WO2001096581A1 - Procede conçu pour induire l'expression genique dans une plante et plante associee - Google Patents

Procede conçu pour induire l'expression genique dans une plante et plante associee Download PDF

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plant
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operator
bare
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PCT/JP2001/005096
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Atsuhiko Shinmyo
Kou Kato
Yasuhiro Yamada
Takuya Nihira
Takuya Shindo
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Kaneka Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to the provision of a gene expression induction system to a plant through the production of a transformed plant using a gene recombination technique.
  • transformation The addition of a new trait to a plant by gene transfer is called transformation.
  • Expression of the introduced gene in plant cells gives the conferred trait.
  • the gene When the gene is integrated into the intracellular chromosome, the assigned trait is stably maintained.
  • the traits newly imparted by the introduction of the gene include, for example, resistance to plague and pesticides, conversion of plant metabolism, and the like.
  • the gene used for transformation can be freely constructed.
  • Several methods have been developed for introducing the thus constructed gene into plants. In order to efficiently integrate a gene into a plant cell nuclear chromosome, there is an agrobacterium infection method that uses a plant-infecting bacterium, agrobacterium (Agrobabacterium) as a gene carrier (vector).
  • Gene expression involves a stage called transcription in which mRNA is copied using the DNA itself, which is the body of the gene that holds the genetic information, as a type II, and proteins are synthesized based on the genetic information copied into the mRNA. It goes through a stage called translation. Genes are known to have regions involved in transcription control in addition to regions encoding protein information. The most basic transcription control region is the 5 'upstream region of the coding region, called the promoter. The structure of the promoter is different between eukaryotes such as plants and prokaryotes such as bacteria. A plant promoter has a base sequence called a TATA box which is essential for initiation of gene transcription, and has various other regulatory sequences.
  • RNA polymerase an enzyme that catalyzes transcription in plant cells, binds to the TATA box to initiate transcription.
  • Various regulatory sequences target these in cells called transcription factors. Specifically bind to various protein factors. These transcription factors control gene expression by promoting or suppressing the transcriptional activity of RNA polymerase. That is, gene expression is under the control of these regulatory sequences.
  • These regulatory sequences and transcription factors are also involved in the induction of gene expression through the transcriptional stage.
  • Controlling the induction of the expression of a gene introduced into a plant for transformation with respect to the time and site has a great advantage because metabolites that are disadvantageous to the growth of the plant can be produced in the plant.
  • attempts are often made to utilize gene expression induction systems of heterologous organisms. This is because using the induction system in the plant as it is may have an unexpected effect on the metabolic system in the plant.
  • a gene expression induction system of a heterologous organism can be provided to a plant.
  • the regulatory system consisting of inducers, repressors and operators found in bacterial operon regulatory systems is one of the major gene expression induction systems.
  • Inducers are small molecules that induce gene expression.
  • Reblesser is the best receptor protein of inducer.
  • Operator 1 is the control array that is the target of the repressor.
  • the bond between inducer and repressor and the bond between repressor and operator are very specific and have high affinity, but the repressor bound to inducer cannot bind to the operator.
  • the gene containing the operator in the promoter that is, the gene under the control of the operator, is suppressed in expression due to the repressor bound to the operator under low concentrations of the inducer (OFF)
  • OFF the repressor bound to the operator under low concentrations of the inducer
  • bacterial inducer Z repressor / operator control system As a method for inducing gene expression in plants.
  • two genes a repressor gene and a gene under the control of the operator, are introduced into the plant.
  • their promoters are preferably plant promoters.
  • the operator is located in and near the plant promoter. By selecting a promoter, various characteristics of the motor such as gene expression intensity and tissue specificity, etc. Functional combinations with gene expression inducibility are possible.
  • an object of the present invention is to provide a method for inducing gene expression in plants for controlling the time and site of the induction of expression of genes introduced into plants for transformation.
  • the present invention relates to a method for inducing gene expression in a plant, the method comprising imparting the traits of a libretusor and an operator constituting a gene expression induction system using an actinomycete autoregulator as an inducer to the plant by gene transfer,
  • This method involves administering an actinomycete autoregulator to the transformed plant, thereby inducing the expression of a gene under the control of the operator at the site where the actinomycetes autoregulator is administered.
  • Actinomycetes are present in soil at a high density next to eubacteria and produce many bioactive substances, including antibiotics.
  • Examples of actinomycetes include Streptomyces (S treptomyces) Nou, Micromomo nospora jh ⁇ A ctinoma dura Nou, ⁇ treptosporangiu mJh, Actino 1 anes, No cardia, and S accharopolyspora.
  • Production of bioactive substances and morphological differentiation of actinomycetes are endogenous microbial hormone-like substances It is controlled by quality, a self-regulator.
  • actinomycete auto-regulators include the A-factor of Streptomyces glycesus, Streptomyces cerevisiae, and the A-factor of Streptomyces cesvirginiae.
  • Butanolide viralginiaebutano 1 ide: VB
  • Factor A induces production of the antibiotic streptomycin (streptomycin) in the producing bacteria and streptomycin resistance, and also induces the formation of conidia and aerial hyphae.
  • VB simultaneously induces the production of two antibiotics (virginiamycin, virginiamycin M and virginiamycin S) in the producing strain.
  • Inducer 2 is the conversion of antibiotic production in the producing bacterium (from D-cycloserine to nucleoside antibiotic), and blue pigment production with insufficient carbon and nitrogen sources Is induced.
  • Actinomycete autoregulators like the hormones phlomon and other hormones found in other species, show activity at very low concentrations in the culture broth, at several ⁇ —several 10 ⁇ .
  • actinomycete autoregulators are 2 _ (1'-otaso or hydroxyalkyl) -l-hydroxymethylbutyratataton (2- (1 ,, -0X ⁇ or hydroxyalkyl — 3-hy drox yme thyl-butyrolactone Therefore, known actinomycete autoregulators are also called petit-mouth ratatotone-type autoregulators.
  • the two substituents on the rataton ring are all trans conformations, and their absolute structure is 2 R and 3 R.
  • the difference is that the alkyl side chain at the 2-position, the carbonyl or hydroxyl group at the 6-position, and whether the orientation of the hydroxyl group is ⁇ (derivative substance type 2) or ⁇ (VB type). 3 points. It is known that VB has five types (A, B, C, D, E) with different alkyl side chains at the 2-position. Artificially synthesized derivatives also exhibit activity. The structure of the side chain at position 2 affects the level of activity. 'The structure of the actinomycete autoregulator is relatively simple, so its chemical synthesis is easy. It is also possible to purify a large amount of bacteria producing each factor in a large amount and separate and purify each factor from the culture.
  • amino acid sequence of Bar A and the nucleotide sequence encoding it are represented by SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively.
  • Kd value The specific binding force between actinomycetes autoregulator and its receptor protein is extremely high, and its dissociation constant (Kd value) is, for example, 0.7 nM for factor A ZAr pA and 1 for VB _C 7 ZBar A 1 nM [Nihei, Journal of the Enzyme Engineering Society (1991), Vol. 69, 89-105].
  • bar B and bar X which appear to be governed by a gene expression induction system common to the bar A gene.
  • the existence of each named gene was revealed.
  • the functions of the proteins encoded by these genes are not clear at present, but they are likely to be involved in the virginiamycin biosynthesis, the resistance to purgiamycin, and their regulatory systems in the producing strain.
  • BARE-3 26 bp of the bar A gene promoter
  • BARE-1 29 bp
  • BARE-2 28 bp
  • SEQ ID NO: 3 the base sequence of BARE-3 is represented by SEQ ID NO: 3.
  • actinomycete autoregulatory factors are involved in the gene expression induction system in the producing bacteria.
  • This gene expression induction system consists of an inducer, a reblesser and an operator.
  • the actinomycete self-regulator, the receptor protein of the actinomycetes self-regulator and the target sequence of the receptor protein function as an inducer, a repressor and an operator, respectively.
  • plants used in the present invention include tobacco, corn, soybean, rapeseed, potato, potato, and the like.
  • providing a trait of a repressor means transformation of a plant by introducing a repressor gene.
  • the addition of the operator trait means transformation of a plant by introduction of a gene under the control of the operator.
  • two genes a gene for a receptor protein of an actinomycete autoregulator and a gene under the control of a target sequence of a receptor protein, are introduced into a plant for transformation.
  • the coding region of the receptor protein gene is ligated to the downstream of the promoter functioning in the plant at 3 and downstream.
  • a plant promoter is preferable.
  • the use of the cauliflower mosaic virus (Cauliflourwe mo rsaicvirus: CaMV) 35 S promoter which is known to exert strong promoter activity in many species of plants, is a powerful and constitutive factor in plants. It is effective for effective gene expression.
  • plant promoters include, for example, the opain (nopaline, octopine, mannopine) synthase gene promoter derived from agrobacterium, but are not limited thereto, and a general plant promoter may be used.
  • a general plant promoter may be used.
  • the target gene is incorporated into a plasmid vector called a binary vector.
  • the binary vector contains a replication system in Escherichia coli and Agrobacterium territory and a selection gene, as well as 25 bp bases called RB and LB, which are essential for integration of the gene into the nuclear chromosome of plant cells. Holds an array.
  • the gene inserted between the RB and LB of the binary vector is efficiently integrated into the nuclear chromosome when introduced into a plant cell.
  • pBI121 J effers on et al., EMB OJ., Pp. 312, which is a binary 'vector having a structure in which a -dlucuronidase (GUS) gene coding region is linked to the downstream of the C aMV 35 S promoter. 7), 6, 3901-3907], etc., to transform the bar A gene into a bar A gene coding region, thereby transforming the receptor protein (repressor) Bar A gene of actinomyces self-regulating factor VB.
  • GUS -dlucuronidase
  • the binary sequence can be obtained through the recognition sites for the restriction enzymes BamHI and SacI.
  • the GUS gene coding region of the vector pBI121 can be converted to the bar A gene coding region.
  • R bar A gene coding region fragments having recognition sites for restriction enzymes BamHI and SacI at both ends can be obtained.
  • the target sequence was placed on a promoter that functions in the plant and modified in this manner.
  • the coding region of a desired gene is ligated 3 'downstream of the promoter, and this is inserted into an appropriate plasmid' vector.
  • a plant promoter is preferable.
  • the target sequence (operator) is located near 3, downstream or 5 'upstream of the TATA box of the promoter, and it is more effective to arrange multiple target sequences.
  • the base sequence BARE in the C aMV 35 S promoter of the binary vector pBI122 or the like, the target sequence of the VB receptor protein Bar A (operator), the GUS gene placed under the control of BARE can be obtained.
  • Binary vectors can be constructed for introduction into plants for transformation.
  • the GUS gene is widely used as a reporter gene for detecting the gene expression activity in plant cells in experiments, because the activity of the enzyme encoded by the GUS gene is easy to detect and there is no homolog in the plant.
  • the arrangement of promoter 1 "in the target sequence (operator) is, for example, if there is an appropriate restriction enzyme recognition site across the arrangement site, the double-stranded DN consisting of the base sequence between the restriction enzyme recognition sites It can be achieved by synthesizing fragment A. Alternatively, it can be achieved by a partially specific mutagenesis technique using chemically synthesized oligo DNA, for example, BARE-3 represented by SEQ ID NO: 3 is replaced by a CaMV 35 S promoter.
  • a double-stranded DNA fragment consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5 may be synthesized in order to arrange it in the vicinity of 3, downstream or 5, upstream of the TATA box.
  • a double-stranded DNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 may be synthesized.
  • BAR E 3 of TAT A box C aMV35 S promoter 3 'downstream vicinity ⁇ Pi 5 'To arrange a large number near the upstream for example, a double-stranded DNA fragment consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 may be synthesized.
  • a double strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which BARE-3 is located 2 and 5 near the 3 'downstream of the TAT
  • a box of the CAMV 35S promoter and 1 near the upstream
  • chemically synthesized oligo DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 and 11 whose 3 'ends are complementary to each other over 16 bp are mixed in a test tube, and the complementary ends are mixed.
  • the plasmid vector constructed as described above is introduced into a plant for transformation.
  • the binary vector constructed as described above is introduced and the Agrobacterium umme Ichenis; Alternatively, transform Agrobacterium um rhizogenes (eg, electroporation), etc.
  • the agrobacterium used at this time is a binary vector vector. It is necessary to have the necessary functions to integrate the RB-LB region into the nuclear chromosome of the plant cell Transformed agrobacterium can be easily obtained by using the function of the selectable marker gene in the binary vector. The plant is then infected with the transformed agrobacterium into which the binary vector containing the desired gene has been introduced.
  • plant tissue explants are cultured with the transformed agrobacterium, and callus is induced from the explants, and at the same time, in addition to the selectable marker, agrobacterium such as carbenicillin is used.
  • Selective marker genes include, for example, kanamycin (kanamy c'in), / digromycin (hygromycin), phleomycin (b1eomycin), and chloramphenicone. (chlor amp henicol) and other genes conferring resistance to antibiotics can be used.
  • the transformed plant is obtained by placing the plant in a regeneration medium and regenerating the plant. Transformed m strains can also be obtained from transformed m. Seeds.
  • a transformed plant cultured cell can be obtained. However, in this case, it is not necessary to go through steps such as vigor formation, plant regeneration, or seed formation.
  • gene transfer into plants includes electroporation, which introduces genes into protoplasts, particle bombardment using a gene gun, and direct cell transfer using microcapillaries.
  • electroporation which introduces genes into protoplasts
  • particle bombardment using a gene gun and direct cell transfer using microcapillaries.
  • microinjection method or the like for injecting into a gene and any of the gene transfer methods can be used to carry out the gene expression induction method provided by the present invention.
  • the presence of the gene and the gene product inserted into the nuclear chromosome can be easily confirmed by PCR and gestan analysis, respectively.
  • Transgenic plants can be obtained by introducing a gene for the receptor protein (repressor) of the actinomycetes autoregulator or a gene placed under the control of the target sequence (operator) of the receptor protein.
  • a gene for the receptor protein (repressor) of the actinomycetes autoregulator or a gene placed under the control of the target sequence (operator) of the receptor protein.
  • a method in which different plasmids / vectors are sequentially used for each transformation.
  • a method using a plasmid / vector incorporating both genes makes it possible to obtain a transformant in which both genes have been introduced.
  • repressor Bar A receptor protein of VB
  • BARE-3 target sequence of Bar A
  • VB repressor protein of VB
  • BARE-3 target sequence of Bar A
  • VB was able to induce the expression of genes under BARE-3 control at concentrations as low as 10 OnM.
  • the actinomycete autoregulator has a relatively small molecular weight of about 200 in addition to its hydrophobic structure, so it can easily pass through cell membranes. Therefore, it is very suitable as an inducer where quick absorption into plants is desired.
  • Actinomycete autoregulators are not toxic to plants.
  • VB is not toxic to plants at concentrations of 10 // M.
  • a useful transgenic plant it is possible to produce a useful transgenic plant and effectively use the transgenic plant by selecting a gene under the control of the operator. For example, by placing a gene imparting a fertility trait to a plant under the control of an operator, and administering an actinomycete autoregulatory factor to the transformed plant to control the fertility of the plant. Can be.
  • Such a plant can be used, for example, as a host for transformation to efficiently prevent the spread of the transformed plant into the natural environment.
  • FIG. 1 shows that in Example 3, the gene of the repressor Bar A (receptor protein of VB), which constitutes a gene expression induction system using the self-regulating factor VB of Streptomyces virginia as an inducer, was transfected.
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting analysis on whether or not Bar A protein was accumulated in transformed tobacco cultured cells.
  • B Tobacco cultured cell B Y 2.
  • T The obtained transiently transformed tobacco cultured cell protoplasts (Example 5)
  • Arrow Position of the band representing Bar A protein
  • Fig. 2 shows that in Example 4, the reblesser Bar A (receptor protein of VB) and the operator B AR E, which constitute a gene expression induction system in which the self-regulating factor VB of Streptomyces 'Virginia' was used as an inducer.
  • — 3 one of the target sequences of Bar A) is given to cultured tobacco cells by gene transfer, and VB is administered to the transformed tobacco cultured cells to control them under the control of BARE-3. The results of examining whether or not the ability to induce the expression of the placed GUS reporter gene are shown.
  • GUS se c i f i c a c t i v i t y (vertical axis of graph): GUS specific activity used for evaluation of GUS gene expression activity (unit is [nmo 14MU / min / mg g rote in])
  • I Nductionrate (vertical axis of the graph): VB when added (VB- C 6 Last concentration: ⁇ ⁇ , ON) ratio of GUS gene expression activity for No additive (OFF) of ( GUS gene expression activity (ON) ZGUS gene expression activity (OFF)) VB gene expression induction activity
  • Plasmid pCaMV35 SUDD gus used for transient transformation as a GUS reporter gene under the control of BARE-3 bar A-: bar A gene was not used for transient transformation If
  • FIG. 4 shows the gene expression induction system using the self-regulating factor VB of Actinomyces streptomyces 'Virginia' as an inducer in Example 6. Transformation of repressor Bar A (receptor protein of VB) and operator BARE-3 (one of the target sequences of Bar A) by gene transfer to cultured tobacco cells and transient transformation
  • FIG. 2 shows the results (part 2) of examining whether or not administration of VB to the cultured tobacco cells induced the expression of the GUS reporter gene under the control of BA RE-3.
  • I n du ctionrate (vertical axis of the graph): VB when added (VB- C 6 Last concentration: ⁇ ⁇ , ON) when no additive ratio of GUS gene expression activity against (OFF) (GUS gene expression activity (ON) / GUS gene expression activity (OFF)) VB gene expression induction activity
  • 35 SD BARE—Plus as a GUS reporter gene under the control of 3 When the mid-p CaMV35 SD-gus is used for transient transformation 35 SUD: Use the plasmid pCaMV35 SUD_gus as a GUS reporter gene under the control of BARE-3 for transient transformation If
  • FIG. 5 shows the actinomycete streptococcus in Example 7. Mrs. Virginia's self-regulating factor Repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator B ARE-3 (a target sequence of Bar A) ) was transferred to tobacco cultured cells by gene transfer, and placed under the control of BARE-3 by administering a low concentration of VB to the transiently transformed tobacco cultured cells. The results of examining whether the expression of the GUS reporter gene is induced are shown.
  • Induction rate (vertical axis of the graph): expressed as the ratio of GUS gene expression activity (GUS gene expression activity (ON) / GUS gene expression activity (OFF)) when VB was added (ON) to when it was not added (OFF).
  • VB-induced gene expression 35 SD Plasmid p CaMV35 SD-gus used as a GUS reporter gene under the control of BARE-3 for transient transformation
  • FIG. 3 shows the results of examining whether or not VB administration to induced tobacco induces the expression of a GUST reporter gene placed under the control of BARE-3.
  • Reblesser Bar A (VB receptor protein), which constitutes a gene expression induction system that induces the self-regulatory factor Virginiae butanolide (Virginiaebutano 1 ide: VB) of actinomyces Streptomyces virginiae ) was added to plants by gene transfer, that is, a plasmid vector was constructed for introducing the repressor barA gene into plants for transformation.
  • the cloning plasmid vector pB1uescriptll SK (-) (GenBank Accession No.X52330)
  • the restriction enzyme in the cloning region was inserted between the BamHI recognition site and the SacI recognition site (plasmid pbarA). It was confirmed by sequencing that the bar A gene coding region was correctly closed.
  • Cauliflower, mosaic, vinoles (C aulifl owe r mo saicvirus: C aMV)
  • C aulifl owe r mo saicvirus C aMV
  • GUS glucuronidase
  • Restriction enzyme containing BamHI-SacI fragment was removed, and the remaining vector fragment contained the barA gene coding region cut out from plasmid pbarA by treatment with restriction enzymes BamHI and SacI.
  • the enzyme BamHI-SacI fragment was ligated (binary vector pBIC aMV35S-barA).
  • Plasmid NtADHp-GUS (Na gaya et al., J. Biosci. Bioen] having a structure in which the GUS gene coding region is linked 3 'downstream of the promoter of tobacco alcoholic dehydrogenase (Nicotianatabacum alcohol dehydrogenase: NtADH). g. (2000), 89, 231-235]. It is known that the NtADH promoter of this plasmid exerts a very strong promoter activity in tobacco.
  • Plasmid N t ADHp The restriction enzyme BamHI—SacI fragment containing the GUS gene coding region was removed from the GUS by treatment with the restriction enzymes BamHI and SacI.
  • Plasmid NtADHp The restriction enzyme BamHI-SacI fragment containing the GUS gene coding region was removed from the GUS by treatment with restriction enzymes BamHI and SacI, and the remaining vector fragment was terminated. After blunting, ligation was performed (plasmid ⁇ N t ADHA BS).
  • the method is the standard method!
  • KOD DNA polymerase [Toyobo Co., Ltd.] was used for PCR, and the conditions were in accordance with the manual.
  • Transfection of the trait of the operator BARE-3 (a target sequence of the receptor for VB, one of Bar A), which constitutes a gene expression induction system using VB as an inducer of Streptomyces streptomyces Virginia
  • a plasmid vector was constructed to introduce the GUS reporter gene, which is to be given to the plant, that is, placed under the control of the operator BARE-3, into the plant for transformation.
  • BARE-3 was located at 3, downstream of the TATA box of the CaMV 35S promoter, two at the downstream, and one at the 5 'upstream.
  • BARE—3 (26 bp) represented by SEQ ID NO: 3 A double-stranded DNA fragment consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 was synthesized, with BARE-3 (26 bp) inserted between the 27th base and the 28th base downstream of box 3, .
  • the chemically synthesized oligo DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 10 and 11 whose 3 'ends are complementary to each other over 16 bp are added to a 10 ⁇ l ⁇ solution of each lOO pmo. After mixing and maintaining at 95 ° C for 3 minutes, the mixture was cooled to room temperature. E. coli DNA polymerase I Klenow fragment (K1 enowframgent) was added to 2 ⁇ l of this solution, and the total volume of the reaction solution was adjusted to 401, and the mixture was kept at 37 ° C for 30 minutes. The ethanol precipitate of the reaction solution in which the enzyme was inactivated by the treatment was dissolved in 5 ju1 of the TE solution.
  • the restriction enzyme Eco RV—X ba I fragment obtained by reacting 2 ⁇ l of this solution with the restriction enzymes Eco RV and X ba I was used to clone the restriction enzyme Eco RV—X ba I fragment into a plasmid for cloning. It was inserted between the restriction enzyme EcoRV recognition site and the XbaI recognition site in the ligating region (plasmid pBARE3UDD). Sequencing confirmed that BARE-3 was correctly positioned.
  • Binary 'vector pBI10lHmB [Nakayama et al., Pant P, which has a structure in which the GUS gene coding region is linked downstream of the C aMV35S promoter and also has a hygromycin resistance gene as a selectable marker gene.
  • hysio 1. (200 0), 122, 12 39-124 7]
  • the restriction enzymes containing the CaMV 35 S promoter by treatment with the restriction enzymes Hind III and Xba I.
  • the raw HindIII—XbaI fragment was removed, and the remaining vector fragment was excised from plasmid pCaMV35SUDD by treatment with the restriction enzymes HindIII and XbaI.
  • BARE-3 was a TATA box.
  • the restriction enzyme HindIII-XbaI fragment containing the CaMV35S promoter which has two and five sites near the 3 'downstream and one site near the upstream, was ligated (binary' vector pBIC aMV35 SUDD-gus).
  • a plasmid vector was also constructed for introducing a GUS reporter gene under the control of operator BARE-3 into plants for transient transformation.
  • BARE-3 was placed at two near the 3 'downstream and one near the 5' upstream of the TATA box of the CaMV 35S promoter.
  • the plasmid pBI221 was treated with restriction enzymes HindIII and XbaI to remove the restriction enzyme HindIII-XbaI fragment containing the CaMV 35S promoter, and the remaining vector fragment was replaced with the plasmid pCaMV.
  • 35 CDDs with a structure in which two BARE-3 fragments cut out from SUDD by the restriction enzyme 11111 (111, 1 and 13 & 1) are located near the 3 'downstream and 1 near the 5' upstream of the TATA bot a
  • a restriction enzyme HindIII-XbaI fragment containing the MV35S promoter was ligated (plasmid pCaMV35SUDD-gus).
  • the structure represented by SEQ ID NO: 4 in which one BARE-3 is located near the 3 ′ downstream of the TATA box the structure represented by SEQ ID NO: 5 in which one BARE-3 is located near the upstream of the TATA box Structure and plasmid vectors each having a C a MV 35 S promoter having the structure shown in SEQ ID NO: 6, which is located near the 3 'downstream and 5, near the TATA box and one upstream, respectively, were also constructed ( Plasmids pCaMV35SD-gus, CaMV35SU-gus and pCaMV35SUD-gus).
  • Repressor Bar A (receptor protein of VB), which constitutes a gene expression induction system using VB as an inducer of Streptomyces streptomyces ) was imparted to cultured tobacco cells by gene transfer. That is, the repressor barA gene was introduced into cultured tobacco cells for transformation.
  • the gene transfer was carried out by the agrobacterium (Agrobactereurn) infection method.
  • Agrobacterium was once transformed by introduction of the bA rA gene, and the resulting transformed agrobacterium was infected to cultured tobacco cells.
  • the electroporation method was used for gene transfer into Agrobacterium. Combined cell of Agrobacterium um tumefaciens EHA101 strain [Elizanbeth et al., J. B acteriol. (1 986), 168, 1291-1 301]. 200 ng of the gene (Example 1, Pinary 'vector: BI Ca MV 35 S-bar A) was mixed and transferred to a cuvette (distance between electrodes: 2 mm) of Gene' Pulsar (Nippon Bio'Rad 'Laboratories, Inc.) did. A pulse with a voltage of 2.5 kV, a capacitance of 25 ⁇ FD, and a resistance of 400 ⁇ was generated between the cuvette electrodes.
  • the time constant at the time of pulse generation was about 10 ms.
  • the entire contents of the cuvette loaded with the pulse were applied to an LB medium agar plate containing 10 Omg / 1 kanamycin (kanamici ⁇ ), and the plate was allowed to stand in a dark place at 30 ° C. Two days later, the colony formed on the plate was shake-cultured for 2 days in a dark place at 30 ° C using 5 ml of LB medium containing 10 Omg / 1 kanamycin. This culture was used as a transformed Agrobacterium culture.
  • the resulting transformed agrobacterium was transformed into tobacco cultured cells BY 2 (RIKEN Gene Bank, Plant Cell Development Bank (P1ant Cell Bank) RP C No. 1) [ Nagata et al., Methods Enzymo 1. (1987), 148, 34-39].
  • Cultured tobacco cells BY2 used a modified LS medium [Nagata et al., Methods Enzymo 1. (1987), 148, 34-39] 27. Passage at about 1/50 dilution for about 1 week by shaking culture in place C, and use cells in logarithmic growth phase (3-5 days after passage) for infection with agrobacterium. Was.
  • the Western blotting method was used to determine whether the repressor Bar A protein was accumulated in the cultured tobacco cells thus obtained.
  • the transformed tobacco cultured cells are suspended in a suitable cell extraction buffer (eg, 0.1 M KP04, 2 mM EDTA, 5% glycerol, 2 mM DTT, H7.8), and an ultrasonic generator [Ltd. It was crushed using Tomi Ichisei Handy Sonic UR-20P].
  • a suitable cell extraction buffer eg, 0.1 M KP04, 2 mM EDTA, 5% glycerol, 2 mM DTT, H7.8
  • an ultrasonic generator Lithyl
  • the supernatant obtained by high-speed centrifugation of the cell lysate was used as a cell extract.
  • the protein concentration (mg / ml) of the cell extract was measured by the method of Pradford [Bradford, A. 1. Biochem. (1976), 72, 248-254].
  • the cell extract corresponding to 20 ⁇ g / lane of protein was separated by SDS-PAGE (12.5% polyacrylamide gel), and then transferred to PV DF membrane [Nippon Bio 'Rad' Laboratories Co., Ltd.] and used as antibody. Reacted. Egret anti-Bar A antibody [Nakano et al., J. B acteriol. (1998), 180, 3317-3322] for the primary antibody, and alkaline phosphatase (alkaline phosphatase) labeled antibody for the secondary antibody. ⁇ A heron IgG antibody was used. Each reaction and washing was performed in the presence of 3% skim milk.
  • an alkaline phosphatase reaction solution (0.01% 7-bromo-4-chloro-1--3-indolinole 'phosphate p-toluidine (5-bromo—4-chloro—3-indolylphosphatep to 1 uidinesalt), 1 pm nitro 'blue' tetranitrozolium, 100 mM Tris—H C l, l O OmM Na C l, 5 mM MgC l 2, pH9. 5) to the immersed membrane bands were detected which develops on the membrane. 10 ng of Bar A protein produced and purified using transgenic Escherichia coli was used as a control sample.
  • the repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (part of the target sequence of Bar A) which constitute the gene expression induction system using VB as an inducer of Streptomyces streptomyces 1) was added to cultured tobacco cells by gene transfer. That is, two genes, a repressor bar A gene and a GUS reporter gene under the control of operator BARE-3, were introduced into cultured tobacco cells for transformation.
  • the bar A gene (Example 1, binary 'vector p BIC a MV 35 S-bar A) was introduced into tobacco cultured cells BY2, and the resulting transformed tobacco cultured cells (Example 3) were analyzed by Western analysis. Clones that seem to have a relatively high accumulation of Bar A protein (Nos. 30 and 21 in Figure 1) and clones that seem to have accumulated a small amount of Bar A protein ( Figure 1)
  • a GUS reporter gene (Example 2, binary. Vector p BIC aMV35 SUDD_gus) placed under the control of BARE-3 was introduced into No. 27 shown in Table 2 below.
  • the Agrobacterium infection method was used as in Example 3.
  • Transformed tobacco culture cells were modified LS containing hygromycin (hygromycin) 2 Omg / 1, kanamycin (kana mycin) l O OmgZl and canolebenicillin (carbenici 1 1 in) 25 Omg / 1 Selected in the medium and maintained for the passage.
  • inducer VB The administration of inducer VB to the transformed cultured tobacco cells obtained in this manner was examined to determine whether it could induce the expression of the GUS reporter gene under the control of operator BARE-3. .
  • Modified transformed tobacco cells shaking culture in darkness at 27 ° C using LS medium GUS gene expression activity (GUS activity per unit protein) of cell extract prepared from cells cultured at about 1 Z25 dilution for about 1 week at a time and added for 4 days after adding VB at the time of passage. , Ie evaluated using GUS specific activity) was compared with that without VB.
  • VB was added by adding VB-C 6 [Nihei, Journal of the Enzyme Engineering Society (1991), Vol. 69, 89-105] stock solution (lOmgZml methanol solution) diluted to 1 Z50 with water and adding 1 V to the medium. It was performed by adding 1000 volume (VB- C 6 final concentration: about 1 mu M).
  • the supernatant was removed by centrifugation.
  • the cells were then extracted with 5001 cell extraction buffer (5 OmM NaH2 P04 / Na2HP04, 1 OmM EDTA, 10 mM 2-mercapto'ethanol, pH7) And crushed using an ultrasonic generator [TOMY SEIJE HANDY Sonic UR-20P].
  • the supernatant obtained by high-speed centrifugation of the cell lysate was used as a cell extract.
  • the protein concentration (mgZml) of the cell extract was measured by the method of Bradford.
  • the GUS activity of the cell extract [J efferson et al., EMBO J.
  • the GUS activity (nmo 14 MU / min / min / ml) was calculated.
  • the average value of GUS specific activity (GUS specific activity [nmo ⁇ 4 MU min / mgrotein]) obtained in three independent experiments under the same experimental conditions was defined as the GUS gene expression activity under the experimental conditions.
  • a trait that appears to have accumulated only a small amount of Bar A protein obtained by introducing the bar A gene (Example 1, binary 'vector p BIC aMV 35 S-bar A) into cultured tobacco cells BY2
  • the transformed tobacco cultured cell clone (Example 3, No. 27 shown in FIG. 1) was further combined with a GUS reporter gene placed under the control of BARE-3 (Example 2, binary vector p B ⁇ C aMV 35 SUDD- gus), the gene expression induced by VB is less than 2 (Induction rate ⁇ 2) in the transgenic tobacco cultured cell clones (numbers 27-1 and 27-9).
  • the gene expression inducing activity by VB increased.
  • the repressor Bar A (VB receptor protein) and the operator BARE-3 (one of the target sequences of Bar A), which constitute the gene expression induction system with actinomycetes autoregulator VV as an inducer, ) Is imparted to cultured tobacco cells by gene transfer, and VB is administered to the transformed tobacco cultured cells, thereby inducing the expression of genes under the control of BARE-3 at the VB administration site.
  • Repressor Bar A receptor protein of VB
  • the operator BARE—3 the target sequence of Bar A
  • GUS reporter gene under the control of the reblesser ba.rA gene and the operator BARE-3 were introduced into cultured tobacco cells for transient transformation.
  • Electroporation was used for gene transfer. To this end, tobacco cultured cells were protoplasted. The cultured tobacco cells BY2 were subcultured in a shaking culture at 27 ° C using a modified LS medium in a dark place at a dilution of about 150 at a cycle of about 1 week, and reached a logarithmic growth phase (3 to 3 weeks after the passage). On day 5), the cells were subjected to an enzyme solution (0.1% vector Y23 [Yakult Co., Ltd.]), 1% cellulase "Onozuka” RS [Kikkoman Co., Ltd.], 0.4M mannitol, pH 5. 5).
  • the enzyme reaction was allowed to proceed at 30 ° C for 2-3 hours, and the cells were dispersed by pipetting every 15 minutes during the reaction. It was confirmed by microscopy that spherical cells were almost completely dispersed, and the cells in this state were used as protoplasts for gene transfer.
  • electroporation buffer 5mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (2-(N- morpholino) ethanesulfonicacid: MES), 7 OmM KC1, 0.3M Mannitol
  • Example 1 plasmid pNtADH—bar A
  • BARE-3 plasmid pC aMV35 SUDD-gus and luciferase (1 uciferase: LUC) gene
  • plasmid pCaMV35S-1uc plasmid pCaMV35S-1uc [Miliar et al., Platt Mol. (1992), 10, 3 24—3 3 7]
  • 1 ⁇ g was mixed thoroughly with 500 ⁇ l of protoplast suspension, and Gene Pulsar [Nippon Bio-Rad. Laboratories Co., Ltd.] (the distance between the electrodes is 4 mm).
  • Pulses with a voltage of 200 V, a capacitance of 250 ⁇ F, and a resistance of 400 ⁇ were generated between the cuvette electrodes.
  • the time constant for pulse generation is 15-20 Res.
  • the protoplasts from the pulsed cuvette were quickly transferred to a Petri dish (6 cm in diameter), to which 4.5 ml of medium (modified LS medium, 10 gZ 1 sucrose, 0.4 M mannitol) was added.
  • medium modified LS medium, 10 gZ 1 sucrose, 0.4 M mannitol
  • VB was added in the same manner as in Example 4.
  • the protoplasts collected from the Petri dish and the supernatant removed by centrifugation are suspended in 500 ⁇ l of cell extraction buffer (0.1 M ⁇ 04, 2 mM EDTA, 5% glycerol, 2 mM DTT, pH 7.8), and The cells were crushed using a sound generator [Tomy Seike Handy Sonic UR-20P].
  • the supernatant obtained by high-speed centrifugation of the cell lysate was used as a cell extract.
  • the GUS activity (nmol 4 MU / min / ml) of the cell extract was measured in the same manner as in Example 4.
  • the LUC activity of the cell extract was determined by adding 20 ⁇ l of the cell extract at room temperature to 100 ⁇ l of the cell extraction buffer containing 470 ⁇ l of luciferin (Pitka Gene, Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) as the LUC substrate. The mixture was mixed and immediately evaluated based on the amount of light emitted for 10 seconds measured using a luminometer (Lumat LB 9501). LUC activity (pmo 1 L UC / ml) was calculated from a calibration curve prepared using a luciferase standard. The average GUS / LUC value (nmo 14MU / min / pmo 1 LUC) obtained in three independent experiments under the same experimental conditions using simultaneously prepared protoplasts was calculated as the GUS gene expression activity under the experimental conditions. And
  • the gene expression-inducing activity of VB increased as the number of BARE-3 increased.
  • repressor Bar A receptor protein of VB
  • BARE—3 one of the target sequences of Bar A
  • the repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (the target sequence of Bar A), which constitute the gene expression induction system using VB as an inducer of Streptomyces virginia 1) Shape Quality was imparted to cultured tobacco cells by gene transfer. That is, the repressor bar A gene was introduced into tobacco cultured cells, and the resulting transformed tobacco cultured cells were further transformed with a GUS reporter gene placed under the control of operator BARE-3 for transient transformation. Introduced.
  • the transformed tobacco cultured cell clone (Example 3, No. 21 shown in FIG. 1) was further added to a GUS reporter gene placed under the control of BARE-3 (Example 2, plasmid pC aMV35 SUDD-gus, pCaMV35SD-gus, pCaMV35SU-gus and pCaMV35SUD-gus) were introduced for transient transformation.
  • BARE-3 Example 2, plasmid pC aMV35 SUDD-gus, pCaMV35SD-gus, pCaMV35SU-gus and pCaMV35SUD-gus were introduced for transient transformation.
  • the GUS reporter gene placed under the control of BARE-3 was introduced in the same manner as in Example 5.
  • the plasmid pCaMV35SUDD—gus, pCaMV35SD-gus, pCaMV35SU-gus and pCaMV35 as the GUS reporter gene under the control of BARE-3 SUD- be used either to transient form transformants of gus, GUS gene expression activity VB- C 6 ⁇ Ka ⁇ higher than when towards (oN) is continuously added pressure (OFF), GUS by VB Induction of gene expression was observed (Fig. 4).
  • the repressor Bar A (the receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (a target sequence of Bar A) that constitute the gene expression induction system using the actinomycetes autoregulator VB as an inducer
  • BARE-3 a target sequence of Bar A
  • the repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (part of the target sequence of Bar A ) Is transferred to tobacco cultured cells by gene transfer, and a low concentration of inducer VB is administered to the transiently transformed tobacco cultured cells, thereby allowing them to be controlled by the operator BARE-3. It was examined whether the expression of the placed GUS reporter gene was induced.
  • the barA gene (Example 1, binary vector p BIC aMV35 S-bar A) was obtained by introducing the tobacco cultured cells BY2 into In the transformed tobacco cultured cell clones that are considered to have relatively high accumulation of Bar A protein (Example 3, No. 21 shown in FIG. 1), and under the control of BARE-3 GUS reporter gene (example 2, plasmid p C aMV 35 SD- gus) of VB to the culture of the transiently transformed cultured tobacco cell protoplasts obtained by introducing ⁇ Ka ⁇ (VB- C 6 final concentration GUS gene expression activity (ratio of GUS activity to LUC activity, that is, GUSZLUC) of cell extracts prepared from protoplasts left at 25 ° C for 20 hours. (Evaluated using the value) was compared with that without VB.
  • the repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (the target sequence of Bar A) which constitute the gene expression induction system with the actinomyces self-regulating factor VB as an inducer ) was transferred to tobacco cultured cells by gene transfer, and the transiently transformed tobacco cultured cells were placed under the control of BARE-3 by administering VB at a low concentration of 100 nM. Gene expression was sufficiently induced at the site of VB administration.
  • Repressor Bar A (VB receptor protein), which constitutes a gene expression induction system using VB as an inducer of Streptomyces streptomyces Trait was imparted to tobacco by gene transfer. That is, the repressor bar A gene was introduced into tobacco for transformation.
  • the gene transfer was performed using the Agrobacterium terminus infection method. Agrobacterium was once transformed by introducing the barrA gene, and the resulting transformed agrobacterium was used to infect tobacco.
  • Tobacco (Nicotianatabacum L.) was infected with the same transformed Agrobacterium as used in Example 3 by a leaf disc method.
  • MS medium [Mu rashige et al., Physiol. P 1 antar urn (1962), 15, 473-498] 5 to 1 Omm square or disk from several leaves of sterile tobacco grown in gellan gum pot
  • the leaf-shaped leaf pieces were cut off, immersed in sterile water in a petri dish, and mixed with several ml of the transformed agrobacterium culture solution.
  • the leaf pieces were taken out and placed on an MS callus medium (including SingZ 1-naphtha 1-eneacetic acid, 0.2 mg / 16-benzyladenine) gellan gum 'plate with the back side up.
  • Leaf pieces were collected from the plate that had been allowed to stand for 2 days in an artificial weather device (25 ° C, light 16 hours ⁇ ⁇ 8 hours), washed several times with sterile water, and kanamycin 10 Omg / 1 with the back side up.
  • MS callus medium containing carbenicillin 25 OmgZ 1 was arranged on a gellan gum plate.
  • the plate was allowed to stand in a climatic chamber until shoots were formed from the leaf pieces.
  • the formed buds (shoots) were cut out and planted in gellan gum pots containing MS medium containing kanamycin and carpenicillin.
  • Transformed tobacco plants from roots grown in pots placed in an artificial meteorological medium were used as transformed tobacco in an MS medium gellan gum pot containing hygromycin 2 OmgZ1, kanamycin 10 Omg / 1 and carpenicillin 25 Omg / 1. Selection and passage maintained. (Example 9)
  • the repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (the target sequence of Bar A), which constitute the gene expression induction system using VB as an inducer of Streptomyces virginia 1) was added to tobacco by gene transfer. That is, the repressor barA gene was introduced into tobacco, and the resulting transformed tobacco was further transfected with a GUS reporter gene under the control of operator BARE-13 for transient transformation.
  • Example 8 Transformed tobacco (Example 8) obtained by introducing the bar A gene (Example 1, binary .vector pBICaMV35S-barA) into tobacco (Nicotianatabac urn L.) Furthermore, a GUS reporter gene (Example 2, plasmid pCaMV35SD-gus) placed under the control of BARE-3 was introduced for transient transformation.
  • Electroporation was used for gene transfer. To that end, tobacco was protoplasted. Cut off leaf pieces of 5-1 Omm square from several tobacco leaves. Enzyme solution (0.1% ⁇ ⁇ ⁇ ctlyase Y 23 [Yakult Co., Ltd.]), 1% cellulase “Onozuka” RS [Kikkoman Co., Ltd.], 0. The suspension was suspended in 4M mannitol, pH 5.5), and the enzyme reaction was allowed to proceed at room temperature for several hours. When the peeling layer was observed on the leaf piece surface, the enzyme solution was filtered through a mesh having a pore size of 70 ⁇ , and the filtrate was centrifuged. The sedimented green cell mass was used as a protoplast for gene transfer.
  • the cells were suspended in a buffer for electroporation (5 mM MES, 7 OmM KC 1, 0.3 M mannitol) at a cell density of 6 ⁇ 10 6 Zm1.
  • a GUS reporter gene under the control of BARE-3 (Example 2, plasmid pCaMV35 SD-gus) 10 ⁇ g and a luciferase gene (pCaMV35 to monitor gene transfer efficiency) 1 ⁇ g of S-1 uc) was thoroughly mixed with the protoplast suspension 500 ⁇ 1 and transferred to a cuvette (4 mm in distance between electrodes) of Gene Pulsar (Nippon Bio'Rad ⁇ Laboratories).
  • the protoplasts collected from the Petri dish and the supernatant was removed by centrifugation were suspended in 500 ⁇ l of cell extraction buffer (0.1 M ⁇ 04, 2 mM EDTA, 5% glycerol, 2 mM DTT, pH 7.8). Crushing was performed using an ultrasonic generator [Tomy Seishin Handy Sonic UR-20P]. The supernatant obtained by high-speed centrifugation of the cell lysate was used as a cell extract. GUS activity and LUC activity of the cell extract were measured in the same manner as in Examples 4 and 5, respectively. Two independent experiments were performed under the same experimental conditions.
  • the repressor Bar A (the receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (a target sequence of Bar A) that constitute the gene expression induction system using the actinomycetes autoregulator VB as an inducer Traits by gene transfer
  • BARE-3 a target sequence of Bar A
  • the repressor Bar A (receptor protein of VB) and the operator BARE-3 (part of the target sequence of Bar A) which constitute the gene expression induction system using the autoregulator VB of Streptomyces 'Virginia' as an inducer was given to tobacco by gene transfer. That is, two genes, a repressor barA gene and a GUS reporter gene under the control of operator BARE-3, were introduced into tobacco for transformation.
  • the barA gene (Example 1, Binary 'vector pBICaMV35S-barA) was introduced into octopus (Nicotianatabacum L.), and the resulting transformed tobacco (Example 8) A GUS reporter gene under the control of BARE-3 (Example 2, Binary 'vector pBIC aMV35S UDD-gus) was introduced. As in Example 8, the gene transfer was carried out using the Agrobacterium terminus infection method. Transformed tobacco was selected and maintained on an MS medium containing hygromycin 2 OmgZI, kanamycin 10 OmgZ1 and carbenicillin 25 OmgZ1.
  • inducer VB The administration of inducer VB to the transgenic tobacco obtained in this manner was examined to determine whether or not the inducer could induce the expression of a GUS reporter gene under the control of operator BARE-3.
  • VB added Sucker transformed tobacco (VB- C 6 final concentration of planted in MS medium pot, splicing, GU S gene expression activity of the leaves of transformed tobacco grown in about 3 weeks a climate (GUS activity In the GUS activity staining, lmM 5-bromo-4-chloro-3_indolyl- ⁇ -D-dalcuronide was used as the GUS substrate for GUS activity staining.
  • the repressor Bar A (VB receptor protein) and the operator BARE-3 (one of the target sequences of Bar A), which constitute the gene expression induction system with actinomycetes autoregulator VV as an inducer, ) was given to tobacco by gene transfer, and VB was administered to the transformed tobacco, whereby the expression of a gene under the control of BARE-3 was able to be induced at the VB administration site.
  • the present invention provides a plant with the traits of a repressor and an operator constituting a gene expression induction system comprising an actinomycete autoregulator as an inducer, which is provided as an inducer.
  • a method of inducing the expression of a gene placed under the control of an operator at the site of administration of an actinomycetes autoregulator by administering a regulatory factor allows the expression of a desired gene at a desired time and site.
  • metabolites that are disadvantageous for plant growth can be produced in plants. It is also useful for preventing the spread of transformed plants into the environment through fertility control.
  • This method allows the use of an inducer that has excellent properties of gene expression induction activity at low concentrations compared to known methods for inducing gene expression in plants, and at the same time expands the choice of inducers used Paved the way.

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Description

植物における遺伝子発現の誘導方法及ぴその植物
技術分野
本発明は、 遺伝子組換え技術を利用した形質転換植物の作出を介する植物への 遺伝子発現誘導系の付与に関する。 背景技術
遺伝子導入による植物への新たな形質の付与は形質転換と呼ばれる。 導入され た遺伝子が植物細胞内で発現することにより、 付与された形質が表れる。 遺伝子 が細胞内染色体に組み込まれた場合、 付与された形質は安定に維持される。 遺伝 子導入により新しく付与される形質には、 例えば、 疫病や農薬に対する抵抗性、 植物本来の代謝の変換等がある。 現在の遺伝子組換え技術では形質転換のために 用いる遺伝子は自在に構築できる。 このように構築された遺伝子を植物に導入す るための方法もいくつか開発されている。 遺伝子を効率よく植物細胞核染色体に 組み込む場合には、 遺伝子の運搬体 （ベクター） として植物感染性細菌であるァ グロバタテリゥム （A g r o b a c t e r i u rn) を利用するァグロパクテリゥ ム感染法がある。
遺伝子の発現は、 遺伝情報を保持する遺伝子本体である D N Aを铸型として m R N Aが写し取られる転写と呼ばれる段階、 及ぴ m R N Aに写し取られた遺伝情 報に基づいて蛋白質が合成される翻訳と呼ばれる段階を経る。 遺伝子には、 蛋白 質情報をコードする領域の他に転写制御に関与する領域の存在が知られている。 最も基本的な転写制御領域はコード領域の 5 ' 上流領域でプロモーターと呼ばれ る。 プロモーターの構造は植物等の真核生物と細菌等の原核生物では異なる。 植 物プロモーターは遺伝子の転写開始に必須な T A T Aボックスと呼ばれる塩基配 列を持ち、 他に様々な制御配列を有している。 T A T Aボックスには植物細胞内 で転写を触媒する酵素である R NAポリメラーゼが転写を開始するために結合す る。 様々な制御配列にはこれらをターゲットとして、 転写因子と呼ばれる細胞内 の様々な蛋白質因子が特異的に結合する。 これらの転写因子が R NAポリメラー ゼの転写活性を促進又は抑制することによって遺伝子発現をコントロールする。 すなわち、 遺伝子発現はこれら制御配列の支配下にある。 これらの制御配列及び 転写因子は転写段階を介した遺伝子発現の誘導にも関与している。
形質転換のために植物に導入した遺伝子の発現誘導を時期及ぴ部位に関してコ ントロールすることは、 植物の生育にとつて不利となるような代謝産物も植物で 生産可能になるため利点が大きい。 このような目的のためにしばしば異種生物の 遺伝子発現誘導系の利用が試みられる。 植物内在の誘導系をそのまま利用するこ とは、 植物内の代謝系へ不測の影響を及ぼすおそれがあるからである。 しかし、 異種生物の遺伝子発現誘導系を植物に付与できるかどうかは自明ではない。
細菌のオペロン制御系に見られるインデューサー、 リプレツサー及びオペレ一 ターから成る制御系は主要な遺伝子発現誘導系の 1つである。 インデューサ一は 遺伝子発現を誘導する低分子化合物である。 リブレッサーはインデューサ一のレ セプター蛋白質である。 オペレータ一はリプレッサーのターゲットとなる制御配 列である。 インデューサ一とリブレッサーの結合、 及ぴリプレッサーとオペレー ターの結合はきわめて特異的であり親和性が高いが、 インデューサ一と結合した リプレッサーはオペレーターに結合できない。 オペレーターをプロモーターに含 有する、 すなわち、 オペレーターの支配下に置かれた遺伝子は、 インデューサー 低濃度下ではオペレーターに結合したリブレッサーのため発現が抑制されている (O F F ) I インデューサー濃度の増大に伴ってリブレッサーの離脱により発 現が誘導される （O N) 。
細菌のィンデューサー Zリプレッサー/オペレーター制御系を植物における遺 伝子発現の誘導方法として利用する試みが報告されている。 リプレッサー及ぴォ ペレ一ターの形質を植物に付与するため、 リプレッサー遺伝子及ぴオペレーター の支配下に置いた遺伝子の 2つの遺伝子を植物に導入する。 両遺伝子とも植物細 胞内で発現させるためには、 そのプロモーターは植物プロモーターであることが 望ましい。 オペレータ一は植物プロモーター中及び近傍に配置される。 プロモー ターを選ぶことで遺伝子発現強度や組織特異性等プ口モーターの様々な特性と遺 伝子発現誘導性との機能的な組み合わせが可能がある。 このように形質転換され た植物に,対しィンデューサーを投与することによって、 オペレーターの支配下に 置いた遺伝子の発現をィンデューサー投与部位において誘導する。 このようなィ ンデューサ一/リブレッサー オペレーター制御系の植物への付与に成功した例 として、 テトラサイクリン及ぴ I PTGをインデューサ一とする系に関する報告 がある 〔特開平 6 _ 3 3 9 3 84及び G a t z等， T r e n d s i n P 1 a n t S c i e n c e (1 9 9 8) ， 3， 3 5 2— 3 5 8〕 。 し力 し、 これまで に報告されている例で用いられたィンデューサー物質は環境安全性や使用コスト の点で実用性に問題がある。 発明の要約
本発明は上記現状に鑑み、 形質転換のために植物に導入した遺伝子の発現誘導 を時期及び部位に関してコントロールするための、 植物における遺伝子発現の誘 導方法を提供することを目的とする。
本発明は、 植物における遺伝子発現の誘導方法であって、 放線菌の自己調節因 子をィンデューサーとする遺伝子発現誘導系を構成するリブレツサー及びオペレ 一ターの形質を遺伝子導入により植物に付与し、 形質転換された植物に対し放線 菌自己調節因子を投与することによって、 オペレーターの支配下に置いた遺伝子 の発現を放線菌自己調節因子投与部位において誘導する方法である。
以下、 本発明を詳細に説明する。 発明の詳細な開示
放線菌は真正細菌に次いで高密度に土壌中に存在し、 抗生物質をはじめとする 多くの生理活性物質を生産する。 放線菌としては、 例えば、 ス トレプトミセス （ S t r e p t omy c e s) ノ禹、 M i c r omo n o s p o r a jhヽ A c t i n oma d u r aノ禹、 ¾ t r e p t o s p o r a n g i u mJh、 Ac t i n o 1 a n e s属、 No c a r d i a属、 S a c c h a r o p o l y s p o r a属等が 挙げられる。 放線菌の生理活性物質生産や形態分化は内因性微生物ホルモン様物 質、 すなわち、 自己調節因子によってコントロールされている。
これまでに知られている放線菌自己調節因子は、 ストレプトミセス ·グリセゥ ス (S t r e p t omy c e s g r i s e u s) の A因十 (A— f a c t o r ) 、 ストレプトミセス · / ージニァェ (S t r e p t omy c e s v i r g i n i a e) の/ ージニァェ ·ブタノライド (v i r g i n i a e b u t a n o 1 i d e ： VB) 及ぴストレプトミセス ·ラベンデュラエ （S t r e p t omy c e s l a v e n d u l a e) FR I— 5株の誘導物質 2 (I n d u c i n g Ma t e r i a l— 2) の 3種である 〔仁平， 醱酵工学会誌 （1991) ， 第 69卷， 89— 105〕 。
A因子は、 生産菌における抗生物質ストレプトマイシン （s t r e p t omy c i n) 生産及びストレプトマイシン耐性を誘導し、 分生胞子や気菌糸の形成も 誘導する。 VBは、 生産菌における抗生物質バージニアマイシン （v i r g i n i a my c i n) の 2種 (バージニアマイシン M及ぴバージニアマイシン S) の 生産を同時に誘導する。 誘導物質 2は、 生産菌における抗生物質生産の転換 （D 一サイクロセリン （D— c y c l o s e r i n e) からヌクレオシド型抗生物質 への転換） 、 及び、 炭素源、 窒素源が不十分な状態での青色色素生産を誘導する。 放線菌自己調節因子は他の生物種に見ら るホルモンゃフ: ロモン等と同様に、 その培養液中の濃度が極めて低い数 ηΜ—数 10 ηΜで活性を示す。
ストレブトミセス属放線菌の約 60%は自己調節因子を生産していると推定さ れており、 未知の自己調節因子はまだ数多く存在している可能性がある。
既知の放線菌自己調節因子は全て 2 _ (1 ' —オタソ又はヒドロキシアルキル ) 一 3—ヒドロキシメチループチ口ラタトン （2— (1， - 0 X ο又は h y d r o x y a l k y l — 3— hy d r o x yme t h y l— b u t y r o l a c t o n e) 骨格を共通に持つ。 このため、 既知の放線菌自己調節因子はプチ口ラタ トン型自己調節因子とも呼ばれる。 ラタトン環上の 2つの置換基は全て t r a n sの立体構造であり、 その絶対構造は 2 R及ぴ 3 Rである。 異なる点は 2位のァ ルキル側鎖、 6位がカルボニルか水酸基か、 及びその水酸基の配向が α (誘導物 質 2型） か β (VB型） かの 3点である。 VBには、 2位アルキル側鎖が異なる 5種 （A， B, C， D， E) の存在が知 られている。 人工的に合成した誘導体も活性を発揮する。 2位側鎖の構造は活性 の強弱に影響を与える。 ' 放線菌自己調節因子の構造は比較的簡単であるため、 その化学合成は容易であ る。 各々の因子の生産菌を大量に純粋培養しその培養液から各々の因子を分離精 製することも可能である。
A因子、 VB及ぴ誘導物質 2には各々生産菌内に各々のレセプター蛋白質の存 在が明らかになり、 各々 A r pA 〔On a k a等， J. B a c t e r i o l . ( 1995) , 1 77, 6083— 6092〕 、 8 & ^ 〔01^ 1110 1 0等， J. B i o l . Ch e m. (1 995) ， 270， 1 2319— 12326〕 及ぴ F a rA 〔Wa k i等， J. B a c t e r i o l . (1 997) , 179, 5 1 3 1— 5 137〕 と命名された。 各々 276個、 232個及ぴ 221個のアミノ酸 から成る。 いずれのレセプター蛋白質も N末端に DNA結合性を示すヘリックス 一ターン一ヘリックス ·モチーフが見られる。
例えば、 B a r Aのァミノ酸配列及びそれをコ一ドする塩基配列は各々配列番 号 1及ぴ 2で示される。
放線菌自己調節因子とそのレセプター蛋白質の特異的結合力はきわめて高く、 その解離定数 （Kd値） は、 例えば、 A因子 ZAr p Aの場合 0. 7 nM、 VB _C7ZB a r Aの場合 1. 1 nMである 〔仁平， 醱酵工学会誌 （1991) ， 第 69卷， 89— 105〕 。
例えば、 VBのレセプター蛋白質 B a r Aをコードする b a r A遺伝子の 3 ' 下流及び 5' 上流には、 b a r A遺伝子と共通の遺伝子発現誘導系に支配される と見られる b a r B及ぴ b a r Xと名付けられた遺伝子の存在が各々明らかにな つた。 これらの遺伝子がコードする蛋白質は現在のところ機能は明確でないが、 生産菌のバージニアマイシン生合成やパージ二アマイシン耐性、 あるいはそれら の制御系に関与すると思われる。
i n v i v o実験 〔K i n o s h i t a等， J. B a c t e r i o l . (1 997) , 1 79, 6986— 6993〕 の結果、 B a r Aは b a r A及ぴ b a r B各遺伝子のプロモーターに結合してこれらの遺伝子の転写を OFFにするリ プレッサーであり、 VBは B a r Aをプロモーターから離脱させることでこれら の遺伝子の転写を ONにするインデューサーであることが示された。 また、 i n v i t r o実験 〔K i n o s h i t a等， J. B a c t e r i o l . (1 99 9) , 181, 5075— 5080〕 の結果、 B a r Aが特異的に結合するター ゲット配列 （オペレーター） が b a r A及ぴ b a r B各遺伝子上で同定され、 B AREと命名された。 b a r A遺伝子プロモーターの BARE— 3 (26 b p) 、 b a r B遺伝子プロモーターの BARE— 1 ( 29 b p ) 及ぴ B AR E— 2 (2 8 b p) である。 例えば、 BARE— 3の塩基配列は配列番号 3で示される。
このように、 放線菌の自己調節因子は、 生産菌内において遺伝子発現誘導系に 関与することが明らかになった。 この遺伝子発現誘導系はインデューサー、 リブ レッサー及ぴオペレーターから成る。 放線菌自己調節因子、 放線菌自己調節因子 のレセプター蛋白質及ぴレセプター蛋白質のターゲット配列が各々インデューサ 一、 リプレッサー及ぴオペレータ一として機能する。
本発明では、 放線菌の自己調節因子をインデューサ一とする遺伝子発現誘導系 を構成するリプレッサー及びオペレーターの形質を遺伝子導入により植物に付与 する。 本発明で用いられる植物としては、 タバコ、 トウモロコシ、 ダイズ、 ナタ ネ、 ジャガイモ、 ヮタなどが挙げられる。
ここで言うリブレッサーの形質の付与とは、 リブレッサー遺伝子の導入による 植物の形質転換を意味する。 また、 オペレーターの形質の付与とは、 オペレータ 一の支配下に置いた遺伝子の導入による植物の形質転換を意味する。
すなわち、 本発明では、 放線菌自己調節因子のレセプター蛋白質の遺伝子及ぴ レセプター蛋白質のターゲット配列の支配下に置いた遺伝子の 2つの遺伝子を形 質転換のために植物に導入する。
放線菌自己調節因子のレセプター蛋白質 （リブレッサー） の遺伝子を形質転換 のために植物に導入するには、 レセプター蛋白質遺伝子のコード領域を、 植物で 機能するプロモーターの 3， 下流に連結し、 これを適当なプラスミド 'ベクター に組み这む。 ここで用いるプロモーターとしては、 植物プロモーターが好ましい。 例えば、 多くの種の植物で強力なプロモーター活性を発揮することが知られて いるカリフラワー ·モザイク · ウイノレス （Ca u l i f l owe r mo s a i c v i r u s ： C aMV) 35 Sプロモーターの利用は、 植物での強力で構成 的な遺伝子の発現に有効である。 この他の植物プロモーターとしては、 ァグロバ クテリゥム起源のォパイン （ノパリン、 ォクトピン、 マンノピン) 合成酵素遺伝 子プロモーター等が挙げられるが、 これに限定されることなく、 一般的な植物プ 口モーターを使用することができる。 例えば、 ァグロパクテリゥム感染法を用いる植物への遺伝子導入では、 バイナ リー ·ベクターと呼ばれるプラスミ ド ·ベクターに目的の遺伝子を組み込む。 バ イナリー ·ベクターは、 大腸菌内及びァグロバタテリゥム内複製系、 及び選択マ 一力一遺伝子に加えて、 植物細胞核染色体への遺伝子の組み込みに必須な R B及 び LBと呼ばれる 25 b pの塩基配列を保有する。 バイナリー ·ベクターの RB -LB間に挿入された遺伝子は、 植物細胞に導入されると効率良く核染色体に組 みこまれる。
例えば、 C aMV 35 Sプロモーターの 3， 下流に —ダルクロニダーゼ （ -g l u c u r o n i d a s e ： GUS) 遺伝子コード領域が連結された構造を 持つバイナリー 'ベクターである p B I 121 〔J e f f e r s on等， EMB O J . (1 98 7) ， 6， 3901— 3907〕 等の GUS遺伝子コード領域 を b a r A遺伝子のコード領域に変換することで、 放線菌自己調節因子 VBのレ セプター蛋白質 （リプレッサー） B a r Aの遺伝子を形質転換のために植物に導 入するためのバイナリー 'ベクターを構築できる。 例えば、 両端に制限酵素 B a mH I及ぴ S a c Iの認識部位を持つ b a r A遺伝子コード領域断片を準備すれ ば、 制限酵素 B a mH I及ぴ S a c Iの認識部位を介してバイナリー 'ベクター p B I 121の GUS遺伝子コード領域を b a r A遺伝子コード領域に変換でき る。 例えば、 配列番号 8及び 9で示される塩基配列から成る化学合成ォリゴ D N Aを各々 5' —及ぴ 3' — PCRプライマーとし、 配列番号 1で示される b a r A遺伝子を含むプラスミ ド p ET— p 26 k 〔Ok amo t o等， J. B i o l . C e m. (1995) , 270, 12319— 1 2326〕 を鎵型として P C Rを行えば、 両端に制限酵素 B a mH I及び S a c Iの認識部位を持つ b a r A 遺伝子コ一ド領域断片を得ることができる。
放線菌自己調節因子レセプター蛋白質のターゲット配列 （オペレーター） の支 配下に置いた遺伝子を形質転換のために植物に導入するには、 ターゲット配列を 植物で機能するプロモーターに配置し、 このように改変したプロモーターの 3' 下流に所望する任意の遺伝子のコード領域を連結し、 これを適当なプラスミ ド ' ベクターに組み込む。 ここで用いるプロモーターとしては、 植物プロモーターが 好ましい。
ターゲット配列 （オペレーター） はプロモーターの TATAボックスの 3， 下 流近傍又は 5 ' 上流近傍に配置することが望ましく、'複数配置する方が効果的で ある。
例えば、 バイナリー ·ベクター p B I 1 21等の C aMV 35 Sプロモーター に塩基配列 BAREを配置することで、 VBレセプター蛋白質 B a r Aのターグ ット配列 （オペレーター） BAREの支配下に置いた GUS遺伝子を形質転換の ために植物に導入するためのバイナリー .ベクターを構築できる。 GUS遺伝子 はそのコードする酵素の活性検出が容易であり植物内にホモログもないため、 植 物細胞内の遺伝子発現活性を実験で検出するためのレポータ一遺伝子として広く 利用される。 ターゲット配列 （オペレーター） のプロモータ1 "の配置は、 例え ば、 配置部位を挟んで適当な制限酵素認識部位がある場合には、'その制限酵素認 識部位間の塩基配列から成る 2本鎖 DN A断片を合成することで達成できる。 あ るいは化学合成ォリゴ D N Aを利用した部分特異的変異導入技術によっても可能 である。 例えば、 配列番号 3で示される BARE— 3を C aMV 35 Sプロモー ターの TATAボックスの 3， 下流近傍又は 5， 上流近傍に配置するには、 例え ば、 配列番号 4又は 5で示される塩基配列から成る 2本鎖 DNA断片を各々合成 すればよい。 例えば、 BARE— 3を C aMV 35 Sプロモーターの TATAボ ッタスの 3' 下流近傍及び 5' 上流近傍に配置するには、 例えば、 配列番号 6で 示される塩基配列から成る 2本鎖 DNA断片を合成すればよい。 例えば、 BAR E— 3を C aMV35 Sプロモーターの TAT Aボックスの 3 ' 下流近傍及ぴ 5 ' 上流近傍に多数配置するには、 例えば、 配列番号 7で示される塩基配列から成 る 2本鎖 DN A断片を合成すればよい。 例えば、 B ARE— 3を C aMV 35 S プロモーターの TAT Aボックスの 3 ' 下流近傍に 2個及ぴ 5， 上流近傍に 1個 配置されている配列番号 7で示される塩基配列から成る 2本鎖 DNA断片を合成 するには、 互いに 3' 末端が 1 6 b pにわたつて相補的な、 配列番号 10及び 1 1で示される塩基配列から成る化学合成オリゴ DNAを試験管内で混合後、 相補 末端をァニールさせる。 これに DNAポリメラーゼを添加し、 合成された 2本鎖 DNA断片を制限酵素 E c o RVと Xb a Iで処理後、 適当なプラスミ ド .ベタ ターにクローユングする。 '
本発明では、 以上のように構築したプラスミド .ベクターを形質転換のために 植物に導入する。
例えば、 ァグロバタテリゥム感染法を用いる植物への遺伝子の導入では、 以上 のように構築したバイナリー .ベクターの導入によりー且ァグロパクテリゥム · ッメファシェンス (Ag r o b a c t e r i um t ume I a c i e n s; 又 はァグロバタテリゥム · リゾゲネス （Ag r o b a c t e r i um r h i z o g e n e s) を形質転換する。 これには、 電気穿孔法等の方法が有効である。 こ の時に用いるァグロパクテリゥムは、 バイナリー ·ベクターの RB— LB間領域 を植物細胞核染色体へ組み込むのに必要な機能を保有している必要がある。 形質 転換されたァグロバクテリゥムはバイナリー ·ベクター中の選択マーカー遺伝子 の働きを利用して容易に選抜できる。 こうして所望する遺伝子を含有するバイナ リー ·ベクターを導入した形質転換ァグロパクテリゥムを植物へ感染させる。 こ のために、 植物組織片を形質転換ァグロパクテリゥムと共に培養する。 その後組 織片からカルスを誘導する。 この時、 選択マーカー薬剤に加えカルべニシリン （ c a r b e n i c i l l i n) 等のァグロバタテリゥムを殺すための抗生物質も 共存させる。 選択マーカー遺伝子には、 例えば、 カナマイシン （k a.n amy c' i n) 、 /ヽィグロマイシン (hy g r omy c i n) 、 フ レオマイシン (b 1 e omy c i n) 、 クロラムフエニコ一ノレ (c h l o r amp h e n i c o l) 等 の抗生物質に耐性を与える遺伝子が利用できる。 こうして得られる形質転換カル スを再生培地に置き、 植物を再生させることにより形質転換植物が得られる。 形 質転 m¾物の種子から形質転 m½物系統も得ることができる。
同様にして、 形質転換植物培養細胞も得ることができる。 ただし、 この場合、 力ルス形成や植物体の再生、 あるいは種子形成等のステップを経由する必要はな い。
植物への遺伝子導入法には、 ァグロバタテリゥム感染法以外にもプロトプラス トへ遺伝子を導入する電気穿孔法、 遺伝子銃を用いるパーティクル ·ボンバード メント法、 微細キヤピラリーを用いて遺伝子を直接細胞に注入するマイクロ ィ ンジェクシヨン法等があり、 本発明が提供する遺伝子発現誘導法の実施には、 い ずれの遺伝子導入法も利用可能である。
このようにして得られる形質転換植物において、 核染色体に挿入された遺伝子 及ぴ遺伝子産物の存在は P C R及ぴゥェスタン解析により各々容易に確かめるこ とができる。
放線菌自己調節因子のレセプター蛋白質 （リブレッサー） の遺伝子、 あるいは レセプター蛋白質のターゲット配列 （オペレーター） の支配下に置いた遺伝子の 導入により各々形質転換植物を得ることが可能であるが、 選択マーカー遺伝子を 違えたプラスミ ド ·ベクターを各々の形質転換に順次用いる方法ゃ両遺伝子を組 み込んだプラスミド ·ベクターを用いる方法により、 両遺伝子が導入された形質 転^ 物の取得が可能である。
本発明では、 このように形質転換された植物に対し放線菌自己調節因子を投与 することによって、 オペレーターの支配下に置いた遺伝子の発現を放線菌自己調 節因子投与部位において誘導する。
例えば、 放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調節因子 V Bをインデ ユーサーとする遺伝子発現誘導系を構成するリブレッサー B a r A (V Bのレセ プター蛋白質） 及ぴオペレーター B A R E— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1 つ） の形質を遺伝子導入によりタバコ及びタバコ培養細胞に付与し、 形質転換さ れたタバコ及ぴタバコ培養細胞に対し V Bを投与することによって、 B AR E— 3の支配下に置いた遺伝子の発現を V B投与部位において誘導することができた。 例えば、 V Bは 1 0 O n Mという低濃度で十分に B A R E— 3の支配下に置いた 遺伝子の発現を誘導することができた。 ' 放線菌自己調節因子は疎水性構造に加え分子量が概ね 2 0 0と比較的小さいた め細胞膜を容易に通過できる。 したがって、 植物内への速やかな吸収が望まれる インデューサ一として非常に適している。
放線菌自己調節因子は植物に対する毒性がない。 例えば、 V Bは 1 0 // Mの濃 度でも植物に対する毒性を示さない。
本発明では、 オペレーターの支配下に置く遺伝子の選択により、 有用な形質転 換植物の作出及ぴ形質転換植物の有効な利用が可能である。 例えば、 植物に稔性 形質を付与する遺伝子をオペレーターの支配下に置くことにより、 上記形質転換 された植物に対し放線菌自己調節因子を投与することで、 その植物の稔性をコン トロールすることができる。 このような植物は、 例えば、 形質転換のための宿主 として用いることで形質転換植物の自然環境への拡散を効率よく防ぐために利用 できる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 3において、 放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調 節因子 V Bをインデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成するリブレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） の形質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に 付与し、 形質転換されたタバコ培養細胞において B a r A蛋白貧が蓄積している かどうかをウェスタン 'ブロッテイング法により解析した結果を示す。
(符号の説明）
M：分子量マーカー
R：遺伝子組換え大腸菌を用いて作製し精製した B a r A蛋白質 1 0 n g 3 0 , 2 1， 2 7 ：得られた形質転換タバコ培養細胞クローンの識別番号
B ：タバコ培養細胞 B Y 2 .
T：得られた一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラスト （実施例 5 ) 矢印： B a r A蛋白質を表すバンドの位置 図 2は、 実施例 4において、 放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調 節因子 VBをィンデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成するリブレッサー B a r A (VBのレセプター蛋白質） 及ぴオペレーター B AR E— 3 (B a r Aの ターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与し、 形 質転換されたタバコ培養細胞に対し V Bを投与することによって、 BARE— 3 の支配下に置いた GU Sレポーター遺伝子の発現が誘導される力 どうかを調べた 結果を示す。
(符号の説明）
GUS s e c i f i c a c t i v i t y (グラフの縦軸） ： GUS遺伝子 発現活性の評価に用いた GUS比活性 （単位は [nmo 1 4MU/m i n/m g r o t e i n] )
30— 16, 30- 17, 30-23, 30— 35， 21-5, 21— 21， 2 1-22, 27- 1, 27_ 9 ：得られた形質転換タバコ培養細胞クローンの識 別番号
OFF (VB—） ： VB無添加時
ON (VB+) ： VB添加時 （VB— C6最終濃度： Ι μΜ) 図 3は、 実施例 5において、 放線菌ストレブトミセス 'バージニアェの自己調 節因子 VBをィンデユーザーとする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋白質） 及ぴオペレーター B AR E— 3 (B a r Aの ターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与し、 一 過的に形質転換されたタバコ培養細胞に対し V Bを投与することによって、 BA RE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうか を調べた結果 （その 1) を示す。
(符号の説明）
I n d u c t i o n r a t e (グラフの縦軸） ： VB添加時 （VB— C6最終濃 度： Ι μΜ, ON) の無添加時 （OFF) に対する GUS遺伝子発現活性の比 （ GUS遺伝子発現活性 （ON) ZGUS遺伝子発現活性 （OFF) ) で表した V Bによる遺伝子発現誘導活性
35 S ： BARE— 3の支配下にない GUSレポーター遺伝子を一過的な形質転 換に用いた場合
35 SD： BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラス ミド pCaMV35 SD— g u sを一過的な形質転換に用いた場合
35 SUDD： BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプ ラスミド pCaMV35 SUDD— g u sを一過的な形質転換に用いた場合 b a r A-： b a r A遺伝子を一過的な形質転換に用いなかった場合
b a r A+： b a r A遺伝子を一過的な形質転換に用いた場合 図 4は、 実施例 6において、 放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調 節因子 V Bをィンデューサーとする遺伝子発現誘導系を構成す.るリブレッサー B a r A (VBのレセプター蛋白質） 及ぴオペレーター B AR E— 3 (B a r Aの ターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与し、 一 過的に形質転換されたタバコ培養細胞に対し V Bを投与することによって、 BA RE- 3の支配下に置いた GU Sレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうか を調べた結果 （その 2) を示す。
(符号の説明）
I n du c t i o n r a t e (グラフの縦軸） ： V B添加時 （V B— C 6最終濃 度： Ι μΜ, ON) の無添加時 （OFF) に対する GUS遺伝子発現活性の比 （ GUS遺伝子発現活性 （ON) /GUS遺伝子発現活性 （OFF) ) で表した V Bによる遺伝子発現誘導活性
35 S ： BARE— 3の支配下にない GUSレポーター遺伝子を一過的な形質転 換に用いた場合
35 SU ; BARE— 3の支配下に置いた GU Sレポーター遺伝子としてプラス ミド pCaMV35 SU— gu sを一過的な形質転換に用いた場合
35 SD： BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラス ミド p CaMV35 SD— gu sを一過的な形質転換に用いた場合 35 SUD： BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラ スミ ド pC aMV35 SUD_g u sを一過的な形質転換に用いた場合
35 SUDD ： BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプ ラスミ ドp C aMV35 SUDD—g ^l sを一過的な形質転換に用いた場合 図 5は、 実施例 7において、 放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調 節因子 VBをインデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成するリブレッサー B a r A (VBのレセプター蛋白質） 及ぴオペレーター B AR E— 3 (B a r Aの ターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与し、 一 過的に形質転換されたタバコ培養細胞に対し低濃度の VBを投与することによつ て、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子の発現が誘導される かどうかを調べた結果を示す。
(符号の説明）
I n d u c t i o n r a t e (グラフの縦軸） ： VB添加時 （ON) の無添加 時 （OFF) に対する GUS遺伝子発現活性の比 （G US遺伝子発現活性 （ON ) /GUS遺伝子発現活性 (OFF) ) で表した VBによる遺伝子発現誘導活性 35 SD： BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラス ミド p CaMV35 SD— g u sを一過的な形質転換に用いた場合
0 nM： VB無添加時 （OFF)
10 nM： VB添加時 （ON, VB— C6最終濃度： 10 nM)
100 nM： VB添加時 （ON, VB— C6最終濃度： 100 nMM)
1000 nM： VB添加時 （ON， VB— C6最終濃度： 1000 nM= 1 juM) 図 6は、 実施例 10において、 放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己 調節因子 VBをィンデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） 及びオペレーター B AR E— 3 (B a r A のターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入によりタバコに付与し、 形質転換 されたタバコに対し VBを投与することによって、 BARE— 3の支配下に置い た GU Sレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうかを調べた結果を示す。
(符号の説明）
OFF (VB—） ： VB無添加時
ON (VB+) ： VB添加時 （VB— C6最終濃度： 1 zM) 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれら実施例 のみに限定されるものではない。
(実施例 1 )
放線菌ストレプトミセス ·バージニアェ （S t r e p t omy c e s v i r g i n i a e) の自己調節因子バージニアェ 'ブタノライド （V i r g i n i a e b u t a n o 1 i d e ： VB) をインデューサ一 する遺伝子発現誘導系を 構成するリブレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） の形質を遺伝子導入 により植物に付与する、 すなわち、 リブレッサー b a r A遺伝子を形質転換のた めに植物に導入するためのプラスミド ·ベクターを構築した。
このために配列番号 1で示される b a r A遺伝子を含有するプラスミ ド ρΈΤ - 26 k 〔Ok amo t o等， J. B i o l . C h e m. (1995) ， 27 0， 1 231 9— 12326〕 から、 b a r A遺伝子コード領域を P C Rにより クローニングした。 PCRの 5， 一及び 3' —プライマーには、 各々制限酵素 B amH I及ぴ S a c I認識配列を導入した各々配列番号 8及ぴ 9で示される塩基 配列から成る化学合成オリゴ DN Aを用いた。 PCRで増幅した断片を制限酵素 B amH Iと S a c Iで処理後、 クローニング用プラスミド .ベクター p B 1 u e s c r i p t l l SK (-) 〔ジェンバンク （Ge nB a nk) ァクセッ シヨン番号 X 52330〕 のマルチ 'クローニング領域内制限酵素 B a mH I認 識部位一 S a c I認識部位間に挿入した （プラスミ ド p b a rA) 。 b a r A遺 伝子コード領域が正しくクローユングされたことをシーケンシングにより確認し た。 ' カリフラワー ·モザイク · ウイノレス （C a u l i f l owe r mo s a i c v i r u s ： C aMV) 35 Sプロモーターの 3， 下流に i3—グ 7レクロニダ一 ゼ — g l u c u r o n i d a s e ： GUS) 遺伝子コード領域が連結された 構造を持ち選択マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を有するバイナリ 一 ·ベクター p B I 121 [J e f f e r s o n等， EMBO J . (1987 ) , 6, 3901— 3907〕 から制限酵素 B a mH Iと S a c Iの処理により、 GUS遺伝子コード領域を含む制限酵素 B a mH I— S a c I断片を除去し、 残 つたベクター断片に、 プラスミ ド p b a r Aから制限酵素 B a mH Iと S a c I の処理により切り出した b a r A遺伝子コード領域を含む制限酵素 B a mH I一 S a c I断片をライゲーションした （バイナリー ·ベクター p B I C aMV 35 S - b a r A) 。
リプレッサー b a r A遺伝子を一過的な形質転換のために植物に導入するため のプラスミ ド 'ベクターも構築した。 タバコのアルコーノレ脱水素酵素 （N i c o t i a n a t a b a c u m a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ： N tADH) のプロモーターの 3' 下流に GUS遺伝子コード領域が連結された 構造を持つプラスミド N t ADHp—GUS 〔Na g a y a等， J. B i o s c i . B i o e n g. (2000) ， 89, 231— 235〕 を材料にした。 この プラスミ ドの N t ADHプロモーターはタバコで非常に強力なプロモーター活性 を発揮することが知られている。
プラスミド N t ADHp— GUSから制限酵素 B a mH Iと S a c Iの処理に より、 GUS遺伝子コード領域を含む制限酵素 B a mH I— S a c I断片を除去 し、 残ったベクター断片に、 プラスミド p b a r Aから制限酵素 B amH Iと S a c Iの処理により切り出した b a r A遺伝子コード領域を含む制限酵素 B a m H I— S a c I断片をライゲーシヨンした （プラスミド p N t ADH— b a r A ) 。
プラスミド N t ADHp— GUSから制限酵素 B a mH Iと S a c Iの処理に より、 GU S遺伝子コード領域を含む制限酵素 B amH I -S a c I断片を除去 し、 残ったベクター断片の末端を平滑処理後ライゲーシヨンした （プラスミド ρ N t ADHA B S)。
組換え DN A実験の宿主には大腸菌 DH 5 α¾ C s u pE44, Δ 1 a cUl 69 (φ 80, 1 a c Z ΔΜ1 5) , h s d R 1 7, r e cAl, e n d A 1 , g y r A 96, t h i— 1， r e 1 A 1〕 を用いた。 方法は標準法 ！: M o 1 e c u 1 a r C l o n i n g, Ma n i a t i s等， 1 982, Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, Co l d S p r i n g Ha r b o r, N. Y. 〕 にしたがった。
PCRには KOD DNAポリメラーゼ 〔東洋紡績 （株） 〕 を用い、 条件はそ のマエュアルにしたがつた。
シーケンシングは、 シーケンサー 〔ピー ·ィ一 'バイオシステムズ 'ジャパン (株） AB I PR I SM 310 Ge n e t i c An a l y z e r] を 用いて実施した。
(実施例 2)
放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するオペレーター BARE— 3 (VBのレセプタ 一蛋白質 B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により植物に付 与する、 すなわち、 オペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポータ 一遺伝子を形質転換のために植物に導入するためのプラスミ ド ·ベクターを構築 した。
BARE— 3は、 C aMV 35 Sプロモーターの TATAボックスの 3， 下流 近傍に 2個及び 5' 上流近傍に 1個配置した。
このために、 C aMV 35 Sプロモーターの TATAボックス （5' — TAT ATAA-3 ' ) を含む制限酵素 E c oRV— Xb a I断片 （CaMV35 Sプ 口モーター 871 b pの 762番目の塩基から 871番目の塩基までの断片） で、 TATAボックスの 5'·上流 2番目の塩基から 27番目の塩基までの 26 b pと TATAボックスの 3 ' 下流 2番目の塩基から 27番目の塩基までの 26 b pが 各々配列番号 3で示される BARE— 3 (26 b p) に置換され、 更に TATA ボックスの 3， 下流 2 7番目の塩基と 2 8番目の塩基の間に BARE— 3 (2 6 b p) が挿入された、 配列番号 7で示される塩基配列から成る 2本鎖 DNA断片 を合成した。 互いに 3 ' 末端が 1 6 b pにわたつて相補的な配列番号 1 0及ぴ 1 1で示される塩基配列から成る化学合成オリゴ DNAを、 各々 l O O pmo 1ず つ 1 0 μ 1の ΤΕ溶液に混合し 9 5°Cに 3分間保持後、 室温まで冷却した。 この 溶液 2 μ 1に大腸菌 DNAポリメラーゼ Iクレノー断片 （K 1 e n o w f r a gm e n t ) を加え全量を 4 0 1とした反応液を 3 7°Cに 3 0分間保持し、 フ 'ェノール /ク口口ホルム処理により酵素を失活させた反応液のエタノール沈殿物 を 5 ju 1の TE溶液に溶かした。 この溶液 2 μ 1に制限酵素 E c o RVと X b a Iを作用させて得られた制限酵素 E c o RV— X b a I断片をクローニング用プ ラスミド 'ベクター p B l u e s c r i p t l l S K (一） のマルチ 'クロー ニング領域内制限酵素 E c o RV認識部位一 X b a I認識部位間に挿入した （プ ラスミド p B ARE 3UDD) 。 B AR E— 3が正しく配置されたことをシーケ ンシングにより確認した。
BARE— 3が TATAボックスの 3 ' 下流近傍に 2個及ぴ 5 ' 上流近傍に 1 個配置されている構造の C a MV 3 5 Sプロモーターを構築するために、 C aM V 3 5 Sプロモーターの 3， 下流に GUS遺伝子コード領域が連結された構造を 持つプラスミ ド p B I 2 2 1 [ J e f f e r s o n等， EMBO J . ( 1 9 8 7) , 6， 3 9 0 1— 3 9 0 7〕 から制限酵素 H i n d I I Iと E c o RVの処 理により切り出した C a MV 3 5 Sプロモーターの 1番目の塩基から 7 6 1番目 の塩基までの断片をプラスミ ド p B ARE 3 UDDの制限酵素 H i n d I I I認 識部位一 E c o R V認識部位間に揷入した （プラスミ ド p C a MV 3 5 SUDD
) o
C aMV 3 5 Sプロモーターの 3， 下流に GUS遺伝子コード領域が連結され た構造を持ち選択マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子も有するバ イナリー 'ベクター p B I 1 0 l HmB 〔N a k a y a m a等， P l a n t P h y s i o 1 . (20 0 0) , 1 2 2, 1 2 3 9— 1 24 7〕 から制限酵素 H i n d I I Iと X b a Iの処理により、 C aMV 3 5 Sプロモ"ターを含む制限酵 素 H i n d I I I—Xb a I断片を除去し、 残ったベクター断片に、 プラスミド p C aMV 35 S UDDから制限酵素 H i n d I I Iと X b a Iの処理により切 り出した、 BARE— 3が TATAボックスの 3 ' 下流近傍に 2個及び 5， 上流 近傍に 1個配置されている構造の C aMV 35 Sプロモーターを含む制限酵素 H i n d I I I -Xb a I断片をライゲーシヨンした （バイナリー 'ベクター p B I C aMV 35 SUDD- g u s ) 。
オペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子を一過的 な形質転換のために植物に導入するためのプラスミド ·ベクターも構築した。
BARE— 3は、 C aMV 35 Sプロモーターの TATAボックスの 3 ' 下流 近傍に 2個及び 5 ' 上流近傍に 1個配置した。
プラスミド p B I 221から制限酵素 H i n d I I Iと X b a Iの処理により、 C aMV 35 Sプロモーターを含む制限酵素 H i n d I I I -Xb a I断片を除 去し、 残ったベクター断片に、 プラスミド p C aMV 35 SUDDから制限酵素 11111 (1 1 1 1と 13 & 1の処理により切り出した BARE— 3を TATAボッ タスの 3' 下流近傍に 2個及び 5' 上流近傍に 1個配置されている構造の C a M V 35 Sプロモーターを含む制限酵素 H i n d I I I -Xb a I断片をライゲー シヨンした （プラスミ ド p C aMV 35 SUDD- g u s ) 。
同様にして、 BARE— 3が TATAボックスの 3' 下流近傍に 1個配置され ている配列番号 4で示される構造、 TATAボックスの 5， 上流近傍に 1個配置 されている配列番号 5で示される構造、 及ぴ TATAボックスの 3' 下流近傍及 び 5， 上流近傍に 1個ずつ配置されている配列番号 6で示される構造の C a MV 35 Sプロモーターを各々持つプラスミ ド ·ベクターも構築した （プラスミ ド p C aMV 35 SD— g u s、 C aMV 35 SU— g u s及び p C a MV 35 S UD- g u s) 。
(実施例 3)
放線菌ストレプトミセス 'パージ-ァェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） の形質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与した。 すなわち、 リプレ ッサー b a r A遺伝子を形質転換のためにタバコ培養細胞に導入した。
遺伝子導入にはァグロパクテリゥム （Ag r o b a c t e r i urn) 感染法を 用いた。 b a r A遺伝子の導入により一旦ァグロバタテリゥムを形質転換し、 得 られた形質転換ァグロパクテリゥムをタバコ培養細胞へ感染させた。
ァグロパクテリゥムへの遺伝子導入には電気穿孔法を用いた。 ァグロパクテリ ゥム ·ッメファシエンス (Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n s ) EHA 101株 〔E l i z a n b e t h等， J. B a c t e r i o l . (1 986) , 1 68， 1291— 1 301〕 のコンビテント .セル 50 μ 1を b a r A遺伝子 （実施例 1， パイナリー 'ベクター: B I Ca MV 35 S— b a r A ) 200 n gと混合しジーン 'パルサー 〔日本バイオ 'ラッド 'ラボラトリーズ (株） 〕 のキュベット （電極間距離が 2 mm) に移した。 電圧 2. 5 kV、 静電 容量 25 μ FD及ぴ抵抗 400 Ωに設定したパルスをキュべット電極間に発生さ せた。 パルス発生時の時定数は約 10ミリ秒であった。 パルスを負荷したキュべ ッ トの内容物全量を、 10 Omg/ 1のカナマイシン （k a n amy c i η) を 含む LB培地寒天プレートに塗布し、 このプレートを 30°Cの暗所に静置した。 2日後にプレート上に形成したコロニーを、 10 Omg/ 1のカナマイシンを含 む 5 m 1の L B培地を用いて、 30 °Cの暗所で 2日間振盪培養した。 この培養液 を形質転換ァグロバクテリウム培養液とした。
得られた形質転換ァグロパクテリゥムをタバコ培養細胞 B Y 2 (理化学研究所 ジーン ·バンク （R I KEN Ge n e B a n k ) 植物細胞開発銀行 （ P 1 a n t C e l l B a n k) RP C番号 1) 〔Na g a t a等， Me t h o d s E n z ymo 1. (1987) , 148， 34— 39〕 へ感染させた。 タバコ 培養細胞 B Y 2は、 改変 L S培地 〔Na g a t a等， Me t h o d s En z y mo 1. (1 987) ， 148, 34— 39〕 を用いた 27。Cの喑所での振盪培 養により約 1/50希釈一約 1週間周期で継代し、 対数増殖期 （継代後 3— 5日 目） の細胞をァグロバタテリゥムの感染に用いた。 タバコ培養細胞 BY2を含む 培養液 5m 1を、 形質転換ァグロパクテリゥム培養液 100 μ 1と混合しシヤー レに移し、 このシャーレを 25°Cの喑所に静置した。 2日後、 シャーレ内容物か ら遠心分離によりァグロパクテリゥムを除去し、 残ったタバコ B Y 2細胞を 2— 3m lの改変 L S培地に懸濁後、 カナマイシン （k a n a my c i n) 100m gZ 1及ぴカルべ-シリン （c a r b e n i c i 1 1 i n) 25 Omg/ 1を含 む改変 L S培地ゲランガム 'プレートに塗布し、 このプレートを 25°Cの暗所に 静置した。 2— 3·週間後にプレート上に形成したカルスを分離、 形質転換タバコ 培養細胞としてカナマイシン及ぴカルべニシリン存在下で継代維持した。
このようにして得られた形質転換タバコ培養細胞においてリプレッサー B a r A蛋白質が蓄積しているかどうかをウェスタン ·ブロッティング法により解析し た。
形質転換タバコ培養細胞を適当な細胞抽出用緩衝液 （例えば、 0. 1M KP 04， 2mM EDTA, 5%グリセロール， 2 mM DTT, H 7. 8) に 懸濁し、 超音波発生装置 〔 （株） トミ一精ェ Ha n d y S o n i c UR— 20 P〕 を用いて破砕した。 細胞破砕液を高速遠心分離して得られた上澄みを細 胞抽出液とした。 細胞抽出液の蛋白質濃度 （mg/m l) は、 プラットフォード の方、法 [B r a d f o r dの An a 1. B i o c h e m. (1976) 、 72、 248 -254] により測定した。 蛋白質 20 μ g/レーンに相当する細胞抽出 液を SDS— PAGE (12. 5%ポリアクリルァミ ド ·ゲル） で分離後、 P V DFメンプレン 〔日本バイオ 'ラッド 'ラボラトリーズ （株） 〕 に転写し、 抗体 に反応させた。 1次抗体にはゥサギ抗 B a r A抗体 〔Na k a n o等， J. B a c t e r i o l . (1998) ， 180， 3317— 3322〕 、 2次抗体には ァノレ力リ ·フォスファターゼ （a l k a l i n e p h o s p h a t a s e) 標 識ャギ抗ゥサギ I gG抗体を各々用いた。 各反応及び洗浄は 3%のスキム · ミル ク存在下で行った。 最後にアルカリ ·フォスファターゼ反応液 （0. 01 7% 5—ブロモ一4一クロ口一 3—インドリノレ' リン酸 p—トルイジン （5— b r omo— 4— c h l o r o— 3— i n d o l y l p h o s p h a t e p— t o 1 u i d i n e s a l t) , 1 p m ニトロ 'ブルー 'テトラゾリゥム （ n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m) 、 100 mM T r i s— H C l、 l O OmM Na C l、 5 mM MgC l 2、 pH9. 5) にメンブレンを 浸し、 メンブレンに発色するバンドを検出した。 遺伝子組換え大腸菌を用いて作 製し精製した B a r A蛋白質 10 n gを対照サンプルに用いた。
この結果、 いくつかの形質転換タバコ培養細胞クローンで B a r A蛋白質の蓄 積を確認した （図 1) 。
(実施例 4)
放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） 及ぴオペレーター BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形 質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与した。 すなわち、 リブレッサー b a r A遺伝子及びオペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺 伝子の 2つの遺伝子を形質転換のためにタバコ培養細胞に導入した。
b a r A遺伝子 （実施例 1， バイナリー 'ベクター p B I C a MV 35 S— b a r A) をタバコ培養細胞 B Y 2に導入し、 得られた形質転換タバコ培養細胞 （ 実施例 3) のうち、 ウェスタン解析から B a r A蛋白質を比較的高蓄積している と思われるクローン （図 1に示した 30番及ぴ 21番） 及ぴ B a r A蛋白質を少 量しか蓄積していないと思われるクローン （図 1に示した 27番） に、 更に、 B ARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子 （実施例 2， バイナリー . ベクター p B I C aMV35 SUDD_g u s) を導入した。 遺伝子導入には実 施例 3と同様にァグロパクテリゥム感染法を用いた。 形質転換タバコ培養細胞は、 ハイグロマイシン (hy g r omy c i n) 2 Om g/ 1 , カナマイシン (k a n a my c i n) l O OmgZl及ぴカノレべ二シリン (c a r b e n i c i 1 1 i n) 25 Omg/1を含む改変 L S培地で選択、 継代維持した。
このようにして得られた形質転換タバコ培養細胞に対しインデューサー VBを 投与することによって、 オペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポ 一タ一遺伝子の発現が誘導される力 どうかを調べた。
形質転換タバコ培養細胞を、 改変: LS培地を用いた 27°Cの暗所での振盪培養 により約 1 Z 25希釈一約 1週間周期で継代し、 継代時に V Bを添加後 4日間培 養した細胞から調製した細胞抽出液の G U S遺伝子発現活性 （単位蛋白質量当た りの GUS活性、 すなわち、 GUS比活性を用いて評価） を VB無添加のそれと 比較した。 VBの添加は、 VB— C6 〔仁平， 醱酵工学会誌 (1991) ， 第 69 卷， 89— 105〕 原液 （l OmgZmlメタノール溶液） を水で 1 Z 50に希 釈したものを培地に 1 1000容量加えることで実施した （VB— C6最終濃度 ：約 1 μ M) 。 細胞懸濁液 1 m 1から、 遠心分離により上澄みを除いた細胞を 5 00 1の細胞抽出用緩衝液 （5 OmM NaH2 P04/Na 2HP04, 1 OmM EDTA, 10 mM 2—メルカプト 'エタノール， pH7) に懸濁し 超音波発生装置 〔 （株） トミー精ェ Ha n d y S o n i c UR— 20 P〕 を用いて破碎した。 細胞破静液を高速遠心分離して得られた上澄みを細胞抽出液 とした。 細胞抽出液の蛋白質濃度 （mgZm l) は、 ブラッドフォードの方法に より測定した。 細胞抽出液の GUS活性 〔J e f f e r s o n等， EMBO J. (1 987) , 6 , 3901— 3907〕 は、 GU Sの基質として 1 mMの 4— メチノレゥンベリフェリノレ一 β一 D—グノレクロ-ド （4一 m e t hy l umb e l 1 i f e r y l— i3— D— g l u c u r o n i d e ： 4 MUG) を細胞抽出液に 加えた時に 37 °Cにおける GUSの酵素反応により単位時間当たりに生成する蛍 光色素 4ーメチノレゥンベリフエロン （4— me t hy l umb e l l i f e r o n e ： 4MU) の量で評価した。 反応生成物 4 MUの定量は波長 365 nmの励 起光による波長 455 nmの蛍光を測定することで行レ、、 標準物質 4MUを用い て作成した検量線から GUS活性 （nmo 1 4MU/m i n/ml ) を算出し た。 同一の実験条件における 3つの独立した実験で得られた GUS比活性 （GU S s p e c i f i c a c t i v i t y [nmo 丄 4 MU mi n /m g r o t e i n] ) の平均値を当該実験条件の GU S遺伝子発現活性とした。
この結果、 多くの形質転換タバコ培養細胞クローンで、 GUS遺伝子発現活性 は VB— C6添加時 （ON (VB+) ) の方が無添加時 （OFF (VB—） ) より 高く、 VBによる GUS遺伝子の発現誘導を観察できた （図 2) 。 b a r A遺伝 子 (実施例 1 , バイナリー 'ベクター pB I C aMV35 S— b a r A) のタバ コ培養細胞 BY 2への導入により得られた、 B a r A蛋白質を比較的高蓄積して いると思われる形質転換タバコ培養細胞クローン （実施例 3， 図 1に示した 30 番及び 21番） に、 更に、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝 子 （実施例 2, バイナリー 'ベクター p B I C aMV 35 SUDD— g u s ) を 導入して得られた形質転換タバコ培養細胞クローンのいくつか （クローン 30番 由来の 30— 16番， 30— 1 7番， 30— 23番及ぴ 30— 35番、 及びクロ ーン 21番由来の 21—5番， 21— 21番及ぴ 21—22番） では、 VB— C6 添加時 （ON) の無添加時 （OFF) に対する GUS遺伝子発現活性の比 （GU S遺伝子発現活性 （ON) ZGUS遺伝子発現活性 （OFF) ) 、 すなわち、 V Bによる遺伝子発現誘導活性 （I n d u c t i o n r a t e) は最大で約 30 (I n du c t i o n r a t e≤ 30) であった。 b a r A遺伝子 （実施例 1， バイナリー 'ベクター p B I C aMV 35 S- b a r A) のタバコ培養細胞 BY 2への導入により得られた、 B a r A蛋白質を少量しか蓄積していないと思われ る形質転換タバコ培養細胞クローン （実施例 3, 図 1に示した 27番） に、 更に、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子 （実施例 2， バイナリー •ベクター p B ί C aMV 35 SUDD- g u s ) を導入して得られた形質転換 タバコ培養細胞クローンのいくつ力 （27— 1番及ぴ 27— 9番） では、 VBに よる遺伝子発現誘導活性は 2未満 （I n d u c t i o n r a t e < 2) であつ た。 このように、 形質転換タバコ培養細胞内に蓄積する B a r A蛋白質の量が多 くなるに伴つて V Bによる遺伝子発現誘導活性は大きくなつた。
このように、 放線菌自己調節因子 VBをインデューサ一とする遺伝子発現誘導 系を構成するリプレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） 及びオペレータ 一 BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により タバコ培養細胞に付与し、 形質転換されたタバコ培養細胞に対し VBを投与する ことによって、 BARE— 3の支配下に置いた遺伝子の発現を VB投与部位にお いて誘導することができた。
(実施例 5) 放線菌ストレプトミセス ·バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリブレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） 及ぴオペレーター BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形 質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与した。 すなわち、 リブレッサー b a . r A遺伝子及ぴオペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺 伝子の 2つの遺伝子を一過的な形質転換のためにタバコ培養細胞に導入した。
遺伝子導入には電気穿孔法を用いた。 そのために、 タバコ培養細胞をプロトプ ラス ト化処理した。 タバコ培養細胞 BY 2を、 改変 L S培地を用いた 2 7°Cの暗 所での振盪培養により、 約 1 5 0希釈一約 1週間周期で継代し、 対数増殖期 ( 継代後 3〜 5日目） の細胞を酵素液 （ 0. 1 %ぺクトリァーゼ Y 2 3 〔 （株） ャ クルト〕 ， 1 %セルラーゼ "オノズカ" R S 〔キッコーマン （株） 〕 ， 0. 4M マンニトール， p H 5. 5) に懸濁した。 3 0°Cで 2— 3時間酵素反応を進行さ せ、 途中の 1 5分毎のピペッティングにより細胞を分散させた。 球形の細胞がほ ぼ完全に分散していることを顕微鏡で確認し、 この状態の細胞をプロトプラスト として遺伝子導入に用いた。 ·プロトプラストを 0. 4Mマンニホールで洗浄後、 電気穿孔用緩衝液 （5mM 2 - (N—モルホリノ） エタンスルホン酸 （2— （ N— m o r p h o l i n o) e t h a n e s u l f o n i c a c i d : ME S) ， 7 OmM KC 1 , 0. 3Mマンニトール） に 3 X 1 06/m 1の細胞密度 で懸濁した。 b a r A遺伝子 （実施例 1、 プラスミ ド p N t ADH— b a r A) 5 0 /i g、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子 （実施例 2、 プラスミド p C aMV 3 5 SUDD- g u s及び p C aMV 3 5 SD- g u s ) 5 μ g及ぴ遺伝子導入をモニターするためのルシフェラーゼ （ 1 u c i f e r a s e ： LUC) 遺伝子 （プラスミド p C aMV 3 5 S- 1 u c [M i l i a r等、 P l a t Mo l . B i o l . R e p . ( 1 9 9 2) 、 1 0、 3 24— 3 3 7 ] ) 1 μ gをプロトプラスト懸濁液 5 0 0 μ 1と完全混合しジーン ·パルサー 〔 日本バイオ · ラッド .ラボラトリーズ （株） 〕 のキュべット （電極間距離が 4 m m) に移した。 電圧 20 0 V、 静電容量 2 5 0 μ F及び抵抗 4 0 0 Ωに設定した パルスをキュべット電極間に発生させた。 パルス発生時の時定数は 1 5— 2 0ミ リ秒であった。 パルスを負荷したキュべットからすばやくプロトプラストをシャ ーレ （直径 6 cm) に移し、 これに 4. 5m lの培地 （改変 LS培地， 10 gZ 1ショ糖， 0. 4 Mマンニトール） を加えた。
このようにして得られた一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラストに対し インデューサー VBを投与することによって、 オペレーター BARE— 3の支配 下に置いた GU Sレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうかを調べた。
シャーレ内の一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラストの培養液に VBを 添カ卩 （VB— C6最終濃度： 1 μΜ) し、 20時間 25 °Cの暗所に静置したプロト プラストから調製した細胞抽出液の GUS遺伝子発現活性 （LUC活性に対する GUS活性の比、 すなわち、 GUS/LUC値を用いて評価） を VB無添加のそ れと比較した。 VBの添加は実施例 4と同様に行った。 シャーレから回収し、 遠 心分離により上澄みを除いたプロトプラストを 500 μ 1の細胞抽出用緩衝液 ( 0. 1M ΚΡ04, 2mM EDTA, 5%グリセロール， 2 mM DTT, pH7. 8) に懸濁し、 超音波発生装置 〔 （株） トミー精ェ Ha n d y S o n i c UR— 20 P〕 を用いて破碎した。 細胞破砕液を高速遠心分離して得ら れた上澄みを細胞抽出液とした。 細胞抽出液の GUS活性 （nmo l 4MU/ m i n/ml) は実施例 4と同様に測定した。 細胞抽出液の L U C活性は、 L U Cの基質として 470 μΜのルシフェリン （l u c i f e r i n) 〔東洋ィンキ 製造 （株） ピツカジーン〕 を含む 100 μ 1の細胞抽出用緩衝液に 20 μ 1の 細胞抽出液を室温で混合し、 直ぐにルミノメーター 〔ベルトールド研究所 （ドィ ッ） Luma t LB 950 1〕 を用いて測定した 10秒間の発光量で評価し た。 ルシフェラーゼ標品を用いて作成した検量線から LUC活性 （pmo 1 L UC/m l) を算出した。 同時に調製したプロトプラストを用いた同一の実験条 件における 3つの独立した実験で得られた GUS/LUC値 （nmo 1 4MU /m i n/pmo 1 LUC) の平均値を当該実験条件における GUS遺伝子発 現活性とした。
この結果、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラ スミ ド p C aMV 35 SUDD— g u s及ぴ p C a MV 35 SD— g u sのいず れを一過的な形質転換に用いても、 GUS遺伝子発現活性は VB— C6添加時 （O N) の方が無添加時 （OFF) より高く、 VBによる GUS遺伝子の発現誘導を 観察できた （図 3 ) 。 V Bによる遺伝子発現誘導活性 （I n d u c t i o n r a t e= GUS遺伝子発現活性 （ON) ノ GUS遺伝子発現活性 （OFF) ) は、 各々 I n d u c t i o n r a t e = 5 (図 3 , b a r A + , 35 SUDD) , 及び I n d u c t i o n r a t e = 2 (図 3， b a r A + , 35 SD) であつ た。 このように、 BARE— 3の数が多くなるに伴って VBによる遺伝子発現誘 導活性は大きくなつた。 これに対し、 b a r A遺伝子を一過的な形質転換に用い なかった （b a r A遺伝子を含有しない対照プラスミド ^^ 011厶83をー 過的な形質転換に用いた） 場合 （図 3， b a r A-) 、 及ぴ BARE— 3の支配 下にない GUSレポーター遺伝子 （BARE— 3を含有しない対照プラスミ ド p B I 221) を一過的な形質転換に用いた場合 （図 3, 35 S) は、 いずれも V Bによる遺伝子発現誘導活性は観察されなかった （I n d u c t i o n r a t e = l)。
実施例 3と同様のウェスタン .プロッティング法による解析の結果、 得られた 一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラストでリプレッサー B a r A蛋白質の 蓄積を確認した （図 1， T)。
このように、 放線菌自己調節因子 V Bをィンデューサーとする遺伝子発現誘導 系を構成するリプレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） 及ぴオペレータ 一 BARE— 3 (B.a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により タバコ培養細胞に付与し、 一過的に形質転換されたタバコ培養細胞に対し V Bを 投与することによって、 BARE— 3の支配下に置いた遺伝子の発現を VB投与 部位において誘導することができた。 (実施例 6)
放線菌ストレプトミセス ·バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） 及ぴオペレーター BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形 質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与した。 すなわち、 リブレッサー b a r A遺伝子をタバコ培養細胞に導入し、 得られた形質転換タバコ培養細胞に、 更 に、 オペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子を一過 的な形質転換のために導入した。
b a r A遺伝子 （実施例 1， バイナリー ·ベクター p B I C a MV 35 S— b a r A) のタバコ培養細胞 BY 2への導入により得られた、 B a rA蛋白質を比 較的高蓄積していると思われる形質転換タバコ培養細胞クローン （実施例 3、 図 1に示した 21番） に、 更に、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター 遺伝子 （実施例 2, プラスミド p C aMV 35 SUDD- g u s , p C aMV 3 5 SD- g u s , p C aMV 35 SU— g u s及び p C aMV 35 SUD— g u s) を一過的な形質転換のために導入した。 BARE— 3の支配下に置いた GU Sレポーター遺伝子の導入は実施例 5と同様に行った。 遺伝子導入効率をモニタ 一するため、 ルシフェラーゼ遺伝子 （プラスミ ド p C aMV 35 S- 1 u c) も 併せて一過的形質転換に用いた。
このようにして得られた一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラストに対し ィンデューサー VBを投与することによって、 オペレーター BARE— 3の支配 下に置いた GU Sレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうかを調べた。
実施例 5と同様に、 シャーレ内の一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラス トの培養液に VBを添加 （VB— C6最終濃度： Ι μΜ) し、 20時間25°(：の喑 所に静置したプロトプラストから調製した細胞抽出液の GUS遺伝子発現活性 （ LUC活性に対する GUS活性の比、 すなわち、 GUSZLUC値を用いて評価 ) を VB無添加のそれと比較した。
この結果、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラ スミ ド p C aMV 35 SUDD— g u s , p C aMV 35 SD-gu s, p C a MV 35 SU- g u s及ぴ p C aMV 35 SUD- g u sのいずれを一過的な形 質転換に用いても、 GUS遺伝子発現活性は VB— C6添カ卩時 （ON) の方が無添 加時 （OFF) より高く、 VBによる GUS遺伝子の発現誘導を観察できた （図 4) 。 V Bによる遺伝子発現誘導活性 （I n d u c t i o n r a t e =GUS 遺伝子発現活性 （ON) ZGUS遺伝子発現活性 （OFF) ) は、 各々 I n d u c t i o n r a t e = 22 (図 4， 35 SUDD) , I n d u c t i o n r a t e 4 (図 4, 35 SD) , I n d u c t i o n r a t e 2 (図 4， 3 5 SU) ， 及び I n d u c t i o n r a t e = 1 3 (図 4, 35 SUD) であ つた。 このように、 BARE— 3の数が多くなるに伴って VBによる遺伝子発現 誘導活性は大きくなつた。 BARE— 3の位置は TATAボックスの 3， 下流近 傍の方が 5， 上流近傍より VBによる遺伝子発現誘導活性は大きかった。 これに 対し、 BARE— 3の支配下にない GUSレポーター遺伝子 （BARE— 3を含 有しない対照プラスミド pB I 221) を一過的な形質転換に用いた場合 （図 4， 35 S) は、 VBによる遺伝子発現誘導活性は観察されなかった （I n d u c t i o n r a t e = l) 。
このように、 放線菌自己調節因子 V Bをィンデューサーとする遺伝子発現誘導 系を構成するリプレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） 及ぴオペレータ 一 BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により タバコ培養細胞に付与し、 一過的に形質転換されたタバコ培養細胞に対し VBを 投与することによって、 BARE— 3の支配下に置いた遺伝子の発現を VB投与 部位において誘導することができた。
(実施例 7)
放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） 及びオペレーター BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形 質を遺伝子導入によりタバコ培養細胞に付与し、 一過的に形質転換されたタバコ 培養細胞に対し低濃度のインデューサー VBを投与することによって、 オペレー ター BARE— 3の支配下に置いた GU Sレポーター遺伝子の発現が誘導される かどうかを調べた。
実施例 6と同様に、 b a rA遺伝子 （実施例 1、 バイナリー ·ベクター p B I C aMV35 S - b a r A) のタバコ培養細胞 B Y 2への導入により得られた、 B a r A蛋白質を比較的高蓄積していると思われる形質転換タバコ培養細胞ク口 ーン （実施例 3、 .図 1に示した 21番） に、 更に、 BARE— 3の支配下に置い た GUSレポーター遺伝子 （実施例 2、 プラスミド p C aMV 35 SD— g u s ) を導入して得られた一過的形質転換タバコ培養細胞プロトプラストの培養液に VBを添カ卩 （VB— C6最終濃度： 1 ζΜ、 100 ηΜ及び 10 ηΜ) し、 20時 間 25°Cの喑所に静置したプロトプラストから調製した細胞抽出液の GUS遺伝 子発現活性 （LUC活性に対する GUS活性の比、 すなわち、 GUSZLUC値 を用いて評価） を VB無添加のそれと比較した。
この結果、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラ スミド pCaMV35 SD g u sを一過的な形質転換に用いた場合、 VB— C6 の濃度が 1 Μ、 100 ηΜ及ぴ 10 ηΜのいずれにおいても、 GUS遺伝子発 '現活性は VB— C 6添加時 （ON) の方が無添加時 （OFF) より高く、 VBによ る GUS遺伝子の発現誘導を観察できた （図 5) 。 VBによる遺伝子発現誘導活 性 （I n du c t i o n r a t e = GUS遺伝子発現活性 （ON) ZGUS遺 伝子発現活性 （OFF) ) は、 各々 I n d u c t i o n r a t e 5， I n d u c t i o r a t e ^ 4 , 及ひ I n d u c t i o n r a t e 1. 4であ つた。 このように、 VBによる遺伝子発現誘導活性は VBの濃度の低下に伴って 減少したが、 100 nM以上の VB— C6濃度で十分に観察できた。
このように、 放線菌自已調節因子 VBをインデューサ一とする遺伝子発現誘導 系を構成するリプレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） 及ぴオペレータ 一 BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により タバコ培養細胞に付与し、 一過的に形質転換されたタバコ培養細胞に対し V Bを 100 nMという低濃度で投与することによって、 BARE— 3の支配下に置い た遺伝子の発現を VB投与部位において十分に誘導することができた。
(実施例 8)
放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） の形質を遺伝子導入によりタバコに付与した。 すなわち、 リブレッサー b a r A遺伝子を形質転換のためにタバコに導入した。
遺伝子導入にはァグロバタテリゥム感染法を用いた。 b a r A遺伝子の導入に より一旦ァグロパクテリゥムを形質転換し、 得られる形質転換ァグロバタテリゥ ムをタバコへ感染させた。
実施例 3に用いたのと同じ形質転換ァグロバグテリゥムをリーフ ·ディスク （ l e a f d i s c) 法により タバコ (N i c o t i a n a t a b a c um L . ) へ感染させた。 M S培地 〔Mu r a s h i g e等， P h y s i o l . P 1 a n t a r urn (1 9 6 2) , 1 5， 473— 49 8〕 ゲランガム ·ポットで 育てた無菌タバコの葉数枚から 5〜1 Omm角、 あるいはディスク状の葉片を切 り取りシャーレ内の無菌水に浸し、 これに形質転換ァグロバタテリゥム培養液数 m lを混合した。 葉片を取り出し、 裏面を上にして MSカルス培地 （含 SingZ 1 一ナフタレン酢酸 (n a p h t h a 1 e n e a c e t i c a c i d) , 0. 2mg/ 1 6一べンジルアデニン (b e n z y l a d e n i n e) ) ゲラ ンガム 'プレートに並べた。 人工気象器 （ 25 °C， 明 1 6時間 ·喑 8時間） に 2 日静置したプレートから葉片を回収、 無菌水で数回洗浄後、 裏面を上にしてカナ マイシン 1 0 Omg/ 1及ぴカルべニシリン 2 5 OmgZ 1を含む MSカルス培 地ゲランガム ·プレートに並べた。 人工気象器に 1〜 2週間静置したプレートか らカナマイシン及ぴカルペニシリンを含む MSシュート培地 （含 0. 0 2mgZ 1 α—ナフタレン酢酸， lmgZ l 6—べンジルアデニン） ゲランガム .プ レートに葉片を移し並べた。 葉片の周囲にはカルス形成を確認した。 葉片から芽 (シュート） が形成されるまでプレートを人工気象器に静置した。 形成した芽 ( シュート） を切り取り、 カナマイシン及ぴカルペニシリンを含む MS培地ゲラン ガム ·ポットに植えた。 人工気象器に静置したポットの中で根を生やした個体を 形質転換タバコとしてハイグロマイシン 2 OmgZ 1、 カナマイシン 1 0 Omg / 1及ぴカルペニシリン 2 5 Omg/ 1を含む MS培地ゲランガム ·ポットで選 択、 継代維持した。 (実施例 9)
放線菌ストレプトミセス ·バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） 及ぴオペレーター BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形 質を遺伝子導入によりタバコに付与した。 すなわち、 リブレッサー b a r A遺伝 子をタバコに導入し、 得られた形質転換タバコに、 更に、 オペレーター BARE 一 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子を一過的な形質転換のために導入 した。 - b a r A遺伝子 （実施例 1， バイナリー .ベクター p B I C a MV 3 5 S— b a r A) のタバコ （N i c o t i a n a t a b a c urn L. ) への導入によ り得られた形質転換タバコ （実施例 8) に、 更に、 BARE— 3の支配下に置い た GUSレポーター遺伝子 （実施例 2， プラスミ ド p C aMV 3 5 SD— g u s ) を一過的な形質転換のために導入した。
遺伝子導入には電気穿孔法を用いた。 そのために、 タバコをプロトプラスト化 処理した。 タバコの葉数枚から 5〜1 Omm角の葉片を切り取り酵素液 （0. 1 %ぺクトリアーゼ Y 2 3 [ (株） ヤクルト〕 ， 1 %セルラーゼ "オノズカ" RS 〔キッコーマン （株） 〕 ， 0. 4Mマンニトール， pH5. 5) に懸濁し、 室温 で数時間、 酵素反応を進行させた。 葉片表面に剥離層を観察した時点で酵素液を 70 μιη孔のメッシュで濾し、 濾液を遠心分離した。 これにより沈降した緑色の 細胞塊をプロトプラストとして遺伝子導入に用いた。 プロトプラストを 0. 4M マンニトールで洗浄後、 電気穿孔用緩衝液 （5 mM ME S, 7 OmM KC 1 , 0. 3 Mマンニトール） に 6 X 1 06Zm 1の細胞密度で懸濁した。 BARE— 3 の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子 （実施例 2、 プラスミド p C aMV3 5 SD— g u s ) 1 0 μ g及ぴ遺伝子導入効率をモニターするためのルシフェラ ーゼ遺伝子 （p C aMV 3 5 S— 1 u c) 1 μ gをプロトプラスト懸濁液 5 00 β 1と完全混合しジーン ·パルサー 〔日本バイオ'ラッド♦ラボラトリーズ （株 ) 〕 のキュベット （電極間距離が 4mm) に移した。 電圧 30 0V、 静電容量 2 50 μ F及ぴ抵抗 400 Ωに設定したパルスをキュべット電極間に発生させた。 パルス発生時の時定数は約 16ミリ秒であった。 パルスを負荷したキュべットか らすばやくプロトプラストを等量ずつ 2つのシャーレ （直径 6 cm) に移し、 こ れらに各々 4. 75m 1の培地 （改変 L S培地， l O gZlショ糖， 0. 4Mマ ンニトール） を加えた。
このようにして得られた一過的形質転換タバコ ·プロトプラストに対しインデ ユーサー VBを投与することによって、 オペレーター BAR E— 3の支配下に置 いた GUSレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうかを調べた。
一方のシャーレ内の一過的形質転換タバコ ·プロトプラストの培養液に VBを 添カ卩 （VB— C6最終濃度： Ι μΜ) し、 22時間 25 ¾の暗所に静置したプロト プラストから調製した細胞抽出液の GUS遺伝子発現活性 （LUC活性に対する GUS活性の比、 すなわち、 GUS/LUC値を用いて評価） をもう一方の VB 無添加のそれと比較した。 VBの添加は、 実施例 4と同様に行った。 シャーレか ら回収し、 遠心分離により上澄みを除いたプロトプラストを 500μ 1の細胞抽 出用緩衝液 (0. 1M ΚΡ04, 2mM EDTA, 5%グリセロール， 2m M DTT, pH 7. 8) に懸濁し、 超音波発生装置 [ (株） トミー精ェ Ha n d y S o n i c UR— 20 P] を用いて破碎した。 細胞破碎液を高速遠心 分離して得られた上澄みを細胞抽出液とした。 細胞抽出液の GUS活性及び LU C活性は各々実施例 4及び 5と同様に測定した。 同一の実験条件において 2つの 独立した実験を行った。
この結果、 BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子としてプラ スミド pC aMV35 SD— g u sを一過的な形質転換に用いた場合、 GUS遺 伝子発現活性は VB_C6添加時 （ON) の方が無添加時 （OFF) より高く、 V Bによる G U S遺伝子の発現誘導を観察できた。 V Bによる遺伝子発現誘導活性 (I n d u c t i o n r a t e = GUS遺伝子発現活性 （ON) /GUS遺伝 子発現活性 （OFF) ) はいずれも I n d u c t i o n r a t e 2であった。 このように、 放線菌自己調節因子 V Bをィンデューサーとする遺伝子発現誘導 系を構成するリプレッサー B a r A (V Bのレセプター蛋白質） 及ぴオペレータ 一 BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により タバコに付与し、 一過的に形質転換されたタバコに対し V Bを投与することによ つて、 BARE— 3の支配下に置いた遺伝子の発現を VB投与部位において誘導 することができた。 (実施例 10)
放線菌ストレプトミセス 'バージニアェの自己調節因子 VBをインデューサー とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋 白質） 及びオペレーター BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形 質を遺伝子導入によりタバコに付与した。 すなわち、 リブレッサー b a r A遺伝 子及びオペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺伝子の 2 つの遺伝子を形質転換のためにタバコに導入した。
b a r A遺伝子 （実施例 1 , バイナリー 'ベクター p B I C a MV 35 S— b a rA) をタノ コ (N i c o t i a n a t a b a c um L. ) に導入し、 得 られた形質転換タバコ （実施例 8) に、 更に、 BARE— 3の支配下に置いた G USレポーター遺伝子 （実施例 2， バイナリー 'ベクター p B I C aMV 35 S UDD-g u s) を導入した。 遺伝子導入には実施例 8と同様にァグロバタテリ ゥム感染法を用いた。 形質転換タバコは、 ハイグロマイシン 2 OmgZ I、 カナ マイシン 10 OmgZ 1及びカルべニシリン 25 OmgZ 1を含む MS培地で選 択、 継代維持した。
このようにして得られた形質転換タバコに対しインデューサー VBを投与する ことによって、 オペレーター BARE— 3の支配下に置いた GUSレポーター遺 伝子の発現が誘導される力 どうかを調べた。
形質転換タバコのわき芽を VB添加 （VB— C6最終濃度： の MS培地 ポットに植え,継ぎ、 約 3週間人工気象器で成長させた形質転換タバコの葉の GU S遺伝子発現活性 （GUS活性染色で観察される染色度合いで評価） を VB無添 加のそれと比較した。 GUS活性染色では GUSの基質として lmMの 5—ブロ モー 4一クロロー 3 _インドリル一 β—D—ダルクロニド · シク口へキシノレアン モニゥム （5— b r omo— 4— c h l o r o— 3_ i n d o l y l— 一 D— g l u c u r o n i d e e y e 1 o h e xy 1 ammo n i um s a l t : X— g l u e) を含む細胞抽出用緩衝液 （5 OmM NaH2 P04/Na 2H PO4, 1 OmM EDTA, 1 OmM 2—メルカプト ·エタノール， pH7 ) に切り取った葉を浸し 37°C—晩反応させた。 GUSの酵素反応による葉の青 色色素生成を観察した。
この結果、 形貧転換タバコの GUS遺伝子発現活性は VB— C6添加時 （ON ( VB+) ) の方が無添カ卩時 （OFF (VB-) ) より高く、 VBによる GUS遺 伝子の発現誘導を観察できた （図 6) 。
このように、 放線菌自己調節因子 VBをインデューサ一とする遺伝子発現誘導 系を構成するリプレッサー B a r A (VBのレセプター蛋白質） 及びオペレータ 一 BARE— 3 (B a r Aのターゲット配列の 1つ） の形質を遺伝子導入により タバコに付与し、 形質転換されたタバコに対し VBを投与することによって、 B ARE— 3の支配下に置いた遺伝子の発現を VB投与部位において誘導すること ができた。 産業上の利用の可能性
本発明が提供する、 放線菌の自己調節因子をインデューサ一とする遺伝子発現 誘導系を構成するリブレッサー及ぴオペレーターの形質を遺伝子導入により植物 に付与し、 形質転換された植物に対し放線菌自己調節因子を投与することによつ て、 オペレーターの支配下に置いた遺伝子の発現を放線菌自己調節因子投与部位 において誘導する方法は、 所望する遺伝子を所望する時期及び部位に発現させる ことができ、 植物の生育にとって不利となるような代謝産物も植物で生産可能に する。 稔性のコントロールを介して形質転換植物の環境への拡散を防止する上で も有用である。 本法は、 植物における既知の遺伝子発現誘導方法に比較して低濃 度で遺伝子発現誘導活性を示す優れた特性を持つィンデューサ一の使用を可能に すると同時に、 使用するインデューサ一の選択肢の拡大に道を開いた。

Claims

請求の範囲
1. 植物における遺伝子発現の誘導方法であって、 放線菌の自己調節因子をィ ンデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成するリプレッサー及ぴオペレーター の形質を遺伝子導入により植物に付与し、 形質転換された植物に対し放線菌自己 調節因子を投与することによって、 オペレーターの支配下に置いた遺伝子の発現 を放線菌自己調節因子投与部位において誘導する方法。
2. 前記放線菌が、 ストレプトミセス （S t r e p t omy c e s) 属である 請求の範囲第 1項に記載の方法。
3. 前記放線菌が、 ス トレプトミセス 'バージニアェ （S t r e p t omy c e s v i r g i n i a e) である請求の範囲第 1項に記載の方法。
4. 前記自己調節因子が、 ブチロラタトン （b u t y r o 1 a c t o n e) 型 自己調節因子である請求の範囲第 1から 3項のいずれかに記載の方法。
5. 前記自己調節因子が、 バージニアェ 'ブタノライド （V i r g i n i a e b u t a n o 1 i d e) である請求の範囲第 1から 3項のいずれかに記載の方 法。
6. 前記遺伝子発現誘導系が、 抗生物質生産に関連するものである請求の範囲 第 1から 5項のいずれかに記載の方法。
7. 前記遺伝子発現誘導系が、 バージニアマイシン （v i r g i n i amy c i n) 生産に関連するものである請求の範囲第 1から 5項のいずれかに記載の方 法。
8. 前記リプレッサーの遺伝子が、 b a r A遺伝子である請求の範囲第 1から 7項のいずれかに記載の方法。
9. 前記リプレッサーの遺伝子が、 配列番号 1で示される塩基配列から成る領 5 域を含有することを特徴とする請求の範囲第 1力 ら 8項のいずれかに記載の方法。
10. 前記リブレッサーの遺伝子が、 配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコ ードする領域を含有することを特徴とする請求の範囲第 1から 9項のいずれかに 記載の方法。
10
1 1. 前記リプレッサーの遺伝子のプロモーターが、 植物プロモーターである 請求の範囲第 1から 10項のいずれかに記載の方法。
12. 前記植物プロモーターが、 カリフラワー ·モザイク ' ウィルス （C a u ID 1 i f l owe r mo s a i c v i r u s) 35 Sフ—口モーターである S青求 の範囲第 11項に記載の方法。
1 3. 前記オペレーターの塩基配列が、 b a rA、 13 & で 8又は13 & 1 のぃ ずれかの遺伝子由来のものである請求の範囲第 1から 12項のいずれかに記載の
20 方法。
14. 前記オペレーターの塩基配列が、 BARE— 1、 BARE— 2又は B A RE— 3のいずれかである請求の範囲第 1から 12項のいずれかに記載の方法。
25 1 5. 前記オペレーターの塩基配列が、 BARE— 3である請求の範囲第 1か ら 12項のいずれかに記載の方法。
16. 前記オペレーターの塩基配列が、 配列番号 3で示される塩基配列から成 る領域を含有することを特徴とする請求の範囲第 1カゝら 15項のいずれかに記載 の方法。
1 7. 前記オペレーターの支配下に置いた遺伝子のプロモーターが、 植物プロ モーターである請求の範囲第 1から 16項のいずれかに記載の方法。
18. 前記植物プロモーターが、 カリフラワー 'モザイク · ウィルス （C a u l i f l owe r mo s a i c v i r u s) 35 Sァロモーターでめる青求 の範囲第 17項に記載の方法。
1 9. 前記オペレーターが、 前記植物プロモーターに 1個以上配置されている 請求の範囲第 1 7又は 18項に記載の方法。
20. 前記オペレーターが、 前記植物プロモーターの TATAボックスの 3， 下流近傍又は 5 ' 上流近傍に 1個以上配置されている請求の範囲第 1 7又は 1 8 項に記載の方法。
21. 前記オペレーターが、 前記植物プロモーターの TATAボックスととも に、 配列番号 4から 7のいずれかで示されるように配置されている請求の範囲第 17から 20項のいずれかに記載の方法。
22. 前記オペレーターの支配下に置いた遺伝子が、 植物に稔性形質を付与す る遺伝子である請求の範囲第 1から 21項のいずれかに記載の方法。
23. 請求の範囲第 1から 22項のいずれかに記載の方法により形質転換され た植物。
24. 請求の範囲第 1から 22項のいずれかに記載の方法により形質転換され たタノ コ (N i c o t i a n a t a b a c um L. ) 。
25. 請求の範囲第 1から 22項のいずれかに記載の方法により形質転換され た植物培養細胞。
26. 請求の範囲第 1から 22項のいずれかに記載の方法により形質転換され たタバコ培養細胞。
27. 請求の範囲第 1から 22項のいずれかに記載の方法により形質転換され たタバコ培養細胞 BY 2。
28. 放線菌の自己調節因子をインデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成 するリプレッサーの遺伝子であって、 そのプロモーターが植物プロモーターであ ることを特徴とするリブレツサー遺伝子。
29. 前記植物プロモーターが、 カリフラワー 'モザイク ' ウィルス （C a u 1 i i l owe r mo s a i c v i r s) 35 Sプロモーターである言肓求 の範囲第 28項に記載のリプレツサー遺伝子。
30. 前記リプレッサーの遺伝子が、 b a r A遺伝子である請求の範囲第 28 又は 29項に記載のリブレツサー遺伝子。
31. 前記リブレッサーの遺伝子が、 配列番号 1で示される塩基配列から成る 領域を含有することを特徴とする請求の範囲第 28から 30項のいずれかに記載 のリプレッサー遺伝子。
32. 前記リブレツサ一の遺伝子が、 配列番号 2で示されるァミノ酸配列をコ ードする領域を含有することを特徴とする請求の範囲第 28から 31項のいずれ かに記載のリブレツサー遺伝子。
33. 放線菌の自己調節因子をインデューサ一とする遺伝子発現誘導系を構成 するオペレーターが、 植物プロモーターの TATAボックスの 3， 下流近傍又は 5' 上流近傍に 1個以上配置されていることを特徴とする改変プロモーター。
34. 前記植物プロモーターが、 カリフラワー 'モザイク 'ウィルス （C a u l i f l owe r mo s a i c v i r u s) 35 Sプロモーターである請求 の範囲第 33項に記載の改変プロモーター。 '
35. 前記オペレーターの塩基配列が、 BARE— 1、 B ARE— 2又は B A RE— 3のいずれかである請求の範囲第 33又は 34項に記載の改変プロモータ
36. 前記オペレーターの塩基配列が、 配列番号 3で示される塩基配列から成 る領域を含有することを特徴とする請求の範囲第 33から 35項のいずれかに記 載の改変プロモーター。
37. 前記オペレーターが、 前記植物プロモーターの TATAボックスととも に、 配列番号 4から 7のいずれかで示されるように配置されていることを特徴と する請求の範囲第 33から 36項のいずれかに記載の改変プロモーター。
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