HUT65428A - Plasmids for controlling expression in plants - Google Patents
Plasmids for controlling expression in plants Download PDFInfo
- Publication number
- HUT65428A HUT65428A HU9200055A HU9200055A HUT65428A HU T65428 A HUT65428 A HU T65428A HU 9200055 A HU9200055 A HU 9200055A HU 9200055 A HU9200055 A HU 9200055A HU T65428 A HUT65428 A HU T65428A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- plant
- dna
- repressor
- operator
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány olyan DNS szekvenciákat magában foglaló plazmidokkal foglalkozik, amelyek lehetővé teszik a génkifejeződés szabályozását növényekben.
A növények tulajdonságait javítani lehet új genetikai információk beépítésével a növényi sejt magjába.
Ez a genetikai információ olyan DNS szekvenciákat tartalmaz, amelyek, amikor növényekbe beiktatják, heterológ termékek kialakulását eredményezik a növényekben. Az itt leírt DNS szekvenciák olyan folyamatot közvetítenek, amelyben ezek a termékek csak addig képződnek, amíg valamely kis molekula tömegű vegyületet adnak hozzájuk.
A nevezett DNS szekvenciák által kifejezett heterológ termékek lehetnek pl. olyan vegyületek, pl. fehérjék, amelyek rezisztenciát adnak át kártevők és kémiai anyagok ellen; enzimek, amelyek befolyásolják a növények metabolizmusát; fehérjék, amelyek diagnosztikumként vagy gyógyszerként alkalmazhatók; vagy ribonukleinsavak, amelyek gátolják az endogén termékek kifejeződését.
Az ilyen vagy más géntermékek kifejeződését megfelelő szabályozó szekvenciák alkalmazásával lehet szabályozni. A szabályozó szekvenciák izolálhatok magának a növénynek a genomjából. Szabályozó szekvenciák már ismertek, amelyeket bizonyos paraméterek szabályoznak, mint pl. a fény 'Kuhlemeier és munkatársai: Ann. Rév. Plánt. Physíol. 38 , 221-257 ( 1987)J , a hőmérséklet [Ainley és Key: Plánt. Mól. Bioi. 14, 949-966 (1990)] , anaerobiózis [_Freeling és Bennett: Ann. Rév. Génét. 19 , 297-332(1985)]], sérülések ]keil és munkatársai: EMBO 3. J3, 1323-1330 (1989)], növényi hormonok[Gu ilfoy1e: CRC, 247-276 (1985)], és szalicilsav (Mól és munkatársai: 337 532 lajstromszámú európai szabadalmi leírás), vagy amelyek csak bizonyos szervekben aktívak, pl. levelekben [ Stockhaus és munkatársai: EMBO J. 8^, 2445-2451 (1989)^, virágokban [Goldberg: Science 240, 1460-1467 (1988)], vagy gyökerekben ^Lam és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
7890-7894 (1989)j .
A jelen találmány olyan plazmidot szolgáltat, amely eszközöket foglal magában egy DNS szekvencia kifejeződésének növényekben való szabályozására az idővel és az elhelyezkedéssel összefüggésben. Ez a DNS szekvencia általában olyan szekvencia, amely valamely heterológ terméket kódol, bár - ha kívánatos - a szekvencia kódolhat olyan terméket is, amely a természetben is jelen van a választott gazdaszervezetben.
A találmány szerinti plazmidban a szabályozó eszközök általában olyanok, hogy a DNS szekvencia kifejezésére csak valamely induktor jelenlétében hatnak, és így általában tartalmaznak egy operátort és egy represszióhoz szükséges gént. Az előnyös szabályozó eszközök azok, amelyekkel az induktor fajlagos kölcsönhatásban van, azaz az induktor csak az újonnan megalkotott- szabályozó rendszerrel lép kölcsönhatásba, míg lényegében nincs hatása annak a növénynek a genomjában levő további szabályozó rendszerekre, amelyekbe a szabályozó eszközöket be kívánjuk iktatni .
A találmány pl. olyan plazmidokat szolgáltat, amelyek növényi kifejezés-szabályozó szekvenciák és bakteriális szabályozó szekvenciák működőképes kombinációját tartalmazzák, úgy, hogy a heterológ termék idővel és elhelyezkedéssel összefüggő módon szabályozott kifejeződését egy induktor szabályozott hozzáadásával érhetjük el; az induktor csak az újonnan megalkotott szabályozó rendszerrel lép kölcsönhatásba, és nincs számottevő hatása a genomban jelen levő más szabályozó szekvenciákra.
• ·
- 4 A bakteriális szabályozó szekvenciáknak ilyen típusú kombinációját eukarióta organizmusokból származó, génkifejeződést szabályozó elemekkel kialakíthatjuk bármely más organizmusban, így egerekben, emberi sejtvonalakban, legyekben és élesztőkben.
A találmány olyan növényeket is nyújt, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti plazmidok DNS szekvenciáit.
A természetben előforduló, szabályozható növényi szabályozó szekvenciák ismert kombinációival ellentétben a találmány szerinti plazmidok tartalmazhatják növényi kifejezés-szabályozó szekvenciák és egy vagy több bakteriális szabályozó elem, pl. represszor-operátor-induktor rendszerek, működőképes kombinációját. Egy ilyen rendszerben egy represszor fehérje nagyfokú affinitással kötődik egy fajlagos operátor szekvenciához. Ha ez az operátor szekvencia egy gén promotor területében van, ennek a génnek a kifejeződése akadályozva van. Egy represszor kölcsönhatásba lép egy fajlagos induktor molekulával, amely a represszor fehérje leválasztását idézi elő a DNS-ről, és amely ezáltal indukálja a gén aktivitását. Erre a célra több bakteriális szabályozó.rendszer áll rendelkezésre, amelyek aktivitását aktív vegyületek szabályozzák; ilyen vegyületek pl. az antibiotikumok [_Hillen és munkatársai: J. Mól. Bioi. 172, 185 (1983)]; a cukorszármazékok vagy aminosav-származékok{ Pabo és Sauer: Ann. Rév. Biochim. 5 3 , 293-321 ( 1984) j, vagy az aromás vegyületek [Nermod és munkatársai. 3. Bact. 167, 447-454 (1986)J.
Ez a találmány olyan plazmidot szolgáltat, amely tartalmaz egy növényi kifejezés-szabályozó szekvenciát és egy vagy több operátor szekvenciát pl. egy bakteriális szabályozó szekvenciából. A találmány szerinti plazmid tartalmazhat egy olyan növényi promotort, amelybe egy vagy több operátor szekvencia van beiktatva.
A növényi promotor, az operátor(ok) és a kívánt terméket kódoló DNS elrendeződésének olyannak kell lennie, hogy a DNS szekvencia csak a represszor induktorának a jelenlétében fejeződjék ki .
A növényi kifejező szekvenciák, pl. promotorok, és bakteriális szabályozó elemek vagy más operátorok találmányunk szerinti kombinációja különösen nagyfokú fátlagosságot és jó szabályozhatóságot eredményez, amikor 'az alábbi előfeltételeknek eleget tesz: az induktor nem fordul elő a növényben; jól abszorbeálódik; nem metabolizálódik vagy másféle módon sem módosul vagy inaktiválódik; és nincs figyelemreméltó hatása az endogén növényi fehérjékre. Egy olyan induktor, amely valamely transzgenikus növényben bakteriális szabályozó elemekkel lép kölcsönhatásba, annyiban van előnyben azokkal a vegyületekkel szemben, amelyek növényi szabályozó elemekkel lépnek kölcsönhatásba, hogy csak egy újonnan beépített termék kifejeződésére hat, és nem egy sorozat géntermékének kifejeződésére, amely gének természetes módon vannak jelen a növény genomjában.
A találmány kiindulási eszközeit alkalmazva a kívánt termék kifejeződése valamely represszor jelenlétében nem megy végbe mindaddig, amíg valamely induktort adunk a növényhez; a kifejeződés csak azokban a szervekben megy végbe, amelyeket az induktorral kezelünk.
Amint fentebb jeleztük, egy heterológ termék kifejeződése transzgenikus növényekben szabályózhatóvá válik operátor szekvenciák beiktatásával valamely növényi promotorba, úgy, hogy egy represszor fehérje kötődik ezekhez az operátor szekvenciákhoz és ezáltal megakadályozza a kifejeződést; a represszor • · «
- 6 fehérje elveszti az operátor szekvenciákhoz kötődés képességét valamely induktor hozzáadásának következményeképpen, ez pedig a heterológ termék kifejeződéséhez vezet. Az operátor szekvenciák lehetnek prokarióta vagy eukarióta eredetűek.
Arra is rájöttünk, hogy bakteriális operátor szekvenciák és valamely növényi promotor kombinációja különösen hatásos akkor, ha a két operátor szekvencia egy növényi promotor TATA elemétől 3’ irányban helyezkedik el.
A növényi promotor mögött előnyösen van egy polilinker is, amely lehetségessé teszi különböző génszekvenciák beiktatását, továbbá,.van egy terminációs terület is.
Arra is rájöttünk, hogy a tetraciklin rezisztencia operon szabályozó elemei, pl. a TnlO transzpozon, alkalmas egy növényi promotor aktivitásának szabályozására.
A represszor fehérje egy 207 aminosav hosszúságú polipeptid, amely nagyfokú affinitással (K = 10 ^‘''mól/l fiziológiás e g konyhasóoldatban végzett vizsgálatban) bír egy 19 bp-s operátor szekvenciához pKleinsmidt és munkatársai: Biochemistry 27, 1094-1101 (1988)].
A represszor-tetraciklin komplex nagy egyensúlyi állandója (10 mól/1) lehetővé teszi a represszor hatékony leválasztását a DNS-ről még nagyon kis tetraciklin koncentrációknál is jTakahashi és munkatársai: 3. Mól. Bioi. 187, 341-34B (1986) |.
A tetraciklin, a tetraciklin valamely származéka, vagy más olyan vegyületek, amelyek a tét represszorhoz kötődve képesek változást hozni létre ez utóbbi DNS-ének kötési tulajdonságaiban, alkalmazhatók induktorként egy ilyen rendszerben.
A tetraciklin maga egy különösen hatékony mduktornak bizonyult, mivel - legtöbb antibiotikumhoz hasonlóan - könnyen • · · * · · · «····· ··· ♦ · 4 ··· · · keresztüldiffundál a membránokon, következésképpen a növényi sejtek képesek ezt abszorbeálni. A növényekben nincsenek tetraciklin-szerű aktivitású anyagok, amelyek a represszort a kiinduláskor inaktiválnák.
Arra is rájöttünk, hogy különösen előnyös, ha két tét operátort szolgáltatunk, amelyek előnyösen a növényi promotor TATA elemétől 3’ felé helyezkednek el. Még ennél is előnyösebb, ha egy operátort a TATA-doboztól fölfelé is elhelyezünk a két, lefelé levő operátoron kívül.
A találmány szabályozó eszközeiben előnyös valamely erős promotor alkalmazása, ilyen pl. a karfiol mozaik vírus promotor. Egy promotornak lehetnek fokozó elemei, pl. a karfiol mozaik vírus (CaMV) 35S promotornak lehetnek CaMV 35S promotor fokozó elemei, amelyek konstitutív kifejeződést idézhetnek elő, vagy lehetnek más fokozó elemei, amelyek egy eltérő kifejezési mintát adnak át.
A találmány szerinti szabályozó eszközökre példa lehet egy karfiol mozaik vírus 35S promotor fragmentum, amely rendelkezik fokozó elemekkel, egy TATA dobozzal, két vagy három operátorral és egy heterológ terméket kódoló DNS szekvenciával.
A karfiol mozaik vírus 35S promotor fragmentum, amely fokozó elemekkel, pl. CaMV 35S promotor fokozó elemekkel bír, lehet pl. egy 334 bp -s fragmentum, és a TATA doboz, valamint a két tét operátor pl. egy kapcsolt CCC fragmentummal együtt lehetnek jelen egy 99 bp-s oligo-DNS fragmentumban, amelynek szekvenciája az alábbi:
• · ·
I 1 0 20 30 40 50 60 70
II I I I . ι ι ' CCCACTAGTCTTCGCAAGACCCTTTACGIATATAAGGAGATCTCTATCACTGATAGGGAGTGTTAACATAA gggtgatcagaagcgttctgggaaatgcatatattcctctagagatagtgactatccctcacaaitgtatt
90 100
I I I
CTCTATCACTGATAGAGTGATCCTTTCTAGA
GAGATAGTGACTATCTCACTAGGAAAGATCT
A karfiol mozaik vírus 35S promotor fragmentum, amelynek operátor helyei vannak a TATA doboz szomszédságában, egy ope rátora van a TATA boxról 5’ irányban és két operátora van a TATA boxtól 3’ irányban elhelyezve egy 83 bp-s DNS fragmentummal van együtt, amelynek képlete az alábbi:
10 20 30 40 CTAGACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTGA
TGAGATAGTCACTATCTCACATATATTCTGAGATAGTCACT
60 70 80
Ilii
TAGAGTGAACTCTATCAGTGATACAGTTAACGGTACCT ATCTCACTTGAGATAGTCACTATGTCAATTGCCATGGAGATC « « · » · · · • ····· · · · •» · ··« ··
- 9 Egy szabályozó rendszer tartalmazhat egy vagy több további elemet is, pl. az alábbiakból egyet vagy többet:
- polilinker szekvencia; poliadenilező szignál, pl. a nopalin szintetáz gén 203 bp-s poliadenilező szignálja; szelektálható marker gén, pl. antibiotikum rezisztencia gén, mint az 1650 bp-s higromicin foszfotranszferáz gén.
Példaként megemlítünk egy olyan szabályozó rendszert, amely tartalmaz egy polilinker szekvenciát, egy fokozó elemekkel, pl. CaMV 35S promotor fokozó elemekkel bíró, 334 bp-s karfiol mozaik vírus 35S promotort, egy TATA-dobozzal és két tét operátorral bíró 99 bp-s oligo-DNS fragmentumot, egy heterológ terméket kódoló DNS szekvenciát, a nopalin szintetáz gén 203 bp-s poliadenilező szignálját, és egy 1650 bp-s higromicin foszfotranszferáz gént; a 99 bp-s oligo-DNS fragmentuma előnyösen a fentebb megadott szekvenciával bír.
Nagyszámú klónozó vektor áll rendelkezésre idegen gének beiktatásához magasabbrendű növényekbe; ezek a vektorok E. coliban működő replikációs rendszert és egy olyan markért tartalmaznak, amely lehetővé teszi a transzformált gének szelektálását. Az ilyen vektorok között találjuk pl. a pBR322-t, a pUC sorozatot, az M13mp sorozatot, a pACYC184-et, stb. A kívánt szekvenciát a vektorba a megfelelő restrikciós helynél iktathatjuk be. Az így létrejött plazmidot alkalmazzuk E. coliba való transzformálásra. Az E. coli sejteket megfelelő tápközegben tenyésztjük, majd kinyerjük és lizáljuk. A plazmidot kinyerjük. Elemzési eljárásként általában szekvenciaelemzést, restrikciós elemzést, elektroforézist, és más biokémiai-molekulárbiológiai eljárásokat alkalmazunk. Az egyes műveletek után az alkalmazott DNS szekvenciát kihasíthatjuk és egyesít- 10 hetjük a következő DNS szekvenciával. Mindegyik plazmid szekvenciát klónozhatjuk ugyanabba/! a plazmidban, de eltérő plazmidokban is. A kívánt gének növényekbe való beiktatásának eljárásától függően más DNS szekvenciák is szükségesek lehetnek.
Ha pl. a Ti vagy Ri plazmidot alkalmazzuk a növényi sejt transzformációjához, akkor a Ti- vagy Ri-plazmid legalább jobb határterületéhez, de gyakran mind a jobb, mind a bal határterületéhez T-DNS-t kell csatolni a beiktatandó gének szegélyező területeként. A T-DNS alkalmazását növényi sejtek transzformálásához már erőteljesen kutatták; erről számolnak be pl. az alábbi irodalmi helyek: 120 516 számú európai szabadalmi leírás; Hoekema: a The Binery Plánt Vector System(A binér növényi vektor rendszer) című köntfv V. fejezetében, kiadó: Offset-drukkerij Kanters B.V., Ablasserdgm (1985); Frailey és munkatársai: Crit. Rév. Plánt. Sci. £, 1-46; An és munkatársai: EMBO 0. £, 277-287(1985).
Amikor a beiktatott DNS integrálódott a genomban, ott már viszonylag stabil, és általában nem jön ki újból. Ez normálisan tartalmaz egy szelekciós markért, amely a transzformált növényi sejteknek rezisztenciát ad át valamely biocid vagy antibiotikum ellen; ilyen antibiotikum lehet többek között pl. kanamicin, G418, bleomicin, higromicin vagy klóramfenikol. Az egyedileg alkalmazott markernek következésképpen lehetővé kell tennie a transzformált sejtek szelekcióját azok közül a sejtek közül, amelyek nem tartalmazzák a beiktatott DNS-t.
Nagy számú technika áll rendelkezésre DNS beiktatására valamely növényi gazdasejtbe. Ezek között a technikák között találjuk a T-DNS transzformálását, transzformáló ágensként Agrobacterium tumefacienst vagy Agrobacterium rhizogenest alkalmazva, továbbá a fúziót, az injektálást, vagy az elektro• · • · ·· « · e · · · · • ····· * * · •a « ··· «♦
- 11 porációt, valamint további lehetséges eljárásokat. Ha a transzformáláshoz Agrobacteriumokat alkalmazunk, a beiktatandó DNS-t speciális plazmidokba kell beiktatni, nevezetesen valamely intermedier vektorba vagy egy biner vektorba. Az intermedier vektorok a Ti vagy Ri plazmidba homológ rekombinációval integrálhatok a T-DNS-ben levő szekvenciákhoz homológ szekvenciák miatt. A Ti vagy Ri plazmidok tartalmazzák a T-DNS átviteléhez szükséges vir területet is. Az intermedier vektorok nem képesek replikálódni Agrobacteriumokban. Az intermedier vektorokat egy segítő (helper) plazmid segítségével lehet átvinni Agrobacterium tűmetaciensbe (konjugáció). A binér vektorok képesek replikálódni mind E. coliban, mind Agrobacteriumokban. Ezek tartalmaznak egy szelekciós marker gént és egy kapcsolót vagy Polliinkért, amelyeket a jobb és bal T-DNS határterületek szegélyeznek. Ezek transzformálhatok közvetlenül Agrobacteriumokba [JTolsters és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 ( 1978 )J. A gazdasejtként alkalmazott Agrobacteriumnak tartalmaznia kell egy vir területet hordozó plazmidot, A vir terület a T-DNS átviteléhez szükséges a növényi sejtekbe. További T-DNS-ek is lehetnek jelen. Az így transzformált baktériumot alkalmazzuk növényi sejtek transzformálására. Előnyösen növényi explantátumokat tenyésztünk Agrobacterium tumefacienssel vagy Agrobacterium rhizogenessel a DNS átviteléhez a növényi sejtekbe. Ezután teljes növényeket regenerálunk a fertőzött növényi anyagból (pl. levéldarabból, a szár valamely szegmenséből, gyökérből, illetve protoplasztokból vagy szuszpenzióban tenyésztett sejtekből) megfelelő tápközegben, amely a szelekció érdekében tartalmazhat antibiotikumokat vagy biocidokat. A plazmidokkal szemben nincsenek speciális igények, ha injektálást vagy
4444 · 4 ··
4 44 · « 4 4 4 4 ·4 » « 4 · 4 4 4 · 4 « · ·· · ♦ elektroporációt alkalmazunk. Alkalmazhatunk ez esetben közönséges plazmidokat, pl. pUC származékokat is.
A transzformált sejtek a növényeken belül a szokásos módon növekednek. A növényeket növeszthetjük a szokásos módon és keresztezhetjük olyan növényekkel, amelyek azonos transzformált öröklődő faktorokkal vagy más öröklődő faktorokkal bírnak. A keletkező hibrid egyedek a megfelelő fenotípusos tulajdonságokkal bírnak.
Figyelembe kell venni, hogy a találmány szerinti szabályozó rendszer valamely növényben csak akkor működik, ha megfelelő represszor fehérje van jelen; így pl. amikor a szabályozó eszköz tét operátort tartalmaz, valamely tét represszort kell szolgáltatni. Következésképpen ha a gazdanövény már nem termeli a megfelelő represszort, a növényt el kell látni eszközökkel a represszor termelésére, vagyis a represszort kódoló DNS-sel.
Ezt általában úgy lehet elérni, hogy a represszor génjét vagy megfelelő gén-fragmentumát megfelelő vektorban klónozzuk, és a gént valamely növénybe iktatjuk. Valamely megfelelő vektor megalkotásé bán megfelelő növényi kifejezés-szabályozó elemeket is kell szolgáltatni abból a célból, hogy biztosítsuk a represszor kifejeződését a gazdanövényben. Előnyös erős, elsősorban konstitutív növényi promotorokat alkalmazni.
Az alábbiakban leírjuk a DNS beiktatásának megfelelő technikáit valamely gazdanövénybe.
A találmány olyan plazmidokat nyújt, amelyek tartalmaznak valamely represszort, pl. tét represszort kódoló DNS-t, továbbá olyan növényeket nyújt, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti szabályozó eszközöket és tartalmazzák a megfelelő represszort kódoló DNS-t is.
«4*9 9 « 9 it · ·9
99« • <99·*
- 13 A találmány ismerteti a találmány szerinti szabályozó eszközöket tartalmazó plazmidok alkalmazását, ahol a plazmidok magukban foglalnak valamely operátort is, ismerteti továbbá általában a megfelelő represszor kódoló DNS-t tartalmazó plazmidok alkalmazását olyan növények előállításában, amelyben egy DNS szekvencia kifejeződése szabályozható idő és elhelyezkedés szerint.
Valamely kívánt termék kifejeződésének szabályozását idő és elhelyezkedés ' szerint a találmány szerinti transzgenikus növényekben úgy érhetjük el, hogy az induktort hozzáadjuk a szabályozó rendszerhez, amelyet beiktattunk a növénybe; a kifejeződés csak akkor megy végbe, amikor az induktor jelen van, és csak azokon a helyeken megy végbe, ahol az induktor jelen van.
Az időbeli szabályozást pl. úgy érhetjük el, hogy szabályozzuk az induktor alkalmazásának időbeosztását, gyakoriságát és számát.
Figyelembe kell venni, hogy valamely találmányunk szerinti transzgenikus növényben való alkalmazásnál az induktornak képesnek kell lennie elérni a represszort, vagyis a transzgenikus növénynek képesnek kell lennie, felvenni az induktort és amikor már a növényen belül van, az induktornak képesnek kell lennie elérni a represszort. Ezen kívül az induktor nem lehet toxikus a növényre.
Amint fentebb jeleztük, a tetraciklin teljesíti a fenti kritériumokat. A további alkalmas induktorok között találjuk azokat a tetraciklin származékokat, amelyek kötődnek a represzszorhoz és megszüntetik annak DNS-kötő képességét. Egy kiválasztott induktorhoz tartozó megfelelő operátor/represszor rendszert beépíthetünk valamely növénybe a fentebb leírtak szerint, pl. a tetraciklin operátor/represszor rendsze ana- 14 lógiájára.
Meghatározások és rövidítések bp, kb - bázispár, kilobázis
DNS = dezoxiribonukleinsav, a genetikai információ hordozója
RNS - ribonukleinsav
HEPES = N-2-hidroxi-etil-piperazin-N’-2-etánszulfonsav kDa = kilodalton
SDS = nátrium-dodecil-szulfát trisz - trisz(2-amino-etil)amin
EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav mmól = millimól fmól = femtomól
Az alábbi plazmidokat deponáltuk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél (DSM) (Német Mikroorganizmus-gyűjtemény) Brunswickban (Német Szövetségi Köztársaság), 1990. december 23-án (MM í n i ú/'.u > - , \ έ . ) '1 pTETl plazmid (DSM 6281) pAT2HyStuh piAzmíd ( t. :.2..Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat:
Az 1. ábra a 10,7 kb-s pTETl plazmid restrikciós térképét mutatja be. A rövidítések jelentése az alábbi:
LB = a T-DNS bal határszekvenciája
RB = a T-DNS jobb határszekvenciája
CaMV 35S = a karfiol mozaik vírus promotora (526 bp) tetR = a tetraciklin represszor strukturgénje (695 bp) öcs = az oktopin szintetáz gén poliadenilező szignálja (180 bp) nptll = a neomicin foszfotranszferáz kiméra génje a nopalin szintetáz promotor szabályozása alatt (1200 bp)
Bemutatjuk az 1. példában leírt hasítási helyeket is.
• ·
A 2. ábra egy elektroforézis autoradiogrammja a működőképes tét represszor kimutatására transzgenikus dohánynövényekben.
Az 1.-10. helyeken 6 fmól és a 11.-20. helyeken 20 fmól ^^P-jelzett operátor fragmentum (360 bp) volt beiktatva. Az 1.-4. helyeken a kötési reakciót végeztük el 0 (kontroll), 20, 60 és 120 fmól tét represszor jelenlétében (a tét represszor Escherichia coliból volt tisztítva). Az 5.-10. helyeken a kötési reakciót végeztük el O(kontroll), 1, 2, 4, 6 és 8^g fehérje extraktum jelenlétében, ahol a fehérjé-extraktum a pTETl plazmid T-DNS-ét tartalmazó transzgenikus növény leveleiből származott; a 11.-14. helyeken a kötési reakciót végeztük el 0(kontroll), 10, 100 és 200 fmól tét represszor jelenlétében (a tét represszor Escherichia coliból volt tisztítva); a 15.-20. helyeken a kötési reakciót végeztük el O(kontroll), 1, 2, 4, 8 és 16 víg fehérje extraktum jelenlétében, ahol a fehérje-extraktum a pTETl plazmid T-DNS-ét tartalmazó transzgenikus növény protoplasztjaiból származott.
A rövidítések az alábbi jelentéssel bírnak
R = tet-represszor-DNS komplex
F = komplexbe nem vitt DNS.
A 3. ábra a 15 kb-s pAT2HyStuh plazmid restrikciós térképét mutatja be. A rövidítések jelentése az alábbi.
LB = a T-DNS bal határszekvenciája
RB = a T-DNS jobb határszekvenciája
CaMV 35S = a karfiol mozaik vírus két tét operátort tartalmazó promotorja (fokozója) (334 bp) oligo = a TATA dobozt, két tét operátort és az Spl , SnabI, BglII, Hpal és Xbal hasítási helyeket tartalmazó DNS fragmentum (99 bp)
- 16 gus = a ^>-glukuronidáz strukturgénje (1800 bp) Escherichia coliból nos = a nopalin szintetáz gén poliadenilező szignálja (203 bp) hptl = a higromicin foszfotranszferáz kiméra génje (1650 bp) a nopalin szintetáz promotor szabályozása alatt nptll - a neomicin foszfotranszferáz kiméra génje a nopalin szintetáz promotor szabályozása alatt (1200 bp)
A 2. példában leírt hasítási helyeket szintén bemutatjuk.
A 4. ábra a Northern folt elemzés' autoradiogramját mutatja be a gus gén tetraciklin-függő kifejeződésének kimutatására 6 független transzgenikus növény (1.-6. helyek) leveleinek extraktumában, amely növények tartalmazzák a pTETl plazmid és pAT2HyStu plazmid T-ONS-ét.
+ = RNS transzgenikus növények leveleiből tetraciklinnel végzett kezelés után
- = RNS transzgenikus növények leveleiből tetraciklinnel végzett kezelés nélkül
Az 5. ábra a Northern folt elemzés autoradiogramjét mutatja be a tetraciklin indukció koncentrációfüggésének jellemzésére transzgenikus növények (1.-5. helyek) leveleinek extraktumaiban különböző tetraciklin koncentrációkkal ‘ Tc(mg/1): 0,1; 0,5; 1; és 10 és kontrollal [Tc(mg/1): O] végzett kezelés után.
A rövidítések jelentése az alábbi.
Te = tetraciklin gus = p-glukuronidáz mRNS-e Escherichia coliból tetR = a tét represszor mRNS-e
A 6. ábra a Northern folt elemzés géljét mutatja be a tetraciklin indukció időbeni kifejlődésének jellemzésére transzgenikus növények (1.-6. helyek) leveleinek extraktumaiban. A • ·
- 17 mintákat O(kontroll); 0,5; 1; 3; 6; és 22 óra (h) múlva veszszük. A rövidítések jelentése az alábbi:
gus = ρ -glukoronidáz mRNS-e Escherichia coliból tetR = a tét represszor mRNS-e
A 7. ábra a gus-kifejeződés helyi indukcióját mutatja be egy transzgenikus növény levelében.
Abból a célból, hogy megértsük a találmány alapját képező példákat, az összes olyan műveletet, amely ezekhez a vizsgálatokhoz szükséges, és amely önmagában ismert, először sorrendbe szedve ismertetjük.
1. ) Klónozási eljárás
A klónozáshoz a pUC18/19 vektorokat |Yanisch-Perron és munkatársai: Gene 33 , 103-119(1985)J alkalmazzuk. A növény transzformálásához a génkonstrukciókat a BIN19 binér vektorba |_Bevan: Nucl. Acids Rés. 12 , 8711-8720(1984)J klónozzuk. Standard eljárásokat végzünk ismert munkamenetek szerint jManiatis és munkatársai: Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1982)] .
2. ) Baktériumtörzsek
A pUC vektorokhoz az E. coli DH 5 alfa törzset használjuk, amelynek genotípusa F , end Al, hsdR17, (r^, m^), supE44, thi-I, R , recAl, gyrA96, rdAl , 0 80d lacZAM15. A növények transzformálását Agrobacterium tumefaciens GV 2260 segítségével végezzük [ Deblaere és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 13, 4777-4788(1985)].
3. ) Az Agrobacterium tumefaciens transzformálása
A DNS beiktatását Agrobacteriumokba közvetlen transzformálással hajtjuk végre a Holster és munkatársai által ki18 fejlesztett eljárás szerint fjétől. Gén. Génét. 163, 181187(1978)3- A transzformált Agrobacteriumok plazmid QNS-ét a Bimbóim és Doly által kifejlesztett eljárás szerint izoláljuk ^Nucl. Acids Rés. 1_, 1513-1523(1979).], és megfelelő restrikciós hasítás után gélelektroforézissel különítjük el.
4.) A növények transzformálása
Agrobacterium turnéfaciens egy éjszakán át YEB tápközegben amely 0,5¾ marhahúskivonatot, 0,1¾ élesztőkivonatot, 0,5¾ peptont, 0,5¾ szacharózt és 2 mmól/1 magnézium-szulfátot tartalmaz - nőtt tenyészetének 10 ml-ét lecentrifugáljuk, a felülúszót eldobjuk, és a baktériumokat újra szuszpendáljuk azonos térfogatú, antibiotikum-mentes tápközegben. Steril Petri-csészében steril növények levéllemezeit (mintegy 1 cm ), amelyeknek központi erét előzőleg eltávolítottuk, belemerítjük a baktériumszuszpenzióba. A levéllemezeket azután szorosan csomagolt elrendezésben olyan Petri-csészékbe helyezzük, amelyek 2¾ szacharózzal és 0,8¾ Bacto agarral kiegészített MS tápközeget tartalmaznak [ Murashige és Skoog szerint: Physiologia Plantarum 25, 473-497 ( 1962 )3- Két napos, sötétben és 25°C hőmérsékleten végzett inkubálás után ezeket olyan MS tápközegbe visszük át, amely tartalmaz 100 mg/1 kanamicint vagy higromicint, 500 mg/1 claforant, 1 mg/1 benzil-aminopurint (BAP), 0,2 mg/1 nafti1-ecetsavat (NAA) és 0,8 ¾ Bacto-agart is. A növekvő hajtásokat átvisszük hormonmentes MS tápközegbe, amely ki van egészítve 250 mg/1 claforannal és 50 mg/1 kanamicinnel vagy higromicinnel .
Azokat a hajtásokat, amelyek ezen a tápközegen gyökereket • ·
- 19 képeznek, átvizsgáljuk Northern és Southern folt elemzéssel a vizsgálandó DNS szekvenciák integrációjára.
5. ) A genomikus DNS elemzése transzgenikus növényekből
A genomikus növényi DNS izolálását Rogers és Bendich szerint végezzük j^Plant. Mól. Bioi. 69-76(1985)]. A DNS elemzéshez 20 g, megfelelő restrikciós hasítás után kapott DNS-t elemzőnk Southern folt elemzéssel a vizsgálandó DNS szekvenciák integrálódására.
A DNS-t 3 mól/1 nátrium-kloridot és 0,3 mól/1 nátriumcitrátot tartalmazó SSC pufferban membránra visszük át.
Hibridizálást hajtunk végre hibridizáló pufferben Amasino szerint [Anal. Biochem. 152, 304-307(1986)^; a puffer 10¾ polietilénglikolt is tartalmaz. Abból a célból, hogy az integrált DNS szekvenciát kimutassuk, a DNS fragmentumot radioaktívan jelezzük.
6. ) A teljes RNS elemzése transzgenikus növényekből.
A növény teljes RNS-ének izolálását Logemann és munkatársai szerint hajtjuk végre Analytical Biochem. 163, 16-20( 1987)]. Az elemzéshez a teljes RNS 30 <g-os részleteit vizsgáljuk Northern foltképzés segítségével a keresett átirat jelenlétére. A foltképzést és hibridizálást ugyanazzal a munkamenettel végezzük, mint amelyet a Southern foltelemzéshez megadtunk.
8.) A tét represszor kimutatása transzgenikus növényekben,
100 mg levél-anyagot olyan növényekből, amelyek tartalmazzák a pTETl plazmid T-DNS-ét, homogenizálunk fagyasztás r~ nélkül 200 extrakciós pufferban [50 mmól/1 nátrium-dihidrogén-foszfát/dinátrium-hidrogén-foszfát puffer (pH 7,5), 1 mmól/1 EDTA, 0,1¾ 4-(1,1,3,3-tetrameti1-buti1)• · ··
- 20 -fenol, 10 mmól/1 p-merkapto-etanol, 2 mmól/1 nátriumhidrogén-szulfit, 2 mmól/1 fenil-metil-szulfoní1-fluorid, 1 vjg/l antipain, 1 m g/ml aprotinin, lu/V[g/ml kimosztatin, l^g/ml leupeptin, 1 Mg/ml pepsztatin, továbbá 1 g levélanyagra számítva 0,1 g polivinilpirrolidon .
A kötési reakciót 40 v<l trisz pufferban Γ 50 mmól/1 nátriumklorid, 10 mmól/1 magnézium-klórid és 10 mmól/1 trisz.HC1 (pH 7,5) | hajtjuk végre, a pufferhoz 5-20 fmól ^^P-végjelzett operátor fragmentumot adva, amelynek fajlagos aktivitása 0,6 Ci P/mmól, továbbá 80;\g heringsperma DNS-t
V adva. Ezután a kötési reakciókeverékhez 0,5-10 il levélextraktumot adunk. 15 perces, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után megfelelő mennyiségű glicerint adunk a keverékhez, hogy az oldat glicerinre 25%-os legyen. Az oldatot 5%-os poliakrilamid gélre visszük fel, és gélelektroforézissel elkülönítjük. Az elektroforézist trisz pufferban hajtjuk végre (pH 8,0)(60 mmól/1 trisz bázis, 60 mmól/1 bórsav, 1 mmól/1 EDTA és 10¾ glicerin) 12 óra alatt 2,5 V/cm-nél. A géleket ezután megszárítjuk. Az előforduló radioaktív csíkokat azután autoradiográfiával tesszük láthatóvá.
9.) Protoplaszt előállítás pTETl plazmid T-ONS-et tartalmazó steril növények leveleiből a Damm és Wilmitzer által kifejlesztett eljárással j_Mol. Gén. Génét. 213, 15-20(1988) j állítunk elő protoplasztokat. A protoplasztokat megszámláljuk, centrifugálással koncentráljuk, és felvesszük 100^1 extrakciós pufferban; 100 vil extrakciós puffer 300000 protoplasztot tartalmaz. A protoplasztokat ugyanebben a pufferban lizál• · · • · ···· · · · •β · ··· · ·
- 21 juk. A sejttörmeléket azután lecentrifugáljuk.
10.) A gus aktivitás vizsgálata
A fluorometriás gus vizsgálathoz explantátumokat homogenizálunk és inkubáljuk 37°C hőmérsékleten 4-metil-umbelliferil-p-D-glukuroniddal. A fluoreszcencia mennyiségi mérését Jefferson szerint végezzük ^Plant Mól. Bioi. Rep. £, 387-405(1987)j. A fehérjekoncentrációkat Bradford szerint határozzuk meg (1979). Az in vivő festéshez ép növényi anyagot vákuumban kezelünk 1 mmól/1 X-Gluc-cal (5-bróm-4-klór-3indoli1-^-D-glukuronsav ciklohexil-ammónium) , és inkubáljuk egy éjszakán át 37°C hőmérsékleten.
1. példa
A pTETl plazmid előállítása és a plazmid T-DNS-ének beiktatása a dohány növényi genomjába.
A BINAR I Höfgen és Willmitzer: Plánt Science 66 , 221-230 (1990)J és pWH305 [Ohemichen és munkatársai: EMBO J. £,539-543 (1984)J plazmidokat használjuk a pTETl plazmid előállítására. A BINAR plazmid a BIN19 binér vektor [Bevan: Nucl. Acids Rés. 12, 8711-8720(1984) j származéka, amely a polilinker EcoRI és HindlII helyei között tartalmazza a karfiol mozaik vírus (CaMV) 35S RNS-ének promotorát, amely promotor konstitutív kifejeződést tesz lehetővé, valamint tartalmazza az oktopin szintetáz gén poliadenilező szignálját. A promotor és a poliadenilező hely között vannak elrendezve az alábbi hasítási helyek: KpnI, Smal, BamHI, Xbal, Sáli, Pstl. A pWH305-ből való 695 bp-s Hpa'l fragmentumot beiktatjuk az Smal hasítási helyre. A Hpal fragmentum tartalmaz 18 bp-t az 5’-nem transzlatált vezetőből, 624 bp-t a strukturgénből és 51 bp-t a tefR gén 3 ’-területéből. A Smal hasítási hely elvész a klónozási folyamat során. A pTETl
plazmid teljes mérete 10,7 kb, amely az alábbiakból tevődik össze: az Ecol hely és a KpnI hely között van a CaMV 35S vírus 526 bp-s promotor fragmentuma |_Covey és Hull: Advances in Cauliflower Mosaic Vírus Research (Fejlemények a karfiol mozaik vírus kutatásában), Oxford Surveys of Plánt Molecular and Cell Biology 2_, 339-346(1985)3, a KpnI hely és a BamHI hely között van a tetR gén 695 bp-s fragmentuma; a BamHI hely és az Sphl hely között található a fentebb említett hasítási helyekkel bíró polilinker szekvencia; az Sphl hely és a HindlII hely között található az oktopin szintetáz gén 180 bp-s poliadenilező szignálja. Mihelyt integrálódott a növényi genomban, a plazmid megfelelő része végrehajtja a tét represszor fehérje szintézisét az összes szövetekben. A szekvenciák az EcoRI helyen és a HindlII helyen kívül a BIN19 vektor szekvenciái. Ezek tartalmazzák az összes funkcióit a plazmid replikációjához és szelekciójához Escherichia coliban és Agrobacterium tumefaciensben, továbbá a T-DNS átviteléhez növényekbe, valamint a transzformált növényi sejtek szelektálási lehetőségét kanamicinen. A rezisztenciát az nptll gén adja át. A plazmidot Agrobacterium tumefaciensbe transzformáljuk. A DNS átvitelét dohány növénybe úgy hajtjuk végre, hogy ezeket az Agrobacteriumokat együtt tenyésztjük dohánynövényekből származó levelek kis darabjaival. A szelekciót kanamicinen végezzük. Ép és szaporodásra képes növényeket regenerálunk a transzformált sejtekből.
A függetlenül transzformált növényeket megvizsgáljuk a tét represszor mRNS-ének szintézisére Northern folt elemzéssel.
Amint ismeretes, az mRNS mennyisége az egymástól független transzgenikus növényekben jelentősen eltérő lehet [Sanders és munkatársai: Nucl . Acids Rés. 15, 15 43-1558( 1987)] . A szinte• · · • ••4 • · • · · • · · · · · • · ·
- 23 tizált mRNS legmagasabb kitermelését mutató növényt használjuk fel további elemzésre.
Abból a célból, hogy meghatározzuk a működőképes tét represszor mennyiségét egy adott növényben, retard gélelemzést hajtunk végre Fried és Crothers szerint '[Nucl. Acids Rés. 9_, 6505-6525(1981)^ (lásd a 2. ábrát). Az elemzésnek ez a módszere azt a tényt használja ki, hogy egy fehérje-DNS komplex lassabban fut az 5%-os poliakrilamidon végzett elektroforézis után (lásd a 2. ábra R csíkját), mint a nem-kötött DNS (lásd a 2. ábra F csíkját). A növények egyike leveleiből származó nyers extraktum azon fehérjéjéből, amely a tét represszor szintéziséhez az átiratot szintetizálja, 1-8 vig-ot inkubálunk 6 fmól tisztított, P-végjelzett operátor-fragmentummal, és elektroforezisnek vetjük alá 5%-os poliakrilamid gélen. Amint a 2. ábrában bemutatjuk, az 5.-10. helyeken levő fragmentumok mobilitása ugyanolyan mértékben marad vissza, mint a 2.-4. helyeken, ahol E. coliból tisztított represszor fehérjét .alkalmazunk a kötési reakcióban. Ezt a fehérjét az Ohemichen és munkatársai által leírt tisztítási munkamenettel kapjuk meg j EMBO J. 539-543 (1984)]. Ezek a helyek szolgálnak kontrollként annak jelzésére, hogy a növényi kivonatokban előforduló operátor kötő fehérje azonos elektroforetikus mobilitással bír, mint a tét represszor. Ebből az következhet, hogy a tetR átiratot tartalmazó növény működőképes tét represszort szintetizál. Visszamaradás nem figyelhető meg a nem transzformált dohány növényekből származó extraktumokkal. Az operátor fragmentum koncentrációja a kötési reakcióban 0,25.10-^M.
A represszor kötési állandója az operátor DNS-hez az itt alkalmazott fiziológiás konyhasóoldat körülményei között (50 ·· ·
mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 magnézium-klorid) 0,5.10 mól/1 Lkleinschmidt és munkatársai: Biochemistry 27 , 1094-1104 (1988)Ahhoz, hogy ki tudjuk számítani a represszor mennyiségét, fel kell tételeznünk, hogy ilyen körülmények között kvantitatív kötés megy végbe. Mivel a négy monomer, amelyek mindegyikének molekulatömege 24 kDa, kötése a fragmentum teljes visszamaradását eredményezi, úgy számítjuk - a 8. nyomvonal alapján - hogy 24 fmól tét represszor található 4 ,wg fehérjeextraktumbaη, amely a fehérje teljes mennyiségének 0,01%-át alkotja. Abból a célból, hogy felbecsüljük a tét represszorok sejtenként! számát, ugyanabból a dohánynövényből protoplasztokat készítünk. A 2. ábra 15.-20. helyei titrálási kísérletet mutatnak be, amelyekben 5000; 10000; 20000; 40000; és 80000 protoplaszt kivonatait alkalmazzuk. Mintegy 18 fmól marad vissza a 20. helyen , amely 72 fmól represszort jelez 80000 protoplasztban. Mivel 72 fmól represszor egyenértékű 4,5.10^ represszor molekulával, a becslés az, hogy a szintézis aránya legalább 50000 represszor molekula sejtenként az elemzett növényben .
2. példa
A pAT2HyStu4 plazmid előállítása, és egy operátort tartalmazó CaMV 35S promotor stabil integrálódása dohány növénybe, amely tét represszort szintetizál.
A következő klónozási lépéseknek az a célja, hogy egyesítsék azt a két operátor szekvenciát, amelyekhez a tét represszor kötődik, a CaMV 35S promotorral. Hasonlóan a többi olyan eukarióta promotorhoz, amelyet a polimeráz II ismer fel, a CaMV 35S promotor tartalmaz egy TATA dobozt, amelynek szomszédságában az általános transzkripciós faktorok aktívak, valamint t < <· • · ·· · • « · · · ·« • ····· · * * ·· · ··· ·«· *···
- 25 5’-irányban elhelyezett fokozó elemeket, amelyek - a CaMV 35S promotor esetében - felelősek egy erős konstitutív kifejezésért a növény összes szöveteiben. Az operátor szekvenciák a TATA doboz közvetlen szomszédságában úgy helyezkednek el, hogy a hozzájuk kötődő tét represszor kölcsönhatásban van az ebben a területben aktív transzkripciós faktorokkal. Ennek a stratégiának az az előnye, hogy az újonnan megalkotott DNS szekvenciát, nevezetesen a TATA dobozzal kombinált operátor szekvenciákat, lehet egyesíteni más fokozó elemekkel is, amelyek a CaMV 35S promotor fokozó elemei által átadott kifejezési mintától eltérő kifejezési mintát adnak át.
Mivel a promotor vad típusú szekvenciájában nincs megfelelő hasítási hely egy további DNS fragmentum beiktatásához, a -56-tól a +7-ig terjedő szekvenciát (ahol +1 felel meg a transzkripciós rajthelynek) a következőképpen változtatjuk meg: a már leírt klónozási folyamattal ^Gatz és Quail: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1394-1397(1988 analóg módon a -56-tól a +7-ig terjedő területekben a promotor vad típusú szekvenciáit az alábbi primer szerkezettel bíró szintetikus DNS fragmentummal helyettesítjük:
-56 * 1
CCCACTAGTCTTCGCAAGACCCTTTACGTATATAAGGCCTTTCTAGACATTTGCTCGA
ATCAGAAGCGTTCAGGGAAATGCATATATTCCGGAAAGCTCTGTAAACGAGCTCTAG
Ez a szintetikus DNS fragmentum az alábbi hasítási helyekkel bír:
Spel: ACTAGT a -53,helytől a -48,helyig;
SnabI: TACGTA a -32,helytől a -27.helyig;
Stul: AGGCCT a -22,helytől a -17,helyig;
| -•4· v ·· • 4 4* · • · * · ··· * «·««· · · · ·· « «»4 ·· - 26 - | ||
| Xbal: | TCTAGA | a -15, helytől a -10,helyig; |
| Xhol: | CTCGAG | a +3.helytől a -3.helyig; |
| BglII | : AGATCT • > | a + 2_ helytől a +7rhelyig, továbbá, a TATATAA szekvenciával a -31. és -24. |
helyek között, amely a promotor aktivitásához fontos.
Ennek a klónozásnak az eredményeként a CaMV 35S promotort olyan mértékig változtatjuk meg, hogy lehetségessé váljék DNS fragmentumnak beiktatása a fentebb felsorolt hasítási helyekbe. A változtatások nem befolyásolják a promotor aktivitást. Ezt a promotort ezután CaMV(Rés.)-nek nevezzük.
A Stul helybe egy 55 bp-s szintetikus szekvenciát iktatunk be. Ennek a szintetikus DNS-nek a primer szerkezete az alábbi:
agatctctatcactgatagggagagttaacataactctatcactgatagagtgat tctagagatagtgactatccctctcaattgtattgagatagtgactatctcacta
A klónozás során a Stul hely elvész.
A klónozási lépés után az operátort tartalmazó CaMV 35S
| promotor hely) az | szekvenciája a alábbi: | -56^ és +61. helyek | között | (összesen 118 |
| 1 | 10 20 | 30 40 | 50 | 60 70 |
CCCACTAGTCTTCGCAAGACCCTTTACGTAT ATAAGGAGATCT CTATCACTGATAGGGAGTGTTAACATAA
GGGTGATCAGAAGCGTTCTGGGAAATGCATATATTCCTCTAGAGATAGTGACTATCCCTCACAATTGTATT
-56 _
- 27 «*·· V « · • * * * · »·· ·· • ·· ·· Λ «' · 1 • · » ··· ··
90 100 110
I I I I
CTCTATCACTGATAGAGTGATCCTTTCTAGACATTTGCTCGAGATCT
GAGATAGTGACTATCTCACTAGGAAAGATCTGTAAACGAGCTCTAGT ♦61 [118.^1
A szekvencia az alábbi szerkezeti vonásokkal bír:
Spel: ACTAGT a 4. és 9. helyek között;
SnabI: TACGTA a 25. és 30. helyek között;
TATA doboz: TATATAA a 29. és a 35. helyek között;
BglII: AGATCT a 38. és a 43. helyek között;
tét operátor: TCTCTATCACTGATAGGGA a 41. és 59. helyek között; Hpal: GTTAAC a 62. és 67. helyek között;
tét operátor: ACTCTATCACTGATAGAGT a 71. és 89. helyek között;
Xbal: TCTAGA a 97. és 102. helyek között;
Xhol: CTCGAG a 109. és 114. helyek között;
BglII: AGATCT a 113. és 118. helyek között.
Ennek a szekvenciának az egyesítése valamely növényi fokozó elemmel olyan promotor képződéséhez vezet, amely nem olvasódik le a növényben tét represszor jelenlétében. Tetraciklin induktor jelenlétében azonban a promotor aktív.
Az itt bemutatott példákban a 118 bp-s DNS fragmentum a CaMV 35S promotor fokozó elemeivel egyesítve van jelen (lásd a fenti klónozási stratégiát).
Egy összesen 471 bp hosszúságú fragmentumot - amely tartalmazza a vad típusú CaMV 35S promotor -390. és -56. bázispárjai közti területet, valamint tartalmazza az Xbal helyet (a 97. és 102. helyek között) magában foglaló szintetikus szék28 véneiét - klónozunk EcoRI/Xbal fragmentum formájában a pGUS vektorba (amelyet előzőleg EcoRI-gyel és Xbal-gyel hasítottunk). Ez a pGUS vektor tartalmazza a bakteriális p>-glukuronidáz (gus) strukturgénjének szekvenciáját [Jefferson és munkatársai: EMBO J. 6_, 3901-3907 (1987)], amely előtt egy EcoRI, SacI , KPnI , Smal , BamHI és Xbal hasítási helyekkel bíró polilinker helyezkedik el.A nopalin szintetáz gén poliadenilező szignálja a 3’ végen helyezkedik el. Ezt a kiméra gént EcoRI/HindlII fragmentum formájában hasítjuk ki és a BIN19 [ Bevan: Nucl . Acids Rés. 12 , 8711 — 8720 (1984)] EcoRI/Hind helyei közé klónozzuk. Ezután ennek a BIN19 származéknak HindlII helyébe egy kiméra higromicin foszfotranszferáz gént klónozunk a nopalin szintetáz promotor szabályozása alatt úgy, hogy lehetséges legyen a transzformációs esemény szelektálása azokban a már kanamicin rezisztens növényekben, amelyek tartalmazzák a pTETl plazmid T-DNS-ét. A higromicin foszfotranszferáz gén helyett lehet más rezisztencia gént is alkalmazni; az egyetlen kivétel a neomicin foszfotranszferáz gén. A pAT2HyStu4 rekombináns DNS restrikciós térképét a 3. ábrában mutatjuk be. A nevezett ábrát azért alkottuk meg, hogy bemutassuk: a 15 kb-s pAT2HyStu4 plazmid az alábbi fragmentumokból tevődik össze; az EcoRI és BamHI helyek közt egy polilinker szekvenciája található; a BamHI és az Spel helyek között egy 334 bp-s DNS fragmentum található, amely tartalmazza a CaMV 35S promotor fokozó elemeit és tartalmaz még egy CCC szekvenciát; az Spel és az Xbal helyek között található az a szintetikus oligo-DNS fragmentum, amely tartalmaz egy TATA dobozt és két tét operátort.
A 99 bp-s szintetikus oligo-DNS fragmentum és a CCC szekvencia együttes bázisszekvenciája az alábbi ;
10 20 30 «0 50 6070
I I I I I I II cccactagtcttcgcaagaccctttacgtatataaggagatctctatcactgatagggagtgttaacataa GGGTGATCAGAAGCGTTCTGGGAAATGCATATATTCCTCTAGAGATAGTGACTATCCCTCACAATTGTATT
90100
I II
CTCTATCACTGATAGAGTGATCCTTTCTAGA
GAGATAGTGACTATCTCACTAGGAAAGATCT
Az Xbal és SacI helyek között található a p-glukuronidáz - . strukturgénje (1800 bp); a SacI és a HindlII helyek között található a nopalin szintetáz gén poliadenilező szignálja (203 bp); a két HindlII hely között található a higromicin foszfotranszferáz gén a nopalin szintetáz promotor szabályozása alatt (1650 bp). Az EcoRI helyen és a második HindlII helyen belül levő szekvenciák tartalmazzák az információt a p-glukuronidáz szintézisről, valamint a higromicin-rezisztencia kifejezéséhez szükséges információt. Az EcoRI helyen és a második HindlII helyen kívül levő szekvenciák a BIN19 vektor szekvenciái. Ezek tartalmazzák az összes funkciót a plazmid replikációjához és szelekciójához Escherichia coliban és az Agrobacterium tumefaciensben, valamint a T-DNS átviteléhez a növénybe, tartalmazzák továbbá a lehetőséget a transzformált növényi sejtek szelektálására kanamicinen. A rezisztenciát az nptll gén vagy a hptl gén adja át.
Ezt a plazmidot Agrobacterium tumefaciensbe transzformáljuk.
• ·
- 30 A DNS átvitelét a dohány növényekbe azután úgy hajtjuk végre, hogy ezeket az Agrobacteriumokat együtt transzformáljuk a dohány növényekből származó levelek kis darabjaival. Ezekhez a transzformációkhoz olyan dohány növényeket alkalmazunk, amelyek tartalmazzák a pTETl plazmid T-DNS-ét, és ennél fogva szintetizálják a tét represszort. A p-glukuronidáz szintézise a tetraciklin hozzáadásától függően csak akkor megy végbe, ha tét represszor van jelen. A szelekciót higromicinen végezzük. Ép és fejlődésre képes növényeket regenerálunk a transzformált sejtekből.
3. példa
A pAT2HyStu4-ből való p-glukuronidáz gén tetraciklin-függő kifejezésének kimutatása a tét represszort szintetizáló transzformált dohány növények leveleiben.
Abból a célból, hogy a tetraciklin induktor homogén abszorpcióját hozzuk létre az összes sejtekben, az antibiotikumot úgy vezetjük be a sejtközötti térbe, hogy az egyes leveleket tetraciklint is tartalmazó pufferral kezeljük. Erre a célra hat egymástól független transzformált növény egyedi leveleit egy főzőpohárba helyezzük olyan 50 mmól/literes nátrium-citrát pufferral együtt, amely 10 mg/1 tetraciklint is tartalmaz. A főzőpoharat szárítókamrába helyezzük és 3 percen át vákuum alatt tartjuk. A vákuumkezelés eredményeképpen a levegő kiszabadul a sejtközötti térből. A levegőt azután a puffer helyettesíti, miután a szárítókamrát szellőztetjük. A kezelés után a leveleket 16 órán át inkubáljuk olyan MS tápközegben, amely 10 mg/1 tetraciklint is tartalmaz. A kontroll leveleket ugyanúgy kezeljük, de tetraciklin hozzáadása nélkül. A levelek RNS-ét ezután kinyerjük, 1%-os agaróz gélre visszük fel és Northern folt elemzésnek vetjük alá; a gus mRNS átiratát egy, a í':-glukuronidáz
- 31 strukturgénjéből származó, radiaktívan jelzett fragmentummal végzett hibridizálással tesszük láthatóvá. A 4. ábrában bemutatott RNS elemzés azt demonstrálja, hogy olyan mRNS, amely a fj-glukuronidáz gén szekvenciáit tartalmazza, csak akkor keletkezik a pTETl és pAT2HyStu4 plazmidok T-DNS-ét tartalmazó növényekben, ha a levelek tetraciklinnel voltak előkezelve.
Abból a célból, hogy meghatározzuk az indukcióhoz szükséges tetraciklin legkisebb mennyiségét, egy olyan növény, amely tartalmazza a pTETl és pAT2HyStu4 plazmidok T-DNS-ét, leveleit kezeljük tetraciklin különböző koncentrációit is tartalmazó 50 mmól/literes cifrát pufferral.
A leveleket O(kontroll); 0,5; 1,0; illetve 10,0 mg/1 tetraciklinnel kezeljük 50 mmól/literes cifrát pufferban, és minden esetben ekvivalens tetraciklin koncentrációt tartalmazó MS tápközegbe helyezzük. A Northern folt elemzés azt mutatja, hogy még 0,1 mg/1 tetraciklin is elegendő a maximális indukcióhoz (lásd az 5. ábra 2. helyét).
Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a gus mRNS indukciójának idő-függését, egy, a pTETl és pAT2HyStu4 plazmidok T-DNS-ét tartalmazó növény leveleit 10 mg/1 tetraciklint is tartalmazó, 50 mmól/literes nátrium-cifrát pufferral kezeljük, és MS tápközegre helyezzük 0; 0,5; 1; 3; 6; illetve 22 órára. Ezután RNS kivonást és Northern folt elemzést végzünk. 10 mg tetraciklin hozzáadása a gus mRNS teljes indukcióját eredményezi már fél óra után is (lásd a 6. ábra 2. helyét).
Az 5. és 6. ábrák ugyanakkor bemutatják, hogy az RNS minták tartalmazzák a tét represszor génjének mRNS-ét. Az mRNS már látható az egyes ábrák 1. helyében is, mivel ennek kifejeződése konstitutívan megy végbe.
A 2. példában leírt klónozási stratégiával bármely kívánt gént lehet klónozni, pl. bármely kívánt génnel helyettesíthetjük a -glukuronidáz gént a 2. példában leírt munkamenetben. Az Agrobacterium tumefaciensbe való transzformálás és egy tét represszor termelésére képes növénybe való átvitel után a kívánt termék csak a tetraciklin jelenlétében termelődik.
4. példa
A pAT2HyTriple-X plazmid előállítása
Az ez után következő klónozási lépéseknek az a célja, hogy javítsák a fentebb leírt szabályozó rendszer hatékonyságát. Lin és Riggs azt javasolták jTcell 4_,. 107-111 (1975)3» hogy a repressziós hatékonyság növekszik az operátorok számával egy promotoron belül, ha az egyes kópiák maguk is hozzájárulnak a represszióhoz. Ennél fogva megalkottunk egy másik CaMV 35S promotor fragmentumot, amely három operátor helyet tartalmaz a TATA doboz szomszédságában, amelyek közül egy operátor 5’ irányban helyezkedik el a TATA doboztól, két operátor pedig 3’ irányban helyezkedik el a TATA doboztól.
Ezt úgy érjük el, hogy beiktatunk egy 83 bp-s szintetikus szekvenciát a korábban a 2. példában leírt plazmidba, amely a CaMV 35S(Res.) nevű CaMV 35S promotor származékot tartalmazza. Az Spel és Xhol helyek közti 56 bp-s fragmentumot (amelyet a
2. példában mutattunk be) egy szintetikus, 83 bp-s DNS fragmentummal cseréljük ki, amelynek szekvenciája az alábbi:
10 20 30 40 CTAGACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTGA TGAGATAGTCACTATCTCACATATATTCTGAGATAGTCACT i
- 33 5° 60 70 80 tagagtgaactctatcagtgatacÁgttaacggtÁcct ATCTCACTTGAGATAGTCACTATGTCAATTGCCATGGAGATC
A szekvencia az alábbi szerkezeti jellemzőkkel bír:
| TATA doboz: TATATAA | . a | 25. | és | 31. | helyek | között | |
| 1. | tét operátor: ACTCTATCAGTGATAGAGT | az | 5. | és | 23. | helyek | között |
| 2. | tét operátor: | a | 33. | és | 51. | helyek között | |
| 3. | tét operátor | az | 53 | . és | 71 | . helyek | között |
| Hpal: GTTAAC | a | 71. | és | 76. | helyek | között | |
| KpnI: GGTACC | a | 77. | és | 82. | helyek | között |
Az így létrejött, megváltozott CaMV 35S promotor származékot ezután CaMV 35S(Triple X)-nek nevezzük.
A CAMV 35S(Triple X) promotor klónozását EcoRI/Xbal fragmentumként a pGus vektorba, majd ennek a génnek a bevezetését a represszor fehérjét szintetizáló transzgenikus növényekbe a fentebb leírtak szerint hajtjuk végre.
5. példa
A pAT2HyTripleX-ből való β-glukuronidáz gén tetraciklinfiiggő kifejeződésének kimutatása a tét represszort szintetizáló transzformált dohány növények leveleiben.
A tét represszor szintézis információját kódoló DNS szekvenciákat és a p-glukuronidáz gén kifejeződését szabályozó CaMV 35S(Triple X) promotort tartalmazó növényeket elemezzük tetraciklin-függő génkifejeződésre. A tetraciklint a növény hatékonyan felveszi a gyökereken keresztül, ez pedig a gén homogén kifejeződéséhez vezet a CaMV 35S promotort tartalmazó
3. operátor szabályozása alatt. Az enzimaktivitás szintjére
alapozva, az aktivitás az induktor távollétében 500-szor kisebb, mint az induktor jelenlétében. A β-glukuronidáz riporter gén génterméke csak azokban a növényekben fejeződik ki, amelyeket előzőleg tetraciklinnel kezeltünk. Helyi indukciót is érhetünk el, a tetraciklint közvetlenül alkalmazva a leveleken. Ezt a
7. ábra mutatja be.
• · tartalmaz valamely
Claims (30)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. ) Plazmid azzal jellemezve, hogy eszközöketDNS szekvencia növényekben való kifejeződésének szabályozására idő és elhelyezkedés szerint.
- 2. ) Az 1. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS szekvencia valamely heterológ terméket kódol.
- 3. ) Az 1. vagy 2. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy olyan szabályozó eszközöket tartalmaz, amelyek segítségével a nevezett DNS szekvencia kifejeződése csak valamely induktor jelenlétében megy végbe.
- 4. ) Az 1.-3. igénypontok bármelyike szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy a nevezett szabályozó eszközök valamely növényi szabályozó szekvencia és egy vagy több operátor működőképes kombinációjából állnak.
- 5. ) A 4. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy a nevezett szabályozó eszközök tartalmaznak egy növényi promotort, amelybe előzőleg egy vagy több operátor szekvencia volt beiktatva, továbbá tartalmazzák valamely represszor egy vagy több génjét; a növényi promotor, az operátor(ok) és a kifejezendő DNS szekvencia úgy vannak elrendezve, hogy a DNS szekvencia csak a represszor induktorának jelenlétében fejeződik ki.
- 6. ) A 4. vagy 5. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy az operátor szekvencia vagy szekvenciák prokarióta vagy eukarióta eredetű(ek).
- 7. ) A 3.-6. igénypontok bármelyike szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy az operátor szekvencia vagy szekvenciák a tetraciklin rezisztencia operon szabályozó elemeit tartalmazzák.
- 8. ) A 7. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy az operátor a TnlO transzpozon tetraciklin rezisztencia operon szabályozó elemeit tartalmazza.
- 9. ) A 3.-8. igénypontok bármelyike szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy két operátor szekvencia helyezkedik el a növényi promotor TATA elemétől 3’ irányban.
- 10. ) Az 1.-9. igénypontok bármelyike szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy tartalmaz még egyet vagy többet az alábbi elemekből: polilinker szekvencia, poliadenilező szignál, és valamely szelektálható markért kódoló DNS szekvencia.
- 11. ) A 9. vagy 10. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy fokozó elemekkel bíró karfiol mozaik vírus 35S promotort, TATA dobozt, két vagy három tét operátort és valamely heterológ terméket kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.
- 12. ) A 11. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy polilinker szekvenciát, egy 334 bp-s, fokozó elemekkel bíró karfiol mozaik vírus 35S promotor fragmentumot, egy TATA dobozzal és két tét operátorral bíró 99 bp-s oligo-DNS fragmentumot, valamely heterológ terméket kódoló DNS szekvenciát, a nopalin szintetáz gén egy 203 bp-s poliadenilező szignálját, és egy 1650 bp-s higromicin foszfotranszferáz gént.
- 13. ) A 11. vagy 12. igénypontok szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy a TATA doboz és a két tét operátor egy kapcsolt CCC fragmentummal együtt egy 99 bp-s oligo-DNS fragmentumban vannak jelen, amelynek szekvenciája az alábbi:1 10 20 30 40 50 60 70I I I I I I I ICCCACTAGTCTTCGCAAGACCCTTTACGTATATAAGGAGAT CT CTATCACTGATAGGGAGTGTTAACATAA GGGTGATCAGAAGCGTTCTGGGAAATGCATATATTCCTCTAGAGATAGTGACTATCCCTCACAATTGTATT • · <*- 37 • * • ·«80 90 100I I ICTCTATCACTGATAGAGTGATCCTTTCTAGAGAGATAGTGACTATCTCACTAGGAAAGATCT
- 14.) A 11. igénypont szerinti plazmid azzal jellemezve, hogy a TATA doboz és a három tét operátor egy 83 bp-s DNS fragmentummal együtt van jelen, amelynek szekvenciája az alábbi:1 10 20 .30 40I l II lCTAGACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTGATGAGATAGTCACTATCTCACATATATTCTGAGATAGTCACT50 60 70 80III* TAGAGTGAACTCTATCAGTGATACAGTTAACGGTACCTATCTCACTTGAGATAGTCACTATGTCAATTGCCATGGAGATC
- 15. ) Plazmid azzal jellemezve, hogy ez a pAT2HyStu4 plazmid (DSM 6280)
- 16. ) Plazmid azzal jellemezve, hogy ez a pAT2HyTriple-X plazmid (DSM e.'UO.
- 17. ) Plazmid azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 526 bp-s karfiol mozaik vírus 35S promotor fragmentumot, egy 695 bp-s tét represszor fragmentumot, és tartalmazza az oktopin szintetáz gén egy 180 bp-s poliadenilezö szignálját.
- 18. ) Plazmid azzal jellemezve, hogy ez a pTETl plazmid (DSM 6281).
- 19. ) Növény azzal jellemezve, hogy eszközöket tartalmaz valamely DNS szekvencia idő és elhelyezkedés szerinti szabályozására.
- 20. ) A 19. igénypont szerinti növény azzal jellemezve, hogy valamely heterológ terméket kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.
- 21. ) A 19. vagy 20. igénypont szerinti növény azzal jellemezve, hogy a nevezett szabályozó eszközök a 3.-10. igénypontok bármelyike szerint meghatározott eszközök, és az alkalmazott szabályozó elemek a 11.-13. igénypontok bármelyike szerint meghatározott szabályozó elemek.
- 22. ) A 19.-21. igénypontok bármelyike szerinti növény azzal jellemezve, hogy valamely, az 1.-15. igénypontok bármelyike szerinti plazmidot tartalmaz.
- 23. ) A 19.-22. igénypontok bármelyike szerinti növény azzal jellemezve, hogy tartalmaz olyan DNS szekvenciát is, amely a jelen levő operátor represszorját kódolja.
- 24. ) A 19.-23. igénypontok bármelyike szerinti növény azzal jellemezve, hogy az operátor valamely tét operátor és a represszor valamely tét represszor fehérje.
- 25. ) A 24. igénypont szerinti növény azzal jellemezve, hogy valamely 17. vagy 18. igénypont szerinti plazmidot tartalmaz.
- 26. ) Növény azzal jellemezve, hogy tartalmazza a pTET(DSM 6281) plazmidot, pAT2HyStu4 (DSM 6280) plazmidot, vagy pAT2HyTriple-X (DSM <·.><.>) plazmidot.
- 27. ) A 19.-26. igénypontok bármelyike szerinti növény azzal jellemezve, hogy ez dohány növény.
- 28. ) Az 1.-14. igénypontok bármelyike szerinti plazmid alkalmazása növények előállítására azzal jellemezve, hogy a plazmid segítségével olyan növényt állítunk elő, amelyben egy adott DNS szekvencia kifejeződése idő és elhelyezkedés szerint szabályoz- 39 - ·«·· * • · · « L »·· ·· · • * ··· **« ·♦ ható .
- 29. ) Az 1.-14. igénypontok bármelyike szerinti plazmid és egy, a megfelelő represszort kódoló plazmid alkalmazása növények előállítására azzal jellemezve, hogy a plazmidok segítségével olyan növényt állítunk elő, amelyben egy adott DNS szekvencia kifejeződése idő és elhelyezkedés szerint szabályozható.
- 30. ) a pTETl, pAT2HyStu4 és pAT2HyTriple-X plazmidok alkalmazása növények előállítására azzal jellemezve, hogy a nevezett plazmidok segítségével olyan növényt állítunk elő, amelyben egy adott DNS szekvencia kifejeződése idő és elhelyezkedés szerint szabályozható.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4100594A DE4100594A1 (de) | 1991-01-08 | 1991-01-08 | Neue plasmide zur zeitlichen und oertlichen kontrollierten expression eines heterologen produktes in pflanzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9200055D0 HU9200055D0 (en) | 1992-03-30 |
| HUT65428A true HUT65428A (en) | 1994-06-28 |
Family
ID=6422810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9200055A HUT65428A (en) | 1991-01-08 | 1992-01-07 | Plasmids for controlling expression in plants |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0494724A3 (hu) |
| JP (1) | JPH06339384A (hu) |
| KR (1) | KR920014931A (hu) |
| AU (1) | AU1010592A (hu) |
| CA (1) | CA2058900A1 (hu) |
| DE (1) | DE4100594A1 (hu) |
| HU (1) | HUT65428A (hu) |
| IE (1) | IE920047A1 (hu) |
| IL (1) | IL100539A0 (hu) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9216151D0 (en) * | 1992-07-29 | 1992-09-09 | Ici Plc | Containment of plant germplasm |
| US5789156A (en) * | 1993-06-14 | 1998-08-04 | Basf Ag | Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors |
| US5859310A (en) | 1993-06-14 | 1999-01-12 | Basf Aktiengesellschaft | Mice transgenic for a tetracycline-controlled transcriptional activator |
| US5814618A (en) * | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
| US5888981A (en) * | 1993-06-14 | 1999-03-30 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
| JPH09500526A (ja) * | 1993-06-14 | 1997-01-21 | ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト | テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御 |
| US5589362A (en) * | 1993-06-14 | 1996-12-31 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities |
| US5912411A (en) * | 1993-06-14 | 1999-06-15 | University Of Heidelberg | Mice transgenic for a tetracycline-inducible transcriptional activator |
| US6004941A (en) * | 1993-06-14 | 1999-12-21 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
| US5866755A (en) * | 1993-06-14 | 1999-02-02 | Basf Aktiengellschaft | Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor |
| US5654168A (en) * | 1994-07-01 | 1997-08-05 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units |
| CA2168430A1 (en) * | 1993-08-02 | 1995-02-09 | Carole Lyn Cramer | Hmg2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures |
| EG23907A (en) * | 1994-08-01 | 2007-12-30 | Delta & Pine Land Co | Control of plant gene expression |
| US5851796A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-22 | Yale University | Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes |
| EP1083230A1 (en) * | 1999-09-10 | 2001-03-14 | Academisch Medisch Centrum Amsterdam | Viral replicons and viruses dependent on inducing agents |
| DE19956272B4 (de) * | 1999-11-23 | 2004-09-16 | Mpb Cologne Gmbh Molecular Plant & Protein Biotechnology | Verfahren zur gesteuerten Nach-Ernte-Produktion von Proteinen in Wirtsorganismen |
| RU2002106730A (ru) * | 2000-06-15 | 2004-03-10 | Канека Корпорейшн (Jp) | Способ индуцирования экспрессии гена в растениях и растение, обработанное по этому способу |
| WO2008064056A2 (en) * | 2006-11-22 | 2008-05-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tetracycline repressor and uses thereof |
| CA2740147A1 (en) | 2008-10-28 | 2010-06-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Sulfonylurea-responsive repressor proteins |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8901674D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Regulation of plant gene expression |
-
1991
- 1991-01-08 DE DE4100594A patent/DE4100594A1/de not_active Withdrawn
- 1991-12-27 IL IL100539A patent/IL100539A0/xx unknown
-
1992
- 1992-01-06 EP EP19920250003 patent/EP0494724A3/en not_active Withdrawn
- 1992-01-07 JP JP4018239A patent/JPH06339384A/ja active Pending
- 1992-01-07 AU AU10105/92A patent/AU1010592A/en not_active Abandoned
- 1992-01-07 CA CA002058900A patent/CA2058900A1/en not_active Abandoned
- 1992-01-07 KR KR1019920000079A patent/KR920014931A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-01-07 HU HU9200055A patent/HUT65428A/hu unknown
- 1992-01-08 IE IE004792A patent/IE920047A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06339384A (ja) | 1994-12-13 |
| HU9200055D0 (en) | 1992-03-30 |
| IE920047A1 (en) | 1992-07-15 |
| EP0494724A2 (en) | 1992-07-15 |
| EP0494724A3 (en) | 1993-06-23 |
| DE4100594A1 (de) | 1992-07-09 |
| AU1010592A (en) | 1992-07-16 |
| CA2058900A1 (en) | 1992-07-09 |
| KR920014931A (ko) | 1992-08-25 |
| IL100539A0 (en) | 1992-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6555673B1 (en) | Synthetic promoters | |
| US6605754B1 (en) | DNA constructs and plants incorporating them | |
| HUT65428A (en) | Plasmids for controlling expression in plants | |
| Kobayashi et al. | Identification of novel cis‐acting elements, IDE1 and IDE2, of the barley IDS2 gene promoter conferring iron‐deficiency‐inducible, root‐specific expression in heterogeneous tobacco plants | |
| AU762993C (en) | Constitutive maize promoters | |
| DE69533037T2 (de) | Pflanzentraskriptionsregulator von circovirus | |
| US5633363A (en) | Root preferential promoter | |
| JPH07500970A (ja) | 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法 | |
| JPH09503652A (ja) | Ｈｍｇ２プロモーター発現系ならびに植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産 | |
| CA2078229A1 (en) | Plant promoter | |
| EP0602113B1 (en) | Callus-specific promoters | |
| CA2078327A1 (en) | Plant promoter | |
| JPH03112488A (ja) | 調節ｄｎａ配列 | |
| US5824872A (en) | A constitutive promoter from tobacco | |
| KR102000454B1 (ko) | 벼 흰잎마름병균에 의한 프로모터 인식부위 및 이의 용도 | |
| WO2012030827A1 (en) | Regulatory element for heterologous protein production in the fruiting body of filamentous fungi | |
| US7557264B2 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
| CA2331774A1 (en) | Inducible promoters | |
| Handayani et al. | Characterization of the rolB promoter on mikimopine-type pRi1724 T-DNA | |
| JPH0589A (ja) | 遺伝子発現の誘導方法 | |
| CA2168617C (en) | Constitutive promoter from tobacco | |
| JPH03277291A (ja) | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター | |
| EP1462522A2 (en) | Maize Met-1 promoter | |
| WO2001036649A2 (en) | Isolation and characterization of the genomic dna clones of ribosomal protein gene l25 in tobacco | |
| JP2004049143A (ja) | 感染誘導性ｐｒ４遺伝子プロモーター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |