KR102118787B1 - 까마중의 형질전환방법 및 형질전환된 까마중 - Google Patents

까마중의 형질전환방법 및 형질전환된 까마중 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 준비하는 단계; 까마중 자엽을 MS 배지에 배양하여 증식하는 단계; 상기 아그로박테리움을 상기 까마중 자엽과 공조배양하여 형질전환된 까마중 자엽을 얻는 단계; 상기 형질전환된 까마중 자엽을 선발배지에 치상하고, 암상태로 배양하는 단계; 및 암배양된 까마중 자엽을 명배양하여 까마중 신초를 얻는 단계;를 포함하는 까마중의 형질전환방법 및 본 발명의 형질전환방법을 통하여 형질전환된 까마중 식물체를 개시한다.

Description

까마중의 형질전환방법 및 형질전환된 까마중{Transformation method of Solanum nigrum and Transgenic Solanum nigrum}
본 발명은 까마중의 형질전환방법 및 상기 방법에 의하여 형질전환된 까마중에 관한 것으로서, 구체적으로, 아그로박테리움을 활용하여 까마중의 형질을 전환하는 방법과 유전자가위(CRISPR/cas9)법을 접목하여 까마중의 형질을 전환하는 방법, 및 상기 방법들에 의하여 형질전환된 까마중에 관한 것이다.
까마중(Solanum nigrum)은 솔라눔 속의 식물로서 품종개량에 의한 인위적인 선발이 제한적으로 이루어진 종에 해당한다. 야생형 까마중은 안토시아닌과 같은 항산화 물질, 글라이코알칼로이드 내지 세린-프로티에이즈(Serine protease)와 같은 이차대사산물을 포함하고 있으며, 한방에서는 그 줄기와 잎에 해열, 진통 기능이 있는 것으로 보았으며, 뿌리는 이뇨제로 사용하여 왔다.
더불어, 솔라눔 속의 다른 종들에 비하여 까마중은 생장속도가 빠른 편이며, 동시에 토마토 및 감자와 유사한 생장패턴을 보인다. 그러므로, 솔라눔 속의 유전자 기능을 연구하기 위한 모델식물 내지는 유전공학적 도구로서 까마중을 활용하는 방안을 강구할 필요가 있으나, 이에 대한 구체적인 방안은 제시되지 않은 상태이다. 따라서, 까마중은 유전공학적인 접근을 통한 개발의 잠재력이 큰 작물이라고 할 것이다.
한편, 생물의 형질전환 방법으로서 아그로박테리움(Agrobacterium)속의 균을 활용하는 아그로박테리움법, 원형질 상태의 식물세포를 활용하는 프로토플라스트(protoplast)법, 및 강한 외력을 투사하여 세포에 직접 DNA 등을 주입하는 유전자총(gene gun)법 등을 고려할 수 있다. 그 중 식물체의 유전자 변형에 있어서는, 상대적으로 낮은 공정단가가 요구되며 동시에 높은 성공률을 보이는 아그로박테리움법이 흔히 사용된다.
아그로박테리아움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 Ti-플라스미드(Ti-plasmid)를 포함하는 균이다. Ti-플라스미드는 아그로박테리아움 투메파시엔스가 병원성을 띠게 되는 원인인 플라스미드이며, Ti-플라스미드 내의 T-DNA(Transferred DNA) 영역에 해당하는 염기서열이 식물세포로 이행된다. 특히, T-DNA가 식물세포로 전이됨에 있어서, 말단의 직렬반복 배열이 핵심적인 역할을 수행한다는 점은 잘 알려져 있다. T-DNA 내부의 배열은 임의의 염기서열로 치환함으로써 식물세포에 원하는 형질을 도입할 수 있다. 다만, 까마중의 형질전환방법으로서 아그로박테리움을 활용하는 구체적인 방안은 제시되지 않은 상태이다.
한편, 유전자가위를 활용하여 유전체의 일부 염기서열을 선택적으로 교정하는 방법이 지속적으로 개발되어 왔다. 크게 핵산가수분해효소를 활용하는 징크핑거 뉴클레이즈(ZFNs, Zinc Finger Nucleases)법 및 탈렌(TALENs, Transcription Activator-Like Effector Nucleases)법과 gRNA(Guide RNA)과 Cas단백질의 복합체를 활용하는 크리스퍼(CRISPR)법이 있다.
특정 핵산가수분해효소를 합성하기 위하여 많은 비용이 소모되고, 반응자리 특이성이 제한적인 징크핑거 뉴클레이즈법 및 탈렌법과 달리, 크리스퍼법은 적은 비용으로 높은 반응자리 특이성을 확보할 수 있다. 다만, 크리스퍼법을 특정 종에 적용하기 위해서는 최적화 작업이 선행될 필요가 있으며, 까마중에 크리스퍼법을 적용하는 방법은 구체적으로 제시되지 않은 상태이다.
한국등록특허 제10-1647789호
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하고자 안출된 것으로서, 까마중의 구체적인 형질전환방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 형질이 전환된 까마중 식물체를 제공하여 까마중의 활용성을 증대하는 것을 다른 목적으로 한다.
상술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 명세서는 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 준비하는 단계; 까마중 자엽을 MS 배지에 배양하여 증식하는 단계; 상기 아그로박테리움을 상기 까마중 자엽과 공조배양하여 형질전환된 까마중 자엽을 얻는 단계; 상기 형질전환된 까마중 자엽을 선발배지에 치상하고, 암상태로 배양하는 단계; 및 암배양된 까마중 자엽을 명배양하여 까마중 신초를 얻는 단계;를 포함하는 까마중의 형질전환방법을 개시한다.
본 발명의 까마중의 형질전환방법에 있어서, 본 발명의 벡터는 재조합 벡터인 것이 바람직하며, 더불어, 본 발명의 벡터는 재조합 바이너리벡터(Binary vector)인 것이 바람직하다. 아울러, 본 발명의 바이너리벡터는 gRNA및 Cas9 단백질을 코딩하는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 서열식별번호: 1의 염기서열과 상보적으로 결합하는 gRNA 및 서열식별번호: 2와 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 것이 가장 바람직하다.
추가로, 본 명세서는 본 발명의 까마중의 형질전환방법을 통하여 생산된 것을 특징으로 하는 형질전환된 까마중 식물체를 개시한다. 구체적으로, 본 발명의 형질전환된 까마중 식물체는 식물세포 내에 플라스미드 내지 바이너리벡터가 삽입되어 형질전환되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 바이너리벡터는 gRNA및 Cas9 단백질을 코딩하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 gRNA는 서열식별번호: 1의 염기서열과 상보적으로 결합하는 gRNA 및 서열식별번호: 2와 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 것이 가장 바람직하다.
상술한 과제해결수단을 통하여, 본 발명은 까마중의 구체적인 형질전환방법을 제공할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 형질전환방법을 통하여 까마중에 신규한 염기서열을 삽입하거나, 까마중의 염기서열 중 특정 염기서열에 결실변이를 유도하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 까마중의 형질전환방법을 활용함으로써, 솔라눔 속의 유전자 기능연구의 효율을 현저히 개선할 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 형질전환방법을 통하여 형질이 전환된 까마중 식물체를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 까마중의 형질전환방법과 종래 마이크로톰의 형질전환방법을 시간의 변화에 따라 비교하여 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 까마중의 형질전환방법에 사용된 벡터의 구조를 나타낸 개념도이다.
도 2b는 본 발명의 까마중의 형질전환방법의 적용결과를 PCR을 통하여 검증한 것이다.
도 2c는 GUS 염색을 통하여 리포터 유전자의 발현여부를 확인한 것이다.
도 3a 내지 3b는 토마토의 Lazy 1 염기서열 및 상기 염기서열에 상응하는 까마중의 염기서열을 비교하여 도시한 것이다.
도 3c는 본 발명의 CRISPR/Cas9의 타겟 염기서열의 위치를 표시한 개념도이다.
도 4a는 본 발명의 형질전환방법에 의하여 까마중에 도입된 T-DNA의 구조에 대한 개념도이다.
도 4b는 PCR을 통하여 T0 식물체로부터 NPTⅡ 염기서열의 유무를 검증한 결과이다.
도 5a는 PCR을 통하여 형질전환된 까마중 식물체의 부분적 결손 유무를 검증한 결과이다.
도 5b 내지 도 5c는 부분적 결손이 발생한 염기서열 부위의 개념도 및 부분적 결손이 발생한 실제 염기서열이다.
본 출원에서 사용하는 용어는 단지 특정한 예시를 설명하기 위하여 사용되는 것이다. 때문에 가령 단수의 표현은 문맥상 명백하게 단수여야만 하는 것이 아닌 한, 복수의 표현을 포함한다. 덧붙여, 본 출원에서 사용되는 "포함하다" 또는 "구비하다"등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 기능, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 명확히 지칭하기 위하여 사용되는 것이지, 다른 특징들이나 단계, 기능, 구성요소 또는 이들을 조합한 것의 존재를 예비적으로 배제하고자 사용되는 것이 아님에 유의해야 한다.
한편, 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진 것으로 보아야 한다. 따라서, 본 명세서에서 명확하게 정의하지 않는 한, 특정 용어가 과도하게 이상적이거나 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.
아울러, 본 명세서 상에서 단수형인 용어는 복수 또한 포함하고 있는 것으로 보아야 하며, 문맥이 의미하는 바에 따라 특정 용어가 복수 개를 지칭하는 것인지 단수 개를 지칭하는 것인지 파악하여야 한다. 가령, 본 명세서 상의 "gRNA"는 단수개의 gRNA뿐만 아니라 복수 개의 서로 구별이 가능한 gRNA들을 지칭하기 위하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "유전자"라는 용어는 염기서열로서 코딩서열 및 연관된 발현 조절 서열을 의미한다. 상기 코딩서열은 특정 유전자에 따라 gRNA, mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA 등인 RNA로 전사된다. 조절 서열의 예로는 프로모터 서열, 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열 등이 있다.
본 명세서에서, "벡터"라는 용어는 표적인 생물종의 외부로부터 도입되어, 상기 생물종의 세포에 삽입될 수 있는 유전자 일반을 의미한다. 벡터가 삽입된 세포를 숙주세포라 간략히 칭한다. 벡터에 포함된 염기서열은 복제가 가능하며, 숙주세포 내에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 한편, "재조합 벡터"는 목적한 코딩서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩서열을 발현하는데 필수적인 적정염기서열을 포함하는 재조합 유전자 일반을 의미한다. 따라서, 동일한 맥락에서, "재조합"은 목적한 코딩서열과 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩서열을 발현하는데 필수적인 적정염기서열을 특정 염기서열에 추가하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "까마중조직"이라 함은 분화된 또는 미분화된 까마중조직 일반을 모두 포함한다. 가령, 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 꽃가루, 잎, 줄기, 뿌리, 싹, 종자, 원형질체, 및 캘러스 등의 조직이 예시된다. 또한, 상기 까마중조직은 식물체 내의 식물조직이거나, 기관배양, 조직배양, 및 세포배양 등에 의하여 얻어진 까마중조직을 모두 포함한다.
아울러, 본 명세서에서, 형질전환에 이용되는 "까마중세포"는 어떠한 까마중의 세포여도 무방하다. 가령, 예시로서 배양세포, 배양조직, 배양기관, 까마중의 식물체로부터 얻어지는 세포 등을 모두 고려할 수 있다. 까마중의 식물체로부터 얻어진 세포는 꽃가루, 잎, 줄기, 뿌리, 싹, 종자 등으로부터 얻어지는 세포 일반을 모두 포함한다.
또한, 본 명세서에서, "형질전환"이라 함은 프로모터와 작동 가능하게 연결되며 유용물질의 코딩서열을 포함하는 외인성 유전자가 삽입되어, 식물체의 유전체에 일부 변화가 발생하는 것을 의미한다. 식물체의 형질전환은 새로운 단백질의 생산 내지 종래 생산되던 단백질의 변형을 초래한다. 새로운 단백질이 생산되거나 종래 생산되는 단백질이 변형되는 것을 "발현"이라 한다. 다만, 식물체의 외형 변화 여부는 형질전환 여부에 반드시 수반되어야 하는 것은 아니다.
한편, 본 명세서에서 사용되는 "모델식물"은 식물체의 특성을 연구하기 위하여 활용되는 식물을 의미하며, 정확히는 유전공학적 연구에 있어서, 다른 식물체의 예시가 될만한 식물을 의미한다. 예컨대, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 형질전환방법을 적용함으로써 까마중을 솔라눔 속의 야생 및 약용식물체를 육종하는데 모델식물로서 활용할 수 있으며, 종래의 모델식물이라 할 수 있는 마이크로톰(Micro-Tom.)에 비하여 형질전환 기간과 방법측면에서 개선된 특성을 가진다.
<1. 까마중의 형질전환방법>
본 명세서는 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 준비하는 단계; 까마중 자엽을 MS 배지에 배양하여 증식하는 단계; 상기 아그로박테리움을 상기 까마중 자엽과 공조배양하여 형질전환된 까마중 자엽을 얻는 단계; 상기 형질전환된 까마중 자엽을 선발배지에 치상하고, 암상태로 배양하는 단계; 및 암배양된 까마중 자엽을 명배양하여 까마중 신초를 얻는 단계;를 포함하는 까마중의 형질전환방법을 개시한다. 이하에서는 유전공학적인 접근을 통한 까마중의 형질전환방법과 관련하여, 각 단계를 세분화하여 서술하기로 한다.
<1-1. 아그로박테리움을 준비하는 단계>
(1) 재조합 벡터의 준비
본 발명의 까마중의 형질전환방법은 아그로박테리움을 매개로 하여 까마중세포에 유전자를 도입하는 것을 기본 골자로 한다. 적당한 숙주세포가 존재한다는 전제하에, 아그로박테리움은 Ti-플라스미드 상에 존재하는 T-DNA를 상기 숙주세포의 내부로 삽입시키는 특성을 가진다. 따라서, T-DNA의 염기서열 중 병원성을 띠게 하는 염기서열을 제거하고 목적하는 염기서열을 추가하는 방식으로, 숙주세포의 내에 원하는 염기서열을 삽입할 수 있게 된다.
본 발명의 까마중의 형질전환방법에 있어서, 본 발명의 벡터는 재조합 벡터인 것이 바람직하다. 본 발명의 재조합 벡터에 사용될 벡터로서, 특별한 제한은 없으나, 까마중에 도입이 가능한 벡터이면 충분하다. 가령, pBI계, pPZP계, pSMA계, pUC계, pBR계 등의 플라스미드 벡터나, pBI계 등의 바이너리 벡터 등을 고려할 수 있다.
상기 벡터의 예시들에 목적하는 염기서열을 삽입하는 방법으로서 당해 기술분야에 개시된 공지의 방법을 사용할 수 있다. 가령, 적당한 제한효소를 사용하여 상기 벡터의 염기서열의 특정 부분을 절단하고, 상기 목적하는 염기서열을 연결하는 방법을 활용할 수 있다.
본 발명의 T-DNA는 "T-DNA 경계영역(좌경계영역(LB) 및 우경계영역(RB))"에 의하여 다른 염기서열과 구별될 수 있다. 상기 T-DNA 경계영역은 각각 식물 세포로의 이동에 충분한, 약 25 뉴클레오티드 길이 염기서열을 의미한다. 따라서, 본 발명은 야생형 Ti-플라스미드로부터 자연 발생하는 모든 T-DNA 경계영역뿐만 아니라, 인공적으로 합성된 T-DNA 경계영역까지 모두 포함하며, T-DNA 경계영역의 구체적인 염기서열에 의하여 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터 상에는 상기 좌경계영역과 상기 우경계영역의 사이에 전사되는 것을 목적하는 염기서열과 프로모터, 인핸서, 및 터미네이터 등의 조절영역, 선발마커 유전자 또는 리포터 유전자 등의 염기서열이 연결되어 있을 수 있다.
가령, 본 발명의 프로모터는 식물세포에서 작동이 가능한 프로모터인 것이 바람직하며, 까마중세포 내에서 작동이 가능한 프로모터인 것이 더욱 바람직하다. 예시로서, 노팔린 합성효소 유전자의 프로모터(pNOS), 옥수수 유래 유비퀴틴 프로모터, 벼 유래의 액틴 프로모터, 담배 유래 PR 단백질 프로모터 등을 고려할 수 있다.
또한, 본 발명의 터미네이터는 식물세포에서 작동이 가능한 터미네이터인 것이 바람직하며, 까마중세포 내에서 작동이 가능한 터미네터인 것이 더욱 바람직하다. 예시로서, 노팔린 합성 효소(NOS) 유전자의 터미네이터, 옥토핀 합성 효소(OCS) 유전자의 터미네이터, 대장균 리포폴리프로테인 lpp의 3' 터미네이터, trp 오페론 터미네이터, amyB 터미네이터, ADH1 유전자의 터미네이터 등을 고려할 수 있다.
또한, 본 발명의 선발마커 유전자의 예시로서, 테트라 사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자와 같은 약제 내성 유전자의 사용이 가능하다. 한편, 본 발명의 리포터 유전자의 예시로서, 루시페라제, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(GUS), 또는 녹색형광단백질(GFP), 네오마이신 포스포트랜스페라제 Ⅱ(NPT Ⅱ), 디히드로엽산 환원효소 등의 효소 유전자를 고려할 수 있다.
(2) CRISPR system의 준비
본 발명의 까마중의 형질전환방법에 있어서, 본 발명의 벡터는 재조합 바이너리벡터(Binary vector)인 것이 바람직하다. 본 발명의 재조합 바이너리벡터에 관하여, 상기 <(1) 재조합 벡터의 준비>에 기재된 내용이 준용된다. 따라서, 본원발명의 재조합 바이너리벡터 상에 반드시 후술할 CRISPR system만이 도입되어야만 하는 것은 아니다.
본 발명의 바이너리벡터는 gRNA및 Cas9 단백질을 코딩하는 것이 더욱 바람직하다. CRISPR system은 gRNA와 Cas9 단백질(이하 "Cas9")을 포함한다. 사전적인 의미에서, CRISPR(클러스터링된 규칙적 사이 공간을 둔 짧은 팔린드롬 반복부)는 다수의 원핵생물(예를 들어, 박테리아 및 고세균)의 게놈 내에서 발견되는 게놈 좌위를 의미한다. 또한, CRISPR 좌위는 본래 원핵생물 내 이질적 침입자(예를 들어, 바이러스, 파지)에 대하여 내성을 제공한다.
본 발명의 gRNA와 Cas9은 복합체를 형성하여, 표적 DNA의 염기 사이의 결합을 절단할 수 있다. 상기 복합체에서 통상적으로 gRNA는 Cas9의 절단 부위 밖에 결합되거나 절단 부위 안에 결합된다. 상기 gRNA가 절단 부위 안/밖에 결합되어 있는지에 따라서, 절단되는 염기서열과 Cas9 사이의 상호작용 유무가 달라질 수 있다. gRNA가 특정 DNA 서열에 상보적으로 결합함으로써, 절단될 결합을 특정하게 된다. 실질적인 절단은 Cas9에 의하여 수행되며, Cas9에서 실질적으로 결합 절단에 기여하는 도메인은 NHN 도메인과 RuvC 도메인인 것으로 알려져 있다.
따라서, 상기 gRNA의 구체적인 염기서열을 달리 함으로써 절단이 발생하는 결합을 변경할 수 있으며, 이는 본 발명의 형질전환방법의 범용성을 의미한다. 본 발명의 형질전환방법에 따라, 바이너리벡터를 까마중에 도입함으로써, 까마중의 유전체 중 어느 서열의 조작도 가능하다. 따라서, 실시예의 gRNA 및 그와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열에 대한 서술은 본 발명의 중요한 기술적 특징 중 하나라고 할 것이나, 본 발명의 과제해결원리가 반드시 특정 염기서열에 한정되는 것은 아니다.
<1-2. 까마중을 배양하는 단계>
(1) 까마중 자엽을 증식하는 단계
본 발명의 까마중의 형질전환방법은 아그로박테리움을 까마중 자엽에 도입하여 형질전환된 까마중 자엽을 얻는 단계를 포함한다. 이를 위해서는 우선하여, 형질전환에 사용될 까마중 자엽을 증식하는 단계가 수행될 수 있다.
다만, 본 발명의 까마중의 형질전환방법에 있어서 별도의 전배양 단계는 수반되지 않는다. 식물체로부터 얻어진 자엽이 안정적으로 재생될 수 있도록 아그로박테리움의 접종 전에 가지는 휴식기를 상기 '전배양'기간이라고 한다. 까마중의 경우, 본래 조직의 재생이 빠르게 일어나는 바, 전배양을 생략하여도 아그로박테리움을 통한 형질전환 효율이 높다. 전배양 기간을 생략하여, 전체 형질전환에 요구되는 시간을 단축시킨 것이 본 까마중의 형질전환방벙의 특장점 중 하나라고 할 수 있다. 한편, 전배양 단계의 생략은 본 발명의 유전자가위법을 통한 염기서열의 편집에 있어서 위양성(false-positive)의 감소로 이어지게 된다.
본 발명의 까마중 증식을 위한 배지는 MS(Mursahige and Shoog medium) 배지인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 MS 배지에는 필요에 따라 적당량의 아세토시링곤(Acetosyringone, 이하 "AS")을 첨가하여 MS 배지를 준비한다. 그 외에 증식을 돕기 위하여, 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원 등을 첨가하는 것이 가능하다.
또한, 까마중의 자엽에 물리력을 투사하여 상처를 유도한다. 본 발명의 까마중을 활용함에 있어서, 유상부위 상에 특별한 제한은 없다. 즉, 까마중의 자엽뿐만 아니라, 전술한 꽃가루, 잎, 줄기, 뿌리, 싹, 및 종자 등에 유상부위를 조성하는 것이 가능하다. 다만, 생장이 용이하지 않은 까마중 자엽을 활용함에도 높은 형질전환율을 확보할 수 있다는 것이 본 발명의 일 효과라고 할 수 있다.
(2) 공조배양하는 단계
유상부위를 가진 까마중 자엽이 증식된 후에, 아그로박테리움을 까마중 자엽에 도입하여 형질전환된 까마중 자엽을 얻는 단계가 진행된다. 구체적으로, AS가 포함된 MS 배지에 유상부위가 존재하는 까마중 자엽을 첨가한 후에, 상기 <1-1. 아그로박테리움을 준비하는 단계>를 통하여 얻어진 형질전환된 아그로박테리움을 첨가한다.
상기 아그로박테리움은 미리 균일하게 분산시켜 첨가될 수도 있으며, 까마중 자엽을 건조시키고 다시 공조배양하는 단계를 추가할 수도 있다. 분산이 방식에는 특별한 제한이 없으며, 마찬가지로 까마중 자엽을 건조 후 다시 공조배양하는 횟수 또한 제한이 없다. 이는, 아그로박테리움과 까마중 자엽의 접촉면적 및 접촉횟수를 증가시켜 형질전환율을 증가시키는 요인이 된다.
본 발명의 공조배양 배지는 MS 배지인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 MS 배지에는 필요에 따라 적당량의 AS을 첨가하여 공조배양 배지를 준비한다. 그 외에 증식을 돕기 위하여, 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원 등을 첨가하는 것이 가능하다. 또한, 배지를 고형화하기 위하여, 고형제로 한천 등을 추가하는 것이 바람직하다.
(3) 계대배양하여 선발하는 단계
본 발명의 까마중의 형질전환방법은 형질전환된 까마중 자엽을 선발배지에 치상하고, 암상태로 배양하는 단계를 포함한다. 우선하여, 상기 공조배양하는 단계를 통하여, 아그로박테리움이 도입된 까마중 자엽을 선발배지에 치상하여 암배양한다. 암배양 기간은 약 2주 정도의 기간인 것이 바람직하다. 상기 암배양은 막눈(adventitious bud)와 부정지(adventitious shoot)가 형성된 직후 중지되는 것이 바람직하다. 이는, 상기 부정지가 일단 발생한 후에는 명상태에서 비로소 정상적인 식물체로 성장할 수 있기 때문이다. 암배양이 상기 기간보다 길어지는 경우, 까마중 식물체의 재생효율이 감소하게 된다. 암배양을 통하여, 아그로박테리움의 벡터가 까마중세포 내로 충분히 도입되는 동시에, 형질전환된 까마중 식물체의 재생효율을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 암배양을 위한 선발배지는 MS 배지인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 MS 배지에는 필요에 따라 적당량의 AS을 첨가하여 선발배지를 준비한다. 그 외에 증식을 돕기 위하여, 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원 등을 첨가하는 것이 가능하다. 또한, 배지를 고형화하기 위하여, 고형제로 한천 등을 추가하는 것이 바람직하다.
아울러, 생장조절제로서 Zeatin riboside, IAA 등을 첨가하는 것이 바람직하며, 선발에 활용한 항생제를 추가하는 것이 바람직하다. 다만, 까마중 자엽에 도입된 내성 유전자의 종류에 따라 선발배지에 첨가하는 항생제를 결정한다. 가령, 카나마이신 내성 유전자가 까마중 자엽에 도입된 경우, 선발배지에는 카나마이신을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 까마중의 형질전환방법은 암배양된 까마중 자엽을 명배양하여 까마중 신초를 얻는 단계를 포함한다. 명배양을 통하여, 아그로박테리움이 접종된 까마중 자엽으로부터 신초의 발생을 유도한다. 명배양이 이루어지는 배지는 암배양이 진행된 선발배지와 동일하다. 명배양은 신초가 충분히 유도될 수 있도록 2주 이상 진행하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 명배양을 통하여 유도된 까마중 신초를 신장시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 신초를 신장시키는 단계는 광도 및 온도가 일정하게 유지되는 상태로 신초신장배지에서 진행된다.
본 발명의 신초신장을 위한 상기 신초신장배지는 MS 배지인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 MS 배지에는 필요에 따라 적당량의 AS을 첨가하여 신초신장배지를 준비한다. 그 외에 증식을 돕기 위하여, 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원 등을 첨가하는 것이 가능하다. 또한, 배지를 고형화하기 위하여, 고형제로 한천 등을 추가하는 것이 바람직하다.
아울러, 생장조절제로서 Zeatin riboside, IAA 등을 첨가하는 것이 바람직하며, 선발에 활용한 항생제를 추가하는 것이 바람직하다. 다만, 까마중 자엽에 도입된 내성 유전자의 종류에 따라 신초신장배지에 첨가하는 항생제를 결정한다. 가령, 카나마이신 내성 유전자가 까마중 자엽에 도입된 경우, 선발배지에는 카나마이신을 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 줄기가 신장된 까마중 신초를 발근배지에 치상하여, 발근시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 발근을 유도 위한 상기 발근배지는 MS 배지인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 MS 배지에는 필요에 따라 적당량의 AS을 첨가하여 발근배지를 준비한다. 그 외에 증식을 돕기 위하여, 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원 등을 첨가하는 것이 가능하다. 또한, 배지를 고형화하기 위하여, 고형제로 한천 등을 추가하는 것이 바람직하다. 더불어, 상기 선발배지에 첨가하였던 항생제를 추가하는 것이 바람직하다.
<2. 모델식물로서의 까마중>
이하에서는, 상기 <1. 까마중의 형질전환방법>을 통하여 얻어진 형질전환된 까마중의 특장점에 대하여 서술하기로 한다. 본 명세서는 본 발명의 까마중의 형질전환방법을 통하여 생산된 것을 특징으로 하는 형질전환된 까마중 식물체를 개시한다. 본 출원인들은 솔라눔 속의 형질전환에 있어서, 종래의 모델식물인 마이크로 톰(Micro tom.) 등에 비하여 까마중이 모델식물로서 더욱 적합함을 발견하였다. 까마중은 높은 형질전환율을 보일 뿐만 아니라, 형질발현에 요구되는 기간도 상대적으로 매우 짧다는 특징이 있다.
도 1은 본 발명의 까마중의 형질전환방법과 종래 마이크로톰의 형질전환방법을 시간의 변화에 따라 비교하여 도시한 것이다. 까마중의 형질전환은 상기 <1. 까마중의 형질전환방법>에 기재된 방법을 통하여 이루어졌다. 한편, 마이크로 톰은 Sun et al. (2006)이 개시한 종래 잘 알려진 방법을 통하여 형질전환 된 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 형질전환방법을 통하여 얻어진 형질전환된 까마중의 결실을 얻는 시기가 종래 모델식물인 마이크로 톰에 비하여 약 8주 정도 빨라진 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는 전반적인 형질전환 실험의 시적 효율이 약 36%이상 개선되었음을 의미한다.
아울러, 본 발명의 형질전환된 까마중은 선발이 1주 이내에 이루어진다는 것을 확인할 수 있다. 반면, 마이크로 톰은 선발자체에 2주가 소요되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 형질전환된 까마중은 상대적으로 조기에 형질전환여부의 확인이 가능하며, 조기선발을 통하여 형질전환에 소요되는 인적, 물적, 시적 비용을 절약할 수 있다는 장점을 가진다.
이하, 첨부한 도면 및 실시예들을 참조하여 본 명세서가 청구하는 바에 대하여 더욱 자세히 설명한다. 다만, 본 명세서에서 제시하고 있는 도면 내지 실시예 등은 통상의 기술자에게 의하여 다양한 방식으로 변형되어 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 본 명세서의 기재사항은 본 발명을 특정 개시 형태에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 균등물 내지 대체물을 포함하고 있는 것으로 보아야 한다. 또한, 첨부된 도면은 본 발명을 통상의 기술자로 하여금 더욱 정확하게 이해할 수 있도록 돕기 위하여 제시되는 것으로서 실제보다 과장 되거나 축소되어 도시될 수 있다.
<3. 실시예 및 평가>
<3-1-1. 실시예 1: 플라스미드의 도입>
도 2a는 본 발명의 까마중의 형질전환방법에 사용된 벡터의 구조를 나타낸 개념도이다. 본 발명의 플라스미드를 도입하는 방법은 상기 <1. 까마중의 형질전환방법>에 기재된 바를 준용한다. 실시예 1의 형질전환된 까마중을 얻기 위하여, pBI계 플라스미드를 아그로박테리움를 통하여 까마중에 도입하였다. 선발마커 유전자는 카나마이신에 대하여 저항성을 나타내는 NPTⅡ였으며, 리포터 유전자는 GUS 유전자였다. 플라스미드의 도입에 사용된 각 배지의 구체적인 조성은 하기 [표 1]과 같다. 모든 배지는 고온(121℃)/고압(15 psi)멸균기에서 15분 이상 멸균하였으며, 생장조절제 및 항생제는 여과 살균한 것을 고온/고압 멸균된 배지에 첨가하였다.
배지 중분류 소분류 농도
M
S
배
지		 대량원소 CaCl2 2.99 mM
KH2PO4 1.25 mM
KNO3 18.79 mM
MgSO4 1.5 mM
NH4NO3 20.61 mM
미량원소 CoCl2·6H2O 11 μM
CuSO4·5H2O 0.1 μM
FeNaEDTA 100 μM
H3BO3 100.27 μM
KI 5 μM
MnSO4·2H2O 100 μM
Na2MoO4·2H2O 1.03 μM
ZnSO4·7H2O 29.91 μM
비타민 myo-inositol 100 mg/L
Nicotinic acid 1 mg/L
pyridoxineHCl 1 mg/L
thiamineHCl 10 mg/L
탄소원 sucrose 30 g/L
공조배양배지 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
페놀계화합물 아세토시링곤(AS) 100 mM(in DMSO or DMF)
선
발
배
지		 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
생장조절제 Zeatin riboside 2 mg/L
IAA 0.2 mg/L
항생제 Kanamycin 100 mg/L
Cefotaxime 200 mg/L
신
초
신
장
배
지		 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
생장조절제 Zeatin riboside 1 mg/L
IAA 0.1 mg/L
항생제 Kanamycin 100 mg/L
Cefotaxime 200 mg/L
발
근
배
지		 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
항생제 Kanamycin 100 mg/L
Cefotaxime 200 mg/L
<3-1-2. 평가 1: 플라스미드 도입을 통한 형질전환의 검증>
도 2b는 본 발명의 까마중의 형질전환방법의 적용결과를 PCR을 통하여 검증한 것이다. 구체적으로 T0 까마중에 GUS 유전자가 도입되었는지 유무를 PCR을 통하여 확인하였다. 도 2b의 상단에 기재된 숫자는 각각 까마중 개체(T0)의 번호를 의미하며, w는 야생형 까마중 개체이며, +는 pBI121 플라스미드이다.
카나마이신이 첨가된 선발배지에서 재생된 20개의 T0 까마중 개체 중에서 2 개체(1번, 4번 개체)를 제외하고, 나머지 개체에서 pBI121 플라스미드와 동일한 전기영동 결과를 확인할 수 있다. 이는 총 18 개체의 까마중이 GUS 유전자를 가지고 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 까마중의 형질전환방법을 통하여 약 90% 정도의 형질전환효율을 확보할 수 있다.
구체적으로 GUS 유전자의 유무를 확인하기 위하여 사용된 프라이머(Primer)의 서열은 다음과 같다. 한편, PCR 산물의 크기는 989 bp였다.
Forward Primer: 5' CAACGAACTGAACTGGCAGA 3' (서열식별번호: 3)
Reverse Primer: 5' GGCACAGCACATCAAAGAGA 3' (서열식별번호: 4)
도 2c는 GUS 염색을 통하여 리포터 유전자의 발현여부를 확인한 것이다. GUS 염색 방식은 다음과 같다. 샘플병에 각 까마중 개체(T0)의 잎을 잘라 넣은 뒤, 상기 샘플병에 인산나트륨(Sodium phosphate) 50 mM, X-Gluc 2 mM, TrixonTM X-100 0.1%의 용액(pH는 7.0)을 부어준다. 그 후 37℃에서 16시간 방치한 후, 상기 샘플병의 용액을 모두 제거하고 100% 에탄올을 넣어주어 엽록소가 잎으로부터 이탈될 때까지 실온에 방치한다. 엽록소가 충분히 이탈될 때까지 에탄올을 반복 교체한다.
도 2c를 참고하면, 상술한 방법을 통하여 GUS 염색을 진행한 결과, 총 15 개체의 까마중 잎 중에서 11 개체의 까마중 잎이 염색된 것을 확인할 수 있다. 이는, GUS 유전자가 까마중에 도입된 후 발현되는 비율이 대략 73%임을 의미한다. 아울러, 이와 같은 평가결과는 본 발명의 까마중의 형질전환방법을 활용함으로써 단순히 까마중에 특정 염기서열을 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 나아가서 까마중의 실질적인 특성 변화까지 초래할 수 있음을 의미한다.
<3-2-1. 실시예 2: CRISPR/Cas9 복합체의 도입>
본 발명의 까마중의 형질전환방법은 플라스미드를 까마중세포 내로 도입하는 방법뿐만 아니라, 전술한 CRISPR system을 까마중세포 내에 도입하는 것까지 가능하게 한다. 이하의 실시예는 LAZY 1 염기서열을 타켓으로 하는 gRNA 및 Cas9 효소를 코딩하는 염기서열이 포함된 T-DNA를 본 발명의 형질전환방법을 통하여 까마중세포 내에 도입하여 결실변이를 유도한 예시이다. LAZY 1 염기서열은 식물체의 초형 발달에 관여한다.
본 발명의 CRISPR system를 도입하는 방법은 상기 <1. 까마중의 형질전환방법>에 기재된 바를 준용한다. CRISPR system 도입에 사용된 각 배지의 구체적인 조성은 하기 [표 2]과 같다. 모든 배지는 고온(121℃)/고압(15 psi)멸균기에서 15분 이상 멸균하였으며, 생장조절제 및 항생제는 여과 살균한 것을 고온/고압 멸균된 배지에 첨가하였다.
배지 중분류 소분류 농도
M
S
배
지		 대량원소 CaCl2 2.99 mM
KH2PO4 1.25 mM
KNO3 18.79 mM
MgSO4 1.5 mM
NH4NO3 20.61 mM
미량원소 CoCl2·6H2O 11 μM
CuSO4·5H2O 0.1 μM
FeNaEDTA 100 μM
H3BO3 100.27 μM
KI 5 μM
MnSO4·2H2O 100 μM
Na2MoO4·2H2O 1.03 μM
ZnSO4·7H2O 29.91 μM
비타민 myo-inositol 100 mg/L
Nicotinic acid 1 mg/L
pyridoxineHCl 1 mg/L
thiamineHCl 10 mg/L
탄소원 sucrose 30 g/L
공조배양배지 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
페놀계화합물 아세토시링곤(AS) 100 mM(in DMSO or DMF)
선
발
배
지		 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
생장조절제 Zeatin riboside 2 mg/L
IAA 0.2 mg/L
항생제 Kanamycin 100 mg/L
Cefotaxime 200 mg/L
신
초
신
장
배
지		 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
생장조절제 Zeatin riboside 1 mg/L
IAA 0.1 mg/L
항생제 Kanamycin 100 mg/L
Cefotaxime 200 mg/L
발
근
배
지		 상기 MS 배지와 대량원소, 미량원소, 비타민, 탄소원의 함량 동일
배지고형제 한천 8 g/L
항생제 Kanamycin 100 mg/L
Cefotaxime 200 mg/L
더욱 구체적으로, 본 발명의 서열식별번호: 1의 염기서열과 상보적으로 결합하는 gRNA 및 서열식별번호: 2와 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 gRNA는 는 까마중의 LAZY 1 염기서열(SnLAZY1) 중 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2와 상보적으로 결합하여 Cas9의 절단부위를 지정하게 된다. gRNA의 염기서열을 달리하여 Cas9의 절단부위를 조절할 수 있음은 전술한 바와 같으므로, 본 발명의 형질전환방법이 반드시 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2에 의하여 제한되는 것은 아님에 주의하여야 한다.
도 3a 내지 3b는 토마토의 Lazy 1 염기서열(SlLAZY1) 및 상기 염기서열에 상응하는 까마중의 염기서열(SnLAZY1)을 비교하여 도시한 것이다. 구체적으로, 서열식별번호: 1은 SlLAZY1의 911번째 염기부터 929번째 염기까지 포함하는 서열이다. 특히, SnLAZY1과 SlLAZY1을 비교하면, SlLAZY1의 915번째 염기와 916번째 염기 사이에 AGCAGCACA가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 CRISPR system을 까마중세포에 도입하여 SnLAZY1 상의 844번째 염기부터 852번째 염기까지의 결실을 일으킬 필요가 있다. 이하는 구체적인 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 염기서열이다.
서열식별번호: 1의 염기서열 : 5'CCATCCTGAGAGCTCAATGAAGC 3'
서열식별번호: 2의 염기서열 : 5'GAGAGGGCACATGACCGTGGAGG 3'
다만, 단일 gRNA를 도입하여 결실을 유도할 시에는 염기서열상 짧은 길이의 결실만이 일반적으로 유도된다. 따라서 염기서열 상에서 충분한 길이의 결실을 초래하기 위해서는 두 자리 이상의 염기간 결합의 해리가 진행될 필요가 있다. 즉, 서열식별번호: 2는 CRISPR system을 통한 결실변이가 발생하는 길이를 조절하기 위하여 추가로 타겟팅되는 염기서열에 해당한다. 서열식별번호: 1의 염기서열과 동시에 서열식별번호: 2를 동시에 타겟팅 함으로써 SnLAZY1 상의 844번째 염기부터 852번째 염기까지의 결실이 발생하는 것을 확실히 담보할 수 있다.
가령, 서열식별번호:1의 염기서열을 본 발명의 gRNA가 타겟팅 하여, 서열식별번호:1 내에 결실이 발생하는 동시에, 서열식별번호:2의 염기서열을 본 발명의 또 다른 gRNA가 타겟팅 하여, 서열식별번호:2 내에 결실이 발생하는 것이 가능하다. 이 경우, Cas9에 의한 결합의 절단은 5'방향과 3'방향에서 각각 한 번씩 일어나게 되어 서열식별번호:1의 염기서열 내의 특정 결합과 서열식별번호:2의 염기서열 내의 특정 결합이 절단된다.
따라서, 본 발명의 CRISPR system 도입이 반드시 염기서열 상에 둘 이상의 결실을 예정하여야만 하는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 특징은 까마중 식물체에 CRISPR system을 도입하는 방법 자체에 있는 것이라고 할 수 있으며, 상술한 바와 같은 둘 이상의 결실은 다만 CRISPR system을 통한 돌연변이의 정확성을 증대시키기 위함이다.
즉, 본 발명의 까마중의 형질전환방법 및 CRISPR system의 도입을 통하여, 해리되는 염기간의 결합 수 및 각 위치를 조정할 수 있다. 더 나아가, Cas9 단백질에 추가로 결합된 활성자(Activator), 억제자(Repressor), 또는 GFP(green fluorescent protein) 등을 활용하여, 특정 염기서열의 전사를 촉진하거나, 억제하거나, 또는 그 위치를 표시하는 것 또한 가능하다.
도 3c는 본 발명의 CRISPR/Cas9의 타겟 염기서열의 위치를 표시한 개념도이다. 도 3c는 LAZY 1 유전자의 구조를 개괄적으로 표현하고 있다. LAZY 1 유전자는 총 6 개의 엑손으로 구성되어 있으며, 각각의 엑손은 속이 빈 막대로 표현되어 있다. 본 발명의 CRISPR system이 타겟으로 하는 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 염기서열은 다섯 번째 엑손의 흑색삼각형으로 표시된 부분이다.
도 4a는 본 발명의 형질전환방법에 의하여 까마중에 도입된 T-DNA의 구조에 대한 개념도이다. 상기 T-DNA는 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2와 각각 상보적으로 결합할 수 있는 gRNA(target 1, target 2으로 도시)와 Cas9(Cas9으로 도시)을 코딩하고 있는 것을 특징으로 한다. 그 외에, 도 4a에 나타난 바와 같이, T-DNA는 NOS 프로모터(pNOS), 카나마이신 내성 유전자(NPT Ⅱ), NOS 터미네이터(tNOS), CaMV35S 포로모터(p35S) 등을 포함할 수 있다.
<3-2-2. 평가 2: 염기서열 상 부분적 결실변이의 평가>
도 4b는 PCR을 통하여 T0 식물체로부터 NPTⅡ 염기서열의 유무를 검증한 결과이다. 도 4b의 상단에 기재된 M은 염기서열의 사이즈 마커이고, w는 야생형 까마중 개체(T0)이며, +는 형질전환에 사용된 T-DNA 중 NPTⅡ염기서열, 각 숫자는 형질전환된 까마중 개체(T0)를 의미한다. 도 4b를 참조하면, 총 8 개체의 까마중에 모두 NPTⅡ가 도입되었음을 확인할 수 있다. NPTⅡ와 본 발명의 CRISPR system은 동일 T-DNA 상에 포함되었으므로, 상기 검증결과를 토대로 본 발명의 형질전환된 까마중 개체에 본 발명의 CRISPR system 또한 도입되었을 것임을 추측할 수 있다.
NPTⅡ 염기서열의 유무를 검증하기 위한 프라이머의 염기서열은 이하와 같다. PCR 산물의 크기는 280 bp였다.
F: 5' CCATTCGACCACCAAGCGA 3' (서열식별번호: 5)
R: 5' GTAGCCAACGCTATGTCCTG 3' (서열식별번호: 6)
도 5a는 PCR을 통하여 형질전환된 까마중 식물체의 부분적 결손 유무를 검증한 결과이다. 도 5a의 상단에 기재된 표기 중, w는 야생형의 까마중 개체의 PCR 결과임을 표시하는 것이고, 7 및 22는 각각 본 발명의 CRISPR system이 도입되어 형질전환된 까마중 개체의 PCR 결과임을 표시한 것이다. 7번 개체와 22번 개체에서 모두 야생형과는 구별되는 절편(화살표로 지목)이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는 7번 개체와 22번 개체에서, 야생형에서는 관찰되지 않는 염기서열 상의 결실이 발생하였음을 의미한다.
부분적인 결실변이가 발생하였는지 확인하기 위하여, PCR 시 하기의 염기서열을 가진 프라이머를 사용하였다.
F: 5′'ATCCTACAAATGTTCCACAGAAAA 3′'(서열식별번호: 7)
R: 5′'AATCTGCATCAGTTTTGATCCAG 3′' (서열식별번호: 8)
도 5b 내지 도 5c는 부분적 결손이 발생한 염기서열 부위의 개념도 및 부분적 결손이 발생한 실제 염기서열이다. 도 5b 내지 도 5c는 시퀀싱을 통하여, 결실이 발생한 염기서열을 구체적으로 확인한 결과이다. 도 5b에서, 결실이 발생한 염기서열의 위치가 흑색의 가는 선으로 표시되어 있다. 본 발명의 gRNA에 의하여 타겟팅이 된 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 염기서열은 각각 흑색의 두꺼운 화살표로 표시되어 있다.
도 5c에서, 적색 가는 화살표로 표시된 염기서열을 확인하고자 상기 gRNA는 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 8의 프라이머가 활용되었다. 한편, 도 5b에서 적색 두꺼운 화살표로 표시된 염기서열은 도 5c의 밑줄이 그어진 염기서열과 동일하다. 즉, 본 발명의 gRNA는 본 발명의 일 실시예에서 각각 5'CCATCCTGAGAGCTCAATAGCAG 3'의 염기서열과 5'GAGAGGGCACATGACCGTGGAGG 3'의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있다.
따라서, 일 예시로서 본 발명의 CRISPR system을 구성하는 gRNA의 염기서열은 이하의 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 10과 같을 수 있다.
gRNA 1: 5'CCATCCTGAGAGCTCAATGAAGC 3' (서열식별번호: 9)
gRNA 2: 5'GAGAGGGCACATGACCGTGGAGG 3' (서열식별번호: 10)
상술한 바에 기초하였을 때, 본 발명의 까마중의 형질전환방법은 종래의 마이크로 톰 등에 대한 형질전환방법에 비하여 효율성이 높은 방법임을 확인할 수 있다. 더불어, 본 발명의 까마중의 형질전환방법을 적용함으로써, 까마중에 신규한 염기서열을 도입하거나, 까마중의 염기서열 중 특정 부위에 결실을 유도하는 것이 모두 가능하다는 점에 주목할 필요가 있다.
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Transformation method of Solanum nigrum and Transgenic Solanum nigrum <130> KL-P-01971 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum nigrum <400> 1 ccatcctgag agctcaatga agc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Solanum nigrum <400> 2 gagagggcac atgaccgtgg agg 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR <400> 3 caacgaactg aactggcaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR <400> 4 ggcacagcac atcaaagaga 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR <400> 5 ccattcgacc accaagcga 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR <400> 6 gtagccaacg ctatgtcctg 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR <400> 7 atcctacaaa tgttccacag aaaa 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR <400> 8 aatctgcatc agttttgatc cag 23 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for CRISPR system <400> 9 ccatcctgag agctcaatga agc 23 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for CRISPR system <400> 10 gagagggcac atgaccgtgg agg 23

Claims (10)

  1. 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 준비하는 단계;
    유상부위를 가지는 까마중 자엽을 MS 배지에 배양하는 단계;
    상기 아그로박테리움을 상기 유상부위를 가지는 까마중 자엽과 공조배양하여 형질전환된 까마중 자엽을 얻는 단계;
    상기 형질전환된 까마중 자엽을 Zeatin riboside 및 IAA(indole acetic acid)를 포함하는 선발배지에 치상하고, 암상태로 배양하는 단계;
    상기 암상태로 배양된 까마중 자엽을 명배양하여 까마중 신초를 얻는 단계; 및
    상기 까마중 신초를 Zeatin riboside 및 IAA(indole acetic acid)를 포함하는 신초 신장배지에서 일정한 광도 및 온도를 유지하여 신장시키는 단계를 포함하는 까마중의 형질전환방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 벡터는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 벡터는 재조합 바이너리벡터(Binary vector)인 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 바이너리벡터는 guideRNA(이하 'gRNA'이라 함) 및 Cas9 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 gRNA는 서열식별번호: 1의 염기서열과 상보적으로 결합하는 gRNA 및 서열식별번호: 2와 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 플라스미드 벡터는 GUS(ß-glucuronidase) 유전자를 도입하는 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 신장된 까마중 신초를 발근배지에 치상하여 발근시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 까마중의 형질전환방법.
  10. 삭제
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