DE4100594A1

DE4100594A1 - Neue plasmide zur zeitlichen und oertlichen kontrollierten expression eines heterologen produktes in pflanzen

Info

Publication number: DE4100594A1
Application number: DE4100594A
Authority: DE
Inventors: Christiane Dr Gatz; Claus Frohberg; Astrid Kaiser
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Priority date: 1991-01-08
Filing date: 1991-01-08
Publication date: 1992-07-09
Also published as: IL100539A0; HU9200055D0; AU1010592A; HUT65428A; EP0494724A3; KR920014931A; EP0494724A2; IE920047A1; CA2058900A1; JPH06339384A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Plasmide, die DNA-Sequenzen ent halten, die eine zeitlich und örtlich kontrollierte Expression eines hete rologen Produktes in Pflanzen ermöglichen, wobei die Expression erst durch Zugabe einer niedermolekularen Substanz als Induktor erreicht wird.

Durch die Einführung neuer genetischer Informationen in den pflanzlichen Zellkern können die Eigenschaften von Pflanzen verbessert werden.

Diese genetischen Informationen sind auf DNA-Sequenzen enthalten, die, wenn sie in die Pflanze eingeführt werden, heterologe Produkte in der Pflanze erzeugen, wobei die Erzeugung dieser Produkte erst nach Zugabe einer niedermolekularen Substanz erfolgt.

Die von den DNA-Sequenzen exprimierten heterologen Produkte können z. B. Stoffe wie Resistenzproteine gegen Schädlinge und Chemikalien, Enzyme, die in den Stoffwechsel der Pflanze eingreifen, Proteine, die in der Diagnostik und Medizin eingesetzt werden oder Ribonukleinsäuren, die die Expression endogener Produkte inhibieren, sein.

Die Expression dieser Genprodukte kann durch die Verwendung geeigneter Kon trollsequenzen gesteuert werden. Diese Kontrollsequenzen können aus dem Genom der Pflanze selber isoliert werden. Es sind bereits Kontrollsequenzen bekannt, deren Aktivität von Parametern wie Licht (Kuhlemeier et al., Annu. Rev. Plant Physiol. (1987), 38, 221-257), Temperatur (Ainley and Key, Plant Mol. Biol. (1990), 14, 949-966), Anaerobiosis (Freeling and Bennett, Annu. Rev. Genet. (1985) 19, 297-332), Verwundung (Keil et al., EMBO J. (1989), 8, 1323-1330), Pflanzenhormone (Guilfoyle, CRC (1985) 247-276), sowie Salicylsaure (Mol et al., EP 3 37 532) kontrolliert werden, oder die nur in bestimmten Organen, wie z. B. Blattern (Stockhaus et al., EMBO J. (1989), 8, 2445-2451), Blüten (Goldberg, Science 1988, 240, 1460-1467) oder Wurzeln (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86, 7890-7894) aktiv sind.

Im Gegensatz zu bekannten Kombinationen von natürlich vorkommenden regu lierbaren pflanzlichen Kontrollsequenzen enthalten die hier beschriebenen erfindungsgemäßen Plasmide eine Kombination von pflanzlichen Expressions sequenzen mit bakteriellen Kontrollelementen. Es können dazu Repressor- Operator-Induktor-Systeme verwendet werden. Die Wirkung dieser Systeme be steht darin, daß ein Repressorprotein mit hoher Affinität an eine spezi fische Operatorsequenz bindet. Befindet sich diese Operatorsequenz im Promotorbereich eines Gens, so wird die Expression dieses Gens verhindert. Repressoren wechselwirken mit spezifischen niedermolekularen Induktormole külen, die eine Ablösung der Repressorproteine von der DNA bewirken und da durch Genaktivitäten induzieren. Es stehen hierfür bakterielle Kontroll systeme zur Verfügung, deren Aktivität durch Wirkstoffe wie Antibiotika (Hillen et al., J. Mol. Biol. (1983), 172, 185-), Zucker- oder Aminosäure derivaten (Pabo und Sauer, Annu. Rev. Biochem. (1984), 53, 293-321 oder aromatische Verbindungen (Nermod et al., J.Bact. (1986), 167, 447-454) kontrolliert werden.

Die Kombination pflanzlicher Expressionssequenzen mit bakteriellen Kon trollelementen beeinhaltet eine hohe Spezifität und gute Kontrollierbar keit, wenn die Voraussetzungen erfüllt sind, daß die induzierenden Wirk stoffe in der Pflanze nicht vorkommen, gut aufgenommen werden, nicht meta bolisiert oder sonstwie modifiziert oder inaktiviert werden, und keinen meßbaren Einfluß auf endogene Pflanzenproteine haben. Die induzierenden Wirkstoffe, die mit bakteriellen Kontrollelementen in transgenen Pflanzen wechselwirken, haben gegenüber den niedermolekularen Wirkstoffen, die mit pflanzlichen Kontrollelementen wechselwirken, den Vorteil, daß nur die Ex pression des neu eingebrachten heterologen Produktes betroffen ist, und nicht die Expression einer Reihe von im Genom der Pflanze vorhandenen Gen produkten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, neue Plasmide, die eine funktionale Kombination von pflanzlichen Expressionssequenzen mit bakteriellen Kontrollsequenzen enthalten, so daß eine zeitliche und ört liche kontrollierte Expression eines heterologen Produktes durch die ge zielte Zugabe einer niedermolekularen Substanz als Induktor erreicht wird, wobei der Induktor nur mit diesem neu konstruierten Kontrollsystem wechsel wirkt und keinen meßbaren Einfluß auf andere im Genom vorhandene Kontroll sequenzen hat, bereitzustellen.

Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bereitzustellen, die die DNA-Sequenz dieser Plasmide enthalten.

Es wurde nun gefunden, daß nach Einführung von Plasmiden in eine Pflanze, welche eine DNA-Sequenz eines stark exprimierbaren Pflanzenpromotors ent halten, der die Operatorsequenzen des Tetracyclin-Gens enthält, eine Ex pression endogener Produkte in Gegenwart eines Repressors erst erfolgt, wenn der Pflanze ein Induktor zugeführt wird, wobei die Expression nur in den Organen erfolgt, die direkt mit dem Induktor behandelt werden.

Die Expression eines heterologen Produkts in transgenen Pflanzen wird durch die Einführung von Operatorsequenzen in einen pflanzlichen Promotor dadurch kontrollierbar, daß ein Repressorprotein an diese Operatorsequenzen bindet und dadurch die Expression verhindert, wobei das Repressorprotein durch Zugabe einer niedermolekularen Substanz als Induktor, seine Fähigkeit, an die Operatorsequenzen zu binden, verliert, was dadurch zur Expression des heterologen Produkts führt. Die Operatorsequenzen hierfür sind prokaryon tischen und/oder eukaryontischen Ursprungs.

Es wurde ferner gefunden, daß die Kombination von bakteriellen Operator sequenzen mit einem pflanzlichen Promotor dann besonders wirksam ist, wenn zwei Operatorsequenzen 3′ von dem TATA-Element eines pflanzlichen Promotors lokalisiert sind.

Hinter dem Pflanzenpromotor befindet sich ein Polylinker, der die Insertion verschiedener Gensequenzen erlaubt, sowie eine für die Expression wichtige Terminations-Region.

Als Induktoren können Tetracyclin, Derivate des Tetracyclins oder eine andere niedermolekulare Verbindung, die in der Lage ist, durch Bindung an den Tet-Repressor eine Veränderung seiner DNA-Bindungseigenschaft zu er reichen, verwendet werden.

Als ein besonders wirksamer Induktor hat sich Tetracyclin erwiesen, wobei hierfür die regulatorischen Elemente des Tetracyclinresistenz-Operons des Transposons Tn10 zur Regulation eines Pflanzenpromotors verwendet wurden.

Das Repressorprotein hierfür ist ein 207 Aminosäuren langes Polypeptid, das mit hoher Affinität (K_eq = 10^-11M unter physiologischen Salzbedingungen) an eine 19 bp lange Operatorsequenz bindet (Kleinschmidt et al., Biochemistry (1988) , 27, 1094-1104).

Wenn sich die Operatorsequenz im Promotorbereich vor einem Strukturgen befindet, blockiert der Repressor in diesem Bereich die Funktion anderer DNA-Bindeproteine, die für die Transkription des Gens verantwortlich sind. Der Induktor Tetracyclin bindet an das Repressorprotein, was eine Konformationsänderung auslöst. Der Repressor-Tetracyclin-Komplex bindet nicht mehr an die Operatorsequenz.

Es hat sich ferner erwiesen, daß sich die Regulationselemente des Tetracy clinresistenz-Operons zur Steuerung der Aktivität eines Pflanzenpromotors eignen. Die hohe Gleichgewichtskonstante des Repressor-Tetracyclin-Kom plexes von 10^-9M ermöglicht schon bei sehr geringen Tetracyclin-Konzentra tionen eine effiziente Ablösung des Repressors von der DNA (Takahashi et al., J. Mol. Biol. (1986), 187, 341-348). Tetracyclin diffundiert wie die meisten Antibiotika leicht durch Membranen und kann daher von Pflanzenzel len aufgenommen werden. In Pflanzen befinden sich keine Tetracyclin-ähnli chen Wirkstoffe, die den Repressor von vornherein inaktivieren.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, beinhalten. Die Vektoren beinhalten z. B. pBR 332, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Dementsprechend kann die Sequenz an einer passen den Restriktionsstelle in den Vektor eingefügt werden. Das erhaltene Plas mid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethoden werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, Elektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig je doch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich der einzuführenden Gene, verbunden werden.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 1 20 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4 : 1-46 und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277-287 beschrieben worden.

Ist die eingeführte DNA erst einmal im Genom integriert, so ist sie dort auch relativ stabil und springt in der Regel nicht mehr heraus. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzel len Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. vermittelt. Der in dividuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zel len gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Viel zahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transforma tion mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobac terium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder die Elektroporation sowie weitere Möglichkeiten. Werden für die Transforma tion Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plas mide kloniert werden und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Se quenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekom bination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige Vir-Region. Intermediäre Vektoren können sich nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Hel ferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sich sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektions marker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro bakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978), 163 : 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine Vir-Region trägt, enthalten. Die Vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzen zellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agro bacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmate rial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Me dium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind keine speziellen Anforderungen an die Plasmide ge stellt. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet wer den.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die ent sprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Begriffe und Abkürzungen

Abkürzungen
bp. Kb = Basenpaare, Kilobasen
DNA = Desoxyribonukleinsäure, Träger der genetischen Information
RNA = Ribonukleinsäure
HEPES = N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2-ethansulfonsäure
kDA = Kilodalton
SDS = Natriumdodecylsulfat
Tris = Tris(2-aminoäthyl)-amin
EDTA = Ethylendiamintraessigsäure
mmol = Millimol
fmol = Femtomol

Begriffe
Elektrophorese = biochemisches Trennverfahren zur Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren nach Größe und Ladung.
Expression = Aktivität eines Gens
Gen = Erbfaktor; eine Einheit des Erbguts, Träger der Teilinformation für ein bestimmtes Merkmal. Gene bestehen aus Nukleinsäuren (z. B. DNA, RNA).
Klon = Zellpopulation, die von einer einzigen Mutter stammt.
Die Nachkommen sind genotypisch gleich. Durch Klonierung kann die Einheitlichkeit von Zellinien noch gesteigert werden.
Linker, Polylinker = synthetische DNA-Sequenz, die eine oder mehrere (Polylinker) Restriktionsschnittstellen in unmittelbarer Reihenfolge enthält.
Northern Blot, Southern Blot = Transfer und Fixierung elektrophoretisch aufgetrennter RNA oder DNA auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran und anschließender Detektion spezifischer Sequenzen mittels Hybridisierung mit radioaktiven Proben.
Operator = Kommt in Genen von Mikroorganismen vor. Ein genetisches Element, das an der Regulation der Genaktivität von bakteriellen Operons beteiligt ist.
Phänotyp = Summe der Merkmale, die in einem Organismus im Gegensatz zu seiner Genausstattung (Genotyp) ausgeprägt ist.
Plasmid = zusätzlicher, extrachromosomaler DNA-Erbträger in Bakterienzellen (evtl. auch in Eukaryonten), der sich unabhängig vom Bakteriencromosom redupliziert. Das Plasmid kann in andere Wirts-DNA integriert werden.
Polyadenylierung = Bezeichnung für die nach der Synthese fast aller eukaryontischer m-RNA am 3′-Ende erfolgende Anheftung von ca. 20-250 Adenyl-Resten.
Promotor = Kontrollsequenz der DNA-Expression, die die Transkription homologer oder heterologer DNA-Gen-Sequenzen gewährleistet.
Replikation = Verdopplung der DNA-Sequenz
Repressor = Bezeichnung für Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen in der Nähe der Transcriptionsinitiationsstelle von prokaryontischen Genen binden und hierdurch die Transcription dieser Gene verhindern.
Resistenz-Gen = Gen, dessen Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen, wie z. B. Toxine oder Schermetalle verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
Restriktionsenzyme = Restriktionsendonukleasen, die eine Untergruppe der Endodesoxyribonukleasen sind

zeichnen sich durch eine hohe Spezifität der Substraterkennung aus (↓ = Spaltstelle).
Restriktionsstellen = Spaltstellen, die spezifisch durch Restriktionsenzyme erzeugt werden.
TATA-Box = Eine in vielen Genen von eukaryontischen Zellen und Viren in der Promotorregion vorhandene, hochkonservierte, aus AT-Paaren bestehende Basensequenz.
Transformation = Einfügung exogener DNA eines Bakerienstammes in eine Empfängerzelle.
Transposon = Bezeichnung für diskretes genetisches Element aus prokaryontischen Genomen (Bakterien, Plasmide, Bakteriophagen), die die Fähigkeit besitzen, innerhalb des Genoms eines Organismus an unterschiedlichen Stellen zu springen dort zu integrieren.
Vektoren = wirtsspezifische, replizierfähige Strukturen, die Gene aufnehmen und diese auf andere Zellen übertragen. Plasmide können als Vektoren benutzt werden.

Am 23. 12. 1990 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid pTET1 (DSM 6281)
Plasmid pAT2HyStu4 (DSM 6280)

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte des 10,7 kb großen Plasmids pTET1. Die Abkürzungen bedeuten:

LB = Linke Bordersequenz der T-DNA,
RB = Rechte Bordersequenz der T-DNA,
CaMV 35S = Promotor (526bp) des Cauliflower-Mosaik-Virus,
tetR = Strukturgen (695bp) des Tetracyclin-Repressors,
ocs = Polyadenylierungssignal des Octopin Synthase Gens (180bp),
nptII = Chimäres Gen der Neomycinphosphotransferase unter der Kontrolle des Nopalin-Syntase-Promotors (1200 bp).

Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.

Fig. 2 zeigt das Autoradiogramm einer Elektrophorese zum Nachweis des funktionalen Tet-Repressors in transgenen Tabakpflanzen. In den Positionen 1 bis 10 wurden 6 fmol, in den Positionen 11 bis 20 wurden 20 fmol ³²P mar kiertes Operatorfragment (360 bp) eingesetzt. In den Positionen 1-4 wurde die Bindereaktion in Gegenwart von 0 (Kontrolle), 20, 60 und 120 fmol Tet- Repressor (aus Escherichia coli gereinigt) durchgeführt. In den Positionen 5 bis 10 wurde die Bindereaktion in Gegenwart von 0 (Kontrolle), 1, 2, 4, 6 und 8 µg Proteinextrakt aus Blättern einer transgenen Pflanze, die die T-DNA des Plasmids pTET1 enthält, durchgeführt; in den Positionen 11 bis 14 wurde die Bindereaktion in Gegenwart von 0 (Kontrolle), 10, 100 und 200 fmol Tet-Repressor (aus Escherichia coli gereinigt) durchgeführt; in den Positionen 15 bis 20 wurde die Bindereaktion in Gegenwart von 0 (Kon trolle), 1, 2, 4, 8 und 16 µg Proteinextrakt aus Protoplasten einer trans genen Pflanze, die die T-DNA des Plasmids pTET1 enthält, durchgeführt.

Die Abkürzungen bedeuten:

R = Tet-Repressor-DNA-Komplex
F = Unkomplexierte DNA

Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte des 15 kb großen Plasmids pAT2HyStu4. Die Abkürzungen bedeuten:

LB = Linke Bordersequenz der T-DNA
RB = Rechte Bordersequenz der T-DNA
CaMV 35S = Promotor (Enhancer) (334bp) des Cauliflower-Mosaik-Virus, der zwei Tet-Operatoren enthält
Oligo = DNA-Fragment (99 bp), das die TATA-Box, zwei Tet-Operatoren und die Schnittstellen SpeI, SnabI, BglII, HpaI und XbaI enthält.
gus = Strukturgen (1800 bp) der β-Glucuronidase aus Escherichia coli
nos = Polyadenylierungssignal des Nopalin-Synthase-Gens (203bp)
hptI = chimäres Gen der Hygromycinphosphotransferase (1650 bp) unter der Kontrolle des Nopalin-Synthese-Promotors
nptII = chimäres Gen der Neomycinphosphotransferase unter der Kontrolle des Nopalin-Synthase-Promotors (1200 bp).

Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.

Fig. 4 zeigt das Autoradiogramm der Northern-Blot-Analyse zum Nachweis der Tetracyclin-abhängigen Expression des aus Gens in Extrakten aus Blättern von 6 unabhängigen transgenen Pflanzen (Positionen 1-6), die die T-DNA des Plasmids pTET 1 und des Plasmids pAT2HyStu enthalten.

+ = RNA aus Blättern transgener Pflanzen nach Infiltration mit Tetracyclin
- = RNA aus Blättern transgener Pflanzen ohne Infiltration mit Tetracyclin

Fig. 5 zeigt das Autoradiogramm der Northern-Blot-Analyse zur Charakteri sierung der Konzentrationsabhängigkeit der Tetracyclin-Induktion in Extrak ten aus Blättern einer transgenen Pflanze (Positionen 1-5) nach Infil tration mit unterschiedlichen Tetracyclin-Konzentrationen (Tc (mg/l) : 0,1, 0,5, 1 und 10), sowie einer Kontrolle (Tc (mg/l) : 0).

Die Abkürzungen bedeuten:

TC = Tetracyclin
gus = m-RNA der β-Glucuronidase aus Escherichia coli
tetR = m-RNA des Tet-Repressors

Fig. 6 zeigt das Gel der Northern-Blot-Analyse zur Charakterisierung des zeitlichen Verlaufs der Tetracyclin-Induktion in Extrakten aus Blättern einer transgenen Pflanze (Positionen 1-6). Es wurden Proben nach 0 (Kon trolle), 0,5, 1, 3, 6 und 22 Stunden (h) entnommen. Die Abkürzungen bedeu ten:

gus = m-RNA der β-Glucuronidase aus Escherichia coli
tetR = m-RNA des Tet-Repressors.

Zum Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18/19 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119) benutzt.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711-8720) kloniert. Standardmethoden wurden nach bekannten Vorschriften durchge führt (Molecular Cloning, Maniatis et al., (1982), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

2. Bakterienstämme

Für die pUC-Vektoren wurde der E. coli-Stamm DH 5 Alpha des Genotyps F⁻, end A1, hsdR17 (r, m_k+) supE44, thi-I, R ¯, recA1, gyrA96, rdA1, Φ 80d laczΔM15 benutzt.

Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefa ciens-Stammes GV 2260 Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788, (1985) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobakterium tumefaciens

Die Einführung der DNA in die Agrobakterien erfolgt durch direkte Trans formation nach der Methode von Holsters et al., (Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelek trophoretisch aufgetrennt.

4. Pflanzentransformation

10 ml einer Übernachtkultur von Agrobakterium tumefaciens in YEB-Medium, bestehend aus 0,5% Rindfleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,5% Saccharose und 2 mM Magnesiumsulfat, wurden abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen antibiotika freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (ca. 1 cm²), denen die Mittel rippe entfernt wurde, in dieser Bakteriensuspension gebadet. An schließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen, die MS-Medium (nach Murashige und Skoog, Physiologia Plantarum (1962), 15, 473-497) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar enthalten, dicht ausgelegt. Nach zweitä giger Inkubation bei 25°C im Dunkeln wurden sie auf MS-Medium übertra gen, welches 100 mg/l Kanamycin oder Hygromycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthylessigsäure (NAA) und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/l Claforan und 50 mg/l Kanamycin oder Hygromycin überführt.

Sprosse, die auf diesem Medium Wurzeln bildeten wurden durch Northern- und Southern-Blot-Analyse auf Integration der zu untersuchenden DNA-Se quenzen überprüft.

5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers und Bendich (Plant Mol. Biol. (1985), 5, 69-76).

Für die DNA-Analyse wurden 20 µg DNA nach geeigneter Restriktionsspal tung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchen den DNA-Sequenzen analysiert.

Die DNA wurde in SSC-Puffer, bestehend aus 3M Natriumchlorid und 0,3M Natriumcitrat, auf eine Membran geblottet. Die Hybridisierung erfolge in dem Hybridisierungspuffer nach Amasino (Anal. Biochem. (1986), 152, 304-307), der 10% Polyethylenglycol enthielt. Zum Nachweis der inte grierten DNA-Sequenz wurde das DNA Fragment radioaktiv markiert.

6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163, 16-20) .

Für die Analyse wurden je 30 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht. Blotten und Hybridisieren erfolgt nach der gleichen Vorschrift wie für die Southern-Blot Analyse.

8. Nachweis des Tet-Repressors in transgenen Pflanzen

100 mg Blattmaterial aus Pflanzen, die die T-DNA des Plasmids pTET1 ent hielten, wurden ohne Einfrieren in 200 µl Extraktionspuffer (50 mM Na triumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat pH 7,5, 1 mM EDTA, 0.1% 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenol, 10 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM Natriumbisulfit, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 µg/ml Antipain, 1 µg/ml Aprotinin, 1 µg/ml Chymostatin, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin und 0.1 g Polyvinylpyrrolidon/g Blattmaterial) homogenisiert.

Die Bindereaktion wurde in 40 µl Tris-Puffer (50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Tris/HCl, pH 7.5) durchgeführt, wobei dem Puffer 5 bis 20 fmol ³²P-endmarkiertes Operator-Fragment mit einer spe zifischen Aktivität von 0.6 Ci ³²P/mmol und 80 µg Heringsperma DNA zu gegeben wurden. Anschließend wurden dieser Bindereaktionsmischung 0,5 bis 10 µl Blattextrakt zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Mi nuten bei Raumtemperatur, wurde soviel Glycerin zugegeben, bis eine 25%ige Lösung erhalten wurde. Diese Lösung wurde auf ein 5%iges Poly acrylamidgel gegeben und gelelektrophoretisch getrennt. Die Elektropho rese wurde in Tris-Puffer pH 8,0 (60 mM Tris/Base, 60 mM Borsäure, 1 mM EDTA und 10% Glycerin) für 12 Stunden bei 2.5 V/cm durchgeführt. Die Gele wurden anschließend getrocknet. Die auftretenden radioaktiven Banden wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

9. Protoplastenpräparation

Protoplasten aus Blättern von axenischen Pflanzen, die die T-DNA des Plasmids pTET1 enthielten, wurden nach der Methode von Damm und Willmitzer (Mol. Gen. Genet. (1988), 213, 15-20) präpariert. Die Protoplasten wurden gezählt, durch Zentrifugation aufkonzentriert und in 100 µl Extraktionspuffer aufgenommen, wobei in 100 µl Puffer 3 00 000 Protoplasten enthalten waren. In diesem Puffer lysierten die Protoplasten. Die Zelltrümer wurden anschließend abzentrifugiert.

Ausführungsbeispiel 1 Herstellung von Plasmid pTET1 und Einführung der T-DNA des Plasmids in das pflanzliche Genom des Tabaks

Für die Herstellung des Plasmids pTET1 wurden die beiden Plasmide BINAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science (1990), 66, 221-230) und pWH 305 (Ohemichen et al., EMBO J. (1984), 3, 539-543) verwendet. Das Plasmid BINAR ist ein Derivat des binären Vektors BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711-8720), das zwischen der EcoRI- und der HindIII-Stelle des Polylinkers den eine konstitutive Expression bewirkenden Promotor der 355 RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV) sowie das Polyadenylierungs signal des Octopin-Synthase-Gens enthält. Zwischen dem Promotor und dem Polyadenylierungssignal befinden sich folgende Schnittstellen: KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SaII, PstI. In die SmaI Schnittstelle wurde das 695 bp lange HpaI-Fragment aus pWH305 insertiert. Dieses HpaI-Fragment enthält 18 bp des 5′-untranslatierten Leaders, 624 bp des Strukturgens und 51 bp des 3′-Bereichs des tetR-Gens. Die Smal-Schnittstelle ging bei dieser Klo nierung verloren. Das Plasmid pTET1 hat eine Gesamtgröße von 10.7 kb, die sich folgendermaßen zusammensetzt: Zwischen der EcoRI-Stelle und der KpnI- Stelle befindet sich das 526 bp lange Promotorfragment des CaMV 35S Virus (Covey and Hull (1985) Advances in Cauliflower Mosaic Virus Research, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, 2, 339-346); zwischen der KpnI-Stelle und der BamHI Stelle befindet sich das 695 bp lange Frag ment des tetR-Gens; zwischen der BamHI und der SpHI-Stelle befindet sich eine Polylinkersequenz mit den oben genannten Schnittstellen; zwischen der SpHI-Stelle und der HindIII-Stelle befindet sich das 180 bp lange Poly adenylierungssignal des Octopin-Synthase-Gens. Dieser Teil des Plasmids be wirkt, sobald er im pflanzlichen Genom integriert ist, die Synthese des Tet-Repressorproteins in allen Geweben. Die Sequenzen außerhalb der EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle sind Sequenzen des Vektors BIN19. Sie enthal ten alle Funktionen zur Replikation und Selektion des Plasmids in Escher ichia coli und Agrobacterium tumefaciens sowie für den Transfer der T-DNA in Pflanzen und die Möglichkeit zur Selektion transformierter Pflanzenzel len auf Kanamycin. Die Resistenz wird durch das nptII-Gen vermittelt.

Dieses Plasmid wurde in Agrobakterium tumefaciens transformiert. An schließend erfolgte der DNA-Transfer in Tabakpflanzen durch Kokultvierung dieser Agrobakterien mit Blattstückchen aus Tabakpflanzen. Die Selektion erfolgte auf Kanamycin. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fer tile Pflanzen regeneriert.

Zehn unabhängig transformierte Pflanzen wurden durch Northern Blot Analyse auf die Synthese der mRNA für den Tet Repressor überprüft.

Wie bereits bekannt, variierten die mRNA-Mengen in den unabhängigen trans genen Pflanzen beträchtlich (Sanders et al., Nucl. Acids Res. (1987), 15, 1543-1558). Eine Pflanze mit der höchsten mRNA Synthese-Leistung wurde für alle weiteren Analysen verwendet.

Um die Menge funktionalen Tet-Repressor-Proteins in dieser Pflanze zu quan tifizieren, wurde eine Gel-Verzögerungsanalyse nach Fried und Grothers (Nucl. Acids Res. (1981), 9, 6505-6525) durchgeführt (siehe Fig. 2). Hierbei wird ausgenutzt, daß ein Protein-DNA-Komplex bei einer Elektropho rese auf einem 5%igen Polyacrylamidgel langsamer läuft (siehe Bande R in Fig. 2), als die ungebundene DNA (siehe Bande F in Fig. 2). 1 bis 8 µg Pro tein des Rohextraktes aus Blättern einer der Pflanzen, die das Transkript zur Synthese des Tet-Repressors synthetisiert, wurde mit 6 fmol eines ge reinigten ³²P endmarkierten Operator-Fragments inkubiert und einer Elektro phorese auf einem 5%igen Polyacrylamidgel unterworfen. Wie in Fig. 2 ge zeigt, ist die Mobilität des Fragmentes in den Positionen 5 bis 10 im gleichen Maß verzögert wie in den Positionen 2 bis 4, wo aus E. coli gerei nigtes Repressorprotein in die Bindereaktion eingesetzt worden war. Dieses Protein war nach dem Reinigungsverfahren nach Ohemichen et al. (EMBO J. (1984), 3, 539-543) gewonnen worden. Diese Positionen dienen als Kontrol le dafür, daß das in Pflanzenextrakten vorkommende Operator-Bindeprotein die gleiche elektrophoretische Mobilität hat wie der Tet-Repressor. Es ist daher davon auszugehen, daß die das TetR-Transkript synthetisierende Pflan ze funktionalen Tet-Repressor synthetisiert. Keine Verzögerung wurde mit dem Extrakt aus untransformierten Tabakpflanzen beobachtet. Die Konzentra tion des Operator-Fragments in der Bindereaktion beträgt 0.25×10^-9M. Die Bindekonstante des Repressors an Operator-DNA, unter den hier verwendeten Salzbedingungen (50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid), ist <0,5×10^-11M (Kleinschmidt et al., Biochemistry (1988), 27, 1094-1104). Es kann daher für die Berechnung der Repressormenge davon ausgegangen werden, daß eine quantitative Bindung unter diesen Bindungen erfolgt. Da die Bindung von vier Monomeren mit einem Molekulargewicht von je 24 kDa zu einer voll ständigen Verzögerung des Fragmentes führt, wurde, ausgehend von Spur 8, berechnet, daß eine Menge von 24 fmol Tet-Repressor in 4 mg Proteinextrakt enthalten sind, was 0.01% der Gesamtproteinmenge ausmacht. Um die Anzahl der Tet-Repressoren pro Zelle zu ermitteln, wurden Protoplasten derselben Tabakpflanze präpariert. Die Positionen 15 bis 20 der Fig. 2 zeigen ein Titrationsexperiment, bei dem Extrakte von 5000, 10 000, 20 000, 40 000 und 80 000 Protoplasten verwendet wurden. Für dieses Experiment wurden 20 fmol DNA Fragment eingesetzt. In Position 20 wurden etwa 18 fmol verzögert, was auf 72 fmol Repressor in 80 000 Protoplasten hinweist. Da 72 fmol Repressor äquivalent zu 4.5×10¹⁰ Repressormolekülen sind, kann man von einer Syn theserate von mindestens 500 000 Repressormolekülen pro Zelle in der analy sierten Pflanze ausgehen.

Ausführungsbeispiel 2

Herstellung des Plasmids pAT2HyStu4 und stabile Integration eines operator enthaltenen CaMV 355 Promotors in eine Tabakpflanze, die den Tet-Repressor synthetisiert.

Ziel der folgenden Klonierschritte war es, zwei Tet-Operatorsequenzen, an die der Tet-Repressor bindet, mit dem CaMV 35S Promotor zu kombinieren. Wie die meisten anderen eukaryontischen Promotoren, die von der Polymerase II erkannt werden, enthält der CaMV 35S Promotor eine TATA-Box, in deren Umge bung allgemeine Transkriptionsfaktoren wirksam sind sowie dazu 5′-gelegene Enhancer-Elemente, die im Falle des CaMV 35S Promotors für eine starke kon stitutive Expression in allen Geweben der Pflanze verantwortlich sind. Die Operatorsequenzen wurden in unmittelbarer Nähe von der TATA-Box lokali siert, so daß der daran bindende Tet-Repressor mit den in diesem Bereich wirksamen allgemeinen Transkriptionsfaktoren interferiert. Diese Strategie hat den Vorteil, daß man die neugeschaffene DNA-Sequenz, nämlich die mit der TATA-Box kombinierten Operatorsequenzen, auch mit anderen Enhancerele menten kombinieren kann, die ein unterschiedliches Expressionsmuster ver mitteln, als die Enhancerelemente des CaMV 35S Promotors.

Da sich in der Wildtypsequenz des Promotors keine geeignete Schnittstelle für die Insertion eines zusätzlichen DNA-Fragmentes befindet, wurde die Se quenz zwischen den Basenpaaren -56 bis +7 (+1 entspricht der Transkrip tionsstartstelle) wie folgt verändert: Analog zu dem schon beschriebenen Klonierungsverfahren (Gatz und Quail, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968), 85, 1394-1397) wurden die Wildtypsequenzen des Promotors im Bereich von -56 und +7 durch ein synthetisches DNA-Fragment der folgenden Primärstruk tur ersetzt:

Dieses synthetische DNA-Fragment besitzt folgende Schnittstellen:

SpeI: ACTAGT zwischen den Positionen -53 und -48
SnabI: TACGTA zwischen den Positionen -32 und -27
StuI: AGGCCT zwischen den Positionen -22 bis -17
XbaI: TCTAGA zwischen den Positionen -15 bis -10
XhoI: CTCGAG zwischen den Positionen +3 bis -3
BgIII: AGATCT zwischen den Positionen +2 bis +7
sowie die für die Promotoraktivität wichtige Sequenz TATATAA zwischen den Positionen -22 und -27.

Durch diese Klonierung wurde der CaMV 35S Promotor insoweit verändert, als daß die Insertion von DNA-Fragmenten in den hier aufgeführten Schnitt stellen möglich ist. Die Veränderungen beeinflussen die Promotoraktivität nicht.

In die StuI Stelle wurde eine 55 bp lange synthetische Sequenz eingefügt. Die Primärstruktur dieser synthetischen DNA ist wie folgt:

Bei der Klonierung ging die StuI-Stelle verloren.

Nach diesem Klonierungsschritt lautet die Sequenz des Operator-enthaltenden CaMV 35S Promotors von der Position -56 bis +61 wie folgt:

Diese Sequenz beinhaltet folgende Strukturmerkmale:

SpeI: ACTAGT zwischen den Positionen 4 und 9
SnabI: TACGTA zwischen den Positionen 25 und 29
TATA-Box: TATATAA zwischen den Positionen 30 bis 35
BgIII: AGATCT zwischen den Positionen 38 bis 43
tet-Operator: TCTCTATCACTGATAGGGA zwischen den Positionen 41 und 59
HpaI: GTTAAC zwischen den Positionen 62 und 67
tet-Operator: ACTCTATCACTGATAGAGT zwischen den Positionen 71 und 89
XbaI: TCTAGA zwischen den Positionen 97 bis 102
XhoI: CTCGAG zwischen den Positionen 109 bis 114
BgIII: AGATCT zwischen den Positionen 113 bis 118

Durch die Kombination dieser Sequenz mit einem pflanzlichen Enhancerelement entsteht ein Promotor, der in Anwesenheit des Tet-Repressors in der Pflanze nicht abgelesen wird. In Anwesenheit des Induktors Tetracyclin jedoch ist der Promotor aktiv.

In den hier gezeigten Ausführungsbeispielen liegt das 118 bp lange DNA- Fragment in Kombination mit den Enhancerelementen des CaMV 35S Promotors vor (Klonierstrategie siehe oben).

Ein insgesamt 471 bp langes Fragment, das, die Basenpaare -390 bis -56 des Wildtyp CaMV 35S Promotors sowie die synthetische Sequenz einschließlich der XbaI-Stelle (Position 97 bis 102) enthält, wurde als EcoRI/XbaI Frag ment in den Vektor pGUS (geschnitten mit EcoRI und XbaI) kloniert. Dieser Vektor pGUS enthält die Sequenz des Strukturengens für die bakterielle β-Glucuronidase (gus) (Jefferson et al., EMBO J. (1987), 6, 3901-3907) vor dem sich ein Polylinker mit den Schnittstellen EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI befindet. Am 3′ Ende befindet sich das Polyadenylierungssignal des Nopalin-Synthase-Gens. Dieses chimäre Gen wurde als EcoRI/HindIII Frag ment ausgeschnitten und zwischen die EcoRI/HindIII-Stelle von BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8720) kloniert. Anschließend wurde in die HindIII-Stelle dieses BIN19-Derivates ein chimäres Hygromycinphosphotrans ferase-Gen unter der Kontrolle des Nopalin Synthase-Promotors kloniert, so daß eine Selektion des Transformationsereignisses in den schon kanamycin resistenten Pflanzen, die die T-DNA des Plasmids pTET1 enthalten, möglich ist. Anstelle des Hygromycinphosphotransferase-Gens kann auch ein anderes Resistenzgen benutzt werden. Die einzige Ausnahme bildet das Neomycinphos photransferase-Gen. Die Restriktionskarte der rekombinanten DNA pAT2HyStu4 ist in Fig. 3 gezeigt. Die Abbildung soll verdeutlichen, daß sich das 15 kb große Plasmid pAT2HyStu4 aus folgenden Fragmenten zusammensetzt: zwischen den Schnittstellen EcoRI und BamHI befindet sich eine Sequenz eines Poly linkers; zwischen BamHI und SpeI befindet sich das 334 bp lange DNA Frag ment, das die Enhancerelemente des CaMV 35S Promotors sowie die Sequenz CCC enthält; zwischen SpeI und XbaI befinden sich 99 bp des synthetischen Oli go-DNA Fragments, das eine TATA-Box und zwei tet-Operatoren enthält.

Die Basensequenz dieses 99 bp großen synthetischen Oligo-DNA-Fragments und der CCC-Sequenz lautet wie folgt:

Zwischen XbaI und SacI befindet sich das Strukturgen (1800 bp) der β-Glucu ronidase; zwischen SacI und HindIII befindet sich das Polyadenylierungssig nal des Nopalin-Synthase-Gens (203 bp); zwischen zwei HindIII Stellen be findet sich das Hygromycinphosphotransferase-Gen unter der Kontrolle des Nopalin-Synthase-Promotors (1650 bp). Die Sequenzen innerhalb der EcoRI- Stelle und der zweiten HindIII Stelle enthalten die Information für die Synthese der β-Glucuronidase sowie die Information zur Ausprägung einer Resistenz gegen Hygromycin. Die Sequenzen außerhalb der EcoRI-Stelle und der zweiten HindIII-Stelle sind Sequenzen des Vektors BIN19. Sie enthalten alle Funktionen zur Replikation und Selektion des Plasmids in Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens sowie für den Transfer der T-DNA in Pflanzen und die Möglichkeit zur Selektion transformierter Pflanzenzellen auf Kanamycin. Die Resistenz wird durch das nptII-Gen vermittelt.

Dieses Plasmid wurde in Agrobakterium tumefaciens transformiert. Anschließend erfolgte der DNA-Transfer in Tabakpflanzen durch Kokulti vierung dieser Agrobacterien mit Blattstückchen aus Tabakpflanzen. Für diese Transformationen wurden Tabakpflanzen benutzt, die die T-DNA des Plasmids pTET1, enthalten und daher den Tet-Repressor synthetisieren. Nur in Gegenwart des Tet-Repressors erfolgt die Synthese der β-Glucuronidase in Abhängigkeit von der Zugabe von Tetracyclin. Die Selektion erfolgte auf Hygromycin. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert.

Ausführungsbeispiel 3 Nachweis der Tetracyclin-abhängigen Expression des β-Glucuronidase-Gens aus pAT2HyStu4 in Blättern transformierter, den Tet-Repressor synthetisierender Tabakpflanzen

Um eine homogene Aufnahme des Induktors Tetracyclin in allen Zellen zu be wirken, wurde das Antibiotikum durch Infiltration einzelner Blätter mit ei nem Tetracyclin-haltigen Puffer in den Interzellularraum eingebracht. Dazu wurden einzelne Blätter von sechs unabhängigen transformierten Pflanzen in ein Becherglas mit 50 mM Natriumcitratpuffer, der 10 mg/l Tetracyclin ent hielt, gelegt. Das Becherglas wurde in einen Exsikkator gestellt und für 3 Minuten unter Vakuum gehalten. Durch das Vakuum entwich Luft aus dem Inter zellularraum. Diese wurde beim Belüften des Exsikkators durch den Puffer ersetzt. Nach der Infiltration wurden die Blätter für 16 Stunden auf MS Medium mit 10 mg/l Tetracyclin inkubiert. Kontrollblätter wurden genauso behandelt, jedoch ohne Zugabe von Tetracyclin. Anschließend wurde die RNA der Blätter präpariert, auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und einer Northern-Blot Analyse unterzogen, wobei das Transkript der gus mRNA durch Hybridisierung mit einem radioaktiv markierten Fragment aus dem Strukturgen der β-Glucuronidase sichtbar gemacht wurde. Die in Fig. 4 ge zeigte RNA-Analyse zeigt, daß die mRNA, die die Sequenzen des Gens für die β-Glucuronidase enthält, in den Pflanzen, die die T-DNAs der Plasmide pTET1 und pAT2HyStu4 enthalten, nur dann gebildet wird, wenn die Blätter mit Tetracyclin vorbehandelt wurden.

Um die kleinste Menge für die Induktion noch benötigten Tetracyclins zu be stimmen, wurden Blätter einer Pflanze, die die T-DNAs der Plasmide pTET1 und pAT2HyStu4 enthält, mit 50 mM Natriumcitratpuffer, mit unterschiedlich hohen Tetracyclinkonzentrationen infiltriert.

Jeweils ein Blatt wurde mit 0 (Kontrolle), 0.5, 1.0 bzw. 10.0 mg/l Tetra cyclin in 50 mM Natriumcitratpuffer infiltriert und auf MS-Medium, das die jeweils gleiche Tetracyclinkonzentration enthielt, aufgelegt. Die Nor thern-Blot-Analyse zeigt, daß 0.1 mg/l Tetracyclin schon für eine maximale Induktion ausreichend sind (s. Fig. 5, Position 2).

Um die Zeitabhängigkeit der Induktion der gus mRNA zu untersuchen, wurden Blätter einer Pflanze, die die T-DNAs der Plasmide pTET1 und pAT2HyStu4 enthält, mit 50 mM Natriumcitratpuffer, der 10 mg/l Tetracyclin enthielt, infiltriert und für je 0, 0.5, 1, 3, 6 und 22 Stunden auf MS Medium gelegt. Anschließend erfolgte eine RNA-Extraktion und eine Northern-Blot-Analyse. Eine Zugabe von 10 mg/l Tetracyclin führt bereits nach einer halben Stunde zu einer vollständigen Induktion der gus mRNA. (s. Fig. 6, Position 2).

In Fig. 5 und 6 wird gleichzeitig gezeigt, daß die RNA Proben die mRNA für das Gen des Tet-Repressors enthalten. Diese ist schon jeweils in der Po sition 1 sichtbar, da die Expression dieser mRNA konstitutiv erfolgt.

Claims

1. Plasmide enthaltend DNA-Sequenzen, die eine zeitliche und örtliche kon trollierte Expression eines heterologen Produkts in Pflanzen ermög lichen.

2. Plasmide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression eines heterologen Produkts erst durch Zugabe einer niedermolekularen Substanz als Induktor erfolgt.

3. Plasmide gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie DNA-Sequenzen enthalten, die eine funktionale Kombination von pflanz lichen Expressionssequenzen mit bakteriellen Kontrollsequenzen sind.

4. Plasmide gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression eines heterologen Produkts in transgenen Pflanzen durch die Einführung von Operatorsequenzen in einen pflanzlichen Promotor dadurch kontrollierbar wird, daß ein Repressorprotein an diese Operatorsequenzen bindet und dadurch die Expression verhindert, wobei das Repressorprotein durch Zugabe einer niedermolekularen Substanz als Induktor seine Fähig keit, an die Operatorsequenzen zu binden, verliert, was dadurch zur Ex pression des heterologen Produkts führt.

5. Plasmide gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Repressorpro tein und die Operatorsequenzen prokaryontischen und/oder eukaryontischen Ursprungs sind.

6. Plasmide gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Operatorse quenz aus den regulatorischen Elementen des Tetracyclinresistenz-Operons des Transposons Tn10 besteht.

7. Plasmide gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Operatorse quenzen 3′ von dem TATA-Element eines pflanzlichen Promotors lokalisiert sind.

8. Plasmide gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Plasmide pTET1 und pAT2HyStu 4 handelt.

9. Plasmid pTET1 (DSM 6281).

10. Plasmid pAT2HyStu4 (DSM 6280).

11. Plasmide gemäß den Ansprüchen 8-10, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pTET1 aus dem 526 bp langen Cauliflower-Mosaik-Virus 35S Promo tor-Fragment, dem 695 bp langen Tet-Repressor-Fragment und dem 180 bp langen Polyadenylierungssignal des Octopin-Synthase-Gens, und das Plas mid pAT2HyStu4 aus einer Polylinkersequenz, einem 334 bp langen Cauli flower-Mosaik-Virus 35S Promotor-Fragment mit Enhancerelementen, einem 99 bp langen Oligo-DNA-Fragment mit einer TATA Box und zwei Tet-Ope ratoren, einem 1800 bp langen Strukturgen der β-Glucuronidase, einem 203 bp langen Polyadenylierungssignal des Nopalin-Synthase-Gens und einem 1650 bp langen Hygromycinphosphotransferase-Gen besteht.

12. Plasmide gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das 99 bp lange Oligo DNA-Fragment und das CCC-Fragment des Plasmids pAT2HyStu4 die Se quenz hat.

13. Plasmide gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Induktor Te tracyclin ein Derivat des Tetracyclins oder eine andere niedermolekulare Verbindung, die in der Lage ist, durch Bindung an den Tet-Repressor eine Veränderung seiner DNA-Bindungseigenschaft zu erreichen, ist.

14. Eine Pflanze enthaltend eine DNA-Sequenz, die eine zeitliche und ört liche kontrollierte Expression eines heterologen Produkts ermöglicht.

15. Eine Pflanze gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Expres sion eines heterologen Produkts erst durch Zugabe einer niedermoleku laren Substanz als Induktor erfolgt.

16. Eine Pflanze gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Induktor Tetracyclin, ein Derivat des Tetracyclins oder eine andere niedermole kularen Verbindung, die in der Lage ist, durch Bindung an den Tet-Re pressor eine Veränderung seiner DNA-Bindungseigenschaft zu erreichen, ist.

17. Eine Pflanze gemäß den Ansprüchen 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie DNA-Sequenzen enthält, die eine funktionale Kombination von pflanz lichen Expressionssequenzen mit bakteriellen Kontrollsequenzen ist.

18. Eine Pflanze enthaltend die Plasmide pTET1 und pAT2HyStu4.

19. Eine Pflanze gemäß den Ansprüchen 14-18, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Tabakpflanze ist.

20. Verwendung der Plasmide pTET1 und pAT2HyStu4 zur Herstellung von Pflan zen mit einer zeitlichen und örtlichen kontrollierten Expression eines heterologen Produkts.