EP1135480A1 - Promotoren zur genexpression in wurzeln von pflanzen - Google Patents

Promotoren zur genexpression in wurzeln von pflanzen

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Publication number
EP1135480A1
EP1135480A1 EP99959279A EP99959279A EP1135480A1 EP 1135480 A1 EP1135480 A1 EP 1135480A1 EP 99959279 A EP99959279 A EP 99959279A EP 99959279 A EP99959279 A EP 99959279A EP 1135480 A1 EP1135480 A1 EP 1135480A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
promoter
plants
plant
root
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99959279A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg Riesmeier
Lothar Willmitzer
Marcel Bucher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Original Assignee
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
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Filing date
Publication date
Application filed by Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ filed Critical Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Publication of EP1135480A1 publication Critical patent/EP1135480A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to promoters which bring about a root-specific expression of coding nucleotide sequences controlled by them for tissue-specific gene expression in plants, expression cassettes, recombinant vectors and microorganisms which comprise such promoters, thus transformed transgenic plants, a process for producing transgenic plants and a process for Isolation of root-specific promoters.
  • promoters are of great importance for the production of transgenic plants, since the specificity of a promoter is decisive for the point in time, in which tissue types and in what intensity a genetically transmitted structural gene is expressed.
  • a large number of promoters which control the expression of foreign genes in plants are known.
  • the most frequently used promoter is the 35S CaMV promoter (Franck et al, Cell 1 (1980), 285-294), which leads to a constitutive expression of the introduced gene.
  • inducible promoters are also frequently used, for example for wound induction (DE-A-3843628), chemical induction (Ward et al., Plant Molec. Biol.
  • promoters which mediate gene expression in root are the class H patatin promoter (Koester-Toepfer et al., Mol. Gen. Genet. 219 (1989), 390-396), which after fusion with the reporter gene of the ⁇ -glucuronidase (GUS) gene shows a high expression in potato tubers and in certain cell layers of root tips.
  • GUS fusion experiments with the agropine synthase promoter (ags) (Inoguchi et al., Plant Phys. 149 (1996), 73-78) also showed high GUS activity, especially in roots.
  • promoters described are often problematic. Promoters which bring about a consumer expression of the genes controlled by them can be used, for example, to produce herbicide-tolerant and pathogen-resistant plants but the disadvantage that the products of the genes they control in all parts of the
  • Plant present even in the harvested parts of the plant, which can be undesirable in some cases.
  • Inducible promoters are also not without problems, since the induction conditions in agricultural plants in the field are typically difficult to control.
  • genes that are to be regulated differently are required under the
  • the present invention is therefore based on the object of providing agents which enable an organ-specific, preferably root-specific, gene expression of plants. These agents should be suitable, for example, for the expression of genes which influence the uptake of nutrients from the soil and of genes which modify the root growth.
  • the present invention thus relates to a promoter selected from the group consisting of a) promoters which are listed under Seq ID No. 1, SEQ ED No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ED No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. Include 6 nucleic acid sequence given; b) promoters that contain a functional part of the Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 comprise the nucleic acid sequence indicated and which bring about a root-specific expression in plants of a coding nucleotide sequence controlled by them; c) promoters which have a sequence which corresponds to one of those listed under Seq ID No.
  • the promoters according to the invention are derived from or from plant genes.
  • a “promoter” is understood to mean a DNA sequence which comprises the regulatory portion of a gene, preferably a structural gene.
  • the "regulatory part” of a gene is understood to mean that part which determines the expression of the gene.
  • a regulatory part has a sequence motif on which transcription factors and RNA polymerase assemble and initiate the transcription of the coding part of the gene.
  • the regulatory component can include one or more positive regulatory elements, so-called enhancers. In addition or instead of this, it can also contain negative regulatory elements, so-called silencers.
  • a “structural gene” is understood to mean a genetic unit composed of a regulatory and coding part, the gene product of which is a protein.
  • the information for the primary amino acid sequence of the protein is contained in the coding portion of the structural gene, while the regulatory portion determines when and in what tissues the amounts of the transcript of the coding portion are formed, after the presentation of which the gene product is synthesized.
  • the promoters according to the invention can originate, for example, from plant genes, be modified by recombinant DNA techniques and / or be produced synthetically.
  • the term “root-specific” is understood to mean that a foreign gene under the control of a promoter according to the invention in the
  • Roots is expressed. In particular, root specificity is within the scope of the present
  • Foreign gene in the roots favored in comparison to mature leaves and in roots caused a significantly increased expression, for example at least 2 to 5 times, preferably 5 to 10 times, particularly preferably 10 to 100 times.
  • root specificity can be achieved by
  • the promoter can be used, for example, in a
  • Reporter genes such as the ß-glucuronidase gene from E. coli. This
  • the various promoter fragments are preferably constructed in such a way that they do not encompass this 5 'upstream area (items 1-255, SEQ ED No. 7).
  • the promoter according to the invention now allows root-specific gene expression of a coding nucleotide sequence controlled by the promoter. It is an interesting alternative to other root-specific promoters because it can also mediate gene expression in root hairs. Because of the larger surface area of the root hair compared to the root, there is the possibility that the expression of those genes whose gene products mediate, for example, the transport of nutrients and metabolites through the root hair cells can be manipulated more effectively with the aid of the promoter according to the invention.
  • the promoter according to the invention can be used for the root-specific expression of those genes which mediate the absorption of, for example, heavy metal ions from contaminated soils. With the help of the promoter according to the invention it would thus be possible to produce transgenic plants which can be used in phytoremediation.
  • the promoters according to the invention allow the expression of a coding nucleotide sequence controlled by them in specific root cells, such as for example in root cells of the primary root, in root hairs of the Primary root, in root cells of the root tip or in root hairs of the primary root below the hypocotyl.
  • the present invention also relates to promoters which have a functional part of this sequence and which bring about a root-specific expression of a coding nucleotide sequence controlled by them in plants.
  • a "functional part” is understood to mean those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions, such as e.g. Have promoter activity and tissue or organ specificity.
  • a measure of the promoter activity is, for example, the expression rate determined for a specific marker gene which is under the regulatory control of the promoter according to the invention.
  • suitable marker genes are the ⁇ -glucuronidase (GUS) gene from E. coli or the green fluorescence protein (GFP) gene (Baulcombe et al., Plant J. 7 (16) (1993), 1045 - 1053).
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • GFP green fluorescence protein
  • Functional parts of the promoter sequences within the scope of the present invention include naturally occurring variants of the sequences described here as well as artificial, e.g. nucleotide sequences obtained by chemical synthesis.
  • a functional part is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in an originally isolated promoter sequence which continue to show the desired functions. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges and / or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which can be obtained by modifying the sequence shown under Seq ED No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ED No. 3, SEQ ED No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ED No. 6 nucleotide sequence specified can be obtained. The aim of such a modification can e.g. further narrowing down the promoter sequence contained therein or e.g. also be the insertion of further restriction interfaces.
  • Functional parts of a promoter sequence also include those promoter variants whose promoter activity is weakened or enhanced compared to the wild type.
  • the activity of a eukaryotic RNA polymerase II promoter is caused by the synergistic interaction of various tr ⁇ «5-active factors (DNA binding proteins) which bind to the various cis-regulatory DNA elements present in the promoter. These factors interact directly or indirectly with single or multiple factors of the basal transcription machinery, which ultimately leads to the formation of a pre-initiation complex in the vicinity of the transcription start site (Drapkin et al., Current Opinion in Cell Biology 5 (1993), 469-476).
  • RNA polymerase II promoters eukaryotic RNA polymerase II promoters
  • different cw elements modules
  • This modular structure was illustrated, for example, by promoter studies with the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (Benfey and Chua, Science 250 (1990), 959-966; Benfey et al., EMBO J. 9 (1990) , 1677-1684; Benfey et al, EMBO J. 9 (1990), 1685-1696).
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • the promoter was divided into 6 subdomains.
  • the strong, constitutive expression mediated by the full promoter can thus be sectioned into tissue-specific sub-activities.
  • a minimal promoter is understood to mean a DNA sequence, a TATA box which is approximately 20 to 30 base pairs upstream from the transcription start site, or an initiator sequence (Smale and Baltimore, Cell 57 (1989), 103-113; Zawel and Reinberg , Proc. Natl. Acad. Sci. 44 (1993), 67-108; Conaway and Conaway, Annu. Rev. Biochem 62 (1993), 161-190).
  • minimal promoters are, for example, the -63 to +8 ⁇ 35S promoter (Frohberg, dissertation at the FU Berlin FB Biologie (1994)), the -332 to +14 minimal Patatin Classl promoter and the -176 to + 4- Minimal PetE promoter (Pwee et al, Plant J. 3 (1993), 437-449.)
  • subdomains or cts elements of the promoter according to the invention can also be identified by deletion analyzes or mutagenesis (Kawagoe et al, Plant J. 5 (6) (1994), 885-890).
  • the test for functionality of such a subdomain or -Elements can be transformed in planta by detecting the reporter gene activity
  • the functional part of the promoter sequence also means those subdomains or cw elements of the SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No.
  • ED No. 6 indicated nucleotide sequences that impart root specificity.
  • the effectiveness of a subdomain or a c ⁇ element can be significantly increased by multimerization.
  • the CaMV-35S promoter for example, dimerization of a 250 bp fragment in tandem arrangement resulted in a tenfold increase in promoter activity (Kay et al., Science 230 (1987), 1299-1302).
  • subdomain B5 of the CaMV-35S promoter there was a significant increase in activity of the promoter construct when this domain was present as a tetramer and not as a monomer (Benfey et al, EMBO J. 9 (1990), 1685-1696).
  • the present invention therefore also relates in particular to dimers and multimers of subdomains or cw elements of the SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ED No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 indicated nucleotide sequences.
  • the increase in promoter activity compared to the wild type is achieved by combining the promoter according to the invention with a so-called enhancer.
  • tissue specificity being generally determined by the enhancer used in each case (Benfey et al, Science 250 (1990), 959-966; Benfey et al, EMBO J. 8 (1989), 2195-2202; Chen et al, EMBO J. 7, (1988), 297-302; Simpson et al., Nature 323 (1986), 551-554).
  • enhancers such as the PetE enhancer (Sandhu et al., Plant Mol. Biol. 37 (1998), 885-896), which do not have a tissue-specific effect and can therefore be placed in front of the promoter according to the invention as purely quantitative enhancer elements, in order to increase expression in roots without changing the quality of the tissue specificity of the promoter according to the invention.
  • a root-specific enhancer based on the multimerization of a specific box box
  • synthetic enhancers can also be used which are derived, for example, from naturally occurring enhancers and / or by combining different enhancers
  • the present invention also relates to promoters which have a nucleotide sequence which is identical to that shown under SEQ ID no. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 nucleotide sequence shown hybridize and which cause a root-specific expression of a coding nucleotide sequence controlled by them in plants.
  • Such sequences preferably hybridize under stringent conditions with that under SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ED No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 sequence shown.
  • stringent conditions preferably means hybridization conditions, as described, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). In particular, hybridization takes place under the following conditions:
  • Such promoters preferably have a sequence identity of at least 30%, preferably at least 40%, preferably at least 50%, particularly preferably at least 60%, particularly preferably at least 70% and advantageously at least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% o to that under Seq ID No. 1 promoter sequence shown or parts thereof.
  • the sequence identity of such promoter sequences is preferably determined by comparison with the one under SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown determined. If two sequences to be compared have different lengths, the
  • the parameters are preferably set so that the
  • Percentage of identity is calculated over the entire length of the reference sequence and that homology gaps of up to 5% of the total number of nucleotides in the
  • SEQ ED No. 4 hybridize shown nucleotide sequence or a sequence identity to SEQ ID No. 1, preferably come from vegetable
  • Organisms preferably from higher plants, particularly preferably from dicotyledonous plants, particularly preferably from plants of the Lycopersicon genus.
  • the promoter according to the invention has all of the SEQ ID no. 3 (approx. 1.4 kb fragment), SEQ ID No. 4 (approx. 1.1 kb fragment), SEQ ED No. 5 (0.9 kb fragment) or SEQ ID No. 6 (0.55 kb fragment) shown sequence.
  • the present invention also relates to promoters which have a functional part of these sequences and which bring about a root-specific expression in plants of a coding nucleotide sequence controlled by them.
  • the promoter according to the invention has all or part of the functional part of SEQ ID no. 4 (1.1 kb fragment) sequence shown.
  • SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6 promoter shown comes from a plant gene belonging to a group of extensin-like proteins.
  • the present invention thus also relates to promoters of genes which encode a protein, preferably from the group of the extensin-like proteins, and which have a homology, i.e. Identity, of at least 60%, preferably of at least 70%, preferably of at least 80%, particularly preferably of at least 90% and in particular of at least 95% of the total under SEQ ID No. 8 indicated amino acid sequence, these promoters in plants causing a root-specific expression of a coding nucleotide sequence controlled by them.
  • a homology i.e. Identity
  • the present invention relates to promoters of genes that contain a protein with the SEQ ID no. Coding 8 given amino acid sequence, these promoters cause a root-specific expression of a nucleotide sequence controlled by them in plants.
  • the under SEQ ID No. The nucleotide sequence shown in Figure 7 encodes a polypeptide (SEQ ID No. 8) from L. esculentum which can be assumed to belong to the group of extensin-like proteins.
  • an extensin-like protein is understood to mean a plant protein whose amino acid sequence has at least one of the following sequence motifs: SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPPPPP, PPPPPPPP, PPPPPPPP , SPPPPPPPP , SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPPPYP, SPPPPVYPPVPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
  • DNA sequences the homology to that under SEQ ID No. 7, can be identified, for example, by computer-aided sequence comparisons with known sequences, or also by screening, for example, cDNA or genomic libraries with the SEQ ID no. 7 shown sequence or parts thereof. Such techniques are known to those skilled in the art (see e.g. Sambrook et al., Op. Cit.). Likewise, computer-aided sequence comparisons can also be carried out at the amino acid level with the sequence shown in SEQ ID No. 8 specified amino acid sequence or parts thereof.
  • the cell wall influences both the shape and the function of the cell.
  • the protein fraction of the cell wall contains both enzymes and structural proteins.
  • the best characterized structural proteins of the cell wall include the so-called extensions (Cassab and Varner, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 39 (1988), 321-353; Showalter, Plant Cell 5 (1993), 9-23.) Extensines belong to the Family of hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs). Genes and cDNAs coding for extensins have so far been characterized from carrot (Chen and Varner, EMBO J. 4 (1985), 2145-2151), Bohne (Corbin et al., Mol. Cell Biol.
  • Rapeseed (Evans et al., Mol. Gen. Genet. 223 (1990), 273-287), tomato (Showalter et al., Plant Mol. Biol. 16 (1991), 547-565) and tobacco (Memelink et al, EMBO J. 6 (1987), 3579-3583).
  • the gene expression of the extensine is development-dependent and is tissue-specific rather than constitutively regulated (Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry 47 (1998), 483-497; Ye et al, Plant Cell 3 (1991), 23-37). Comparing the tissue specificity of different extensin genes from different plants, it is found that the expression pattern of extensin genes can vary significantly depending on the type of plant examined, the cell type and the tissue type (Showalter et al, Plant Mol. Biol. 19 (1992) , 205-215). In soybean, HRGPs are most strongly expressed in meristematic cells.
  • the HRGPnt3 gene from tobacco is expressed in the pericyclic and in the endodermis, especially in certain cells which are involved in the formation of side roots (Keller et al., Proc. Nat. Acad. Sei 86 (1989), 1529).
  • extensin gene expression can be regulated by environmental factors such as e.g. Light, pathogen infestation, wounding, heat stress (see for example Cassab and Varner, Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39 (1988), 321-353; Cortin et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 4337 -4344; Niebel et al., Plant Cell 5 (1993), 1697-1710).
  • environmental factors such as e.g. Light, pathogen infestation, wounding, heat stress (see for example Cassab and Varner, Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39 (1988), 321-353; Cortin et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 4337 -4344; Niebel et al., Plant Cell 5 (1993), 1697-1710).
  • this is not the case for all extensines (Sommer-Knudsen et al, Phytochemistry 47 (1998), 483-497).
  • the mature extensin protein is usually rich in hydroxyproline (Hyp), serine and certain combinations of the amino acids valine, tyrosine, lysine and histidine.
  • the primary structure of extensins (for an overview see, for example, Sommer-Knudsen, Phytochemistry 47 (1998), 483-497) is usually characterized by at least one Ser-Pro 3.6 peptide unit, which can also be repeated or in conjunction with similar sequences, such as can, for example, the following sequence motifs SOOOO, SPPPPKH, SPPPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVK
  • Extensines are subject to a strong post-translational modification.
  • proline residues are hydroxylated by prolyl hydroxylases.
  • the hydroxyproline residues serve as attack sites for glycosylations (Lamport et al, Biochem J. 133 (1972), 125-132; van Holst, Plant Physiol. 74 (1984), 247-251).
  • the carbohydrates primarily galactose and arabinose (Smith et al., Phytochemistry 25 (1986), 1021ff; Holst et al., Plant Physiol.
  • the prolyl hydroxylase can be selectively inhibited so that the biosynthesis of the hydroxyproline can be reduced with the help of Dhp.
  • Carrot root discs (Daucus carota) have been shown to treat structurally modified HRGPS after treatment with Dhp. The treatment of tobacco protoplasts with Dhp also led to the regeneration of cell walls with an altered structure (Cooper, Plant Physiol. 104 (1994), 747-752).
  • the present invention further relates to expression cassettes containing a promoter according to the invention.
  • expression cassette is understood to mean the combination of a promoter according to the invention with a nucleic acid sequence to be expressed.
  • This nucleic acid sequence can be, for example, a sequence encoding a polypeptide, ie a structural gene. It can be linked to the promoter in sense or antisense orientation.
  • the nucleic acid sequence can also encode a non-translatable RNA, for example an antisense RNA or a ribozyme. These nucleic acid sequences can be used in conjunction with the promoter according to the invention to produce plants with an altered, preferably improved phenotype.
  • the metabolism of the plant in the root can be influenced by means of the promoter according to the invention.
  • Some examples of heterologous (over) expression and antisense inhibition with the aim of manipulating metabolic flows in transgenic plants are summarized in Herbers and Sonnewald (TIBTECH 14 (1996), 198-205).
  • An example of ribozymes was published by Feyter (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-228).
  • a variety of possible uses of transgenic plants which can be generated with the aid of the promoters and vectors according to the invention are also described in TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312-397.
  • the expression cassettes according to the invention can also be a
  • transcription termination sequence downstream of the 3 ' end of the nucleic acid sequence linked to the promoter.
  • a "transcription termination sequence” is understood to mean a DNA sequence which is at the 3 'end of a coding sequence
  • An example of such a termination sequence is that of the octopine synthase gene.
  • one or more can be used between the promoter and the nucleic acid sequence or between the nucleic acid sequence and the terminator
  • the present invention relates to vectors which contain at least one promoter according to the invention.
  • the promoter according to the invention is linked in such a vector to a polylinker which allows integration of any sequences downstream of the promoter.
  • a “polylinker” is understood to mean a DNA sequence which contains recognition sequences of at least one restriction enzyme, preferably two or more restriction enzymes.
  • a vector according to the invention also contains a sequence for the termination of the transcription, for example that of the octopine synthase gene, downstream of the promoter or the polylinker.
  • the present invention also relates to vectors which contain expression cassettes according to the invention.
  • the vectors according to the invention advantageously contain selection markers which are suitable for identifying and, if appropriate, selecting cells which contain the vectors according to the invention.
  • the vectors according to the invention are suitable for transforming plant cells and particularly preferably for integrating foreign DNA into the plant genome.
  • An example of such vectors are binary vectors, some of which are already commercially available.
  • the present invention further relates to host cells which are genetically modified with a promoter according to the invention or with an expression cassette or vector according to the invention.
  • Genetically modified means that the host cell contains a promoter or an expression cassette or vector according to the invention, preferably stably integrated into the genome, and the promoter or expression cassette was either introduced into the host cell or into a predecessor of this cell as foreign DNA . That the cells according to the invention can either themselves be the direct product of a transformation event or cells derived therefrom which contain a promoter according to the invention or an expression cassette according to the invention. Both prokaryotic, in particular bacterial, and eukaryotic cells can be considered as host cells. Eukaryotic cells can be, for example, fungal cells, in particular of the Saccharomyces genus, preferably of the Saccharomyces cerevisiae species.
  • the invention relates to the use of vectors according to the invention, expression cassettes according to the invention or host cells according to the invention for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or parts.
  • the host cells according to the invention are plant cells, which are referred to below as transgenic plant cells.
  • the present invention also relates to plants which contain plant cells according to the invention. These can belong to any plant type, genus, family, order or class. Both monocot and dicot plants can be used.
  • the plants according to the invention are preferably useful plants, ie plants which are of agricultural, forestry and / or horticultural interest for humans. Agricultural crops such as cereals (for example wheat, oats, barley, rye), maize, rice, potatoes, beets, tobacco, sugar cane, sugar beet, sunflower, banana, rape or fodder are preferred and pasture grasses (such as alfalfa, white clover, red clover), flax, cotton. Soy, millet,
  • Beans, peas etc, vegetables such as tomato, cucumber, zucchini, eggplant,
  • Herbs and medicinal plants are also of interest, e.g. Catharanthus roseus, Datura stramonium, Taxus SSP.I, Dioscorea deltoidea, Papaver somniferum, Atropa belladonna,
  • the present invention also relates to processes for the production of transgenic plants, characterized in that plant cells, tissues or parts or protoplasts are transformed with a vector according to the invention or with an expression cassette according to the invention or with a microorganism according to the invention, the transformed cells, Tissues, parts of plants or protoplasts are cultivated in a growth medium and, if appropriate, regenerated from the plants.
  • the invention relates to the use of vectors according to the invention, expression cassettes according to the invention or host cells according to the invention for producing transgenic hairy roots by Agrobacterium rhizogenes.
  • plants of the invention can be prepared by methods known to those skilled in the art, e.g. by transforming plant cells or tissues and
  • Electroporation of DNA the introduction of DNA using the biolistic approach and other possibilities.
  • Plants preferably using the Agrobacterium-mediated transformation, have been studied intensively and are sufficient in EP 0 120 516; Hoekema (In: The Binary Plant
  • Protoplast transformation the electroporation of partially permeabilized cells or the introduction of DNA using glass fibers.
  • the transformation of maize in particular is described several times in the literature (e.g. WO 95/06128, EP 0 513 849, EP 0 465
  • the present invention also relates to propagation and cultivation material of plants according to the invention which contains plant cells according to the invention.
  • the term "propagation material" includes those components of the plant that are suitable for the production of progeny by a vegetative or generative route.
  • vegetative propagation for example, cuttings, callus cultures, rhizomes, rhizomes or tubers are suitable.
  • Other propagation material includes, for example, fruits, seeds, seedlings, protoplasts, cell cultures, etc.
  • the propagation material is preferably tubers and seeds.
  • the present invention further relates to a method for identifying and isolating promoters which bring about a root-specific expression in plants of a coding nucleotide sequence controlled by them, comprising the following steps: a) Hybridization of a plant genomic library with a cDNA which codes for an extensin-like protein ; b) isolation of positive clones; c) Testing the isolated clones for promoter activity.
  • the hybridization carried out in step a) is preferably carried out under stringent conditions.
  • Known sequences which encode an extensin-like protein or parts thereof are used for hybridization with a corresponding library, preferably under stringent conditions. Preference is given to SEQ ED No. 7 listed sequence or parts thereof used. The methods are known to the specialist and are described in detail, e.g. in Sambrook et al. (op. cit.).
  • an extensin-like protein means a protein whose amino acid sequence has at least one of the sequence motifs SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPPPPY, PPPPOP SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP.
  • SPPPPVYSPPPP SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP and that has a homology of at least 60%>, preferably at least 70% > , preferably at least 80% o, particularly preferably at least 90% and in particular at least 95%> to that below SEQ ID No. 7 indicated coding region.
  • the promoter sequence is carried out according to methods which are known to the person skilled in the art and which are described, for example, in Sambrook et al. (op. cit.).
  • the expression properties of the isolated promoter can be analyzed by reporter gene experiments.
  • the promoter can be operated, for example, in an expression cassette or in a vector for plant transformation with a reporter gene, such as e.g. the ß-glucuronidase gene from E. coli. This construct is used to transform plants.
  • the organ-specific expression of the ⁇ -glucuronidase is then determined, e.g. in Martin et al. (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene Expression, In: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Academic Press (1992), 23-43). Those promoters that have root specificity are selected and then isolated.
  • an operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements, each of the elements mentioned being able to fulfill its function as intended for gene expression.
  • the present invention relates to the use of the promoters according to the invention or the promoters identified by means of the method according to the invention for the root-specific expression of transgenes in plants.
  • transgene means a DNA sequence artificially introduced into a plant.
  • Figure 1 Northern blot analysis of RNA from roots
  • RNA was isolated using the hot phenol extraction method of Verwoerd et al. (Nucleic Acids Research 17 (1989), 2362).
  • RNA was separated electrophoretically, transferred to a nylon membrane and fixed thereon with UV radiation. After hybridization and washing, the radioactive membrane was exposed on X-ray film. This was developed after an overnight exposure at -80 ° C. The intensity of the signals correlates with the concentration of the specific mRNA on the membrane.
  • Figure 2 Northern blot analysis for the expression of LeExtl 10 ⁇ g total RNA (5 ⁇ g in the case of lanes 3 and 4: 18 days and earth) from 7, 14 and 18
  • RNA "Northern blot" analysis Day old seedlings (7 days, 14 days, 18 days), roots grown on soil (soil), seedling roots which were incubated in the dark (light) or in light (+ light), and controls (control), as well as wounded leaves (Wound) were used for the RNA "Northern blot" analysis. Radioactive labeled LeExtl cDNA was used for hybridization. Plant RNA was isolated according to Verwoerd et al. (1989) (see above). The RNA was separated electrophoretically, transferred to a nylon membrane and fixed thereon with UV radiation. After hybridization and washing, the radioactive membrane was exposed on X-ray film. This was developed after an overnight exposure at -80 ° C. The intensity of the signals correlates with the concentration of the specific mRNA on the membrane.
  • LeExtl transcript in tomato roots Optical micrographs of young tomato roots under sterile conditions.
  • A, B Sections embedded in paraffin were made according to the sztw hybridization method as in Daram et al. (Planta 206 (1998), 225-233) described hybridized with non-radioactively labeled LeExtl "antisense" RNA.
  • Example 1 Isolation of a root-specific gene
  • RNA from the specified organs was determined by the method of Verwoerd et al. (Nucleic Acid Research 17 (1989), 2362). 7-60 ⁇ g of total RNA from root hair was used for the isolation of the poly (A) + RNA using magnetic oligodT beads (Dynabeads, Dynal, Germany). 700 ng poly (A) + RNA were used for the production of double-stranded cDNA (Pharmacia, Germany). After attaching an Ec ⁇ RI / Notl linker, the cDNA was cloned into the expression vector ⁇ ZAPII (Stratagene, Germany). Packaging in the ⁇ phages was carried out with the Gigapack II Gold Packaging ⁇ xtract Kit from Stratagene (Germany).
  • RNA from the specified organs were loaded onto a 1.2% agarose glyoxal gel (Hüll (1985), Purification, biophysical and biochemical characterization of viruses with special reference to plant viruses. In: Mahy, (ed.), Virology, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK, pp. 1-24). "Northern blot" analysis and hybridization conditions were taken from standard instructions (Sambrook et al., See above). The blots were hybridized at 68 ° C. Detection of LeExtl mRNA was achieved using the LeExtl cDNA as a radioactive probe.
  • the blot was last washed with 0.1 x SSC at 68 ° C. After washing, the blots were exposed on X-ray film (Kodak, Germany) at -80 ° C. The transcript sizes were determined by comparison with glyoxylated marker DNA (BRL, Germany). The results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Example 2 Isolation of a Genomic Fragment Comprising the Promoter Region of the Root Specific Gene
  • a tomato genomic DNA library (Clontech Laboratories, USA) was screened with radioactively labeled LeExtl cDNA (see Example 1).
  • 500,000 plaque-forming units (PFE) from the DNA library were plated on YT agar in agar dishes, incubated for 6 to 8 hours at 37 ° C. and transferred to nylon membranes (Hybond N, Amersham, Germany) (Sambrook et al., See above). Hybridization conditions were taken from standard regulations (Sambrook et al., See above).
  • 30 plaques from the first screening were selected for a second round. The phage suspensions of two selected plaques after the second screening were replated to produce phage lysates.
  • ⁇ DNA was prepared according to Lockett (Analytical Biochemistry 185, (1990), 230-234). Each 600 ng ⁇ DNA was then digested with various restriction enzymes and the resulting fragments made visible on an agarose gel with ethidium bromide.
  • a total of three different types of GUS expression cassettes were produced.
  • the genomic fragment was excised from the pBluescript II SK " plasmid by Kpnl digestion, smoothed by means of a replenishment reaction with the T7 DNA polymerase (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology.
  • pBI101.3 is a plasmid which contains a promoterless GUS cassette in the binary vector pBIN19.
  • a PCR product of approx. 3270 bp was produced using the following primers: 42Xba (5'-GAGATCTAGACCATGGAGAAGAATTGG-3 ⁇ SEQ ID No. 11) and 42Sal (5'-GAGAGTCGACGGGCGAATTGGGTACCG-3 ', SEQ ID No. 12) .
  • the PCR conditions were: 20 sec at 94 ° C. melting of the DNA, 45 sec at 50 ° C. installation of the primers, 2 min at 72 ° C. DNA synthesis using Pfu DNA polymerase (Stratagene, Germany).
  • the PCR product was cloned directly into the plasmid pCR-Script according to the manufacturer's instructions (Stratagene, Germany).
  • the PCR product was smoothed with the Klenow enzyme [Sambrook, 1989 # 68] and cloned into Sm ⁇ l and dephosphorylated pBluescript II SK " plasmid.
  • the plasmid was digested with BstXI and Linear shortening of the PCR product using exonuclease III and S1 nuclease from the 5 'end in accordance with the manufacturer's protocol (Fermentas, Lithuania) produced shortened genomic fragments of the following approximate length: 2.2 kb, 1.7 kb, 1.4 kb, 1.1 kb , 0.9 kb and 0.55 kb.
  • the AKI ⁇ -GUS-3'NOS cassette from the plasmid 5 ⁇ KT1-320.X (Lagarde et al, Plant J. 9 (1996), 195-203) was isolated with Sacl, by means of mung bean nuclease Treatment smoothed (New England BioLabs Inc., Bioconcept, Switzerland) and digested again with Ncol
  • the resulting GUS-3' ⁇ OS cassette was digested in NcoI / EcoRV and dephosphorylated pBluescript II SK " plasmids containing the truncated genomic fragments kloni ert.
  • the promoter-GUS-3'NOS cassettes thus produced were isolated from the respective plasmid by digestion with Sacl and S ⁇ I and digested and dephosphorylated binary vector Binl9 in Sac ⁇ / Sa (Bevan et al, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711) cloned.
  • the contracts obtained were called BIN- ⁇ genx-GUS in the following, where x is the respective fragment length 2.2 kb (SEQ ED No. 1), 1.7 kb (SEQ ID No. 2), 1.4 kb (SEQ ID No. 3), 1.1 kb (SEQ ED No. 4), 0.9 kb (SEQ ED No. 5) or 0.55 kb (SEQ ED No. 6).
  • Example 4 Plant transformation
  • Agrobacteria were grown on YEB medium (Vervliet et al., Journal of General Virology 26
  • the tobacco and tomato plants were transformed by the method of gene transfer mediated by Agrobacterium tumefaciens, as by
  • Rosahl et al. (EMBO J. 6 (1987), 1155-1159) for tobacco and by Lillatti et al.
  • constructs described above were furthermore introduced by electroporation into the A. rhizogenes strain 15834 (Jung et al., Biotechnol Lett 14 (1992), 695-700) and then for the transformation of Catharanthus roseus by means of Agrobacterium rhizogenes based on Toivonen et al. (Plant Cell Tissue Org. Cult. 18 (1988), 79 ff.).
  • the plant material was vacuum-filtered with a 0.1% X-Gluc solution (pre-dissolve 0.1 g of X-Gluc in 1 ml of dimethylformamide, 1 ml of 10% Triton and 5 ml of 1 M sodium phosphate buffer, pH 7.2 and make up to 100 ml with still water) and incubated overnight at 37 ° C. After staining, the plants were fixed in 3: 1 ethanoic acetic acid and decolored in 100% ethanol. Green parts of the plant became colorless, while the blue dye remains stable; see Figure 3.
  • X-Gluc solution pre-dissolve 0.1 g of X-Gluc in 1 ml of dimethylformamide, 1 ml of 10% Triton and 5 ml of 1 M sodium phosphate buffer, pH 7.2 and make up to 100 ml with still water
  • the GUS activity in leaves was compared to that in roots according to the method described by Jefferson et al. (EMBO J. 6 (1987), 3901-3907).
  • GUS activity in roots is between 20 and 300 times higher than in mature leaves.
  • Most of the GUS-positive potato plants examined showed strong GUS activity in the roots, but no GUS activity in mature leaves.
  • the GUS activities were compared to those of the 35S promoter. The lines with the strongest activity of the promoter had about half as much activity compared to the CaMV 35S promoter.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Promotoren bereit, die eine wurzelspezifische Expression von ihnen kontrollierter codierender Nucleotidsequenzen bewirken und Expressionskassetten, rekombinante Vektoren und Mikroorganismen, die solche Promotoren umfassen. Ferner werden transformierte transgene Pflanzen beschrieben, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren zur Isolierung wurzelspezifischer Promotoren.

Description

Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren, die eine wurzelspezifische Expression von ihnen kontrollierter codierender Nucleotidsequenzen bewirken, zur gewebespezifischen Genexpression in Pflanzen, Expressionskassetten, rekombinante Vektoren und Mikroorganismen, die solche Promotoren umfassen, damit transformierte transgene Pflanzen, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen sowie ein Verfahren zur Isolierung wurzelspezifischer Promotoren.
Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.
Der Einsatz von Pflanzen, die mit Hilfe gentechnischer Verfahren in ihrem Erbgut verändert wurden, hat sich in vielen Bereichen der Landwirtschaft als vorteilhaft und oft als der einzige Weg erwiesen, bestimmte Eigenschaften auf Nutzpflanzen zu übertragen. Die vornehmlichen Ziele sind zum einen der Pflanzenschutz und zum anderen eine Qualitätssteigerung der erntbaren Produkte.
Es sind zahlreiche Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. u.a. Gasser und Fraley, Science 244 (1989), 1293-1299; Potrykus, Ann. Rev. Plant mol. Biol. Plant Physiol. 42 (1991), 205-225). Alle Verfahren basieren auf der Übertragung von Genkonstrukten, die in den meisten Fällen Neukombinationen von bestimmten codierenden Regionen von Strukturgenen mit Promotorregionen anderer Strukturgene, sowie Transkriptionsterminatoren darstellen.
Die Bereitstellung von Promotoren ist dabei von großer Bedeutung ftir die Herstellung von transgenen Pflanzen, da die Spezifität eines Promoters ausschlaggebend dafür ist, zu welchem Zeitpunkt, in welchen Gewebetypen und in welcher Intensität ein gentechnisch übertragenes Strukturgen exprimiert wird. Eine Vielzahl von Promotoren, die die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern, ist bekannt. Der am häufigsten verwendete Promotor ist der 35S CaMV-Promotor (Franck et al, Cell 1 (1980), 285-294), der zu einer konstitutiven Expression des eingeführten Gens fuhrt. Häufig werden aber auch induzierbare Promotoren eingesetzt, beispielsweise zur Wundinduktion (DE-A-3843628), chemischen Induktion (Ward et al., Plant Molec. Biol. 22 (1993), 361-366) oder Lichtinduktion (Fluhr et al., Science 232 (1986), 1106-1112). Auch die Verwendung zell- und gewebespezifischer Promotoren wurde beschrieben: schließzellenspezifische Genexpression (DE-A-4207358), samen-, knollen- und fruchtspezifische Genexpression (zusammengefaßt in Edwards and Coruzzi, Annu. Rev. Genet. 24 (1990), 275-303; DE- A-3843627), phloemspezifische Genexpression (Schmülling et al., Plant Cell 1 (1989), 665-670), wurzelknöllchenspezifische Genexpression (DE-A- 3702497) oder meristemspezifische Genexpression (Ito et al, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 863-878).
Beispiele für Promotoren, die die Genexpression in Wurzel vermitteln, sind der Class-H- Patatin-Promotor (Köster-Töpfer et al., Mol. Gen. Genet. 219 (1989), 390-396), der nach Fusion mit dem Reportergen des ß-Glucuronidase (GUS)-Gens eine hohe Expression in Kartoffelknollen und in bestimmten Zellschichten von Wurzelspitzen zeigt. Auch GUS- Fusionsexperimente mit dem Agropinsynthase-Promotor (ags) (Inoguchi et al., Plant Phys. 149 (1996), 73-78) zeigten eine hohe GUS-Aktivität vor allem in Wurzeln. Transgene Arabidopsis-Püaτizen enthaltend ein AKT1 (= Kaliumkanal)-GUS-Konstrukt (Lagarde et al., Plant J. 9 (1996), 195-203) führten vor allem zu einer Expression in äußeren Zellschichten reifer Wurzelabschnitte. Auch ein 636 bp langer Abschnitt des 5 '-Bereiches des TobRB7 (= Wasserkanal)-Gens (Yamamoto et al., Plant Cell 3 (1991), 371-382) vermittelte eine wurzelspezifische GUS-Expression in transgenen Tabakpflanzen. Ferner wurden GUS- Fusionsexperimente mit dem Promotor eines Extensingens beschrieben, wobei GUS- Aktivität in Sojabohnenkeimlingen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium im Hypocotyl und in der Wurzel bzw. spezifischen Zonen der Wurzel nachgewiesen werden konnte (Ahn et al., Plant Cell 8 (1996), 1477-1490).
Die Verwendung der beschriebenen Promotoren ist oft problematisch. Promotoren, die eine konsumtive Expression der von ihnen kontrollierten Gene bewirken, können beispielsweise zur Erzeugung herbizidtoleranter und pathogenresistenter Pflanzen eingesetzt werden, haben aber den Nachteil, daß die Produkte der von ihnen kontrollierten Gene in allen Teilen der
Pflanze vorliegen, auch in den geernteten Pflanzenteilen, was in manchen Fällen unerwünscht sein kann. Induzierbare Promotoren sind gleichfalls nicht unproblematisch, da die Induktionsbedingungen bei landwirtschaftlich genutzten Pflanzen im Freiland typischerweise schwer kontrollierbar sind.
Darüberhinaus ist es zur Bewältigung verschiedener Ansätze der genetischen Veränderung von Pflanzen erforderlich, Gene, die unterschiedlich reguliert werden sollen, unter die
Kontrolle verschiedener Promotoren zu stellen. Es ist daher notwendig, verschiedene
Promotorsysteme mit unterschiedlicher Spezifität zur Verfügung zu stellen.
Promotoren, die die Genexpression in Wurzeln regulieren sind bisher nur in begrenzter Zahl bekannt. Zur Bewältigung bestimmter Ansätze der genetischen Veränderung von Pflanzen ist es erforderlich, weitere, alternative Promotorsysteme zur Genexpression in Wurzeln zur
Verfügung zu stellen, die im Vergleich zu den bekannten Systemen unterschiedlich reguliert sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, die eine organspezifische, vorzugsweise wurzelspezifische Genexpression von Pflanzen ermöglichen. Diese Mittel sollten beispielsweise zur Expression von Genen, die die Aufnahme von Nährstoffen aus dem Boden beeinflussen, und von Genen, die das Wurzelwachstum modifizieren, geeignet sein.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Promotor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Promotoren, die die unter Seq ID No. 1, SEQ ED No. 2, SEQ ID No. 3 , SEQ ED No. 4 , SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebene Nucleinsäuresequenz umfassen; b) Promotoren, die einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 , SEQ ID No. 4 , SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleinsäuresequenz umfassen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; c) Promotoren, die eine Sequenz aufweisen, die mit einer der unter Seq ID No. 1, SEQ ED No. 2, SEQ ID No. 3 , SEQ ID No. 4 , SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten hybridisiert, und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; und d) Promotoren von Genen, die Proteine codieren deren Aminosäuresequenzen eine Homologie von mindestens 60 % zu der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Promotoren solche von pflanzlichen Genen oder von solchen abgeleitet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Promotor" eine DNA- Sequenz verstanden, die den regulatorischen Anteil eines Gens, vorzugsweise eines Strukturgens, umfaßt. Unter dem "regulatorischen Anteil" eines Gens wird derjenige Anteil verstanden, der die Expression des Gens bestimmt. Ein regulatorischer Anteil besitzt ein Sequenzmotiv, an dem Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerase assemblieren und die Transkription des codierenden Anteils des Gens einleiten. Darüber hinaus kann der regulatorische Anteil ein oder mehrere positive regulatorische Elemente, sogenannte Enhancer umfassen. Er kann zusätzlich oder an deren Stelle aber auch negativ regulatorische Elemente, sogenannte Silencer enthalten. Unter einem "Strukturgen" wird eine genetische Einheit aus regulatorischem und codierendem Anteil verstanden, deren Genprodukt ein Protein ist. Die Information für die primäre Aminosäuresequenz des Proteins ist im codierenden Anteil des Strukturgens enthalten, während der regulatorische Anteil bestimmt, wann und in welchen Geweben zu welchen Mengen das Transkript des codierenden Anteils gebildet wird, nach dessen Vorlage das Genprodukt synthetisiert wird. Die erfindungsgemäßen Promotoren können beispielsweise aus pflanzlichen Genen stammen, durch rekombinante DNA-Techniken modifiziert sein und/oder synthetisch hergestellt werden. Unter dem Begriff "wurzelspezifisch" versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß ein unter der Kontrolle eines erfindungsgemäßen Promotors stehendes Fremdgen in den
Wurzeln exprimiert wird. Insbesondere ist Wurzelspezifität im Rahmen der vorliegenden
Erfindung auch dann gegeben, wenn der erfindungsgemäße Promoter die Expression eines
Fremdgens in den Wurzeln im Vergleich zu maturen Blättern begünstigt und in Wurzeln eine signifikant, wie beispielsweise mindestens 2- bis 5-fach, bevorzugt 5- bis 10-fach, besonders bevorzugt 10- bis lOOfach erhöhte Expression bewirkt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann Wurzelspezifität durch
Reportergen-Experimente analysiert werden. Zur Testung einer isolierten Promotorsequenz auf Promotoraktivität in Wurzeln kann der Promotor beispielsweise in einer
Expressionskassette bzw. in einen Vektor zur Pflanzentransformation operativ mit einem
Reportergen, wie z.B. dem ß-Glucuronidasegen aus E. coli, verknüpft werden. Dieses
Konstrukt wird zur Transformation von Pflanzen verwendet. Anschließend wird die
Expression der ß-Glucuronidase in Wurzeln im Vergleich zu maturen Blättern bestimmt, wie z.B. bei Martin et al. (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene Expression,
In: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Academic Press
(1992), 23-43) beschrieben.
Der Begriff "Wurzel" ist dem Fachmann geläufig. Ergänzend sei verwiesen auf Strasburger (Lehrbuch der Botanik für Hochschulen: Begr. v. Eduard Strasburger u. a. Neubearb. v. Peter Sitte, Hubert Ziegler u. a., 34. Aufl., 1998, Fischer (Gustav)-Verlag, Stuttgart).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Promotor mit der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Nucleotidsequenz in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirkt.
Diese Beobachtung ist insbesondere überraschend, weil ein genomisches Fragment (SEQ ID No. 13) der Promotorregion (s. Beispiel 2), welches im Vergleich zur SEQ ID No. 1 um ca. 1000 bp verlängert ist, keine wurzelspezifische GUS -Expression vermitteln kann. Nur im Vergleich zum großen Fragment (SEQ ED No. 13) verkürzte Promotorfragmente (SEQ ID No. 1 bis 6), die wie in Beispiel 3C beschrieben hergestellt wurden, führen zu einer wurzelspezifischen Genexpression einer vom Promotor kontrollierten codierenden
Nucleotidsequenz.
Untersucht man die Sequenz der cDNA (SEQ ED No. 7) so findet man im 5'-Bereich, upstream vom eigentlichen ATG (Pos. 256-258, SEQ ID No. 7), drei weitere ATG Translations-Initiations-Codons (Positionen 42-44, 65-67 und 142-144 von SEQ ID No. 7), die zu mehreren upstream open reading frames (uORFs) führen. Die Anwesenheit solcher uORFs kann einen negativen Einfluß auf die Translationsrate spezifischer mRNAs haben. Die verschiedenen Promotorfragmente werden vorzugsweise derart konstruiert, daß sie diesen 5 '-upstream-B ereich (Pos. 1-255, SEQ ED No. 7) nicht umfassen.
Der erfindungsgemäße Promotor erlaubt nun eine wurzelspezifische Genexpression einer vom Promotor kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz. Er stellt eine interessante Alternative zu anderen wurzelspezifischen Promotoren dar, weil er auch die Genexpression in Wurzelhaaren vermitteln kann. Aufgrund der größeren Oberfläche der Wurzelhaare im Vergleich zur Wurzel besteht die Möglichkeit, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Promotors die Expression von solchen Genen effektiver manipuliert werden kann, deren Genprodukte beispielsweise den Transport von Nährstoffen und Metaboliten durch die Wurzelhaarzellen vermitteln.
Vielfältige Verwendungsmöglichkeiten stehen für den erfindungsgemäßen Promotor zur Verfügung. Beispielsweise kann man sich die Herstellung transgener Pflanzen vorstellen, die aufgrund eines modifizierten Wurzelhaarmetabolismus, der einen positiven Einfluß auf die Flora der Wurzelumgebung (Rhizosphäre) ausübt, einen erhöhten Ertrag zeigen. Darüberhinaus kann man die erfindungsgemäßen Promotoren zur wurzelspezifischen Expression solcher Gene verwenden, die die Aufnahme beispielsweise von Schwermetallionen aus kontaminierten Böden vermitteln. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Promotors wäre es somit möglich, transgene Pflanzen herzustellen, die bei der Phytoremediation eingesetzt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erlauben die erfindungsgemäßen Promotoren, die Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz in spezifischen Wurzelzellen, wie z.B. in Wurzelzellen der Primärwurzel, in Wurzelhaaren der Primärwurzel, in Wurzelzellen der Wurzelspitze oder in Wurzelhaaren der Primärwurzel unterhalb des Hypocotyls, zu bewirken.
Neben einem Promotor, der die gesamte unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellte Sequenz aufweist, betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die einen funktionalen Teil dieser Sequenz aufweisen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
Unter einem "funktionalen Teil" versteht man in diesem Zusammenhang solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nucleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, wie z.B. Promotoraktivität und Gewebe- oder Organspezifität besitzen. Ein Maß für die Promotoraktivität ist beispielsweise die für ein bestimmtes Markergen, das unter der regulativen Kontrolle des erfmdungsgemäßen Promotors steht, ermittelte Expressionsrate. Beispiele für geeignete Markergene sind das ß-Glucuronidase-(GUS)-Gen aus E. coli oder das Green-Fluorescence-Protein-(GFP)-Gen (Baulcombe et al., Plant J. 7 (16) (1993), 1045- 1053). Die Organ- bzw. Gewebespezifität läßt sich leicht durch Vergleich der an einzelnen Geweben bzw. Organen der Pflanze ermittelten Expressionsraten für obige Markergene bestimmen. Funktionale Teile der Promotorsequenzen umfassen im Rahmen der vorliegenden Erfindung natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene Nucleotidsequenzen. Unter einem funktionalen Teil versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Promotorsequenz, welche weiterhin die gewünschten Funktionen zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen und/oder Insertionen eines oder mehrerer Nucleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nucleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der unter Seq ED No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ED No. 3, SEQ ED No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ED No. 6 angegebenen Nucleotidsequenz erhalten kann. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Promotorsequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsschnittstellen sein.
Funktionale Teile einer Promotorsequenz umfassen auch solche Promotorvarianten, deren Promotoraktivität, verglichen mit dem Wildtyp, abgeschwächt oder verstärkt ist. Prinzipiell wird die Aktivität eines eukaryontischen RNA-Polymerase Il-Promotors durch das synergistische Zusammenwirken verschiedener trα«5-aktiver Faktoren (DNA- Bindeproteine) bedingt, welche an die verschiedenen im Promotor vorhandenen cis- regulatorischen DNA-Elemente binden. Diese Faktoren wechselwirken direkt oder indirekt mit einzelnen oder mehreren Faktoren der basalen Transkriptionsmaschinerie, was letztlich zur Ausbildung eines Präinitiationskomplexes in der Nähe der Transkriptionsstartstelle führt (Drapkin et al., Current Opinion in Cell Biology 5 (1993), 469-476). Man kann von einem modularen Aufbau eukaryontischer RNA-Polymerase II-Promotoren sprechen, wobei verschiedene cw-Elemente (Module) jeweils als Teilkomponenten die Gesamtaktivität des Promotors determinieren (Tjia und Maniatis, Cell 77 (1994), 5-8). Verdeutlicht wurde dieser modulare Aufbau beispielsweise durch Promotorstudien mit dem Blumenkohl- Mosaik-Virus-(CaMV)-35S-Promotor (Benfey und Chua, Science 250 (1990), 959-966; Benfey et al., EMBO J. 9 (1990), 1677-1684; Benfey et al, EMBO J. 9 (1990), 1685-1696). Aufgrund der unterschiedlichen Gewebespezifität, die verschiedene Restriktions- Subfragmente des -343 bis +8 (relativ zur Transkriptionsstartstelle) Promotors in transgenen Tabakpflanzen vermitteln, wurde der Promotor in 6 Subdomänen aufgeteilt. Die starke, konstitutive Expression, die der vollständige Promotor vermittelt, ist also in gewebespezifische Teilaktivitäten sektionierbar.
Einzelne, potentiell Gewebespezifität vermittelnde Subdomänen des erfindungsgemäßen Promotors können beispielsweise durch Fusion mit einer Minimalpromotor-Reportergen- Kassette identifiziert werden. Unter einem Minimalpromotor versteht man eine DNA- Sequenz, die eine TATA- Box, die sich etwa 20 bis 30 Basenpaare stromaufwärts von der Transkriptionsstarstelle befindet, oder eine Initiatorsequenz (Smale und Baltimore, Cell 57 (1989), 103-113; Zawel und Reinberg, Proc. Natl. Acad. Sei. 44 (1993), 67-108; Conaway und Conaway, Annu. Rev. Biochem 62 (1993), 161-190) umfaßt. Beispiele für Minimalpromotoren sind beispielsweise der -63 bis +8 Δ35S-Promotor (Frohberg, Dissertation an der FU Berlin FB Biologie (1994)), der -332 bis +14 Minimal-Patatin-Classl- Promotor sowie der -176 bis +4-Minimal-PetE-Promotor (Pwee et al, Plant J. 3 (1993), 437- 449.)
Desweiteren können solche Subdomänen bzw. cts-Elemente des erfindungsgemäßen Promotors auch über Deletionsanalysen bzw. Mutagenesen identifiziert werden (Kawagoe et al, Plant J. 5(6) (1994), 885-890). Der Test auf Funktionalität einer solchen Subdomäne oder -Elements kann in planta durch den Nachweis der Reportergεnaktivität in transformierten
Zellen erfolgen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem funktionalen Teil der Promotorsequenz auch solche Subdomänen bzw. cw-Elemente der unter SEQ ID No.l, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 , SEQ ID No. 4 , SEQ ID No. 5 oder SEQ
ED No. 6 angegebenen Nucleotidsequenzen, die eine Wurzelspezifität vermitteln.
Ferner kann die Wirksamkeit einer Subdomäne oder eines cώ-Elementes durch Multimerisierung deutlich verstärkt werden. Im Falle des CaMV-35S-Promotors führte beispielsweise die Dimerisierung eines 250 bp großen Fragmentes in Tandemanordnung zu einer Verzehnfachung der Promotoraktivität (Kay et al., Science 230 (1987), 1299-1302). Im Falle der Subdomäne B5 des CaMV-35S-Promotors zeigte sich eine deutliche Aktivitätssteigerung des Promotorkonstruktes für den Fall, daß diese Domäne als Tetramer und nicht als Monomer vorlag (Benfey et al, EMBO J. 9 (1990), 1685-1696). In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher insbesondere auch Di- und Multimere von Subdomänen bzw. cw-Elementen der unter SEQ ID No.l, SEQ ID No. 2, SEQ ED No. 3 , SEQ ID No. 4 , SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleotidsequenzen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Erhöhung der Promotoraktivität im Vergleich zum Wildtyp durch die Kombination des erfindungsgemäßen Promotors mit einem sogenannten Enhancer erreicht.
In der Literatur sind verschiedene Enhancer beschrieben worden, die in der Regel eine gewebespezifische Erhöhung der Expression bewirken, wobei die Gewebespezifität in der Regel durch den jeweils verwendeten Enhancer determiniert wird (Benfey et al, Science 250 (1990), 959-966; Benfey et al, EMBO J. 8 (1989), 2195-2202; Chen et al, EMBO J. 7, (1988), 297-302; Simpson et al., Nature 323 (1986), 551-554).
Darüberhinaus gibt es auch Enhancer, wie z.B. den PetE Enhancer (Sandhu et al., Plant Mol. Biol. 37 (1998), 885-896), die nicht gewebespezifisch wirken und somit als reine quantitative Verstärkerelemente vor den erfmdungsgemäßen Promotor gesetzt werden können, um die Expression in Wurzeln zu erhöhen, ohne die Qualität der Gewebespezifität des erfmdungsgemäßen Promotors zu verändern. Ein wurzelspezifischer Enhancer, der auf der Multimerisierung einer bestimmten Box (Box
II) basiert, wurde beispielsweise beschrieben in "DNA-Protein Interactions in the Auxin regulated Promoter of T-DNA gene 5" (Autor: Sirpa Nuotio, Acta Universitatis Ouluensis, A
Scientiae Rerum Naturalium 299 (1997), Oulu University Press, S. 38 ff). Ferner können auch synthetische Enhancer verwendet werden, die beispielsweise von natürlich vorkommenden Enhancern abgeleitet sind und/oder durch Kombination verschiedener
Enhancer erhalten werden.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, die mit der unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken. Bevorzugt hybridisieren solche Sequenzen unter stringenten Bedingungen mit der unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ED No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Sequenz.
Der Ausdruck "stringente Bedingungen" bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisierungsbedigungen, wie sie beispielsweise beschrieben sind in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Insbesondere findet Hybridisierung unter den folgenden Bedingungen statt:
Hybridisierungspuffer: 2x SSC; lOx Denhardt's Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1:1:1); 0.1% SDS; 5 M EDTA; 50 mM Na^O,,; 250 μg/ml Heringsperma- DNA; 50 μg/ml tRNA; oder 0.25 M Natriumphosphatpuffer pH 7.2, ImM EDTA, 7% SDS Hybridisierungstemperatur T= 65 bis 68 °C; Waschpuffer 0.2 x SSC; 0.1% SDS; Waschtemperatur T = 65 bis 68° C.
Vorzugsweise weisen derartige Promotoren eine Sequenzidentität von mindestens 30%, bevorzugt von mindestens 40%, bevorzugt von mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 60%, insbesondere bevorzugt von mindestens 70% und vorteilhafterweise von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95%o zu der unter Seq ID No. 1 gezeigten Promotorsequenz oder Teilen davon auf. Vorzugsweise wird die Sequenzidentität derartiger Promotorsequenzen durch Vergleich mit der unter SEQ ID No. 1 dargestellten Nucleotidsequenz bestimmt. Wenn zwei zu vergleichende Sequenzen eine unterschiedliche Länge aufweisen, bezieht sich die
Sequenzidentität vorzugsweise auf den prozentualen Anteil der Nucleotidreste der kürzeren
Sequenz, die identisch sind mit den Nucleotidresten der längeren Sequenz. Die
Sequenzidentität kann konventionell durch Verwendung von Computerprogrammen wie z.
B. das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix,
Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI
53711) bestimmt werden. Bestfit nützt den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und
Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, um das Segment mit höchster Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen zu finden. Bei der Anwendung von
Bestfit oder einem anderen Sequenz-Alignment-Programm zur Bestimmung, ob eine bestimmte Sequenz beispielsweise zu 95 %> identisch ist mit einer Referenzsequenz der vorliegenden Erfindung, werden die Parameter vorzugsweise so eingestellt, daß der
Prozentanteil der Identität über die gesamte Länge der Referenzesequenz berechnet wird und daß Homologielücken ("gaps") von bis zu 5%> der Gesamtzahl der Nucleotide in der
Referenzsequenz erlaubt sind. Bei der Verwendung von Bestfit werden die sogenannten optionalen Parameter vorzugsweise bei ihren voreingestellten ("default") Werten belassen.
Die Abweichungen, die bei dem Vergleich einer gegebenen Sequenz mit den oben beschriebenen Sequenzen der Erfindung auftreten, können beispielsweise durch Addition,
Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination verursacht sein. Promotorsequenzen, die wie oben beschrieben mit der unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ
ED No. 4, SEQ ED No. 5 oder SEQ ED No. 6 gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren oder eine Sequenzidentität zu SEQ ID No. 1 aufweisen, stammen vorzugsweise aus pflanzlichen
Organismen, bevorzugt aus höheren Pflanzen, besonders bevorzugt aus dikotylen Pflanzen, insbesondere bevorzugt aus Pflanzen der Gattung Lycopersicon.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße Promotor die gesamte unter SEQ ID No. 3 (ca. 1.4 kb-Fragment), SEQ ID No. 4 (ca. 1.1 kb-Fragment), SEQ ED No. 5 (0.9 kb-Fragment) oder SEQ ID No. 6 (0.55 kb-Fragment) dargestellte Sequenz auf. Femer betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die einen funktionalen Teil dieser Sequenzen aufweisen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße Promotor die gesamte oder einen funktionalen Teil der unter SEQ ID No. 4 (1.1 kb- Fragment) dargestellten Sequenz auf.
Ohne daran zu denken, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß der unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigte Promotor von einem pflanzlichen Gen stammt, das zu einer Gruppe extensinähnlicher Proteine gehört.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Promotoren von Genen, die ein Protein, vorzugsweise aus der Gruppe der extensinähnlichen Proteine, codieren und die eine Homologie, d.h. Identität, von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 70%>, bevorzugt von mindestens 80%>, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere von mindestens 95%> zu der gesamten unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Promotoren von Genen, die ein Protein mit der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz codieren, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten Nucleotidsequenz bewirken.
Die unter SEQ ID No. 7 dargestellte Nucleotidsequenz codiert ein Polypeptid (SEQ ID No. 8) aus L. esculentum, von dem angenommen werden kann, daß es der Gruppe der extensinähnlichen Proteine zuzurechnen ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem extensinähnlichen Protein ein pflanzliches Protein verstanden, dessen Aminosäuresequenz mindestens eines der folgenden Sequenzmotive aufweist: SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPXY, SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP. Insbesondere solche pflanzlichen Proteine, die mindestens eines in der SEQ ID No. 8 enthaltenen SPPPP- und/oder (P)PPPPYY-Motive aufweisen, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als extensinähnlich bezeichnet.
DNA- Sequenzen, die Homologie zu der unter SEQ ID No. 7 gezeigten Sequenz aufweisen, können zum einen beispielsweise durch computergestütze Sequenzvergleiche mit bekannten Sequenzen identifiziert werden oder auch durch Durchmusterung von beispielsweise cDNA- oder genomischen Bibliotheken mit der unter SEQ ID No. 7 dargestellten Sequenz oder Teilen davon. Derartige Techniken sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., a.a.O.). Gleichfalls können computergestützte Sequenzvergleiche auch auf Aminosäureebene mit der in SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz oder Teilen davon durchgeführt werden.
Die Zellwand beeinflußt sowohl die Form als auch die Funktion der Zelle. Die Proteinfraktion der Zellwand enthält sowohl Enzyme als auch Strukturproteine. Zu den am besten charakterisierten Strukturproteinen der Zellwand gehören die sogenannten Extensme (Cassab und Varner, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 39 (1988), 321-353; Showalter, Plant Cell 5 (1993), 9-23.) Extensine gehören zur Familie der hydroxyprolinreichen Glykoproteine (HRGPs). Gene und cDNAs codierend für Extensine konnten bisher charakterisiert werden aus Karotte (Chen und Varner, EMBO J. 4 (1985), 2145-2151), Bohne (Corbin et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 4337-4344), Raps (Evans et al., Mol. Gen. Genet. 223 (1990), 273-287), Tomate (Showalter et al., Plant Mol. Biol. 16 (1991), 547-565) und Tabak (Memelink et al, EMBO J. 6 (1987), 3579-3583).
Die Genexpression der Extensine ist entwicklungsabhängig und eher gewebespezifisch als konstitutiv reguliert (Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry 47 (1998), 483-497; Ye et al, Plant Cell 3 (1991), 23-37). Vergleicht man die Gewebespezifität verschiedender Extensingene unterschiedlicher Pflanzen, so stellt man fest, daß das Expressionsmuster von Extensingenen in Abhängigkeit von der Art der untersuchten Pflanze, vom Zelltyp und vom Gewebetyp deutlich variieren kann (Showalter et al, Plant Mol. Biol. 19 (1992), 205-215). In Sojabohne werden HRGPs am stärksten in meristematischen Zellen exprimiert. Das HRGPnt3-Gen aus Tabak wird im Perizyklus und in der Endodermis, speziell in bestimmten Zellen, welche an der Bildung von Seitenwurzeln beteiligt sind, exprimiert (Keller et al., Proc. Nat. Acad. Sei 86 (1989), 1529).
Es wurde beschrieben, daß die Genexpression der Extensine durch Umweltfaktoren reguliert werden kann, wie z.B. Licht, Pathogenbefall, Verwundung, Hitzestress (siehe beispielsweise Cassab und Varner, Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39 (1988), 321-353; Cortin et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 4337-4344; Niebel et al., Plant Cell 5 (1993), 1697-1710). Dies ist jedoch nicht für alle Extensine der Fall (Sommer-Knudsen et al, Phytochemistry 47 (1998), 483-497).
Das mature Extensinprotein ist normalerweise reich an Hydroxyprolin (Hyp), Serin und an bestimmten Kombinationen der Aminosäuren Valin, Tyrosin, Lysin und Histidin. Die Primärstruktur von Extensinen (für einen Überblick siehe beispielsweise Sommer- Knudsen, Phytochemistry 47 (1998), 483-497) ist in der Regel charakterisiert durch mindestens eine Ser-Pro3.6-Peptideinheit, die auch wiederholt oder in Verbindung mit ähnlichen Sequenzen, wie z.B. folgenden Sequenzmotiven SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP auftreten kann (s. auch Sommer-Knudsen et al., a.a.O.).
Extensine unterliegen einer starken post-translationalen Modifikation. Beim Karotten- Extensin beispielsweise werden die meisten der Prolin-Reste durch Prolyl-Hydroxylasen hydroxyliert. Die Hydroxyprolinreste dienen als Angiffsstelle für Glykosylierungen (Lamport et al, Biochem J. 133 (1972), 125-132; van Holst, Plant Physiol. 74 (1984), 247- 251). Die Kohlenhydrate, vornehmlich Galactose und Arabinose (Smith et al., Phytochemistry 25 (1986), 1021ff; Holst et al., Plant Physiol. 74 (1984), 247; Smith et al., Phytochemistry 23 (1984), 1233) dienen der Stabilisierung der Proteine (Showalter, Plant Cell 5 (1993), 9-23). Die Arabinose tritt hauptsächlich in der Hyp-AraM-, die Galaktose in der Ser-Gal-Form auf.
Darüberhinaus wurde eine Verknüpfung verschiedener Extensine über Isodityrosin- bindungen diskutiert, was beispielsweise als Antwort auf Pathogenbefall zu einer weiteren Verstärkung der Zellwand führen kann (Brisson, Plant Cell 6 (1994), 1703-1712; Epstein, Phytochemistry 23 (1984), 1241-1246). Intramolekulare Isodityrosinbindungen konnten in Extensinen nachgewiesen werden (Epstein et al, Phytochemistry, 23 (1984), 1241 ff). Intermolekulare Isodityrosinbindungen konnten hingegen bisher nur in vitro nachgewiesen werden (Everdeen et al., Plant Physiol. 87 (1988), 616ff; Huystee et al., Plant Phys. Biochem. 33 (1995), 55ff).
Mit Hilfe des Prolin- Analogs 3,4-Dehydro-L-Prolin (Dhp) läßt sich die Prolyl-Hydroxylase selektiv inhibieren, so daß man die Biosynthese des Hydroxyprolins mit Hilfe von Dhp reduzieren kann. Für Wurzelscheiben der Möhre (Daucus carota) konnte nach Behandlung mit Dhp gezeigt werden, daß sie strukturell veränderte HRGPS synthetisieren. Auch die Behandlung von Tabakprotoplasten mit Dhp führte zur Regeneration von Zellwänden mit veränderter Struktur (Cooper, Plant Physiol. 104 (1994), 747-752).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Expressionskassetten enthaltend einen erfindungsgemäßen Promotor. Unter dem Begriff "Expressionskassette" wird dabei die Kombination eines erfindungsgemäßen Promotors mit einer zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz verstanden. Diese Nucleinsäuresequenz kann beispielsweise eine ein Polypeptid codierende Sequenz sein, d.h. ein Strukturgen. Sie kann in sense- oder in antisense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft sein. Die Nucleinsäuresequenz kann auch eine nicht-translatierbare RNA, beispielsweise eine antisense-RNA oder ein Ribozym, codieren. Diese Nucleinsäuresequenzen können in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Promotor benutzt werden, um Pflanzen mit verändertem, vorzugsweise verbessertem Phänotyp herzustellen. Weiterhin kann der Stoffwechsel der Pflanze in der Wurzel mittels des erfindungsgemäßen Promotors beeinflußt werden. Einige Beispiele zur heterologen (Über)expression und zur Antisense-Inhibierung mit dem Ziel, Stoffwechselflüsse in transgenen Pflanzen zu manipulieren, sind in Herbers und Sonnewald (TIBTECH 14 (1996), 198-205) zusammengefaßt. Ein Beispiel für Ribozyme wurde von Feyter (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-228) publiziert. Vielfältige Anwendungsmöglichkeiten von transgenen Pflanzen, die mit Hilfe der erfmdungsgemäßen Promotoren und Vektoren erzeugt werden können, sind auch in TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312-397 beschrieben. Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können weiterhin eine
Transkriptionsterminationssequenz stromabwärts des 3 '-Endes der mit dem Promotor verknüpften Nucleinsäuresequenz enthalten. Unter einer "Transkriptionsterminations- sequenz" wird dabei eine DNA-Sequenz verstanden, die am 3 '-Ende eines codierenden
Genabschnitts lokalisiert ist und in der Lage ist, die Beendigung der Transkription und gegebenenfalls die Synthese eines Poly-A-Schwanzes hervorzurufen. Ein Beispiel für eine solche Terminationssequenz ist die des Octopinsynthasegens.
Erfindungsgemäß können zwischen dem Promotor und der Nucleinsäuresequenz bzw. zwischen der Nucleinsäuresequenz und dem Terminator jeweils eine oder mehrere
Restriktionsschnittstellen liegen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die mindestens einen erfindungsgemäßen Promotor enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Promotor in einem derartigen Vektor verknüpft mit einem Polylinker, der eine Integration beliebiger Sequenzen stromabwärts des Promotors erlaubt. Dabei wird unter einem "Polylinker" eine DNA- Sequenz verstanden, die Erkennungssequenzen von mindestens einem Restriktionsenzym, vorzugsweise von zwei oder mehr Restriktionsenzymen, enthält.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält ein erfmdungsgemäßer Vektor auch noch eine Sequenz für die Termination der Transkription, beispielsweise die des Octopinsynthasegens, stromabwärts des Promotors bzw. des Polylinkers.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die erfindungsgemäße Expressionskassetten enthalten. Vorteilhafterweise enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren Selektionsmarker, die geeignet sind, Zellen, die die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten, zu identifizieren und gegebenenfalls zu selektionieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfmdungsgemäßen Vektoren geeignet zur Transformation von pflanzlichen Zellen und besonders bevorzugt zur Integration von Fremd- DNA in das pflanzliche Genom. Ein Beispiel für derartige Vektoren sind binäre Vektoren, die zum Teil auch bereits kommerziell erhältlich sind. Femer betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit einem erfmdungsgemäßen Promotor oder mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder Vektor genetisch modifiziert sind.
"Genetisch modifiziert" bedeutet dabei, daß die Wirtszelle einen erfindunggemäßen Promotor oder eine erfmdungsgemäße Expressionskassette oder Vektor enthält, vorzugsweise stabil ins Genom integriert, und der Promotor bzw. die Expressionskassette entweder in die Wirtszelle oder in einen Vorgänger dieser Zelle als Fremd-DNA eingebracht wurde. D.h. die erfindungsgemäßen Zellen können entweder selbst das unmittelbare Produkt eines Transformationsereignisses sein oder davon abstammende Zellen, die einen erfmdungsgemäßen Promotor oder eine erfmdungsgemäße Expressionskassette enthalten. Als Wirtszellen kommen sowohl prokaryontische, insbesondere bakterielle, als auch eukaryontische Zellen in Frage. Eukaryontische Zellen können beispielsweise Pilzzellen sein, insbesondere der Gattung Saccharomyces, bevorzugt von der Art Saccharomyces cerevisiae.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Vektoren, erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder erfmdungsgemäßen Wirtszellen zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen Pflanzenzellen, die im folgenden als transgene Pflanzenzellen bezeichnet werden.
Femer betrifft die vorliegende Erfindung auch Pflanzen, die erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthalten. Diese können jeder beliebigen Pflanzenart, -gattung, -familie, -Ordnung bzw. -klasse angehören. Es können sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen sein. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Pflanzen Nutzpflanzen, d.h. Pflanzen, die für den Menschen von agrarwirtschaftlichem, forstwirtschaftlichem und/oder gartenbauwirtschaftlichem Interesse sind. Bevorzugt sind dabei landwirtschaftliche Nutzpflanzen, wie z.B. Getreidearten (z.B. Weizen, Hafer, Gerste, Roggen), Mais, Reis, Kartoffeln, Rüben, Tabak, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Banane, Raps oder Futter- und Weidegräser (wie z.B. Alfalfa, weißer Klee, roter Klee), Flachs, Baumwolle. Soja, Hirse,
Bohne, Erbse etc, Gemüsepflanzen (wie z.B. Tomate, Gurke, Zucchini. Aubergine,
Kohlarten, Artischocke, Chicoree etc), Obstbaumgewächse, Hopfen, Wein usw. Von
Interesse sind auch Kräuter und Heilpflanzen, wie z.B. Catharanthus roseus, Datura stramonium, Taxus SSP.I, Dioscorea deltoidea, Papaver somniferum, Atropa belladonna,
Rauwolfia serpentina, Hyoscyamus niger, Digitalis lanata, Datura metel, Digitalis purpurea, Pilocarpus jaborandi, Cinchona ledgeriana, Aconitum napellus.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfmdung auch Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder mit einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfmdung die Verwendung von erfindungsgemäßen Vektoren, erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder erfindungsgemäßen Wirtszellen zur Herstellung transgener hairy roots durch Agrobacterium rhizogenes.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen können nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Transformation pflanzlicher Zellen oder Gewebe und
Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen bzw. dem Gewebe.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von
Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die
Elektroporation von DNA, die Einbringung der DNA mittels des biolistischen Ansatzes sowie weitere Möglichkeiten.
Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen und Pflanzen, vorzugsweise dikotylen
Pflanzen, vorzugsweise unter Verwendung der Agrobakterium-vermittelten Transformation, sind intensiv untersucht und ausreichend in EP 0 120 516; Hoekema (In: The Binary Plant
Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.N., Alblasserdam (1985), Kapitel V); Fraley et al.
(Crit. Rev. Plant Sei. 4 (1993), 1-46) und An et al. (EMBO J. 4 (1985), 277-287) beschrieben worden. Für die Transformation von Kartoffel siehe z.B. Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8
(1989), 29-33).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobakterium-basierender
Vektoren wurde beschrieben (Chan et al, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al.,
Plant J. 6 (1994), 271-282; Deng et al., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al,
Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492;
Conner und Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2
(1993), 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Phyiol. 104
(1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al, Plant Mol.
Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die
Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen oder die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wird in der Literatur mehrfach beschrieben (z.B. WO 95/06128, EP 0 513 849, EP 0 465
875, EP 0 292 435; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al.,
Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al,
Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschreiben, z.B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al., s.o.; Krens et al., Nature 296 (1982), 72-74) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285-297).
Für Reis wurden unterschiedliche Transformationsmethoden beschrieben, wie z.B. die
Agrobakterium-vermittelte Transformation (Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Hiei et al, Plant Mol. Biol. 35 (1997), 205-218; Park et al., J. Plant Biol. 38 (1995), 365-371), die
Protoplasten-Transformation (Datta, In "Gene transfer to plants", Potrykus, Spangenberg
(Eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1995, 66-75; Datta et al, Plant Mol. Biol. 20
(1992), 619-629; Sadasivam et al., Plant Cell Rep. 13 (1994), 394-396), der biolistische
Ansatz zur Pflanzentransformation (Li et al., Plant Cell Rep. 12 (1993), 250-255; Cao et al,
Plant Cell Rep. 11 (1992), 586-591; Christou, Plant Mol. Biol. (1997), 197-203) sowie die Elektroporation (Xu et al., In "Gene transfer to plants", Potrykus, Spangenberg (Eds.), Springer- Verlag, Berlin, Heidelberg, 1995, 201-208).
Femer betrifft die vorliegende Erfmdung auch Vermehrungs- und Eratematerial von erfindungsgemäßen Pflanzen, das erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthält. Der Begriff "Vermehrungsmaterial" umfaßt dabei jene Bestandteile der Pflanze, die geeignet sind zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder generativem Weg. Für die vegetative Vermehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Calluskulturen, Rhizome, Wurzelstöcke oder Knollen. Anderes Vermehrungsmaterial umfaßt beispielsweise Früchte, Samen, Sämlinge, Protoplasten, Zellkulturen etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Knollen und Samen.
Femer betrifft die vorliegende Erfmdung ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Promotoren, die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken, umfassend die folgenden Schritte: a) Hybridisierung einer pflanzlichen genomischen Bank mit einer cDNA, die für ein extensinähnliches Protein codiert; b) Isolierung positiver Klone; c) Testung der isolierten Klone auf Promotoraktivität.
Die in Schritt a) durchgeführte Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter stringenten Bedingungen. Hierbei werden bekannte Sequenzen, die ein extensinähnliches Protein codieren, oder Teile davon zur Hybridisierung mit einer entsprechenden Bibliothek, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen eingesetzt. Bevorzugt wird die unter SEQ ED No. 7 aufgeführte Sequenz oder Teile davon eingesetzt. Die Methoden sind dem Fachmaim bekannt und sind detailliert beschrieben, z.B. in Sambrook et al. (a.a.O.).
Wie bereits vorstehend erwähnt, versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter einem extensinähnlichen Protein ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mindestens eines der Sequenzmotive SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPXY, SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP. SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK,
SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP aufweist und das eine Homologie von mindestens 60%>, vorzugsweise von mindestens 70%>, bevorzugt von mindestens 80%o, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere von mindestens 95%> zu der unter SEQ ID No. 7 angegebenen codierenden Region aufweist.
Die unter Schritt b) genannte Identifizierung positiver Klone und Isolierung der
Promotorsequenz erfolgt nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und die beispielsweise beschrieben sind bei Sambrook et al. (a.a.O.).
Die Expressionseigenschaften des isolierten Promotors können durch Reportergen- Experimente analysiert werden. Zur unter Schritt c) genannten Testung der isolierten Promotorsequenzen auf Promotoraktivität in Wurzelzellen kann der Promotor beispielsweise in einer Expressionskassette bzw. in einen Vektor zur Pflanzentransformation operativ mit einem Reportergen, wie z.B. dem ß-Glucuronidasegen aus E. coli, verknüpft werden. Dieses Konstrukt wird zur Transformation von Pflanzen verwendet. Anschließend wird die organspezifische Expression der ß-Glucuronidase bestimmt, wie z.B. bei Martin et al. (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene Expression, In: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Academic Press (1992), 23-43) beschrieben. Diejenigen Promotoren, die eine Wurzelspezifität aufweisen, werden selektioniert und anschließend isoliert.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang die sequentielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiteren regulativen Elementen, wobei jedes der genannten Elemente seine Funktion bei der Genexpression bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Promotoren oder der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Promotoren zur wurzelspezifischen Expression von Transgenen in Pflanzen.
Der Begriff "Transgen" bedeutet dabei eine in eine Pflanze künstlich eingeführte DNA- Sequenz. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfaßt durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfmdung.
Weiterführende Literatur kann zu einer der oben angeführten Methoden. Mittel und
Verwendungen, die im Sinne der vorliegenden Erfmdung angewendet werden können, dem
Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der
Benutzung von elektronischen Hilfsmitteln. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über Internet zur Verfügung stehen, z. B. unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen werden, z. B. unter der Adresse http://www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen und
Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in Berks,
TIBTECH 12 (1994), 352-364 gegeben.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Northern Blot Analyse von RNA aus Wurzeln
5 μg Gesamt-RNA von abgestreiften Wurzeln und Wurzelhaaren und 10 μg Gesamt-RNA der angegebenen Tomatenorgane wurden für die "Northern blot" Analyse pro Spur aufgetragen. Hybridisierung der RNA mit radioaktiv markierter LeExtl cDNA oder 25S rDNA cDNA. Die Transkriptgrößen sind zur rechten Seite angegeben. 25S rDNA diente als Kontrolle für gleichmässiges Beladen der Spuren und Transfer auf die Nylon Membran. Abgestreifte Wurzeln sind Wurzeln nach Wurzelhaarisolierung mit einer deutlich reduzierten Anzahl an Wurzelhaaren. Die Isolierung pflanzlicher RNA erfolgte nach der heißen Phenol Extraktion- Methode von Verwoerd et al. (Nucleic Acids Research 17 (1989), 2362). Die RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit UV- Bestrahlung daran fixiert. Nach Hybridisierung und Waschen wurde die radioaktive Membran auf Röntgenfilm exponiert. Dieser wurde nach einer über-Nacht-Exposition bei -80°C entwickelt. Die Intensität der Signale korreliert mit der Konzentration der spezifischen mRNA auf der Membran.
Figur 2: Northern Blot Analyse zur Expression von LeExtl 10 μg Gesamt- RNA (5 μg im Falle der Spuren 3 und 4: 18 Tage und Erde) von 7, 14 und 18
Tage alten Keimlingen (7 Tage, 14 Tage, 18 Tage), auf Erde gewachsenen Wurzeln (Erde), Keimlingswurzeln, welche im Dunkeln (-Licht) oder im Licht (+Licht) inkubiert wurden, und Kontrollen (Kontrolle), sowie verwundete Blätter (Verwundung) wurden für die RNA "Northern blot" Analyse verwendet. Radioaktiv markierte LeExtl cDNA wurde für die Hybridisierung verwendet. Die Isolierung pflanzlicher RNA erfolgte nach Verwoerd et al. (1989) (s.o.). Die RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit UV-Bestrahlung daran fixiert. Nach Hybridisierung und Waschen wurde die radioaktive Membran auf Röntgenfilm exponiert. Dieser wurde nach einer über-Nacht- Exposition bei -80°C entwickelt. Die Intensität der Signale korreliert mit der Konzentration der spezifischen mRNA auf der Membran.
Figur 3: In «tw-Nachweis der LeExtl mRNA
Lokalisation des LeExtl Transkripts in Tomatenwurzeln. Lichtmikroskopische Aufnahmen von jungen Tomatenwurzeln unter sterilen Bedingungen. A, B In Paraffin eingebettete Schnitte wurden entsprechend der in sztw-Hybridisierungsmethode wie in Daram et al. (Planta 206 (1998), 225-233) beschrieben mit nicht-radioaktiv markierter LeExtl "antisense" RNA hybridisiert. A Junge Keimlingswurzel mit wachsenden Wurzelhaaren in der Differenzierungszone der Wurzel. B Wurzelhaarzone einer jungen Keimlingswurzel. Die Wurzelspitze ist auf der linken Seite lokalisiert. Die Größe des Balkens beträgt 200 μm.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Isolierung eines wurzelspezifischen Gens
Pflanzenmaterial und Wurzelhaargewinnung
Als Pflanzenmaterial dienten verschiede Organe von auf Erde im Gewächshaus gewachsenen Tomatenpflanzen Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker. Für die Wurzel- und Wurzelhaargewinnung wurden 8000 oberflächensterilisierte Samen auf ein Metallgitter auf Papier (No. 0858, Schleicher & Schuell, Deutschland) unter sterilen Bedingungen in Petrischalen ausplattiert. Das Papier wurde vorgängig in 0.5x Hoagland Lösung angefeuchtet. Keimung geschah bei 22°C bei einem Tag/Nacht Zyklus von 16h/8h. Am Tage 3 nach der Keimung wurde das Netz um ca. 4mm über das Papier angehoben, indem sterile Glaskugeln zwischen Netz und Papier geschoben wurden. Dies erlaubte vertikales Wachstum der Keimlingswurzeln und optimale Wurzelhaarbildung. Am Tage 5 wurden die Keimlinge mitsamt dem Netz in flüssigen Stickstoff getaucht und die Wurzeln wurden mit einem Spatel vom Netz weggekratzt. Die Wurzelhaare wurden daraufhin wie in Röhm und Werner (Physiologia Plantarum 69 (1987), 129-136) beschrieben in flüssigem Stickstoff von den Wurzeln abgestreift und durch Filter über ein 250 μm Analysensieb gereinigt. Für die "Northern blot" Analyse von Keimlingswurzeln unterschiedlichen Alters wurden die Keimlinge wie oben beschrieben während 7, 14 und 18 Tagen inkubiert und die Wurzeln entsprechend isoliert. Zur Isolierung von behaarten Wurzeln von auf Erde gewachsenen Pflanzen wurden dicht durchwachsene Pflanzentöpfe aus dem Gewächshaus vom Erdballen entfernt. Die an der seitlichen Oberfläche des Erdballens wachsenden Wurzeln wurden mit der Pinzette abgeerntet und unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für Licht/Dunkel Versuche wurden Keimlinge wie oben beschrieben inkubiert in einem Tag/Nachtzyklus von 16h 8h Belichtung. 7 Tage alte Wurzeln wurden nach 4-stündiger Belichtung nach Beginn des Tagzyklus geemtet. Parallel dazu wurden Keimlinge während 7 Tagen im Dauerdunkeln inkubiert und danach deren Wurzeln ebenfalls geerntet. Tomatenblätter wurden wie in Pena-Cortes et al. (Planta 186 (1992), 495-502) beschrieben verwundet und nach 24 h geemtet. Als Kontrolle wurden unverwundete Blätter verwendet. RNA Extraktion und Herstellung einer cDNA Bibliothek
Gesamt-RNA aus den angegebenen Organen wurde nach der Methode von Verwoerd et al. (Nucleic Acid Research 17 (1989), 2362) extrahiert. 7-60 μg totale RNA aus Wurzelhaaren wurde für die Isoliemng der poly(A)+ RNA mittels dem Gebrauch von magnetischen oligodT Kügelchen (Dynabeads, Dynal, Deutschland) weiterverwendet. 700 ng poly(A)+ RNA wurden für die Herstellung doppelsträngiger cDNA verwendet (Pharmacia, Deutschland). Die cDNA wurde nach Anhängen eines EcσRI/Notl linkers in den Εxpressionsvektor λZAPII (Stratagene, Deutschland) Moniert. Verpackung in den λ Phagen erfolgte mit dem Gigapack II Gold Packaging Εxtract Kit von Stratagene (Deutschland).
Differentielles Durchmustern der Wurzelhaar-spezifischen cDΝA Bibliothek 500,000 in Phagen verpackte cDΝAs wurden auf YT Agar in Agarschalen ausplattiert und nach einem Standardprotokoll (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd ed., Cold Spring Harbour Press., Cold Spring Harbour, ΝY.) mit 680 ng radioaktiv markierter revers transkribierter mRΝA aus entweder Wurzelhaaren oder abgestreiften Wurzeln durchmustert. 100 putativ positive Plaques wurden einer zweiten Durchmusterung unterworfen, um Artefakte zu vermeiden. Letzlich wurden 76 positive Plaques für die in v/vo-Εxcision weiterverwendet. Die daraus folgenden Bakterienkulturen wurden in einer 96er Mikrotiter Platte in 2x YT Medium (Sambrook et al., s.o.) bei 28°C über Nacht geschüttelt. Plasmid-DNA aus diesen Kulturen wurden für eine zweite Durchmusterung verwendet, indem eine Art reverser Southern-Methode, wie in Bucher et al. (Plant Molecular Biology 35 (1997), 497-508) beschrieben, angewendet wurde. Nach EcoRI Verdau von vielversprechenden Plasmiden wurde die entsprechenden Inserts isoliert und für die "Northern blot" Analyse weiterverwendet.
"Northern blot" Analyse und DNA Sequenzierung
5-10 μg Gesamt-RNA aus den angegebenen Organen wurden nach Glyoxylierung auf ein 1, 2-prozentiges Agarose-Glyoxalgel geladen (Hüll (1985), Purification, biophysical and biochemical characterisation of viruses with Special reference to plant viruses. In: Mahy, (ed.), Virology. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK, pp. 1-24). "Northern blot" Analyse und Hybridiserungsbedingungen wurden Standardvorschriften entnommen (Sambrook et al., s.o.). Die Blots wurden bei 68°C hybridisiert. Detektion von LeExtl mRNA wurde erreicht durch Verwendung der LeExtl cDNA als radioaktive Sonde. Die letzte Waschung des Blots erfolgte mit 0.1 x SSC bei 68°C. Nach dem Waschen wurden die Blots auf Röntgenfilm (Kodak, Deutschland) exponiert bei -80°C. Die Transkriptgrößen wurden durch Vergleich mit glyoxylierter Marker DNA (BRL, Deutschland) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt.
Sequenzierung der LeExtl cDNA (= SEQ ID. No. 7) erfolgte durch Verwendung der Didesoxysequenziemng mit T7 DNA Polymerase (Amersham, Deutschland). Sequenzanalyse erfolgte mit dem University of Wisconsin GCG Packet (Devereux et al., A comprehensive set of sequence analysis prgrams for the VAX. Nucleid Acids Research 12 (1984), 387-395).
Beispiel 2: Isolierung eines genomischen Fragments, das die Promotorregion des wurzelspezifischen Gens umfaßt
Eine genomische DNA Bibliothek aus Tomate (Clontech Laboratories, USA) wurde mit radioaktiv markierter LeExtl cDNA (s. Beispiel 1) durchmustert. 500,000 Plaque formende Einheiten (PFE) der DNA Bibliothek wurden dazu auf YT Agar in Agarschalen ausplattiert, über 6 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert und auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham, Deutschland) transferiert (Sambrook et al., s.o.). Hybridisierungsbedingungen wurden Standardvorschriften entnommen (Sambrook et al., s.o.). 30 Plaques von der ersten Durchmusterang wurden für eine zweite Runde ausgewählt. Die Phagensuspensionen von zwei ausgewählten Plaques nach der zweiten Durchmusterang wurden erneut ausplattiert, um Phagenlysate herzustellen. Davon wurde λ DNA nach Lockett (Analytical Biochemistry 185, (1990), 230-234) präpariert. Je 600 ng λ DNA wurden daraufhin mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und die daraus resultierenden Fragmente auf einem Agarosegel mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Nach Southern Blot-Hybridisierung (Sambrook et al., s.o.) mit radioaktiv markierter LeExtl cDNA wurde letzlich ein ungefähr 3.4 kb langes genomisches Fragment isoliert, welches mit LeExtl cDNA hybridisiert hat und in ebenfalls mit Aspl IS verdautes pBluescript II SK" Plasmid kloniert. Das Fragment wurde durch Didesoxysequenziemng mit T7 DNA Polymerase (Amersham, Deutschland) zunächst partiell sequenziert. Dabei stellte sich heraus, daß das genomische Fragment über 204 Basenpaare mit der LeExtl cDNA Sequenz überlappte und sich 5' aufwärts in den nichtcodierenden Bereich des LeExtl Gens weitererstreckt.
Anschließend wurden beide Stränge des genomischen Fragments (ca. 3.4 kb) sequenziert (SEQ ID No. 13).
Beispiel 3: Herstellung von GUS-Expressionskassetten zur Analyse der Funktionalität des Promotors
Es wurden insgesamt drei verschiedenartige GUS-Expressionskassetten hergestellt. A. Translationelle Fusion des 3.4 kb großen genomischen Fragments enthaltend ungefähr 200 Basenpaare codierende Sequenz der LeExtl cDNA mit einer GUS Kassette. Das genomische Fragment wurde durch einen Kpnl Verdau aus dem pBluescript II SK" Plasmid herausgeschnitten, mittels einer Auffüllreaktion mit der T7 DNA Polymerase geglättet (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., New York., 1998) und in den mit Smαl verdauten und dephosphorylierten binären Vektor pBI101.3 kloniert (Clontech, USA). pBI101.3 ist ein Plasmid, das eine promotorlose GUS Kassette im binären Vektor pBIN19 enthält. Dieses Konstrukt wurde rohl genannt.
B. Transkriptionelle Fusion eines modifizierten genomischen Fragmentes mit einer GUS Kassette. Mit den Oligonucleotiden 42trx3 (5'-
GAGAGTCGACGATATCGGGCGAATTGGGTACC-3', SEQ ID No. 9), enthaltend die Restriktionsschnittstelle von Saä, und 42trx4 (5'-
GAGATCTAGAGGTACCGGACTTTATATAACATAAC-3', SEQ ID No. 10), enthaltend die Restriktionsschnittstelle von Xbal, wurde mittels PCR (30 sec bei 94°C Schmelzen der DNA, 1 min bei 60°C Anlagerung der Primer, 1 min bei 72°C mit 3 sec Extension pro Zyklus DNA Synthese mittels Taq DNA Polymerase [Fermentas, Litauen]) ein genomisches Fragment von ca. 3200 bp Länge synthetisiert, welchem der, mit der LeExtl cDNA überlappende, ORF (open reading frame) fehlt. Das Fragment wurde mit Satl und Xbal verdaut und in das ebenso verdaute und dephosphorylierte pBluescript II SK" Plasmid kloniert. Nach Isolation des Plasmids aus einer E.coli DH5α Kultur (Sambrook et al., s.o.). wurde das Fragment mittels SafiJXbal Verdau isoliert und durch eine Auffüllreaktion mittels
T7 DNA Polymerase geglättet. Das Endprodukt wurde daraufhin in den mit Smal verdauten und dephosphorylierten binären Vektor pBI101.3 kloniert. Dieses Konstrukt wurde rohtrx genannt.
C. Es wurde ein PCR Produkt von ca. 3270 bp mit Hilfe folgender Primer hergestellt: 42Xba (5'-GAGATCTAGACCATGGAGAAGAATTGG-3\ SEQ ID No. 11) und 42Sal (5'- GAGAGTCGACGGGCGAATTGGGTACCG-3', SEQ ID No. 12). Die PCR Bedingungen waren: 20 sec bei 94°C Schmelzen der DNA , 45 sec bei 50°C Anlagemng der Primer, 2 min bei 72°C DNA Synthese mittels Pfu DNA Polymerase (Stratagene, Deutschland). Das PCR- Produkt wurde nach der Anleitung des Herstellers direkt in das Plasmid pCR-Script kloniert (Stratagene, Deutschland). Nach SaWNotl Verdau wurde das PCR Produkt mit dem Klenow Enzym geglättet [Sambrook, 1989 #68] und in Smαl verdautes und dephosphoryliertes pBluescript II SK" Plasmid kloniert. Nach Plasmidpreparation (Sambrook et al., s.o.). wurde das Plasmid mit BstXI verdaut und linearisiert. Durch serielle Verkürzung des PCR- Produktes mittels Exonuclease III und Sl Nuclease vom 5' Ende her gemäß dem Protokoll des Herstellers (Fermentas, Litauen) wurden verkürzte genomische Fragmente folgender ungefährer Länge hergestellt: 2.2 kb, 1.7 kb, 1.4 kb, 1.1 kb, 0.9 kb und 0.55 kb. Die AKIΪ- GUS-3'NOS Kassette aus dem Plasmid 5ΑKT1-320.X (Lagarde et al, Plant J. 9 (1996), 195-203) wurde mit Sacl isoliert, mittels Mung Bean Nuclease Behandlung geglättet (New England BioLabs Inc., Bioconcept, Switzerland) und mit Ncol nachverdaut. Die so erhaltene GUS-3'ΝOS Kassette wurde in NcoI/EcoRV verdaute und dephosphorylierte pBluescript II SK" Plasmide enthaltend die verkürzten genomischen Fragmente kloniert. Die so hergestellten Promotor-GUS-3'NOS Kassetten wurden durch Verdau mit Sacl und Sα I aus dem jeweiligen Plasmid isoliert und in Sacϊ/Sa verdauten und dephosphorylierten binären Vektor Binl9 (Bevan et al, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711) kloniert. Die erhaltenenen Konstrakte wurden im folgenden BIN-Δgenx-GUS genannt, wobei x die jeweilige Fragmentlänge 2.2 kb (SEQ ED No. 1), 1.7 kb (SEQ ID No. 2), 1.4 kb (SEQ ID No. 3), 1.1 kb (SEQ ED No. 4), 0.9 kb (SEQ ED No. 5) oder 0.55 kb (SEQ ED No. 6) bezeichnet. Beispiel 4: Pflanzentransformation
Die beschriebenen Konstrukte enthaltend die verschieden großen Promotorfragmente wurden durch Elektroporation in den Agrob akteriumstamm C58C1 enthaltend das Plasmid pGV2260
(Deblaere et al., Nucleic Acids Research 13 (1985), 4777-4788) eingeführt. Die
Agrobakterien wurden auf YEB Medium (Vervliet et al., Journal of General Virology 26
(1975), 33-48) kultiviert. Die Transformation von Tabak und Tomatenpflanzen erfolgte nach der Methode des durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfers, wie von
Rosahl et al. (EMBO J. 6 (1987), 1155-1159) für Tabak und von Lillatti et al.
(Biotechnology 5 (1987), 726-730) für Tomate beschrieben, durchgeführt.
Darüberhinaus erfolgte die Transformation von Kartoffel wie bei Rocha-Sosa et al. (EMBO
J. 8 (1989), 23-29).
Die Transformation von Mais erfolgte wie bei Omirulleh et al. (in "Gene Transfer to Plants",
Potrykus, Spangenberg (Eds), Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1995, S. 99 ff.) beschrieben.
Die oben beschriebenen Konstrukte wurden darüberhinaus durch Elektroporation in den A. rhizogenes Stamm 15834 (Jung et al., Biotechnol Lett 14 (1992), 695-700) eingeführt und anschließend zur Transformation von Catharanthus roseus mittels Agrobacterium rhizogenes in Anlehnung an Toivonen et al. (Plant Cell Tissue Org. Cult. 18 (1988), 79 ff.) verwendet.
In den hairy roots konnte eine starke GUS -Expression nachgewiesen werden. Die Transformation von Reis erfolgte mittels der particle bombardement-Methode, wie beispielsweise beschrieben bei Christou (Plant Mol. Biol. 35 (1997), 197-203).
Beispiel 5: Histochemische Lokalisierung der LeExtl Promotoraktivität
Das Pflanzenmaterial wurde mit einer 0.1%>igen X-Gluc Lösung (0.1 g X-Gluc in 1 ml Dimethylformamid vorlösen, 1 ml 10% Triton und 5 ml 1 M Natriumphoεphatpuffer, pH 7.2 dazugeben und mit Destwasser auf 100 ml auffüllen) vakuuminfiltriert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach dem Färben wurden die Pflanzen in EthanoEEssigsäure (3:1) fixiert und in 100% Ethanol entfärbt. Dabei wurden grüne Pflanzenteile farblos, währenddem der blaue Farbstoff stabil bleibt; siehe Figur 3.
Beispiel 6: Untersuchung der Spezifität und der Stärke des Promotors
Zur Untersuchung der Spezifität des Promotors wurde an Kartoffel- und an Tomatenpflanzen die GUS-Aktivität in Blättern im Vergleich zur Aktivität in Wurzeln nach der von Jefferson et al. (EMBO J. 6 (1987), 3901-3907) beschriebenen Methode bestimmt. In Tomate ist die GUS-Aktivität in Wurzeln zwischen 20 und 300 mal höher als in maturen Blättern. Die meisten der untersuchten GUS-positiven Kartoffelpflanzen zeigten eine starke GUS-Aktivität in den Wurzeln, aber keinerlei GUS-Aktivität in maturen Blättern. Zur Bestimmung der Stärke des Promotors wurden die GUS-Aktivitäten verglichen mit solchen des 35S-Promotors. Die Linien mit der stärksten Aktivität des Promotors wiesen im Vergleich zum CaMV 35S-Promotor eine etwa halb so starke Aktivität auf.

Claims

Patentansprüche:
1. Promotor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Promotoren, die die unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebene Nucleinsäuresequenz umfassen; b) Promotoren, die einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 1, SEQ ED No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ED No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleinsäuresequenz umfassen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; c) Promotoren, die eine Sequenz aufweisen, die mit der unter Seq ED No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten hybridisiert, und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; und d) Promotoren von Genen, die ein Protein codieren dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 60% zu der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
2. Promotor nach Anspruch 1 , der ein pflanzlicher Promotor ist.
3. Expressionskassetten enthaltend einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
4. Vektor enthaltend einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 3.
5. Vektor nach Ansprach 4, der zur Transformation von pflanzlichen Zellen geeignet ist.
6. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Promotor nach einem der
Ansprüche 1 oder 2, mit einer Expressionskassette nach Ansprach 3 oder einem Vektor nach Ansprach 4 oder 5.
7. Wirtszelle nach Ansprach 6, die eine Pflanzenzelle ist.
8. Hairy roots enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.
9. Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.
10. Vermehrungs- oder Erntematerial von Pflanzen nach Ansprach 9, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.
11. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen nach Ansprach 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit einem Vektor nach Ansprach 4 oder 5 oder mit einer Expressionskassette nach Ansprach 3 oder mit einer Wirtszelle nach Ansprach 6 transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert.
12. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Promotoren, die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Hybridisierung einer pflanzlichen genomischen Bank mit einer cDNA, die für ein extensinähnliches Protein codiert;
(b) Isolierung positiver Klone;
(c) Testung der isolierten Klone auf Promotoraktivität.
13. Verfahren nach Ansprach 12, wobei die verwendete cDNA identisch mit einem Teil der unter SEQ ID No. 7 dargestellten Nucleotidsequenz ist.
4. Verwendung eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eines nach einem Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis 13 identifizierten Promotors zur wurzelspezifischen Expression von Transgenen in Pflanzen.
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