MX2011003766A - Proteinas represoras responsivas a sulfonilurea. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos relacionados con el uso de represores responsivos a sulfonilurea. Las composiciones incluyen polipéptidos que específicamente enlazan a un operador, en donde el enlace específico es regulado por un compuesto de sulfonilurea. Las composiciones también incluyen polinucleótidos que codifican los polipéptidos así como constructos, vectores, células procarióticas y eucarióticas, y organismos eucarióticos incluyendo plantas y semillas que comprenden el polinucleótido y/o producidos por los métodos. También se proporcionan métodos para proporcionar un represor responsivo a sulfonilurea a una célula u organismo, y para regular la expresión de un polinucleótido de interés en una célula un organismo, incluyendo una planta o célula de planta.

Description

PROTEÍNAS REPRESORAS RESPONSIVAS A SULFONILUREA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona al campo de biología molecular, más particularmente a la . regulación de la expresión génica.

ANTECEDENTES El sistema de operón de tetraciclina, que comprende elementos represores y operadores, se aisló originalmente de bacterias. El sistema de operón es estrechamente controlado por la presencia de tetraciclina, y autorregula el nivel de expresión de los genes tetA y tetR. El producto de tetA remueve la tetraciclina de la célula. El producto de tetR es la proteína represora que enlaza a los elementos operadores con una Kd de aproximadamente 10 pM en la ausencia de tetraciclina, para de esta manera bloquear la expresión de tetA y tetR.

Este sistema se ha modificado para controlar la expresión de otros polinucleótidos de interés, y/o para el uso en otros organismos, principalmente para el uso en sistemas animales. Los sistemas basados en operón Tet han tenido uso limitado en plantas, por lo menos parcialmente debido a problemas con los inductores que son típicamente compuestos antibióticos, y sensibles a la luz.

Hay una necesidad para regular la expresión de secuencias de interés en organismos, se proporcionan composiciones y métodos para regular estrechamente la expresión en respuesta a compuestos de sulfonilurea.

BREVE DESCRIPCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos relacionados con el uso de represores responsivos a sulfonilurea. Las composiciones incluyen polipéptidos que específicamente enlazan a un operador, en donde el enlace específico es regulado por un compuesto de sulfonilurea. Las composiciones también incluyen -polinucleótidos que codifican los polipéptidos así como constructos, vectores, células procarióticas y eucarióticas y organismos eucarióticos que incluyen plantas y semillas que comprenden el polinucleótido y/o producidos por los métodos. También se proporcionan métodos para proporcionar un represor responsivo a sulfonilurea a una célula u organismo y para regular la expresión de un polinucleótido de interés en una célula u organismo, incluyendo una planta o célula de planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Acoplamiento de tetraciclina-Mg++ y el compuesto de sulfonilurea Harmony® (tifensulfurón-metilo; Ts) en la cavidad de enlace de TetR de clase D basado en la estructura de cristal 1DU7 del banco de Datos de Proteínas (PDB) .

Figura 2. Mapa de vector de un vector de expresión tetR basado en E. colí ejemplar, pVER7314. La cadena principal del replicón está basada en aquella de pBR322. El dominio de enlace de ligando TetR (LBD) se flanquea codificado por los sitios SacI y AscI . KMspl72 y KMspl73 representan sitios de enlace para los cebadores utilizados para la secuenciación de DNA de genes tetR insertados. rrnB TI T2 es un fuerte terminador transcripcional para inhibir la corrida alrededor de la transcripción y la expresión de tetR no regulada.

Figura 3. Respuesta de aciertos de librería 1 a 20 µg/ml de tifensulfurón-metilo (Ts) . Las células KM3 de E. coli que albergan los aciertos Ll-1 de tetR putativos a través de Ll-20 o wt tetR se colocaron en placa por replicado en el medio de ensayo M9 +/- 20 g/ml Ts, luego se incubaron a 30°C hasta que fue evidente la discriminación de la colonia azul/blanca. En este tiempo las colonias se formaron en imagen y la actividad de ß-galactosidasa relativa se determinó basada en el grado de color de la colonia azul.

Figura 4. Actividades de ß-galactosidasa relativas de 45 aciertos de la librería L4 putativos contra 0, 0.2 y 1.0 ppm de etametsulfurón (Es). La actividad inducida se midió utilizando 5 µ? de mezcla de células completas perforada, y la actividad antecedente se midió utilizando 25 µ? de mezcla de células perforada de modo que la actividad detectable podría ser medida en el mismo cuadro de tiempo para todos los tratamientos. Los valores de actividad antecedentes se multiplicaron por 10 con el fin de llevarlos en el intervalo de exhibición de la gráfica. El lado derecho de la gráfica contiene los controles, TetR de tipo silvestre y el acierto Ll-9 de primera ronda.

Figura 5. Inducción de ß-galactosidasa en los aciertos L7 con etametsulfurón . Los aciertos superiores de la librería L7 se rearreglaron y se probaron en el formato de cultivo de 9.6 cavidades para la inducción relativa por 0.02 pg/ml y 0.2 yg/ml de inductor (Es) y para la actividad antecedente en la ausencia del inductor. La actividad inducida fue ensayada utilizando 5 µ? de mezcla de células perforada, mientras que 25 µ? de células se utilizaron para detectar la actividad antecedente. Esto permitió a todas las actividades detectables ser medidas en el mismo cuadro de tiempo para todos los tratamientos. Los valores de actividad antecedentes se multiplicaron por diez para llevarlos en el intervalo de la gráfica. La parte posterior de la gráfica muestra los controles: aciertos L4-89 de la 2nd ronda y L4-120, y wt TetR (B) con etametsulfurón; y wt TetR con 0.4 µ? ate como inductor cognado para la comparación (barra rayada diagonalmente) . Los ID' s de cavidad indicados con el texto en diagonal se refieren a aquel del rearreglo de ensayo mientras que los ID's del clon original son indicados enseguida en el texto horizontal.

Figura 6. Respuesta de dosis de etametsulfurón de dos variantes de EsR determinados por la expresión transiente en hojas de Nicotiana benthamiana . Las barras negras representan wt TetR, las barras grises representan el acierto All de EsR, y las barras blancas representan el acierto de D01 de EsR. La barra rayada representa un control no represor que indica el nivel máximo de la expresión reportadora en el ensayo .

Figura 7. Enlace de DNA a tetOp en la ausencia o presencia de ligando. Cinco pmol de Teto o DNA de control se mezcló con las cantidades indicadas de la proteina represora y el inductor en la solución reguladora compleja que contiene Tris-HCl 20mM (pH8.0) y EDTA lOmM.

Figura 8. Estructuras de compuestos de sulfonilurea registrados ejemplares.

Figura 9. Resumen de la diversidad de fuente, diseño en librería y diversidad de aciertos e inclinación de población para varias generaciones de librerías de entremezclado represoras de sulfonilurea. Un guión ("-") indica nada de diversidad de aminoácido introducida en esa posición en esa librería. Un X indica que los oligos de librerías se diseñaron para introducir diversidad de aminoácido completa (cualquiera de 20 aminoácidos) en esa posición en esa librería. Los residuos en negrita indican la inclinación durante la selección con el tamaño de fuente más grande que indica un grado más grande de inclinación en la población seleccionada. Los residuos entre paréntesis indican mutaciones seleccionadas. La acumulación de diversidad filogenética se deriva de una familia amplia de 34 secuencias represoras de tetraciclina .

Figura 10. Depresión de sulfonilurea del reportador fluorescente en el callo de maíz (A) o plantas (B) .

Figura 11. Inducción de ß-galactosidasa en los aciertos L13 ejemplares con etametsulfurón .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Las herramientas de expresión químicamente reguladas se han probado valiosas para estudiar la función y regulación génica en muchos sistemas biológicos. Estos sistemas permiten probar el efecto de la expresión de cualquier gen de interés en un sistema de cultivo y organismo completo cuando el transgén no puede ser específicamente regulado, o continuamente expresado debido a las consecuencias negativas. Estos sistemas esencialmente proporcionan la oportunidad para hacer la prueba de expresión génica "pulsada" o "pulsada-proseguida". Un sistema de expresión mediado por el cambio químico permite la prueba de respuestas genómicas, proteómicas y/o metabolómicas inmediatamente después de la activación del gen objetivo. Estos tipos de prueba no se pueden hacer con sistemas de expresión constitutivos, de desarrollo o específicos de tejido. Las tecnologías de cambio químico también pueden proporcionar un medio para la terapia génica.

Los sistemas de cambio químico se pueden aplicar comercialmente, tal como en la biotecnología agrícola. Para propósitos agrícolas es deseable ser capaz de controlar la expresión y/o flujo genético de transgenes en el ambiente, tales como genes de resistencia herbicida, especialmente en casos donde existen malas hierbas con relación al cultivo objetivo. Además, teniendo una familia de mecanismos de cambio químico viables permitirían tratar el manejo de inventario de un solo cultivo transgénico, por ejemplo, una línea de producción podría ser utilizada para suministrar atributos seleccionados en demanda al cliente por la vía de la acción química específica. Adicionalmente, la producción de semilla híbrida podría ser perfilada al usar el control químico del mantenimiento del híbrido.

El sistema de cambio genético basado en el represor Tet (TetR) ampliamente utilizado en sistemas animales ha tenido uso limitado en sistemas genéticos de plantas, debido en parte a problemas con los ligando activadores. TetR se ha rediseñado para reconocer la química de sulfonilurea comercialmente utilizada en lugar de compuestos de tetraciclina, mientras que retiene la habilidad para enlazar específicamente la secuencias operadoras de tetraciclina. Esto se realizó al modificar el dominio de enlace de ligando de represor Tet utilizando la modelación de proteína racional y el entremezclado de DNA para reconocer los compuestos de sulfonilurea comercialmente utilizados. El entremezclado de TetR inicial y la clasificación utilizando un ensayo de ß-galactosidasa in vivo sensible condujo al reconocimiento específico del herbicida Harmony® ( tifensulfurón-metilo) en 20 ppm en el medio de crecimiento, y la pérdida de reconocimiento de tetraciclina . En la prueba con otros compuestos de sulfonilurea, muchos de los aciertos reactivos a Harmony® también respondieron a otros compuestos SU. En algunos casos, los aciertos tuvieron aún mejor reactividad a los herbicidas relacionados clorsulfurón y etametsulfurón (2 ppm) . Rondas adicionales de entremezclado y clasificación de los derivados de TetR condujo a variantes de TetR que reaccionan robustamente a 0.2 ppm de clorsulfurón y 0.02 ppm de etametsulfurón como es medido utilizando ensayos de inducción in vivo en E. coli. Las variantes de SuR responsivas a etametsulfurón (EsRs) de desempeño superior muestran capacidad de inducción casi igual a aquella de la inducción de TetR de clase B de tipo silvestre mediante anhidrotetraciclina (ate) utilizando concentraciones de inductor similares. Estas moléculas SuR no tienen reactividad a las tetraciclinas, y TetR(B) de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) no tiene reactividad a las sulfonilureas .

Se proporcionan composiciones y métodos relacionados con el uso de represores responsivos a sulfonilurea . Los represores responsivos a sulfonilurea (SuRs) incluyen cualquier polipéptido represor cuyo enlace a una secuencia operadora es controlado por un ligando que comprende un compuesto de sulfonilurea. En algunos ejemplos, el represor enlaza específicamente el operador en la ausencia de un ligando de sulfonilurea. En algunos ejemplos, el represor enlaza específicamente al operador en la presencia de un ligando de sulfonilurea. Los represores que enlazan un operador en la presencia de ligando son algunas veces llamados un represor inverso. En algunos ejemplos las composiciones incluyen polipéptidos SuR que específicamente enlazan a un operador de tetraciclina, en conde el enlace específico es regulado por un compuesto de sulfonilurea. En algunos ejemplo las composiciones incluyen un polipéptido represor de sulfonilurea aislado (SuR) que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido a un dominio de enlace de ligando de proteína represora de tetraciclina de tipo silvestre en donde el polinucleótido SuR, o un multímero del mismo, específicamente enlaza un polinucleótido que comprende una secuencia operadora, en donde el enlace de represor-operador es regulado con la ausencia o presencia de un compuesto de sulfonilurea. En algunos ejemplos las composiciones incluyeron represores de sulfonilurea aislados que comprende un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido a un dominio de enlace ligando de proteina represora de tetraciclina de tipo silvestre fusionado a un dominio de enlace de DNA de operador heterólogo específicamente enlaza un polinucleótido que comprende la secuencia operadora o derivado de la misma, en donde el enlace de represor-operador se regula por la ausencia o presencia de un compuesto de sulfonilurea . Cualquier dominio de enlace de DNA de operador se puede utilizar, incluyendo pero no limitado a un dominio de enlace de DNA de operador de los represores incluidos tet, lac, trp, phd, arg, LexA, represor phiChl, represores lambda Cl y Cro, represor de fago X, represores MetJ, phirlt rro, phi434 Cl y Cro, RafR, gal, ebg, uxuR, exuR, ROS, SinR, PurR, FruR, P22 C2, TetC, AcrR, Betl, Bm3Rl, EnvR, QacR, MtrR, TcmR, Ttk, YbiH, YhgD y mu Ner o dominio de enlace de DNA en familias Interpro incluyendo pero no limitados a IPR001647, IPR010982 y IPR011991.

En algunos ejemplos las composiciones incluyen un polipéptido represor de sulfonilurea aislado (SuR) que comprende por lo menos un sustitución de aminoácido a una proteína represora de tetraciclina de tipo silvestre en donde el polipéptido SuR, o un multímero del mismo, específicamente enlaza a un polinucleótido que comprende una secuencia operadora de tetraciclina, en donde el enlace de represor-operador se regula por la ausencia o presencia de un compuesto de sulfonilurea.

Los represores de tipo silvestre incluyen represores de tetraciclina clase A, B, C, D, E, G, H, J- y Z . un ejemplo de la clase TetR(A) se encuentra en el transposón Tn 1721 y depositado bajo el acceso de GenBank X61307, interreferenciado bajo gi48198, con el acceso de proteina codificado CAA43639, interreferenciado bajo gi48195 y acceso de UniProt Q56321. Un ejemplo de la clase TetR(B) se encuentra en el transposón TnlO y depositado bajo el acceso de GenBank X00694, interreferenciado bajo gi43052, con el acceso de proteina codificado CAA25291, interreferenciado bajo gi43052 y el acceso de UniProt P04483. Un ejemplo de la clase TetR(C) se encuentra en el plásmido pSClOl y depositado bajo el Acceso de GenBank M36272, interreferenciado bajo gil50945, con el acceso de proteina codificado AAA25677, interreferenciado bajo gil50946. Un ejemplo de la clase TetR(D) se encuentra en Salmonella ordonez y depositado bajo el Acceso de GenBank X65876, interreferenciado bajo gi49073, con el acceso de proteina codificado CAA46707, interreferenciado bajo gi49075 y accesos de UniProt P0ACT5 y P09164. Un ejemplo de la clase TetR(E) se aisló del transposón TnlO de E. coli y se depositó bajo el Acceso de GenBank M34933, interreferenciado bajo gil55019, con el acceso de proteina codificado AAA98409, interreferenciado bajo gil55020. Un ejemplo de la clase TetR(G) se aisló de Vibrio anguillarium y se depositó bajo el Acceso de GenBank de S52438, interreferenciado bajo gi262928, con el acceso de proteina codificado AAB24797, interreferenciado bajo gi262929. Un ejemplo de la clase TetR(H) se encuentra en el plásmido pMVlll aislado de Pasteurella multocida depositado bajo el Acceso de GenBank U00792, interreferenciado bajo gi392871, con el acceso de proteina codificado AAC43249, interreferenciado bajo gi392872. Un ejemplo de la clase TetR(J) se aisló de Proteus mirabilis y se depositó bajo el Acceso de GenBank AF038993, interreferenciado bajo gi4104704, con el acceso de proteina codificado AAD12754, interreferenciado bajo gi4104706. Un ejemplo de la clase TetR(Z) se encontró en el plásmido pAGI aislado de Corynej acteriuíii glutamicum y depositado bajo el Acceso de GenBank AF121000, interreferenciado. bajo gi4583389, con el acceso de proteina codificado AAD25064, interreferenciado bajo gi4583390. En algunos ejemplos el represor de tetraciclina de tipo silvestre es una proteina represora de tetraciclina de clase B. En algunos ejemplos, el represor de tetraciclina de tipo silvestre es una proteina represora de tetraciclina de clase D.

En alguno ejemplos los polipéptidos represores de sulfonilurea (SuR) comprenden una sustitución de aminoácido en el dominio de enlace de ligando de una proteina represora de tetraciclina de tipo silvestre. En las proteínas TetR de tipo silvestre de clase B y D, los residuos de aminoácido 6-52 representan el dominio de enlace de DNA. El resto de la proteina está involucrado en el enlace de ligando y la modificación alostérica subsecuente. Para TetR clase B los residuos 53-207 representan el dominio de enlace de ligando, mientras que los residuos 53-218 comprenden el dominio de enlace de ligando para el TetR de clase de D. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una sustitución de aminoácido en el dominio del enlace de ligando de una proteina TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos, los polipéptidos SuR comprenden una sustitución de aminoácido en el dominio de enlace de ligando de una proteina TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados comprenden un aminoácido o cualquier combinación de aminoácidos, correspondientes a las posiciones de aminoácido equivalentes seleccionados de la diversidad de aminoácido mostrado en ,1a Figura 9, en donde la posición de residuo de aminoácido mostrado en la Figura 9 ¦ corresponde a la numeración de aminoácido de un TetR (B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados comprenden un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácidos mostrados en la Figura 9, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre. En alguno ejemplos los polipéptidos SuR aislados comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido mostrados en la Figura 9, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre. En alguno ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado comprende un dominio de enlace de ligando que comprende una sustitución de aminoácido en una posición de residuo seleccionado del grupo que consiste de la posición 55, 60, 64, 67, 82, 86, 100, 104, 105, 108, 113, 116, 134, 135, 138, 139, 147, 151, 170, 173, 174, 177 y cualquier combinación de los mismos, en donde la posición de residuo de aminoácido y la sustitución corresponde a una posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR (B ( de tipo silvestre. En algunos ejemplos el polipéptido de SuR aislado además comprende una sustitución de aminoácido en una posición de residuo seleccionado del grupo que consiste de 109, 112, 117, 131, 137, 140, 164 y cualquier combinación de las mismas. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 1. en algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados comprende un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: (a) M o L en la posición de residuo de aminoácido 55; (b) A, L o M en la posición de residuo de aminoácido 60; (c) A, N, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácido 64; (d) M, I, L, V, F o Y en la posición de residuo de aminoácido 67; (e) N, S o T en la posición de residuo de aminoácido 82; (f) F, M, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 86; (g) C, V, L, , F, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 100; (h) R, A o G en la posición de residuo de aminoácido 104 (i) A, I, V, F o W en la posición de residuo de aminoácido 105; (j) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (k) A, M, H, K, T, P o V en la posición de residuo de aminoácido 113; (I) I, L, M, V, R, S, N, P o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) I, L, V, M, R, S o en la posición de residuo de aminoácido 134; (n) R, S, N, Q, K o A en la posición de residuo de aminoácido 135; (o) A, C, G, H, I, V, R o T en la posición de residuo de aminoácido 138; (p) A, G, I, V, M, W, N, R o T en la posición de residuo de aminoácido 139; (q) I, L, V, F, W, T, S o R en la posición de residuo de aminoácido 147; '(r) M, L, W, Y, K, R o S en la posición de residuo de aminoácido 151; (s) I, L, V o A en la posición de residuo de aminoácido 170; (t) A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (u) L, V, W, Y, H, R, K o S en la posición de residuo de aminoácido 174; y, (v) A, G, I, L, Y, K, Q o S en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos, los polipéptidos SuR aislados comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados de los residuos de aminoácido listados en (a) - (v) anterior, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados seleccionados para la actividad aumentada y clorosulfurón comprenden un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, -73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados del grupo que consiste de : (a) en la posición de residuo de aminoácido 60; (b) A o Q en la posición de residuo de aminoácido 64; (c) M, F, Y, I, V o L en la posición de residuo de aminoácido 67; (d) N o T en la posición de residuo de aminoácido 82; (e) M en la posición de residuo de aminoácido 86; (f) C o en la posición de residuo de aminoácido 100; (g) W en la posición de residuo' de aminoácido 105; (h) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (i) M, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácidol09; (j) G, A, S o T en la posición de residuo de aminoácido 112; (k) A en la posición de residuo de aminoácido 1 13; (I) M o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) M o V en la posición de residuo de aminoácido 134; (n) G o R en la posición de residuo de aminoácido 138; (o) N o V en la posición de residuo de aminoácido 139; (p) F en la" posición de residuo de aminoácido 147; (q) S o L en la posición de residuo de aminoácido 151; (r) A en la posición de residuo de aminoácido 164; (s) A, L o V en la posición de residuo de aminoácido 170; (t) A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (u) L o W en la posición de residuo de aminoácido 174; y; (v) K en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos, los polipéptidos SuR aislados comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados de los residuos de aminoácido listados en (a) - (v) anterior, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados seleccionados para la actividad aumentada en etametsulfurón comprende un dominio en enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados del grupo que consiste de : (a) M o L en la posición de residuo de aminoácido 55; , (b) A en la posición de residuo de aminoácido 64; c) M, Y, F, I, L o V en la posición de residuo de aminoácido 67; (d) M en la posición de residuo de aminoácido 86; (e) C en la posición de residuo de aminoácido 100; (f) G en la posición de residuo de aminoácido 104; (g) F en la posición de residuo de aminoácido 105; (h) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (i) Q, M, L o H en la posición de residuo de aminoácido 109; (j) S, T, G o A en la posición de residuo de aminoácido 112; (k) A en la posición de residuo de aminoácido 113; (I) S en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) M o L en la posición de residuo de aminoácido 117;. (n) M o L en la posición de residuo de aminoácido 131; (o) en la posición de residuo de aminoácido 134; (P) Q en la posición de residuo de aminoácido 135; (q) A o V en la posición de residuo de aminoácido 137; (r) C o G en la posición de residuo de aminoácido 138; (s) I en la posición de residuo de aminoácido 139; (t) F o Y en la posición de residuo de aminoácido 140; (u) L en la posición de residuo de aminoácido 147; (v) L en la posición de residuo de aminoácido 151; (w) A en la posición de residuo de aminoácido 164; (X) V, A o L en la posición de residuo de aminoácido 170; (y) G, A o V en la posición de residuo de aminoácidol73 (z) L en la posición de residuo de aminoácido 174; y, (aa) N o K en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos, los polipéptidos SuR aislados comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% los residuos de aminoácido que son seleccionados de los residuos de aminoácido listados en (a) - (aa) anterior, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene por lo menos aproximadamente 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 801, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia al dominio de enlace de ligando de un TetR(B) de tipo silvestre ejemplificado por los residuos de aminoácido 53-207 de la SEQ ID NO: 1, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa del dominio del enlace de ligando utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global utiliza el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSUM62.

En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene por lo menos aproximadamente 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, .91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad secuencia a un TetR(B) de tipo silvestre ejemplificado por la SEQ ID NO: 1, en donde la identidad se secuencia se determina sobre la longitud completa del polipéptido utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global utiliza el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62.

Las composiciones incluyen polipéptidos SuR aislados que tienen por lo menos aproximadamente 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia al dominio de enlace ligando de un polipéptido SuR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1205-1213, 1228-1233, o 1240-1243, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa del dominio del enlace de ligando utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global utiliza el algoritmo GAP con parámetros de error con % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62.

En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene por lo menos aproximadamente 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polipéptido SuR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa del polipéptido utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global utiliza el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácido utilizando la Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 374, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos, los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia es determinada por alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 88% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia es determinada por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de ¦espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para el % de identidad y % de similitud se secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos' los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que pueden ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1 100, 1 110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de valor e BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-1 12, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 ( SEQ ID NO: 7) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 387, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un por ciento de identidad se secuencia de por lo menos 92% de identidad se secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % se similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 393, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 1006, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228- 1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un por ciento de identidad de % de similitud de se secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSU 62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-112, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 388, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62 , una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un por ciento de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66 % , 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM 62 , una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 93% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 996, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-111, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62 , una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un por ciento de identidad se secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM 62 , una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden ,una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 93% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro de BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e- 70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-111, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente- alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 93% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método en la alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % se similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1 110, 1120, 1 130, 1140, 1150, 1 160, 1170, 1 180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un registro de valor e BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 381, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácido utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 , y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio .de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 978 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-108, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228- 1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la alineación de identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 90% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de E7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 368, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62 , una sanción de existencia de espacio de 11, y una - sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la alineación de identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 945 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-105, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz LOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de' aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente, alineada con una secuencia de polipéptido de LlO-84 (B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la alineación de identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de LlO-84 (B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 86% de identidad de secuencia, en donde la alineación de identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud se secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 , y la matriz de registro BLOS UM 62 . En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e- 95 , e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 320, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 86% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción >de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, ¦ 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 819 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, 'e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ I D NO: 1231) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-90, en donde la alineación BLAST utilizó la matrizó LOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ I D NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243.

En algunos ejemplos el polipéptidos SuR aislados comprenden un dominio de enlace de ligando de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ I D NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polipéptido SuR aislados comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ I D NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado se selecciona del grupo que consiste de SEQ I D NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243, y el compuesto de sulfonilurea se selecciona del grupo que consiste de clorsulfurón, un etametsulfurón, un metsulfurón, un sulfometurón, un tribenurón, un clorimurón, un nicosulfur.ón, un rimsulfurón y un tifensulfurón .

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados tienen una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea mayor que 0.1 nM y menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea de por lo menos 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? pero menor que 10 µ . En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene una constante de enlace del equilibrio para un compuesto de sulfonilurea de por lo menos 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM pero menos que 1 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea mayor que 0 nM, pero menor 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? o 10 µ . En algunos ejemplos el compuesto de sulfonilurea es un clorsulfurón, un etametsulfurón, un metsulfurón, un sulfometurón, un tribenurón, un clorimurón, un nicosulfurón, un rimsulfurón y/o un tifensulfurón .

En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora mayor que 0.1 nM y menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora de por lo menos 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? pero menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora de por lo menos 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, .10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM pero menor que 1 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR aislado tiene una constante de enlace de equilibrio por una secuencia operadora mayor que 0 nM, pero menor que 0.1 nM, 0.5 M, 1 nM, 10 n , 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? o 10 µ?. En algunos ejemplos la secuencia operadora es una secuencia operadora Tet . En algunos ejemplos la secuencia operadora Tet es una secuencia operadora TetR(A), una secuencia operadora TetR(B), una secuencia operadora TetR(D), una se3cuencia operadora TetR(E), una secuencia operadora TetR(H) o un derivado funcional de las mismas.

Los polipéptidos SuR aislados específicamente enlazan a un compuesto de sulfonilurea . Las moléculas de sulfonilurea comprenden una porción de sulfonilurea (-S (0) 2NHC (O) NH (R) -) . En herbicidas de sulfonilurea el extremo sulfonilo de la porción de sulfonilurea se conecta ya sea directamente o por medio de un átomo de oxígeno o un grupo amino o metileno opcionalmente sustituido a un grupo cíclico o acíclico típicamente sustituido. En el extremo opuesto del puente de sulfonilurea, el grupo amino, que puede tener un sustituyente tal como metilo (R que es CH3) en lugar de hidrógeno, se conecta a un grupo heterocíclico, típicamente un anillo de pirimidina o triazina simétrico, que tiene uno o dos sustituyentes tales como metilo, etilo, trifluorometilo, metóxi, etoxi, metilamino, dimetilamino, etilamino y los halógenos. Los herbicidas de sulfonilurea pueden estar en la forma de un ácido libre o una sal. En la forma de ácido libre el nitrógeno de sulfonamida sobre el puente no es de desprotonado (es decir, - S (0) 2NHC (0) H (R) - ) , mientras que la forma de sal el átomo de nitrógeno de sulfonamida sobre el puente es desprotonado (es decir, -S (0) 2NC (0) NH (R) - ) y catión esta presente, típicamente de un metal alcalino o metal alcalinotérreo, más comúnmente sodio o potasio. Los compuestos de sulfonilurea incluyen, por ejemplo, clases de compuestos tales como compuestos de pirimidinilsulfonilurea, compuestos de triazinilsulfonilurea, compuestos de tiadiazolilurea y sustancias farmacéuticas tales como fármacos antidiabéticos, así como sales y otros derivados de los mismos. Ejemplos de compuestos de pirimidinilsulfonilurea incluyen amidosul furón, azimsulfurón, bensulfurón, bensulfurón-metilo, clorimurón, clorimurón-etilo, ciclosulfamurón, etoxisulfurón, flazasulfurón, flucetosulfurón, flupirsulfurón, flupirsulfurón-metilo, foramsulfurón, halosulfurón, halosulfurón-metilo, imazosulfurón , mesosulfurón , mesosulfurón-metilo, nicosulfurón, ortosulfamurón, oxasulfurón, primisulfurón, primisulfurón-metilo, pirazosulfurón, pirazosulfurón-etilo, rimsulfurón, sulfometurón, sulfometurón-metilo, sulfosulfurón, trifloxisulfurón y sales y derivados de los mismos. Ejemplos de compuestos de triazinilsulfonilurea incluyen clorsulfurón, cinosulfurón, etametsulfurón, etametsulfurón-metilo, iodosulfurón, iodosulfurón-metilo, metsulfurón, metsulfurón-metilo, prosulfurón, tifensulfurón, tifensulfurón-metilo, triasulfurón, tribenurón, tribenurón-metilo, triflusulfurón, triflusulfurón-metilo, tritosulfurón y sales y derivados de los mismos. Ejemplos de compuestos de tiadiazolilurea incluye butiurón, etidimurón, tebutiurón, tiazaflurón, tidiazurón y sales y derivados de los mismos. Eejmplos de fármacos antidiabéticos incluyen acetohexamida , clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glipizida, gliclazida, glibenclamida (gliburida) , gliquidona, glimepirida y sales y derivados de los mismos. En algunos ejemplos los polipéptidos SuR aislados específicamente enlazan a más de un compuesto de sulfonilurea. En algunos ejemplos el compuesto de sulfonilurea se selecciona del grupo que consiste de clorsulfurón, etametsulfurón-metilo, metsulfurón-metilo, tifensulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, tribenurón-metilo, clorimurón-etilo , nicosulfuron y rimsulfurón .

Las composiciones también incluyen polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos SuR que específicamente enlazan un operador de tetraciclina , en donde el enlace específico es regulado por un compuesto de sulfonilurea. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos represores de sulfonilurea (SuR) que comprenden una sustitución de aminoácido en el dominio de enlace de ligando de una proteina represora de tetraciclina de tipo silvestre. En las proteínas TetR de tipo silvestre clase B y D los residuos 6-52 representan el dominio de enlace de DNA. El resto de la proteína está involucrada en el enlace de ligando y la modificación alostérica subsecuente. Para TetR clase B y los residuos 53-207 representan el dominio de enlace de ligando, mientras que los residuos 53-218 comprenden el dominio de enlace de ligando para TetR clase D. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una sustitución de aminoácido en el dominio de enlace de ligando de una proteína TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos los polinucleótidos codifican polipéptidos SuR que comprenden una sustitución de aminoácido en el dominio de enlace de ligando de una proteína TetR (B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden un aminoácido, o cualquier combinación de aminoácidos, seleccionados de la diversidad de aminoácidos mostrados en la Figura 9, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre e emplificado por la SEQ ID NO: 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácidos mostrados en la Figura 9, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácidos mostrados en la Figura 9, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden un dominio de enlace de ligando que comprenden una sustitución de aminoácido en una posición de residuos seleccionado del grupo que consiste de la posición 55, 60, 64, 67, 82, 86, 100, 104, 105, 108, 113, 116, 134, 135, 138, 139, 147, 151, 170, 173, 174, 177 y cualquier combinación de las mismas, en donde la posición de residuo de aminoácido y la sustitución corresponde una posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que además comprenden una sustitución de aminoácidos en una posición de residuo seleccionado del grupo que consiste de 109, 112, 117, 131, 137, 140, 164 y cualquier , combinación de las mismas. En algunos ejemplos la secuencia de polipéptido TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que tiene un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácidos que son seleccionados del grupo que consiste de: (a) o L en la posición de residuo de aminoácido 55; (b) A, L o M en la posición de residuo de aminoácido 60; (c) A, N, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácido 64; (d) , I, L, V, F o Y en la posición de residuo de aminoácido 67; (e) N, S o T posición de residuo aminoácido 82; (f) F, M, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 86; (g) C, V, L , M, F, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 100; (h) R, A o G posición de residuo aminoácido 104 (i) A, I, V, F o W en la posición de residuo de aminoácido 105; (j) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (k) A, M, H , K, T, P o V en la posición de residuo de aminoácido 113; (I) I, L,' M, V, R, S, N, P o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) I, L, V, M, R, S o W en la posición de residuo de aminoácido 134; (n) R, S, N, Q, K o A en la posición de residuo de aminoácido 135; (o) A, C, G, H, I, V, R o T en la posición de residuo de aminoácido 138; (p) A, G, I, V, M, W, N, R o T en la posición de residuo de aminoácido 139; (q) I, L, V, F, W, T, S o R en la posición de residuo de aminoácido 147; (r) M, L, W, Y, K, R o S en la posición de residuo de aminoácido 151; (s) I, L, V o A en la posición de residuo de aminoácido 170; (t) A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (u) L, V, W, Y, H, R, K o S en la posición de residuo de aminoácido 174; y, (v) A, G, I, L, Y, K, Q o S en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos los polinucleótidos SuR aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados de los residuos de aminoácido listados en (a) - (v) anterior, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR seleccionados para actividad aumentada sobre clorsulfurón que tienen un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados del grupo que consiste de: (a) M en la posición de residuo de aminoácido 60; (b) A o Q en la posición de residuo de aminoácido 64; (c) , F, Y, I, V o L en la posición de residuo de aminoácido 67; (d) N o T en la posición de residuo de aminoácido (e) M en la posición de residuo de aminoácido 86; (f) C o W en la posición de residuo de aminoácido 100; (g) en la posición de residuo de aminoácido 105; (h) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (i) M, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácido 109; (j) G, A, S o T en la posición de residuo de aminoácido 112; (k) A en la posición de residuo de aminoácido 113; (I) M o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) o V en la. posición de residuo de aminoácido 134; (n) G o R en la posición de residuo de aminoácido 138; (o) N o V en la posición de residuo de aminoácido 139; (p) F en la posición de residuo de aminoácido 147; (q) S o L en la posición de residuo de aminoácido 151; (r) A en la posición de residuo de aminoácido 164; (s) A, L o V en la posición de residuo de aminoácido 170; (t) A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (u) L o W en la posición de residuo de aminoácido 174 ; y; (v) K en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de Tet (B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos los polinucleótidos SuR aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados de los residuos de aminoácido listados en (a) - (v) anterior en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR seleccionados para actividad aumentada sobre etamesulfurón que tienen un dominio de enlace de ligando que comprende por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados del grupo que consiste de: (a) M o L en la posición de residuo de aminoácido 55; (b) A en la posición de residuo de aminoácido 64; (c) M, Y, F, I, L o V en la posición de residuo de aminoácido 67; (d) M en la posición de residuo de aminoácido 86; e) C en la posición de residuo de aminoácido 100, f) G en la posición de residuo de aminoácido 104 g) F en la posición de residuo de aminoácido 105, h) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; i) Q, M, L o H en la posición de residuo de aminoácido 109; j) S, T, G o A en la posición de residuo de aminoácido 112; k) A en la posición de residuo de aminoácido 113; I) S en la posición de residuo de aminoácido 116; m) M o L en la posición de residuo de aminoácido 117; n) o L en la posición de residuo de aminoácido 131; o) M en la posición de residuo de aminoácido' 134 ; p) Q en la posición de residuo de aminoácido 135; q) A o V en la posición de residuo de aminoácido 137; r) C o G en el residuo de aminoácido 138; s) I en la posición de residuo de aminoácido 139; t) F o Y en la posición de residuo de aminoácido 140; u) L en la posición de residuo de aminoácido 147; v) L en la posición de residuo de aminoácido 151; (w) A en la posición de residuo de aminoácido 164; (x) V, A o L en la posición de residuo de aminoácido 170; (y) G, A o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (z) L en la posición de' residuo de aminoácido 174; Y, (aa) N o K en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos, los polinucleótidos SuR aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 941, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los residuos de aminoácido que son seleccionados de los residuos de aminoácido listados en (a) - (aa) anterior, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre. En algunos ejemplos el TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que tienen por lo menos aproximadamente 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia al dominio de el enlace de ligando mostrado como residuos de aminoácidos 53.-207 de SEQ ID NO: 1, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa del dominio de enlace de ligando utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global es GAP, en donde los parámetros de error son para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSU 62.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que tienen por lo menos aproximadamente 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa del polipéptido utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global es GAP, en donde los parámetros de error son para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados incluyen secuencias de ácido nucleico que selectivamente hibridan bajo condiciones de hibridación severas a un polinucleótido que codifica un polipéptido de SuR. Los polinucleótidos que selectivamente hibridan son polinucleótidos que enlazan a una secuencia objetivo a un nivel de por lo menos 2-veces sobre el antecedente como es comparado con la hibridación a una secuencia en un objetivo. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y dependientes de la condición. Las condiciones severas típicas son aquellas en las la concentración de sal de aproximadamente 0.01 a 1.0 M en pH 7.0-8.3 a 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) o aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas pueden incluir formamida y otros agentes deestabilizantes . Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0. IX SSC a 60 a 65°C.

La especificidad es impactada por las condiciones de lavado de post-hibridación, típicamente vía la concentración iónica y la temperatura. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Bioche . 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques ' in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization con Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York (1993); and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, y colaboradores, Eds., Greene Publishing and iley-lnterscience , New York (1995). En algunos ejemplos, los polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos SuR específicamente hibridan a un polinucleótido de SEQ ID NO: 434- 832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247 bajo condiciones moderadamente severas o bajo condiciones altamente severas.

En algunos ejemplos los pol.inucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que pueden ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptidos de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (S-EQ ID NO: 220) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 374, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 88% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación de BLAST utilizando la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitudes de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende la secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 600, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BL0SUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-1A04 (SEQ ID NO: 220) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-1 10, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado acidifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247 o los polipéptidos complementario del mismo.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polipéptido aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptidos de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 387, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido el polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 92% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSU 62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende la secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 600, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, '960, 970, 980,· 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende la secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-22 (SEQ ID NO: 7) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110,. e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e- 119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1.· En algunos ejemplos el polinucleotido aislado codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleotido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleotido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos en los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para ¦ generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLO.SUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos en los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 393, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con la Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación de BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. gEn algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de similitud de BLÁST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 1006, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-29 (SEQ ID NO: 10) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100,- e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-1 17, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la. alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el ; polinucleótido aislado codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700,· o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%-, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%/ 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de errores para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1 110, 1120, 1 130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de 'existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipeptido de Ll-02 (SEQ ID NO: 3) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-112, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismo.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 388, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, v 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 93% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud se secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 , y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 996 en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-07 (SEQ ID NO: 4) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-111, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifican un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polipéptido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un por ciento de identidad se secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, .74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 801, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 93% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en. donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-20 (SEQ ID NO: 6) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-111, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleót ido aislados codifican un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismos .

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. en algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia . de N polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un por ciento de identidad de secuencia a por lo menos 93% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060,. 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de Ll-44 (SEQ ID NO: 13) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOS UM'62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ I D NO : 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden una secuencia de polinucleótido de SEQ I D NO : 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede · ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO : 1228) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 381, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BL0SUM62. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 978, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ .ID NO: 1228) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-1 14, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de existencia de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleotidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3A09 (SEQ ID NO: 1228) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-108, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en -donde la alineación de identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un por ciento de identidad de secuencia por lo menos 90% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 , y la matriz de registro BLOSU 62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L6-3H02 (SEQ ID NO: 94) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e- 100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifican un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. en algunos ejemplos, los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleot ido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleot idos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 368, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 945, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 ( SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e- 109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L7-4E03 (SEQ ID NO: 1229) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-105, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una' sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de identidad de secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de identidad de secuencia de por lo menos 86% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácidos utilizando Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSU 62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150/ 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSU 62 una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L10-84(B12) (SEQ ID NO: 1230) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e- 95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e-109, ?-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-116, e-117, e-118, e-119, e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleótido complementario de los mismos .

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de bitios de BLAST de por lo menos 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 750, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 320, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un por ciento de identidad se secuencia de por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, en donde la alineación de identidad de secuencia se determina por la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos, los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprenden una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un por ciento de identidad de secuencia de por lo menos 86% de identidad de secuencia, en donde la identidad de secuencia se determina mediante la alineación BLAST utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el por ciento de identidad de secuencia se determina utilizando un método de alineación global utilizando el algoritmo GAP con parámetros de error para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, o 1200, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptidos SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de similitud de BLAST de por lo menos 819, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de valor e de BLAST de por lo menos e-60, e-70, e-75, e-80, e-85, e-90, e-95, e-100, e-105, e-106, e-107, e-108, e- 109, e-110, e-111, e-112, e-113, e-114, e-115, e-1 16, e-117, e-118, e-119, ' e-120, o e-125, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de L13-46 (SEQ ID NO: 1231) para generar un registro de valor de e de BLAST de por lo menos e-90, en donde la alineación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1. En algunos ejemplos el polinucleótido aislado codifica un polipéptido que es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprende una secuencia de polinucleotido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleotido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende un dominio de enlace de ligando de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido SuR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233 o 1240-1243. En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243, y el compuesto de sulfonilurea se selecciona del grupo que consiste de clorsulfurón, etametsulfurón-metilo, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo y tifensulfurón-metilo. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden una secuencia de polinucleotido de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247, o el polinucleotido complementario de los mismos.

En algunos ejemplos el polinucleotido SuR aislado codifica un polipéptido SuR que tiene una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea mayor que 0.1 nM y menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado tiene una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea de por lo menos 0.1 nM, 0.5nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? pero menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado tiene una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea de por lo menos 0.1 nM, 0.5nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM pero menor que 1 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado tiene una constante de enlace de equilibrio para un compuesto de sulfonilurea mayor que 0 nM, pero menor que 0.1 nM, 0.5nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ?, o 10 µ?. En algunos ejemplos el compuesto de sulfonilurea es un clorsulfurón, un etametsulfurón, un metsulfurón, un sulfometurón y/o o un compuesto tifensulfurón .

En algunos ejemplos el polinucleótido SuR aislado codifica un polipéptido SuR que tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora mayor que 0.1 nM y menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora de por lo menos 0.1 nM, 0.5nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? pero menor que 10 µ?. En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora de por lo menos 0.1 nM, 0.5nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM pero menor que 1 µ . En algunos ejemplos el polipéptido SuR codificado tiene una constante de enlace de equilibrio para una secuencia operadora mayor que 0 nM, pero menor que 0.1 nM, 0.5nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 µ?, 5 µ?, 7 µ? o 10 µ?. En algunos ejemplos la secuencia operadora es una secuencia operadora Tet. En algunos ejemplos la secuencia operadora Tet es una secuencia operadora TetR(A) una secuencia operadora TetR(B), una secuencia operadora TetR(D), una secuencia operadora TetR(E), una secuencia operadora TetR(H) o un derivado funcional de las mismas.

En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos SuR comprenden perfiles de composición de codón representativo de preferencia de codón para células hospederas particulares, u organelos de célula hospedera. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de procariota. En algunos ejemplos, los polinicleótidos aislados comprenden codones preferidos de bacterias. En algunos ejemplos la bacteria es E. coli o Agrobacterium. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de plástida. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de eucariota. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos nucleares, en algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos planta. En algunos ejemplos los polinucleótidos . aislados comprenden codones preferidos de planta monocotiledónea. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de maíz, arroz, sorgo, cebada, trigo, centeno, mijo perenne, hierva de césped y/o de avena. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de planta dicotiledónea. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de soja, girasol, cártamo, Brassica, alfalfa, Arabidopsis, tabaco y/o algodón. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de levadura. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos mamíferos. En algunos ejemplos los polinucleótidos aislados comprenden codones preferidos de insecto.

Las composiciones también incluyen polinucleótidos aislados completamente complementarios a un polinucleótido que codifica un polipéptido de SuR, cásete de expresión, replicones, vectores, T-DNAs, librerías de DNA, células hospederas, tejidos y/u organismos que comprenden los polinucleótidos que codifican los polipéptidos SuR y/o complementos o derivados de los mismos. En algunos ejemplos una librería de DNA que comprende una población de polinucleótidos que codifica una población de variantes de polipéptido SuR es proporcionada. En algunos ejemplos el polinucleótido se incorpora establemente en un genoma de la célula hospedera, tejido y/u organismo. En algunos ejemplos la célula hospedera es una procariota, incluyendo cepas de E. coli y Agrobacterium. En algunos ejemplos el hospedero es una eucariota, incluyendo por ejemplo levadura, insectos, plantas y mamíferos.

Además se proporcionan métodos que utilizan las composiciones. En un ejemplo se proporcionan métodos de regulación de transcripción de un polinucleótido de interés en una célula hospedera, los métodos que comprenden: proporcionar una célula que comprende polinucleótido de interés operablemente enlazado a un promotor que comprende por lo menos una secuencia operadora de tetraciclina ; proporcionar un polipéptido SuR y, proporcionar un compuesto de sulfonilurea, para de esta manera regular la transcripción del polinucleótido de interés. Cualquier célula hospedera se pueden utilizar, incluyen por ejemplo células procarióticas tales como bacterias y células eucarióticas, incluyendo células de levadura, de plantas, de insectos y de mamíferos. En algunos ejemplos la provisión del polipéptido SuR comprende poner en contacto la célula con un cásete de expresión que comprende un promotor funcional en la célula operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica el polipéptido SuR.

Los métodos para generar y seleccionar librerías diversificadas para producir polinucleótidos SuR adicionales, incluyendo polinucleótidos que codifican polipéptidos SuR con características mejoradas y/o aumentadas, por ejemplo, constantes de enlace alteradas para compuestos de sulfonilurea y/o o la secuencia operadora de DNA objetivo y/o estabilidad incrementada, todas basadas en la selección de un constituyente de polinucleótido de la librería para actividades nuevas o mejoradas también son proporcionadas. En algunos ejemplos por lo menos una librería o población de oligonucleótidos diseñados para introducir modificaciones de secuencia y/o diversidad a un polipéptido de dominio de enlace ligando TetR de tipo silvestre o modificado es proporcionada. En algunos ejemplos la librería o población se diseña para introducir modificaciones y/o diversidad a un polipéptido TetR de tipo silvestre modificado. En algunos ejemplos, la librería o población introduce por lo menos una modificación como es ejemplificado en la Figura 9. En algunos ejemplos la librería o población comprende por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más grande de oligonucleótidos distintos. En algunos ejemplos la librería o población comprende oligonucleótidos seleccionados de los oligonucleótidos mostrados en por lo menos una de la Tabla 2, 9, 12, 13, 15, 17, 19 o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos la librería o población comprende uno o más oligonucleótidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 833-882, 885-986, 987-059, 1060-1083, 1084-1124, 1125- 1154, 1159-1205.

En algunos ejemplos el compuesto de sulfonilurea es un etametsulfurón. En algunos ejemplos el etametsulfurón se proporciona en una concentración de aproximadamente 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, '45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 200 o 500 g/ml. En algunos ejemplos el polipéptido SuR tiene un dominio de enlace ligando que tiene por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polipéptido SuR de SEQ ID NO: 205-401, 1206-1213, o 1228-1233, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de polipéptido utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global es GAP, en donde los parámetros de error son para un % de identidad y % similitud de secuencia de aminoácido utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos el polipéptido tiene dominio de enlace de ligando de un polipéptido SuR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 205-401, 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 205-401/ 1206-1213, 1228-1233, o 1240-1243. En algunos ejemplos el polipéptido es codificado por un polinucleótido de SEQ ID NO: 636-832, 1214-1221, 1234-1239, o 1244-1247.

En algunos ejemplos el compuesto de sulfonilurea es clorsulfurón . En algunos ejemplos el clorsulfurón se proporciona a una concentración de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 200 o 500 g/ml . En algunos ejemplos el polipéptido SuR tiene un dominio de enlace de ligando que tiene por lo menos 50% 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a un polipéptido SuR de SEQ ID NO: 14-204, en donde la identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa del polipéptido utilizando un método de alineación global. En algunos ejemplos el método de alineación global es GAP, en donde los parámetros de error son para % de identidad y % de similitud de secuencia de aminoácido utilizando Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSUM62. En algunos ejemplos, el polipéptido tiene un dominio de enlace de ligando de un polipéptido SuR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14-204. En algunos ejemplos el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14-204. En algunos ejemplos el polipéptido se codifica por un polinucleótido de SEQ ID NO: 445-635.

La habilidad para capturar valor en varios mercados de semilla requerirá desarrollo de tecnología para controlar la distribución de atributos diseñada. Una opción es un sistema de desactivación/activación de atributo utilizando un cambio de gen químicamente regulado. Hasta la fecha no existe tal sistema, en gran parte debido a la carencia de la química relevante, por ejemplo química compatible con agricultura y/o basada en farmacéutica, que se puede utilizar como un ligando para una tecnología de cambio de gen sensitiva.

Para desarrollar un cambio de gen de ligando basado en química de agricultura, TetR se modificó utilizando la modelación de proteína, entremezclado de DNA y un mecanismo de clasificación altamente sensible para reproducir un represor que específicamente reconoce compuestos de sulfonilurea . Para aplicaciones agrícolas los compuestos de sulfonilurea son móviles de floema y comercialmente disponibles, para de esta mansera proporcionar una buena base para el uso como química de ligando de cambio. Después de tres rondas de modelación y entremezclado de DNA, los represores que reconocen la química de SU estrechamente así como TetR de tipo silvestre reconoce los inductores cognados y todavía son totalmente específicos a la química de sulfonilurea que se ha generado. Estos polipéptidos comprenden represores de sulfonilurea reales (SuRs) , que se han validado en planta utilizando un sistema de ensayo transiente recientemente desarrollado para mostrar la funcionalidad del sistema de cambio de SuR. Mientras que ejemplificado en un contexto agrícola, estos métodos y composiciones se pueden utilizar en una amplia variedad de otras instalaciones y organismos.

En general, un sistema de cambio químico en donde la sustancia química utilizada penetra rápidamente y se percibe por todos los tipos de células en el organismo, pero no perturba cualquiera de las redes reguladoras endógenas será mucho más útil. Otros aspectos importantes tienen que hacerse con el comportamiento del componente sensor, por ejemplo, la severidad de regulación y respuesta en la ausencia o presencia del inductor. En general un sistema de cambio que tiene estrecha regulación del estado "apagado" en la ausencia de inductor y respuesta rápida e intensa en la presencia del inductor es preferido.

La habilidad para volver reversiblemente los genes encendido y apagado tiene gran utilidad para el análisis de la expresión y función génica, particularmente para aquellos genes cuyos productos son tóxicos a la célula. Un mecanismo de control bien caracterizado en procariota involucra proteínas represoras que enlazan al DNA operador para prevenir la iniciación de transcripción (Wray and Reznikoff (1983) J Bacteriol 156:1188-1191) y los sistemas regulados con represor se han desarrollado para controlar la expresión, tanto en animales (Wirtz and Clayton (1995) Science 268:1179-1183; Deuschle y colaboradores. (1995) Mol Cell Biol 15:1097-1914; Furth y colaboradores. (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:9032-9306; Gossen and Bujard (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:5547-5551 and Gossen y colaboradores. (1995) Science 268:1766-1769) como en plantas (Wilde y colaboradores. (1992) EMBO J 11:1251-1259; Gatz y colaboradores. (1992) Plant J 2:397-404; Roder y colaboradores." (1994) Mol Gen Genet 243-32-38 and Ulmasov y colaboradores. (1997) Plant Mo Biol 35: 17-424) .

Dos sistemas basados en represores mayores se han explotado exitosamente para la regulación de la expresión génica de planta: el sistema de operador-represor lac (Ulmasov y colaboradores. (1997) Plant Mol Biol 35:417-424; Wilde y colaboradores. (1992) EMBO J 11:1251-1259) y el sistema de operador-represor tet (Wilde y colaboradores. (1992) EMBO J 11:1251-1259; Gatz y colaboradores. (1992) Plant J 2:397-404; Roder y colaboradores. (1994) Mol Gen Genet 243:32-38; Ulmasov y colaboradores. (1997) Plant Mol Biol 35-417-424). Ambos son sistemas basados en represor/operador que derivan de elementos claves de su operón procariótico correspondiente, específicamente el operón de lactosa de E. coli para lac y el operón de tetraciclina TnlO de transposón para tet. Generalmente, estos sistemas controlan la actividad de un promotor al colocar la secuencias operadoras cerca del sitio de inicio transcripcional de un gen tal que la expresión génica del operón es inhibida en el enlace de la proteína represora a su secuencia operadora cognada. Sin embargo, en la presencia de un agente de inducción, el enlace del represor a su operador es inhibido, activando de esta manera el promotor y permitiendo la expresión génica. En el sistema lac, isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (IPTG) es el agente de inducción comúnmente utilizado, mientras que tetraciclina y/o doxiciclina son agentes de inducción comúnmente utilizados para el sistema tet.

La expresión del TnlO-operón es regulado mediante el enlace del represor tet a sus secuencias operadoras (Beck y colaboradores. (1982) J Bacteriol 150:633-642; Wray and Reznikoff (1983) J Bacteriol 156:1188-1191). La alta especificidad" del represor de tetraciclina para el operador tet, la alta eficiencia de inducción por tetraciclina y sus derivados, la baja toxicidad del inductor, asi como la habilidad de la tetraciclina para fácilmente permear la mayoría de las células, son la base para la aplicación del sistema tet y la regulación génica somática en células eucarióticas de animales (Wirtz and Clayton (1995) Science 268:1179-1183; Gossen y colaboradores. (1995) Science 268:1766-1769), humans (Deuschle y colaboradores. (1995) Mol Cell Biol 15:1907-1914; Furth y colaboradores. (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:9302-9306; Gossen and Bujard (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:5547-5551; Gossen y colaboradores. (1995) Science 268:1766-1769) and plant cell cultures (Wilde y colaboradores. (1992) EMBO J 11:1251-1259; Gatz y colaboradores. (1992) Plant J 2:397-404; Roder y colaboradores. (1994) Mol Gen Genet 243:32-28; Ulmasov y colaboradores. (1997) Plant Mol Biol 35:417-424).

Un número de variaciones de sistemas de operador/represor de tetraciclina se han ideado. Por ejemplo, un sistema basado en la conversión del represor tet a un activador se desarrolló por la vía de la fusión del represor a un dominio de transactivación transcripcional tal como el virus de herpes simple VP16 y el represor tet (tTA, Gossen and Bujard (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:5547-5551). En este sistema, un promotor mínimo se activa en la ausencia del tetraciclina mediante el enlace de tTA a la secuencias operadoras tet, y tetraciclina inactiva el transactivador e inhibe la transcripción. Este sistema se ha utilizado en plantas ( einmann y colaboradores. (1994) Plant J 5:559-569), corazones de rata (Fishman y colaboradores. (1994) J Clin Invest 93:1864-1868) y ratones (Furth y colaboradores. (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:9302-9306) . Sin embargo, hubo indicaciones de que la proteína de fusión tTA quimérica fue tóxica a las células en los niveles requeridos para la regulación génica eficiente (Bohl y colaboradores. (1996) Nat ¦Med 3:299-305) .

Los promotores modificados para ser regulados por tetraciclina y análogos de los mismos son conocidos (Matzke y colaboradores. (2003) Plant Mol Biol Rep 21:9-19; Padidam (2003) Curr Op Plant Biol 6:169-177; Gatz and Quail (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:1394-1397; Ulmasov y colaboradores. (1997) Plant Mol Biol 35:417-424; Weinmann, y colaboradores. (1994) Plant J 5:559-569) . Una o más secuencias operadoras tet se pueden adicionar a un promotor con el fin de producir un promotor inducible de tetraciclina. En algunos ejemplos hasta 7 operadores tet se han introducido corriente arriba de una secuencia de promotor mínima y un dominio de activación TetR: :VP16 aplicado en trans activa la expresión solamente en la ausencia del inductor (Weinmann y colaboradores. (1994) Plant J 5:559-569; Love y colaboradores. (2000) Plant J 21:579-588). Un sistema de expresión regulado de tetraciclina ampliamente probado para plantas utilizando el promotor 35S de CaMV se desarrolló (Gatz y colaboradores. (1992) Plant J 2:397-404) que tiene tres operadores tet introducidos cerca de la caja TATA (3XOpT 35S) . El promotor 3XOpT 35S generalmente funcionó en tabaco y papa, sin embargo la toxicidad y pobre fenotipo de la planta en tomate y Arabidopsis (Gatz (1997) Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108; Corlett y colaboradores. (1996) Plant Cell Environ 19:447-454) también se reportaron. Otro factor es que la química relacionada con tetraciclina es rápidamente degradada en la luz, lo cual tiende a confinar su uso a la prueba en condiciones de laboratorio.

TetR se ha sometido al entremezclado de DNA para modificar su especificidad inductora de tetraciclina a 4-de (dimetiloamino) -6-deoxi-6-demetil-tetraciclina (cmt3) un compuesto relacionado pero no inductor (Scholz y colaboradores. (2003) J Mol Biol 329:217-227) que carece de grupos laterales químicos en las posiciones 4 y 6 y por lo tanto es más pequeño que la tetraciclina. La especificidad de TetR se alteró al remover la cavidad de enlace de ligando, para de esta manera bloquear esféricamente la tetraciclina. De ligando natural. El polipéptido de partida fue una quimera de TetR (BD) que consiste de los aminoácidos 1-50 de TetR (B) y los residuos 51-208 de TetR(D). Varias rondas de evolución y selección se utilizaron para desplazar la especificidad de TetR de la tetraciclina a cmt3. El sistema cmt3 no inductor tuvo poca actividad de partida y se llevó al nivel de la tetraciclina, produciendo una mejora en la actividad de varias miles de veces, y la tetraciclina casi no tuvo actividad inductora con los represores mutantes. Mientras que la habilidad para desplazar la especificidad de TetR a ligando cmt3 es excitante, se debe mantener en mente que cmt3 está altamente relacionado al ligando de tetraciclina al natural. Basados en estos experimentos, no es obvio que TetR podría ser utilizado como la base para desarrollar especificidad a una clase completamente diferente de ligandos químicos.

Para producir un nuevo sistema de cambio químico, los inventores rediseñaron el sistema TetR para reconocer la química viable para el uso en agricultura. El proceso de rediseño se inició al elegir un compuesto agroquímico registrado que tiene excelentes propiedades de captación y distribución en la planta, así como que tiene un tamaño y una forma razonable para la modelación en la cavidad de enlace de ligando TetR de tipo silvestre. El compuesto elegido, tifensulfurón-metilo (Harmony®) es uno de una familia de herbicidas de tipo sulfonilurea comercialmente utilizados que inhiben la enzima de planta clave en la biosíntesis de aminoácido de cadena ramificada, acetolactato sintasa (ALS) . Tifensulfurón (Ts) y herbicidas relacionados son estructuralmente distintos a la tetraciclina, por lo tanto fue improbable que tendrían cualquier actividad de partida con TetR. El ent emezclado de DNA es una tecnología ponderosa y puede mejorar las afinidades par los sustratos o la velocidad de vuelta del sustrato para varios miles de veces, sin embargo no ha sido capaz de cerrar la actividad de partida de Nuevo. Para satisfacer este espacio en la ruta de evolución se buscó una estrategia de modelación en computadora que reducirá la investigación para la diversidad de aminoácidos significante para el entremezclado. La tecnología de modelación recientemente desarrollada se utilizó para retener las proteínas de enlace periplásmicas de E. coli que normalmente se enlazan al azúcar y reaccionan inician la señalización con conjuntos completamente diversos de compuestos tal como serotonina, L-lactato y trinitrotolueno (Looger y colaboradores. (2003) Nature 423:185-190). Utilizando el diseño de proteína acoplado con el entremezclado de DNA y un sistema de clasificación muy sensible, las variantes de proteína TetR que responden a tifensulfurón (Ts) y otros compuestos según relacionados se han identificado. Después de varias rondas de entremezclado de DNA, las variantes TetR se desarrollaron teniendo capacidad de cambio genético con los ligandos SU (SuRs) similares a aquel de TetR con inductores de tetraciclina.

Cualquier método de diseño de proteina racional se puede utilizar solo o en combinación. Por ejemplo, la diversidad filogenética dentro de una familia de secuencias de proteina se puede utilizar para identificar posiciones en la estructura primaria que tiene sustituciones de aminoácido, y los tipos de sustituciones que han ocurrido y su impacto en la función. Las familias de dominio conservado también se pueden alinear y examinar similarmente para identificar posiciones en la estructura primaria que tiene sustituciones de aminoácido y los tipos de sustituciones que han ocurrido y el impacto en la función. La estructura (s) secundaria y dominios funcionales se pueden evaluar y varios modelos utilizar para predecir la tolerancia o impacto de las sustituciones de aminoácido sobre la estructura y función. La modelación usando la estructura terciaria y/o cuaternaria y el ligando, sustrato y/o enlace de cofactor proporcionan discernimientos adicionales en los efectos de la sustitución de aminoácido y/o ligandos alternos, sustratos y/o interacciones de cofactores con el polipéptido.

Para examinar la diversidad filogenética de represores de tetraciclina, tanto una amplia familia de proteina represora de tetraciclina asi como represores de tetraciclina estrechamente relacionados se utilizaron. Treinta y cuatro proteínas se identificaron y se alinearon para examinar la diversidad de aminoácido en varias posiciones en la familia represora (SEQ ID NO: 1 y 402-433) . La amplia familia de represores de tetraciclina comprendió un mutante TetR(D) cuya estructura se determinó por la cristalización de PDB_1A61 (Orth y colaboradores. (1998) J Mol Biol 279:439-447) y los accesos de deposito de secuencia pública A26948, AAA98409, AAD12754, AAD25094, AAD25537, AAP93923, AAR96033, AAW66496, AAW83818, ABO14708, ABS19067, CAA24908, CAC80726, CAC81917, EAY62734, NP_387455, NP_387462, NP_511232, NP_824556, P51560, YP_001220607, YP_001370475, YP_368094, YP_620166, YP_772551, ZP_00132379, ' ZP_01558383, y ZP_01567051. Los represores de tetraciclina estrechamente relacionados incluyeron TetR(A) P03038, TetR(B) P04483, TetR(D) P0ACT4, TetR(E) P21337 y TetR(H) P51561. Las alineaciones de esta secuencia se utilizaron para buscar la diversidad de secuencia total asi como la diversidad en el DNA y los dominios de enlace de ligando (ver, Ejemplo 1H, SEQ ID NO: 1 y 402-433) .

La arquitectura modular de las proteínas represoras y la comunidad de dominios de enlace de DNA de hélice-vuelta-hélice permite la creación de polipéptidos SuR que tienen especificidad de enlace de DNA alterada. Por ejemplo, la especificidad de enlace de DNA se puede alterar al fusionar un dominio de enlace de ligando SuR a un dominio de enlace de DNA alterno. Por ejemplo, el dominio de enlace de DNA de TetR clase D se puede fusionar a un dominio de enlace de ligando SuR para crear polipéptidos SuR que específicamente enlazan a polinucleótidos que comprenden un operador de tetraciclina clase D. En algunos ejemplos se puede utilizar una variante de dominio de enlace de DNA o derivado. Por ejemplo, un dominio de enlace de DNA para una variante TetR que específicamente reconoce un operador tetO-4C o un operador tetO-6C podría ser utilizado (Helbl and Hillen (1998) J Mol Biol 276:313-318; Helbl y colaboradores. (1998) J Mol Biol 276:319-324. El manojo de cuatro hélices formado por las hélices a8 y lO en ambas unidades se puede sustituir para asegurar la especificidad de dimerización cuando se dirigen dos variantes represoras específicas de operador diferentes en la misma célula para prevenir la heterodimerización (por ejemplo, Rossi y colaboradores. (1998) Nat Genet 20:389-393; Berens and Hillen (2003) Eur J Biochem 270:3109-3121). En otro ejemplo, el dominio de enlace de DNA del represor LexA se fusionó a GAL4 en donde esta proteína híbrida reconoció los operadores LexA tanto en E. coli como en levadura (Brent and Ptashne (1985) Cell 43:729-736). En otro ejemplo, todos los grupos r de enlace de DNA otra de reconocimiento de DNA presupuestos de represor 434 se reemplazó por las posiciones correspondientes del represor P22. La especificidad de enlace del operador del represor híbrido 434R [OÍ3 (P22R) ] se probó tanto in vivo como in vitro y cada prueba mostró que esa modificación dirigida de 434 desplazó la especificidad de enlace de DNA del operador 434 al operador P22 (Wharton and Ptashne (1985) Nature 316:601-605). Este trabajo además extendió al crear uno heterodimero de 434R de tipo silvestre y 434R [OÍ3 ( P22R) ] que luego específicamente reconoció una secuencia operadora P22/434 quimérica (Hollis y colaboradores. (198'8) Proc Nati Acad Sci USA 85:5834-5838). En otro ejemplo, la mitad N-terminal de la proteina AraC se fusionó al dominio de enlace de DNA de represor LexA. La quimera AraC:LexA resultante se dimerizó, se enlazó al operador LexA, y reprimió la expresión de un gen de fusión de operador LexA: -galactosidasa en una manera responsiva arabinosa (Bustos and Schleif (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:5638-5642).

Los polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos SuR también se pueden utilizar como sustratos para procedimientos de generación de diversidad, incluyendo mutación, recombinación y reacciones de recombinación recursivas, para producir variantes de polinucleótido y/o polipéptido SuR adicionales con propiedades deseadas. Adicionalmente, los polinucleótidos SuR se pueden utilizar para procedimientos de generación de diversidad para producir variantes de polinucleótido y/o polipéptido que tiene una característica alterada como es comparada con el material de partida, por ejemplo el enlace a un inductor de ligando diferente. El proceso de generación de diversidad produce alteraciones de secuencia incluyendo sustituciones de nucleótidos individuales, sustituciones de nucleótidos múltiplex e inserción o supresión de regiones de la secuencia de ácido nucleico. Los procedimientos de generación de diversidad se pueden utilizar separadamente y/o en combinación para producir uno o más variantes SuR o un conjunto de variantes asi como variantes de proteínas codificadas. Individualmente y colectivamente, estos procedimientos proporcionan maneras ampliamente aplicables, robustas para generar polinucleótidos y polipéptidos diversificados, así como conjunto de polinucleótidos y polipéptidos, incluyendo librerías. Estas variantes y conjuntos de variantes son útiles para el diseño o la evolución rápida de polinucleótidos, proteínas, rutas, células y/u organismos con características nuevas y/o mejoradas. Las variantes de polinucleótido y/o polipéptido resultante se pueden seleccionar o clasificar para características y/o propiedades alteradas, incluyendo el enlace de ligando alterado, retención de enlace de DNA y/o cuantificación de propiedades de enlace.

Cualquier método se puede utilizar para proporcionar diversidad de secuencia a una librería. Muchos procedimientos de generación de diversidad, incluyendo el entremezclado multigénico y métodos para generar secuencias de ácido nucleico modificadas están disponibles, incluyendo por ejemplo Soong y colaboradores. (2000) Nat Genet 25:436-39; Stemmer y colaboradores. (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness y colaboradores. (1999) Nature Biotech 17:893-896; Chang y colaboradores. (1999) Nature Biotech 17 -.193-191 ; Minshull and Stemmer (1999) Curr Op Chem Biol -3:284-290; Christians y colaboradores. (1999) Nature Biotech 17:259-264; Crameri y colaboradores. (1998) Nature 391:288-291; Crameri y colaboradores. (1997) Nature Biotech 15:436-438; Zháng y colaboradores. (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94:4504-4509; Patten y colaboradores. (1997) Curr Op Biotech 8:724-733/ Crameri y colaboradores. (1996) Nature Med 2:100-103; Crameri y colaboradores. (1996) Nature Biotech 14:315-319; Gates y colaboradores. (1996) J Mol Biol 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" in The Encyclopedia of Molecular Biology (VCH Publishers, New York) pp. 447-457; Crameri and Stemmer (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer y colaboradores. (1995) Gene 164:49-53; Stemmer (1995) Science 270:1510; Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 and Stemmer (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:10747-10751. Los métodos mutacionales para generar diversidad incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio (Ling y colaboradores. (1997) Anal Biochem 254:157-178; Dale y colaboradores. (1996) Methods Mol Biol 57:369-374; Smith (1985) Ann Rev Genet 19:423-462; Botstein and Shortle (1985) Science 229:1193-1201; Cárter (1986) Biochem 237:1-7 and Kunkel (1987) "Los polipéptidos efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids and Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds . , Springer Verlag, Berlín). Los métodos de mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo incluyeron Kunkel (1985) Proc Nati Acad Sci USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores. (1987) Methods Enzymol 154 : 367-382 ; and Bass y colaboradores. (1988) Science 242:240-245. Los métodos de mutagénesis dirigida a oligonucleótido incluyen Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol 100:468-500; Zoller and Smith (1982) Nucí Acids Res 10:6487-6500 and Zoller and Smith (1987) Methods Enzymol 154:329-350. Los métodos de mutagénesis de DNA modificados con fosforotioato incluyen Taylor y colaboradores. (1985) Nucí Acids Res 13:8749-8764; Taylor y colaboradores. (1985) Nucí Acids Res 13:8765-8787; Nakamaye and Eckstein (1986) Nucí Acids Res 14:9679-9698; Sayers y colaboradores. (1988) IVucI Acids Res 16:791-802 and Sayers y colaboradores. (1988) Nucí Acids Res 16:803-814. Los métodos de mutagénesis utilizando DNA de dúplex espaciado incluyen (Kramer y colaboradores. (1984) Nucí Acids Res 12:9441-9456; Kramer and Fritz (1987) Methods Enzymol 154:350-367; Kramer y colaboradores. (1988) Nucí Acids Res 16:7207; and Fritz y colaboradores. (1988) Nucí Acids Res 16:6987-6999. Les métodos de generación de diversidad adecuados ' adicionales incluyen la reparación de desigualación puntual (Kramer y colaboradores. (1984) Cell 38:879-887); la mutagénesis utilizando cepas hospederas deficientes de reparación (Cárter y colaboradores. (1985) Nucí Acids Res 13:4431-4443; and Cárter (1987) Methods Enzymol 154:382-403); mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh and Henikoff (1986) Nucí Acids Res 14:5115); restricción-selección y restricción-purificación (Wells y colaboradores. (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423); mutagénesis mediante la síntesis de gen total (Nambiar y colaboradores. (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) Nucí Acids Res 14:6361-6372; Wells y colaboradores. (1985) Gene 34:315-323 and Grundstrom y colaboradores. (1985) Nucí Acids Res.13 : 3305-3316) ; reparación de rompimiento de doble hebra (Mandecki (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:7177-7181; and Arnold (1993) Curr Op Biotech 4:450-455). Los ácidos nucleicos se pueden recombinar in vitro mediante cualquier técnica o combinación de técnicas que incluyen, por ejemplo, la digestión de DNAse de ácidos nucleicos para ser recombinados seguido por la ligación y/o de ensamble de PCR de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, la mutagénesis de PCR sexual se puede utilizar en la cual la fragmentación de la molécula de DNA seguida por la recombinación in vitro, basado en la similitud de secuencia, entre moléculas de DNA, con secuencias del DNA diferentes pero relacionadas, seguido por la fijación del cruzamiento por la extensión en una reacción en cadena polimerasa. De manera similar los ácidos nucleicos se pueden recombinar recursivamente in vivo, por ejemplo, al permitir que ocurra la recombinación entre ácidos nucleicos en las células. Tales formatos opcionalmente proporcionan recombinación directa entre los ácidos nucleicos de interés, o proporcionar recombinación entre constructos, vectores, virus y/o plásmidos que comprenden los ácidos nucleicos de interés. Los métodos de recombinación de genoma completo también se pueden utilizar en donde genomas completos de células u otros organismos se recombinan, opcionalmente incluyendo el espigado de las mezclas de recombinación genómicas con componentes de librería deseado. Estos métodos^ tienen muchas aplicaciones, incluyendo aquellos en los cuales la identidad de un gen objetivo no es conocida. Cualquiera de estos procesos se puede utilizar solo en combinación para generar polinucleotidos que codifican polipéptidos SuR. Cualquiera de los métodos de generación de diversidad se puede utilizar en un aspecto reiterativo, utilizando uno o más ciclos de mutación/recombinación u otros métodos de generación de diversidad, opcionalmente seguido por uno o más métodos de selección para generar ácidos nucleicos recombinantes adicionales .

Por conveniencia y alto rendimiento frecuentemente será deseable clasificar/seleccionar ácidos nucleicos modificados deseados en un microorganismo, tal como una bacteria tal como E. coli, o eucariota unicelular tal como levadura incluyendo S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris o protistas tal como Clamidomonas , o en un sistema de célula modelo tal como SF9, Hela, CHO, BMS, BY2 u otros sistemas de cultivo celular. En algunos casos, la clasificación en células de plantas o plantas puede ser deseable, incluyendo sistemas de célula de planta o cultivo de plantas o sistemas de planta modelo tal como Arabidopsis, o tabaco. En algunos ejemplos el rendimiento se incrementa al clasificar las acumulaciones de células hospederas que expresan diferentes ácidos nucleicos modificados, ya sea solo o .como parte de un constructo de fusión génica. Cualquiera de las acumulaciones que muestran actividad significante se pueden desarrollar para identificar clones individuales que expresan la actividad deseable.

Los constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de SuR son proporcionados. Los constructos comprenden un vector, tal como, un plásmido, cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) o los similares, en los cuales son polinucleótido que codifica un polipéptido SuR se ha insertado. En algunos ejemplos, el constructo además comprende secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operablemente enlazado a la secuencia. Los vectores adecuados son bien conocidos e incluyen secuencias cromosómicas , no cromosómicas y de DNA sintético, tales como derivado de SV40; plásmidos bacterianos; replicones; DNA de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmido y DNA de fago, DNA viral tal como vacinia, adenovirus, virus fowl pox, seudorabia, adenovirus, virus adenoasociados , retrovirus, geminivirus, TMV, PVX, otros virus de plantas, plásmidos Ti, plásmidos Ri y muchos otros.

Los vectores opcionalmente pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un atributo fenotipico para la selección de células hospederas transformadas. Usualmente, el gen marcador seleccionable codificará la resistencia a antibiótico o herbicida. Los genes adecuados incluyen aquellos que codifican para la resistencia al antibiótico espectinomicina o estreptomicina (por ejemplo, el gen aadA) , el gen estreptomicina fosfotransferasa (SPT) para resistencia estreptomicina, el gen neomicina fosfotransferasa (NPTII o NPTIII) o resistencia geneticina, el gen fosfotransferasa (HPT) para la resistencia a higromicina. Los genes marcadores seleccionables adicionales incluyen dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo células eucariótico y resistencia a tetraciclina o ampicilina. Los genes que codifican para resistencia herbicida incluyen aquellos que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), EPSPS, GOX, o GAT que proporcionan resistencia a glifosato, ALS mutante (acetolactato sintasa) que proporciona resistencia a los herbicidas de tipo sulfonilurea o cualquiera de otros genes conocidos .

En sistemas bacterianos un número de vectores de expresión están disponibles. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tal como BLUESCRIPT ( Stratagene) ; vectores pIN (Van Heeke and Schuster, (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison Wis.) y los similares. De manera similar, en S. cerevisiae un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tal como al factor alfa, alcohol oxidasa PGH se puede utilizar para la producción de polipéptidos . Para revisiones, ver Ausubel and Grant y colaboradores. (1987) Meth Enzymol 153:516-544. Una variedad de sistemas de expresión se pueden utilizar en células hospederas mamiferas, incluyendo sistemas de base viral, tal como adenovirus y sistemas de virus de sarcoma de rous (RSV) . Cualquier número de sistemas de expresión, comercialmente o públicamente disponibles o derivados de los mismos se pueden utilizar.

En células de plantas la expresión se puede inducir de un cásete de expresión integrado en un cromosoma de planta, o un organelo o citoplásmicamente de un ácido nucleico episomal o viral. Numerosas secuencias reguladoras derivadas de plantas se han descrito, incluyendo secuencias que dirigen la expresión en una manera especifica de tejido, por ejemplo, TobRB7, B33 de patatina, promotores de gen GRP, el promotor rbcS-3A y los similares. Alternativamente, la expresión de alto nivel se puede lograr al expresar transsientemente secuencias exógenas de un vector viral de planta, por ejemplo, TMV, BMV, geminivirus incluyendo WDV y los similares.

Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son conocidos incluyendo vectores derivados del plásmido de inducción de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers y colaboradores. (1987) Meth Enzymol 153:253-277. Los vectores de A. tumefaciens ejemplares incluyen los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl y colaboradores. (1987) Gene 61:1-11 and Berger y colaboradores. (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:8402-8406 y el plásmido pB101.2 es disponible de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.) . Una variedad de virus de plantas conocidos se pueden emplear como vectores incluyendo virus de mosaico de coliflor (CaMV) , geminivirus, virus de mosaico de bromo y virus de mosaico de tabaco.

El SuR se puede utilizar para controlar la expresión de un polinucleótido de interés. El polinucleótido de interés puede ser cualquier secuencia de interés, incluyendo pero no limitadas a secuencias que codifican un polipéptido, que codifica un mRNA, que codifica un precursor de RNAi, que codifica un agente de RNAi antivo, un miRNA, un polinucleótido de antisentido, una ribozima, una proteína de fusión, un vector replicante, un marcador clasificable y los similares. La expresión del polinucleótido de interés se puede utilizar para inducir la expresión de un RNA de codificación y/o polipéptido, o a la inversa para suprimir la expresión de un RNA codificado, secuencias objetivo de RNA y/o polipéptido. En ejemplos específicos, la secuencia de polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una hormona de planta, proteína de defensa de planta, una proteína de transporte de nutrientes, una proteína de asociación biótica, un atributo de entrada deseable, un atributo de salida deseable, un gen de resistencia estrés, un gen de resistencia herbicida, un gen de resistencia enfermedad/patógeno, un esterilidad masculina, un gen de desarrollo, un gen regulador, un gen de reparación de DNA, un gen regulador transcripcional y cualquier otro polinucleótido y/o polipéptido de interés.

Un número de promotores se pueden utilizar en las composiciones y métodos. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido SuR se puede enlazar operablemente a un promotor constitutivo, preferido de tejido, inducible, de desarrollo, temporalmente y/o espacialmente regulado u otros promotores que incluyen aquellos de virus de plantas u otros patógenos que funcionan a una célula de planta. Una variedad de promotores útiles en la planta es revisado en Potenza y colaboradores. (2004) In Vitro Cell Dev Biol Plant 40:1-22.

Cualquier polinucleótido, incluyendo polinucleótidos de interés, polinucleótidos que codifican SuRs, regiones reguladoras, intrones, promotores que comprenden secuencias TetOp se pueden obtener y sus secuencias de nucleótido determinada, mediante cualquier método estándar. Los polinucleótidos pueden ser sintetizados químicamente en su longitud completa o ensamblados de oligonucleótidos químicamente sintetizados (Kutmeier y colaboradores. (1994) BioTechniques 17:242). El ensamble de oligonucleótidos típicamente involucra la síntesis de oligonucleótidos sobrepuestos, recocido y ligación de esos oligonucleótidos y amplificación por PCR de producto ligado. Alternativamente, un polinucleótido se puede aislar o generar de una fuente adecuada incluyendo la fuente adecuada de una librería de cDNA generada de tejidos células con una librería genómica, o directamente aislados de un hospedero mediante amplificación de PCR utilizando cebadores específicos a los extremos 3' y 5' de la secuencia o al clonar utilizando una sonda de nucleótidos específica para el nucleótido de interés. Las moléculas de ácido nucleico amplificadas generadas por PCR luego se pueden clonar en vectores de clonación replicables utilizando métodos estándares. El polinucleótido además se puede manipular utilizando cualquiera de los métodos estándares incluyendo técnicas de DNA recombinantes , construcción de vector, mutagénesis y PCR (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y colaboradores., Eds . (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY) .

Cualquier método para introducir una secuencia en una célula u organismo se puede utilizar, mientras que el polinucleótido o polipéptido gane acceso al interior de por lo menos una célula. Los métodos para introducir secuencias en plantas son conocidos e incluyen, pero no están limitados a, transformación estable, transformación transiente, métodos mediados por virus, y reproducción sexual. Establemente incorporado indica que el polinucleótido introducido se integra en un genoma y es capaz de ser heredado por la progenie. La transformación transiente indica que una secuencia introducida no se integra en un genoma tal que es heredable por la progenie del hospedero. Cualquier medio se puede utilizar para llevar conjuntamente un SuR y el polinucleótido de interés operablemente enlazado a un promotor que comprende TetOp incluyendo, por ejemplo, transformación estable, suministro transiente, fusión de célula, cruzamiento sexual o cualquier combinación de los mismos.

Los protocolos de transformación asi como protocolos para introducir polipéptidos o secuencias de polinucleótido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para introducir polipéptidos y polinucleótidos en células de planta incluyen la microinyección (Crossway y colaboradores. (1986) Biotechniques 4:320-334 y la Patente Norteamericana Número 6,300,543), electroporación (Riggs y colaboradores. (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:5602-5606, transformación medida por Agrobacterium (Patente Norteamericana Números 5,563,055 y 5,981,840), transferencia génica directa (Paszkowski y colaboradores. (1984) EMBO J 3:2717-2722) , aceleración de partículas balísticas (Patente Norteamericana Números 4,945,050, 5, 879,918, 5, 886, 244 y 5, 932, 782; Tomes y colaboradores. (1995) in Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe y colaboradores. (1988) Biotechnology 6:923-926). También ver, Weissinger y colaboradores. (1988) Ann Rev Genet 22:421-477 ; Sanford y colaboradores. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37; Christou y colaboradores. (1988) Plant Physiol 87:671-674; Finer and McMullen (1991) In Vitzo Cell Dev Bíol 27P: 175-182 (soja); Singh y colaboradores. (1998) Theor Appl Genet 96:319-324; Datta y colaboradores. (1990) Biotechnology 8:736-740; Klein y colaboradores. (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:4305-4309; Klein y colaboradores. (1988) Biotechnology 6:559-563; Patente Norteamericana Números 5,240,855, 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores. (1988) Plant Physiol 91:440-444; Fromm y colaboradores. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores. (1984) Nature 311:763-764; Patente Norteamericana Número 5,736,369; Bytebier y colaboradores. (1987) Proc Nati Acad Sci USA 84:5345-5349; De et y colaboradores. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores. (Longman, New York), pp. 197-209; Kaeppler y colaboradores. (1990) Plant Cell Rep 9:415-418; Kaeppler y colaboradores. (1992) Theor Appl Genet 84:560-566; D'Halluin y colaboradores. (1992) Plant Cell 4:1495-1505; Li y colaboradores. (1993) Plant Cell Rep 12:250-255; Christou and Ford (1995) Ann Bot 75:407-413 and Osjoda y colaboradores. (1996) Nat Biotechnol 14:745-750. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden introducir en plantas al poner en contacto las plantas con un virus, o ácidos nucleicos virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas por la via de moléculas de DNA o RNA virales son conocidos, ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Números 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931 y Porta y colaboradores. (1996) Mol Biotech 5:209-221.

El término planta incluye células de planta, protoplastos de planta, cultivos de tejido de células de planta de la cual una planta se puede regenerar, callos de planta, agrupaciones de plantas y células de plantas que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruto, núcleos, mazorcas, elotes, farfollas, tallos, raices, puntas de raíz, anteras y los similares. También se incluyen la progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas.

En algunos ejemplos, un SuR se puede introducir en una plástida, ya sea mediante la transformación de la plástida o al dirigir un transcripto o polipéptido de SuR en la plástida. Cualquier método de transformación, enucleado de plástida se puede utilizar, dependiendo del producto y/o uso deseado. La transformación de plástida proporciona ventajas incluyendo la expresión transgénica alta, control de expresión de transgén, habilidad para expresar mensajes policistrónicos, integración especifica del sitio por la vía de recombinación homologa, ausencia de silenciamiento de transgén y efectos de posición, control de transmisión de transgén por la vía de la herencia de gen de plástida uni parental y la secuestración de polipéptidos expresados en la organela que pueden obviar los impactos adversos posibles sobre los componentes citoplásmicos (por ejemplo, ver, las revisiones que incluyen Heifetz (2000) Biochimie 82:655-666; Daniell y colaboradores. (2002) Trends Plant Sci 7:84-91; Maliga (2002) Curr Op Plant Biol 5:164-172; Maliga (2004) Ann Rev Plant ¦ Biol 55-289-313; Daniell y colaboradores. (2005) Trends Biotechnol 23:238-245 and Verma and Daniell (2007) Plant Physiol 145:1 129-1 143) .

Métodos y composiciones para transformación de plástida son bien conocidos, por ejemplo, los métodos de transformación incluyen (Boynton y colaboradores. (1988) Science 240:1534-1538; Svab y colaboradores. (1990) Proc Nati Acad Sci USA 87:8526-8530; Svab y colaboradores. (1990) Plant Mol Biol 14:197-205; Svab y colaboradores. (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:913-917; Golds y colaboradores. (1993) Bio/Technology 11:95-97; O'Neill y colaboradores. (1993) Plant J 3:729-738; Koop y colaboradores. (1996) Planta 199:193-201; Kofer y colaboradores. (1998) In Vitro Plant 34:303-309; Knoblauch y colaboradores. (1999) Nat Biotechnol 17:906-909); asi como vectores de transformación de plástida, elementos y selección (Newman y colaboradores. (1990) Genetics 126:875-888; Goldschmidt-Clermont , (1991) Nucí Acids Res 19:4083-4089; Carrer y colaboradores. (1993) Mol Gen Genet 241:49-56; Svab y colaboradores. (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:913-917; Verma and Daniell (2007) Plant Physiol 145:1 129-1143) .

Métodos y composiciones para controlar la expresión génica en plástidas son bien conocidos incluyendo (McBride y colaboradores, (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:7301-7305; Lossl y colaboradores, (2005) Plant Cell Physiol 46:1462- 1471; Heifetz (2000) Biochemie 82:655-666; Surzycki y colaboradores, (2007) Proc Nati Acad Sci USA 104:17548-17553; patentes norteamericanas Números 5,576,198 y 5,925,806; WO 2005/0544478), asi como métodos y composiciones para importar polinucleotidos y/o polipéptidos en una plástida, incluyendo la fusión traduccional a un péptido de tránsito (por ejemplo, Comai y colaboradores, (1988) J Biol Chem 263:15104-15109).

Los polinucleotidos y polipéptidos SuR proporcionan · un medio para regular la expresión génica de la plástida por la vía de un inductor químico que fácilmente entra a la célula. Por ejemplo, utilizando el sistema de expresión T7 para cloroplastos (McBride y colaboradores, (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:7301-7305) el SuR podría ser utilizado para controlar la expresión de T7 polimerasa nuclear. Alternativamente, un promotor regulado de SuR podría ser integrado en el genoma de la plástida y operablemente enlazado al polinucleótido ( s ) de interés y el SuR expresado e importado del genoma nuclear, o integrado en la plástida. En todos los casos, la aplicación de un compuesto de sulfonilurea se utiliza para regular eficientemente el polinucleótido (s) de interés.

Cualquier tipo de célula y/u organismo, procariótico o eucariótico, se puede utilizar con los métodos y composiciones de SuR. Por ejemplo, cualquier sistema celular bacteriano puede ser transformado con las composiciones. Por ejemplo, los métodos de E. coli, Agrobacterium y otra transformación celular bacteriana, preparación de plásmido y el uso de fagos se detallan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, y colaboradores, (eds.) (1994), una empresa asociada entre Greene Publishing Associates, Inc. y John iley & Sons, Inc . ) .

Los sistemas SuR se puede utilizar con cualquier linea celular eucariótica, incluyendo levaduras, protistas, algas, células de insecto, células de ave o mamiferas. Por ejemplo, muchas cepas comercialmente y/o públicamente disponibles de S. cerevisiae están disponibles, como son los plásmidos utilizados para transformar estas células. Por ejemplo, las cepas están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) e incluyen el inventario del Centro de Extracto Genético de Levadura, que se movió a ATCC en 1998. Otras lineas de levadura, tales como S. pombe y P. pastoris, y los similares también están disponibles. Por ejemplo, los métodos de transformación de levadura, preparación de plásmido y los similares se detallan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, (eds.) (1994), una empresa asociada entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., ver la Unidad 13 en particular) . Los métodos de transformación para levadura incluyen la transformación de esferoplasto, electroporación y métodos de acetato de litio. Un método de transformación de alta eficiencia, versátil para la levadura es descrito por Gietz y oods ((2002) Methods Enzymol 350:87-96) utilizando acetato de litio, PEG 3500 y DNA portador.

Los SuRs se pueden utilizar en células mamiferas, tales como CHO, HeLa, BALB/c, fibroblastos, células madre embriónicas de ratón y los similares. Muchas líneas de células competentes comercialmente disponibles y plásmidos son bien conocidos y fácilmente disponibles, por ejemplo de la ATCC (Manassas, VA) . Los polinucleótidos aislados para transformación y transformación de células mamiferas se pueden hacer mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los métodos de mamíferos y otra transformación de célula eucariótica, preparación de plásmido y el uso de virus son detallados, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, (eds.) (1994), una empresa asociada entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., ver, la Unidad 9 en particular) . Por ejemplo, muchos métodos están disponibles, tal como la transfección de fosfato de calcio, electroporacion, transfección de DEAE-dextrano, transfección mediada por liposoma, microinyección asi como técnicas virales .

Cualquier especie de planta se puede utilizar con los métodos y composiciones SuR, incluyendo, pero no limitadas a, monocotiledoneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas incluyen, pero no están limitadas a, maíz (Zea mays) , Brassica spp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), resino, palma, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorgo bicolor, Sorgo vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra (Setaria itálica), mijo extendido (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus) , cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo (Triticum aestivum) , soja (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (), cacahuates (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea batatus) , cassava (Manihot esculenta) , café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera) , piña (Ananas comosus) , árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea) , papaya (Carica papaya) , anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia [Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus- amygdalus) , betabeles (Beta vulgaris) , caña de azúcar {Saccharum spp. ) , Arabidopsis thaliana, avenas {Avena spp.), cebada {Hordeum spp. ) , plantas leguminosas tales como frijoles, guar, algarroba, fenegreco, frijoles de jardín, caupí, mungo, haba, lentajas y garbanzo, vegetales, plantas ornamentales, hierbas y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), frijoles verdes (Phaseolus vulgaris) , habas (Phaseolus limensis) , gruisantes (Pisium spp., Lathyrus spp.), y especies de Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón amarillo (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea {Rhododendron spp. ) , hidrángea {Macrophylla hydrangea) , hibisco {Hibiscus rosasanensis) , rosas {Rosa spp.), tulipanes {Tulipa spp.), narcisos {Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel {Dianthus caryophyllus) , poinsetia {Euphorbia pulcherrima) , y crisantemo. Las coniferas incluyen pinos, por ejemplo, pino de incienso {Pinus taeda) , pino largo {Pinus elliotii) , pino ponderosa {Pinus ponderosa) , pino lodgepole {Pinus contorta), y pino Monterey {Pinus radia ta) , aveto Douglas (Pseudotsuga menziesii) ; aveto del Occiednete {Tsuga canadensis) , aveto Sitka {Picea glauca), madera roja {Sequoia sempervirens) , abetos reales tal como abeto plateado {Abies amabilis) y aveto de bálsamo (A ies balsamea) y cedros tal como el cedro rojo del Occidente (Thuja plicata) y cedro amerillo de Alaska {Chamaecyparis nootkatensis) .

Las células de plantas y/o tejido que1 se han transformado se pueden cultivar en plantas utilizando métodos convencionales (ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Rep 5:81-84). Estas plantas luego pueden ser cultivadas y polinizadas, retrocruzadas y/o cruzadas exteriormente, y la progenie resultante que tiene la característica deseada identificada. Dos o más generaciones se pueden cultivar para asegurar que la característica sea establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas. De esta manera las semillas transformada/transgénica que tiene un constructo de DNA que comprende un polinucleótido de interés y/o un polinucleótido modificado que codifica un SuR establemente incorporado en su genoma son proporcionadas. Una planta y/o una semilla que tiene incorporado establemente el constructo de DNA además puede ser caracterizado para expresión, agronomía y número de copias.

La identidad de secuencia se puede utilizar para comparar la estructura primaria de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, describir la estructura primaria de una primera secuencia con relación a una segunda secuencia y/o describir relaciones de secuencia tales como variantes y homólogos. La identidad de secuencia media los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima. Las relaciones se secuencia se pueden analizar utilizando algoritmos implementados en computadora. La relación de secuencia entre dos o más polinucleótidos o dos o más polipéptidos se pueden determinan al calcular la mejor alienación de las secuencias y al registrar las igualaciones y los espacios en la alineación, lo cual produce el por ciento de identidad de secuencia y el por ciento de similitud de secuencia. Las relaciones de polinucleótidos también pueden ser descritas basadas en una comparación de los polipéptidos que cada uno codifica. Muchos programas y algoritmos para comparación y análisis de secuencias son conocidos. A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 (GCG, Accelrys, San Diego, CA) utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando Ponderación de GAP de 50 Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de registro; nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de GAP de 8 y la Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:10915-10919). GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J Mol Biol 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios.

Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos se pueden evaluar utilizando otras herramientas de secuencia. Por ejemplo, los polinucleótidos y/o polipéptidos se pueden evaluar utilizando una herramienta de alineación BLAS . Una alineación local de espacios consiste simplemente de un par de segmentos de secuencia, uno de cada una de las secuencias que es comparada. Una modificación de los algoritmos de Smith- aterman o Sellers encontrará todos los pares de segmentos cuyo registros no pueden ser mejorados por la extensión o recorte, llamados pares de segmento de alto registro (HSPs) . Los resultados de las alineaciones BLAST incluyen medidas estadísticas para indicar la probabilidad de que el registro BLAST puede ser esperado de la oportunidad solamente. El registro en bruto, S, se calcula del número de espacios y sustituciones asociadas con cada secuencia alineada en donde registros de similitud más alta indica una alineación más significante. Los registros de sustitución se dan por una tabla de uso (ver PAM, BLOSUM) . Los registros de espacio son típicamente calculados como la suma de G, la sanción de abertura de espacio y L, la sanción de extensión de espacio. Para un espacio de longitud n, el costo de espacio sería G+Ln. La elección de costos de espacio, G y L es empírico, pero es usual elegir un valor alto para G (10-15) y un valor bajo para L (1-2). El registro de citreos, S' , se deriva del registro de alineación en bruto S en el cual las propiedades estadísticas del sistema de registro utilizados se han tomado en cuenta. Los registros de vitreo se normalizan con respecto al sistema de registro, por lo . tanto se pueden utilizar para comparar registros de alineación de diferentes búsquedas. El Valor E, o valor esperado, describe la probabilidad de que una secuencia con un registro similar ocurrirá en la base de datos por oportunidad. Es una predicción del número de diferentes alineaciones con registros equivalentes a o mejores que S que sean esperados que ocurran en una búsqueda de base de datos por oportunidad. Entre más pequeño es el Valor de E, más significante es la alineación. Por ejemplo, una alineación que tiene un valor de E de e"117 significa que una secuencia con un registro similar es muy improbable que ocurra simplemente por oportunidad. Adicionalmente, el registro esperado para alinear un par aleatorio de aminoácidos se requiere que sea negativo, de otra manera alineaciones largas tendrían que tener registro alto independientemente de si los segmentos alineados estuvieron¦ relacionados . Adicionalmente, el algoritmo BLAST utiliza una matriz de sustitución apropiada, nucleótido o aminoácido y para alineaciones espaciadas utiliza sanciones de creación y extensión de espacio. Por ejemplo, la alineación BLAST y la comparación de secuencias des polipéptido típicamente se han utilizando la matriz BLOSU 62, una sanción de existencia de espacio de 11 y una sanción de extensión de espacio de 1. A menos que se establezca de otra manera, los registros reportados de los análisis BLAST se hicieron utilizando la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11 y una sanción de extensión de espacio de 1.

La base de datos de secuencia de proteína UniProt es un depositario para los datos de proteína funcional y estructural y proporciona una base de conocimiento de secuencia de proteína estable, comprensiva, ' completamente clasificada, ricamente y precisamente anotada, con referencias cruzadas extensivas e interfaces de interrogación libremente accesibles a la comunidad científica. El sitio UniProt tiene una herramienta, UniRef, que proporciona una agrupación de proteínas que tiene 50%, 90% o 100% de identidad de secuencia a una secuencia de proteína de interés de la base de datos. Por ejemplo, utilizando TetR(B) (referencia de UniProt P04483) se da una agrupación de 18 proteínas que tienen 90% de identidad de secuencia a P04483.

RefiD Nombre de la Proteina Especies Longitud P04483 TetR clase B del E. coli 207 transposón TnlO B1VCF0 Proteína TetR E. coli 208 A0ZSZ1 Represor de gen Photobacterium sp. 208 resistente a TC21 tetraciclina A4LA82 Proteína represora de Edwardsiella tarda 208 tetraciclina A4CV9K4 Represor de Salmonella entérica 208 tetraciclina A8R6K3 Proteína represora de Salmonella entérica • 208 tetraciclina subsp. Entérica serovar Choleraesuis Q573N4 Proteína represora de Uncultured bacterium 208 Q7BQ37 TetR Shigella flexneri 208 Q9S455 TetR Salmonella typhi 208 A41U15 Proteína R represora Yersinia ruckeri 207 de tetraciclina, clase B Q1A2K5 Proteína represora de E. coli 207 resistencia a tetraciclina Q6MXH5 TetR clase B de Serratia marcescens 207 transposón tnlO Q70VX4 Proteína TetR Salmonella 207 typhimurium Q7AZW7 Proteína represora Pasteurella 207 Tet aerogenes Q7AK84 Represor del operón Plasmid R100 . 207 tet Q6QR72 Proteina represora de E. coli 208 tetraciclina Q93F26 Represor de tet Shigella flexneri 2a 208 Q8L0M9 Proteína represora de Neisseria 205 tetraciclina putativa meningitidis Estas secuencias de proteínas se pueden utilizar como fuentes para diversidad de secuencia para el diseño de proteína y/o evolución dirigida del dominio de enlace de ligando. Además, estas secuencias de proteína se pueden utilizar como fuentes para dominios de enlace operadores para proteínas represoras quiméricas o para el diseño y/o evolución del dominio de enlace operador.

Las propiedades, dominios, porciones y función del represor de tetraciclina son bien conocidos, como son las técnicas estándares y ensayos para evaluar cualquier represor derivado que comprende una o más sustituciones de aminoácido. La estructura de la proteína TetR clase D comprende 10 alfa hélice con circuitos y vueltas de conexión. Las 3 hélices N-terminales forman el dominio HTH de enlace de DNA, que tiene orientación inversa como es comparado .con las porciones HTH en otras proteínas de enlace de DNA. El núcleo de la proteína, formado por hélices 5-10, comprende el dominio de interface de dimerización, y para cada monómero comprende la cavidad de enlace para ligando/efector y el cofactor de catión divalente (Kisker y colaboradores, (1995) J Mol Biol 247:260-180; Orth y colaboradores, (2000) Nat Struct Biol 7:215-219) . Cualquier cambio de aminoácido puede comprender una sustitución de aminoácido no conservativa o conservativa. Las sustituciones conservativas generalmente se refieren al intercambio de un aminoácido con otro que tienen propiedades químicas y/o estructurales similares (ver, por ejemplo, Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, Nati Biomed Res Found, Washington, DC) . Diferente agrupación de aminoácidos por similitud se ha desarrollado dependiendo de la propiedad evaluada, tal como acídico contra básico, polar contra no polar, anfipático y los similares y es utilizada cuando se evalúa en el efecto posible de cualquier sustitución o combinación de sustituciones.

Numerosas variantes de TetR se han identificado y/o derivado y estudiado extensivamente. En el contexto del sistema represor de tetraciclina, los efectos de varias mutaciones, modificaciones y/o combinaciones de los mismos se han utilizado para caracterizar extensivamente y/o modificar las propiedades de los represores de tetraciclina, tal como el enlace de cofactor, constantes de enlace de ligando, cinética y constante de disociación, restricciones de secuencia de enlace operadora, cooperatividad, constantes de enlace, cinética y constante de disociación de actividades y propiedades de la proteina de fusión. Las variantes incluyen variantes TetR con un fenotipo inverso de enlace de la secuencia operadora en la presencia de tetraciclina o un análogo de la misma, las variantes que tienen propiedades de enlace operadoras alteradas, variantes que tienen especificidad de secuencia operadora alterada y variantes que tienen especificidad de ligando alterada y proteínas de fusión. Ver, por ejemplo, Isackson y Bertrand (1985) Proc Nati Acad Sci USA 82:6226-6230; Smith y Bertrand (1988) J Mol Biol 203:949-959; Altschmied y colaboradores, (1988) EMEO J 7:4011-4017; Wissmann y colaboradores, (1991) EMBO J 10:4145-4152; Baumeister y colaboradores, (1992) J Mol Biol 226:1257-1270; Baumeister y colaboradores, (1992) Proteins 14:168-177; Gossen y Bujard (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:5547-5551; Wasylewski y colaboradores, (1996) J Protein Chem 15:45-58; Berens y colaboradores, (1997) J Biol Chem 272:6936-6942; Barón y colaboradores, (1997) Nucí Acids Res 25:2723-2729; Helbl y Hillen (1998) J Mol Biol 276:313-318; Urlinger y colaboradores, (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97:7963-7968; Kamionka y colaboradores, (2004) Nucí Acids Res 32:842-847; Bertram y colaboradores, (2004) J Mol Microbiol Biotechnol 8:104-1 10; Scholz y colaboradores, (2003) J Mol Biol 329: 217-227; y la publicación de patente US 2003/0186281.

Las estructuras tridimensionales de represores de tetraciclina, y variantes represores de tetraciclina, acopladas al ligando y/o co-factor(s) y enlazas a la secuencia operadora son conocidas (ver, por ejemplo, Kisker y colaboradores, (1995) J Mol Biol 247:260-280; Orth y colaboradores, (1998) J Mol Biol 279:439-447 ; Orth y colaboradores, (1999) Biochemistry 38:191-198; Orth y colaboradores, (2000) Nat Struct Biol 7:215-219; Luckner y colaboradores, (2007) J Mol Biol 368:780-790) que proporcionan estructura ( s ) extremadamente bien caracterizadas, identificación de dominios y aminoácidos individuales asociados con varias funciones y propiedades de enlace, y modelo (s) predictivo para los efectos potenciales de cualquier sustitución (es) de aminoácido asi como las posibles enlaces estructurales para el fenotipo (s) de mutantes represores de tetraciclina conocidos. Un ejemplo de por ciento de identidad de secuencia observado con los miembros de la familia represora de tetraciclina se muestra enseguida . % de identidad de secuencia de polipéptido entre los miembros de la familia TetR TetR Clase A (P03038) E (P21337) B (P04483) D (P0ACT4) H (P51561) A (P030038) 100 44 51 48 50 E (P21337) 100 51 49 50 B 100 64 64 (P04483) 100 D ( P0ACT4 ) 58 H (P51561) 100 EJEMPLOS EJEMPLO 1: Evolución de TetR para el reconocimiento por compuestos de sulfonilurea A. Modelación computacional Las estructuras de cristal 3-D del represor de tetraciclina clase D (aislado de E. coli; dimero enlazado a TET, 1DU7 (Orth y colaboradores, (2000) Nat Struct Biol 7:215-219); y dimero enlazado a DNA, 1QPI (Orth y colaboradores, (2000) Nat Struct Biol 7:215-219)), se utilizaron como la estructura de diseño para el reemplazo computacional de la molécula de tetraciclina (TET) mediante la molécula de tifensulfurón-metilo (Ts, Harmony®) en la cavidad de enlace de ligando. TET y sulfonilureas (Süs) son generalmente similares en tamaño y tienen estructuras basadas en anillo aromático con donadores y aceptores de enlace de hidrógeno, que permiten potencialmente el enlace de SU a un TetR mutada. Sin embargo, hay diferencias notables entre la familia de tetraciclina y la familia de moléculas SU. TET es internamente rígido y casi plano, con una cara de altamente enlace de hidrógeno con hidroxilo y cetonas, logP ~ -0.3. Las sulfonilureas (SUs) son más altamente flexible y aromáticas, con una porción de sulfonil-urea de núcleo que conecta típicamente un benceno, piridina o tiofeno sustituido (como en el caso de Harmony®) en un lado con una pirimidina sustituida o 1, 3, 5-triazina en el otro lado. Aunque tienen diferentes grupos funcionales, el logP de HarmonyCD es similar (-0.02 a pH 7) a aquel de tet . Una molécula Harmony® mejor propuesta se posicionó mediante la modelación molecular en la cavidad de enlace TetR in silico (Figura 1) . Basado en este modelo, diecisiete posiciones de residuo de aminoácido (60, 64, 82, 86, 100, 104, 105, 113, 1 16, 134, 135, 138 y 139 del monómero A y las posiciones 147, 151, 174 y 177 del monómero B, utilizando la numeración de TetR(B)) se determinaron que están en proximidad suficientemente estrecha a un Harmony® acoplado para ser reclutado en una superficie de enlace. La optimización de cadena lateral computacional se empleó para diseñar conjuntos de aminoácidos en cada una de las 17 posiciones consideradas que son más compatibles con el enlace de SU. Esto da por resultado una librería con (4, 5, 4, 4, 5, 3, 8, 11, 10, 10, 8, 8, 7, 9, 6, 7 y 5) aminoácidos en las 17 posiciones, para un tamaño de librería diseñado total de 4 x 1013. La elección de aminoácidos en las posiciones de librería fue dictado por las consideraciones estéricas y fisicoquímicas para ajustar el acoplamiento de ligando en la cavidad de ligando.

El TetR case B de tipo silvestre del TnlO se eligió como la molécula de partida para la generación de derivados de entremezclado (SEQ ID NO: 2). Es ligeramente diferente en la secuencia utilizada en el diseño compacto computacional (P0ACT4, clase D, para la cual la estructura de cristal de alta resolución 1DU7 está disponible) , pero solo sutilmente afecta el enlace de ligando. Una comparación de TetR('D) (SEQ ID NO:401) y TetR(B) (SEQ ID N0:2) se muestra enseguida con posiciones involucradas en el reconocimiento de tet y el enlace en negritas: 1 1DU7 SRLNRESVIDAALELLNETGIDGLTTRKLAQKLGIEQPTLYWHVKNKRALLDALAVEI Clase B MGSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEM 61 . . . . 1DU7 LARHHDYSLPAAGESWQSFLRNNAMSFRRALLRYRDGAKVHLGTRPDEKQYDTVETQLRF Clase B LDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGA VHLGTRPTEKQYETLENQLAF 121 . . . . . 1DU7 MTENGFSLRDGLYAISAVSHFTLGAVLEQQEHTAALTDRPAAPDENLPPLLREALQIMDS Clase B LCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDH 181 . . 208 1DU7 DDGEQAFLHGLESLIRGFEVQLTALLQIV Clase B QGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGS- El polinucleótido de partida utilizado para expresar TetR se sintetizó comercialmente y sitios de restricción se adicionaron para la funcionalidad de la construcción de la librería y además la manipulación (DNA2.0, Menlo Park, California, USA) . Los sitios de restricción adicionados incluyen un sitio ?/coI en el extreme 5' , un sitio SacI 5' del dominio de enlace de ligando (LBD) y un sito AscI después del codón de detención. Esto permite que la construcción de librería sea localizada en un segmento de DNA de ~480 bp que contiene la región de enlace de ligando pa5a evitar mutaciones inadvertidas en las otras regiones, tal como el dominio de enlace de DNA. El gen sintético se enlazó operablemente corriente debajo de un promotor inducible a arabinosa, PBAD> utilizando Ncol/AscI para crear el vector de expresión TetR de pVER7314 (Fig. 2). La adición del sitio Ncol en el extreme 5' de la región de codificación dio por resultado la inserción de una glicina después de la metionina N-terminal en la posición de aminoácido uno (SEQ ID NO:2). Esta secuencia se utilizó como el control TetR de tipo silvestre en todos los ensayos a menos que se mencione de otra manera, y la actividad observada fue equivalente a TetR sin la inserción de serina (SEQ ID NO:l). Sin embargo, todas las referencias a las posiciones de aminoácido y cambios diseñados y uso observado el uso de la numeración de aminoácido de TetR (B) de tipo silvestre (207 aa) por ejemplo, SEQ ID NO: 1.

B. Diseño de la librería Debido al gran número de sustituciones diseñadas en muchas posiciones en estrecha proximidad entre sí a la librería calculada (Tabla 1, Librería Diseñada) no fue fácilmente codificable con un número pequeño de codones degenerados. Esto es particularmente evidente en regiones de secuencia tales como aminoácidos 134, 135, 138 y 139, que razonablemente podrían ser codificados por un solo cebador. Por esta razón, la librería de secuencias fabricada y probada en el laboratorio caracterizó el conjunto de aminoácidos diseñado en las posiciones 6/17, ligeramente agrandado en las posiciones 1/17 y completamente degenerado (codón NNK) en las posiciones 10/17 (Tabla 1) . Esto dio por resultado una diversidad de secuencia predicha mucho más alta, un total de 3 x 1019 secuencias.

TABLA 1.

Residuo Residuo WT Librería Librería Diseñada Actual 60 L A L K M A L K M 64 H A N Q H L A N Q H L 82 N A N S T A N S T 86 F M F W Y M F W Y 100 H H F W Y AII 20 aa's 104 R A R G A R G 105 P A N D G P S T V AII 20 aa's 113 L A R N D Q E K M S T A R N D Q E K M S V T V I P L G H 116 Q A R N Q E I K M T V AII 20 aa's 134 L A R I L K M F W Y V AII 20 aa'S 135 S A R N Q H K S T A R N Q H K S T 138 G A H K M F S Y W AII 20 aa's 139 H A R Q H L K Y AII 20 aa's 147 E A R Q E H L K M Y AII 20 aa's 151 H A Q H K I L AII 20 aa's 174 I A R Q E L K M AII 20 aa's 177 F A R L K M AII 20 aa's librería construida, llamada con un total de cincuenta oligonucleótidos (Tabla 2) antes que los miles que tendrían que ser requeridos para completamente especificar la librería objetivo diseñada. La Tabla 2 también incluye dos cebadores de amplificación de PCR.

TABLA 2 Oligo Secuencia Oligo SEQ ID ID Ll: 01 TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGAGCTCTGCTCGACGCCTTA 833 Ll: 02 GCCATTGAGATGA GGATAGGCACCWGACTCACTTTGCCCT 834 Ll: 03 GCCATTGAGATGAWGGATAGGCACMATACTCACTTTGCCCT 835 Ll:04 GCCATTGAGATGA GGATAGGCACGCGACTCACTTTGCCCT 836 Ll : 05 GCCATTGAGATGACGGATAGGCACCWGACTCACTTTGCCCT 837 Ll: 06 GCCATTGAGA5GACGGATAGGCACMATACTCACTTTGCCCT 838 Ll: 07 GCCATTGAGATGACGGATAGGCACGCGACTCACTTTGCCCT 839 Ll: 08 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACC GACTCACTTTGCCCT 840 Ll:09 GCCATTGAGA5TGATGGATAGGCAC ATACTCACTTTGCCCT 841 Ll: 10 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACGCGACTCACTTTGCCCT 842 Ll:ll TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCT 843 Ll:12 TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATDCTGCT 844 Ll: 13 AAAAGTTWTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCA 845 Ll: 14 AAAAGTTGGAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCA 846 Ll: 15 AAAAGTATGAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCA 847 Ll:16 AAAGTANNLTTAGGTACAGCGMMLACAGAAAAACAGTATGAA 848 Ll: 17 AAAGTANNLTTAGGTACASGCMMLACAGAAAAACAGTATGAA 849 Ll: 18 ACTVN SGAAAATNNKTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 850 Ll: 19 TCACTAGAGAATGCATTATATGCANNSRCCGCTGTGNNKNNK 851 Ll:20 TCACTAGAGAATGCATTATATGCANNS GCGCTGTGNNKNNK 852 Ll:21 TCACTAGÁGAATGCATTATATGCANNSMAKGCTGTGNNKNNK 853 Ll:22 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGNNKGATCAAGAGNNKCAAGTC 854 Ll:23 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCG 855 Ll:24 CCATTATTACGACAAGCTNNKGAATTANNKGATCACCAAGGT 856 Ll:25 GCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGC 857 Ll:26 GGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAAGGC 858 Ll:27 CCTATCCWTCATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAGAGCTCG 859 Ll:28 CCTATCCGCCATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAGAGCTCG 860 Ll:29 CCTATCCAGCATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAGAGCTCG 861 Ll : 30 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTCWGGTG 862 Ll:31 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATLGTG 863 Ll : 32 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTCGCGTG 864 Ll:33 TAAAGCACATCTAWAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATC 865 Ll : 34 TAAAGCACATCTCCAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATC 866 Ll:35 TAAAGCACATCTCATACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATC 867 Ll:36 TAAAGCACATCTAWAACTTTTAGCAGHATTACGTAAAAAATC 868 Ll: 37 TAAAGCACATCTCCAACTTTTAGCAGHATTACGTAAAAAATC 869 Ll:38 TAAAGCACATCTCATACTTTTAGCAGHATTACGTAAAAAATC 870 Ll: 39 CGCTGTACCTAAMNNTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 871 Ll: 40 GCSTGTACCTAAMNNTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 872 Ll: 41 GGCTAAMNNATTTTCSNBAGTTTCATACTGTTTTTCTGTMNN 873 Ll:42 ATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAA 874 Ll:43 CAATACGCAACCTAAAGTAAA NNMNNCACAGCGGYSNNTGC 875 Ll: 44 CAATACGCAACCTAAAGTAAAMNNMNNCACAGCGCKSNNTGC 876 Ll: 45 CAATACGCAACCTAAAGTAAAMNNMNNCACAGCMTKSNNTGC 877 Ll:46 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGMNNCTCTTGATCMNN 878 Ll:47 MNNAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGG 879 Ll: 48 · GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCMNNTAATTC 880 Ll : 48 TTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCC 881 Ll:50 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCACA 882 Ll: 5' CATGT AAAAATAAGCGAGC C G 883 LI:3' GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGAC 884 ensamble de los oligos XL1' se llevó a cabo mediante la extensión sobrepuesta (Ness, y colaboradores, (2002) Nat Biotech 20:1251-1255) para generar un fragmento de PCR bordeado por los sitios de restricción Sacl/Ascl. Las condiciones para el ensamble de todos los fragmentos de la librería fueron como sigue: oligonucleótidos que representan la librería se normaliza a una concentración de 10 µ? y luego volúmenes iguales se mezclan para crear una acumulación de 10 µ?. La amplificación de PCR de fragmentos de la librería se realizó en seis reacciones de 25 µ? idénticas que contienen: 1 µ? de oligos de librería acumulados; 0.5 µ? de cada cebador de rescate: Ll:5' y Ll:3' y 200 µ? de dNTP' s en una reacción dirigida de Herculase II (Stratagene, La Jolla, CA, USA) . Las condiciones para PCR ' fueron 98 °C durante 1 min (desnaturalización inicial), seguido por 25 ciclos de desnaturalización de 95°C durante 20 segundos, recocido durante 45 segundos entre 45°C y 55°C (gradiente), luego extensión de la plantilla durante 30 segundos a 72°C. Una extensión final de 72 °C durante 5 minutos completa la reacción. TetR(B) de tipo silvestre se extirpa del vector de expresión P AD~tetR de pVER7314 mediante la digestión con Sacl/Ascl. El fragmento de cadena principal de pVER7314 se trata con fosfatasa intestinal de ternero y se purifica, luego la acumulación de fragmento de librería completamente extendida (-500 bp) digerida con enzimas de restricción Sacl/Ascl se inserta para generar la librería de plásmido Ll. Aproximadamente 50 clones aleatorios de la librería Ll se secuenciaron y la información se recopiló para propósitos de control de calidad. Los resultados indicaron que casi todos los aminoácidos dirigidos en el conjunto de diversidad fueron representados (datos no mostrados) . La secuenciación reveló que 17% de las secuencias contuvieron codones de detención. Esto es menor que el 27% predicho (por ejemplo, 10 posiciones que tienen 1/32 codones que es un codón de detención, 1- (31/32) 10 ~27%). Adicionalmente, el análisis de secuencia mostró que 13% de los clones tuvieron desplazamiento de estructura debido a errores en el proceso de extensión sobrepuesto. Asi, de manera global aproximadamente 30% de la librería consistió de clones que codifican polipéptidos truncados .

C. Ajuste de la clasificación Con el fin de probar la librería para clones raros que reaccionan con trifensulfurón-metilo (Ts) se desarrolló una clasificación genética basada en E. coli sensitiva. La clasificación es una modificación de un sistema de ensayo establecido (Wissmann y colaboradores, (1991) Genetics 128:225-232). La clasificación consiste de dos partes: una pre-clasificación represora seguido por una clasificación de inducción. Para este propósito una cepa de E. coli se desarrolló que tiene ambas funcionalidades. Para la preclasificación represora una cascada genética se desarrolló mediante lo cual un gen nptIII que codifica resistencia a canamicina está bajo el control de un promotor lac. El promotor lac es reprimido por el represor Lac codifica por lacl, cuya expresión es a su vez controlada por el promotor tet (PtefR) . El promotor tet es reprimido por TetR que bloquea la producción de Lacl y así finalmente habilita que sea expresada la resistencia a canamicina.

Puesto que el reguión tet tiene promotores bivalentes, un promotor para tetR y un promotor para tetA, la misma cepa se diseñó con el gen lacZ de E. coli que codifica la ß-galactosidasa reportadora de enzima, bajo el control del promotor tetA (PtefA) . El reguión doble que codifica tanto lacl e IacZ luego fue bordeado por terminadores transcripcionales Fuertes: El terminador de operón ribosomal RNA de E. Coli rrnB T1-T2 (Ghosh y colaboradores, (1991) J Mol Biol 222:59-66) y el terminador de subunidad C de polimerasa de RNA de E. coli rpoC, tal que los transcriptos espurios se lee en la dirección de ya sea el promotor tet no interferiría con la expresión de cualquier otro transcripto. En la presencia de TetR funcional, la cepa exhibe un fenotipo lac y las colonias pueden ser fácilmente registradas para la inducción por la química novedosa con X-gal, en donde la inducción da color de colonia azul incrementado. Además, la inducción con la química novedosa en cultivos líquidos se pueden medir cuantitativamente al emplear ensayos de enzima de /?-galactosidasa con sustratos ya sea colorimétricos o fluorimétricos .

Una refinación adicional de la cepa hospedera es que la posición to/C fue inactivada con el reportador Plac-r¡aptIII entrante. Esto se hizo para obtener mejor penetración de los compuestos SU en E. coli (Robert LaRossa - DuPont: personal communication) . Un terminador transcripcional fuerte, T22 de fago 22 de S. Typhimurium, se colocó corriente arriba del promotor lac para prevenir la expresión débilmente no regulada del marcador de resistencia a canamicina condicional. El nombre de la cepa diseñada final es KM3 de E. Coli .

La población de LBD' s de tetR emtremezclada se clonó en un vector basado en Apr/ColEl pVER7314 detás del promotor Esto se diseñó para permitir el control fino de la expresión de TetR mediante la variación de concentraciones de arabinosa en el medio de crecimiento (Guzman y colaboradores, (1995) J Bacteriol 177:4121-4130). A pesar de estar bajo el control del promotor PBADÍ la proteina TetR se expresa a un nivel suficiente en la ausencia de arabinosa adicionada para habilitar la selección para resistencia a canamicina en la cepa KM3. No obstante, la expresión puede ser incrementada mediante la adición de arabinosa, por ejemplo, si se desea un cambio en la severidad del ensayo. D. Clasificación de la librería Después del ensamble de los oligos Ll y la captura en el vector pVER7314, la librería resultante se transformó en la cepa KM3 de E. coli .y se colocó sobre LB que contiene 50 ug/ml de carbenicilina para seleccionar plásmidos de librería, y 60 ug/ml de canamicina para seleccionar la población represora activa en la ausencia del ligando objetivo ( "apo-represpres" ) . El análisis de secuencia de DNA de esta población seleccionada indicó que esta etapa altamente enriqueció varias posiciones de la librería, sugiriendo que pocas combinaciones de aminoácido en el dominio de enlace de ligando conduce a una conformación compatible con el enlace de DNA por el dominio N-terminal. Además, esta etapa eliminó clones con codones de detención prematuros y/o mutaciones de desplazamiento de estructura. Subsecuentemente, estas secuencias apo-represora se clasificaron para la alteración en la actividad represora en la presencia de Harmony® (Ts) . Esto se hizo al colocar en placa por replicado la población preseleccionada Kmr de cultivos líquidos en el formado de 384 cavidades sobre agar M9 que contiene glycerol al 0.1% como fuente de carbón, casamino ácidos al 0.04% (para prevenir la deficiencia de aminoácido de cadena ramificada causada por la aplicación de sulfonilurea ) . 50 pg/ml de carbenicilina para el mantenimiento del plásmido, X-gal al 0.004% para detectar la actividad de ß-galactosidasa y el inductor +/- SU de Ts en 20 µg/ml. Los aciertos iniciales se identificaron de una población de casi 20,000 colonias clasificadas para la respuesta Ts después de la incubación a 30°C durante 2 días. Catorce xaciertos' putativos identificados luego se reprobaron bajo las mismas condiciones pero en el formato de 96 cavidades (Figura 3) .

El análisis de secuencia de DNA reveló que los clones 11-3 y 11-19 son idénticos y que los aciertos más intensamente respondientes (L-2, -3(19), -5, -9, -11 y -20) tuvieron enriquecimiento significante en varias posiciones de librería, indicando un involucramiento de la interacción de ligando, directamente o indirectamente. La misma librería luego se reclasificó para identificar 10 aciertos adicionales para llevar el número total de clones a 23.

Todos los 23 aciertos putativos se clasificaron subsecuentemente en el mismo formato de ensayo de placa con un panel de nuevo compuestos de sulfonilurea (SU) registrados para uso comercial (Tabla 3) , en donde 11 aciertos se encontraron que responden significativamente a otros ligandos SU (Tabla 4) . Para esta experimento, los clones de E. coli que codifican los aciertos Ll o TetR wt (SEQ ID NO:2) se arreglaron en el formato de 96 cavidades y se estamparon sobre el medio de ensayo X-gal M9 con o sin los compuestos SU de prueba de 20 g/ml. Después de 48 horas de crecimiento a 30°C, las places se formaron en imagine digitalmente y la intensidad de la colonia se convirtió a valores relativos de actividad de ß-galactosidasa . Los inductores utilizados: tifensulfurón (Ts), metsulfurón ( s), sulfometurón (Sm) , etametsulfurón (Es), tribenurón (Tb) , clorimurón (Ci), nicosulfurón (Ns), rimsulfurón (Rs), clorsulfurón (Cs) en 20 ppm y anhidrotetraciclina (ate) como el control positivo en 0.4 µ? para la inducción de TetR. De manera sorprendente, algunos compuestos de sulfonilurea, particularmente clorimurón, etametsulfurón y clorsulfurón, fueron activadores más potentes que el ligando de partida Harmony®.

TABLA 3.

TABLA 4 Inductor clon Ningún Ts . Ms Sm Es Tb Ci NS RS Cs ate o Ll-2 1.0 1.6 1.9 4.7 5.8 1.7 13.6 1.3 1.3 4.1 1.2 Ll-7 0.0 0.1 0.2 6.4 0.1 0.2 16.5 0.1 0.2 3.1 0.0 Ll-9 0.3 1.1 1.2 0.6 11.8 0.4 9.8 0 1.3 0.4 23.6 0.3 Ll-20 1.4 2.6 12.4 6.0 15.0 2.6 13.5 1.6 2..0 22.0 2.0 Ll-22 0.1 0.0 0.1 17.2 0.3 0.3 10.4 0.2 0.1 0.2 0.0 Ll-24 0.1 0.3 0.4 3.1 0.2 1.6 22.1 0.3 0.3 3.3 0.1 Ll-28 0.0 0.1 18.8 1.1 0.8 0.3 14.6 0.1 0.2 5.8 0.0 Ll-29 0.0 0.0 13.5 2.7 1.7 0.3 20.9 0.1 0.2 5.-8 0.0 Ll-31 0.3 0.9 0.5 0.9 13.7 0.1 1.1 0.5 0.4 1.4 0.4 L-38 9.5 16.7 14.7 18.3 14.8 15.8 15.3 8.7 9.5 14.0 6.4 Ll-44 0.2 1.9 2.9 0.4 2.4 0.4 6.7 0.4 0.3 12.0 0.2 TetR 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.0 25.0 Las sustituciones de aminoácido para estos siete aciertos superiores se resumen en la Tabla 5. Las secuencias se comparan con TetR(B) de tipo silvestre y solamente las posiciones que tienen diferencias son mostradas utilizando la numeración de acuerdo con TetR(B) (por ejemplo, SEQ ID NO:l). Un guión en la alineación indica nada de cambio con relación al dominio de enlace de ligando TetR wt .

TABLA 5 ro r- r- TetR L H N F H R P L Q L S G H E H D I F C S (B) Ll- - A - - C A V M I R R I A W Y - R I -02 Ll- - N - V A I H P I A R R V R - S Q - R 07 Ll- - A - M C G F A S M Q C I L L - L K - - 09 Ll- M Q - M F A W V L - N A T W K - H G S - 20 Ll- M - T Y C A I K N R Q R V F - S L s - 22 Ll- - M s M L A V Y S I R R T V R - K L - - 24 Ll- - A - W A w P V s R V T T K - W L - - 28 Ll- M Q t M W - w P M w - C N s R - w S - - 29 Ll- - A M M - A V R V ' R H W I M - Y Y - - 31 Ll- A - - M W A w T M w R T M R W - L G - - 38 Ll- - A - Y Y A V A - V A G W S A V A - - 44 Las clasificaciones iniciales de la librería 1 también detectaron miembros de la librería que tiene actividad represora inversa (SEQ ID NO: 1206-1213) , en donde el polipéptido se enlazó al operador en la presencia del ligando SU. Estos aciertos mostraron la expresión de ß- galactosidasa sin el ligando SU, que se redujo sustancialmente en la adición del ligando, por ejemplo tifensulfurón . Estos aciertos se clasificaron subsecuentemente en el mismo formato de ensayo de placa como es descrito en lo anterior con el panel de nueve compuestos de sulfonilurea (SU) registrados para uso comercial (Tabla 3), en donde 8 aciertos se encontraron que responden significativamente a otros ligandos SU (Tabla 6) .

TABLA 6 Las sustituciones de aminoácido para estos ocho aciertos represores inversos (SEQ ID NO: 1206-1213 codificado por SEQ ID NO: 1214-1221) se resumen en la Tabla 7. Las secuencias se comparan con TetR(B) de tipo Silvestre y solamente las posiciones que tienen diferencias son mostradas utilizando la numeración de acuerdo con TetR(B) (por ejemplo, SEQ ID N0:1). Un guión en la alineación indica nada de cambio con relación al dominio de enlace de ligando de TetR wt .

TABLA 7 E. Correlación de los resultados de entremezclado de primera ronda con el modelo estructural El enriquecimiento significante ocurrió en la mayoría de las posiciones de la librería, donde el enriquecimiento incluye inclinaciones que favorecen a aminoácidos particulares e inclinaciones que desfavorecen aminoácidos particulares. La clasificación inicial involucró las etapas para identificar las funciones tanto represoras y des-represoras . El enriquecimiento ocurrió en ambas etapas de la clasificación. En la primera etapa, las posiciones se enriquecieron mediante la selección para "apo represores", esto es, proteínas que reprimen la transcripción génica en la ausencia del ligando. En la segunda etapa, las posiciones se enriquecieron mediante la selección para "activadores", esto es, proteínas que permiten la transcripción génica en la presencia del ligando. Las posiciones se pueden enriquecer ya sea por criterio de selección, o por ambos criterios, o por ninguno. Los resultados de clasificación de la primera ronda para la actividad represora se resumen enseguida: Posición Inclinación de Aminoácido Observada Apo represor Inducción de Ambos SU , 60 L (no K) 64 Q,N (no L, A) 82 N (No A, T) A (no N,S) 86 (no M) M (no ) 100 R (no K,Q) C,W (no H, K, Q) 104 G A 105 C,G,L,V (NO L,W (no G,S) L H,K) 113 A (no G,P) A, I (no D,G) A 116 (no GL) M,V (no A, R) 134 M, S I,R, (no.G) 135 K,R (no H,S) Q,R (no A, ) R 138 (no T) A,C,R,V (no L,P,Q,T) 139 R (no H) T (no L, P) 147 (no A,C) R, W (no A, S) 151 R (no C,G,Q) M,R (no V) R 174 V (no L, R) W (no F,L) 177 T (no S) K,L (no P,T) El enriquecimiento en el nivel activador fue consistente con el modelo computacional del enlace de SU: posiciones estéricamente seleccionadas (por ejemplo, 60, 86, 104, 105, 113, 138, 139) ocurrieron en proximidad más estrecha al ligando moderado, posiciones electrostáticamente seleccionadas (por ejemplo, 135, 147, 151, 177) ocurrieron cerca de la porción de sulfonil modelada, y posiciones aromáticamente seleccionadas (por ejemplo, 100, 105, 147, 174) se modelaron para formar interacciones de apilamiento aromáticas con las estructuras de anillo planas en tifensulfurón . El enriquecimiento en el nivel represor apo fue consistente con el modo predicho de enlace de DNA: posiciones enriquecidas se modelaron para ser capaces de la asociación de modulación de la proteina represora con la secuencia operadora de DNA.

En el caso de la clasificación de inducción de SU, el enriquecimiento fue evidenciado por ambos aminoácidos sobrerepresentados que se modelaron para formar interacciones favorables con el ligando (por ejemplo, metionina (M) y valina (V) en la posición 116 se modelaron para empacar bien contra el anillo de triasina de la molécula SU) y por los aminoácidos subrepresentados que se modelaron para producir interacciones no favorables con el ligando (por ejemplo, triptófano ( XW ) en la posición 86 se modeló para ser demasiado grande para acomodar el ligando en la cavidad de enlace) . En el caso del repeso rapo, el enriquecimiento tomó la forma de ambos de los aminoácidos sobrerepresentados que se modelaron para dar origen a una conformación represora funcional capaz de enlazar la secuencia operadora del DNA en la ausencia del ligando (por ejemplo, alanina ( ??' ) en la posición 113, que mantiene la integridad estructural de esta -hélice) y de aminoácidos subrepresentados que se modelaron para interrumpir la conformación activamente represora en la ausencia del ligando (por ejemplo, glicina y prolina ( XP' ) en la posición 113, que reduce la integridad estructural de esta a-hélice) .

Los resultados de diferentes rondas de clasificación y selección pueden producir enriquecimientos alterados en algunas posiciones, como el resultado de interacciones con otros aminoácidos seleccionados, o con la molécula pequeña. Las secuencias enriquecidas solamente demuestran que las cadenas laterales pueden contribuir a inductores activos, y no excluyen cualquiera de los aminoácidos. Asi, los aciertos seleccionados son probables que representen solamente un conjunto de secuencias activas posibles. Una variedad de modos de enlace de ligando posible e interacciones de proteina pueden ser posibles para la misma molécula SU, y asi el enriquecimiento de varios tipos de cadenas laterales en una posición especifica pueden representar múltiples poblaciones de proteínas activas. La modelación computacional de las secuencias enriquecidas es útil mientras que permitan la priorización de la diversidad de aminoácido para las rondas de clasificación y selección .

Conjuntamente, estos resultados de enriquecimiento sustentan el modelo computacional total y facilitan el diseño adicional. Varias posiciones que se construyeron como codones completamente degenerados (todos los 20 aminoácidos) regresaron los resultados de clasificación de primera ronda consistente con el modelo computacional sugerido. Por ejemplo, la modelación computacional sugirió que las cadenas laterales aromáticas , Y y F en la posición 100 favorecerían el enlace de SU. La librería de primera ronda se clasificó con un codón degenerado en esta posición, y los aminoácidos W, Y y F fueron significativamente enriquecidos. Las librerías diseñadas permiten que la diversidad de secuencia sea reducida en posiciones de librería, con un énfasis en disminuir la diversidad en posiciones acopladas tal que se pueden evitar codones completamente degenerados. Adicionalmente, más posiciones podrían ser reclutadas para la diversificación para lograr cobertura más grande de una librería de más alta calidad, más enfocada en secuencia. Esto permite la construcción de una librería con miembros suficientemente pocos para clasificar con buena cobertura, pero suficiente diversidad para descubrir secuencias con actividad detectable. Tales secuencias luego se pueden mejorar al introducir más diversidad en las posiciones de la librería, con una clasificación o selección que elige clones óptimos, independiente de predicciones del modelo. De esta manera la combinación de la modulación computacional y la evolución dirigida permite la generación de secuencias diseñadas no probables para ser descubiertas por cualquier técnica separadamente.

F. Entremezclado de segunda ronda La librería original se diseñó a trifensulfurón, pero una vez que se estableció la actividad de inducción con otros compuestos SU que tienen potencialmente mejores propiedades en el suero y estabilidad in planta que el ligando original, el proceso de evolución se redirigió hacia estos ligandos alternativos. De particular interés fueron los herbicidas metsulfurón, sulfometurón, etametsulfurón y clorsulfurón . Para este objetivo, clones parentales Ll-9, -22, -29 y -44 se seleccionaron para el entremezclado adicional. El clon Ll-9 tiene fuerte actividad sobre tanto etametsulfurón como clorsulfurón; el clon Ll-22 tiene fuerte actividad de sulfometurón; el clon Ll-29 tiene actividad moderada de metsulfurón; y el clon Ll-44 tiene actividad moderada sobre metsulfurón, etametsulfurón y clorsulfurón (Tabla 4). No se encontraron clones en la clasificación inicial que fueron esencialmente reactivos al metsulfurón. Estos cuatro clones también se dirigieron debido a su actividad represora relativamente fuerte, que muestran baja actividad antecedente de ß-gal sin inductor. La actividad represora fuerte es importante para establecer un sistema que es tanto altamente sensible a la presencia del inductor od, y estrechamente apagado en la ausencia del inductor .

Basado en la información de secuencia de clones parenterales Ll-9, -22, -29 y -44, dos librerías de segunda ronda se diseñaron, se construyeron y se clasificaron. La primera librería, L2, consistió de un entremezclado de 'familia' mediante lo cual la diversidad de aminoácido entre los clones parentales seleccionados se varió utilizando el ensamble sintético de oligonucleótidos para encontrar clones mejorados en responsividad a cualquiera de los cuatro ligandos objetivo nuevos. Un resumen de la diversidad utilizada y las secuencias de aciertos resultantes para la librería L2 se muestra en la Tabla 8.

TABLA 8 Los oligonucleótidos utilizados para construir la librería se muestran en la Tabla 9. Los oligonucleótidos L2 se ensamblaron, se clonaron y se clasificaron según el protocolo descrito para la librería Ll excepto que cada ligando se probó en 2 ppm para incrementar la severidad del ensayo, que es una reducción de 10 veces de la concentración de clasificación de librería de la Ia ronda.

TABLA 9 Oligo Secuencia SEQ ID L2: 01 TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGAGCTCTGCTCGACGCCTTA 885 L2:02 GCCATTGAGATGWTGGATAGGCACCASACTCACTTTTGCCCT 886 L2: 03 GCCATTGAGATGWTGGATAGGCACGCAACTCACTTTTGCCCT 887 L2: 04 TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAMTGCT 888 L2:05 AAAAGTTACAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCA 889 L2:06 AAAAGTATGAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCA 890 L2:07 AAAGTATRTTTAGGTACACGCDTCACAGAAAAACAGTATGAA 891 L2: 08 AAAGTATRTTTAGGTACACGCTGGACAGAAAAACAGTATGAA 892 L2:09 AAAGTATRTTTAGGTACAGSTDTCACAGAAAAACAGTATGAA 893 L2: 10 AAAGTATRTTTAGGTACAGSTTGGACAGAAAAACAGTATGAA 894 L2: 11 AAAGTATGGTTAGGTACACGCDTCACAGAAAAACAGTATGAA 895 L2 : 12 AAAGTATGGTTAGGTACACGCTGGACAGAAAAACAGTATGAA 896 L2:13 AAAGTATGGTTAGGTACAGSTDTCACAGAAAAACAGTATGAA 897 L2 : 14 AAAGTATGGTTAGGTACAGSTTGGACAGAAAAACAGTATGAA 898 L2:15 ACTAAAGAAAATARCTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 899 L2 : 16 ACTAAAGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 900 L2: 17 ACTAAAGAAAATATGTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 901 L2: 18 ACTSCTGAAAATARCTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 902 L2 : 19 ACTSCTGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 903 L2:20 ACTSCTGAAAATATGTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 904 L2 : 21 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCTGTGGCTAWT 905 L2:22 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCTGTGGCTGKT 906 L2:23 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCTGTGYGCAWT 907 L2:24 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCTGTGYGCGKT 908 L2:25 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGMAAGCTGTGGCTA T 909 L2:26 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGMAAGCTGTGGCTGKT 910 L2:27 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGMAAGCTGTGYGCAWT 911 L2:28 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTG AAGCTGTGYGCGKT 912 L2 : 29 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGAGTGCTGTGGCTAWT 913 L2:30 TCACTAGAGAATGCATTATATGCA GGAGTGCTGTGGCTA T 914 L2 : 31 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGAGTGCTGTGYGCAWT 915 L2:32 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGAGTGCTGTGYGCGKT 916 L2:33 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGMAAGCTGTGGCTA T 917 L2 : 34 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGMAAGCTGTGGCTGKT 91.8 L2 : 35 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGMAAGCTGTGYGCAWT 919 L2 : 36 TCACTAGAGAATGCATTATATGCAWGGMAAGCTGTGYGCGKT 920 L2:37 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTKGGATCAAGAGAGMCAAGTC 921 L2: 38 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTKGGATCAAGAGMTGCAAGTC 922 L2:39 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTYTGATCAAGAGAG CAAGTC 923 L2 : 40 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTYTGATCAAGAGMTGCAAGTC 924 L2 : 41 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGMTAGTATGCCG 925 L2: 42 CCATTATTACGACAAGCTAGTGAATTATTGGATCACCAAGGT 926 L2: 43 CCATTATTACGACAAGCTAGTGAATTAKCAGATCACCAAGGT 927 L2:44 CCATTATTACGACAAGCTAGTGAATTAAAGGATCACCAAGGT 928 L2:45 CCATTATTACGACAAGCTTKGGAATTATTGGATCACCAAGGT 929 L2:46 CCATTATTACGACAAGCTTKGGAATTAKCAGATCACCAAGGT 930 L2:47 CCATTATTACGACAAGCTTKGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 931 L2: 48 CCATTATTACGACAAGCTGTAGAATTATTGGATCACCAAGGT 932 L2: 49 CCATTATTACGACAAGCTGTAGAATTAKCAGATCACCAAGGT 933 L2: 50 CCATTATTACGACAAGCTGTAGAATTAAAGGATCACCAAGGT 934 L2: 51 GCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGC 935 L2: 52 GGATTAGAAAAACAACTTAAATSCGAAAGTGGGTCTTAA 936 L2: 53 CCTATCCAWCATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAGAGCTCG 937 L2:54 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTSTGGTG 938 L2 : 55 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTTGCGTG 939 L2 : 56 TAAAGCACATCTGTAACTTTTAGCAKTATTACGTAAAAAATC 940 L2 : 57 TAAAGCACATCTCATACTTTTAGCAKTATTACGTAAAAAATC 941 L2 : 58 GCGTGTACCTAAAYATACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 942 L2:59 ASCTGTACCTAAAYATACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 943 L2: 60 GCGTGTACCTAACCATACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 944 L2: 61 ASCTGTACCTAACCATACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 945 L2: 62 GGCTAAGYTATTTTCTTTAGTTTCATACTGTTTTTCTGTGAH 946 L2 : 63 GGCTAAGYTATTTTCTTTAGTTTCATACTGTTTTTCTGTGAH 947 L2: 64 GGCTAAGYTATTTTCTTTAGTTTCATACTGTTTTTCTGTGAH 948 L2 : 65 GGCTAAGYTATTTTCAGSAGTTTCATACTGTTTTTCTGTGAH 949 L2: 66 GGCTAATTGATTTTCAGSAGTTTCATACTGTTTTTCTGTGAH 950 L2: 67 GGCTAACATATTTTCAGSAGTTTCATACTGTTTTTCTGTGAH 951 L2 : 68 GGCTAAGYTATTTTCTTTAGTTTCATACTGTTTTTCTGTCCA 952 L2: 69 GGCTAATTGATTTTCTTTAGTTTCATACTGTTTTTCTGTCCA 953 L2:70 GGCTAACATATTTTCTTTAGTTTCATACTGTTTTTCTGTCCA 954 L2:71 GGCTAAGYTATTTTCAGSAGTTTCATACTGTTTTTCTGTCCA 955 L2:72 GGCTAATTGATTTTCAGSAGTTTCATACTGTTTTTCTGTCCA 956 L2:73 GGCTAACATATTTTCAGSAGTTTCATACTGTTTTTCTGTCCA 957 L2:74 ATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAA 958 L2: 75 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAWTAGCCACAGCACTCAYTGC 959 L2:76 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCAGCCACAGCACTCAYTGC 960 L2:77 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAWTGCRCACAGCACTCAYTGC 961 L2:78 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCGCRCACAGCACTCAYTGC 962 L2:79 CAATACGCAACCTAAAGTAAAA TAGCCACAGCTTKCAYTGC 963 L2:80 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCAGCCACAGCTTKCAYTGC 964 L2:81 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAWTGCRCACAGCTTKCAYTGC 965 L2:82 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCGCRCACAGCTTKCAYTGC 966 L2:83 CAATACGCAACCTAAAGTAAAA TAGCCACAGCACTCCWTGC 967 L2: 84 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCAGCCACAGCACTCC TGC 968 L2:85 CAATACGCAACCTAAAGTAAAA TGCRCACAGCACTCCWTGC 969 L2:86 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCGCRCACAGCACTCCWTGC 970 L2:87 CAATACGCAACCTAAAGTAAAA TAGCCACAGCTTKCCWTGC 971 L2:88 CAATACGCAACCTAAAGTAAAA1MCAGCCACAGCTTKCC TGC 972 L2:89 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAWTGCRCACAGCTTKCC TGC 973 L2: 90 CAATACGCAACCTAAAGTAAAAMCGCTCACAGCTTKCCWTGC 974 L2: 91 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGKCTCTCTTGATCCMA 975 L2: 92 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGCAKCTCTTGATCCMA 976 L2:93 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGKCTCTCTTGATCARA 977 L2: 94 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGCAKCTCTTGATCARA 978 L2:95 ACTAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTAKCAGTAGTAGG 979 L2: 96 CMAAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTAKCAGTAGTAGG 980 L2 : 97 TACAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTA CAGTAGTAGG 981 L2: 98 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCCAATAATTC 982 L2: 99 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCTGMTAATTC 983 L2: 100 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCCTTTAATTC 984 L2: 101 TTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCC 985 L2: 102 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCGSA 986 G Resultados de clasificación para la librería L2 Casi 8,000 colonias que surgen de la preclasificación del represor se sometieron a la clasificación de activación en el medio de ensayo M9 que contiene los inductores potenciales etameltsulfurón, sulfometurón, me'tsulfurón o clorsulfurón en 2 ppm. Después de 48 horas de incubación a 30°C se analizaron las placas. Doce aciertos putativos de estas placas se rearreglaron en el formato de 96 cavidades y se re-probaron en el mismo conjunto de medio (Tabla 10) . Solamente el clon L2-14 tuvo una fuerte respuesta a la inducción y regulación estrecha a cualquiera de los inductores en esta dosis de 2 ppm inferior, en donde tuvo una fuerte respuesta a Cs y bajo antecedente sin inductor. El clon L2-18 tuvo una respuesta moderada a este ligando, y bajo antecedente. El clon L2-9 también respondió bien a Cs, pero tuvo actividad antecedente más alta sin inductor. Nada de aislados mostraron una respuesta significante a metsulfurón. Una observación inesperada fue que el clon Ll-9 parental tiene sensibilidad a 2 ppm de Es. El análisis de secuencia de los clones de aciertos de la librería 2 (Tabla 6) indica que F86M, G138R y F177K fueron sustituciones preferidas en los aciertos respondientes. Esto es especialmente acentuante en la posición 138 donde A está muy por encima representado en la población no seleccionada y todavía cinco clones tienen R en esta posición mientras que solamente uno tiene alanina. R105W también podría ser importante, pero en la población de secuencias aleatorias W105 fue ya inclinado sobre C o Y.

TABLA 10 Ensamble de la librería L4 de segunda ronda Otra librería de segunda ronda, L4, se creó de oligonucleótidos sintéticos utilizando el clon Ll-9 como la plantilla y al inyectar diversidad de aminoácidos novedosos en la secuencia basada en la comparación filogenética de 34 TetR y moléculas relacionadas. Una múltiple alineación de secuencia de la SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO: 402-433 generó utilizando GCG Seq eb PILEUP (Accelrys, San Diego, CA) bajo parámetros de error de ponderación de espacio = 8, ponderación de longitud de espacio = 2 y la matriz BLOSUM62 se muestra enseguida : 1 50 ZP_01558383 mkdtg . a rltrdtvmra aldllnevgi dglstrrlae rlgvqsptly YP_772551 mkdts . t rltrdtvmra aldllnevgi dglstrrlae rlgvqsptly YP_620166 ~~~mkdtg . t rltrdtvlra alnlldevgi dglstrrlae rlgvqsptly EAY62734 miemkdtg . a rltrdtvlra alnlldevgi dglstrrlae rlgvqsptly YP_368094 ~~~mkdtg . a rltrdtvlra alelldevgi dglstrklae rlgvqsptly AAP93923 ~mseknta . a rltretvlrg alallddigi dalstrrlaq hlgvqsptly AAW66496 -mskkdiapq rltreivlrt aldmlneegi dsittrklaq rlgiksptly CAA24908 mt klqpntvira aldllnevgv dglttrklae rlgvqqpaly P03038 ~ mt klqpntvira aldllnevgv dglttrklae rlgvqqpaly ABS19067 klqpntvirv aldllnevgv ealttrklak rlgvqqpaly NP_387462 klqreavirt alellndvgm eglttrrlae rlgvqqpaly NP_387455 klqreavirt alellndvgm eglttrrlae rlgvqqpaly AAR96033 klqreavirt alellndvgm eglttrrlae rlgvqqpaly NP_511232 klqreavirt alellndvgm eglttrrlae rlgvqqpaly AAW83818 ~~~ mt klqpntvira aldllnevgv dglttrklae rlgvqqpaly AAD25094 kldkgtviaa alellnevgm dslttrklae rlkvqqpaly P51560 mt kldkgtviaa glellnevgm dslttrklae rlkvqqpaly AAD25537 mt kldkgtviaa alellnevgm dslttrklae rlrvqqpaly YP_001220607 kldretviqa alellnevgv dnlttrklae rlkvqqpaly YP_001370475 ~mvsala klhrdaviqt alellnevge eglttrrlae rlgvqqpaly P21337 ma rlslddvism altlldsegl eglttrklaq slkieqptly ???98409 .—-~~ma rlslddvism altlldsegl eglttrklaq slkieqptly CAC81917 ma rlslddvism altlldregl eglttrnvaq slkieqptly P51561 -~ma kldkeqvidd alillnevgi eglttrnvaq kigveqptly ??_00132379 ~~ma kldkeqvidn alillnevgi eglttrklaq kigveqptly AAD12754 ~~- ma kldkeqvidn alillnevgm eglttrklaq kigveqptly ?04483 ras rldkskvins alellnevgi eglttrklaq kigveqptly ?26948 ~~~~~ms rldkskvins alellnevgi eglttrklaq kigveqptly CAC80726 rama rldkkrvies alalldevgm eglttrklaq klnieqpsly P0ACT4 MA RLNRESVIDA ALELLNETGI DGLTTRKLAQ KLGIEQPTLY ??_01567051 ma kirrdeivda alalldeqgl dalttrrlaq rlgvesaaly ?? 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Además, se eligieron posiciones para la variación basada en el espaciamiento para limitar el número de cambios en un par de oligonucleótidos sobrepuestos. Un resumen de la librería se muestra en la Tabla' 11. El objetido de esta librería fue recuperar los aciertos mejorados para la reactividad a ya sea etametsulfurón o clorsulfurón.

TABLA 11 El ensamble de los oligonucleótidos sintéticos de la librería L4 se hizo para las librerías previas, excepto que dos conjuntos de acumulaciones de oligonucleotido se utilizaron. Primero, múltiples oligonucleótidos que representan diversidad en una sola ubicación de recocido de oligonucleótido se acumulan ("Grupo" en la Tabla 12) . Enseguida, un volumen igual de cada grupo de oligos se acumula para representar la diversidad de L4 novedosa. Del mismo modo, los oligonucleótidos que representan la secuencia de cadena principal Ll-9 se acumularon (Tabla 13) . La reacción de ensamble de L4 se llevó a cabo al poner la acumulación de diversidad de oligonucleótido en la acumulación de cadena principal de Ll-9 en una relación aproximadamente 1:3.

TABLA 12 Oligo Secuencia Grupo SEQ ID L4:01 TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGAGCTCTGWTGGACGCCWTG 1 987 L4:02 TATTGGCATGTAAAGAATAAGCGCGCTCTGWTGGACGCC TG 1 988 L4 : 03 GCCATTGAGATGCTCGATARACACGCCACTCACTTTTGCCYC 2 989 L4:04 GCCATTGAGATGCTCGATGAKCACGCCACTCACTTTTGCCYC 2 990 L4:05 TTAGAAGGGGM AGCTGGCAAGATTTTBTTCGTAATAACGCA 3 991 L4 : 06 TTAGAAGGGGM AGCTGGCAAGATTTTBTTCGTAATAACART 3 992 L4:07 TTAGAAGGGGMWAGCTGGAGGGATTTTBTTCGTAATAACGCA 3 993 L4 : 08 TTAGAAGGGGMWAGCTGGAGGGATTTTBTTCGTAATAACART 3 994 L4 : 09 TTAGAAGGGGMWAGCTGGGMTGATTTTBTTCGTAATAACGCA 3 995 L4 : 10 TTAGAAGGGGM AGCTGGGMTGATTTTBTTCGTAATAACART 3 996 L4 : 11 AAAARTATGAGAHGTGCTTTACTAAGTYACCGCGATGSAGCA 4 997 L4 : 12 AAAGSAATGAGAHGTGCTTTACTAAGTYACCGCGATGSAGCA 4 998 L4: 13 ARAGTATGCTCCRGGACAGGATTTACAGAAAAACAAKTTGAA 5 998 L4:14 ARAGTATGCTCCRGGACAGGATTTACAGAAAAACAATACGAA 5 1000 L4 : 15 ARAGTATGCTCCRGGACAGGATTTACAGAAAAAMATTACGAA 5 1001 L4:16 ARAGTATGCMTCRGGACAGGATTTACAGAAAAAMATTACGAA 5 1002 L4:17 ARAGTATGCMTCRGGACAGGATTTACAGAAAAACAAKTTGAA 5 1003 L4 : 18 ARAGTATGCMTCRGGACAGGATTTACAGAAAAACAATACGAA 5 1004 L4 : 19 ARAGTATGCMTCRGGACAGGATTTACAGAAAAAMATKTTGAA 5 1005 L4 :20 ARAGTATGCMTCRGGACAGGATTTACAGAAAAA ATTACGAA 5 1006 L4:21 ACTGCTGAMAATTCAVTTGCCTTTMTGTGCCAACAAGGTTTK 6 1007 L4:22 ACTGCTAGGAATTCAVTTGCCTTTMTGTGCCAACAAGGTTTK 6 1008 L4 : 23 ACTGCTAGGAATTCAVTTGCCTTTMTGTGCCAACAAGGTTTK 6 1009 L4:24 ACTGCTAGGAATTCAVTTGCCTTTTACTGCCAACAAGGTTTK 6 1010 L4:25 TCACTAGAGVACGSATTATATGCAATGCAAGCTGCATGTATT 7 1011 L4 : 26 TCACTAGAGVACGSATTATATGCAATGCAAGCTVTCTGTATT 7 1012 L4:27 TCACTAGAGSAAGSATTATATGCAATGCAAGCTGCATGTATT 7 1013 L4 : 28 TCACTAGAGSAAGSATTATATGCAATGCAAGCTVTCTGTATT 7 1014 L4:29 TWCACTTTAGGTTGCGYATTGCTCGATCAAGAGTTGCAAGTC 8 1015 L4 : 30 TWCACTTTAGGTTGCGYATTGCTCGATCGTGAGTTGCAAGTC 8 1016 L4 : 31 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTCAAACTGATAGTATGYCT 9 1017 L4 : 32 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGYCT 9 1018 L4 : 33 CCATTAWTKCGACAAGCTTTGAATTTAAAGGATCACCAARGC 10 1019 L4:34 CCATTA TKCGACAAGCTTTGGA TTAAAGGATCACCAARGC 10 1020 L4 : 35 GCAGRWCCAGCCTTCTTATTCGKGVTTGAATTGVTKATATGC 11 1021 L4 : 36 GGAHTTGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAA 12 1022 L4 : 37 GGAGCTGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAA 12 1023 L4 : 38 TYTATCGAGCATCTCAATGGCCA GGCGTCCA CAGAGCTCG 13 1024 L4 : 39 MTCATCGAGCATCTCAATGGCCAWGGCGTCCAWCAGAGCTCG 13 1025 L4 : 40 TYTATCGAGCATCTCAATGGCCAWGGCGTCCAWCAGAGCGCB 13 1026 L4 : 41 MTCATCGAGCATCTCAATGGCCA GGCGTCCAWCAGAGCGCB 13 1027 L4 : 42 TTGCCAGCT CCCCTTCTAAGRGGCAAAAGTGAGTGGCGTG 14 1028 L4 : 43 CCTCCAGCTWKCCCCTTCTAAGRGGCAAAAGTGAGTGGCGTG 14 1029 L4 : 44 AKCCCAGCTWKCCCCTTCTAAGRGGCAAAAGTGAGTGGCGTG 14 1030 L4 :45 TAAAGCACDTCTCATAYTTTTTGCGTTATTACGAAVAAAATC 15 1031 L4 : 6 TAAAGCACDTCTCATTSCTTTTGCGTTATTACGAAVAAAATC 15 1032 L4 : 47 TAAAGCACDTCTCATAYTTTTAYTGTTATTACGAAVAAAATC 15 1033 L4:48 TAAAGCACDTCTCATTSCTTTAYTGTTATTACGAAVAAAATC 15 1034 L4 : 49 TCCTGTCCYGGAGCATACTYTTGCTSCATCGCGGTRACTTAG 16 1035 L4 :50 TCCTGTCCYGAKGCATACTYTTGCTSCATCGCGGTRACTTAG 16 1036 L4:51 GGCAABTGAATTKTCAGCAGTTTCAAMTTGTTTTTCTGTAAA 17 1037 L4 : 52 GGCAABTGAATTCCTAGCAGTTTCAAMTTGTTTTTCTGTAAA 17 1038 L4:53 GGCAABTGAATTKTCAGCAGTTTCGTATTGTTTTTCTGTAAA 17 1039 L4 : 54 GGCAABTGAATTCCTAGCAGTTTCGTATTGTTTTTCTGTAAA 17 1040 L4:55 GGCAABTGAATTKTCAGCAGTTTCAAMATKTTTTTCTGTAAA 17 1041 L4 : 56 GGCAABTGAATTCCTAGCAGTTTCAAMATKTTTTTCTGTAAA 17 1042 L4 : 57 GGCAABTGAATTKTCAGCAGTTTCGTAATKTTTTTCTGTAAA 17 1043 L4 : 58 GGCAABTGAATTCCTAGCAGTTTCGTAAT TTTTTCTGTAAA 17 1044 L4 : 59 ATATAATSCGTBCTCTAGTGAMAAACCTTGTTGGCACAKAAA 18 1045 L4 : 60 ATATAATSCTTSCTCTAGTGAMAAACCTTGTTGGCACAKAAA 18 1046 L4 : 61 ATATAATSCGTBCTCTAGTGAMAAACCTTGTTGGCAGTAAAA 18 1047 L4 : 62 ATATAATSCTTSCTCTAGTGAMAAACCTTGTTGGCAGTAAAA 18 1048 L4 : 63 CAATRGCAACCTAAAGTG AAATACATGCAGCTTGCATTGC 19 1049 L4: 64 CAATRCGCAACCTAAAGTG AAATACAGABAGCTTGCATTGC 19 1050 L4: 65 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGCAACTCTTGATCGAG 20 1051 L4 : 66 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGCAACTCACGATCGAG 20 1052 L4: 67 CAAAGCTTGTCGMAWTAATGGAGRCATACTATCAGTTTGAGG 21 1053 L4: 68 CAAAGCTTGTCGMAWTAATGGAGRCATACTATCAGTAGTAGG 21 1054 L4:69 GAATAAGAAGGCTGGWYCTGCGCYTTGGTGATCCTTTAAATT 22 1055 L4 :70 GAATAAGAAGGCTGG YCTGCGCYTTGGTGATCCTTTAAWTC 22 1056 L4 :71 TTTAAGTTGTTTTTCAADTCCGCATATMABCAATTCAABCMC 23 1057 L4 :72 TTTAAGTTGTTTTTCAGCTCCGCATA , ABCAATTCAABCMC 23. 1058 Ll:50 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCACA 24 1059 TABLA 13 Oligo Secuencia SEQ ID Ll-9: 01 TATTGGCASTGTAAAGAATAAGCGTGCTCTGTTGGACGCCCTG 1060 Ll-9: 02 GCCATTGAGATGCTCGATCGTCACGCCACTCACTTTTGCCCT 1061 Ll-9: 03 TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTCTCCGTAATAATGCA 1062 Ll-9: 04 AAATCAATGAGATGCGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGGGCA 1063 Ll-9: 05 AAGGTATGTCTTGGTACAGGATTCACAGAAAAACAGTACGAA 1064 Ll-9: 06 ACTGCTGAAAATRAGTTTGGCCTTTCTGTGCCAACAAGGTTTC 1065 Ll-9:07 TCACTAGAGAATGCTTTATATGCAATGCAAGCTGTCTGTATC 1066 Ll-9: 08 TTCACTTTAGGTTGCGTTTTGCTGGATCAAGAGCTCCAAGTC 1067 Ll-9:09 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCC 1068 Ll-9: 10 CCATTATTGCGACAAGCTTTGGAATTAAAAGATCACCAAGGG 1069 Ll-9: 11 GCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGATTGGAATTGATAATATGC 1070 Ll-9: 12 GGATTGGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAA 1071 Ll-9: 13 ACGATCGAGCATCTCAATGGCCAGGGCGTCCAACAGAGCACG 7072 Ll-9: 14 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTGGCGTG 1073 Ll-9: 15 TAAAGCGCATCTCATTGATTTTGCATTATTACGGAGAAAATC 1074 Ll-9: 16 TCCTGTACCAAGACATACCTTTGCCCATCGCGATGACTTAG 1075 Ll-9: 17 GGCCAAACTATTTTCAGCAGTTTCGTACTGTTTTTCTGTGAA 1076 Ll-9: 18 ATATAAAGCATTCTCTAGTGAGAAACCTTGTTGGCACAGAAA 1077 Ll-9: 19 CAAAACGCAACCTAAAGTGAAGATACAGACAGCTTGCATTGC 1078 Ll-9:20 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGGAGCTCTTGATCCAG 1079 Ll-9.21 CAAAGCTTGTCGCAATAATGGGGGCATACTATCAGTAGTAGG 1080 Ll-9:22 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCCCCTTGGTGATCTTTTAATTC 1081 Ll-9:23 TTTAAGTTGTTTTTCCAATCCGCATATTATCAATTCCAATCC 1082 Ll-9:24 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCACA 1083 Los productos de reacción de ensamble se clonaron en la cadena principal pVER7314 y se transformaron en la cepa probadora KM3 de E. coli. Para llevar a cabo el análisis de diversidad de librería, preparaciones de DNA de 96 colonias cultivas en LB + Cb solamente (que representan nada de inclinación de selección positiva de represor) se sometieron al análisis de secuencia. Estos datos mostraron aproximadamente 30% de los clones recuperados que fueron no alterados de la cadena principal Ll-9 y los clones restantes tuvieron aproximadamente uno a dos cambios dirigidos por clon. Los cambios de residuo no dirigidos adicionales se recuperaron en la población mutada, debido a errores de PCR o de oligonucleótidos de pobre calidad incorporados en las reacciones de ensamble.

I. Clasificación de la librería L4 Aproximadamente 20,000 clones que surgen de la reclasificación de represor se probaron para la activación mediante concentraciones de 0, 0.2 y 1 µ9/p?1 de etametsulfurón utilizando las placas de ensayo M9. De manera sorprendente, arriba de 100 aciertos se observador del tratamiento con 0.2 µ?/ml de etametsulfurón . Estos aciertos putativos se rearreglaron en el formato de 96 cavidades y se re-probaron para la inducción de ß-galactosidasa mediante 0, 0.2 y 1 ppm de etametsulforón utilizando un sistema de ensayo basado en cultivo liquido. La Figura 4 .muestra las actividades de ß-galactosidasa relativa de 45 clones de aciertos de la librería L4 putativos 97-142 contra 0, 0.2 y 1 ppm de etametsulfurón . Los cultivos cultivados en el formato de 96 cavidades se subcultivaron en LB fresco con inductor en la concentración indicada y se cultivaron durante la noche y luego se procesaron para el ensayo de enzima. Para la detección de la actividad inducida, se utilizó 5 µ? de la mezcla de células perforadas. La detección de la actividad de la actividad antecedente, 25 µ? de células se utilizaron tal que la actividad detectable podría ser medida en el mismo cuadro de tiempo para todos los tratamientos. Los valores de actividad antecedente se multiplicaron por diez para llevarlos en el intervalo de la gráfica. Los números enseguida de cada muestra se refieren al número de clon de librería. La parte posterior de la gráfica contiene el acierto Ll-9 de primera ronda de controles así como TetR wt .

Las secuencias de DNA para todos los 142 clones de aciertos putativos se determinaron y los polipéptidos traducidos se alinearon. Después de asignar cada polipéptido en la alineación con una respuesta de etametsulfurón relativa, los patrones de incorporación de aminoácido de residuos variados o mutados asociados con alta o baja actividad de respuesta y alta o baja actividad no induvida se identificaron. La mayoría de los descubrimientos significantes de este análisis fueron: las mutaciones C138G o L170V fueron muy favorecidas en los clones superiores L4-59, -89, -1 10, -116, -118, -120, -124, -129, -133, -139, -140 y -142; y K108Q fue muy incorporado en clones con la actividad más alta en la dosis más baja de 0.2 ppm, pero estos clones mostraron un poco de antecedente fugaz (por ejemplo, L4-98, -106, -113, -126, -130, y -141) . Los resultados del clon L4-18 que tiene el K108Q muestran otra posible mutación interesante de L55M. Este clon se induce a un alto nivel con 0.2 ppm de Es, pero no muestra la acta actividad antecedente asociada típicamente observada para clones que contienen K108Q. la mutación L55M puede tener actividad represora incrementada. Es de interés que ninguno de estos cambios diferentes de L55M fueron de diversidad diseñada - todos se derivaron de la incorporación falsa de nucleótidos durante el ensamble de la librería y pocos de estos cambios se representaron en la población de clones no seleccionados.

J. Diseños de librería de tercera ronda y clasificación Librería L6: entremezclado para la respuesta de Clorsulfurón aumentada Puesto que los clones L2-14 y L2-18 tuvieron el mejor perfil de actividad de clorsulfurón de la librería L2, su diversidad de aminoácidos se utilizó como la base para la siguiente ronda de entremezclado. Además de la diversidad proporcionada por estas secuencias antecedentes, los cambios de residuo adicionales a través de los cambios aumenta el empaquetamiento de clorsulfurón basado en las predicciones del modelo 3D se incluyeron. Nuevas posiciones de aminoácido dirigidas fueron 67, 109, 112 y 173 (ver, la Tabla 14) . La sustitución de Gln (Q) en la posición 108 y Val (V) en la posición 170 se mostraron que son probablemente cambios importantes en la librería L4 para ganar responsividad de SU aumentada y así se variaron aquí también. Un resumen de la elección de diversidad se muestra en la Tabla 14. Los oligonucleótidos diseñados y utilizados para generar la librería 6 se muestran en la Tabla 15.

La librería 16 se ensambló, se rescató, se ligó en pVER7314, se transformó el KM3 de E. coli y se colocó sobre carbenicilina/canamicina de LB y carbenicilina solamente como el medio de control como antes. Las placas de librería luego se recolectaron en 42 placas de microtítulo de 384 cavidades (~16,000 clones) que contiene 60 µ? de caldo de carbenicilina LB (Cb) por cavidad. Después del crecimiento durante la noche >a 37 °C los cultivos se estamparon en placas de ensayo M9 que no contienen inductor, 0.2 ppm, y 2.0 ppm de clorsulfurón como inductor de prueba. Después de la incubación a 30°C durante ~48hrs, los aciertos putativos respondientes al tratatamiento de clorsulfurón como es determinado por el color de colonia azul incrementado se rearreglaron en seis places de microtitulo de 96 cavidades y se utilizaron para estampar un conjunto fresco de placas de ensayo M9 paa confirmar los resultados anteriores. Para un análisis más detallado de la inducción relativa por clorsulfurón, fotografías digitales se tomaron de las places después de varios puntos de tiempo de incubación a 30 °C y la intensidad de color de la colonia se midió utilizando el programa freeware de análisis de imagen digital Image J (Rasband, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2007) . La utilización de estos resultados permitió la clasificación de clones en formato múltiples por la actividad antecedente (sin inductor), activación con bajo o alto nivel de aplicación de inductor (color azul con inductor) , y activación en veces (activación dividida entre el antecedente) . Los estudios de activación utilizaron 0.2 \xg/ml de clorsulfurón como el inductor para el conjunto superior de clones muestra una mejora de aproximadamente 3 veces en la activación mientras que se obtienen niveles no inducidos inferiores de expresión (Tabla 12). Además de este análisis, la información de secuencia de DNA para la mayoría de los clones (490 clones) se obtuvo y los polipéptidos deducidos se alinearon entre sí así como con su información de actividad correspondiente. De este análisis se derivaron las relaciones de secuencia-actividad (Tabla 12). Los residuos inclinados para la actividad mejorada se indican en negritas. Brevemente, C en la posición 100, y Q en las posiciones 108 y 109 fuertemente se correlacionaron con la activación, mientras que R en la posición 138, L en la posición 170, y A o G en la posición 173 fueron altamente preferidos en clones con la actividad antecedente más baja. Aunque algunas posiciones fueron fuertemente inclinadas, es decir, observaron más frecuentemente la población seleccionada, la totalidad de diversidad introducidas se observó en la población de aciertos completa. Esta información ayudará en el diseño de librerías adicionales para mejorar la responsividad a clorsulfuron.

TABLA 14 Posición de residuo de aminoácido o No mb de la Di A M N Q M S M M G N L G L Q Y T K L T Q V R V A A W Q A V V id H G ad de Li br Re L H F N F H P K Q T L Q L G H E H D L A I F D fe wt L2 M A F N M C W K Q T A M V R V F S A L A L K D 1 6 1 1 14 6 8 8 L2 M Q F T M W w K Q T A Q M R N F L A L A W K D 5 5 1 18 9 7 0 L6 M A I N M C w Q Q A A M V R V F S A L A W K D 3 6 4 - 0 IB 6 6 03 0 L6 M Q Y T M C w Q I T A Q M R V F L A I A K D 1 5 2 - 3 2C 2 6 09 6 L6 M Q F T M C w Q Q T A M M R V F S A V A W K D 2 5 3 - 0 2D 8 4 07 0 L6 M A Y T M C w Q H s A M V R V F S A V A W K D 1 5 2 - 5 3H 6 8 02 8 L6 M Q Y N M C w K Q s A M V R V F S A L A w K D 1 5 3 O 7 4D 10 L6 M A I N M C W Q Q A A Q V R V F L A L A W K D 2 5 4 5F 4 1 05 L6 M Q Y N M C W Q Q T A Q V R V F L A L G W K D 3 7 4 4 5G 0 9 06 L6 M Q I N M C W K Q T A V R V F L A V A K D 1 5 2 3 . . 5H 1 7 06 L6 M A Y N M C W K Q T A Q R V F L A V A W K D 2 5 5H 7 2 12 L6 M ft L T M C W Q Q S A M M R V F S A L A W K D 1 5 2 6F 1 3 07 TABLA 15 Oligo Secuencia SEQ ID L6:l TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGAGCTCTGCTCGACGCCTTA 1084 L6:2 GCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGC 1085 L6:3 ATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAA 1086 L6: 4 TTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCC 1087 L6:5 TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAMTGCT 1088 L6: 6 TAAAGCACATCTCATACTTTTAGCAKTATTACGTAAAAAATC 1089 L6: 7 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAMAHGTGAGTTGCGTG 1090 L6: 8 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAATAGTGAGTTGCGTG 1091 L6:9 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCCTTTAATTC 1092 L6:10 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACGCAACTCACTATTGCCCT 1093 L6: 11 RSTGCTGAAAATATGTTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 1094 L6: 12 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTTTGATCAAGAGCTCCAAGTC 1095 L6: 13 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGGAGCTCTTGATCAAA 1096 L6:14 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACGCAACTCACDTKTGCCCT 1097 L6:15 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACCAAACTCACDTKTGCCCT 1098 L6: 16 GCCATTGAGATGATGGATAGGCACCAAACTCACTATTGCCCT 1099 L6:17 AAAAGTATGAGATGTGCTTTACTAAGCCATCGCGATGGAGCA 1100 L6:18 AAAGTATGLTTAGGTACACGCTGGACAGAA, AACAWTATGAA 1101 L6: 19 AAAGTATGKTTAGGTACACGCTGGACAGAAMAAWTGTATGAA 1102 L6:20 RSTGCTGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 1103 L6:21 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCGTGGRGGGTG 1104 L6:22 TCACTAGAGAATGCATTATATGCARTGAGTGCGTGGRGGAAC 1105 L6:23 TTTACTTTAGGTTGCGTATTGTTTGATCAAGAGAGCCAAGTC 1106 L6:24 GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGCTAGTATGCCG 1107 L6:25 CCATTAKTGCGACAAGBTTKGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 1108 L6:26 CCATTAGCCCGACAAGBTTKGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 1109 L6:27 GGATTAGAAAAACAACTTAAATGCGAAAGTGGGTCTTAA 1110 L6:28 CCTATCCATCATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAGAGCTCG 1111 L6:29 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAMAHGTGAGTTTGGTG 1112 L6:30 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAATAGTGAGTTTGGTG 1113 L6:31 GGCTAACATATTTTCAGCASYTTCATAWTGTTKTTCTGTCCA 114 L6: 32 GGCTAACATATTTTCAGCASYTTCATAWTGTTKTTCTGTCCA 115 L5:33 GGCTAATTGATTTTCAGCASYTTCATAQWTGTTKTTCTGTCCA 116 L6:34 GGCTAACATATTTTCAGCASYTTCATACAWTTKTTCTGTCCA 117 L6:5 GGCTAATTGATTTTCAGCASYTTCATACAWTTKTTCTGTCCA 118 L6: 36 CAATACGCAACCTAAAGTAAACACCCYCACAGCACTCAYTGC 119 L6: 37 CAATACGAACCTAAAGTAAAGTTCCYCACAGCACTCAYTGC 1120 L6: 38 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGGCTCTCTTGATCAAA 1121 L6:39 CMAAVCTTGTCGCAMTAATGGCGGCATACTAGCAGTAGTAGG 1122 L6: 40 CMAAVCTTGTCGGGCTAATGGCGGCATACTAGCAGTAGTAGG 1123 L6:41 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCGCA 1124 K. Librería L7: Entremezclado para la respuesta de Etametsulfurón aumentada La elección de parentales para representar la diversidad de residuo de aminoácido para la librería L7 se basó en las conclusiones del análisis de la librería L4 -específicamente a la incorporación de mutaciones K108Q, C138G y L170V. Los clones también se eligieron para llevar en otros cambios que ocurrieron en una frecuencia mucho menor en L4, pero pueden haber contribuido a la actividad. Estos residuos son L55M, N129H, V137A y F140Y. Además de la diversidad de familia, otras modificaciones de residuo se introdujeron en las posiciones de aminoácido 67, 109, 112, 117, 131 y 173 basado en la modelación estructural. Esta información se resume en la Tabla 14 que muestra el resumen de diversidad de L7. También se muestra en la Tabla 16 una alineación de secuencia de los aciertos L7 de desempeño 10 superior limitado a las diferencias entre los aciertos y TetR wt . La actividad se determinó utilizando el análisis de imagen del color de la colonia (software ImageJ) sobre placas de ensayo M9 que contienen 0, 0.02 o 0.2 ppm de etametsulfurón . En el fondo de la Tabla 16 está un resumen del análisis de relación de secuencia-actividad para el conjunto de datos completo derivado de más de 300 clones, con las posiciones fuertemente inclinadas mostradas en negritas más grandes. Aunque algunas posiciones fueron fuertemente . inclinadas, es decir, observaron más frecuentemente en la población seleccionada, por ejemplo, M en la posición 55, la totalidad de diversidad introducida se observó en la población de aciertos completa. TABLA 16 La librería L7 se construyó como para la librería Ll utilizando el conjunto de oligonucleótidos mostrados enseguida en la Tabla 17.

TABLA 17 Oligo ID Secuencia de Oligo SEQ ID L7:01 TATTGGCATGTAAAAAATAAGCGAGCTCTGCTCGACGCA TG 1125 L7 : 02 GCCATTGAGATGCTGGATAGGCACGCGACTCACDTSTGCCCT 1126 L7 : 03 GCCATTGAGATGCTGGATAGGCACGCGACTCACTATTGCCCT 1127 L7:04 TTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCT 1128 L7.-05 AAAAGTATGAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCA 1129 L7:06 AAAGTATGTTTAGGTACAGGCTTTACAGAAMAGMTGTATGAA 1130 L7 : 07 AAAGTATGTTTAGGTACAGGCTTTACAGAAMAGCAMTATGAA 1131 L7:08 RSTGCCGAAAATAGTMTGGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTT 1132 L7:09 TCACTAGAGMACGCAMTGTATGCAATGCAGGCTGY6KGTATT 1133 L7:10 TWTACTTTAGGTTGCGTATTGTTGGATCAAGAGCTTCAAGTC 1134 L7:ll GCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCG 1135 L7:12 CCATTAGCTCGACAAGBTCTGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 1136 L7:13 CCATTASTCCGACAAGBTCTGGAATTAAAGGATCACCAAGGT 1137 L7:14 GCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGC 1138 L7: 15 GGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAA 1139 L7.-16 CCTATCCAGCATCTCAATGGCCAWTGCGTCGAGCAGAGCTCG 1140 L7:17 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCASAHGTGAGTCGCGTG 1141 L7:18 TTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAATAGTGAGTCGCGTG 1142 L7:19 TAAAGCACATCTCATAC5555AGCGTTATTACGTAAAAAAC 1143 L7 :20 GCCTGTACCTAAACATACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAG 1144 L7:21 GGCCAKACTATTTTCGCASYTTCATACAKCTKTTCTGTAAA 1145 L7:22 GGCCAKACTATTTTCGGCASYTTCATAKTGCTKTTCTGTAAA 1146 L7:23 ATACAKTGCGTKCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAA 1147 L7:24 CAATACGCAACCTAAAGTAWAAATACMARCAGCCTGCATTGC 1148 L7:25 TGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGAAGCTCTTGATCCAA 1149 L7:26 , CAGAVCTTGTCGAGCTAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGG 1150 L7:27 CAGAVCTTGTCGGASTAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGG 1151 L7 :28 GAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCCTTTAATTC 1152 L7:29 TTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCC 1153 L7 : 30 GGGAACTTCGGCGCGCCTTAAGACCCACTTTCACA 1154 Después de la transformación de la librería en KM3 de E. coli y la colocación en LB+Cb+Km las colonias resultantes se reformatearon en cincuenta y dos placas de microtitulo de 384 cavidades (~20,000 colonias) y subsecuentemente se utilizaron para la placa replicada sobre el medio de ensayo M9 que contiene ya sea 0 g/ml, 0.02 pg/ml o 0.2 yg/ml de etametsulfurón . Después de la incubación a 30°C durante 48 hrs las placas se observaron y 326 aciertos correspondientes a 0.02 g/ml de inductor se identificaron y se rearreglaron en el formato de 96 cavidades. Después de la incubación a 30°C durante 30°C durante 15, 24, 48 y 120 horas, se tomaron imágenes digitales de las placas y la información de color de colonia relativa se convirtió a datos numéricos. El análisis de secuencia de DNA se llevó a cabo en paralelo, y los dos conjuntos de datos surgieron para el cálculo de las relaciones de secuencia-actividad. Los datos de secuencia para los diez clones superiores asi como el resumen de la relación de secuencia-actividad se muestran en la Tabla 16. Los resultados del estudio de relación de secuencia-actividad reveló preferencias que impactan tanto la activación y las actividades antecedentes de los represores de etametsulfurón putativo (EsR's). Por ejemplo, un descubrimiento significante de esta librería fue que la modificación de L55M grandemente redujo la actividad antecedente y así aumentó los niveles de activación en veces. Como se observa de las librerías L4 y L6, K108Q y wt Q109 se prefirieron para la activación. También hubo un alto grado de inclinación hacia L170V con relación a la activación. Esto es diferente de la inclinación L170A o L170G observada en la librería L6, ya que esas modificaciones tuvieron una fuerte correlación con la actividad antecedentes de disminución en la librería L6. Finalmente, teniendo un efecto menos dramático en la activación pero no obstante preferido es F67Y.

L. Propiedades de inducción de los aciertos L7 superiores en cultivos líquidos Basado en el desempeño de los aciertos rearreglados, se hizo un segundo rearreglo y los clones se probaron para la actividad de ß-galactosidasa en cultivo líquido junto con los controles TetR wt y los aciertos de 2a ronda seleccionados para analizar adicionalmente su desempeño y el progreso de entremezclado. Los aciertos superiores de la librería L7 se reanalizaron y se probaron en el formato de cultivo de 96 cavidades para la inducción relativa mediante 0.02 y 0.2 ug/ml de inductor o la actividad antecedente sin inductor (Figura 5) . Los cultivos se cultivaron durante la noche y luego se subcultivaron en medio fresco que contiene tratamientos apropiados. Después de seis horas de incubación las células se procesaron para el ensayo de enzima. Para el ensayo de actividad inducida 5 µ? de mezcla de célula perforada se utilizó, para la actividad antecedente, 25 µ? de células se utilizaron tal que la actividad detectable podría ser medida en el mismo cuadro de tiempo para todos los tratamientos. Los valores de actividad antecedente se multiplicaron por diez para llevarlos en el intervalo de la gráfica. Los números enseguida de cada muestra se refieren a la ID de cavidad de rearreglo final (escritura vertical) y la ID de cavidad del rearreglo original (escritura horizontal) . La parte posterior de la gráfica contiene los controles. Mostrados están los aciertos L4-89 y L4-120 de la 2a ronda así como TetR wt . La muestra final muestra un control que comprende TetR wt con 0.4 µ? de ate como inductor cognado para la comparación. Los resultados muestran que diez a quince de los aciertos superiores tienen actividad inducida que se aproxima a aquella de TetR wt inducido con 0.4 µ? de ate. Además, muchos de los aciertos tienen actividades antecedentes casi tan bajas con TetR de tipo silvestre. Algunos de los mejores aciertos tienen relaciones de inducción con 0.2 ppm de inductor (0.5 µ?) que se aproxima a 70-80% de TetR wt (-1200 veces) . Es interesante que los aciertos que se desempeñan mejor en la concentración de inductor baja de 0.02 ppm (50 nM) también tendieron a tener la actividad antecedente más alta indicando que fueron menos estrechamente enlazados al operador tet y más fácilmente liberados con el enlace de inductor transiente.- La comparación de la actividad de inducción entre los aciertos de la 2a y 3a ronda es acentuante, mostrando una mejora de mayor que 200 veces. Considerando esta mejora, una sola ronda adicional de entremezclado y clasificación puede producir el represor de sulfonilurea (SuRs) que son casi tan sensibles a etametsulfurón como el TetR wt es para tetraciclina .

Resumen La Figura 9 proporciona un resumen acumulativo de la diversidad introducida y los aminoácidos observados en SuRs activos obtenidos de los ensayos de clasificación. Aunque algunas posiciones fueron fuertemente inclinadas, es decir observaron más frecuentemente la población seleccionada, como es indicado por las letras en negritas, la totalidad de la diversidad introducida se observó en las poblaciones de aciertos completa.

M. Diversidad novedosa a través de la mutagénesis in vi tro Los residuos A64, M86, C100, G104, F105, Q108, A113, S116, M134, Q135, 1139, Y140, L147, L151 , V170, L174 y K177 del acierto L7-A11 de la ronda 3 cada uno se mutagenizaron en todos los posibles 20 aminoácidos para generar un conjunto de 340 clones. Cada uno de los clones se colocó por replicado sobre el medio de ensayo 9 que contiene 0, 5, 20 y 200 ppb de etametsulfurón . Para estimar la actividad relativa de cada uno de los mutantes las placas que contienen ligando se fotografiaron después de 18 hrs de incubaron a 37°C. Para determinar el estado fugaz de los clones represores la placa que no tiene adición se ligando se fotografió después de la incubación durante 24 hrs a 37 °C seguido por 48 hrs de incubación a 25°C. Las mediciones cuantitativas se hicieron mediante fotografías digitales de exploración de cada colonia para color azul utilizando el software ImageJ.

Estos datos revelaron que las sustituciones seleccionadas en las posiciones L60, A64, N82, M86, A113, SI 16, M134, L174 y K177 demostraron un incremento en la sensibilidad de etametsulfurón con relación al clon parental L7-A11.

N. Entremezclado de la quinta ronda Se realizó el entremezclado diseñado para la sensibilidad de etametsulfurón mejorada. La Librería L13 (Tabla 18) se diseñó para incorporar diversidad novedosa generada por el experimento de mutagénesis in vitro en el Ejemplo 1 M que tuvo efecto ya sea positivo o neutro en la actividad. Además, la librería también incorporó diversidad en residuos cisteína seleccionados en la cadena principal como es listado (Tabla 18) . El tamaño de la librería predicha es 124,000 miembros.

TABLA 18 La librería se ensambló de oligonucleótidos sintéticos listados ' en la Tabla 19 utilizando la metodología como es descrita previamente en este ejemplo.

TABLA 19 Oligo Secuencia SEQ ID L13: 1 TGGCACGTCAAGAACAAGCGAGCTCTGCTAGACGCTATGGCC 1159 L13:2 ATTGAGATGTTSGATAGGCACAAGACCCACTACTGTCCTTTG 1160 L13:3 ATTGAGATGTTSGATAGGCACAAGACCCACTACCTGCCTTTG 1161 L13:4 ATTGAGATGTTSGATAGGCACG, CACCCACTACTGTCCTTTG 1162 L13: 5 ATTGAGATGTTSGATAGGCACG, CACCCACTACCTGCCTTTG 1163 L13: 6 GAAGGGGAAAGCTGGCAAGACTTCTTGAGGAACAATGCTAAG 1164 L13:7 GAAGGGGAAAGCTGGCAAGACTTCTTGAGGAACARGGCTAAG 1165 L13: 8 TCCAKGAGAAATGCTTTGCTCAGTCACCGTGATGGAGCCAAG ¦ 1166 L13: 9 GTCTGCCTAGGTACGGGCTTCACGGAGCAACAGTATGAAACT 1167 L13: 10 GTCGCTCTAGGTACGGGCTTCACGGAGCAACAGTATGAAACT 1168 L13: 11 GCTGAGAACTSKCTTGCCTTCCTGACACAACAAGGTTTCTCC 1169 L13: 12 ATGGAGAACTSKCTTGCCTTCCTGACACAACAAGGTTTCTCC 1170 L13: 13 CTTGAGAACGCCCTCTACGCATTTCAAGCTGTTGGGATCTAC 1171 L13: 14 CTTGAGAACGCCCTCTACGCAGGTCAAGCTGTTGGGATCTAC - 1172 L13: 15 CTTGAGAACGCCCTCTACGCAATGCAAGCTGTTGGGATCTAC 1173 L13: 16 ACTCTGGGTTGCGTCTTGCTGGATCAAGAGCTGCAAGTCGCT 1174 L13: 17 AAGGAGGAGAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCA 1175 L13: 18 CTGGTTCGACAAGCTTACGAACTCCACGATCACCAAGGTGCA 1176 L13: 19 CTGGTTCGACAAGCTTACGAACTCARAGATCACCAAGGTGCA 1177 L13:20 CTGGTTCGACAAGCTHTCGAACTCCACGATCACCAAGGTGCA 1178 L13:21 CTGGTTCGACAAGCTHTCGAACTCARAGATCACCAAGGTGCA 1179 L13:22 GAGCCAGCCTTCCTGTTCGGCCTTGAACTGATCATAWGTGGA 1180 L13:23 TTGGAGAAGCAGCTGAAGTGTGAAAGTGGGTCTTAATGATAG 1181 L13:24 TTGGAGAAGCAGCTGAAGGCAGAAAGTGGGTCTTAATGATAG 1182 L13:25 GTGCCTATCSAACATCTCAATGGCCATAGCGTCTAGCAGAGC 1183 L13:26 GTCTTGCCAGCTTTCCCCTTCCAAAGGACAGTAGTGGGTCTT 1184 L13:27 GTCTTGCCAGGTTTCCCCTTCCAAAGGCAGGTAGTGGGTCTT 1185 L13:28 GTCTTGCCAGCTTTCCCCTTCCAAAGGACAGTAGTGGGTGKC 1186 L13:29 GTCTTGCCAGCTTTCCCCTTCCAAAGGCAGGTAGTGGGTGKC 1187 L13: 30 GAGCAAAGCATTTCTCMTGGACTTAGCATTGTTCCTCAAGAA 1188 L13: 31 GAGCAAAGCATTTCTCMTGGACTTAGCCYTGTTCCTCAAGAA 1189 L13: 32 GAAGCCCGTACCTAGGCAGACCTTGGCTCCATCACGGTGACT 1190 L13: 33 GAAGCCCGTACCTAGAGCGACCTTGGCTCCATCACGGTGACT 1191 L13: 34 GAAGGCAAGMSAGTTCTCAGCAGTTTCATACTGTTGCTCCGT 1192 L13: 35 GAAGGCAAGMSAGTTCTCCATAGTTTCATACTGTTGCTCCGT 1193 L13: 36 TGCGTAGAGGGCGTTCTCAAGGGAGAAACCTTGTTGTGTCAG 1194 L13: 37 CAGCAAGACGCAACCCAGAGTGTAGATCCCAACAGCTTGAAA 1195 L13: 38 CAGCAAGACGCAACCCAGAGTGTAGATCCCAACAGCTTGACC 1196 L13: 39 CAGCAAGACGCAACCCAGAGTGTAGATCCCAACAGCTTGCAT 1197 L13: 40 AGGTGTTTCCCTCTCCTCCTTAGCGACTTGCAGCTCTTGATC 1198 L13:41 TTCGTAAGCTTGTCGAACCAGTGGCGGCATACTATCAGTAGT 1199 L13: 42 TTCGADAGCTTGTCGAACCAGTGGCGGCATACTATCAGTAGT 1200 L13: 43 GCCGAACAGGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCGTGGAG 1201 L13: 44 GCCGAACAGGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCTYTGAG 1202 L13: 45 ACACTTCAGCTGCTTCTCCAATCCACWTATGATCAGTTCAAG 1203 L13: 46 TGCCTTCAGCTGCTTCTCCAATCCACWTATGATCAGTTCAAG 1204 L13: 47 GCGCCAAGGTACCTTCTGCAGCTATCATTAAGACCCACTTTC 1205 La librería ensamblada luego se clonó en pVER7571.

Este vector es el mismo como el vector pVER7314 excepto porque tiene un sitio de enlace de riboso a mutado para reducir la cantidad de represor producido por célula. Esta modificación permite la estimación más severa de la actividad represora en el ensayo de placa genético azul/blanco estándar, asi como en el ensayo de ß-galactosidasa cuantitativo de célula completa basado en liquido. Después de la colocación en placa de la librería, aproximadamente 5,000 clones se rearreglaron y se colocaron en placa por replicado en placas de ensayo M9 sin adición, o con 2 " ppb de etametsulfurón más arabinosa al 0.002%. Las colonias que responden más fuerte con etametsulfurón mientras que permanecen blancas sin inductor se eligieron como aciertos. Uno de los aciertos, L13-23, se encontró que es be ~3 veces más mejorado sobre el L7-A11 parental de la ronda 3 y tiene la mejor actividad represora dentro de esta comparación (Figura 11). Los cambios de secuencia del acierto de la ronda 5 comparado con la molécula L7-A11 parental y TetR wt se muestra en la Tabla 20.

TABLA 20 EJEMPLO 2: DESARROLLO DEL ENSAYO DE' PLANTA A. Ensayo de infiltración de hoja de Nicotiana benthamiana Se deseó un ensayo de planta transiente in planta para continuar rápidamente en la funcionalidad de los represores responsivos de SU candidatos in planta antes de la prueba en plantas transgénicas . Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de infiltración de hoja basado en Agrobacterium para medir las actividades de represión y desrepresión. La estrategia emplead es infiltrar hojas con una mezcla de cepas de Agrogacterium reportadoras y efectoras (represoras) tal que la actividad reportadora se reduce por ~90% de la presencia del efector y luego se desreprime después del tratamiento con el inductor.

Dos represores de etametsulfurón, EsR All y EsR D01 se seleccionaron para la prueba en conjunción con un control TetR de tipo silvestre para la respuesta de dosis a etametsulfurón por la expresión transiente en hojas de Nicotiana benthamiana (Figura 6) . Con este fin, tres cepas de prueba se derivaron mediante la transformación de EHA105 de Agrobacterium tumefacíens con tres vectores basados en T-DNA diferentes. Las cepas de Agrobacterium que albergan vectores binario con un reportador de 35S : : tetO-Renilia Luciferasa y las variantes efectoras dPCSV-tetR o -SuR se construyeron. Además de estos cultivos probadores, una cepa de Agrobacterium existente que alberga T-DNA de dM V-GFP se adicionó a la mezcla de ensayo para monitorear la progresión de la infección de Agrobacterium para propósitos de muestreo.

Para probar el sistema para la activación de cambio químico, mezclas de los cultivos de Agrobacterium probadores que contiene 10% de 35S : : tetO-ReLuc reportador Agro, 10% de d MV-GFP Agro y 80% de dPCSV-wt tetR Agro se infiltraron en hojas de N. benthamiana y se co-cultivaron durante 36 horas en la cámara de crecimiento. En este tiempo las hojas infiltradas se extirparon y el peciolo se colocó en agua (control negativo) o el inductor en las concentraciones de prueba indicado en la Figura 6 y se dejaron co-cultivar durante otras 36 horas. Las áreas de hojas infectadas se ensayaron para la actividad de luciferasa de Renilla y los tratamientos inductores se compararon. Los resultados muestran represiones significante de la actividad reportadora (~90%) sin tratamiento de inductor (control de agua) para todos los represores probados, e inducción significante pero incompleta del represor EsR D01 enla concentración de inductor tan baja como 0.02 ppm Es. Ambos EsT's se indujeron completamente en 0.2 ppm de ES mientras que TetT solo fue completamente inducido en 2.0 ppm de anhidrotetraciclina (ate) (Figura 6) .

B. Alto rendimiento en el desarrollo de ensayo de planta utilizando el cultivo celular BY-2 de N. tabacum Además del ensayo de hoja se deseó tener un ensayo in planta para permitir la clasificación de alto rendimiento de las librerías SuR para la funcionalidad de planta óptima. Los inventores diseñaron un sistema similar al ensayo de hoja utilizando el cultivo celular BY-2 de tabaco en el formato de 96 cavidades. El cultivo celular BY-2 se transformó en un constructo d V-HRA tal que el cultivo resistiría el tratamiento con los compuestos de prueba de sulfonilurea objetivo. La línea celular resultante se cultiva y es completamente resistente a los 200 ppb de clorsulfuron.

EJEMPLO 3: ENSAYO DE ENLACE DE OPERADOR Para confirmar que los ligandos de sulfonilurea se enlazaron directamente a las moléculas represoras modificadas y causa desrepresión, se llevó a cabo un estudio de desplazamiento de gel operador tet in vitro.

Un ensayo de desplazamiento de movilidad de gel electroforético (E SA) de las variantes EsR se hizo para monitorear el enlace a la secuencia operadora tet (tetO) y la respuesta del complejo a los inductores Es y Cs. TetO consiste de un fragmento que contiene TetO de 48 bp sintético creado para la hibridación del oligonucleótido tetOl (SEQ ID NO: 1 155) : 5' -CCTAATTTTTGTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTC-3' y el oligonucleótido complementario tet02 (SEQ ID NO: 1156) : 5 ' -GGATTAAAAACAACTGTGAGATAGTAACTATCTCAATAAAATGGTGAG-3 ' El operador tet se muestra en negritas.

Un oligonuclaótido y su complemento del mismo tamaño que no contiene secuencia palindrómica" se utilizó como un control (SEQ ID NO: 1157): 5' -CCTAATTTTTGTTGACTGTGTTAGTCCATAGCTGGTATTTTACCACTC-3' y el oligonucleótido complementrio (SEQ ID NO: 1 158) : 5 ' -GGATTAAAAACAACTGACACAATCAGGTATCGACCATAAAATGGTGAG- 3 ' Cinco pmol de TetO o DNA se control se mezcló con las cantidades indicadas (Figura 7) de la proteina del represor etamet sulfurón (L7A11 o el control de BSA con o sin inductor en la solución reguladora completa que contiene Tris-HCl 20 mM (pH 8.0) y EDTA 10 mM- La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 0.5 horas antes de la carga sobre el gel. La reacción se sometió a electroforesis en un gel de retardación de DNA Novex 6% (Invitrogen, EC6365BOX) a temperatura ambiente, 38 V en 0.5 X de solución reguladora TBE durante aproximadamente 2 horas. El DNA se detectó mediante el manchado con bromuro de etidio. El marcador de tamaño de DNA consiste de la escalera de masa de bajo DNA (InVitrogen 10068-013) .

Los resultados se muestran en la Figura 7. Estos resultados directamente demuestran que los represores modificados se enlazan al DNA operador (franja 1 contra franja 3-6) y luego se liberan de la secuencia operadora en una manera especifica del inductor dependiente de la dosis. Los datos también indican una preferencia inductora para la liberación de operador por Es comparado con Cs (franja 9 contra 10) . Ningún cambio en la liberación del operador podría ser detectado por ate comparado con el no inductor (franja 5 contra 11).

EJEMPLO 4: ENLACE Y CONSTANTES DE DISOCIACIÓN Los represores Su seleccionados además se caracterizaron para el enlace de operadores de ligando, la cinética de afinidad y disociación utilizando la tecnología Biacore™ SPR (Biacore, GE Healthcare, USA) . La tecnología está basada en la resonancia del plasmón de superficie (SPR) , un fenómeno óptico que permite la detección de interactuantes no etiquetados en tiempo real. Los biosensores basados en SPR se pueden utilizar en la determinación de la concentración activa, clasificación y caracterización en términos de tanto la afinidad como la cinética.

La cinética de una interacción, es decir, las velocidades de formación de complejo. (ka) y disociación (kd), se puede determinar de la información en un sensorgrama. Si el enlace ocurre a medida que la muestra pasa sobre una superficie sensora preparada, la respuesta en el sensorgrama se incrementa. Si se alcanza el equilibrio, se observa una señal constante. El reemplazo de la muestra con solución reguladora causa que las moléculas enlazadas se disocien y disminuya la respuesta. El software de evaluación Biacore genera los valores de ka y kd al ajusfar los datos a modelos de interacción.

La afinidad de una interacción se determinar al nivel de enlace en el equilibrio (observado como una señal constante) como una función de. la concentración de muestra. La afinidad también se puede determinar de mediciones cinéticas. Para una interacción 1:1 simple, la constante de equilibrio KD es la relación de las constantes de velocidad cinética, kd/ka.

A. Caracterización de , enlace del operador represores B. Caracterización de enlace de SU de los represores KD (µ?) Represor Es +Mg Es -Mg Cs +Mg Cs -Mg ATC +Mg L7-1C03- 0.46 1.78 83 365 A5 L7-1F08- 0.45 1.09 40 92 All L7-1G06- 0.53 2.15 60 255 B2 L7-3E03- 0.73 2.15 48 115 Dl Wt TetR Nuil Nuil Nuil Nuil 0.0036 EJEMPLO 5: FUSIONES DE DOMINIO DE ENLACE DE LIGANDO REPRESOR DE SULFONILUREA Los dominios de enlace de ligando de los represores de sulfonilurea proporcionados en la presente se pueden fusionar a dominios de enlace de DNA alternativos con el fin de crear represores de sulfonilurea adicionales que selectivamente y específicamente enlazan a otra secuencia de DNA (por ejemplo, Wharton y Ptashne (1985) Nature 316:601-605) . Muchos experimentos de intercambio de dominio se han publicado, demostrando la amplitud y flexibilidad de este procedimiento. Generalmente, un dominio de enlace de operador o residuos de contacto de aminoácido/operador específicos de un diferente sistema de represor será utilizado, pero también se pueden utilizar otros dominios de enlace de DNA. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico TetR(D)/SuR que consiste del dominio de enlace de DNA de TetR(D) (por ejemplo, residuos de aminoácido 1-50) y el dominio de enlace de ligando de los residuos SuR (por ejemplo, residuos de aminoácido 51-208 de TetR(B) se pueden construir utilizando cualquier método de biología molecular estándar o combinación de los mismos, incluyendo la digestión y ligación de enzima de restricción, PCR, oligonucleótidos sintéticos, clonación de mutagénesis o recombinacional . Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un SuR que comprende una quimera de TetR(D)/SuR se puede construir mediante PCR (Landt y colaboradores, (1990) Gene 96:125-128/ Schnappinger y colaboradores, (1998) EMBO J 17:535-543) y clonar en un cásete de expresión adecuado y vector. Cualquiera de otros dominios de enlace de TetOp se pueden sustituir para producir un SuR que específicamente enlaza a la secuencia operadora tet cognada.

Además, los dominios de enlace TetOc mutantes de TetR' s variantes que tienen actividad supresora sobre secuencias operadoras constitutivas (tetO-4C y tetO-6C) se puede utilizar (ver, por ejemplo, Helbl y Hillen (1998) J Mol Biol 276:313-318; and Helbl y colaboradores, (1998) J Mol Biol 276:319-324). Además, los polinucléótidos que codifican dominios de enlace de DNA se pueden modificar para cambiar sus propiedades de enlace de operador. Por ejemplo, los polinucléótidos pueden ser entremezclados para aumentar la resistencia de enlace o especificidad a una secuencia operadora de tipo silvestre o tet modificada, o para seleccionar el enlace específico a una nueva secuencia operadora .

Variantes adicionales se podrían hacer al fusionar un represor SuR, o un dominio de enlace de ligando SuR a un dominio de activación. Tales sistemas se han desarrollado utilizando el represor Tet. Por ejemplo, un sistema convirtió un represor tet a un activador por la vía de la fusión del represor al dominio de transactivación transcripcional tal como el virus de herpes simple VP16 y el represor tet (tTA, Gossen y Bujard (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:5547-5551). La fusión del represor se utiliza en conjunción con un promotor mínimo que es activado en la ausencia de tetraciclina mediante el enlace de tTA a las secuencias operadoras. La tetaciclina inactiva el transactivador e inhibe la transcripción.

EJEMPLO 6: Prueba de Proteínas Represoras en Soja Cualquiera de los protocolos de transformación, técnicas de cultivo, fuente de soja y medios, y técnicas de clonación molecular se puede utilizar con las composiciones y métodos. A. Transformación y Regeneración de Soja (Glycine max) Las líneas de soja transgénicas se generaron por el método de bombardeo con pistola de partícula (Klein y colaboradores, Nature 327:70-73 (1987); patente norteamericana No. 4,945,050) utilizando un instrumento PDS1000/He BIORAD Biolistic y cualquier plásmido o DNA de fragmento. Las siguientes soluciones de extracto y medios se utilizaron para la transformación y regeneración de plantas de soja.

Soluciones de extracto: Extracto 100 X de sulfato: 37.0 g MgS04.7H20, 1.69 g MnS04.H20, 0.86 g ZnS04.7H20, 0.0025 g CuS04.5H20 Extracto 100 X de Haluro: 30.0 g CaCl2.2H20, 0.083 g Kl, 0.0025 g CoCl2.6H20 Extracto 100X P, B, Mo: 18.5 g KH2P04, 0.62 g H3B03, 0.025 g Na2Mo04.2H20 Extracto 100X Fe EDTA: 3.724 g Na2 E DTA , 2.784 g FeS04.7H20 Extracto 2,4-D: 10 mg/ml de ácido 2, -Diclorofenoxiacético . Vitaminas B5, Extracto 100OX: 100.0 g mio-inositol, 1.0 g ácido nicotinico, 1.0 g piridoxina HCI, 10 g tiamina.HCL.

Medios (por Litro) : Medio Sólido SB199: 1 paquete de sales MS (Gibco/BRL, Cat . No. 11 117-066), 1 mL de vitaminas B5 extracto 1000X, 30 g Sacarosa, 4 mi 2,4-D (40 mg/L de concentración final), pH 7.0, 2 g Gelrite Medio Sólido SB1 : 1 paquete de sales MS (Gibco/BRL, Cat. No. 11117-066), 1 mL vitaminas B5 extracto 1000X, 31.5 g Glucosa, 2 mL 2,4-D (20 mg/L de concentración final), pH 5.7, 8 g TC agar SB196: 10 mL de cada una de las soluciones de extracto anteriores 1-4, 1 mL de extracto de Vitamina B5, 0.463 g (NH4)2 S04, 2.83 g KN03, 1 mL de extracto 2,4 D, 1 g asparagina, 10 g sacarosa, pH 5.7 SB71-4: sales B5 de Gamborg, 20 g sacarosa, 5 g agar TC, pH 5.7.

SB103: 1 pk. Mezcla de sales de Murashige & Skoog, 1 mL extracto de Vitamina B5, 750 mg de hexahidrato de MgC12, 60 g maltosa, 2 g gelrite, pH 5.7.

SB166: SB103 suplementado con 5 g por litro de carbón vegetal activado.

Iniciación del Cultivo de Suspensión Embriogénico de Soja: Cultivos de soja se inician dos veces cada mes con 5-7 días entre cada iniciación. Tallos con semillas inmaduras de plantas de soja disponibles 45-55 días después de la plantación se recolectan, se remueven de sus cáscaras y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soja se esterilizan al agitarlas durante 15 min en una solución de Clorox al 5% con 1 gota de jabón ivory (es decir, 95 mL de agua destilada colocada en autoclave más 5 mL de Clorox y 1 gota de jabón, mezclado bien) . Las semillas s }e enjuagan utilizando 2 botellas de 1 litro de agua destilada estéril y aquellas de menos de 3 mm se colocan en platinas de microscopio individuales. El extremo pequeño de la semilla se corta y los cotiledones se prensan fuera de la cubierta de semilla. Los cotiledones se transfieren a placas que contienen medio SB199 (25-30 cotiledones por placa) durante 2 semanas, luego se transfieren a SB1 durante 2-4 semanas. Las placas s envuelven con cinta de fibra. Después de este tiempo, los embriones secundarios se cortan y se colocan en el medio líquido XB196 durante 7 días.

Condiciones de Cultivo: Los cultivos de suspensión embriogénicos de soja (ver Jack) se mantienen en 50 mL de SB196 de medio líquido en un agitador rotatorio, 150 rpm, 26°C con luces fluorescentes blancas frías en un fotoperiodo de día/noche de 16; 8 h en la intensidad de luz de 60-85 yE/m2/s. Los cultivos se subcultivan cada 7 días a dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 50 mL de SB196 líquido fresco (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 días) . Preparación del DNA para Bombardeo: En los procedimientos de bombardeo con pistola de partículas es posible usar el DNA de plásmido intacto purificado; o fragmentos de DNA que contienen solamente el cásete (s) de expresión de DNA recombinante de interés. Para cada diecisiete transformaciones de bombardeo, 85 µ? de suspensión se prepara que contiene 1 a 90 picogramos (pg) de DNA de plásmido por par de base de cada plásmido de DNA . Ambos plásmidos de DNA recombinantes se co-precipitan sobre partículas de oro como sigue. Los DNAs en suspensión se adicionan a 50 yL de una suspensión de partículas de oro de 0.6 ym de 10-60 mg/mL y luego se combinan con 50 yL de CaC12 2.5 M) y 20 yL de espermidina (0.1 M) . La mezcla se somete a vórtice durante 5 seg, se gira en una microcentrífuga durante 5 seg, y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas de DNA luego se lavan una vez con 150 yL de etanol al 100%, se someten a vórtice y se forman en pelotillas, luego se resuspenden en 85 yL de etanol anhidro. Cinco yL de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan en cada disco macroportador.

Preparación del Tejido y Bombardeo con DNA: Aproximadamente 150 a 250 mg de sulcultivo de suspensión de dos semanas de edad se coloca en una caja petri de 60 mm X 15 mm vacia y el liquido residual se remueve del tejido utilizando una pipeta. El tejido se . coloca aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y cada placa de tejido se bombardea una vez. La presión de ruptura de membrana se ajusta en 650 psi y la cámara se evacúa a -28 pulgadas de Hg. Después del bombardeo, el tejido de cada placa se divide entre dos matraces, se coloca nuevamente en el medio liquido y se cultiva como es descrito en lo anterior.

Selección de Embriones Transformados y Regeneración de Planta : Después del bombardeo, el tejido de cada placa bombardeada se divide y se coloca en dos matraces de medio de mantenimiento de cultivo liquido SB196 por placa de tejido bombardeado. Siete dias de post bombardeo, el medio liquido en cada matraz se reemplaza con el medio de mantenimiento de cultivo SB196 fresco suplementado con 100 ng/ml de agente selectivo (medio de selección) . Las células de soja transformadas se puede seleccionar utilizando un compuesto de sulfonilurea (SU) tal como 2 cloro N ((4 metoxi 6 meti 1,3,5 triazina 2 il ) aminocarbonil ) bencenesulfonamida (nombres comunes: DPX-W4189 y clorsulfurón) . El clorsulfurón (Cs) es el ingrediente activo en el herbicida de sulfonilurea de DuPont, GLEAN®. El medio de selección que contiene SU se reemplazada cada dos semanas durante 6-8 semanas. Después del periodo de selección de 6-8 semanas, isletas de tejido transformado, verde, se observan creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. Estos eventos transgénicos putativos se aislan y se conservan en el medio liquido SB196 con Cs en 100 ng/ml durante otras 2-6 semanas con el medio que cambia cada 1-2 semanas para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados, los embriones se agotan a un total de alrededor de 8-12 semanas en contacto con Cs . Los cultivos de suspensión se subcultivan y se mantienen como agrupaciones de embriones inmaduros y también se regeneran en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Los embriones somáticos llegan a ser adecuados para germinación después de cuatro semanas en el medio de maduración (1 semana en SB166 seguido por 3 semanas en SB103) . Luego se remueven del medio de maduración y se secan en cajas petri vacias por hasta siete días. Los embriones secos luego se plantan en el medio SB71 4 donde se dejan germinar bajo las mismas condiciones de luz y temperatura como es descrito en lo anterior. Los embriones germinados se transfieren al medio de maceta y se cultivan hasta la madurez para la producción de semilla.

B. Construcción del vector y prueba Se hicieron plásmidos utilizando procedimientos estándares y de estos fragmentos de DNA de plásmidos se aislaron utilizando endonucleasas de restricción y la purificación en gel de agarosa de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 6A. Cada fragmento de DNA contuvo tres casetes. El Cásete 1 es un cásete de expresión reportador; el Cásete 2 es el cásete de expresión represor; y, el Cásete 3 es un cásete de expresión que proporciona un gen HRA. Los represores probados en el Cásete 2 se describen en la Tabla 21. Los polinucleótidos que comprenden la región de codificación represora se sintetizaron para comprender codones preferidos de plantas. En todos los casos el Cásete 1 contuvo un promotor de virus de mosaico de coliflor 35S que tiene tres operadores tet introducidos cerca del cuadro TATA (Gatz y colaboradores, (1992) Plant J 2:397-404 (3X0pT 35S) ) que induce la expresión de DsRed seguido por la región terminadora 3' del virus de mosaico de coliflor 35S. En todos los casos el cásete tres contuvo el promotor de S-adenosilmetionina sintasa seguido por la versión HRA de gel acetolactato sintasa (ALS) seguido por el terminador 3' ALS de Glycine max. La versión HRA del gen ALS confiere resistencia a los herbicidas de sulfonilurrea . EF1A1 es el promotor de un factor de alargamiento de traducción de soja EFl alfa descrito en la publicación de patente US20080313776.

TABLA 21 Los fragmentos de DNA se utilizaron para transformación de soja de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 6A. Las plantas se regeneraron y discos de hoja (~0.5 cm) se recolectaron de hojas jóvenes. Los discos de hoja se incubaron en el medio liquido SB103 que contiene 0 ppm, 0.5 ppm o 5 ppm de etametsulfurón durante 2-5 días. El etametsulfurón (número de producto PS-2183) se adquirió de Chem Service (West Chester, PA) y se solubilizó en ya sea NaoH 10 mM o NH4OH 10 mM. En cada día los discos de hoja se examinaron bajo un microscopio de disección con un filtro de paso de banda DsRed. La presencia de DsRed se registró visualmente .

Las plantas que expresaron DsRed en el tiempo 0 se registraron como agrietadas. Las plantas que no expresan DsRed después de cinco días se registraron como negativas. Las plantas que expresaron DsRed después de la adición de etametsulfurón se registraron como inducibles. Los resultados de las plantas derivadas de los DNAs descritos en la Tabla 21 se muestran en la Tabla 22.

TABLA 22 * En estos casos el total no iguala a 100% ya que múltiples plantas se examinaron de algunos eventos y, en algunos casos, diferentes plantas del mismo evento se comportaron diferentemente .

Esto muestra que la proteína represora responde a etametsulfurón al inducir la expresión de DsRed. Las plantas derivadas de los primeros cuatro fragmentos mostraron evidencia visual de DsRed después de tres dias de incubación. Las plantas derivadas · de los últimos dos fragmentos mostraron evidencia visual de DsRed después de dos dias de incubación. La presencia de DsRed se registró visualmente, pero esto se confirmó mediante el análisis de Manchado de Western en una selección de transformantes utilizando un anticuerpo policlonal de conejo (ab41336) de Abcam (Cambridge, MA) .

Punciones de hoja se recolectaron como es descrito en lo anterior de una selección de transformantes e se incubaron en el medio SB103 con 0, 5, 50, 250 y 500 ppb de etametsulfurón . En todas las concentraciones de etametsulfurón, las hojas mostraron evidencia visual de DsRed después de tres dias de incubación. En la concentración más baja (5 ppb) la presencia de DsRed fue limitada a un "halo" cerca del bode exterior del disco de hoja.

Las plantas se dejaron madurar como es descrito en el Ejemplo 6A. Puesto que las sojas son autofertilizantes, las semillas TI derivadas de estas plantas serian esperadas que segreguen 1 tipo silvestre: 2 hemicigoto: 1 homocigoto si solamente una posición de transgén se creó durante la transformación. Dieciséis semillas de cinco eventos diferentes se plantaron y se dejaron germinar. Punciones de hojas se recolectaron de plántulas jóvenes y se incubaron en el medio SB103 con 0 y 5 ppm de etametsulfurón . Los discos de oja se registraron para la expresión de DsRed y 0 y 3 dias y los resultados se muestran en la Tabla 23.

TABLA 23 EJEMPLO 7: Pruebas de las Proteínas Represoras en Maíz Para evaluar los represores de SU en plantas, se construyeron constructos reportadores RFP y se transformaron en células de maíz por la vía de Agrobacterium utilizando la siguiente configuración de T-DNA: RB-35S/TripleOp/Pro: : RFP-Ubi Pro::EsR-HRA casete-PAT casete- LB.

Utilizando las técnicas de biología molecular y clonación estándares, se construyeron vectores de T-DNA que tiene la configuración anterior que comprende los represores SU de la ronda 3 seleccionados (EsRs) . Los polinucleótidos que comprenden la región de codificación represora se sintetizaron para comprender codones preferidos de planta. Las construcciones se reumen enseguida: ID del Constructo Alias del supresor SEQ ID NO. del SU (EsR) represor SU PHP37707 L7-1C3-A5 1240 PHP37708 L7-1F8-A11 1241 PHP37709 , L7-1G6-B2 1242 PHP37710 L7-3E3-D1 1243 constructo reportador T-DNA contuvo un promotor 35S con dos operadores tet que flanquean la caja TATA y uno corriente abajo adyacente al sitio de inicio de transcripción (como es descrito por Gatz y colaboradores, (1992) Plant Cell 2:397-404) que induce la expresión del gen de Proteina Flourescente Red, un represor de SU inducido por ubicuitina (EsR) , un cásete de expresión que contiene el gen HRA de maíz para resistencia a SU y un cásete de expresión moPAT para la selección.

Los embriones inmaduros se transformaron utilizando métodos estándares y los medios. Brevemente los embriones inmaduros se aislaron de maíz y se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacteríum, para transferir los T-DNA' s que contienen el cásete de expresión de sulfonilurea a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros . Los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de ñgrobacterium a la iniciación de la inoculación y se cultivaron durante siete dias. Los embriones luego se transfirieron al medio de cultivo que contiene carbinicilina para exterminar cualquier Agrobacteríum restante. Enseguida, los embriones inoculados se cultivaron en el medio que contiene tanto carbinicilina y bialafos (un agente selectivo) y se recuperó el callo transformado en crecimiento. Los callos luego se regeneraron en plantitas en el medio sólido antes de la transferencia al suelo para producir plantas maduras. Aproximadamente 10 eventos de copia individual de cada uno de los constructos se enviaron al invernadero.

Para evaluar la des-represión, el callo se transfirió al medio con y sin etametsulfurón y clorsulfurón y la Fluorescencia RFP se observó bajo el microscopio (ver la Figura 10A) . La mayoría de los eventos des-reprimieron y no hubo diferencias obvias entre los represores de la ronda tres probados. Para evaluar la des-represión en plantas, semillas para plantas de copia individual se germinaron en la presencia de etametsulfurón y la fluorescencia se observó y se fotografió (ver la Figura 10B) . Como un control positivo, un vector que contiene la misma configuración de casetes de expresión como PHP37707-10, pero con UBI::TetR en lugar de UBI::EsR, se transformaron en embriones inmaduros de maíz y se probaron para la inducción en doxiclina. Cuando se cultivan en la presencia de 1 mg/1 de doxiciclina, el tallo transgénico y las plantas que contienen el cásete de expresión TetR indujeron durante un periodo de 5-6 dias similar .

Los artículos "un" y "uno" se refieren a uno o más de uno del objeto gramatical del articulo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más del elemento. Todos los libros, revistas, publicaciones de patente y otorgamientos mencionados en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Estos ejemplos y descripciones son ilustrativos y no son leídos como limitantes del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (55)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un represor responsivo a sulfonilurea que especifica enlaza a un polinucleótido que comprende una secuencia operadora, donde el enlace es regulado por un compuesto de sulfonilurea.

2. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una sustitución de aminoácido a un dominio de enlace de ligando represor de tetraciclina de tipo silvestre, en donde el polipéptido o multimero del mismo específicamente enlaza a un polinucleótido que comprende la secuencia operadora, en donde el enlace específico es regulado por un compuesto de sulfonilurea .

3. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la sustitución de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de una sustitución de aminoácido en la posición de residuo de aminoácido 55, 60, 64, 67, 82, 86, 100, 104, 105, 108, 113, 116, 134, 135, 138, 139, 147, 151, 170, 173, 174 o 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO:l.

4. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que puede ser óptimamente alineada con una secuencia de polipéptido de: (a) SEQ ID NO:220 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 374; (b) SEQ ID NO: 220 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 88%; (c) SEQ ID NO: 7 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 387; (d) SEQ ID NO: 7 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 92%; (e) SEQ ID NO: 10 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 393; (f) SEQ ID NO: 10 para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 1006; (g) SEQ ID NO: 3 para generar un valor e BLAST de por lo menos e-112; (h) SEQ ID NO: 4 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 388; (i) SEQ ID NO: 4 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 93%; (j) SEQ ID NO: 4 para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 996; (k) SEQ ID NO: para generar un registro de valor e BLAST de por lo menos e-111; (1) SEQ ID NO: 6 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 93%; (m) SEQ I D NO: 6 para generar un valor e BLAST de por lo menos e-111; (n) SEQ ID NO: 13 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 9%; (o) SEQ ID NO: 1228 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 381; (p) SEQ ID NO: 1228 para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 978; (q) SEQ I D NO : 1228 para generar un valor e BLAST de por lo menos e-108; (r) SEQ ID NO: 94 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 90%; (s) SEQ ID NO: 1229 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 368; (t) SEQ ID NO: 1229 para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 945; (u) SEQ ID NO: 1229 para generar un valor e BLAST de por lo menos e-105; (v) SEQ ID NO : 1230 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 86%; (w) SEQ ID NO: 1231 para generar un registro de bitios BLAST de por lo menos 320; (x) SEQ ID NO: 1231 para generar un por ciento de identidad BLAST de por lo menos 86%; (y) SEQ ID NO: 1231 para generar un registro de similitud BLAST de por lo menos 819; o, (z) SEQ ID NO: 1231 para generar un valor e BLAST de por lo menos e-90; en donde la alienación BLAST utilizó la matriz BLOSUM62, una sanción de existencia de espacio de 11, y una sanción de extensión de espacio de 1.

5. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste: (a) M en la posición de residuo de aminoácido 55; (b) A, L o M en la posición de residuo de aminoácido 60; (c) A, N, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácido 64; (d) Y en la posición de residuo de aminoácido 67; (e) N, S o T en la posición de residuo de aminoácido 82; (f) F, M, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 86; (g) C, V, L, M, F, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 100; (h) R, A o G en la posición de residuo de aminoácido 104 (i) A, I, V, F o W en la posición de residuo de aminoácido 105; (j) Q en la posición de residuo de aminoácido 108; (k) A, M, H, K, T, P o V en la posición de residuo de aminoácido 113; (1) I, L, M, V, R, S, N, P o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) I, L, V, M, R, S o W en la posición de residuo de aminoácido 134; (n) R, S, N, Q, K o A en la posición de residuo de aminoácido 135; (o) A, C, G, H, I, V, R o T en la posición de residuo de aminoácido 138; (p) A, G, I, V, M, W, N, R o T en la posición de residuo de aminoácido 139; (q) I, L, V, F, W, T, S o R en la posición de residuo de aminoácido 147; (r) M, L, W, Y, K, R o S en la posición de residuo de aminoácido 151; (s) I, L, V o A en la posición de residuo de aminoácido 170; (t) A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (u) L, V, W, Y, H, R, K o S en la posición de residuo de aminoácido 174; y, (v) A, G, I, L, Y, K, Q o S en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuos de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO:l.

6. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia al dominio de enlace de ligando de la SEQ ID NO:l.

7. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende por lo menos 50% de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de (a) M o L en la posición de residuo de aminoácido 55; (b) A, L o M en la posición de residuo de aminoácido 60; (c) A, N, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácido 64; (d) M, I, L, V, F o Y en la posición de residuo de aminoácido 67; (e) N, S o T en la posición de residuo de aminoácido 82; (f) F, M, W o Y en la posición de residuo de aminoácido 86; (g.) C, V, L, , F W, o Y en la posición de residuo de aminoácido 100; (h) R, A o G en la posición de residuo de aminoácido 104 (i) A, I, V, F o W en la posición de residuo de aminoácido 105; (j) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (k) A, M, H, K, T, P o V en la posición de residuo de aminoácido 113; (1) I, L, M, V, R, S, N, P o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) I, L, V, , R, S o en .la posición de residuo de aminoácido 134; (n) R, S, N, Q, K o A en la posición de residuo de aminoácido 135; (o) A, C, G, H, I, V, R o T en la posición de residuo de aminoácido 138; (p) ¦ A, G, I, V, , W, N, R o T en la posición de residuo de aminoácido 139; (q) I, L, V, F, W, T, S o R en la posición de residuo de aminoácido 147; (r) M, L, W, Y, K, R o S en la posición de residuo de aminoácido 151; (s) I, L, V o A en la posición de residuo de aminoácido 170; (t) A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; (u) L, V, W, Y, H, R, K o S en la posición de residuo de aminoácido 174; y, (v) A, G, I, L, Y, K, Q o S en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO:l.

8. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende por lo menos 50% de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: M en la posición de residuo de aminoácido 60; (b A o Q en la posición de residuo de aminoácido 64; [c M, F, Y, I, V o L en la posición de residuo de aminoácido 67; N o T en la posición de residuo de aminoácido 82; M en la posición de residuo de aminoácido 86; C o W en la posición de residuo de aminoácido 100; W en la posición de residuo de aminoácido 105; Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; M, Q, L o H en la posición de residuo de aminoácidol09; G, A, S o T en la posición de residuo de aminoácido 112; A en la posición de residuo de aminoácido 1 13; M o Q en la posición de residuo de aminoácido 116; (m; o V en la posición de residuo de aminoácido 134; !n G o R en la posición de residuo de aminoácido 138; [o N o V en la posición de residuo de aminoácido 139; (P F en la posición de residuo de aminoácido 147; q S o L en la posición de residuo de aminoácido 151; r A en la posición de residuo de aminoácido 164; s A, L o V en la posición de residuo de aminoácido 170; t A, G o V en la posición de residuo de aminoácido 173; u L o W en la posición de residuo de aminoácido 174; and; K en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID N0:1.

9. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende por lo menos 50% de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: (a) M o L en la posición de residuo de amiioácido 55; (b) A en la posición de residuo de aminoácido 64; (c) M, Y, F, I, L o V en la posición de residuo de aminoácido 67; (d) M en la posición de residuo de aminoácido 86; (e) C en la posición de residuo de aminoácido 100; (f) G en la posición de residuo de aminoácido 104; (g) F en la posición de residuo de aminoácido 105; (h) Q o K en la posición de residuo de aminoácido 108; (i) Q, M, L o H en la posición de residuo de aminoácido 109; (j) S, T, G o A en la posición de residuo de aminoácido 112; (k) A en la posición de residuo de aminoácido 1 13; (1) S en la posición de residuo de aminoácido 116; (m) M o L en la posición de residuo de aminoácido 117; (n) M o L en la posición de residuo de aminoácido 131; (o) M en la posición de residuo de aminoácido 134; (p) Q en la posición de residuo de aminoácido 135; (q) A o V en la posición de residuo de aminoácido 137; (r) C o G en la posición de residuo de aminoácido 138; (s) I en la posición de residuo de aminoácido 139; (t) F o Y en la posición de residuo de aminoácido 140; (u) L en la posición de residuo de aminoácido 147; (v) L en la posición de residuo de aminoácido 151; (w) A en la posición de residuo de aminoácido 164; (x) V, A o L en la posición de residuo de aminoácido 170; (y) G, A o V en la posición de residuo de aminoácidol73 (z) L en la posición de residuo de aminoácido 174; y, (aa) N o K en la posición de residuo de aminoácido 177, en donde la posición de residuo de aminoácido corresponde a la posición equivalente utilizando la numeración de aminoácido de un TetR(B) de tipo silvestre de la SEQ ID NO:l.

10. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:3-401, 1206-1213, 1228-1233, y 1240-1243.

11. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque tiene una constante de enlace de equilibrio para el compuesto de sulfonilurea mayor que 0 nM y menor que 1 µ?.

12. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque el polipéptido específicamente se libera del polinucleótido que comprende una secuencia operadora en la presencia del compuesto de sulfonilurea.

13. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el polipéptido específicamente enlaza al polinucleótido que comprende una secuencia operadora en la presencia del compuesto de sulfonilurea . 5

14. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea es un compuesto de pirimidinilsulfonilurea, un compuesto de triazinilsulfonilurea o un compuesto de tiadiazolilurea . 10 15. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea se selecciona del grupo que consiste de un clorsulfurón, un metsulfurón, un etametsulfurón, un tif'ensulfurón, un sulfometurón, un

15 tribenurón, un clorimurón, un nicosulfurón y un rimsulfurón.

16. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea tiene actividad herbicida.

17. El polipéptido aislado de conformidad con la 20. reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea es un clorsulfurón .

18. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14-204. 25

19. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea es un etametsulfurón .

20. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:205-401, 1206-1213, 1228-1233, y 1240-1243.

21. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un represor responsivo a etametsulfurón que específicamente enlaza un polinucleótido que comprende una secuencia operadora, en donde el enlace es regulado por un compuesto de etametsulfurón .

22. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un represor responsivo a clorsulfurón que específicamente enlaza a un polinucleótido que comprende una secuencia operadora, en donde el enlace es regulado por un compuesto de clorsulfurón.

23. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica al polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

24. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 434-832, 1214-1221, 1222-1227, 1234-1239, y 1244-1247.

25. Una célula hospedera no humana, caracterizada porque comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 24 establemente incorporada en su genoma .

26. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el polinucleótido se enlaza operablemente a un promotor funcional en la célula hospedera.

27. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizada porque la célula hospedera es una célula procariótica .

28. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la célula procariótica es una bacteria.

29. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la bacteria es un E. coli o un Agrobacterium.

30. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizada porque la célula hospedera es una célula eucariotica.

31. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la célula eucariotica es una célula de planta.

32. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la célula de planta es de soja, arroz, maíz o tabaco.

33. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la célula hospedera está en una planta.

34. Un método para regular la transcripción de un polinucleótido de interés en una célula hospedera, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula hospedera que comprende el polinucleótido de interés, en donde el polinucleótido de interés es operablemente enlazado a un promotor que comprende por lo menos una secuencia operadora; (b) proporcionar un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en donde el polipéptido específicamente enlaza a la secuencia operadora; y, (c) proporcionar un compuesto de sulfonilurea, en donde la sulfonilurea enlaza al polipéptido para formar un complejo que modifica las propiedades de enlace del polipéptido al operador.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el polipéptido específicamente se libera de la secuencia operadora en la presencia del compuesto de sulfonilurea.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el polipéptido específicamente se libera de la secuencia operadora en la ausencia de compuestos de sulfonilurea.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizado porque la célula hospedera es una célula procariótica .

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula procariótica es una 5 bacteria.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la bacteria es un E. coli.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizado porque la célula 10 hospedera es una célula eucariótica.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la célula eucariótica es una célula de planta.

42. El método de conformidad con la reivindicación 15 41, caracterizado porque la célula de planta es de soja, arroz, maíz o tabaco.

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-42, caracterizado porque la célula hospedera es una célula tolerante a sulfonilurea . 20

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-43, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea es un compuesto de pirimidinilsulfonilurea, un compuesto de triazinilsulfonilurea o un compuesto de tiadia olilurea. , 25

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea se selecciona del grupo que consiste de un clorsulfurón, un etametsulfurón, un tifensulfurón, un metsulfurón, un sulfometurón, un tribenurón, un clorimurón, un nicosulfurón y un rimsulfurón.

46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones- 34-44 , caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea tiene actividad herbicida.

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-46, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3-401, 1206-1213, 1228-1233, y 1240-1243.

48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-47, caracterizado porque la provisión del polipéptido comprende poner en contacto la célula con un cásete de expresión que comprende un promotor funcional en la célula operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica el polipéptido.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:434-832, 1214-1221, 1222-1227, 1234-1239, y 1244-1247.

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-49, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea es etametsulfurón.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el etametsulfurón se proporciona en una concentración que varía entre aproximadamente 0.02 µ%/p?1 a aproximadamente 20 yg/ml.

52. El método de conformidad con la reivindicación 50 o 51, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:205-401, 1206-1213, 1228-1233, y 1240-1243.

53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-49, caracterizado porque el compuesto de sulfonilurea es un clorsulfurón .

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el clorsulfurón se proporciona en una concentración que varía entre aproximadamente 0.2 g/ml a aproximadamente 20 g/ml.

55. El método de conformidad con la reivindicación 53 o 54, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14-204.