JP4384037B2 - モジュラーベクターを使用するプラスチド形質転換 - Google Patents
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Classifications
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Description
一般的な分子クローニング技術の発展に伴って、高等植物を形質転換により遺伝的に修飾することがすぐに可能になった。植物形質転換の主たる力点がこれまで核の形質転換にあり、依然としてそうであるのは、大部分の遺伝子、シロイヌナズナの場合、約26,000個は、その完全配列が最近公表されたが(シロイヌナズナ・ゲノム・イニシアチブ計画2000)、細胞の核に見出されるからである。核の形質転換を効率的に可能にするように修飾し得る、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのような生物学的ベクターが利用可能だったので、核の形質転換は達成することがより容易であった(Galvin、1998)。さらに、外来核酸にとって核がより直接的にアクセス可能であるのに対し、小器官は2層の包膜により囲まれていて、一般的に言えば、DNAのような大分子を通さない。
本発明のさらなる目的は、モジュラー形式で使用可能であり、それによりクローニング作業とプラスミド分子の全体サイズを減らせるベクターを提供することである。
本発明のさらなる目的は、耐性マーカー遺伝子を最終の植物又は植物細胞に持ち込まない形質転換体の産生を可能にする方法を提供することである。
上記目的は、そのプラストムで形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生する方法により達成され、前記方法は:
(a)第1のDNA分子と第2のDNA分子を植物プラスチドへ導入すること
[ここで、前記第1のDNA分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第1領域と第1の目的配列を含有し、前記第2のDNA分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第2領域と第2の目的配列を含有し、それによって、前記第1の目的配列の配列セグメントは、前記第2の目的配列の配列セグメントと相同になる]、及び
(b)組込み配列がプラストムに安定的に組み込まれている形質転換体を選択すること[それによって、前記組込み配列は、前記第1の目的配列の少なくとも一部と前記第2の目的配列の少なくとも一部を連続配列として含有する]
を含む。好ましい態様を従属項により明確化する。
上記のように、前記第1の目的配列が前記組込み配列へマーカー遺伝子の断片を提供し、前記第2の目的配列が前記マーカー遺伝子の別の断片を提供する場合があり、それによって、前記断片を前記組込み配列において機能的なマーカー遺伝子へ組み合わせる。好ましくは、前記第1の目的配列がマーカー遺伝子の5’部分を含有し、前記第2の目的配列が前記マーカー遺伝子の3’部分を含有する。従って、前記組込み配列は、前記マーカー遺伝子を、それが発現し得るように含有することができる。この態様は、両方のベクターの組込みの選択と前記組込み配列を形成する組換えを可能にする。
本明細書に記載の方法は、遺伝子若しくは調節配列のような目的配列を導入すること、又は点突然変異、挿入又は欠失のような突然変異をプラストムへ導入することに適用することができる。
本方法は、重複配列がある無制限数の形質転換ベクターを使用し得るので、導入すべき配列の数又はサイズに関するどんな制限からもプラスチド形質転換を解放する。
本方法は、形質転換体を産生するために適用することができ、それによって最終植物は、いかなる耐性マーカー遺伝子も保有しない。
3’−UTR:(→)コード領域の下流にある、転写されるが翻訳されない(→)遺伝子の領域;
5’−UTR:(→)コード領域の上流にある、転写されるが翻訳されない(→)遺伝子の領域;(→)プラスチド(→)遺伝子において、5’−UTRは、その3’端の近傍に翻訳開始のための配列情報(リボソーム結合部位、(→)RBS)を含有する。
aphA−6:細菌アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼA−6の(→)コード領域、抗生物質の(→)選択阻害剤:カナマイシンを解毒化するタンパク質である;
葉緑体:葉緑素を含有する(→)プラスチド;
コード領域:a)ポリペプチドのアミノ酸配列、又はb)機能性RNAのヌクレオチドについての情報を含有するヌクレオチド配列;コード領域は、1以上の(→)イントロンにより随意に中断される;
フランク、フランキング領域:慣用の(→)プラスチド(→)形質転換(→)ベクター中のインサートの5’端及び3’端のDNA配列であり、フランク間の配列の2重逆位(→)相同的組換えによる標的(→)プラストムへの組込みを仲介する。同じ機序により、種々の配列を修飾するか又は、標的(→)プラストムより除去することができる。このように、(→)プラスチド(→)形質転換(→)ベクターのフランクにより、標的(→)プラストム中の変化が(→)形質転換によりどこで産生されるかが決定される;
遺伝子発現:配列情報を機能へ変換するプロセス;ポリペプチドをコードする(→)遺伝子では、遺伝子発現は、RNAポリメラーゼ活性を始動して指令する(→)プロモーター活性を必要とし、それがメッセンジャーRNAの形成をもたらし、続いて、ポリペプチドへ翻訳される;RNAをコードする(→)遺伝子では、(→)プロモーター仲介性のRNAポリメラーゼの活性により、コードされたRNAが産生される;
遺伝子:機能、例えば発現を独立して確保するのに必要とされるすべての要素をコードするヌクレオチド配列;遺伝子は、少なくとも1つの完全な(→)コード領域を含有する(→)オペロンにおいて組織され;ポリペプチドをコードする(→)遺伝子では、これらの要素は:(1)(→)プロモーター、(2)5’非翻訳領域((→)5’−UTR)、(3)完全な(→)コード領域、(4)3’非翻訳領域((→)3’−UTR)であり;RNAをコードする(→)遺伝子では:(→)5’−UTRと(→)3’−UTRが欠落し;1より多い(→)コード領域から成る(→)オペロンでは、2つの続いた完全な(→)(→)コード領域が(→)スペーサーにより分離されて、(→)プロモーター、(→)5’−UTR、及び(→)3’−UTRの要素は、その(→)オペロンの(→)コード領域により共有され;遺伝子の断片は、遺伝子の上記に列挙した要素の少なくとも1つを完全に又は一部失っている;
目的遺伝子:修飾されるか又は新たに導入される配列:(→)形質転換の試みの目的;
ゲノム:細胞の核又は細胞小器官の完全なDNA配列;
GFP:グリーン蛍光タンパク質
相同的組換え:(→)ゲノム中の標的部位に対して十分な配列相同性のある1以上の(→)フランクの存在により、配列の交換、挿入又は欠失をもたらす方法;
イントロン:(→)コード領域を中断する配列
オペロン:プロモーターを共有するいくつかの(→)遺伝子の組織構造;
植物:その(それらの)細胞中に(→)プラスチドを含有する生物;本発明は、特に、多細胞(→)植物に関する;これらには、裸子植物(マツ、トウヒ及びモミ等のような)と被子植物(単子葉類作物のトウモロコシ、小麦、大麦、コメ、ライ麦、ライコムギ、サトウモロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシの木等と非作物の単子葉類、そして双子葉類作物のタバコ、ジャガイモ、トマト、ナタネ、サトウダイコン、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、柑橘類、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタ等と非作物の双子葉類のような)の群、並びにシダ、苔綱コケ、蘚綱コケ、及び多細胞の緑藻、紅藻及び褐藻が含まれる;
プラスチド:それ自身の遺伝機構のある、(→)植物細胞中の小器官であり、機能的及び形態学的に様々な異なる形態で存在する。例えば、アミロプラスト、(→)葉緑体、有色体、黄色体、老化体(gerontoplasts)、白色体、原色素体等;
プラストム:(→)プラスチドの完全なDNA配列;
プロモーター:転写の開始及び調節に機能するヌクレオチド配列;
RBS、リボソーム結合部位:(→)コード領域の(→)翻訳開始コドンの上流にあるDNA配列因子であり、リボソーム結合と各RNA転写物からの翻訳開始を仲介する;RBS要素は、(→)5’−UTR又は(→)スペーサーのいずれかの部分である;
選択阻害剤:形質転換されていない細胞又は小器官の増殖及び発達を、形質転換されたものより強く抑制する化学化合物;
目的配列:修飾されるか又は新たに導入されるあらゆる長さの配列:(→)形質転換の試みの目的;配列の導入が企図されていない場合、目的配列の長さは0であってよく、即ち、目的配列を有さないことが目的になり得る。本発明において、ベクターとして使用するDNA分子の目的配列は、ベクターとして使用する他のDNA分子の配列セグメントに相同な少なくとも1つの配列セグメントを有する;
形質転換ベクター:(→)ゲノムの(→)形質転換を仲介するために産生した、クローニングされたDNA分子;
形質転換:少なくとも1つの(→)形質転換ベクターの使用が含まれる、(→)植物又は植物細胞の処理によりDNA配列の導入、切除又は修飾をもたらす方法;
トランス遺伝子:ある(→)ゲノムに由来して、他のゲノムへ導入されるDNA配列;
uidA:頻繁に使用されるレポータータンパク質である、細菌β−グルクロニダーゼの(→)コード領域。
慣用のプラスチド形質転換ベクターを使用するとき、ホモプラストミック形質転換体を達成するには多数の再生サイクルが必要とされる
慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常組込み配列を含有し、野生型植物には存在しない、選択可能マーカー遺伝子、1以上の目的遺伝子、並びにプロモーター、5’−UTR、3’−UTR又はスペーサー要素のような調節因子を含有する。このベクターにおいて、組込み配列には、標的化プラストムに相同であり、それによりプラストム組込みの位置を指令する2つの配列が隣接する。組込み領域の標的プラストムへの挿入は、2重逆位相同的組換えイベントにより達成される。簡略モデルは、各フランクで1つのイベントという2つの相同的組換えイベントを介して組込みが起こることを示唆する(図1)。しかしながら、実際の分子プロセスはモニターすることが困難で、種々の中間体が関与してより複雑であるかもしれない。我々の研究室で得た実験データは、2つのフランクの1つにより仲介される第1の組換えイベントが形質転換ベクター全体の組込みをもたらし、それによりフランキング配列が重複することを示唆する(図2)。実際、環状プラスミドベクター全体の組込みをPCRとサザンハイブリダイゼーション解析により証明することができた(図3)。異なる時点で、第2の組換えイベントは、第1の組込みの逆転を引き起こすこともある。あるいは、2つの他の重複フランキング配列間の第2の組換えが、プラスミド骨格と重複断片の切除を引き起こし、組込み配列をプラストム中に残す(図2)。
慣用のプラスチド形質転換法とは対照的に、本発明は、少なくとも2つの異なるタイプのDNA分子(例えば形質転換ベクター)を、好ましくは同時に、プラスチドへ導入する、トランスプラストミック植物又は植物細胞を産生する方法を開示する。プラストム組込みを指令するには、前記ベクターのそれぞれについて1つの相同領域で十分であり、好ましくは、各ベクターは、プラストム組込みを指令する1以下の相同領域を含有する。さらに、各ベクターは、好ましくは野生型植物に存在しない目的配列を含有する。前記ベクターの目的配列は、入手されるトランスプラストミック植物において組込み配列をもたらすであろう。
本発明のベクターは、ホモプラストミック植物の産生をごく短時間で可能にする
驚くべきことに、本明細書に記載の方法を使用すると、わずか2サイクルの再生後でホモプラストミックなプラスチド形質転換体を回収することが可能であることがわかった。好ましくは、1回の再生サイクルでも十分である。多くの場合、植物組織又は植物細胞を形質転換した後に回収した再生物は、再生サイクルを実施せずとも、ホモプラストミックである。慣用のプラスチド形質転換ベクターとは対照的に、わずか数週間というごく短期間の後でホモプラストミック植物を得ることが可能である。故に、本明細書に記載の本発明は、莫大なプロセスの加速化と組織培養に必要とされる作業の劇的な軽減を提供する。
プラスチドにおける発現は、植物における栄養組成物の改変から医薬品の高レベル発現に及ぶ広範囲の様々な目的に有用である。その目的のためには、強度や発現様式において異なる相互交換可能なプロモーターと調節因子のセットを入手することが必要である。このことにより、様々な目的(弱い、強い、構成的、又は調節された発現、等)のために発現ベクターを構築することが可能になる。その要素は、発現レベルを改変するために相互交換可能であるべきである。多くの事例において、様々な遺伝子由来のプロモーター、5’−UTR及び3’−UTRを使用することが好ましいのは、挿入された遺伝子が同一の5’−UTR及び3’−UTRを介して内因性遺伝子と交換される内部の組換えが排除されるからである。一方、5’−UTR及び3’−UTRは、時々相互作用して、一緒に翻訳活性を決定する。故に、特別な組合せの効果を推定することは、必ずしも可能ではない。5’調節因子又は3’調節因子のみを含有する本発明のモジュラーベクターは、様々な調節因子を組み合わせる容易で迅速な方法を可能にし、組込み配列において所望の発現カセットを産生する。様々な要素のあるベクターは、ライブラリー中に保存して随意に組み合わせることができる。さらに、様々な要素の最適な組合せが知られていない場合、様々なベクター上の様々な調節因子の混合物を形質転換に使用してよい。次いで、所望の特性のある形質転換体の選択と、それに続く随意の分子解析により、所望の特性のある発現カセットを入手する。
慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常、形質転換体の選択に必要とされる選択可能マーカー遺伝子、1以上の目的遺伝子、及びプロモーター、5’−UTR、3’−UTR又はスペーサー要素のような調節因子を含有する。多くの異なる要素から成るこれらのきわめて複雑なプラスミドを産生するには、実質的な努力を必要とする。しかしながら、異なる形質転換ベクターでは、多くの同一の要素を使用する。本発明の方法を使用して、相同領域、選択マーカー遺伝子及び調節因子のようなこれらの同一要素を1つの分子に含有するベクターを構築することが可能である。この少なくとも1つの他の形質転換ベクターは、プラストムへ導入される様々な目的配列を担う。第1のベクター分子を所望の配列のいずれかを含有する他の適切なベクターと組み合わせることによって、プラスミドの複雑性と、結果的にこれらの分子を構築するための努力が軽減される。
形質転換ベクターの構築は、挿入サイズの限界によりしばしば制限される。慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常、2つの相同領域、選択可能マーカー、及び調節因子を含有する。それ故、ごく限定された数の追加配列しか導入し得ない。しかしながら、プラスチドにおいて複雑な代謝経路を操作することが望ましい場合があり、それはいくつかの異なる酵素の発現に依存する。本発明のベクターは、慣用のベクターよりも必須配列の含有が少ないため、より長い目的配列を挿入することが可能である。さらに、ずっと大きな組込み配列を導入してプラスチド中で組み立てるためには、重複領域のある2つより多い形質転換ベクターを使用してもよい。
遺伝子工学は、莫大な数の有機物質を産生するための自己増殖可能な工場として植物の潜在能力を使用することができる。酵素、診断薬又は治療薬のような物質の植物における経済的で環境に優しい生産が可能であることが示されている。
耐性マーカー遺伝子を欠くプラスチド形質転換体を入手する方法は、マーカー遺伝子の環境への望ましくない拡散を防ぐために、きわめて望ましい。慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常、形質転換体の選択に必要である好適な耐性マーカー遺伝子を含有する。この耐性マーカーは形質転換ベクターの組込み配列に位置しており、この耐性遺伝子の最終植物における安定したプラストム組込みをもたらす。
態様1:2つのベクターの同時形質転換
モジュラーベクターと呼ぶ前記第1のDNA分子及び前記第2のDNA分子でプラスチドを同時に形質転換する(図5)。ベクター1(前記第1のDNA分子)は、プラストム領域に相同な1つの領域(前記第1相同領域)を含有する。目的配列の組込みは、このプラストム領域の下流で起こるべきである。この相同領域は、典型的には長さ500〜1000bpである。所望により、より短い配列又はより長い配列を使用してもよい。ベクター1では、第1の目的配列がこの相同領域の下流に位置する。組込み配列の上流部分は、この相同領域の下流で第1の目的配列に含まれる。
a)プロモーターと5’−UTRをベクター1に位置づける。コード配列をベクター1及びベクター2の重複領域に位置づける。3’−UTRをベクター2に位置づける。
プラスチドと細菌は同様の発現系を有するため、プラスチド形質転換ベクターを大腸菌においてクローニングすることは、その遺伝子産物が大腸菌にとって有毒な遺伝子が関与する場合、時に困難であるか又は不可能ですらある。この問題は、態様1のマーカー遺伝子について記載されるように、このような遺伝子を2以上の断片へ分断することによって解決する。従って、有毒な遺伝子は、不完全な遺伝子として、又は非毒性の断片として、各ベクター上に存在する。次いで、態様1に記載のように、プラスチドを2つのモジュラーベクターで同時に形質転換すると、そのとき、機能上完全な目的遺伝子がプラスチド内に再構築される。
いくつかの目的では、安定なプラスチド形質転換に必要な組込み配列を3つのベクターに分配することが有利である(図6)。非限定的な例は:非常に長い組込み配列(例えば遺伝子クラスター)の挿入、形質転換ベクターの連続構築、等である。
選択可能マーカー遺伝子が組込みのために設計された領域の外側に位置する場合、マーカー遺伝子は、完全なベクター組込み中間体中に存在するであろう(図7)。選択圧を解除するとき、マーカー遺伝子はベクター配列とともに切除される。相同プラスチド配列と目的配列は、態様1に記載のように配置する。態様1とは反対に、マーカー遺伝子は目的配列中に含まれない。その代わり、それはベクター1又はベクター2のどこかに位置する。好ましくは、ベクター配列によって、相同領域と目的配列から成る単位からマーカー遺伝子を分離する。好ましくは、ベクター1とベクター2は、それぞれこの形式でマーカー遺伝子を含有し、それによってこれらのマーカー遺伝子は異なる(例えば、aadAとaphA6)。次いで、2つのそれぞれの抗生物質、例えば、500mg/lのスペクチノマイシン+25mg/lのカナマイシンの組合せを使用することによって選択を行う。あるいは、マーカー遺伝子の断片をベクター1に位置づけ、マーカー遺伝子の他の断片をベクター2に位置づけ、それによって両方の断片を上記に定義した単位の外側にする。このとき、両方の断片が相同セグメント(重複領域)を共有し、両方の断片の組換えにより、両ベクターのプラストムへの挿入後に完全な機能性マーカー遺伝子を組み立てることを可能にすることが先行条件である。可能な組換えイベントのごく一部だけが機能性マーカーを生ずるため、選択圧により、前記機能性マーカーを含有する中間体が維持される。選択圧が除かれるとき、マーカー遺伝子は、残存するベクター配列とともに、反復ベクター配列による組換えによって除去されるだろう。
第1のDNA分子上の耐性マーカー遺伝子の5’と第2のDNA分子上の耐性マーカー遺伝子の3’に相同配列因子を含有する一方で、前記第1のDNA分子及び前記第2のDNA分子上に耐性マーカー遺伝子又はその断片が存在するモジュラーベクターを使用することによって、耐性マーカーを含まない植物を入手することができる。図4に記載の組換えイベントの後で、2つの相同配列因子が隣接した耐性マーカー遺伝子をプラストムへ挿入する。選択マーカーの挿入配列中での存在は、選択圧によって維持することができる。この植物材料を阻害剤を含まない培地へ移したとき、耐性マーカー遺伝子を維持するための選択圧が解除される。2つの相同配列用により仲介されるさらなる組換えイベントにより、選択マーカー遺伝子の切除をもたらすことができる。結果として、最終植物は、形質転換体の選択に使用した耐性マーカー遺伝子を担わない。
プラスチド形質転換ベクター:pKCZ
pKCZは、慣用のプラスチド形質転換ベクターであり、選択マーカーが相同的組換えに使用する2つのフランクの間でクローニングされる。タバコのプラスチドゲノムの逆反復領域中のtrnRとtrnNとの間で中間挿入をするように、ベクターを設計する(Zou、2001)。pKCZは、相同的組換えのための2つのフランキング配列(GenBank受入番号Z00044のNicotiana tabacumのプラストム配列:31106〜132277と132278〜133396に対応)と、16S rRNAプロモーターの制御下にあるaadAプラスチド発現カセット(Koopら、1996)を含む。このプラスミド構築体の概略図を図8に示す。
粒子銃仲介性のプラスチド形質転換とそれに続く選択をMuhlbauerら、2002に記載のように行なった。形質転換体の選択は、aadA遺伝子産物により付与される、抗生物質スペクチノマイシン/ストレプトマイシンへの耐性に基づいている。形質転換されたプラスチドゲノムを増幅して、野生型ゲノムを消失させるために、1次形質転換体(サイクル0)を、スペクチノマイシンを含有する選択培地でのさらに数ラウンドの再生(小葉の外植片より)に処した(ここでは、サイクル−I、サイクル−II、等と呼称する)。
DNeasy Plant Mini Kit(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)で単離した全DNAを使用して、PCRによりプラスチド形質転換体(サイクル−0)を同定した。aadA遺伝子の存在を判定するために、プライマーのoSH81(5’−CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC−3’)及びoFCH60(5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’)を使用した。PCRプログラムは以下の通りである:94℃で3分、1サイクル;94℃で45秒、55℃で45秒、72℃で2分、30サイクル;72℃での最終伸張、10分。結果は、解析した54株のうち48株(6つは衝突された葉)に予測される504bpの増幅産物があることを示した。aadAカセットがタバコのプラストム内に正確に組み込まれていることを証明するために、プライマーのoSH58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’)及びoFCH60(5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’)を使用した。プライマーのoSH58は、タバコプラストム中のpKCZの右フランクの外側(下流)に位置しており、oFCH60との組合せでのみ、aadA発現カセットの逆反復中のtrnRとtrnNの間での組込み時に2106bpの予測産物を与えることができる。PCRプログラムは以下の通りである:94℃で5分、1サイクル;94℃で45秒、55℃で45秒、72℃で3.5分、35サイクル;72℃で7分間の最終伸張。aadA PCR陽性の48株すべてにおいて予測される2106bpの右フランクaadA産物が示された。このサイクル−0形質転換体のうち10個(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:4、2:5、2:6及び2:7)をさらなる解析のために選択した。
通常、安定なプラスチド形質転換体の産生は、形質転換する分子の左フランク及び右フランクとプラストムとの間で起こる2つの同時組換えイベントを介して起こると考えられている(図1に図示するように)。代替機序を図2に提示する。ここでは、ベクターの完全な組込みが、プラストムとの1つのフランクのみ(左又は右のいずれか)での組換えを介して最初に起こり、仮説の不安定中間体を生ずる。次いで、後続の追加の組換えイベントがこの分子中の重複フランク間で起こり、野生型の状態か又は安定に組み込まれたaadAカセットのいずれかを産生する。この可能性を検証するために、プライマーのoSH3(5’−GGCATCAGAGCAGATTG−3’)及びoSH58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’)を使用してPCRを実施した。プライマーのoSH3は、pKCZ(pUC18)のベクター骨格内に位置し、プライマーのoSH58は、タバコプラストム中のpKCZの右フランクの外側(下流)に位置する。図2に示すように、2638bpの産物は、完全なpKCZ組込みが起こったときにのみこれら2つのプライマーで得ることができる。oSH3の結合部位が存在しないため、野生型プラストム断片(左フランク及び右フランクを含む)からは予測サイズのPCR産物は得られない。PCRプログラムは以下の通りである:94℃で5分、1サイクル;94℃で45秒、55℃で45秒、72℃で3.5分、35サイクル;72℃で7分間の最終伸張。解析した10個のサイクル−0形質転換体のうち9つが、これらの株内のプラスチドゲノムへのpKCZの完全な組込みに一致する、2.6kbのPCR産物を示した(図3A)。野生型の対照や試料1:1には、正確なサイズの産物は観察されなかった。pKCZの完全な組込みは不安定な中間体の形成をもたらすため、時間が増すとともに、この分子中の重複フランク間のさらなる組換えイベントにより、野生型状態又は安定組込みaadAカセットのいずれかをもたらすと予測される。サイクルI及びサイクルIIから調製したDNA試料のように、植物材料をプライマーのoSH3及びoSH58を用いたPCRで解析した。図2に提示するモデルが正確であれば、2638bpのバンドをプライマーのoSH3及びoSH58で増幅する確率は、選択の際の再生サイクルごとに低下するはずである。上記の結果は、予測サイズの多量のPCR産物を与えたのは、解析した10個のサイクルI株のうち5つのみであったため、これがまさにそうであることを示唆する(図3B)。さらに、サイクルIIでは、予測される2638bpバンドの明瞭な増幅を示す株の数がさらに減少した。
モジュラーベクターのpICF742(図9)は、タバコのプラストムに相同な右フランキング領域、タバコrpl32プロモーター、タバコpsbA−5’−UTR及びaadAマーカー遺伝子を含む。
A) 5’−CAGACTAATACCAATCCAAGCC−3’(N.tabacumプラストムの左フランキング領域の外側で結合)及び5’−CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC−3’(マーカー遺伝子で結合)
B) 5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’(マーカー遺伝子で結合)及び5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’(N.tabacumプラストムの右フランキング領域の外側で結合)
C) 5’−CATCAATACCTCGGTCTAG−3’(左フランキング領域で結合)及び5’−ACACATAGTATGCCCGGTC−3’(右フランキング領域で結合)。
翻訳ベースのベクターは自身のプロモーター要素を含有しないが、所望の組込み部位の上流にあるプラストムの内因性プロモーター要素に依存する。
モジュラーベクター系は、タバコだけでなく、他の重要な作物種でも使用することができる。本実施例は、実施例2に記載のベクターを使用する、プロトプラスト由来ミクロコロニーの粒子衝突後の、ジャガイモ(Solanum tuberosum)における効率的なプラスチド形質転換を例示する。タバコとジャガイモのプラストム間の高度の相同性により、タバコのフランキング配列を含有するベクターをジャガイモにも使用することができる。
A) 5’−CAGACTAATACCAATCCAAGCC−3’(S.tuberosumプラストム内の左フランキング領域の外側で結合)及び5’−CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC−3’(aadAマーカー遺伝子内で結合)
B) 5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’(aadAマーカー遺伝子内で結合)及び5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’(S.tuberosumプラストム内の右フランキング領域の外側で結合)
C) 5’−CATCAATACCTCGGTCTAG−3’(左フランキング領域内で結合)及び5’−ACACATAGTATGCCCGGTC−3’(右フランキング領域内で結合)。
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US5877402.
US5451513.
Claims (20)
- そのプラストムで形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生する方法であって:
(a)第1のDNA分子と第2のDNA分子を植物プラスチドへ導入する工程、
ここで、前記第1のDNA分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第1領域、及び相同組換えのための第1の配列セグメントを含む第1の目的配列を含有し、ここで第1の配列セグメントは第1領域に関して第1の目的配列の遠位端に位置づけられ、
そして前記第2のDNA分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第2領域、及び相同組換えのための第2の配列セグメントを含む第2の目的配列を含有し、ここで第2の配列セグメントは第2領域に関して第2の目的配列の遠位端に位置づけられ、
前記第1の目的配列の第1の配列セグメントが前記第2の目的配列の第2の配列セグメントと相同であり、それによって、第1の目的配列と第2の目的配列との組換えが起こり、前記第1の目的配列の少なくとも一部と前記第2の目的配列の少なくとも一部を連続した配列として含有する組込み配列の形成を導く;及び
(b)前記組込み配列がプラストムに安定的に組込まれている形質転換体を選択する工程;
を含む、前記方法。 - 前記第1のDNA分子及び前記第2のDNA分子を前記植物プラスチドへ同時形質転換により導入する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の目的配列と前記第2の目的配列が異なっている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第1の目的配列と前記第2の目的配列が前記配列セグメントに加えてさらなる配列をそれぞれ含有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物プラスチドへ、前記第1のDNA分子及び前記第2のDNA分子に加えて1以上の追加DNA分子を導入し、ここで前記追加DNA分子は追加の目的配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つの追加DNA分子が、前記第1の目的配列の配列セグメントに相同な配列セグメントと前記第2の目的配列に相同な配列セグメントを含有する、請求項5に記載の方法。
- 前記第1の目的配列及び/又は前記第2の目的配列及び/又は追加の目的配列が1以上の目的遺伝子又は目的遺伝子の断片を含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 目的遺伝子を2以上の断片へ分断して前記第1の目的配列及び/又は前記第2の目的配列及び/又は追加の目的配列が前記目的遺伝子の断片を含有し、それによって前記目的遺伝子は、前記組込み配列の形成時に前記2以上の断片より組み立てられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の目的配列が目的遺伝子の5’部分を含有し、前記第2の目的配列が前記目的遺伝子の3’部分を含有し、前記組込み配列が前記目的遺伝子をそれが発現され得るように含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的遺伝子の発現にRNAトランススプライシングが含まれる、請求項9に記載の方法。
- 前記第1の目的配列が、前記目的遺伝子の前記5’部分の上流に、第2の目的配列の前記目的遺伝子の前記3’部分の下流に位置する配列因子に相同な配列因子を含有し、それによって前記配列因子は、前記目的遺伝子の前記5’部分及び/又は前記3’部分を含む前記組込み配列の一部の相同組換えによる切除を可能にする、請求項9に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が選択可能マーカー遺伝子である、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のDNA分子又は前記第2のDNA分子が、プラストムの領域に相同な領域と目的配列から成る配列単位の外側に選択可能マーカー遺伝子を含有し、前記マーカー遺伝子の欠失を可能にする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 選択可能マーカー遺伝子を第1の断片及び第2の断片へ分断し、ここで
前記第1の断片を第1配列単位の外側で前記第1のDNA分子に取り込み、そして
前記第2の断片を第2配列単位の外側で前記第2のDNA分子に取り込み、
ここで、前記第1配列単位は前記第1相同領域と前記第1の目的配列から成り、前記第2配列単位は前記第2相同領域と前記第2の目的配列から成る、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記選択可能マーカー遺伝子がaphA−6である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のDNA分子が、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な唯一の領域を含有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のDNA分子及び前記第2のDNA分子が、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な唯一の領域をそれぞれ含有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1相同領域及び前記第2相同領域がともに、形質転換されるプラストムの連続した配列に対応する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- ホモプラストミックなトランスジェニック植物を前記形質転換体より再生する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- プラストム組込みを指令する植物プラストムの領域に相同な第1領域、及び相同組換えのための第1の配列セグメントを含む第1の目的配列を含有し、ここで第1の配列セグメントは第1領域に関して第1の目的配列の遠位端に位置づけられる、第1のDNA分子;
プラストム組込みを指令する前記プラストムの領域に相同な第2領域、及び相同組換えのための第2の配列セグメントを含む第2の目的配列を含有し、ここで第2の配列セグメントは第2領域に関して第2の目的配列の遠位端に位置づけられる、第2のDNA分子;
を含み
ここで、前記第1の目的配列の少なくとも一部と前記第2の目的配列の少なくとも一部を連続した配列として含有する組込み配列の形成ための、植物細胞内における第1の目的配列及び第2の目的配列の相同組換えが可能なように、第1の目的配列の第1の配列セグメントが第2の目的配列の第2の配列セグメントと相同である、
形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生するためのキット。
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