ES2309112T3 - Procesos y vestores para producir plantas transgenicas. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para producir plantas o células de plantas transgénicas capaces de expresar una secuencia codificante transgénica de interés bajo el control transcripcional de un promotor nuclear hospedador mediante la introducción en el genoma nuclear de un vector que comprende en su transcrito una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas en una forma funcional para el inicio de la traducción de una secuencia codificante transgénica de interés aguas abajo y, posteriormente, la selección de células de plantas o plantas que expresan dicha secuencia codificante transgénica.
Description
Procesos y vectores para producir plantas
transgénicas.
La presente invención se refiere a procesos y
vectores para producir plantas transgénicas así como células de
plantas y a plantas obtenidas de tal modo.
El logro de un patrón deseable y establemente
heredable de expresión transgénica continúa siendo uno de los
mayores problemas en biotecnología de plantas. El enfoque estándar
es el de introducir un transgén como parte de una unidad de
transcripción totalmente independiente utilizando un vector, donde
el transgén está bajo el control transcripcional de secuencias
promotoras y de terminación de la transcripción homólogas o
heterólogas específicas de plantas (por ejemplo, ver US 05.591.605;
US 05.977.441; WO 0053762 A2; US 05.352.605, etc.). Sin embargo,
después de la integración dentro del ADN genómico, debido a la
inserción al azar del ADN exógeno dentro del ADN genómico de la
planta, la expresión del gen a partir de tales vectores
transcripcionales se ve afectada por muchos factores diferentes del
hospedador. Estos factores hacen a la expresión transgénica
inestable, impredecible y frecuentemente llevan al silenciamiento
del transgén en la progenie (Matzke & Matzke, 2000, Plant
Mol Biol., 43, 401-415; S. B. Gelvin, 1998,
Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232;
Vaucheret et al., 1998, Plant J., 16,
651-659). Existen casos bien documentados de
silenciamiento de transgenes en plantas, que incluyen los procesos
de silenciamiento génico transcripcional (TGS) y silenciamiento
génico post-transcripcional (PTGS). Hallazgos
recientes revelan una estrecha relación entre la metilación y la
estructura de cromatina en TGS e implicación de la ARN polimerasa
ARN dependiente y una nucleasa en PTGS (Meyer, P., 2000, Plant
Mol. Biol., 43, 221-234, Ding, S. W., 2000,
Curr. Opin. Biotechnol., 11, 152-156; Iyer
et al. Plant Mol. Biol., 2000, 43, 323-346).
Por ejemplo, en TGS, el promotor del transgén puede sufrir
frecuentemente metilación en muchos sitios de integración con una
estructura de cromatina no favorable para la expresión transgénica
estable. Como resultado, poner en práctica los métodos existentes
requiere producir y analizar muchas plantas transgénicas
independientes durante varias generaciones a fin de encontrar
aquellas con el patrón de expresión estable deseado. Más aún,
incluso tales plantas que muestran un patrón de expresión
transgénica estable a través de las generaciones pueden silenciarse
posteriormente bajo condiciones naturales, tales como ataque de
estrés o patógenos. Los intentos existentes que tienden a mejorar el
control de expresión, tal como el uso de regiones de unión al
armazón nuclear (Allen, G. C., 1996, Plant Cell, 8,
899-913; Clapham, D, 1995, J. Exp. Bot., 46,
655-662; Allen G. C., 1993, Plant Cell, 5,
603-613) que flanquean la unidad de transcripción,
podrían aumentar potencialmente la independencia y estabilidad de la
expresión del transgén disminuyendo la dependencia a partir del
denominado "variación del efecto de la posición" (Matzke &
Matzke, 1998, Curr. Opin., Plant Biol., 1,
142-148; S. B. Gelvin, 1998, Curr. Opin.
Biotechnol., 9, 227-232; WO 9844 139 A1, WO
006757 A1, EP 1 005 560 A1; AU 00.018.331 A1). Sin embargo, ellos
sólo proporcionan una solución parcial al problema existente de
diseñar plantas con un patrón de expresión de un transgén
requerido.
El silenciamiento génico puede desencadenarse
como un mecanismo de defensa de una planta mediante virus que
infectan la planta (Ratcliff et al., 1997, Science,
276, 1558-1560; Al-Kaff et
al., 1998, Science, 279, 2113-2115). En
plantas no transgénicas, tal silenciamiento está dirigido contra el
patógeno, pero en plantas transgénicas también puede silenciar el
transgén, especialmente cuando el transgén comparte homología con
un patógeno. Este es un problema, especialmente cuando se usan
muchos elementos diferentes de origen viral en el diseño de
vectores transcripcionales. Un ejemplo ilustrativo es la reciente
publicación por Al-Kaff y colegas
(Al-Kaff et al., 2000, Nature
Biotech., 18, 995-999) que demostró que la
infección por CaMV (virus del mosaico de la coliflor) de una planta
transgénica con el gen BAR bajo el control del promotor 35S
derivado de CaMV puede silenciar el transgén.
Durante los últimos años, el conjunto de
elementos reguladores cis ha aumentado significativamente y
actualmente incluye herramientas para un control espacial y
temporal sofisticado de la expresión del transgén. Estos incluyen
varios elementos transcripcionales tales como diversos promotores y
terminadores de la transcripción así como elementos reguladores de
la traducción o potenciadores de la expresión génica. En general,
los potenciadores de la traducción pueden definirse como elementos
de acción en cis que, junto con factores de acción en
trans celulares, promueven la traducción del ARNm. La
traducción en células eucarióticas se inicia generalmente por el
reconocimiento de ribosomas desde el extremo 5' del ARNm con
capuchón (capped). Sin embargo, el inicio de la traducción
también puede ocurrir mediante un mecanismo que es independiente de
la estructura del capuchón (cap). En este caso, los
ribosomas se dirigen al codón de inicio de la traducción mediante
elementos de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Estos
elementos, inicialmente descubiertos en picornavirus (Jackson &
Kaminski, 1995, RNA, 1, 985-1000), han sido
también identificados en otros ARNm virales y de células
eucariotas. Los IRES son elementos de acción en cis que,
junto con otros factores celulares de acción en trans,
promueven el ensamblaje del complejo ribosomal en el codón de inicio
interno del ARNm. Esta característica de los elementos IRES ha sido
explotada en vectores que permiten la expresión de dos o más
proteínas a partir de unidades de transcripción policistrónicas en
células de animal o de insecto. En la actualidad, se usan
ampliamente en vectores de expresión bicistrónicos para sistemas
animales, en los cuales el primer gen se traduce de una forma
dependiente del capuchón y el segundo está bajo el control de un
elemento IRES (Mountford & Smith, 1995, Trends Genet.,
4, 179-184; Martines-Salas, 1999,
Curr Opin Biotech., 19, 458-464).
Habitualmente la expresión de un gen bajo el control de un IRES
varía significativamente y está dentro de un intervalo del
6-100% comparado con la expresión dependiente del
capuchón del primero (Mizuguchi et al., 2000, Mol.
Ther., 1, 376-382). Estos hallazgos tienen
implicaciones importantes para el uso de IRES, por ejemplo, para
determinar qué gen deberá usarse como el primero en un vector
bicistrónico. La presencia de un IRES en un vector de expresión
confiere una traducción selectiva no sólo en condiciones normales,
sino también en condiciones donde se inhibe la traducción
dependiente del capuchón. Esto ocurre habitualmente en condiciones
de estrés (infección viral, golpe de calor, detención del
crecimiento, etc.,) normalmente debido a la ausencia de los
factores de acción en trans necesarios (Johannes &
Sarnow, 1998, RNA, 4, 1500-1513; Sonenberg
& Gingras, 1998, Cur. Opin. Cell Biol, 10,
268-275).
Los vectores basados en la traducción han
atraído recientemente la atención de los investigadores que trabajan
con sistemas de células animales. Existe un informe relacionado con
el uso de un cassette de IRES- recombinasa Cre para obtener una
expresión específica de tejido de recombinasa cre en ratones.
(Michael et al., 1999, Mech. Dev., 85,
35-47). En este trabajo, se introdujo un novedoso
cassette IRES-Cre dentro de la secuencia del exón
del gen EphA2, codificando un receptor Eph de proteína tirosina
quinasa expresada tempranamente en el desarrollo. Este trabajo es
de un interés específico en tanto que es la primera demostración del
uso de vectores de traducción para la expresión específica de
tejido de un transgén en células animales que dependen del control
transcripcional del ADN hospedador. Otra importante aplicación para
los elementos IRES es su uso en vectores para la mutagénesis
insercional. En tales vectores, el gen marcador seleccionable o
indicador está bajo el control de un elemento IRES y puede
expresarse solamente si se inserta dentro de la región transcrita
de un gen activo transcripcionalmente (Zambrowich et al.,
1998, Nature, 392, 608-611; Araki et
al., 1999, Cell Mol Biol., 45, 737-750).
Sin embargo, a pesar de los progresos hechos en la aplicación de
IRES en sistemas animales, los elementos IRES de estos sistemas no
son funcionales en células de plantas. Más aún, puesto que la
recombinación homóloga o dirigida a sitio en células de plantas es
extremadamente rara y sin uso práctico, no se contemplaron intentos
similares con células de plantas.
Hay significativamente menos datos sobre
elementos IRES específicos de plantas. Recientemente, sin embargo,
se descubrieron varios IRES que también son activos en plantas en
tobamovirus crTMV (un virus TMV que infecta plantas
Cruciferae) (Ivanov et al., 1997, Virology,
232, 32-43; Skulachev et al., 1999,
Virology, 263, 139-154; WO 98/54342) y hay
indicaciones de control de traducción de IRES en otros virus de
plantas (Hefferon et al., 1997, J. Gen Virol., 78,
3051-3059; Niepel & Gallie, 1999, J.
Virol., 73, 9080-9088). La tecnología IRES
tiene un gran potencial para el uso en plantas transgénicas y
vectores virales de plantas proporcionando una alternativa
conveniente a los vectores existentes. Hasta la fecha, la única
aplicación conocida de elementos IRES de plantas para la
transformación nuclear estable está relacionada con el uso de IRES
para expresar un gen de interés en constructos bicistrónicos (WO
98/54342). El constructo en cuestión comprende, en dirección 5' a
3', un promotor de la transcripción, el primer gen ligado a dicho
promotor de la transcripción, un elemento IRES ubicado 3' al primer
gen y el segundo gen ubicado 3' al elemento IRES, por ej., aún
contiene un conjunto completo de elementos de control de la
transcripción.
Sorprendentemente, hemos descubierto que los
vectores de traducción que carecen de sus propios elementos de
control de la transcripción y dependen enteramente de la inserción
en un ADN genómico transcripcionalmente activo de un hospedador
vegetal, permiten la recuperación de numerosos transformantes que
expresan el gen de interés. Incluso más sorprendentemente, tales
transformantes pueden detectarse fácilmente incluso en plantas
hospedadoras con una proporción muy baja de ADN transcripcionalmente
activo en sus genomas, tal como trigo. Esta invención es la base
del proceso propuesto que permite el diseño de una expresión
transgénica que está enteramente controlada por la maquinaria
transcripcional del hospedador, minimizando así la cantidad de
elementos de ADN regulador xenogenéticos conocidos por desencadenar
el silenciamiento transgénico. También permite controlar la
expresión del transgén de un modo novedoso, mediante la modulación
de la relación de traducción dependiente del capuchón frente a
traducción independiente del capuchón.
La Fig. 1 muestra la expresión del transgén a
partir de cuatro de muchas variantes de vector de traducción
posibles.
A - el vector contiene un potenciador de la
traducción y un codón de terminación de la traducción;
B - el vector contiene un IRES como potenciador
de la traducción y una región de terminación de la
transcripción;
C - como en B, excepto que el IRES está
precedido por codones de terminación de la traducción para los tres
marcos de lectura;
D - como en C, excepto que el vector está
flanqueado por regiones límite intrón/exón (3'I-5'E
y 3'E-5'I) para proveer las características de un
exón y facilitar su incorporación en el ARNm empalmado
(spliced).
La Fig. 2 muestra el vector pIC1301 que contiene
IRES_{MP,75}^{CR}, BAR y el terminador 35S.
La Fig. 3 muestra el vector pIC1521 que contiene
una "horquilla", IRES_{CP,148}^{CR}, BAR y el terminador
35S. La estructura de "horquilla" sirve como una alternativa al
codón de terminación de la traducción, evitando la formación de los
productos de fusión de la traducción.
La Fig. 4 muestra el vector pIC1451 que contiene
un gen BAR sin promotor y el terminador 35S.
La Fig. 5 muestra el vector pIC052 que contiene
loxP, HPT y terminador nos.
La Fig. 6 muestra el vector
pIC06-IRES que contiene IRES_{MP,75}^{CR}, el
gen AHAS, en donde AHAS es la versión mutada del gen de
acetohidroxiácido sintasa de Arabidopsis que confiere
resistencia a herbicidas de imidazolina.
La Fig. 7 muestra los vectores
pIC-DOG y pIC-CRE que contienen la
secuencia codificante de la
2-desoxiglucosa-6-fosfato
(2-DOG-6-P)
fosfatasa y de la recombinasa cre de levadura bajo el control del
promotor de actina de arroz, respectivamente.
La Fig. 8 muestra el vector de traducción con
transposón incorporado pIC-dSpm y el vector pIC1491
que contiene una transposasa. El PHBT es un promotor quimérico que
consiste en potenciadores p35S fusionados a la parte basal del gen
C4PPDK de trigo.
La Fig. 9 muestra vectores de traducción basados
en ADN-T.
A - los vectores contienen el gen BAR bajo el
control de IRESmp^{75} (pICH3853) e IREScp^{148} (pICH4021),
respectivamente;
B - los vectores contienen el gen HPT bajo
control de IRESmp^{75} (pICH4661) y IREScp^{148} (pICH4673).
SA representa un sitio aceptor de empalme.
La Fig. 10 muestra los vectores de traducción
basados en ADN-T pICH5410-UPI y
pICH5410-CUPI diseñados para expresar proinsulina en
plantas. LB: borde izquierdo, RB: borde derecho.
SA representa un sitio aceptor de empalme; C
indica el péptido señal de la calreticulina del tabaco.
La Fig. 11 muestra los vectores binarios pICBV10
y pICBV2 (Ejemplo 9).
La Fig. 12 muestra el vector binario pICH5410
(Ejemplo 10).
Un objetivo primario de esta invención es
proporcionar un proceso o vector novedoso para producir plantas
transgénicas para la expresión estable de material transgénico
integrado en un genoma de planta.
Este objeto se alcanza mediante un proceso para
producir plantas o células de plantas transgénicas capaces de
expresar una secuencia codificante transgénica de interés bajo el
control transcripcional de un promotor nuclear del hospedador,
mediante la introducción dentro del genoma nuclear de un vector que
comprende en su transcrito una secuencia para unión a un ribosoma
citoplásmico de plantas en una forma funcional para el inicio de la
traducción y, aguas abajo de la misma, dicha secuencia codificante
transgénica, y posteriormente la selección de células de plantas o
plantas que expresan dicha secuencia codificante transgénica. El gen
de interés está bajo el control de una señal de traducción, tal
como pero no limitada a, un elemento IRES, y el vector no tiene un
promotor ligado operativamente a él. Tales vectores dependen de
inserciones transgénicas dentro del ADN transcripcionalmente activo
del genoma hospedador.
Adicionalmente, se proporciona un novedoso
vector para transformar células de plantas que, opcionalmente
después del procesamiento en la célula hospedadora, comprende en su
transcrito una secuencia para unión a un ribosoma citoplásmico de
plantas en una forma funcional para el inicio de la traducción y,
aguas abajo de la misma, una secuencia codificante, careciendo
dicho vector de un promotor funcional para la transcripción de dicha
secuencia codificante.
Las realizaciones preferidas se definen en las
reivindicaciones secundarias.
La construcción de vectores para la
transformación estable de plantas ha sido descrita por numerosos
autores (para una revisión, ver Hansen & Wright, 1999, Trends
in Plant Science, 4, 226-231; Gelvin, S. B.,
1998, Curr. Opin. Biotech., 9,
227-232). El principio básico de todos estos
constructos es idéntico -una unidad de transcripción completamente
funcional que consiste en, en dirección 5' a 3', un promotor
específico de planta, una parte estructural de un gen de interés y
un terminador transcripcional, debe introducirse en la célula de la
planta e integrarse establemente dentro del genoma con el fin de
lograr la expresión de un gen de interés.
Hemos desarrollado una tecnología diferente para
obtener transformantes nucleares estables de plantas. Nuestra
invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la maquinaria
de transcripción de la planta hospedadora es capaz de conducir la
formación de ARNm a partir de un transgén de interés en una célula
de planta transformada. El proceso propuesto utiliza vectores que
tienen un gen de interés que no está ligado operativamente a un
promotor en dicho vector. En cambio, comprenden la región
codificante de un gen de interés bajo el control solamente de
elementos de traducción. Dicho elemento de traducción puede ser una
secuencia para la unión, preferiblemente después de la
transcripción, a un ribosoma citoplásmico de planta permitiendo así
la traducción de una secuencia de codificación aguas abajo del
mismo. Preferiblemente, dicho elemento de traducción es un sitio de
entrada al ribosoma funcional en plantas y, más preferiblemente, un
elemento IRES específico de plantas, en particular un elemento IRES
de origen viral de plantas, de origen de plantas, de origen distinto
de plantas o un elemento IRES diseñado artificialmente.
Tal ADN vector, después de la integración dentro
de la región transcrita de un gen de planta residente, proporciona
un ARNm quimérico y posteriormente se traduce en la proteína de
interés a través del inicio de la traducción a partir de dicha
secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de planta (Fig.
1). Hasta donde conocemos, no existe técnica anterior que contemple
este enfoque para generar transformantes nucleares estables de
plantas. Toda la técnica anterior de utilización de vectores trampa
de genes o trampa de potenciadores en plantas se centraron en
tareas genómicas funcionales, por ej., en la identificación y
aislamiento de secuencias codificantes de plantas y elementos
reguladores. No se contempló la introducción y expresión de nuevas y
útiles cualidades.
Fue muy sorprendente que, dada la baja
proporción de ADN transcripcionalmente activo en la mayoría de los
genomas de plantas, los experimentos de transformación utilizando
vectores de traducción descritos en la presente invención,
produjeran numerosos transformantes que expresan el gen de interés.
Esto se observó tanto para el suministro de ADN mediado por
Agrobacterium como para el suministro de ADN directo dentro
de las células de plantas.
Nuestra invención aborda problemas inminentes de
expresión fiable de transgenes. El transgén integrado dentro del
genoma hospedador utilizando nuestro procedimiento inventado se basa
en la maquinaria de transcripción incluyendo todos o la mayoría de
los elementos reguladores transcripcionales del gen residente del
hospedador, minimizando así el silenciamiento transgénico
desencadenado habitualmente por elementos de ADN xenogenéticos. Los
elementos IRES contemplados en esta invención son mucho menos
elementos heterólogos que promotores; en muchos casos, puede
utilizarse un IRES derivado de plantas.
Los vectores para suministro de transgenes
pueden construirse de muchas maneras diferentes. Las versiones más
simples consisten solamente en la región codificante de un gen de
interés o una porción del mismo con una señal de traducción (vector
de traducción básico). En un vector preferido, una señal de
terminación de la traducción se proporciona aguas arriba de dichas
secuencias para la unión a un ribosoma citoplásmico de planta. La
señal de terminación puede ser, por ejemplo, al menos un codón de
terminación y/o una estructura secundaria de horquilla de ARN o
similar. Esta señal de terminación ocasiona el aborto de la
traducción aguas arriba. Versiones más avanzadas pueden incluir un
elemento IRES específico de planta seguido de la región codificante
(de un gen) de interés. Versiones avanzadas del vector de traducción
pueden incluir secuencias para la recombinación específica de sitio
(para una revisión, ver Corman & Bullock, 2000, Curr
Biotechnol., 11, 455-460) permitiendo bien el
reemplazo posterior de un transgén existente o la integración de
cualquier gen adicional de interés dentro de la región transcrita
del ADN hospedador. Las recombinasas/integrasas específicas de
sitio de bacteriófagos y levaduras se usan ampliamente para
manipular ADN in vitro y en plantas. Los ejemplos de
recombinasa-sitio de recombinación para el uso en
esta invención incluyen los siguientes: recombinasa
cre-sitio de recombinación LoxP, recombinasa
FLP-sitio de recombinación FRT, recombinasa
R-sitios de recombinación RS, integrasa
phiC31-sitios de recombinación attP/attB,
etc.
La introducción de sitios de empalme dentro del
vector de traducción puede usarse para aumentar la probabilidad de
incorporación del transgén dentro del transcrito procesado.
El vector puede además comprender una secuencia
que codifica para un péptido señal de dirección entre dicha
secuencia para unir un ribosoma citoplásmico de planta y dicha
secuencia codificante. Los ejemplos preferibles de dichos péptidos
señal incluyen un péptido de tránsito a plastos, un péptido de
tránsito mitocondrial, un péptido señal de dirección nuclear, un
péptido de dirección a vacuolas y un péptido señal de secreción.
Pueden usarse diversos métodos para suministrar
vectores de traducción dentro de células de plantas, que incluyen
la introducción directa de dicho vector dentro de una célula de
planta mediante bombardeo de microproyectiles, electroporación o
tratamiento de protoplastos mediado por PEG. La transformación de
plantas mediada por Agrobacterium también representa una
forma eficaz y preferida del suministro de vector de traducción. La
mutagénesis insercional de ADN-T en
Arabidopsis y Nicotiana con el gen indicador
APH(3')II sin promotor estrechamente unido al borde derecho
del ADN-T mostró que al menos el 30% de todos los
insertos indujeron fusiones génicas transcripcionales y
traduccionales (Koncz et al., 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci., 86, 8467-8471).
También puede clonarse un vector de traducción
dentro de elementos transponibles, facilitando la búsqueda de
regiones transcritas adecuadas y proporcionando un patrón
constitutivo o específico de tejido/órgano de expresión del
transgén. Los elementos transponibles se usan ampliamente en plantas
con el propósito del marcado de genes basado en la inactivación
(Pereira & Aarts, 1998, Methods Mol Bio., 82,
329-338; Long & Coupland, 82,
315-328; Martín GB., 1998, Curr Opin
Biotechnol., 9, 220-226). Se han desarrollado
diferentes versiones de los sistemas de marcado por transposón. En
la versión más simple, se usan transposones para mutagénesis
insercional sin ninguna modificación excepto, posiblemente, para
deleciones o mutaciones de cambio del marco de lectura a fin de
generar elementos transponibles no autónomos. En versiones más
sofisticadas, se insertan genes adicionales dentro de los elementos
transponibles, por ej., marcadores de reinserción, genes
indicadores, vectores de rescate de plásmidos (Carroll et
al., 1995, Genetics, 13, 407-420; Tisier
et al., 1999, Plant Cell, 11,
1841-1852). Existen los llamados sistemas trampa de
potenciadores y trampa de genes (Sundaresan et al., 1995,
Genes Dev., 9, 1797-810; Federov & Smith,
1993, Plant J. 3, 273-89). Los elementos
transponibles en tales sistemas están equipados con un gen indicador
sin promotor o un gen indicador bajo el control de un promotor
mínimo. En el primer caso, el gen indicador puede expresarse después
de la inserción dentro de la región transcrita del ADN hospedador,
justo después del promotor del hospedador, o después de la
inserción dentro de la región codificante del gen hospedador y de la
creación de una fusión "en el marco de lectura" con el
transcrito del gen hospedador.
La posibilidad de fusión "en el marco de
lectura" exitosa puede incrementarse significativamente colocando
en frente del gen indicador un conjunto de sitios donadores y
aceptores de empalme para los tres marcos de lectura (Nussaume
et al., 1995, Mol Gen Genet., 249,
91-101). En el segundo caso, la transcripción de un
gen indicador se activará a partir del promotor mínimo siguiendo la
inserción cerca del promotor del hospedador activo (Klimyuk et
al., 1995, Mol Gen Genet., 249, 357-65).
El éxito de tales enfoques para marcado por transposón favorece el
uso de un enfoque similar para los vectores de traducción con
elementos IRES en frente del gen de interés.
Todos los enfoques descritos anteriormente se
dirigen a diseñar un sistema que coloque un transgén bajo el
control de expresión del gen residente en el cual ocurre la
inserción. Esto puede ser ventajoso para tareas y casos
específicos. En muchos otros casos, puede ser preferible un patrón
modificado de expresión del transgén. Para tales propósitos, el
vector de traducción puede estar equipado con elementos
transcripcionalmente activos, tales como potenciadores o regiones
de unión la matriz o andamiaje (MAR) (para una revisión ver Allen
G.C. et al., 2000, Plant Mol Biol., 43
361-376) o elementos aislantes (Geyer PK, 1997,
Curr. Opin. Genet. Dev., 2, 242-248; Nagaya
et al., 2001, Mol. Genet. Genomics, 265,
405-413), que pueden modular el patrón de expresión
de un transgén. Cuando las MAR o elementos aislantes están situados
en cualquier lado de un transgén su presencia habitualmente da como
resultado una expresión mayor y más estable en plantas o líneas
celulares transgénicas. Es también conocido que las secuencias
potenciadoras pueden afectar a la potencia de promotores situados
tan lejos como a varios miles de pares de bases de distancia
(Müller, J., 2000, Current Biology, 10,
R241-R244). La viabilidad de tal enfoque se demostró
en experimentos con marcado por activación en Arabidopsis
(Weigel et al., 2000, Plant Physiol., 122,
1003-1013), en donde los elementos potenciadores
35S situados en el ADN-T cambiaron el patrón de
expresión de los genes residentes, y en el marcado por transposón
de trampa de potenciador descrito anteriormente. En el último
ejemplo, los potenciadores de genes residentes determinaron el
patrón de expresión del transgén indicador. Este enfoque puede ser
útil, por ejemplo, en las etapas iniciales de la transformación de
plantas, o cuando es necesaria la modulación del patrón de expresión
del transgén después de la transformación. Las secuencias
potenciadoras pueden manipularse fácilmente por medio de sistemas
de recombinación específicos de secuencia (insertarse, reemplazarse
o eliminarse) dependiendo de las necesidades de la aplicación.
Todos estos enfoques están contemplados como componentes útiles de
la presente invención.
Nuestro enfoque fue preparar preferiblemente un
conjunto de constructos basados en diferentes elementos IRES
funcionales en células de plantas. Los constructos contienen
elementos IRES seguidos por un gen marcador seleccionable de
plantas y una señal de terminación de la transcripción o traducción.
Estos constructos pueden usarse directamente para la transformación
de células de plantas luego de linealizarse a partir del extremo 5'
en frente de las secuencias IRES o puede clonarse dentro del
ADN-T para transferencia de ADN mediada por
Agrobacterium. Otro conjunto de constructos, que sirven como
controles, contenían un gen seleccionable sin promotor (un control
negativo) o un gen seleccionable bajo el control de un promotor
constitutivo funcional en células monocotiledóneas y/o
dicotiledóneas (un control positivo). Se transformó ADN dentro de
células de plantas utilizando diferentes tecnologías adecuadas,
tales como vector plasmídico Ti portado por Agrobacterium (US
5.591.616; US 4.940.838; US 5.464.763), bombardeo de partículas o
microproyectiles (US 5.100.792; EP 444882 B1; EP 434616 B1). En
principio, podrían usarse otros métodos de transformación de
plantas, tales como, pero no limitados a, microinyección (WO
09209696; WO 09400583 A1; EP 175966 B1), electroporación (EP
00564595 B1; EP 00290395 B1; WO 08706614 A1).
El método de transformación depende de la
especie de planta que se va a transformar. Nuestra ejemplificación
incluye datos de la eficiencia de transformación para representantes
de especies de plantas monocotiledóneas (por ej. Triticum
monococcum, Pennisetum glaucum) y dicotiledóneas (por ej.
Brassica napus, Orichophragmus violaceous, Arabidopsis thaliana,
Nicotiana tabacum), demostrando de este modo la viabilidad de
nuestro enfoque para especies de plantas de diferente origen
fitogenético y con diferentes densidades y organización de regiones
transcritas dentro del genoma de una especie.
La secuencia codificante transgénica en el
vector puede representar sólo una parte de un gen de interés, cuyo
gen se reconstruye hasta una longitud funcional como resultado de la
recombinación dirigida a sitio u homóloga u otros procesos de
recombinación específicos. La traducción de la secuencia de interés
es preferiblemente independiente del capuchón. El hospedador puede
modificarse para inhibir (o potenciar) la traducción dependiente
del capuchón o para potenciar (o inhibir) la traducción
independiente del capuchón. Esto puede lograrse por tratamiento con
agentes exógenos o incluyendo una secuencia en el vector o en dicha
planta, cuya expresión tiene el efecto deseado.
En una realización de nuestra invención
demostramos la transformación de especies monocotiledóneas y
dicotiledóneas utilizando vectores de traducción. Hemos hallado que
la frecuencia de transformación con suministro de ADN directo
(bombardeo con microproyectiles, transformación de protoplastos
mediada por PEG) puede ser aproximadamente el 1-5%
de la de un vector de transcripción dependiendo de la especie de
planta involucrada. Esta es habitualmente más baja para plantas con
grandes genomas y una alta proporción de secuencias no codificantes
repetitivas, por ej. monocotiledóneas (Triticum monococcum,
Pennisetum glaucum), que para plantas con genomas más pequeños
ricos en regiones codificantes (O. violaceous, Brassica napus, N.
tabacum). El uso de un protocolo de transformación mediado por
Agrobacterium proporciona una mayor eficiencia de suministro
de transgenes en diferentes especies de plantas y la frecuencia de
transformación de un vector de traducción puede variar
aproximadamente en el intervalo del 3-10% con
respecto a la de un vector de transcripción. Es importante mencionar
aquí que la frecuencia de transformación no es un factor limitante
en la tecnología de la ingeniería genética. En consecuencia, estas
frecuencias comparativamente bajas no afectan de ningún modo ni la
eficiencia de la transformación genética de plantas ni la duración
del proceso.
Nuestra invención puede usarse para introducir
cualidades útiles en las plantas, en particular con el objeto de
mejorar la resistencia contra agresiones abióticas (tolerancia a
estrés salino, por frío, sequía o fotooxidativo) y bióticas
(resistencia a patógenos), modificar el metabolismo, incrementar el
rendimiento, mejorar la calidad del alimento, etc. Los vectores de
traducción son especialmente adecuados para tales propósitos, ya que
proporcionan la flexibilidad necesaria para obtener un patrón de
expresión requerido. El enfoque es de extremo valor para la
genómica funcional, ya que proporciona la muy necesaria flexibilidad
y sofisticación al muy limitado conjunto existente actualmente de
sistemas de expresión de genes, los cuales están restringidos al uso
de unos pocos promotores constitutivos, inducibles y específicos de
tejidos y órganos. Estos promotores representan sólo una pequeña
fracción de los elementos reguladores existentes in planta y
no representan una elección adecuada para muchas aplicaciones
diferentes. Los vectores de traducción con cualidades útiles pueden
usarse directamente con el propósito de obtener plantas
transgénicas con características fenotípicas requeridas y/o para
identificar los elementos reguladores de plantas necesarios para
proporcionar tales características regulando el patrón de expresión
de dicha cualidad útil. Este enfoque es estratégicamente diferente
de la tecnología existente de trampas de potenciadores, que permite
sólo la identificación de elementos reguladores con la ayuda de
genes indicadores, pero no la evaluación de la utilidad in
situ de tales elementos para regular la expresión de un gen de
interés.
Los genes de interés, o fragmentos de los
mismos, que pueden introducirse, en una orientación con sentido o
anti-sentido, utilizando nuestra invención,
incluyen, pero no están limitados a: enzimas que modifican el
almidón (almidón sintasa, enzima de fosforilación del almidón,
enzima desramificante, enzima ramificante del almidón, enzima
ramificante del almidón II, sintasa del almidón ligada a gránulos),
sacarosa fosfato sintasa, sacarosa fosforilasa, poligalacturonasa,
polifructano sucrasa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrin
glicosiltransferasa, fructosil transferasa, glucógeno sintasa,
pectina esterasa, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana,
proteína glgA de E. coli, MAPK4 y ortólogos, enzima de
asimilación/metabolismo del nitrógeno, glutamina sintasa, osmotina
de plantas, 2S albúmina, taumatina, recombinasa/integrasa específica
de sitio (FLP, Cre, R recombinasa, Int, SSVI Integrasa R, Integrasa
phiC31, o un fragmento activo o variante de las mismas), isopentenil
transferasa, Sca M5 (calmodulina de soja), toxina de tipo
coleóptero o un fragmento insecticidamente activo, proteínas de
fusión de la enzima conjugante de ubiquitina (E2), enzimas que
metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y
polisacáridos, superóxido dismutasa, la forma de proenzima inactiva
de una proteasa; toxinas de proteínas de plantas, fibra que altera
cualidades en plantas productoras de fibras, toxina activa de
coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína
cristal insecticida (ICP), toxina CryIC, endotoxina delta, toxina
de poliopéptido, protoxina, etc.), toxina específica de insectos
AaIT, enzimas que degradan celulosa, celulasa E1 de Acidothermus
celluloticus, enzimas modificadoras de lignina, alcohol
cinamoílico deshidrogenasa,
trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas
de la ruta metabólica de la citoquinina, HMG-CoA
reductasa, pirofosfatasa inorgánica de E. coli, proteína de
almacenamiento de semillas, licopeno sintasa de Erwinia
herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada de pTOM36, fitasa,
cetohidrolasa, acetoacetil CoA reductasa, PHB
(polihidroxibutanoato) sintasa, proteína transportadora de acilo,
napina, EA9, fitoeno sintasa de plantas no superiores, proteína
codificada de pTOM5, ETR (receptor de etileno), piruvato fosfato
diquinasa de plastos, proteína de poro transmembrana inducible por
nematodos, función fotosintética o de plastos potenciadora de
cualidades de la célula de plantas, estilbeno sintasa, una enzima
capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol
2,3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa,
antranilato sintasa, proteína AGL15 de Brassica, fructosa
1,6-bifosfatasa (FBPasa), AMV RNA3, PVY replicasa,
PLRV replicasa, proteína de cubierta de potivirus, proteína de
cubierta de CMV, proteína de cubierta de TMV, replicasa de
luteovirus, ARN mensajero de MDMV, replicasa geminiviral mutante,
acil-ACP tioesterasa que prefiere C12:0 de
Umbellularia californica, acil-ACP
tioesterasa que prefiere C10 o C12:0 de planta,
acil-ACP tioesterasa que prefiere C14:0 (luxD),
factor A de sintasa de planta, factor B de sintasa de planta,
6-desaturasa, proteínas que tienen una actividad
enzimática en la oxidación peroxisomal de ácidos grasos en células
de plantas, acil-Coa oxidasa,
3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa,
acetil-CoA-carboxilasa de maíz,
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSP), fosfinotricin acetil transferasa (BAR, PAT),
proteína CP4, ACC desaminasa, ribozima, proteína que tiene un sitio
de escisión postraduccional, fusión de proteína que consiste en un
dominio de unión a ADN de un activador transcripcional GaI4 y un
dominio de activación transcripcional, una fusión traduccional de
proteína oleosina con proteína de interés capaz de dirigir la
proteína de fusión hacia la fase lipídica, gen DHPS que confiere
resistencia a sulfonamida, nitrilasa bacteriana,
2,4-D monooxigenasa, acetolactato sintasa o
acetohidroxiácido sintasa (ALS, AHAS), poligalacturonasa, nitrilasa
bacteriana, fusión de la región hidrófoba amino terminal de una
proteína translocadora de fosfato madura que reside en la membrana
interna de envoltura del plasto con proteína de interés que se va a
dirigir hacia dicha membrana, etc.
Las plantas pueden someterse a ingeniería
genética utilizando nuestra invención para el propósito del cultivo
molecular de proteínas comercialmente valiosas o farmacéuticamente
importantes. En otra realización de esta invención, describimos la
expresión de proinsulina como fusión de
ubiquitina-proinsulina o como fusión de péptido
señal de
calreticulina-ubiquitina-proinsulina
(Fig. 10). Las fusiones de ubiquitina (UBQ) permiten producir la
proteína de interés con cualquier primer resto aminoacídico
N-terminal incluyendo metionina en células
eucarióticas, en tanto estas fusiones se procesan rápidamente y de
forma precisa in vivo para liberar los grupos moleculares de
proteínas fusionadas en formas libres (Hondred et al., 1999,
Plant Physiol., 119, 713-724). También
la síntesis de una proteína como una fusión de UBQ puede aumentar
significativamente su acumulación.
Cualquier proteína humana o animal puede
expresarse utilizando un vector de traducción. Ejemplos de tales
proteínas de interés incluyen inter alia proteínas de
respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena
única, receptores de célula T, etc.), antígenos, factores
estimulantes de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas,
citoquinas y sus receptores, interferones, factores de crecimiento y
factores de coagulación, enzima lisosomal enzimáticamente activa,
polipéptidos fibrinolíticos, factores de coagulación sanguínea,
tripsinógeno,
\alpha-1-antitripsina (AAT), así
como proteínas conservativas de función como fusiones, versiones
mutantes y derivados sintéticos de las proteínas anteriormente
mencionadas.
El proceso de la invención puede comprender
además la introducción de un gen que codifica una proteína supresora
de silenciamiento génico post-transcripcional o una
variante o fragmento conservador de la función de la misma en una
planta para suprimir el PTGS de dicha secuencia codificante
transgénica. Dicho gen de proteína supresora de PTGS o variante o
fragmento conservador de la función del mismo pueden proporcionarse
a una planta en el mismo vector que lleva dicha secuencia
codificante transgénica o en un vector extra. Dicho gen de proteína
supresora de PTGS puede expresarse bajo el control traduccional de
una secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas.
Como alternativa, puede expresarse bajo el control transcripcional
de un promotor. Dicha proteína supresora de PTGS es preferiblemente
de origen viral o vegetal. Son ejemplos de proteínas supresoras de
PTGS la proteína p25 del virus X de la patata, la proteína AC2 del
virus del mosaico de la mandioca africana, la proteína P1 del virus
moteado amarillo del arroz, la proteína 19K del virus del enanismo
ramificado del tomate, rgs CAM o una variante o fragmento
conservador de la función de una de estas proteínas. Dicha variante
o fragmento conservador de la función tiene preferiblemente una
identidad de secuencia del 75% con una de las proteínas anteriores.
Pueden encontrarse detalles sobre proteínas supresoras de PTGS y su
uso en el documento WO0138512.
Utilizando nuestra invención, el transgén de
interés puede expresarse junto con un marcador
seleccionable/regis-
trable a partir del mismo transcrito, permitiendo así la selección directa del mejor productor de proteína recombinante. Ejemplos de tales marcadores seleccionables/registrables incluyen inter alia genes o fragmentos de: neomicina fosfotransferasa II (NPTII), higromicina fosfotransferasa, aminoglicósido 6'-N-acetiltransferasa, 5-enoilpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, fosfinotricin acetil transferasa (BAR), betaína aldehído deshidrogenasa (BADH), dihidrofolato reductasa (DFR1), 6'gentamicin acetiltransferasa (6'GAT), acetolactato sintasa (ALS), fosfomanosa-isomerasa (PMI), glifosato oxidorreductasa, acetohidroxiácido sintasa (AHAS), 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa (2-DOG-6-P), luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) y fusiones de genes marcadores seleccionables y elegibles. Opcionalmente, el marcador seleccionable puede unirse con un marcador contra-seleccionable (por ej. gen codA bacteriano que codifica la citosina desaminasa o el gen de la citocromo P450 monooxigenasa bacteriana, etc.) y puede estar flanqueado por sitios de recombinación reconocidos por una recombinasa o recombinasas específicas de sitio. Esto permite la eliminación del marcador seleccionable cuando se desea y facilita la selección de tales acontecimientos.
trable a partir del mismo transcrito, permitiendo así la selección directa del mejor productor de proteína recombinante. Ejemplos de tales marcadores seleccionables/registrables incluyen inter alia genes o fragmentos de: neomicina fosfotransferasa II (NPTII), higromicina fosfotransferasa, aminoglicósido 6'-N-acetiltransferasa, 5-enoilpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, fosfinotricin acetil transferasa (BAR), betaína aldehído deshidrogenasa (BADH), dihidrofolato reductasa (DFR1), 6'gentamicin acetiltransferasa (6'GAT), acetolactato sintasa (ALS), fosfomanosa-isomerasa (PMI), glifosato oxidorreductasa, acetohidroxiácido sintasa (AHAS), 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa (2-DOG-6-P), luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) y fusiones de genes marcadores seleccionables y elegibles. Opcionalmente, el marcador seleccionable puede unirse con un marcador contra-seleccionable (por ej. gen codA bacteriano que codifica la citosina desaminasa o el gen de la citocromo P450 monooxigenasa bacteriana, etc.) y puede estar flanqueado por sitios de recombinación reconocidos por una recombinasa o recombinasas específicas de sitio. Esto permite la eliminación del marcador seleccionable cuando se desea y facilita la selección de tales acontecimientos.
Cualquier especie de planta puede transformarse
rutinariamente con protocolos de transformación establecidos
utilizando el enfoque de vector de traducción aquí descrito,
incluyendo especies leñosas como álamos y coníferas, cultivos
agrícolamente importantes como algodón, Brassica, así como
especies de plantas decorativas, como Chrysanthemum,
etc.
Se construyeron series de vectores de expresión
mediada por IRES utilizando técnicas de biología molecular estándar
(Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). El vector
pIC1301 (Fig. 2) se preparó por digestión del plásmido pIC501
(p35S-GFP-IRES_{MP,75}^{CR}-BAR-terminador
35S en pUC120) con HindIII y religando grandes fragmentos
purificados en gel. La secuencia del IRES_{MP,75}^{CR}
representa las 75 bases 3' terminales de la secuencia líder 5' no
traducida del ARN subgenómico de la proteína de movimiento (MP) de
un tobamovirus que infecta crucíferas (CR).
El vector pIC1521 (Fig. 3) se preparó siguiendo
tres etapas de clonación. En la primera etapa, el pIC1311 se
construyó ligando el gran fragmento HindIII-PstI de
pIC031 con el pequeño fragmento HindIII-Ncol de
pIC032 y el pequeño fragmento BspHI-PstI de pIC018.
El constructo resultante pIC1311 (no mostrado) que contiene el gen
BAR bajo el control del promotor 35S se usó como el control
comparativo en los experimentos de transformación. El plásmido
pIC1311 se digirió con HindIII-NruI y sus extremos
se hicieron romos por tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I. El gran fragmento de restricción se purificó en gel y
se religó produciendo pIC1451 (BAR-terminador 35S
sin promotor; ver Fig. 4). La ligación del gran fragmento
Sac1-Pst1 de pIC1451 con el pequeño fragmento
SacI-NcoI de pIC033 y el pequeño fragmento
BspHI-PstI de pIC018 produjo pIC1521 (Fig. 3). Este
constructo contiene una "horquilla" en frente del elemento
IRES_{CP,148}^{CR} (CP significa proteína de cubierta). La
estructura de horquilla se forma por la presencia de una repetición
en tándem invertida formada por fragmentos
KpnI-EcoRI y ClaI-KpnI de la
secuencia polienlazadora de Bluescript II SK+.
Todos los vectores se linealizaron para el uso
en los experimentos de transformación mediante digestión con enzima
de restricción SacI (pIC1521; pIC1451) o HindIII (pIC1311; pIC1301)
y se purificaron en gel para separarlos de los vectores no
digeridos.
El aislamiento de protoplastos de
Brassica se basó en protocolos previamente descritos
(Glimelius K., 1984, Physiol. Plant., 61,
38-44; Sundberg & Glimelius, 1986, Plant
Science, 43, 155-162 y Sundberg et al.,
1987, Theor. Appl. Genet., 75, 96-104).
Se germinaron semillas esterilizadas (ver
Apéndice) en placas de Petri de 90 mm que contenían ½ de medio MS
con 0,3% de Gelrite. Las semillas se colocaron en filas levemente
separadas una de otra. Las placas de Petri se sellaron, se
inclinaron en un ángulo de 45º y se mantuvieron en la oscuridad
durante 6 días a 28ºC. Los hipocótilos se cortaron en largos trozos
de 1-3 mm con una hoja de afeitar afilada. Las hojas
se reemplazaron a menudo para evitar la maceración del material.
Los trozos de hipocótilos se colocaron en la solución TVL (ver
Apéndice) para plasmolisar las células. El material se trató durante
1-3 horas a temperatura ambiente. Este
pre-tratamiento mejora significativamente el
rendimiento de protoplastos intactos. La solución de preplasmolisis
se reemplazó con 8-10 ml de solución de enzima (ver
Apéndice). La solución de enzima debe cubrir todo el material pero
no debe utilizarse en exceso. El material se incubó a
20-25ºC en la oscuridad durante al menos 15 horas.
Las placas de Petri se mantuvieron en un agitador rotatorio con
agitación muy suave.
La mezcla de protoplastos y residuos celulares
se filtró a través de un filtro de tamaño de malla de 70 mm. Las
placas Petri se enjuagaron con 5-10 ml de solución
W5 (Menczel et al., 1981, Theor. Appl. Genet., 59,
191-195) (ver también el Apéndice) que también se
filtró y se combinó con el resto de la suspensión. La suspensión de
protoplastos se transfirió a tubos Falcon estériles de 40 ml y los
protoplastos se sedimentaron por centrifugación a 120 g durante 7
minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento de protoplastos se
resuspendió en sacarosa 0,5 M. La suspensión se colocó en tubos de
centrífuga estériles de 10 ml (8 ml por tubo) y cargados con 2 ml
de solución W5. Después de 10 minutos de centrifugación a 190 g los
protoplastos intactos se recogieron de la interfase con una pipeta
Pasteur. Se transfirieron a nuevos tubos de centrífuga, se
resuspendieron en manitol 0,5 M con CaCl_{2} 10 mM y se
sedimentaron a 120 g durante 5 minutos.
Los protoplastos fueron resuspendidos en el
tampón de transformación (ver Apéndice). La concentración de
protoplastos se determinó utilizando la cámara de recuento y luego
se ajustó a 1-1,5 x 10^{6} protoplastos/ml. La
gota de 100 \mul de esta suspensión se colocó en el borde
inferior de la placa de Petri de 6 cm inclinada y se dejó durante
unos pocos minutos permitiendo que los protoplastos sedimenten. Los
protoplastos se mezclaron entonces suavemente con
50-100 \mul de solución de ADN (purificado por
Qiagen, disuelto en TE a la concentración de 1 mg/ml). Luego se
agregaron 200 \mul de solución de PEG (ver Apéndice) gota a gota a
la mezcla de protoplastos/ADN. Después de 15-30
minutos el tampón de transformación (o solución W5) se agregó en
pequeñas alícuotas (gota a gota) hasta que la placa estuvo casi
llena (\sim6 ml). La suspensión se dejó sedimentar durante
1-5 horas. Luego los protoplastos se transfirieron
a tubos de centrífuga, se resuspendieron en solución W5 y se
sedimentaron a 120 g durante 5-7 minutos.
Los protoplastos se transfirieron a los medios
de cultivo 8 pM (Kao & Michayluk, 1975, Planta, 126,
105-110; ver también Apéndice) y se incubaron a
25ºC, con baja densidad de luz, en placas de Petri de 2,5 cm o 5 cm
con 0,5 ml o 1,5 ml de medio, respectivamente. La densidad de
protoplastos era de 2,5 x 10^{4} protoplastos/ml. Los tres
volúmenes de medio 8 pM fresco sin ninguna hormona se agregaron
inmediatamente después de la primera división de los protoplastos.
Las células se incubaron a alta intensidad de luz, 16 horas por
día.
Después de 10-14 días, las
células se transfirieron a medios K3 (Nagy & Maliga, 1976, Z.
Pflanzenphysiol., 78, 453-455) con sacarosa 0,1
M, agarosa 0,13%, 5-15 mg/l de PPT y la
concentración de hormona cuatro veces menor que en el medio 8 pM.
Para facilitar la transferencia al medio fresco, las células se
colocaron en la parte superior de papel de filtro estéril
distribuyéndolas cuidadosamente en una fina capa. Las células se
mantuvieron a alta intensidad de luz, 16 horas por día. Las colonias
de células se transfirieron a placas Petri con medio K3 de
diferenciación después de que su tamaño hubiera alcanzado
aproximadamente 0,5 cm de diámetro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo crecer una línea celular en suspensión
de T. monococcum L. en medio MS2 (sales MS (Murashige &
Skoog, 1962 Physiol. Plant., 15, 473-497),
0,5 mg/l de HCl de tiamina, 100 mg/l de inosit, 30 g/l de sacarosa,
200 mg/l de Bacto-Tryptone, 2 mg/l de
2,4-D) en matraces de 250 ml en un agitador
rotatorio a 160 rpm a 25ºC y se subcultivó semanalmente. Cuatro
días después de un subcultivo las células se dispersaron sobre
discos de papel de filtro estériles de 50 mm en un MS2 (4 g/l)
solidificado con gelrite con sacarosa 0,5 M.
Se llevó a cabo un bombardeo de microproyectiles
utilizando el Sistema de Suministro de Partículas Biolistic
PDS-1000/He (Bio-Rad). Las células
se bombardearon a 900-1100 psi, con una distancia de
15 mm desde un punto de lanzamiento de macroportador hasta la
pantalla de detención y una distancia de 60 mm desde la pantalla de
detención hasta el tejido diana. La distancia entre el disco de
ruptura y un punto de lanzamiento del macroportador era de 12 mm.
Las células se bombardearon después de 4 horas de pretratamiento
osmótico.
Se preparó un recubrimiento de ADN con oro de
acuerdo con el protocolo original de Bio-Rad
(Sanford et al., 1993, En: Methods in Enzymology, ed. R. Wu,
217, 483-509) como sigue: se mezclaron 25 \mul de
polvo de oro (0,6, 1,0 mm) en glicerol al 50% (60 mg/ml) con 5
\mul de ADN plasmídico a 0,2 \mug/\mul, 25 \mul de
CaCl_{2} (2,5 M) y 10 \mul de espermidina 0,1 M. La mezcla se
agitó en vórtice durante 2 minutos seguido por incubación durante
30 minutos a temperatura ambiente, centrifugación (2000 rpm, 1
minuto), lavado con etanol al 70% y al 99,5%. Finalmente, el
sedimento se resuspendió en 30 \mul de etanol al 99,5% (6
\mul/dosis).
Se llevó a cabo un nuevo procedimiento (PEG/Mg)
de recubrimiento de ADN con oro como sigue: 25 \mul de una
suspensión de oro (60 mg/ml en glicerol al 50%) se mezclaron con 5
\mul de ADN plasmídico en un tubo Eppendorf y posteriormente se
suplementaron con 30 \mul de PEG al 40% en MgCl_{2} 1,0 M. La
mezcla se agitó con vórtice durante 2 minutos y luego se incubó
durante 30 minutos a temperatura ambiente sin mezclar. Después de
la centrifugación (2000 rpm, 1 minuto) el sedimento se lavó dos
veces con 1 ml de etanol al 70%, una vez con 1 ml de etanol al
99,5% y se dispersó finalmente en 30 \mul de etanol al 99,5%. Se
cargaron alícuotas (6 \mul) de suspensión de ADN con oro en
etanol sobre discos macroportadores y se permitió que secaran
durante 5-10 minutos.
Se transformaron plásmidos en E. coli
cepa DH10B, se dejaron crecer maxipreparaciones en medio LB y se
purificó el ADN utilizando el kit de Qiagen.
Para experimentos de transformación estable, los
filtrados con las células tratadas se transfirieron sobre el medio
sólido MS2 con el agente selectivo apropiado esterilizado por
filtración (150 mg/l de higromicina D (Duchefa); 10 mg/l de
bialafos (Duchefa). Las placas se incubaron en la oscuridad a
26ºC.
Se hicieron crecer plantas de O.
violaceus in vitro en medio MS, Gelrite al 0,3%
(alternativamente, ½ MS, sacarosa al 2% y agar al 0,8%) a 24ºC y un
fotoperiodo de 16/8 horas día/noche durante 3-4
semanas. Se cortaron cuatro-seis hojas (dependiendo
del tamaño) en pequeños trozos y se transfirieron a la caja Magenta
con 30 ml de Medio Inductor de Callos (CIM) (ver Apéndice). El
material se mantuvo durante 4-5 semanas en luz
tenue (o en la oscuridad) a 24ºC y con agitación vigorosa. Durante
este periodo se agregó medio CIM fresco para mantener el tejido de
plantas en la caja Magenta cubierto con líquido. Las células
adheridas a la pared de la caja Magenta se liberaron al medio
invirtiendo y agitando vigorosamente la caja.
La alícuota de suspensión de células se colocó
cuidadosamente sobre el papel de filtro estéril soportado por medio
CIM sólido en una placa de Petri. La placa de Petri con el material
de plantas se mantuvo en la oscuridad durante 5-7
días. Cuatro horas antes del procedimiento, el papel de filtro con
células se trasladó a CIM fresco con 10% de sacarosa. El bombardeo
de microproyectiles se llevó a cabo como se ha descrito en el
Ejemplo 3. Catorce horas después del bombardeo, el material se
transfirió a CIM con 3% de sacarosa y se mantuvo en la
oscuridad.
Dos-cuatro días después del
bombardeo, el papel de filtro con células se transfirió a la placa
con CIM suplementado con el agente de selección apropiado
(10-15 \mug/ml de PPT). Cada siete días el
material se transfirió a medio de selección fresco. Las placas se
mantuvieron en la oscuridad y después de aproximadamente 6 semanas
el material de plantas se transfirió a las placas de Petri con Medio
Inductor de la Morfogénesis (MIM) (ver Apéndice) suplementado con
el agente de selección apropiado (10-15 \mug/ml de
PPT). Las placas se incubaron a alta intensidad de luz, duración
del día de 16 horas.
Se linealizó el constructo pIC052 (Fig. 6) por
digestión con enzima de restricción HindIII, se purificó en gel
para separar el material no digerido y se utilizó para el bombardeo
de microproyectiles como se ha descrito anteriormente (ver Ejemplo
3). El vector linealizado contiene el polienlazador de pUC19 (57 pb)
seguido por un sitio loxP a partir del extremo 5' del gen HPT. En
general, se localizan aproximadamente 100 pb en el extremo 5' del
codón de inicio de la traducción del gen HPT. Se transformaron
treinta y cuatro placas y después de 1,5 meses de selección sobre
medio que contenía higromicina (Ejemplo 3), se recuperaron tres
colonias resistentes a higromicina. La secuencia de los sitios de
integración recuperados por IPCR confirmó la independencia de los
tres transformantes.
La acetohidroxiácido sintasa (AHAS) de plantas
es una proteína nuclear codificada, dirigida a cloroplastos, que
cataliza la primera etapa en la biosíntesis de los aminoácidos de
cadena ramificada. Se halla bajo control alostérico por estos
aminoácidos y puede inhibirse por diversas clases de herbicidas.
Se preparó el constructo
pIC06-IRES reemplazando el promotor del gen
AHAS(Ser653-Asn) de Arabidopsis
(fragmento PstI-NcoI de 1,3 Kb) en pIC06 con la
secuencia IRES_{MP,75}^{CR}. El constructo final (Fig. 6)
contenía la versión mutada del gen de la acetohidroxiácido sintasa
(AHAS) de Arabidopsis con una única sustitución de
aminoácido (Ser653Asn) que confiere resistencia a la familia de
herbicidas de imidazolina (Sathasivan, Haughn & Murai, 1991,
Plant Physiol., 97, 1044-1050). El plásmido
se linealizó por tratamiento con la enzima de restricción SaII y se
usó para el bombardeo de microproyectiles de un cultivo en
suspensión de O. violaceous recientemente inducido. Se
cortaron hojas de plantas O. violaceous estériles en pequeños
trozos y se colocaron en el Medio de Alta Auxina (HAM) líquido (ver
Apéndice) en cajas Magenta en un agitador rotatorio para inducir un
cultivo en suspensión. Después de 7-14 días el
cultivo en suspensión se transfirió a las placas de Petri con Medio
para Verdeo (GM) cubiertas con papel de filtro estéril (ver
Apéndice). Después de 3 días el papel de filtro con las células se
transfirió a GM suplementado con sacarosa 0,4 M. Después de cuatro
horas las células se utilizaron para bombardeo de microproyectiles
con ADN linealizado de pIC06-IRES, como se ha
descrito en el Ejemplo 3. Después de 14 horas, el papel de filtro
con células se transfirió a GM, sacarosa al 3%. Dos días después,
las células se transfirieron a GM con imazetapir 0,7 \muM (AC263,
499 o Pursuit, American Cyanamid). Las células se cultivaron cada
7-10 días. Se identificaron supuestos
acontecimientos después de aproximadamente
cuatro-seis semanas y los transformantes se
seleccionaron bajo alta intensidad de luz, 16 horas por día, sobre
el medio de regeneración (RM) con imazetapir 1-2
\muM.
El objetivo de este ejemplo es demostrar la
posibilidad de manipulación con células de plantas transgénicas que
ya contienen secuencias de vectores de traducción con los sitios de
recombinación específicos de secuencia.
Las células de T. monococcum resistentes
a higromicina transformadas con el vector pIC052 (Ejemplo 5) se
usaron para co-bombardeo de microproyectiles con dos
plásmidos, pIC-DOG y pIC-CRE (Fig.
7). El plásmido pIC-DOG contiene ADNc de
2-desoxiglucosa-6-fosfato
(2-DOG-6P) fosfatasa sin promotor
(patente WO 98/45456) flanqueado por dos sitios loxP. La
integración mediada por Cre del gen
2-DOG-6-P en el
sitio loxP de transformantes que contienen pIC052 conduce a la
expresión de
2-DOG-6-P a partir
de un promotor residente. Tal expresión confiere resistencia a la
2-desoxiglucosa (2-DOG). Las
colonias resistentes se seleccionaron como se ha descrito en el
Ejemplo 3, pero utilizando 0,075-0,1% de
2-DOG como el agente selectivo.
El objetivo de este ejemplo es mostrar una vía
alternativa para la transformación directa de un vector de
traducción de dirección a un sitio de transcripción deseado en un
genoma hospedador.
La co-transformación de células
de O. violaceous con los constructos mostrados en la Fig. 8 y
la selección de transformantes se llevó a cabo como se ha descrito
en el Ejemplo 4. El elemento dSpm transponible no autónomo
contiene un gen BAR sin promotor precedido por su
IRES_{MP,75}^{CR} del extremo 5'. La transposición inducida por
transposasa Spm facilita la búsqueda de regiones
transcripcionalmente activas con un patrón de expresión deseado (en
este caso -constitutivo) en dicho genoma hospedador, incrementando
así el número de transformantes primarios recuperados. De hecho, el
número de transformantes fue 3-4 veces más alto que
con el gen BAR-IRES_{MP,75}^{CR} (pIC1301, Fig.
2).
El objetivo de este ejemplo es demostrar un
suministro de vectores de traducción en células de plantas mediado
por Agrobacterium.
Los constructos pICH3853, pICH4021, pICH4661 y
pICH4673 (Fig. 9A y B) se prepararon en base a vectores binarios
pICBV10 y pICBV2 (ver Fig. 11). Los constructos pICH3853 y pICH4021
contienen IRES-BAR precedido por tres sitios
aceptores de empalme (SA) de modo que facilitan la incorporación del
vector de traducción que codifica para BAR en los transcritos. Una
estrategia idéntica se usó para pICH4661 y pICH4673 que contienen
fusiones de IRES-HPT que confieren resistencia
frente a higromicina. Para comparar la eficiencia de vectores de
traducción versus vectores de transcripción, se incorporó también
el gen NPTII bajo control del promotor NOS en pICH3853 y pICH4021.
Los ADN-T de pICH3853 y pICH4021 se introdujeron en
plantas de Arabidopsis thaliana (Col-0) como
se describe en Bent et al., (1994, Science, 285,
1856-1860). Se cosecharon las semillas tres semanas
después de la infiltración al vacío y se dividieron en dos grupos
iguales. Un grupo se esterilizó y se seleccionó para transformantes
en medio GM + glucosa al 1% (Valvekens et al., 1988,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5536-5540.)
que contenía 50 mg l^{-1} de kanamicina. El otro grupo se hizo
germinar en tierra y se roció varias veces con solución de
fosfinotricina (50 \mug/ml). Se contó el número de transformantes
de cada experimento de selección. La relación del número de
transformantes obtenidos con vectores de traducción con respecto al
obtenido con vectores de transcripción (ppt^{R}:Km^{R}) estaba
aproximadamente en el rango de 1:10-1:25
dependiendo del constructo utilizado.
Todos los constructos descritos aquí se usaron
también para transformaciones de discos de hojas de Nicotiana
tabaccum mediadas por Agrobacterium (Horsh et al.,
1985, Science, 227, 1229-1231) e hipocótilo
de Brassica napus (cv. Westar) (Radke et al., 1988,
Theor. Appl. Genet., 75, 685-694). A pesar
de la diferencia de 10-20 veces en el tamaño del
genoma de Arabidopsis comparado con Brassica napus y
tabaco, respectivamente, la frecuencia de transformantes de
Brassica y tabaco obtenida con vectores de traducción, era
comparable a la de Arabidopsis (10-15 veces
más baja comparada con vectores de transcripción).
El objetivo de este ejemplo es demostrar la
posibilidad de producir proteínas farmacéuticas en plantas
utilizando un vector de traducción como un cassette de
expresión.
El reclonado de fusiones de traducción de
ubiquitina 11 de Arabidopsis (Gene Bank L05362) - proinsulina
humana (Gene Bank NM000207) y péptido señal de la calreticulina del
tabaco (Borisjuk et al., 1999, Nat Biotechnol., 17,
466-469) - ubiqutina11-proinsulina
humana como fragmentos NcoI-BamHI en el sitio
NcoI-BamHI de vector binario pICH5410 basado en
pCBV (ver Fig. 12), produciendo los constructos
pICH5410-UPI y pICH5410-CUPI,
respectivamente (Fig. 10).
Semillas inmaduras de las líneas PEN3, PEN5,
HGM100 de Pennisetum glaucum (10-15 días
post-antesis) fueron esterilizadas en la superficie
por inmersión en etanol al 70% durante 5 minutos, seguido por la
incubación en solución de hipoclorito de sodio al 1% con agitación
a 125 rpm durante 20 minutos y finalmente por 3 lavados en agua
destilada estéril. Se aislaron asépticamente embriones inmaduros
(1,0 mm de longitud, transparentes) y se colocaron, con un escutelo
hacia arriba, en un medio MS sólido (Murashige y Skoog 1962) con 2
mg/l de 2,4-D (MS2). Se seleccionaron los callos
nodulares compactos utilizando un estereomicroscopio y se
subcultivaron cada mes en MS2 fresco. Los cultivos se mantuvieron
en la oscuridad a 25ºC.
Se llevó a cabo la preparación del plásmido y el
bombardeo de microproyectiles como se describe en el Ejemplo 3.
Siete días después del bombardeo, los callos
tratados se transfirieron al medio de selección MS con 2 mg/l de
2,4-D y 150 mg/l de Higromicina B y se cultivaron en
la oscuridad. Dos a cuatro meses más tarde, los tejidos de callos
en crecimiento se subcultivaron en el medio de regeneración MS
suplementado con 5 mg/l de zeatina, 1 mg/l de quinetina, 0,1 mg/l
de 2,4-D y 100 mg/l de Higromicina B. Las plántulas
en regeneración se transfirieron a tarros con el medio MS sin
hormonas, de fuerza media, con 50 mg/l de Higromicina B. Las
plántulas totalmente desarrolladas se aclimataron durante
5-7 días en un medio líquido que contenía las sales
MS diluidas cuatro veces. Las plantas con raíces fuertes se
transplantaron a tierra y se cultivaron en condiciones de
invernadero hasta la madurez.
Para ensayar la presencia de proinsulina en
plantas transgénicas, la proteína soluble total se extrajo del
tejido de hojas homogeneizado, se separó mediante SDS/PAGE y las
proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en un
celda Trans-Blot de BioRad (Tzen et al.,
1990, Plant Physiol., 94, 1282-1289). Se
llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia con anticuerpos
monoclonales contra proinsulina.
Remojar las semillas en solución de PPM al 1%
durante al menos 2 horas (es preferible durante una noche). Lavar
las semillas en EtOH al 70% durante 1 minuto, luego esterilizar en
solución de cloro al 10% con SDS al 0,01% o Tween 20) en matraz de
250 ml colocado en el agitador rotatorio. Lavar las semillas en 0,5
l de agua estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
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Las soluciones de hormona se esterilizaron por
filtración y se agregaron a medios autoclavados.
Claims (34)
1. Un proceso para producir plantas o células de
plantas transgénicas capaces de expresar una secuencia codificante
transgénica de interés bajo el control transcripcional de un
promotor nuclear hospedador mediante la introducción en el genoma
nuclear de un vector que comprende en su transcrito una secuencia
para la unión a un ribosoma citoplásmico de plantas en una forma
funcional para el inicio de la traducción de una secuencia
codificante transgénica de interés aguas abajo y, posteriormente,
la selección de células de plantas o plantas que expresan dicha
secuencia codificante transgénica.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicho vector comprende adicionalmente una secuencia que
codifica un péptido señal de dirección entre dicha secuencia para la
unión a un ribosoma citoplásmico de plantas y dicha secuencia
codificante transgénica.
3. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicho vector comprende
adicionalmente una señal de terminación de la traducción aguas
arriba de dicha secuencia para la unión a un ribosoma citoplásmico
de plantas.
4. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho vector comprende
adicionalmente un sitio o sitios donadores o aceptores de empalme
aguas arriba de dicha secuencia para la unión a un ribosoma
citoplásmico de plantas y/o aguas abajo de dicha secuencia
codificante transgénica.
5. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho vector comprende
adicionalmente potenciadores de la traducción.
6. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho vector comprende
adicionalmente potenciadores de la transcripción.
7. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho vector comprende
adicionalmente regiones de unión a la matriz.
8. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho vector comprende
adicionalmente elementos aislantes.
9. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho vector comprende
adicionalmente uno o más cistrones aguas abajo de dicha secuencia
codificante transgénica, en donde dichos cistrones adicionales
están operativamente unidos a secuencias adicionales para la unión a
un ribosoma citoplásmico de plantas o están bajo control de uno o
más promotores.
10. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho vector comprende
adicionalmente uno o más sitios de recombinación reconocidos por
recombinasas.
11. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha secuencia para la unión a
un ribosoma citoplásmico de plantas es un sitio interno de entrada
al ribosoma.
12. El proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es de
origen viral de plantas.
13. El proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es de
origen de plantas.
14. El proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es de
origen distinto de plantas.
15. El proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en donde dicho sitio interno de entrada al ribosoma es un sitio
interno de entrada al ribosoma diseñado artificialmente.
16. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 15, en donde dicho péptido señal de dirección
se selecciona del grupo que consiste en un péptido de tránsito a
plastos, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido señal de
dirección nuclear, un péptido de dirección a vacuolas y un péptido
señal de secreción.
17. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha secuencia codificante
transgénica confiere una cualidad útil.
18. El proceso de acuerdo con la reivindicación
17, en donde dicha cualidad útil es de origen de plantas.
19. El proceso de acuerdo con la reivindicación
17, en donde dicha cualidad útil es de origen distinto de
plantas.
20. El proceso de acuerdo con la reivindicación
17, en donde dicha cualidad útil se diseña artificialmente.
21. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 17 a 20, en donde dicha secuencia codificante
transgénica que codifica dicha cualidad útil es un gen o un
fragmento del mismo en una orientación antisentido.
22. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 21, en donde dicho vector se incorpora
adicionalmente en un transposón de tal modo que se dirige el vector
a un sitio de transcripción deseado en dicho genoma nuclear
hospedador.
23. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho proceso se usa en
combinación con cualquier método de transformación dirigido a sitio
u homólogo que permite dirigir el vector al sitio de inserción
deseado.
24. El proceso de acuerdo con la reivindicación
23, en donde dicha secuencia codificante transgénica presente en
dicho vector representa sólo una parte de un gen de interés cuyo gen
se reconstruye hasta una longitud funcional como resultado de una
recombinación dirigida a sitio u homóloga u otra recombinación
específica.
25. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 24, en donde la traducción de una o varias de
dicha secuencia o secuencias codificantes de dicho vector es
dependiente del capuchón.
26. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 25, en donde la traducción de uno o varios
genes introducidos en dicho genoma nuclear mediante dicho proceso
se controla modificando el hospedador de tal modo que se potencia o
inhibe la traducción independiente de capuchón (cap) o se potencia o
inhibe la traducción dependiente del capuchón.
27. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 26, en donde dicho vector comprende
adicionalmente una región de terminación de la traducción y/o una
región de terminación de la transcripción funcional en dicha planta
y/o dicha célula.
28. El proceso de una de las reivindicaciones 1
a 27, en donde dicha planta o células de plantas transgénicas
expresan un gen de proteína supresora de silenciamiento génico
post-transcripcional transgénico.
29. El proceso de la reivindicación 28, en donde
dicho gen de proteína supresora de silenciamiento génico
post-transcripcional se introduce en dicho genoma
nuclear con dicho vector.
30. El proceso de la reivindicación 28, en donde
dicho gen de proteína supresora de silenciamiento génico
post-transcripcional se introduce en un vector
adicional.
31. El proceso de una de las reivindicaciones 28
a 30, en donde dicho gen de proteína supresora de silenciamiento
génico post-transcripcional se expresa bajo el
control traduccional de una secuencia para la unión a un ribosoma
citoplásmico de plantas.
32. El proceso de una de las reivindicaciones 28
a 30, en donde dicho gen de proteína supresora de silenciamiento
génico post-transcripcional se expresa bajo el
control traduccional de un promotor.
33. Un vector para transformar células de
plantas que comprende, opcionalmente después de la transcripción en
una célula hospedadora, una secuencia para la unión a un ribosoma
citoplásmico de plantas para el inicio de la traducción y, aguas
abajo de la misma, una secuencia codificante de interés, estando
dicho vector carente de un promotor funcional para la transcripción
de dicha secuencia codificante.
34. Células de plantas o plantas que expresan
una secuencia codificante transgénica de interés bajo el control
transcripcional de un promotor nuclear hospedador, teniendo dichas
células de plantas o plantas introducido en el genoma nuclear un
constructo que comprende en su transcrito una secuencia para la
unión a un ribosoma citoplásmico de plantas de una forma funcional
para el inicio de la traducción de la secuencia codificante
transgénica de interés aguas debajo de dicha secuencia para la unión
a un ribosoma citoplásmico de plantas.
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