del ADN del plastidio de tabaco (complementario a los pares de bases 534 a las pares de bases 1336 del plastoma de N. tabaco) con cebadores modificantes 5 ' -TATAGGGCCCAGCTATAGGTTTACATTTTTACCC-31 y 51 -GTCCTGCAGTTATCCATTTGTAGATGGAGCTTCG-31 , introduciendo un sitio de reconocimiento Bspl20I en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento PstI en el extremo 31. El producto de PCR se purifica y digiere con Bspl20I y PstI y se liga en el vector pICF5001, el cual se digiere con las mismas enzimas. El plásmido pICF5001 es un derivado de pUC18 que contiene el sitio de clonación múltiple modificado 5'-GAATTCGGGCCCGTCGACCCTGCAGGCCCGGGGATCCATATGCCATGGTCTAGATGATC ATCATCACCATCATCACTAATCTAGAGAGCTCCTCGAGGCGGCCGCGGTACCATGCATG CAAGCTT-3 ' . La ligación resulta en un pICF5001 que alberga la región flanqueante izquierda. El sitio de unión ribosómico del gen 10 del fago T7 y una etiqueta de fusión N terminal que - mejora la actividad de traducción se introduce al insertar la secuencia nucleotídica sintética 5 ' -CTGCAGGATCCTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGTAATAATTTTGTTTA ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATTTCCATGG-3 ' entre el sitio PstI y Ncol de pICF5001 que alberga a la región flanqueante izquierda. El vector resultante se digiere con Ncol y HindIII. El fragmento N terminal de uidA se amplifica a partir del ADN de E. coli con cebadores modificantes 5 ' -CATGCCATGGTCCGTCCTGTAGAA-31 y 5 ' GCCAAGCTTGTACAGTTCTTTCGGCTTGTTGCCC-3 ' , que introduce un sitio de reconocimiento Ncol en el extremo 5 ' y un sitio de reconocimiento HindIII en el extremo 31. El producto de PCR se purifica y digiere con Ncol y HandIII. El producto de PCR después se inserta en el vector, se digiere con las mismas enzimas, lo que resulta en pICF1033. El vector modular pICF1034 contiene el sitio de unión ribosomico del gen 10 del fago T7, el gen indicador uidA completo, un segundo sitio de unión ribosomico sintético, el gen marcador aadA y la región flanqueante derecha . El sitio de unión ribosomico del gen 10 del fago T7 se introduce en pICF5001 como se describe en lo anterior. Se utilizan los cebadores modificantes 5'-CATGCCATGGTCCGTCCTGTAGAA-3' 5'- CTGGGTACCTTATTGTTTGCCTCCCTGCTGCG-3 ' para amplificar al gen uidA completo, mientras que se .introduce un sitio de reconocimiento Ncol en el extremo 5 ' y un sitio de reconocimiento Kpnl en el extremo 31. El producto de PCR se digiere con Ncol y Kpnl y se liga en el vector que contiene el sitio de unión ribosómico T7, y se digiere con las mismas enzimas. La secuencia aadA de E. coli se amplifica a partir del plásmido pFaadAII (COP et al., 1996) con los cebadores modificantes 5'-G G A T C C A T G C G T G A A G C G G T T A T C G C C G - 3' y 51-GGTGATGATGATCCTTGCCAACTACCTTAGTGATCTC-31. El producto de PCR se vuelve a amplificar con los cebadores modificantes 5 ' -GGGGTACCAGTTGTAGGGAGGGATCCATGCGTGAAGC-3 ' y 5 ' - GCTCTAGATTAGTGATGATGGTGATGATGATCCTTGCC-3 ' para introducir una etiqueta His y un sitio de reconocimiento Xbal en el extremo 31 y un sitio de unión ribosómico sintético en el sitio de reconocimiento Kpnl en el extremo 51. El producto de PCR se purifica y digiere con Kpnl y Xbal . La región flanqueante derecha se amplifica a partir del ADN del plastidio de tabaco (complementario a las pares de bases 155370 hast las pares' de bases 533 del plastoma para N. tabaco) con el cebador modificante 5 ' - CTAATCTAGAGAGCTCGTCTATAGGAGGTTTTGAAAAG-31 que incluye un sitio dé reconocimiento Xbal en el extremo 51 y el cebador exacto 5 ' -CCAGAAAGAAGTATGCTTTGG-31 , que se une detrás de un sitio de restricción HindIII en el plastoma de tabaco. El producto de PCR se purifica y digiere con Xbal y HandIII. El vector que contiene el sitio de unión ribosómico T7 y el gen para uidA se digiere con Kpnl y HandIII y después se liga con los dos productos de PCR (digeridos con Kpnl/Xbal resp. Xbal/HindlII) , lo que- resulta en el ector pICF1034. Se mezclan 12.5 µg del vector pICF1033 y 12.5 \ig del vector pICF1034, . se carga en partículas de oro y se transforma en plastidios de N. tabaco mediante bombardeo de partículas, como se describe en Mühlbauer et al, 2002. La selección de transformantes se basa en la resistencia a los antibióticos espectinomicina/estreptomicina, conferida por el producto del gen aadA. Con el fin de amplificar los genomas de los plastidios transformados y para eliminar los genomas de tipo silvestre, los transformantes primarios (ciclo-0) se someten a varias rondas adicionales de regeneración (a partir de explantes de hojas pequeñas) sobre medios selectivos que contienen espectinomicina (aquí designado como ciclo-I, ciclo-II etc) . la integración correcta de ambos vectores resulta en región integrada continúa dentro del plastoma de tabaco que se confirma por PCR.

Ej emplo 4 : Transfo mación de plastidios de Solanum tuberosum utilizando vectores modulares Además del tabaco, el sistema de vector modular también se puede utilizar con otras especies de cosechas importantes. Este ejemplo ilustra la transformación eficaz de plastidios en. papa {Solanum túberosum) osterior al bombardeo con partículas de microcolonias derivadas de protoplastos utilizando los vectores que se describen en el ejemplo 2. Debido al alto grado de homología entre los plastomas de tabaco y papa, los vectores que contienen secuencias flanqueantes de tabaco también se pueden utilizar para tabaco. Se hacen crecer in vitro plantas de S. túberosum, variedad Walli, como cultivos de brotes estériles (20±1°C, 16h al día, intensidad de luz de 75 ± 10 moles/m2/seg) . Los cultivos nuevos se inician cada 2 meses al transferir las puntas de los brotes (aproximadamente 2 cm de largo) a medio MS (Murashige and Skoog, 1962) en tubos de vidrio (2.5 x 20 cm) . Las hojas expandidas completamente jóvenes se seleccionan de plantas de 3-4 semanas de edad y se utilizan para el aislamiento de protoplastos. Las hojas se cortan en tiras de 1 rara con un bisturí y se preplasmolisan en 10 mi de medio MMM-550. El medio MM-550 contiene 4.066 g/1 ' de MgCL26H20, 1.952 g/1 de ácido 2- (N-morfolino) etansulfónico (MES) y -86 g/1 de manitol (ajustado a 550 mOsm y pH 5.8) . Después de 1 hora de incubación en la oscuridad, el MMM-550 se separa y se sustituye con 10 mi de medio MMS-550 que contiene 0.4% de p/v Macerozyme RIO y.0.4% de Cellulase RIO. El medio MMS-550 contiene 4.066 g/1 de MgCL2-6H20, 1.952 g/1 de MES y -150 g/1 de sacarosa (ajustado a 550 mOsm y pH 5.8).Los explantes de hoja -en solución de enzimas se incuban durante 16 horas en la oscuridad a 25°C, sin agitación. Al siguiente día, la digestión se filtra a través de tamiz de 100 µp? en un tubo de - centrífuga y después se superpone cuidadosamente con 2 mi de medio MMM-550 y se centrífuga (10 min, 70 X g) Los protoplastos intactos se recolectan de la banda en el limite y se lavan una vez al resuspenderlos en 10 mi de medio de cultivo de protoplasto de papa seguido por centrifugación (10 min, 59xg) . El medio de cultivo de protoplasto contiene 133.75 mg/1 de H4CL, 950 mg/1 de N03, 220 mg/1 de CaCl22H20, 185 mg/1 de MgS07H20, 85 mg/1 de K¾P0 , microelementos B5 (Gamborg et al. 1968), MS Fe-EDTA (Murashige and Skoog, 1962), 100 mg/1 de mio-inositol , 100 mg/1 de glutamina, 100 mg/1 de hidrolizado de caseína, 1 mg/1 de ácido nicotínico, 10 mg/1 de clorhidrato de tiamina, 1 mg/1 de clorhidrato de piridoxina, 250 mg/1 de xilosa, 975 mg/1 de MES, 2 mg/1 de ácido naftalenacético ( NAA) , 02. mg/1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 0.5 mg/1 de 6-bencilaminopurina (BAP) y -94 g/1 de glucosa (ajustado a 550 mOsm y pH 5.8) . Los protoplastos se cuentan y resuspenden a 2x de la densidad de siembra en placa final requerida en medio de cultivo de protoplastos (2.0 x 105/ml) y se mezclan con un volumen igual de 1.2% p/v de ácido alginico preparado en medio MMM-550. El cultivo de la capa de alginato delgada en rejillas de polipropileno se realiza como se describe en Dovzhenko et al (1998) . Después de la solidificación de la matriz de alginato, las rejillas se cultivan en cajas de petri de 5cm que contiene 2 mi de medio de cultivo de protoplastos . Los protoplastos se incuban durante un día en la oscuridad (26±1°C) y después se transfieren a un cultivo estándar en condiciones ambientales para desarrollo adicional (26±1°C, 16h de día intensidad de luz 75±10 pinoles/m2/seg) . De 12 a 15 días . después* de remojar las rejillas que contienen microcolonias de papas (aproximadamente ' 8 células) se transfieren a cajas de 9 cm que contiene medios SH-1 solidificado con Gelrite 0.4% p/v. El medio SH-1 contiene 267.5 mg/1 de NH4CL, 1900 mg/1 de K 03, 440 mg/1 de CaCl22H20, 370 mg/1 de MgS04 7H20, 170 mg/1 de KH2P04; microelementos MS y Fe-EDTA (Murashige and Skoog, 1962) , vitaminas Nitsch (Nitsch and Nitsch, 1969) , 40 mg/1 de sulfato de adenina, 100 mg/1 de hidrolizado de caseína, 975 mg/1 de MES, 0.1 mg/1 de NAA) , 05 mg/1 de BAP, 10 mg/1 de sacarosa y 50 g/1 de manitol (ajustado a pH 5.8) . Dos días después de realizar el plantado sobre el medio sólido, se bombardea a las colonias derivadas de protoplastos con alícuotas de oro cargadas con 12.5 g de vector pICF742 y 12.5 de vector pICF743 utilizando las condiciones de recubrimiento con partículas y bombardeo descritas en ühlbauer et al. (2002) . La construcción de los vectores modulares pICF742 y plCF743 han sido descrita previamente (ejemplo 2) . La selección de transformantes se basa en la resistencia al antibiótico espectinomicina, conferida por el producto del gen aadA. Un día después del bombardeo, las rejillas se transfieren a recipientes que contiene medio SH-1 solidificado con Gelrite + 500 mg/1 de espectinomicina y se subcultivan cada 3 semanas a cajas, de selección nuevas. Los plastidios transformantes se observan como microcolonías verdes después de 8-12 semanas de selección (los tejidos no transformados se blanquean en medio SH-1 que contiene espectinomicina) . Se transfieren colonias individuales (aproximadamente 1 mm de diámetro) a recipientes de 5 cm que contiene medio SH-1 + 100 mg/1 de espectinomicina. Para la generación de los callos (de aproximadamente 5 mm de diámetro) se transfieren a medio SH-2 solidificado con Gelrite 0.4% p/v que contiene 100 mg/1 de espectinomicina. El medio SH-2 es idéntico al medio SH-1 (véase antes), excepto que el NAA se sustituye por 0.1 mg/1 de ácido indol-3-acético (IAA) , BAP se sustituye por 1 mg/1 de zeatina y el contenido de manitol se reduce de 50g/l a 36 g/1. Los brotes se retiran de los callos regeneradores después de 6-8 semanas de cultivo en medio SH-2 y estos se transfieren a medio Ms libre de antibiótico para generación de raíces y desarrollo posterior. Los brotes de papa resistente a espectinomicina se analizan por PCR para verificar la transformación correcta de los plastidios. Se utilizan tres pares de cebadores diferentes como se describe para el análisis de transformantes de tabaco (ejemplo 2) : A) 5 * -CAGACTAATACCAATCCAAGCC-3 ' (unión fuera la región flanqueante izquierda dentro del plastoma de S. tujberosum) y 5 ' -CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC-3 ' (unión dentro del gen marcador aadA) . B) 5 ' -CACTACATTTCGCTCATCGCC-31 (unión en el gen marcador aadA) y 5 ' -TATTCCGACTTCCCCAGAGC-3 ' (unión fuera de la región flanqueante derecha dentro del plastoma de S. tujberosum) C) 5 ' -CATCAATACCTCGGTCTAG-3 ' (unión dentro de la región flanqueante izquierda) y 51ACACATAGTATGCCCGGTC-3 ' (unión dentro de la región flanqueante derecha) . La integración correcta de ambos vectores resulta en una región integrada continúa dentro del plastoma de papa se muestra por PCR utilizando tres pares de cebadores descritos antes.

REFERENCIAS : Koop et al., 1996, Planta 199, 193-201 Dovzhenko, A., Bergen, U. & Koop, H.U. Thín-alginate-layertechnique for protopalst culture of tpbacco leaf protoplasts: shoot formation in less than two weeks. Protoplasma 204, 114-118 (1998). Galvin S. B., 1998, Curr. Opln. Biotechnol., 9, 227-232. Gamborg, O.L., Miller, RA & Ojima, K. Nutrient requirements of suspensión cultures of soybean root celia. Exp Ce// Res 50, 151-158 (1968). Gray M. W., Origin and Evolution of Plastid Genomes and Genes, in: Bogorád L. and Vasil I. K. (eds.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Volume 7A, Academic Press, San Diego, 991. Heifetz, P., 2000, Bfochlmfe, 82 , 655-666. Huang F.-C, Klaus S., Herz S., Koop H-U., Goids T., 2002, MGG, in press. lamtham and Day, 2000, Nal Biotechnol., 18,1 72-1176. Nitsch, J.P. and Nitsch, C. Haploid plants from pollen grains. Science 169, 85 (1969). Marechal-Drouard L., Kuntz M., Weil J. H., tRNAs and tRNA Genes of Plastids, in: Bogorad L. and Vasil I. K. (eds.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Volume 7A, Academic Press, Sah Diego, 1991. Mühlbauer S., Lossl A., Tzekova L, Zhou Z., Koop H.-U., 2002, PlantJ. 32, 75- 84 (2002). Murashige, T. & Skoog, F. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol Plant 15, 473-497 ( 962). Palmer J. D., Plastid Chromosomes: Structure and Evolution, in: Bogorad L. and Vasil I. K.(eds.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Volume 7 A, Academic Press, San Diego, 1991. The Arabidopsis Ganóme Initiative, 2000, Natura, 408, 796-815. Svab, Z., Hajduklewicz, P., and Maliga, P., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530. Zou ., 2001, PhD thesis, Ludwig- aximilians-Universitat, Munich, Alemania. US5877402 US5451513 - '

Claims

- 84 - REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para generar plantas transgénicas o células vegetales transformadas en su plastoma, que comprenden: (a) introducir en los plastidios vegetales una primera molécula . de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN contiene una primera región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma en un primera secuencia de interés, y la segunda molécula de ADN contiene una segunda región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma y una segunda secuencia de interés, por lo que un segmento de secuencia de la primera secuencia de interés es homólogo a un segundo segmento de la segunda secuencia de interés, y (b) seleccionar transformantes que tengan una secuencia de integración integrada establemente en el plastoma, por lo que la secuencia de integración contiene por lo menos una porción de la primera y por lo menos una porción de la segunda secuencia de interés, como una secuencia continua.

2. El procedimiento como se describe en la reivindicación 1, en donde la primera y segunda molécula de ADN se introduce en los plastidios vegetales por cotransformación,

3. El procedimiento como se describe en la - 85 - reivindicación 1 6 2, en donde la primera y la segunda secuencia de interés- son diferentes.

4. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada una de la primera y segunda secuencia de interés contienen una secuencia adicional además del segmento de secuencia.

5. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde se introducen una o más moléculas de ADN adicionales dentro de los plastidios vegetales además de la primera y segunda moléculas de ADN, por lo que una o varias de las moléculas de ADN adicionales comprende una o varias secuencias adicionales de interés."

6. El procedimiento como ' se describe en la reivindicación 5, en donde una molécula de ADN adicional contiene un segmento de secuencia homólogo a un segmento de secuencia de la primera secuencia de interés y un segmento de secuencia homólogo a la segunda secuencia de interés.

7. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la primera, la segunda o una secuencia adicional de interés contiene uno o más genes de interés o fragmentos de un gen de interés.

8. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde un gen - 86 - de interés se divide en dos o más fragmentos y en donde la primera, la segunda o una secuencia adicional de interés contiene un fragmento de gen de interés, por lo que el gen de interés es ensamblado desde dos o más fragmentos ante la formación de una secuencia de integración.

9. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera secuencia dé interés contiene una parte 5 ' de un gen de interés y la segunda secuencia de interés contiene una parte 3' de un gen de interés, y la secuencia de integración contiene un gen de interés de manera tal que pueda ser expresado.

10. El procedimiento como se describe en la reivindicación 9 , en donde la expresión del gen de interés incluye empalme trans de ARN.

11. El procedimiento como se describe en la reivindicación 9, en donde la primera secuencia de interés contiene hacia el extremo 51 de la parte 5 ' del gen de interés un elemento de secuencia homólogo a un elemento de secuencia que se localiza hacia el extremo 3 ' de la parte 3' del gen de interés de la segunda secuencia de interés, por lo que los elementos de secuencia permiten el corte por recombinación homologa de una parte de la secuencia de integración que comprende a la parte 5' o 3' del gen de interés. - 87 -

12. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el gen de interés es un gen marcador seleccionable .

13. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 , en donde la primera o segunda molécula de ADN contiene un gen marcador seleccionable fuera de una unidad de secuencia que consiste de la región homologa a una región del plastoma y la secuencia de interés, para permitir la pérdida de dicho gen marcador.

14. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el gen marcador seleccionable se divide en un primero y un segundo fragmentos, por lo que el primer fragmento se incorpora en la primera molécula de ADN fuera de una primera unidad de secuencia, y el segundo fragmento se incorpora en la segunda molécula de ADN fuera de una segunda unidad de secuencia, por lo que la primera unidad de secuencia consiste de la primera región homologa y la primera secuencia de interés, y la segunda unidad de secuencia consiste de la segunda región homologa y la segunda secuencia de interés .

15. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el gen marcador seleccionable es aphA-6. - 88 -

16. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la primera molécula de ADN contiene únicamente una región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma .

17. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la primera y segunda molécula de ADN contienen cada una solo una región homologa a una región del plastoma para dirigir la integración del plastoma.

18. El procedimiento como se describe en cualquiera délas reivindicaciones 1 a 17, en donde la primera y segunda regiones homologas juntas corresponden a una secuencia continua del plastoma que se va a transformar.

19. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde las plantas transgénicas homoplastómicas se regeneran a partir de los transformantes.

20. Un equipo de partes, que comprende una primera y una segunda moléculas de ADN, como , se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. La molécula de ADN para transformación de plastidios que contiene una región homologa a una región de un plastoma para dirigir la integración de plastoma y una - 89 - secuencia de interés .

22. Una biblioteca de moléculas de ADN, como se describe en la reivindicación 21, en la que cada una de las moléculas de ADN contiene una secuencia de interés diferente.

23. Una planta o células vegetales transformadas con las moléculas de ADN del equipo de partes, como se describe en la reivindicación 20, o con la molécula de ADN como se describe en la reivindicación 21.

24. Una planta, célula vegetal o semillas que se obtienen de acuerdo con el procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 19.