CN1383451A - 诱导植物中基因表达的方法及用其处理的植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过基因转移向提供植物阻遏子和操纵子性状的方法,所述阻遏子和操纵子与作为诱导物的放线菌自调节因子构成基因表达诱导系统,并将放线菌自调节因子给予此转化的植物,从而在给予放线菌自调节因子的部位诱导受操纵子控制的基因的表达。这种方法可以使所需的基因在所需的时间和部位表达,从而使植物甚至能够产生代谢产物,否则对植物的生长是不利的。还可以控制其繁殖力防止转化体植物在环境中的扩散。

Description

诱导植物中基因表达的方法及用其处理的植物

发明领域

本发明涉及用基因重组方法产生转基因植物的过程中向植物提供基因表达诱导系统的技术。

发明背景

为了提供具有新特性的植物，而将基因转移到植物中称为转化。当转移的基因在植物细胞中表达时，就表现出所提供的性状。一旦基因整合到细胞内染色体中，就将稳定地维持所提供的特性。由这种基因转移所新提供的特性包括如对疾病和农药的抗性及代谢的改变。用于这种转化的基因可采用现有基因重组方法自由地构建。已开发了一些方法用于将这种方式构建的基因转移入植物中。对将基因有效整合入植物细胞核染色体而言，可以用土壤杆菌感染方法，其中用作基因运载体(载体)的土壤杆菌是一种感染植物的细菌。

基因的表达包括称为转录的步骤(其中mRNA被转录到称为DNA的模板上，DNA是含有遗传信息的基因)和称为翻译的步骤(其中根据从转录mRNA得到的遗传信息合成蛋白质)。已知基因包含有参与转录调节或控制的区域以及编码蛋白质信息的区域。最基本的转录调节区域是5’上游区域(与编码区域相关)，称为启动子。真核生物(如植物)和原核生物(如细菌)之间的启动子在结构上不同。植物启动子含有称为TATA盒的核苷酸序列(对启动基因转录是必不可少的)和其它各种调节序列。为引发转录，RNA聚合酶(催化在植物细胞中转录的酶)结合于此TATA盒。各种称为转录因子的细胞内蛋白质能特异性地结合于各种调节序列(作为转录因子的靶)。这些转录因子引发或抑制RNA聚合酶的转录活性从而控制基因的表达。因此，基因表达受这些调节序列的控制。这些调节序列和转录因子也通过转录步骤参与基因表达的诱导。

控制对转移入植物中的基因的表达诱导来控制转化的时间和部位是可能的，这对植物产生例如代谢物有很大益处，否则对植物生长是不利的。为了此目的，已尝试了使用其它生物的基因表达诱导系统。这是因为用植物固有的基因表达诱导系统可能对植物代谢系统有不能预计的影响。然而，其它生物的基因表达诱导系统是否能成功地用于植物需要进行证明。

调节系统包括诱导物、阻遏子和操纵子，如在细菌操纵子调节系统中所见的那样，它们是主要基因表达诱导系统之一。诱导物是一种低分子量化合物可诱导基因表达。阻遏子是此诱导物的受体蛋白质。操纵子是一种作为阻遏子靶子的调节序列。诱导物-阻遏子结合和阻遏子-操纵子结合是高度特异性的，表现出高水平的亲和力，而结合了诱导物的阻遏子不能结合操纵子。当诱导物浓度低时，启动子中含有的操纵子基因(称为受操纵子控制的基因)被抑制(OFF)而不能表达，因为阻遏子已结合于操纵子，但随着诱导物浓度的增加，阻遏子被释放而引起基因表达(ON)。

还报道了用细菌诱导物/阻遏子/操纵子系统作为在植物中诱导基因表达的手段的尝试。为了提供具有阻遏子和操纵子性状的植物，可将两种基因即称为阻遏子基因和受操纵子控制的基因转移到植物中。为了在植物细胞中获得这两种基因的表达，理想地启动子是植物启动子。操纵子位于植物启动子中或附近。通过对启动子的选择，可以将启动子的各种特性功能性地组合，如将基因表达强度和组织特异性与基因表达的诱导性相结合。通过以这种方式将诱导物给予转化的植物，受操纵子控制的基因的表达在给予诱导物的部位被诱导。将诱导物/阻遏子/操纵子调节系统给予植物的成功例子是：有报道在该系统中使用四环素和IPTG作为诱导物[日本公开出版物Hei-06-339384和Gatz等人，Trends inPlant Science(1998)，3，352-358]。然而从可行性观点看迄今报道的实施例中所使用的诱导物存在问题，如环境安全性和/或使用成本。

发明概述

从本领域的上述发展状况来看，本发明的目的是提供在植物中诱导基因表达的方法，从而控制转移入转化植物中的基因表达诱导的时间和部位。

本发明是一种在植物中诱导基因表达的方法，包括向植物提供阻遏子和启动子性状，这两者构建了基因表达诱导系统，并将放线菌自调节因子作为基因转移的诱导物，给予转化的植物放线菌自调节因子，从而诱导受操纵子控制的基因在给予放线菌自调节因子部位的表达。

现详细描述本发明。

发明详述

放线菌(Actinomycete)在土壤中的最高密度仅次于真杆菌，且产生许多生理活性物质，如抗菌素等。本文这里提到的放线菌可以是例如链霉菌(Streptomyce)、小单孢子菌(Micromonospora)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、孢囊链霉菌(Streptosporangium)、游动放线菌(Actinoplane)、诺卡氏菌(Nocardia)和糖单孢菌(Saccharopolyspora)。放线菌的生理活性物质产生和形态分化受内源微生物激素类物质(称为自调节因子)的控制。

至今，已知三种放线菌自调节因子，称为灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的A因子、弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virgriniae)的弗吉尼亚丁内酯(VB)和淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)菌株FRI-5的诱导物-2[Nihira，HakkoKogaku Kaishi(1991)，第69卷，89-105]。

A因子诱导抗菌素链霉素的产生和生产菌中的链霉素抗性，还诱导形成分生孢子和气生菌丝。VB诱导生产菌同时产生两种抗菌素维吉霉素：维吉霉素M和维吉霉素S。诱导物-2诱导生产菌中抗菌素产生的变化(从D-环丝氨酸类型转化成核苷酸类型的抗菌素)而且在碳源和氮源不充足的条件下还诱导产生蓝色色素。

与其它生物品种中所看到的激素、信息素等一样，链霉素自调节因子在低浓度时，即在培养物中只有几nM到几分nM时，仍显示它们的活性。

认为约60％链霉菌属中的放线菌能产生自发调节因子，而且还可能存在大量未知的自发调节因子。

众所周知，通常放线菌自调节因子具有2-(1’-氧代或羟基烷基)-3-羟基甲基-丁内酯构架。因此，这种已知的放线菌自调节因子也称为丁内酯自调节因子。其中在内酯环上的两个取代彼此在立体结构上是相反的，且它们的绝对构型为2R和3R。这些因子在3方面有差异，即2、6位的烷基侧链为羰基或羟基，和羟基的方向(α，诱导物-2类型；或β，VB类型)。

已知存在5种VB(A、B、C、D和E)，它们差异是2位的烷基侧链。人工合成的衍生物也显示出活性。2位上的侧链结构影响到活性的强度。

放线菌自调节因子在结构上相对简单，因此它们的化学合成是容易的。也可以大量无菌培养各因子的生产菌，并从培养物分离和纯化各因子。

已确定各生产菌中存在A因子、VB和诱导物-2的各自受体蛋白质，并将它们分别称为ArpA[Onaka等人，J.Bacteriol.(1995)，177，6083-6092]、BarA[Okamoto等人，J.Biol.Chem.(1995)，270，12319-12326]和FarA[Waki等人，J.Bacteriol.(1997)，179，5131-5137]。它们分别由276、232和221个氨基酸构成。在各受体蛋白质中，发现在N端有一表明DNA结合能力的螺旋-转角-螺旋基序。

例如，分别用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2显示BarA的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列。

放线菌自调节因子和其受体蛋白质之间的特异性结合亲和力非常高，它们的解离常数(Kd值)，例如A因子/ArpA为0.7nM；VB-C7/BarA为1.1nM[Nihira，Hakko Kogaku Kaishi(1991)，第69卷，89-105]。

例如，已弄清楚存在着称为barB和barX的基因，看来它们是在一基因表达诱导系统的控制下，此系统在其3’下游和5’上游共同具有编码VB的受体蛋白质BarA的barA基因。虽然这些基因编码的蛋白质的功能还不清楚，但估计它们参与维吉霉素的生物合成或生产菌的维吉霉素抗性或其调节系统。

如体内试验结果[Kinoshita等人，J.Bacteriol.(1997)，179，6986-6993]所显示，BarA是结合于barA和barB基因启动子的一种阻遏子并关闭这些基因的转录，还显示VB是导致BarA与启动子分离的诱导物，从而启动这些基因的转录。另外如体外试验结果[Kinoshita等人，J.Bacteriol.(1999)，181，5075-5080]所示，在barA和barB基因上都鉴定到BarA特异性结合的靶序列(操纵子)，称其为BARE。它包括barA基因启动子上的BARE-3(26bp)、barB基因启动子上的BARE-1(29bp)和BARE-2(28bp)。例如SEQ ID NO：3显示了BARE-3的核苷酸序列。

由此看出放线菌自调节因子参与生产菌的基因表达诱导系统。这种基因表达诱导系统包括诱导物、阻遏子和操纵子。放线菌自调节因子、放线菌自调节因子的受体蛋白质、和此受体蛋白质的靶序列功能分别作为诱导物、阻遏子和操纵子。

本发明通过基因转移提供了一种植物，其特征是具有构成基因表达诱导系统的阻遏子和操纵子，还含有放线菌自调节因子作为诱导物。用于实施本发明的植物包括烟草、玉米、大豆、油菜、马铃薯、棉花等。

提供具有本文所述的阻遏子性状的植物的方法是将阻遏子基因转移到植物中来转化该植物。提供具有操纵子性状的植物的方法是将受操纵子控制的基因转移到植物中来转化该植物。

换言之，根据本发明，将两个基因：一为放线菌自调节因子的受体蛋白基因，另一为在该受体蛋白的靶序列控制下的基因，转移入植物对其进行转化。

为了将放线菌自调节因子受体蛋白(阻遏子)的基因转移入要转化的植物，可将此受体蛋白基因的编码区域连接于该植物启动子功能区的3’下游位点，并将其掺入合适的质粒载体中。本文所用的启动子优选植物启动子。

例如，用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(已知其在各种植物品种中表现出强启动子活性)能有效地在植物中导致强组成型基因表达。其它植物启动子包括(但不限制于)土壤杆菌衍生的冠瘿氨基酸(胭脂氨酸、章鱼氨酸、甘露氨酸)合成酶基因启动子。也可使用普通的植物启动子。

例如为了用土壤杆菌感染方法转移到植物中，将所需的基因掺入称为双载体的质粒载体中。这种双载体具有在大肠杆菌和土壤杆菌中起作用的复制系统、选择性标记基因，另外还有称为RB和LB的25bp核苷酸序列(它们是将基因整合入植物细胞核染色体所必需的)。当转移入植物细胞时，插在双载体RB和LB之间的基因即有效地整合入核染色体中。

例如，通过转变pBI121的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的编码区域[Jefferson等人，EMBO J.(1987)，6，3901-3907]，可以构建用于将放线菌自调节因子VB的受体蛋白质(阻遏子)BarA的基因，转移入植物对其进行转化的双载体，该双载体具有一种结构可使GUS基因的编码区域连接于CaMV35S启动子的3’下游，或将类似的双载体连接于barA基因的编码区域。例如，当制备barA基因编码区域片断(在两端都有限制酶BamHI和SacI的识别位点)时，通过限制酶BamHI和SacI识别位点的辅助，可以将双载体pBI121的GUS基因编码区域转变为barA基因编码区域。例如，通过用化学合成的寡-DNA：分别具有如下SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列作为5’-和3’-PCR引物和质粒pET-p26k[Okamoto等人，J.Biol.Chem.(1995)，270，12319-12326]，含有SEQ ID NO：1所示的barA基因作为模板，进行PCR可以得到分别在两端含有限制酶BamHI和SacI识别位点的barA基因编码区域片断。

为了将受放线菌自调节因子受体蛋白的靶序列(操纵子)控制的基因转移入植物对其进行转化，可将该靶序列安置在植物发挥作用的启动子中，将所需任意基因的编码区域连接于如此修饰的启动子的3’下游，并将产生的此结构掺入合适的质粒载体中。本文所用的启动子优选植物启动子。

将靶序列(操纵子)较佳地安置在启动子TATA盒的3’下游或5’上游位点附近，且重复性安置处理靶序列应有效。

例如，可以通过将BARE序列安置在双载体pBI121等的CaMV35S启动子中，构建用于将在VB受体蛋白质BarA的靶序列(操纵子)BARE控制下的GUS基因转移入植物对其进行转化的双载体。GUS基因所编码的酶可不难通过其活性来检测，且GUS基因在植物中没有类似物，因此该基因可广泛地用作在植物细胞中试验性检测基因表达活性的报道基因。例如当启动子在待安置的靶序列(操纵子)之间含有合适的限制酶识别位点时，可以通过合成在限制酶识别位点之间含有该核苷酸序列的双链DNA片断，未实现启动子中靶序列的安置。也可通过化学合成寡-DNA的定点诱变技术进行安置。例如为了在CaMV35S启动子TATA盒的3’下游附近或5’上游附近安置BARE-3(如SEQ ID NO：3所示)，可以合成含有SEQ ID NO：4或5分别所示的核苷酸序列的双链DNA片断。例如为了在CaMV35S启动子TATA盒的3’下游附近和5’上游附近安置BARE-3，可以合成含有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的双链DNA片断。例如为了在CaMV35S启动子TATA盒的3’下游附近或5’上游附近重复安置BARE-3，可以合成含有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的双链DNA片断。例如为了合成含有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的双链DNA片断，其中在CaMV 35S启动子的TATA盒的3’下游附近安置有2个BARE-3序列和该盒的5’上游附近安置有一个BARE-3序列，在试管中将化学合成的含有SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的寡-DNA(它们的3’端彼此互补超过16bp)混合，并使互补末端退火。在其中加入DNA聚合酶，用限制酶EcoRV和XbaI处理合成的双链DNA片断，然后克隆入合适的质粒载体中。

根据本发明，将上述方法所构建的质粒载体转移入待转化的植物中。

用土壤杆菌感染方法将基因转移入植物中，例如，首先通过用上述方法构建的双载体的转移，转化根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。对这种转化而言，电穿孔法等方法有效。其中要求所用的土壤杆菌品种具有将双载体的RB和LB之间的夹层区域整合入植物细胞核染色体中所需的功能。利用双载体中的选择性标记基因的功能不难选择出转化体土壤杆菌。用如此得到的转化体土壤杆菌(其中转入了含有所需基因的双载体)感染植物。为了此目的，用转化体土壤杆菌培养植物组织切片。然后诱导组织切片产生胼胝体。此时除选择性标记试剂外，同时存在杀死土壤杆菌的抗菌素(如羧苄青霉素)。可用作选择性标记基因的基因是赋予对抗菌素(如卡那霉素、潮霉素、博来霉素和氯霉素)抗性的基因。因此将得到的转化体胼胝体置于再生培养基上使植物再生得到转化体植物。也可从转化体植物的种子获得转化体植物品系。

也可用相同的方法得到培养的植物细胞转化体。但此时无需采取胼胝体形成、植物体再生或种子形成等步骤。

除土壤杆菌感染方法外，其它将基因转移入植物的方法也是可利用的，如将基因转移到原生质体中的电穿孔方法，采用基因枪的粒子轰击方法，和包括用毛细管直接将基因注射到细胞中的显微注射方法等。在实施本发明的基因表达诱导方法中，可以采用任何基因送递方法。

如此得到的转化体植物中，分别采用PCR和Western试验不难证实基因已整合入核染色体中和产生了基因产物。

通过转移放线菌自调节因子受体蛋白(阻遏子)的基因或在受体蛋白的靶序列(操纵子)控制下的基因，可以得到各个转化体植物，也可以用连续转化程序中选择性标记基因不同的质粒载体方法，或通过利用含本文两种基因的质粒载体方法，得到含有两种本文所述转移基因的转化体植物。

根据本发明，将放线菌自调节因子给予如此转化的植物，从而诱导受操纵子控制的基因在给予放线菌自调节因子部位的表达。

例如，通过向烟草植物和培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的靶序列之一)性状，它们与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为基因转移的诱导物)组成了基因表达诱导系统；和将VB给予如此转化的烟草植株和培养的烟草细胞；可能在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。例如，可以低达100nM浓度的VB，令人满意地诱导受BARE-3控制的基因的表达。

由于其相对低的分子量(约200)和它们的疏水结构，放线菌自调节因子易穿过细胞膜。所以它们非常适合用作诱导物被迅速吸收到植物中。

放线菌自调节因子对植物没有毒性。例如，VB显示即使在高达10μM的浓度对植物也没有毒性。

根据本发明，有可能产生有用的转化体植物，并且通过对置于操纵子控制下的基因的选择，可有效地利用此转化体植物。例如，将能对植物提供繁殖能力的基因置于操纵子的控制下，通过将放线菌自调节因子给予该植物，可以控制所述转化体植物的繁殖力。这种植物可以用作转化的宿主，从而防止转化体植物扩散到自然环境。

附图简述

图1显示了Western印迹试验分析的结果，表明在培养的实施例3转化的(提供了作为基因转移诱导物的含放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB，构成基因表达诱导系统的阻遏子BarA(VB的受体蛋白)特性)烟草细胞中，是否堆积了BarA蛋白质。

(符号说明)

M：分子量标记

R：10ng用重组大肠杆菌菌株产生并纯化的BarA蛋白质

30、21、27：得到的培养的烟草细胞转化体克隆的身份编号

B：培养的烟草细胞BY2

T：得到的暂时转化培养的烟草细胞原生质体(实施例5)

箭头：表明BarA蛋白质条带的位置

图2显示了当将VB给予培养的烟草细胞转化体时，实施例4通过给予含放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为基因转移的诱导物)构成基因表达诱导系统的阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BRAE-3(BarA的一种靶序列)，而转化培养的烟草细胞中，是否诱导了受BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

(符号说明)

GUS特异性活性(图表的纵轴)：用于评估GUS基因表达的活性(单位：[nmol4MU/分钟/mg蛋白质])

30-16、30-17、30-23、30-35、21-5、21-21、21-22、27-1、27-9：表明得到的培养的烟草细胞转化体克隆的身份编号

OFF(VB-)：未加入VB

ON(VB+)：加入VB(最终VB-C₆浓度为：1μM)

图3显示了试验1的结果，即当将VB给予培养的烟草细胞时，实施例5通过给予含放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为基因转移的诱导物)构成基因表达诱导系统的阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BRAE-3(BarA的一种靶序列)，而转化培养的烟草细胞中，是否诱导了受BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

(符号说明)

诱导速率(图表的纵轴)：当添加VB(最终VB-C₆浓度：1μM，ON)与未添加VB(OFF)相比时，因VB引起的基因表达诱导活性。以GUS基因表达活性的比例表示(GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))。

35S：当采用不受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

35SD：当用质粒pCaM35SD-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

35SUDD：当用质粒pCaM35SUDD-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

barA-：当barA基因不用作瞬时转化时

barA+：当barA基因用于瞬时转化时

图4显示了试验2的结果，即当将VB给予培养的烟草细胞时，实施例6通过给予含放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为基因转移的诱导物)构成基因表达诱导系统的阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BRAE-3(BarA的一种靶序列)，而转化培养的烟草细胞中，是否诱导了受BARE-3控制下的GUS报道基因的表达。

(符号说明)

诱导速率(图表的纵轴)：当添加VB(最终VB-C₆浓度：1μM，ON)与未添加VB(OFF)相比时，因VB引起的基因表达诱导活性，以GUS基因表达活性的比例表示(GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))

35S：当采用不受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

35SU：当采用质粒pCaM35SU-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

35SD：当采用质粒pCaM35SD-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

35SUD：当采用质粒pCaM35SUD-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

35SUDD：当用质粒pCaM35SUDD-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

图5显示了测试的结果，即当将VB给予培养的烟草细胞时，实施例7通过给予含放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为基因转化的诱导物)构成基因表达诱导系统的阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BRAE-3(BarA的一种靶序列)，而转化培养的烟草细胞中，是否诱导了受BARE-3控制下的GUS报道基因的表达。

(符号说明)

诱导速率(图表的纵轴)：当添加VB(最终VB-C₆浓度：1μM，ON)与未添加VB(OFF)相比时，因VB引起的基因表达诱导活性，以GUS基因表达活性的比例表示(GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))

35SD：当用质粒pCaM35SD-gus作为受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时

0nM：未加入VB(OFF)

10nM：加入VB(ON，VB-C₆终浓度为10nM)

100nM：加入VB(ON，VB-C₆终浓度为100nM)

1000nM：加入VB(ON，VB-C₆终浓度为1000nM＝1μM)

图6显示了测试的结果，即当将VB给予培养的烟草细胞时，实施例10通过给予含放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为基因转化的诱导物)构成基因表达诱导系统的阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BRAE-3(BarA的一种靶序列)，而转化培养的烟草细胞中，是否诱导了受BARE-3控制下的GUS报道基因的表达。

(符号说明)

OFF(VB-)：未加入VB

ON(VB+)：加入VB(VB-C₆终浓度为1μM)

本发明最佳实施方式

以下实施例进一步详细说明了本发明。但这些实施例对本发明的范围没有任何限制。

实施例1

通过基因转移构建了一质粒载体，向某植物提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)与放线菌弗吉尼亚链霉菌的自调节因子弗吉尼亚丁内酯(VB)(作为诱导物)构成的基因表达诱导系统，即将阻遏子barA基因转移入该植物对其进行转化。

为此，用PCR从含有SEQ ID NO：1所示的barA基因的质粒pET-p26k[Okamoto等人，J.Biol.Chem.(1995)，270，12319-12326]克隆了barA基因编码区域。将化学合成的含有其中导入了限制酶BamHI和SacI识别位点的SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的寡-DAN，分别作为PCR的5’-和3’-引物。用限制酶BamHI和SacI处理PCR扩增的片断，然后插入到质粒载体pBuluescriptII SK(-)[GenBank登录号X52330]中，在多克隆区域中限制酶BamHI识别位点和SacI识别位点之间克隆。通过测序证实正确克隆了barA基因编码区域。

将双载体pBI121[Jefferson等人，EMBO J.(1987)，6，3901-3907]，含有β-葡糖醛酸酶(GUS)基因编码区域连接于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子3’下游位点的一个结构且含有作为选择性标记基因的卡那霉素抗性基因的结构，用限制酶BamHI和SacI处理来除去含有GUS基因编码区的限制酶BamHI-SacI片断。将残留的载体片断与含有barA基因编码区域的限制酶BamHI-SacI片断(用限制酶BamHI和SacI处理从质粒pbarA切下的)连接(双载体pBICaMV35S-barA)。

还构建了将阻遏子barA基因转移入植物对其进行瞬时转化的质粒载体。所用的起始物是质粒NtADHp-GUS[Nagaya等人，J.Biosci.Bioeng.(2000)，89，231-235]，其具有的结构使GUS基因编码区域连接于烟草酒精脱氢酶(NtADH)启动子的3’下游位点。已知该质粒的NtADH启动子在烟草中表现出极强的启动子活性。

用限制酶BamHI和SacI处理除去了质粒NtADHp-GUS中的含有GUS基因编码区域的限制酶BamHI-SacI片断。将残留的载体片断连接于含有barA基因编码区域的限制酶BamHI-SacI片断，此片断是用限制酶BamHI和SacI处理从质粒pbarA切下的(质粒pNtADH-barA)。

用限制酶BamHI和SacI处理从质粒NtADHp-GUS中除去含有GUS基因编码区域的限制酶BamHI-SacI片断。将残留的载体片断做成钝端，然后连接(质粒pNtADHΔBS)。

将大肠杆菌DH5α菌株[supE44，ΔlacU169(φ80，lacZΔM15)、hsdR17、recA1、ednA1、gyrA96、thi-1、relA1]用作重组DNA实验的宿主。实验程序应遵照标准程序[Molecular Cloning，Maniatis等人，1982，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.]。

将KOD NDA聚合酶[Toyobo Co.，Ltd]用于PCR，所用的条件见相关手册所述。

用测序仪[P.E.Biosystems Japan Co.，Ltd.ABI PRISM310 Genetic Analyzer]进行测序。

实施例2

通过基因转移构建了一质粒载体，向某植物提供操纵子BARE-3(VB的受体蛋白BarA的一个靶序列)与放线菌弗吉尼亚链霉菌的自调节因子弗吉尼亚丁内酯(VB)(作为诱导物)构成的基因表达诱导系统，即将受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因转移入该植物对其进行转化。

在CaMV 35S启动子TATA盒的3’下游附近安置2个BARE-3序列，和在5’上游位点附近安置1个BARE-3序列。

为此，合成了含有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的双链DNA片断，即从含有CaMV 35S启动子的TATA盒(5’-TATATAA-3’)的限制酶EcoRV-XbaI片断(871bp CaMV 35S启动子的第726核苷酸到第871核苷酸的片断)衍生此片断，方法是用BARE-3(26bp，如SEQ ID NO：3所示)取代TATA盒5’上游第2核苷酸到第27核苷酸的26bp和TATA盒3’下游第2核苷酸到第27核苷酸间的26bp，并将BARE-3(26bp)插在TATA盒3’下游第27核苷酸和28核苷酸之间。将10μl TE溶液与两种化学合成的分别含有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列且彼此在3’末端互补超过16bp的寡-DAN(各100皮摩尔)混合，并将此混合物在95℃保持3分钟，然后冷却至室温。在2μl上述反应混合物中加入大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片断，总体积达到40μl，将如此得到的反应混合物在37℃保持30分钟，然后用苯酚/氯仿处理使酶失活，将反应混合物的乙醇沉淀溶解于5μl TE溶液中。用限制酶EcoRV和XbaI处理2μl该溶液，将如此得到的限制酶EcoRV-XbaI片断插入到质粒载体pBluescriptII SK(-)中，从而在多个克隆区域(质粒pBARE3UDD)中的限制酶EcoRV识别位点和XbaI识别位点之间克隆。通过测序证明BARE-3的正确位置。

为了构建在TATA盒的3’下游附近有2个BARE-3序列且在5’上游位点附近有1个BARE-3序列结构的CaMV 35S启动子，用限制酶HindIII和EcoRV处理质粒pBI221[Jefferson等人，EMBO J(1987)，6，3901-3907]，其结构为GUS基因编码区域连接于CaMV 35S启动子的3’下游位点，然后将如此切下的含有CaMV 35S启动子第1核苷酸到第761核苷酸的片断插入到质粒pBARE3UDD的限制酶HindIII识别位点和EcoRV识别位点之间(质粒pCaMV35SUDD)。

通过用限制酶HindIII和XbaI处理，从含有CaMV 35S启动子的限制酶HindIII-XbaI片断衍生双载体pBI101HmB[Nakayama等人，Plant Physiol.(200)，122，1239-1247]，它的结构为GUS基因编码区域连接于CaMV 35S启动子的3’下游且还含有作为选择性标记基因的潮霉素抗性基因。将残留的载体片断与含有CaMV 35S启动子的限制酶HindIII-XbaI片断连接，后者的结构为用限制酶HindIII和XbaI处理从质粒pCaMV35SUDD切下后在TATA盒的3’下游位点附近有2个BARE-3序列，在5’上游位点附近有一个BARE-3序列(双载体pBICaMV35SUDD-gus)。

还构建了用于将受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因转移入植物中来瞬时转化该植物的质粒载体。

将2个BARE-3序列安置在CaMV 35S启动子TATA盒的3’下游位点附近，1个BARE-3序列安置在其5’上游位点的附近。

用限制酶HindIII和XbaI处理质粒pBI221除去含有CaMV 35S启动子的限制酶HindIII-XbaI片断。将残留的载体片断连接于含有CaMV 35S启动子的限制酶HindIII-XbaI片断，其结构为用限制酶HindIII和XbaI处理从质粒pCaM35SUDD切下后在TATA盒的3’下游位点附近有2个BARE-3序列，在5’上游位点附近有1个BARE-3序列[质粒pCaMV35SUDD-gus]。

还用相同的方式构建了质粒载体，含有结构为SEQ ID NO：4所示的CaMV35S启动子和在TAT盒的3’下游位点附近有1个BARE-3序列(结构如SEQ IDNO：5所示)和在TATA盒的5’上游位点附近有1个BARE-3序列(结构如SEQ IDNO：6所示)和在TATA盒的3’下游位点附近和5’上游位点附近各含有1个BARE-3序列(分别为质粒pCaMV35SD-gus、pCaMV35SU-gus和pCaMV35SUD-gus)。

实施例3

通过基因转移向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)性状，该阻遏子与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了一基因表达诱导系统。换而言之，将阻遏子barA基因转移入培养的烟草细胞对其进行转化。

采用了土壤杆菌感染方法作基因转移。首先通过barA基因转移来转化土壤杆菌，然后用得到的转化体土壤杆菌感染培养的烟草细胞。

为了将基因转移入土壤杆菌中，使用了电穿孔方法。将根癌土壤杆菌EHA101菌株[Elizanbeth等人，J.Bacteriol.(1986)，168，1291-1301]的感受态细胞(50μl)与200ng barA基因(实施例1，双载体pBICaMV35S-barA]混合，然后将此混合物转移到基因脉冲仪[Nippon Bio-Rad Laboratories]的小杯中[电极到电极距离2mm]。用2.5KV电压、25μFD静电容量和400Ω电阻在小杯电极间产生脉冲。脉冲产生的时间常数约为10毫秒。在含有100mg/l卡那霉素的LB培养基琼脂平板上涂布脉冲后小杯中的所有内容物，并将此平板静置在30℃的暗处。两天后，30℃暗处，用5ml含有100mg/l卡那霉素的LB培养基振荡培养该平板上出现的菌落2天。将此培养物用作转化体土壤杆菌培养物。

然后用得到的转化体土壤杆菌感染培养的烟草BY2细胞(RIKEN GeneBank Plant Cell Bank RPC号1)[Nagata等人，Methods Enzymol.(1987)，148，34-39]。以1/50的稀释率、以1周间隔振荡培养方式，用改良的LS培养基[Nagata等人，Methods Enzymol.(1987)，148，34-39]在27℃暗处传代培养培养的烟草BY2细胞，将处于对数生长期(最后一次传代后3-5天)的细胞用于土壤杆菌感染。将5ml含有烟草BY2细胞的培养物与100μl转化体土壤杆菌培养物混合，将此混合物转移到培养皿上，将此培养皿静置在25℃暗处。2天后，离心除去培养皿上的土壤杆菌，将残留的烟草BY2细胞悬浮于2-3ml改良的LB培养液中，将此悬浮液涂布在含有100mg/l卡那霉素和250mg/l羧苄青霉素的改良LS培养基-凝胶(gellan)树胶平板上，让此平板静置在25℃暗处。2-3周后，分离得到平板上形成的胼胝体，并作为培养的烟草细胞转化体克隆在存在卡那霉素和羧苄青霉素下传代培养。

用Western印迹方法分析如此得到的培养的烟草细胞转化体中是否积聚了阻遏子BarA蛋白。

将培养的烟草细胞转化体克隆的细胞悬浮于合适的细胞抽提缓冲液(如0.1M KPO₄、2mM EDTA、5％甘油、2mM DTT，pH7.8)中，用超声波发生器[KKTomy Seiko’s Handy Sonic UR-20P]裂解。高速离心含有破裂细胞的液体，将得到的上清液用作细胞提取物。用Bradford方法[Bradford，Anal.Biochem.(1976)，72，248-254]测定细胞提取物中蛋白质的浓度(mg/ml)。从SDS-PAGE(12.5％聚丙烯酰胺)凝胶中分离出相当于每个泳道20μg蛋白质的细胞提取物，然后转移到PVDF膜[Nippon Bio-Rad Laboratories]上，与抗体反应。将兔抗BarA抗体[Nakano等人，J.Bacteriol.(1998)，180，3317-3322]用作第一抗体，将碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体作为第二抗体。各反应和洗涤程序都在3％脱脂乳中进行的。最后，将膜浸泡在碱性磷酸酶反应混合物(0.017％5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸对-甲苯胺盐、1ppm硝基篮四唑、100mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mMMgCl₂、pH9.5)中，检测膜上显色的条带。用大肠杆菌转化体产生的BarA蛋白质(10ng)并经纯化作为对照样品。

结果，在一些培养的烟草细胞转化体克隆中证受有BarA蛋白质的积聚。

实施例4

通过基因转移向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一个靶序列)性状，这两者与与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了一基因表达诱导系统。换而言之，将两种基因，阻遏子barA基因和受操纵子BARE-2控制的GUS报道基因，转移入培养的烟草细胞对其进行转化。

进一步将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，双载体pBICaMV35SUDD-gus)转移入两个表现为BarA蛋白质积聚水平较高的克隆中(图1所示的No.30和No.21)和一个表现为BarA蛋白质只有小量积聚的克隆中(图1所示的No.27)，这是通过对barA基因(实施例1，双载体pBICaMV35S-barA)转移入培养的烟草BY2细胞得到的培养的烟草细胞转化体克隆进行Western分析作出的判断。与实施例3相同，采用土壤杆菌感染方法来转移基因。选出培养的烟草细胞转化体克隆，并用含有20mg/l潮霉素、100mg/l卡那霉素和250mg/l羧苄青霉素的改良LS培养基传代培养。

将诱导物VB给予如此获得的培养的烟草细胞转化体测定了是否诱导了受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

以1/25的稀释率、以1周间隔振荡培养的方式，用改良的LS培养基在27℃暗处传代培养该烟草细胞转化体。传代时，加入诱导物VB，将从培养了4天的细胞制备的各细胞的提取物中的GUS基因表达活性(以单位重量蛋白质的GUS活性评估，称为GUS的比活性)与未加入VB的相应细胞提取物比较。添加VB时，将VB-C₆原液[Nihira，Hakko Kogaku Kaishi(1991)，第69卷，89-105页](10mg/ml甲醇溶液)用水以1/50比例稀释并将1/1000体积的稀释液加到培养基中(VB-C₆终浓度约为1μM)。离心除去上清液，收集1ml细胞悬液中的细胞，并将它们悬浮在500μl细胞提取缓冲液中(50mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、10mMEDTA，10mM 2-巯基乙醇，pH7)，并用超声波发生器[KK Tomy Seiko’s HandySonic UR-20P]裂解。高速离心含有裂解细胞的液体，将得到的上清液用作细胞提取物。用Bradford方法测定细胞提取物中蛋白质的浓度(mg/ml)。37℃在细胞提取物中加入1mM作为GUS底物的4-甲基伞形-β-D-葡糖醛酸(4MUG)后，根据单位时间酶促反应形成的荧光色素4-甲基伞形酮(4MU)的量，评估细胞提取物的GUS活性[Jefferson等人，EMBO J.(1987)，6，3901-3907]。在365nm波长激发，测定455nm波长的荧光来定量测定反应产物4MU，用标准品4MU产生的校准曲线计算GUS活性(nmol/4MU/min/ml)。将在相同实验条件下进行的3次独立实验所得到的3个GUS比活性值的平均值[nmol 4MU/min/mg蛋白质]作为在上述实验条件下GUS基因的表达活性。

结果，在许多培养的烟草细胞转化体克隆中，加入VB-C₆(ON(VB+))时的GUS基因表达活性比相同的未加VB-C₆的(OFF(VB-))高，因此可以观察到VB诱导的GUS基因表达(图2)。将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，双载体pBICaMV35SUDD-gus)进一步转移入培养的烟草细胞转化体克隆中，得到的培养的烟草细胞转化体克隆(实施例3，图1中的No.30和No.21)表现出相对高水平的BarA蛋白质积聚，如同将barA基因(实施例1，双载体pBICaMV35S-barA)转移入培养的烟草BY2细胞所得到的那样，一些克隆[克隆No.30衍生的No.30-16、30-17、30-23、30-35和克隆No.21衍生的No.21-5、21-21和21-22]显示添加VB-C₆(ON)的GUS基因表达活性与未添加VB-C₆(OFF)的比例(GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))，即用VB引起的基因表达诱导活性(诱导率)至多为30(诱导率≤30)。将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，双载体pBICaMV35SUDD-gus)进一步转移入培养的烟草细胞转化体克隆中，得到的培养的烟草细胞转化体克隆(实施例3，图1中的No.27)表现只有少量的BarA蛋白质积聚，如同将barA基因(实施例1，双载体pBICaMV35S-barA)转移入培养的烟草BY2细胞所得到的那样，一些克隆[No.27-1和27-9]显示因VB引起的基因表达诱导活性小于2(诱导率＜2)。因此，随着在培养的烟草细胞转化体中积聚的BarA蛋白质量的增加，VB引起的基因表达诱导的活性也增加。

用这种方法，即通过向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一个靶序列)，它们与放线菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统，并将VB给予如此获得的培养的烟草细胞转化体，可以在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。

实施例5

通过基因转移向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一种靶序列)性状，它们与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统。换而言之，将两种基因：阻遏子barA基因和受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因，转移入培养的烟草细胞对其进行转化。

为了转移基因，使用了电穿孔方法。因此，从培养的烟草细胞制备了原生质体。以1/50的稀释比率、以1周间隔振荡培养的方式，用改良的LS培养基在27℃暗处传代培养此培养的烟草BY2细胞，将处于对数生长期(最后一次传代后的3-5天)的细胞悬浮于酶溶液(0.1％果胶溶酶Y23[KK Yakult]、1％纤维素酶“Onozuka RS[Kikkoman KK]、0.4M甘露醇，pH5.5)中。让酶促反应在30℃进行2-3小时，在此过程中以15分钟间隔用移液管分散细胞。在显微镜下证明球形细胞基本上完全分散后，将这种状态的细胞用作基因转移的原生质体。用0.4M甘露醇洗涤这些原生质体，然后悬浮于电穿孔缓冲液(5mM 2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)、70mM KCl、0.3M甘露醇)中，使细胞密度为3×10⁶/ml。将用于监测基因转移效率的barA基因(实施例1，质粒pNtADH-barA；50μg)、受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，质粒pCaMV35SUDD-gus或pCaMV35SD-gus；5μg)、和荧光素酶(LUC)基因(质粒pCaMV35S-luc[Millar等人，Plant Mol.Biol.Rep.(1992)，10，324-337]；1μg)与500μl此原生质体悬液混合，将此混合物转移到基因脉冲仪[Nippon Bio-Rad Laboratories]的小杯[电极到电极距离2mm]中。用200V电压、250μF静电容量和400Ω电阻在小杯电极间产生脉冲。脉冲产生的时间常数约为15-20毫秒。将这些原生质体迅速地从脉冲后小杯转移到培养皿(6cm直径)中，加入4.5ml培养基(改良的LS培养基，10g/l蔗糖，0.4M甘露醇)。

将诱导物VB给予如此得到的瞬时转化的培养的烟草细胞原生质体，来检验是否诱导了受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

将诱导物VB加到培养皿中瞬时转化的培养的烟草细胞原生质体(VB-C₆的终浓度为1μM)中，让此培养皿静置在25℃的暗处20小时，然后由此原生质体制备细胞提取物，将其GUS基因表达活性(以GUS活性对LUC活性的比例评估，称为GUS/LUC值)与未添加VB的相比较。按与实施例4相同的方法进行VB的添加。从培养皿回收原生质体，离心除去上清液，悬浮于500μl细胞提取用的缓冲液(0.1M KPO₄、2mM EDTA、5％甘油、2mM DTT，pH7.8)，用超声波发生器[KK Tomy Seiko Handy Sonic UR-20]裂解细胞。高速离心含有破裂细胞的液体，将得到的上清液用作细胞提取物。用与实施例4所述相同的方法测定细胞提取物的GUS活性(nmol 4MU/min/ml)。当100μl含有470μM作为LUC底物的荧光素[Toyo Ink Manufacturing’s Pickagene]的细胞提取缓冲液与20μl细胞提取物室温混合后，迅速用光度计[Berthold Institut(Germany)Lumat LB9501]测定10秒内发出的光量来评估细胞提取物的LUC活性。用标准品LUC绘制的校准曲线计算LUC活性(pmol LUC/ml)。将在相同实验条件下用同一批原生质体进行的3次独立实验所得到的3个GUS/LUC值的平均值[nmol 4MU/min/pmolLUC]作为在上述实验条件下GUS基因的表达活性。

结果，当将质粒pCaMV35SUDD-gus或pCaMV35SD-gus用作受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时，加有VB-C₆(ON)的比未加VB-C₆(OFF)的GUS基因表达活性高，因此可以观察到GUS基因的表达受VB的诱导(图3)。VB引起的基因表达诱导活性(诱导率GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))分别为诱导率5(图3，barA+，35SUDD)和诱导率2(图3，barA+，35SD)。因此，VB引起的基因表达诱导活性随着BARE-3序列数量的增加而增加。另一方面，当barA基因不用于瞬时转化时(不含有barA基因的对照质粒pNtADHΔBS用于瞬时转化)(图3，barA-)和当不受BARE-3控制的GUS报道基因(使用不含BARE-3的对照质粒pBI221)用于瞬时转化时(图3，35S)，都没有观察到由VB引起的基因表达诱导活性(诱导率1)。

用Western印迹方法(与实施例3相同)分析结果，证明在得到的瞬时转化的培养的烟草细胞原生质体中有阻遏子BarA蛋白质积聚。

由这种方法，通过基因转化向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一种靶序列)性状，它们与作为诱导物的放线菌自调节因子VB构成了基因表达诱导系统，并将VB给予获得的瞬时转化的培养的烟草细胞，可以在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。

实施例6

通过基因转移向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一个靶序列)性状，它们与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统。换而言之，将阻遏子barA基因转移入培养的烟草细胞对其进行转化，并将受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因也转移入如此得到的培养的烟草细胞转化体克隆中对其进行瞬时转化。

进一步将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，质粒pBICaMV35SUDD-gus、pCaMV35SD-gus、pCaMV35SU-gus或pCaMV35SUD-gus)转移到表现为BarA蛋白质积聚水平高的培养的烟草细胞转化体的克隆中(实施例3，图1所示的No.21)，这是将barA基因(实施例1，双载体pBICaMV35S-barA)转移入培养的烟草BY2细胞培养得到的克隆，以瞬时转化该克隆。用与实施例5相同的方法将受BARE-3控制的GUS报道基因进行转移。为了监测基因的转移效果，还将LUC基因(质粒pCaMV35S-luc)用于瞬时转化。

将诱导物VB给予如此得到的瞬时转化的培养的烟草细胞原生质体来检测是否诱导了受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

与实施例5相同，将诱导物VB加到(VB-C₆的终浓度：1μM)培养皿中的瞬时转化的培养的烟草细胞原生质体培养物中，让此培养物静置在25℃暗处20小时，然后制备此原生质体的细胞提取物，将其GUS基因表达活性(以GUS活性对LUC活性的比例表达，即GUS/LUC值)与未添加VB得到的相比。

结果，当将各质粒pCaMV35SUDD-gus、pCaMV35SD-gus、pCaMV35SU-gus和pCaMV35SUS-gus用作受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时，加有VB-C₆(ON)的比未加VB-C₆(OFF)的GUS基因表达活性高，因此可以观察到GUS基因表达受到VB的诱导(图4)。VB引起的基因表达诱导活性(诱导率GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))分别为诱导率22(图4，35SUDD)、诱导率4(图4，35SD)、诱导率2(图4，35SU)和诱导率13(图4，35SUD)。因此，VB引起的基因表达诱导活性随着BARE-3序列数量的增加而增加。将BARE-3置于TATA盒3’下游位点附近比将其置于TATA盒的5’上游位点附近，导致VB引起的基因表达诱导活性更高。另一方面，当GUS报道基因不受BARE-3控制(不含BARE-3的对照质粒pBI221)用于瞬时转化时(图4，35S)，未观察到VB引起的基因表达的诱导活性(诱导率1)。

以这种方法，通过基因转移向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一种靶序列)性状，它们与作为诱导物的放线菌自调节因子VB构成了基因表达诱导系统，并将VB给予如此获得的瞬时转化的培养的烟草细胞，可以在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。

实施例7

通过基因转化向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一个靶序列)性状，它们与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统，而且通过将低浓度的诱导物VB给予如此得到的瞬时转化的培养的烟草细胞，检测是否诱导了受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

与实施例6相同，进一步将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，质粒pCaMV35 SD-gus)转移入表现为BarA蛋白质积聚水平高的培养的烟草细胞转化体的克隆(实施例3，图1所示的No.21)中，这是将barA基因(实施例1，双载体pBICaMV35S-barA)转移入培养的烟草BY2细胞培养得到的，以瞬时转化该克隆。将诱导物VB加到如此得到的瞬时转化的培养的烟草细胞原生质体培养物(VB-C₆终浓度：1μM，100nM和10nM)中，将由这些原生质体制备的细胞提取物静置在25℃暗处20小时，然后将其GUS基因表达活性(以GUS活性对LUC活性的比例评价，即GUS/LUC值)与未添加VB得到的相比。

结果，当将质粒pCaMV35SD-gus用作受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时，加有VB-C₆(ON)(各为1μM、100nM和10nM浓度)的比未加VB-C₆(OFF)的GUS基因表达活性更高，因此可以观察到GUS基因表达受到VB的诱导(图5)。VB引起的基因表达诱导活性(诱导率GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))分别为诱导率5、诱导率4和诱导率1.4。因此，在VB-C₆浓度不小于100nM时，可以观察到令人满意程度的VB引起的基因表达诱导活性，虽然它随着VB浓度的减少而递减。

以这种方法，通过基因转移向培养的烟草细胞提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一种靶序列)性状，它们与作为诱导物的放线菌自调节因子VB构成了基因表达诱导系统，并将浓度低至100nM的VB给予如此获得的瞬时转化的培养的烟草细胞，可以在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。

实施例8

通过基因转移向烟草植株提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)性状，该阻遏子与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统。换而言之，将阻遏子barA基因转移入烟草植株对其进行转化。

采用了土壤杆菌感染方法进行基因转移。首先通过barA基因的转移来转化土壤杆菌，然后用得到的转化体土壤杆菌感染烟草植株。

通过叶片打孔法，用与实施例3所用相同的转化体土壤杆菌感染烟草(Nicotiana tabacum L.)。从在凝胶-树脂罐中MS培养基(Murashige等人，Physiol.Platnarum(1962)，15，473-498)上生长的无菌烟草植株的一些叶片上切下方形(5-10mm)或圆形叶子切片，浸泡在培养皿中的无菌水里，将几毫升转化体土壤杆菌培养物与其混合。取出这些叶子切片，将叶面朝下置于MS胼胝体培养基(含有2mg/lα-萘乙酸和0.2mg/l 6-苄基腺嘌呤)-凝胶树脂平板上。从该平板回收叶子切片，让它们在生物气候室(25℃，16小时光照，8小时黑暗)静置2天，用无菌水冲洗几次，并叶面朝下置于含有100mg/l卡那霉素和250mg/l羧苄青霉素的MS胼胝体培养基-凝胶树胶平板上。在生物气候室静置1到2周后，将这些叶子切片转移并重新放置在含有卡那霉素和氨苄青霉素的MS幼芽(shooting)培养基(含有0.02mg/l α-萘乙酸和1mg/l 6-苄基腺嘌呤)-凝胶树胶平板上。在各叶子切片上证明形成了胼胝体。让该平板在生物气候室中静置，直到从叶子切片形成幼芽。切下形成的幼芽，种植在含有卡那霉素和氨苄青霉素的MS培养基-凝胶树脂罐中。挑选出在罐中能生根站立的个体，将它们作为转化体烟草植株在含有20mg/l潮霉素、100mg/l卡那霉素和250mg/l氨苄青霉素的MS培养基-凝胶树胶罐中维持传代培养。

实施例9

通过基因转移向烟草植物株提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一个靶序列)性状，它们与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统。换而言之，将阻遏子barA基因转移入烟草植株对其进行转化，并将受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因也转移入如此得到的转化体烟草植株中对其进行瞬时转化。

进一步将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，质粒pCaMV35SD-gus)转移入转化体烟草植株中(实施例8)，此转化体烟草植株是通过将barA基因(实施例1，双载体pBICaVM35S-barA)转移入烟草(Nicotiana tabacum L.)得到的，对其进行瞬时转化。

采用了电穿孔法进行基因转移。因此，处理烟草植株将其转变成原生质体。从该烟草植株的几张叶片上切下方形(5-10mm)叶子切片，并悬浮于酶溶液(0.1％果胶溶酶Y23[KK Yakult]、1％纤维素酶“Onozuka”RS[Kikkoman KK]、0.4M甘露醇、pH5.5)中。让此酶促反应在室温中进行数小时。当在叶片表面观察到剥离层时，用孔径为70μm的筛网过滤此酶溶液，离心滤液。将沉淀下的绿色细胞块作为基因转移用的原生质体。用0.4M甘露醇洗涤此原生质体，然后悬浮于电穿孔用的缓冲液(5mM MES、70mM KCl、0.3M甘露醇)中，细胞密度为6×10⁶/ml。将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，质粒pCaMV35SD-gus；10μg)和监测基因转移效率的LUC基因(质粒pCaMV35S-luc；1μg)与500μl原生质体悬浮液混合，将此混合液转移到转移到基因脉冲仪[Nippon Bio-RadLaboratories]的小杯中[电极到电极距离4mm]。用300V电压、250μF静电容量和400Ω电阻在小杯电极间产生脉冲。脉冲产生的时间常数约为16毫秒。迅速将两份等量的原生质体从脉冲后的小杯移至两个培养皿(6cm直径)中，在各培养皿中加入4.75ml培养基(改良的LS培养基，10g/l蔗糖，0.4M甘露醇)。

在如此得到的瞬时转化的烟草原生质体中加入诱导物VB，以检测是否诱导了受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

在一个培养皿中，将诱导物VB(VB-C₆的终浓度为1μM)加到瞬时转化的烟草原生质体培养物中，让此培养皿静置在25℃暗处22小时，然后制备此原生质体的细胞提取物，并将其GUS基因表达活性(以GUS活性对LUC活性的比例评估，称为GUS/LUC值)与未添加VB的相比较。按与实施例4相同的方法进行VB的添加。从各培养皿回收原生质体，离心除去上清液，悬浮于500μl细胞提取用的缓冲液(0.1M KPO₄、2mM EDTA、5％甘油、2mM DTT，pH7.8)中，用超声波发生器[KK Tomy Seiko Handy Sonic UR-20]破裂细胞。高速离心含有破裂的细胞的液体，将得到的上清液用作细胞提取物。用与实施例4和实施例5所述相同的方法分别测定细胞提取物的GUS活性和LUC活性。在相同实验条件下进行了两次独立的实验。

结果，当将质粒pCaMV35SD-gus用作受BARE-3控制的GUS报道基因进行瞬时转化时，加有VB-C₆(ON)的比未加VB-C₆(OFF)的GUS基因表达活性更高，因此可以观察到GUS基因的表达受到VB的诱导。VB引起的基因表达诱导活性(诱导率GUS基因表达活性(ON)/GUS基因表达活性(OFF))在各试验中为诱导率2。

以这种方法，通过基因转移向培养的烟草植株提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一种靶序列)性状，它们与作为诱导物的放线菌自调节因子VB构成了基因表达诱导系统，并将VB给予如此得到的瞬时转化的烟草，可以在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。

实施例10

通过基因转移向培养的烟草植株提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一个靶序列)性状，它们与放线菌弗吉尼亚链霉菌自调节因子VB(作为诱导物)构成了基因表达诱导系统。换而言之，将两种基因：阻遏子barA基因和受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因，转化入烟草植株对其进行转化。

进一步将受BARE-3控制的GUS报道基因(实施例2，双载体pBICaMV35SUDD-gus)转移入转化体烟草植株(实施例8)，此转化体烟草植株是通过将barA基因(实施例1，双载体pBICaVM35S-barA)转移入烟草(Nicotianatabacum L.)得到的。与实施例8相同，采用了土壤杆菌感染方法进行基因转移。在含有20mg/l潮霉素、100mg/l卡那霉素和250mg/l氨苄青霉素的MS培养基上选择转化体烟草植株，并通过传代培养维持。

给予如此得到的转化体烟草植株诱导物VB，以检测是否诱导了受操纵子BARE-3控制的GUS报道基因的表达。

通过在补充有VB(VB-C₆的终浓度为1μM)的MS培养基罐中再种植，传代培养了该转化体烟草植株的侧芽，测试了在生物气候室中生长约3周的转化体烟草植株叶片的GUS基因表达活性(以在GUS活性染色中所观察到的染色程度来评估)，与未加入VB所得到的活性相比。在GUS活性染色中，将切下的叶片浸泡在含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸环己基铵盐(X-gluc)(作为GUS的底物)的细胞提取用缓冲液中，让此反应物37℃反应过夜。观察到在叶片中形成了蓝色色素，这是GUS酶促反应的结果。

结果，加有VB-C₆(ON(VB+))转化体烟草植株中的GUS基因表达活性比相同的未加VB-C₆(OFF(VB-))的高，因此可以观察到GUS基因的表达受到VB的诱导(图6)。

以这种方法，通过基因转移向培养的烟草植株提供阻遏子BarA(VB的受体蛋白)和操纵子BARE-3(BarA的一种靶序列)性状，它们与作为诱导物的放线菌自调节因子VB构成了基因表达诱导系统，并将VB给予如此获得的转化体烟草植株，可以在给予VB的部位诱导受BARE-3控制的基因的表达。

工业应用

本发明提供的方法，包括向植物提供阻遏子和操纵子性状，它们与作为诱导物的放线菌自调节因子构成了基因表达诱导系统，并将放线菌自调节因子给予转化的植物，以诱导在给予放线菌自调节因子部位上受操纵子控制的基因的表达，这种方法使得可以在所需时间和部位引起所需基因的表达，这些甚至可使植物产生代谢产物，否则对植物的生长不利。这种方法通过控制植物的繁殖力，可用于防止转化体植物在环境中扩散。与其它已知诱导植物基因表达的方法相比，这种方法还可以使用较低浓度的特性优越和具有基因表达诱导活性的诱导物，同时还开辟了拓宽可用作诱导物的备选物范围的方法。

                                     序列表

<110>钟渊化学工业株式会社(Kaneka Corporation)

<120>诱导植物中基因表达的方法及用其处理的植物

<130>T619.PBT-2

<150>JP2000-180466

<151>2000-06-15

<160>11

<210>1

<211>699

<212>DNA

<213>弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(699)

<300>

<301>Okamoto，S.，Nakamura，K.，Nihira，T.和Yamada，Y.

<302>弗吉尼亚链霉菌的弗吉尼亚丁内酯结合蛋白。证据表明VbrA不是弗吉尼亚丁内酯结合蛋白，是真结合蛋白的重新鉴定。

<303>生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)

<304>270

<305>20

<306>12319-12326

<307>1995-05-19

<308>D32251

<309>1994-07-19

<400>1

atg gca gtg cga cac gaa cgg gtg gca gtg cga cag gaa cgg gcc gtc 48

Met Ala Val Arg His Glu Arg Val Ala Val Arg Gln Glu Arg Ala Val

  1               5                  10                  15

cgc acg cgg cag gcg atc gtg cgg gca gcc gcc tcg gtc ttc gac gag 96

Arg Thr Arg Gln Ala Ile Val Arg Ala Ala Ala Ser Val Phe Asp Glu

             20                  25                  30

tac ggg ttc gag gcc gcc aca gtg gca gag atc ctc tcg cgg gcc tcg 144

Tyr Gly Phe Glu Ala Ala Thr Val Ala Glu Ile Leu Ser Arg Ala Ser

         35                  40                  45

gtc acc aag ggc gcg atg tac ttc cac ttc gct tcc aag gaa gag ctg 192Val Thr Lys Gly Ala Met Tyr Phe His Phe Ala Ser Lys Glu Glu Leu

 50                  55                  60gcc cgc ggc gtg ctg gcc gag cag acc ctg cac gtg gcg gtg ccg gaa 240Ala Arg Gly Val Leu Ala Glu Gln Thr Leu His Val Ala Val Pro Glu65                   70                  75                  80tcc ggc tcc aag gcg cag gaa ctg gta gac ctc acc atg ctg gtc gcc 288Ser Gly Ser Lys Ala Gln Glu Leu Val Asp Leu Thr Met Leu Val Ala

             85                  90                  95cac ggc atg ctg cac gat ccg atc ctg cgg gcg ggc acg cgg ctc gca 336His Gly Met Leu His Asp Pro Ile Leu Arg Ala Gly Thr Arg Leu Ala

        100                 105                 110ctg gac cag ggg gcg gtg gac ttc tcc gac gcc aac ccg ttc ggc gag 384Leu Asp Gln Gly Ala Val Asp Phe Ser Asp Ala Asn Pro Phe Gly Glu

    115                 120                 125tgg ggc gac atc tgc gcc cag ctc ctg gcg gag gca cag gaa cgg ggg 432Trp Gly Asp Ile Cys Ala Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gln Glu Arg Gly

130                 135                 140gag gtg ctt ccg cac gtg aac ccg aaa aag acc ggc gac ttc atc gtc 480Glu Val Leu Pro His Val Asn Pro Lys Lys Thr Gly Asp Phe Ile Val145                 150                 155                 160ggc tgc ttc acc ggg ctc cag gcg gtc tcc cgg gtc acc tcc gac cgc 528Gly Cys Phe Thr Gly Leu Gln Ala Val Ser Arg Val Thr Ser Asp Arg

            165                 170                 175cag gac ctc ggc cac cgg atc tcg gtg atg tgg aac cac gtg ctg ccc 576Gln Asp Leu Gly His Arg Ile Ser Val Met Trp Asn His Val Leu Pro

        180                 185                 190agc atc gtg ccg gcg tcc atg ctg acc tgg atc gaa acc ggc gag gag 624Ser Ile Val Pro Ala Ser Met Leu Thr Trp Ile Glu Thr Gly Glu Glu

    195                 200                 205cgg atc ggg aag gtc gcg gcg gcg gcc gag gcc gcc gag gct gcg gag 672Arg Ile Gly Lys Val Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Glu

210                 215                 220gcc tcc gag gcc gcc tcc gac gag tag 699Ala Ser Glu Ala Ala Ser Asp Glu225                 230<210>2<211>232<212>PRT<213>弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)<400>2Met Ala Val Arg His Glu Arg Val Ala Val Arg Gln Glu Arg Ala Val1               5                  10                  15Arg Thr Arg Gln Ala Ile Val Arg Ala Ala Ala Ser Val Phe Asp Glu

         20                  25                  30Tyr Gly Phe Glu Ala Ala Thr Val Ala Glu Ile Leu Ser Arg Ala Ser

     35                  40                  45Val Thr Lys Gly Ala Met Tyr Phe His Phe Ala Ser Lys Glu Glu Leu

 50                  55                  60Ala Arg Gly Val Leu Ala Glu Gln Thr Leu His Val Ala Val Pro Glu65                  70                  75                  80Ser Gly Ser Lys Ala Gln Glu Leu Val Asp Leu Thr Met Leu Val Ala

             85                  90                  95His Gly Met Leu His Asp Pro Ile Leu Arg Ala Gly Thr Arg Leu Ala

        100                 105                 110Leu Asp Gln Gly Ala Val Asp Phe Ser Asp Ala Asn Pro Phe Gly Glu

    115                 120                 125Trp Gly Asp Ile Cys Ala Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gln Glu Arg Gly

130                 135                 140Glu Val Leu Pro His Val Asn Pro Lys Lys Thr Gly Asp Phe Ile Val145                 150                 155                 160Gly Cys Phe Thr Gly Leu Gln Ala Val Ser Arg Val Thr Ser Asp Arg

            165                 170                 175Gln Asp Leu Gly His Arg Ile Ser Val Met Trp Asn His Val Leu Pro

        180                 185                 190Ser Ile Val Pro Ala Ser Met Leu Thr Trp Ile Glu Thr Gly Glu Glu

    195                 200                 205Arg Ile Gly Lys Val Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Glu

210                 215                 220Ala Ser Glu Ala Ala Ser Asp Glu225                  230<210>3<211>26<212>DNA<213>弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)<300><301>Kinoshita，H.，Tsuji，T.，Ipposhi，H.，Nihira，T.和Yamada，Y.<302>链霉菌丁内酯自调节受体结合序列的特性<303>Journal of Bacteriology<304>181<305>16<306>5075-5080<307>1999-08<308>D32251<309>1994-07-19<400>3agatacatac caaccggttc ttttga                                      26<210>4<211>110<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的CaMV 35S启动子序列，被修饰成正好在其TATA-盒的下游含有操纵子BARE-3元件<400>4gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc 60tctatataag agatacatac caaccggttc ttttgacggg ggactctaga            110<210>5<211>110<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的CaMV 35S启动子序列，被修饰成正好在其TATA-盒的上游含有操纵子BARE-3元件<400>5gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcagata cataccaacc ggttcttttg 60actatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactctaga            110<210>6<211>110<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的CaMV 35S启动子序列，被修饰成正好在其TATA-盒的下游和上游含有操纵子BARE-3元件

<400>6

gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcagata cataccaacc ggttcttttg 60

actatataag agatacatac caaccggttc ttttgacggg ggactctaga            110

<210>7

<211>136

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的CaMV 35S启动子序列，被修饰成正好在其TATA-盒的下游和上游含有3个操纵子BARE-3元件

<400>7

gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcagata cataccaacc ggttcttttg 60

actatataag agatacatac caaccggttc ttttgaagat acataccaac cggttctttt 120

gacgggggac tctaga                                                 136

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的反向引物序列，其含有限制酶BamH I识别序列，用于PCR扩增barA基因编码区域，可用该酶切割而克隆

<400>8

taggatccat aaatggcagt gcgacac                                      27

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的正向引物序列，其含有限制酶Sac I识别序列，用于PCR扩增barA基因编码区域，可用该酶切割而克隆

<400>9

tagagctcct actcgtcgga ggcggcc                                      27

<210>10

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的配对寡DNA之一的序列，用于构建在TATA盒的下游和上游含有3个操纵子BARE-3元件的修饰的CaMV 35S启动子

<400>10

cggatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatcaga tacataccaa ccggttcttt 60

tgactat                                                           67

<210>11

<211>89

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的另一配对寡DNA序列，用于构建在TATA盒的下游和上游含有3个操纵子BARE-3元件的修饰的CaMV 35S启动子

<400>11

gctctagagt cccccgtcaa aagaaccggt tggtatgtat cttcaaaaga accggttggt 60

atgtatctct tatatagtca aaagaaccg                                   89

Claims (37)

1.一种诱导植物中基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括通过基因转移向植物提供阻遏子和操纵子特性，所述的阻遏子和操纵子与作为诱导物的放线菌自调节因子构成基因表达诱导系统，

并将放线菌自调节因子施用于此转化的植物，从而在给予放线菌自调节因子的部位诱导受该操纵子控制的基因的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的放线菌属于链霉菌属。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的放线菌是弗吉尼亚链霉菌。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的自调节因子是丁内酯自调节因子。

5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的自调节因子是弗吉尼亚丁内酯。

6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的基因表达诱导系统参与抗菌素的产生。

7.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的基因表达诱导系统参与维吉尼霉素的产生。

8.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的阻遏子基因是barA基因。

9.如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述的阻遏子基因含有包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的区域。

10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述的阻遏子基因含有编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的区域。

11.如权利要求1-10任一所述的方法，其特征在于，所述的阻遏子基因的启动子是植物启动子。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

13.如权利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述的操纵子的核苷酸序列衍生自barA、barB或barX基因。

14.如权利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述的操纵子的核苷酸序列是BARE-1、BARE-2或BARE-3。

15.如权利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述的操纵子的核苷酸序列是BARE-3。

16.如权利要求1-15任一所述的方法，其特征在于，所述操纵子的核苷酸序列含有包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的区域。

17.如权利要求1-16任一所述的方法，其特征在于，所述的受操纵子控制的基因的启动子是植物启动子。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述的操纵子位于所述植物启动子中的至少一个位置。

20.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述的操纵子位于所述植物启动子TATA盒的3’下游位点附近或5’上游位点附近的至少一个位置。

21.如权利要求17-20任一所述的方法，其特征在于，所述的操纵子和所述植物启动子的TATA盒，以SEQ ID NO：4到SEQ ID NO：7任一形式排列在一起。

22.如权利要求1-21任一所述的方法，其特征在于，所述的受操纵子控制的基因是能向植物提供繁殖力的基因。

23.一种用权利要求1-22任一所述方法转化的植物。

24.用权利要求1-22任一所述的方法转化的烟草(Nicotiana tabacum L.)。

25.一种用权利要求1-22任一所述方法转化的培养的植物细胞。

26.一种用权利要求1-22任一所述方法转化的培养的烟草细胞。

27.一种由权利要求1-22任一所述的方法转化的培养的烟草BY2细胞。

28.一种阻遏子基因，其特征在于，所述的阻遏子基因与作为诱导物的放线菌自调节因子构成基因表达诱导系统，

且所述的阻遏子基因的启动子是植物启动子。

29.如权利要求28所述的阻遏子基因，其特征在于，所述的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

30.如权利要求28或29所述的阻遏子基因，其特征在于，所述的阻遏子基因是barA基因。

31.如权利要求28-30任一所述的阻遏子基因，其特征在于，所述的阻遏子基因含有包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的区域。

32.如权利要求28-31任一所述的阻遏子基因，其特征在于，所述的阻遏子基因含有编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的区域。

33.一种修饰的启动子，其特征在于，所述的启动子中，与作为诱导物的放线菌自调节因子构成基因表达诱导系统的操纵子，位于植物启动子TATA盒的3’下游位点附近或5’上游位点附近的至少一个位置。

34.如权利要求33所述的修饰的启动子，其特征在于，所述的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

35.如权利要求33或34所述的修饰的启动子，其特征在于，所述的操纵子的核苷酸序列是BARE-1、BARE-2或BARE-3。

36.如权利要求33-35任一所述的修饰的启动子，其特征在于，所述操纵子的核苷酸序列含有包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的区域。

37.如权利要求33-36任一所述的修饰的启动子，其特征在于，其中所述的操纵子与所述植物启动子的TATA盒，以SEQ ID NO：4到SEQ ID NO：7任一形式排列在一起。

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