JPH11510372A

JPH11510372A - 子房組織転写因子の用途

Info

Publication number: JPH11510372A
Application number: JP9502081A
Authority: JP
Inventors: マクブリッジ，ケビン; エム．ストーカー，デイヴィッド
Original assignee: カルジーン，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-09-14
Also published as: EP0833932A2; AU6330496A; WO1996040951A3; US20010014977A1; WO1996040951A2; CA2221726A1; MX9709726A; US6268546B1

Abstract

(57)【要約】分子プローブとして使用しうる、あるいは植物宿主中に挿入されて子房組織における（特に、非常に初期の果実発生における）関心のあるＤＮＡ配列の転写の修飾を引き起こしうる新規ＤＮＡ構築物を提供する。このＤＮＡ構築物は、開花の直前から花の老化までの子房組織中での遺伝子発現に関連した転写開始調節領域を含む。

Description

【発明の詳細な説明】子房組織転写因子の用途関連出願の相互参照本出願は、1995年６月７日付け米国出願第08/487,087号の一部継続出願であり、この出願第08/487,087号は、1992年12月29日付け米国出願第998,158号の一部継続出願であり、この出願第998,158号は、1990年７月17日付け米国出願第554,1 95号の一部継続出願であり、この出願第554,195号は、1989年７月19日付け米国出願第382,518号の一部継続出願である。これらの出願を参考として本明細書に組み入れるものとする。緒言技術分野本発明は、改変された表現型を有する子房由来細胞を作製するための、関心のあるＤＮＡ配列の子房組織転写を植物中で指令しうるin vitroで構築されたＤＮＡ転写または発現カセットの使用方法、および種々の植物の組織また部分において現存色を付与または修飾する方法に関する。本発明は、綿繊維の色の表現型を改変するための子房組織プロモーターを使用する方法、およびこの方法により製造された綿繊維で例示される。背景一般に、遺伝子工学技術は、特に培養中の個々の原核および真核細胞の表現型を修飾することに向けられている。植物細胞は、他の真核細胞に比べて適応性が低いことが判明しているが、これは、適当なベクター系がないためだけではなく、種々の標的が含まれている結果でもある。多くの適用では、植物の特定の成長段階または植物の特定の部分で遺伝子発現を制御できることが望ましい。この目的のためには、植物の発育および生産性に著しい悪影響を及ぼすことなく、適当な細胞型においておよび／またはその植物の発育の適当な時点で転写を望みどおりに開始させる調節配列が必要となる。したがって、その宿主植物の成長周期中の植物細胞内での転写を望みどおりに調節するのに使用できる配列を単離することに関心が持たれている。この関心の１つの態様は、成熟細胞型の態様を改変または改善するよう、個々の細胞型（例えば、子房組織に由来する分化した表皮細胞、すなわち綿繊維細胞）の表現型を変化させうることである。表現型の所望の変化を得るためには、初期子房発生においてのみ転写を開始しうる転写開始領域が使用される。これらの転写開始領域は、受粉開始前に活性であり、果実の拡大、組織の成熟などが生じる前は、それほど活性でないか、あるいは不活性である。関連文献開花から果実発生までの間（それらの時点を含む）、少なくとも成熟開始までに発現される果実特異的プロモーターのクラスが、欧州出願第88.906296.4号で論じられており、その開示を参考として本明細書に組み入れるものとする。綿繊維中で優先的に発現されるｃＤＮＡクローンが、既に単離されている。単離されたクローンの１つは、後期一次細胞壁および初期二次細胞壁の合成段階で最高となるｍＲＮＡおよびタンパク質に対応する。John Crow PNAS（1992）89:5769-5773 。果実発生中に特異的発現を示すトマトからのｃＤＮＡクローンが、単離され特徴づけられている（Manssonら，Mol．Gen．Genet．（1985）200:356-361：Slate rら，Plant Mol．Biol．（1985）5:137-147）。これらの研究では、主として、果実の成熟中に蓄積するｍＲＮＡに焦点があてられている。成熟特異的ｃＤＮＡにコードされるタンパク質の１つが、ポリガラクツロナーゼとして同定されている（Slaterら，Plant Mol．Biol．（1985）5:137-147）。トマトポリガラクツロナーゼをコードするｃＤＮＡクローンが、既に配列決定されている（Griersonら，Nucleic Acids Research（1986）14:8395-8603）。ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現の転写操作による、トマト果実の保存および取り扱いの態様の改善が報告されている（Sheehyら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1988）85:8805-8809； Smithら，Nature（1988）334:724-726）。 psbA（光化学系IIの成分の１つ）の成熟色素体ｍＲＮＡは、果実発生の後期にその最高レベルに到達するが、成熟開始後は、光化学系ＩおよびIIの他の成分の色素体ｍＲＮＡは、有色体中では検出不能レベルにまで減少する（Piechullaら，P lant Molec．Biol．（1986）7:367-376）。最近、トマトの花粉（McCormickら， Tomato Biotechnology（1987）Alan R．Liss，Inc.，NY）および雌ずい（Gasser ら，Plant Cell（1989），1:15-24）の相互作用に関与していると考えられる遺伝子を発現するｃＤＮＡクローンが、単離され特徴づけられた。他の研究では、誘導調節されている遺伝子、例えば、トマトにおける傷害に応答して発現されるセリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする遺伝子（Grahamら，J ．Biol．Chem．（1985）260:6555-6560; Grahamら，J．Biol．Chem.（1985）260 :6561-6554）、および傷害後の成熟しつつある果実および葉におけるエチレン合成に相関しているｍＲＮＡ（Smithら，Planta（1986）168: 94-100）に焦点があてられている。傷害されたトマト植物の葉においてメタロカルボキシペプチダーゼ阻害剤タンパク質が蓄積することが、報告されている（Grahamら，Biochem & BioPhys．Res Comm．（1981）101:1164-1170）。植物の種子組織（例えば、胚または種皮）内で優先的に発現される遺伝子も報告されている。例えば、欧州特許出願第87306739.1号（1988年２月３日に0 255 37 8として公開されている）およびKridlら（Seed Science Research（1991）1:209 -219）を参照されたし。アグロバクテリウムに媒介される綿の形質転換が、Umbeckの米国特許第5,004,86 3号および第5,159,135号に記載されており、粒子衝撃（particle bombardment）による綿の形質転換が、1992年９月17日付け公開のWO92/15675に報告されている。アブラナ属植物（Brassica）の形質転換が、Radkeら（Theor．Appl．Genet.（ 1988）75:685-694; Plant Cell Reports（1992）11:499-505）に記載されている。栽培されたトマトの形質転換が、McCormickら，Plant Cell Reports（1986）5 :81-89およびFillattiら，Bio/Technology（1987）5:726-730に記載されている。発明の概要関心のある遺伝子の転写を子房組織、特に果実発生の初期において指令しうる新規ＤＮＡ構築物およびその使用方法を記載する。この新規構築物には、子房組織中で発現される遺伝子から入手可能な転写および翻訳開始領域を含むベクターが含まれ、また、構築物の使用方法では、果実の表現型を改変するためのベクターを用いてもよい。その果実は、食用であってもなくてもよい。この方法には、果実の受粉段階の前または受粉段階中の子房細胞内で活性なプロモーターを含む転写または発現カセットを、関心のある宿主植物細胞にトランスフェクションし、ついで、成長後に所望の表現型を有する果実を作る植物を得ることが含まれる。したがって、本発明の構築物および方法は、内在性果実産物のモジュレーションおよび外在性産物の産生、ならびに果実および果実産物の表現型の修飾に有用である。また該構築物は、分子プローブとして有用である。特に、綿胚組織中での遺伝子発現で使用するための構築物および方法が、本発明で注目される。これらの方法により、新規の綿植物および綿植物部分（例えば、修飾された綿繊維）を得ることができる。また、本出願では、植物組織中の色の表現型の修飾に関連した構築物および使用方法が提供される。そのような構築物は、メラニン、インジゴなどの着色化合物の産生に関与する遺伝子の発現のための配列を含有し、また、植物細胞中の特定の位置（例えば、色素体オルガネラまたは液胞）に遺伝子産物を標的化させる配列も含有する。色素体への標的化は、芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する遺伝子の発現の場合に特に重要であるのに対し、液泡への標的化は、色素合成に必要な前駆体が液胞中に存在する場合に特に重要である。例えば、液胞中にチロシンを蓄積する植物組織では、液胞への標的化により、メラニン産生が増強されることがある。色に関連した遺伝子の発現のための転写開始領域は、色の修飾が望まれる組織に基いて選択されることとなる。図面の説明図１は、ｃＤＮＡクローンpZ130のＤＮＡ配列を示す。pZ7 ｃＤＮＡクローンに対応する配列に下線を付す。図２は、pZ130 ｃＤＮＡクローン（この領域に下線を付す）と重複するCalgene. Lambda 140ゲノムクローンの領域の配列、およびその領域の5'および3'側の領域の部分配列を示す。pZ130遺伝子転写の開始点は、2567位の下線を付した太字の「Ａ」で示されている。この遺伝子配列内のイントロンは、2702位〜2921位の小文字の配列で示されている。一般的な制限酵素部位が示されている。配列中の記号は、以下の意義を有する：Ａ＝アデノシン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チミジンまたはウラシル；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴまたはＵ；Ｍ＝ＣまたはＡ；Ｋ＝ＴまたはＵまたはＧ；Ｗ＝ＴまたはＵまたはＡ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｎ＝Ｃ、Ｔ、Ａ、ＧまたはＵのいずれか；Ｂ＝Ａではない；Ｄ＝Ｃではない；Ｈ＝Ｇではない；Ｖ＝ＴまたはＵのいずれでもない。図３は、Calgene Lambda 140の制限地図を示す。Ｂ：BamHI；Ｇ：BglII；Ｈ：Hi ndIII；Ｒ：EcoRI；Ｓ：SalI。図４は、ｃＤＮＡクローンpZ70の完全なＤＮＡ配列を示す。pZ8 ｃＤＮＡクローンに対応する配列に下線を付す。pZ70遺伝子にコードされる成熟タンパク質の起点および終点も示す。図５は、Calgene Lambda 116の制限地図を示す。Ｂ：BamHI；Ｇ：BglII；Ｈ：Hi ndIII；Ｐ：SphI；Ｒ：EcoRI；Ｓ：SalI；Ｘ：XbaI。図６は、pZ7およびpZ8 ＲＮＡの蓄積が展開していく時間経過を示すノーザンブロット実験の結果を示す。UC82Bの果実発生（花および子房／果実）を上部に示す。１〜21の数字は、開花後の日数を表す。図７は、植物を形質転換させてメラニン合成用遺伝子を発現させるためのバイナリーベクターを示す。図８は、リンカー領域部位の地図を示す。発明の詳細な説明本発明では、分子プローブとして使用しうる、あるいは植物宿主中に挿入されて、他の植物細胞と比較して子房細胞中で、一般的には子房細胞中で優先的に、関心のあるヌクレオチド配列の転写を引き起こして、改変された表現型を有する細胞および植物部分を産生する新規ＤＮＡ構築物をおよびその使用方法を記載する。特に関心があるのは、開花の少なくとも１〜３日前から花の老化までの期間である。該構築物には、該構築物の意図される用途に応じて、いくつかの形態が含まれる。したがって、該構築物には、ベクター、転写カセット、発現カセットおよびプラスミドが含まれる。該転写および翻訳開始領域（「プロモーター」と称することもある）は、好ましくは、転写開始調節領域、および非翻訳５'配列の翻訳開始調節領域（リボソームに対するｍＲＮＡの結合および翻訳開始を引き起こす「リボソーム結合部位」）を含む。該開始制御領域の転写および翻訳機能要素のすべてが、同じ遺伝子に由来するか、あるいはそれから入手可能であることが好ましい。いくつかの実施態様では、該プロモーターは、エンハンサーなどの配列の付加により、あるいは非必須のおよび／または望まれていない配列の欠失により修飾されることとなる。「入手可能」は、天然のプロモーターのＤＮＡ配列と十分に類似したＤＮＡ配列を有していて、関心のあるＤＮＡ配列の転写の所望の特異性を付与するプロモーターを意図するものである。それは、天然配列および合成配列、ならびに合成配列および天然配列の組み合わせであってもよい配列を含む。該ベクターは、典型的には、１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列と、子房組織中の遺伝子発現に関連した転写開始調節領域とを含む。関心のあるヌクレオチド配列の子房組織中での転写のための転写カセットは、子房組織の転写開始領域および所望により翻訳開始領域、関心のあるＤＮＡ配列、および転写および所望により翻訳の終結領域（植物細胞中で機能するもの）を、転写方向の順序で含むこととなる。該カセットが、関心のあるＤＮＡ配列の転写および翻訳を引き起こす場合、それは発現カセットとみなされる。また、１以上のイントロンが存在していてもよい。また、所望によりトランジット（transit）ペプチドおよび分泌リーダー配列をコードする配列などの他の配列が存在していてもよい。該調節領域は、開花（an thesis）から花が咲く（flowering）までは子房細胞中の転写を指令しうるが、受粉および／または受精の前後の時点で生じる最初の変化の後では発現をほとんど又は全く指令しない。すなわち、これらの調節領域からの転写は、開花の約３週間後には検出することができない。さらに、本発明の子房組織転写開始領域は、典型的には、他の植物組織中では容易に検出できない。子房組織からの子房特異的でない転写開始領域には、特別な用途があるかもしれない。特に好ましいのは、開花前から開花まで以外の果実発生段階では見出されない転写開始領域である。前記のものに加えて、他の植物組織中でおよび／または子房発生の他の段階で転写を開始しうる転写開始領域も許容されうるが、これは、そのような領域が、関心のある一定の期間、子房組織中で有意な発現レベルを付与し、その植物を全体として負に妨げることがなく、特に、果実および／または果実関連部分の発生を妨げない場合に限られる。また、特異的な子房組織（例えば、外果皮組織、内側中心組織、珠皮など）中で転写を指令しうる子房組織プロモーターおよび／またはプロモーター要素にも関心が持たれる。本発明の関心のある期間、一般には植物生殖周期の開花期に、子房組織中で最高レベルまたはその付近で発現可能な転写開始領域が好ましい。特に関心があるのは、開花の少なくとも１〜３日前から花の老化までの期間である。転写レベルは、修飾された果実を産生しうるＲＮＡ量を得るのに十分な程度であるべきである。本発明で用いる「果実」なる語は、花の子房壁の発生の結果として形成される成熟した器官、および他のいずれかの密接に関連した部分を意味する。Weirer． T.E.，l,編，Botany A Introduction to Plant Biology（第６版）(John Wiley & Sons，1982)；Tootill & Backmore，The Facts on File Dictionary of Botan y(Market Home Books Ltd.，1984)を参照されたし。「修飾された果実」は、同じ種の形質転換されていない植物（例えば、そのゲノム中に問題の転写カセットを有さないもの）とは異なる表現型を有し、その相違が検出可能である果実を意味する。特に関心があるのは、子房組織中で発現される遺伝子に結合しており、開花の少なくとも24時間前から花の老化まで転写を指令しうる転写開始領域である。「開花」なる語は、本発明では、花が開くこと又は花が咲くことに関連した期間を意味する。「花の老化」なる語は、本発明では、（花の）花弁の喪失などを含む花の死に関連した期間を意味する。Abercrombie，M.ら，A Dictionary of Biology （第６版）(Penguin Books，1973)。未だ開いていない花、またはつぼみは、「開花前」とみなされる。開花は、その植物の生殖周期の無性的な受容部分を表す花弁が開くことから始まる。試験されたUCB82トマト品種では、開花は典型的には約１週間続く。綿のような植物では、開花は約２週間続き、繊維が種皮組織から発生する。本発明の転写開始領域が、植物の花芽形成前の有意な時間または有意な程度まで、転写を開始しないのが好ましい。理想的には、転写のレベルは少なくとも約１〜３日間は高く、それは、開花の開始時（「開花前」）を含むであろう。さらに望ましくは、本発明の転写開始領域は、開花の開始後１〜３日以内に転写活性レベルの減少を示し、それは時間経過と共に増加しない、好ましくは減少する。胚植物を形成する接合子を産生するトマトの胚嚢の受精は、典型的には、開花の２〜３日後に起こる。これは、本発明の転写開始領域の活性の減少時と一致する。このように、本発明のプロモーターの転写活性は、開花開始後約２日以内に有意に減少することが望ましい。本発明の転写開始領域は、前記の好ましい期間の間、有意な発現レベルで子房組織中で発現を指令しうるであろう。いくつかの実施態様では、特定の子房組織中での転写を選択的に調節することが望ましいであろう。子房珠皮（「胚珠表皮細胞」としても公知である）、果心または果皮組織などを含む一定の子房組織中で転写、発現を開始させうる５'非翻訳配列と併用すると、該転写開始領域は、関心のあるＤＮＡ配列にコードされる所望のメッセージを特定の組織中で指令して、所望の表現型修飾をより有効に引き起こすことができる。例えば、子房果皮組織（子房壁および／または子房中心組織としても公知である）中での発現により、トマト、ブドウ、ブルーベリー、ツルコケモモ、アカスグリ、ナスなどの真漿果（trueberries）；サクランボ、プラム、アンズ、モモ、ネクタリン、アボカドなどの石果（核果）；およびラズベリー、クロイチゴなどの複果（小石果）を含む多数の果実の可食部に対する有用な修飾が得られるであろう。ミカン状果（オレンジ、カンキツ類）では、そのような発現カセットは、該果実の「多汁質」部分で発現されると予想される。ウリ状果（例えば、スイカ、カンタループ、甘露、キュウリおよびカボチャ）では、同等の組織は、十中八九、内部の可食部である。豆果などの他の果実では、同等の組織は種子の莢である。非食用果実の類似構造の修飾にも関心が持たれるかもしれない。例えば、特に関心があるのは、少なくとも子房の外果皮組織中で発現可能な転写開始領域である。例えば、綿では、類似の子房構造は綿の莢のいが（burr）であり、ナタネでは、それは種子の莢である。同様に、子房の珠皮および／または中心組織中での発現を調節することにより、同様の果実および例えば種皮毛からそこで生成する関連した構造（例えば綿繊維）に対する有用な修飾が得られるかもしれない。綿繊維は、胚珠の外珠皮の分化した単表皮細胞である。それは、４つの異なる成長段階（開始、伸長（一次細胞壁合成）、二次細胞壁合成、および成熟）を有する。繊維の発生の開始は、ホルモンにより誘発されるらしい。一次細胞壁は、伸長段階の間に作られ、開花前日数（DPA）が25になるまで維持される。二次細胞壁の合成は、伸長段階の停止後に開始し、約40DPAまで続き、ほとんど純粋なセルロースの壁が形成される。また、綿繊維細胞の修飾が考慮される適用では、子房組織プロモーターに加え、種子組織中、特に種皮組織中で優先的に発現される遺伝子からの転写開始領域に関心が持たれる。アブラナ属植物の種皮細胞中で高レベルで発現される遺伝子の一例は、EPAO 255 378に記載されているEA9遺伝子である。EA9 ｃＤＮＡの部分核酸配列がそこに記載されており、それを使用して、該プロモーター配列を含む対応配列を得ることができる。種子胚および種皮細胞中で発現される追加的な種子遺伝子は、Bce4 アブラナ属植物遺伝子である。この遺伝子からのプロモーター領域も、本発明で有用である。この遺伝子および対応するプロモーター領域は、1991年９月19日付け公開のWO91/13980に記載されている。繊維特異的タンパク質は、発生的に調節される。したがって、繊維細胞中で発現されるタンパク質からの転写開始領域にも関心が持たれる。発生的に調節される繊維細胞タンパク質の一例は、E6である（JohnおよびCrow，Proc．Nat．Acad．Sci．(USA)(1992)89:5769-5773）。E6遺伝子は、繊維中で最も活性であり、一方、葉、胚珠および花では低レベルの転写が見出される。特異的に誘導される転写開始領域を得るためには、以下の工程を用いてもよい。所望の発生段階の組織から、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離する。ついで、このｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡクローンを構築するが、このｃＤＮＡクローンは、該クローンの一次ＤＮＡ配列の点およびｍＲＮＡ集団中の異なるクローンの存在量の点の両方においてｍＲＮＡ集団に対応したものである。また、標的遺伝子が発現されるはずのない異なる発生段階の組織（代替組織（alternat e tissue））から、ｍＲＮＡを単離する。所望の組織からの及び該代替組織からの放射性ｃＤＮＡを使用して、該ｃＤＮＡクローンの重複コピーをスクリーニングする。予備スクリーニングにより、ｃＤＮＡクローンを以下のとおり分類することが可能となる：両組織中に豊富なｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ；どちらの組織にも豊富でないｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ；一方の組織中に豊富であり、もう一方の組織中にはそれほど豊富でないｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ。ついで、所望の組織中にのみ豊富なｍＲＮＡに対応するクローンを選択し、ついで、選択したこれらのクローンをさらに特徴づける。以上で概要説明した予備スクリーニングのためのハイブリダイゼーションプローブは特定の組織からの全ｃＤＮＡであるため、それは主として、最も豊富な配列とハイブリダイズする。特に、ｍＲＮＡがそれほど豊富でない組織中での、実際の発現レベルを測定するために、所望の組織および種々の所望でない組織の全ｍＲＮＡ集団に対するハイブリダイゼーションプローブとして、該クローン化配列を使用する。これは、個々の組織中のｍＲＮＡの相対存在量と該ｍＲＮＡ転写物のサイズとの両方に関する情報を与えるノーザンブロットとして、最も一般に行われる。ｍＲＮＡの存在が、単一の遺伝子からの転写によるものなのか、あるいはそれが遺伝子ファミリーからの転写産物であるのかを知ることは重要である。これは、ゲノムのサザンブロットを該ｃＤＮＡクローンでプローブすることにより判定することができる。全ゲノムＤＮＡを、種々の制限酵素で消化し、放射性ｃＤＮＡクローンとハイブリダイズさせる。そのハイブリダイゼーションのパターンおよび強度から、ｍＲＮＡが、１つまたは２つの遺伝子にコードされているのか、あるいは関連遺伝子の大きなファミリーにコードされているのかの可能性を識別することができる。クロスハイブリダイズするいくつかの遺伝子のうちのどの遺伝子が、所望の組織中で見出され豊富に発現されるｍＲＮＡをコードしているのかを判定するのは難しいことがある。例えば、pZ130（実施例４を参照されたし）は小さな遺伝子ファミリーのメンバーであるが、pZ7プローブはpZ130を残りのファミリーメンバーから識別しうることが、試験で示されている。所望の標的ＤＮＡ配列を後で、転写カセット中に正しい部位および正しい配向で挿入するために、記載されているとおりに得られたｃＤＮＡを配列決定して、オープンリーディングフレーム（考えられるタンパク質コード領域）および転写の方向を決定することができる。また、ｃＤＮＡクローンの配列情報は、以下に記載するマッピングおよびサブクローニングなどの、対応するゲノムクローンの特徴づけを容易にする。同時に、転写される配列に隣接する制御領域を含む完全な遺伝子配列を含有するクローンに関して、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ゲノムクローンは、一般に、大きなＤＮＡセグメント（約10 〜20kb）を含有し、該ゲノムクローンを制限酵素を用いてマッピングし、ついでサブクローニングし、そして部分的に配列決定して、どのセグメントが、発生的に調節される遺伝子を含有するのかを判定することができる。該制限酵素地図および配列情報を用いて、推定子房遺伝子または子房および／または他の所望の組織（特に、子房由来の組織）中で発現されるべき遺伝子に結合した他の所望のプロモーター領域を有するプラスミドを設計し、構築することができる。該プロモーターが天然のオープンリーディングフレームにもはや結合していない場合に、所望の時機および／または組織の発現および／または発現の全体のレベルがうまく維持されていることを保証するために、これらのハイブリッド構造体を、形質転換され再生された植物中でのそれらの発現パターンに関して試験する。前記の方法を用いて、いくつかの転写調節領域が同定されている。その一例は、pZ130 ｃＤＮＡクローンに対応する配列の発現を調節するトマト由来の転写開始領域である。該pZ130クローンとハイブリダイズしうる配列、例えばプローブpZ7は、特に開花の初期段階で豊富なｍＲＮＡを示す。該メッセージは、子房珠皮および子房の外果皮組織中で発現され、他の組織中または果実発生の他の段階では発現されないか、あるいは少なくとも容易には検出できない。したがって、本発明の目的においては、pZ130転写開始領域は子房特異的と考えられる。図１には、ｃＤＮＡクローンpZ130のＤＮＡ配列を記載する。pZ130を含む構造遺伝子にコードされるアミノ酸配列の天然の機能については、知られていない。子房組織から成熟する構造体（例えば、果実または繊維）の表現型の修飾を与える関心のあるヌクレオチド配列は、子房組織転写／翻訳開始制御領域の下流にあり、その調節制御下にある。該ヌクレオチド配列は、関心のあるポリペプチド（例えば、酵素）をコードするいずれのオープンリーディングフレームであってもよいし、あるいはゲノム配列に相補的な配列であってもよい。この場合、該ゲノム配列はオープンリーディングフレーム、イントロン、非コードリーダー配列、または他の任意の配列であってもよく、該相補的配列は、転写、メッセンジャーＲＮＡのプロセシング、例えばスプライシング、または翻訳を抑制する。本発明のヌクレオチド配列は、合成物であっても、天然由来であっても、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。関心のあるＤＮＡ配列の性質に応じて、植物に好ましいコドンを有する配列を合成するのが望ましいかもしれない。植物に好ましいコドンは、関心のある特定の植物種において最も多量に発現されるタンパク質中の最高頻度のコドンから決定してもよい。表現型の修飾は、内在的な転写または翻訳の産物の産生を例えば量、相対分布などに関して、あるいは、例えばトランスジェニック宿主細胞または組織において新たな機能または産物を得るために、外在的な転写または翻訳の産物をモジュレーションすることにより達成することができる。特に関心があるのは、サイトカイニン、オーキシン、エチレン、アブシジン酸などの代謝に関与する遺伝子を含む、植物果実の発生に関連した発現産物をコードするＤＮＡ配列である。サイトカイニンの発現をモジュレーションするための方法および組成物は、米国特許第5,177,307号に記載されており、その開示を参考として本明細書に組み入れるものとする。あるいは、他の真核または原核細胞、例えば細菌［例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ Agrobacterium tumefaciens）Ｔ‐DNAオーキシンおよびサイトカイニン生合成遺伝子産物からのもの］、哺乳動物（例えば、インターフェロン）などの起源からの種々の遺伝子を使用してもよい。他の表現型の修飾は、子房の珠皮および／または中心組織から発生する植物部分、例えば、綿繊維などの種皮毛の色の修飾を含む。関心があるのは、メラニン産生に関与する遺伝子、およびインジゴ産生に関与する遺伝子である。メラニンは、動物、植物および微生物（これらはいずれも、本発明の構築物中へ挿入するための配列の起源として使用することができる）で見出される暗褐色の色素である。具体例としては、ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyc es antibioticus）からクローニングすることができるチロシン遺伝子などが挙げられる。エス・アンティバイオティカス（S．antibioticus）中のORF438にコードされるタンパク質もメラニン産生に必要であり、これは銅供与機能を付与しうる。さらに、チロシナーゼ遺伝子は、メラニンを作る生物から単離することができる。該遺伝子は、とりわけ、ヒトの毛、メラノサイトまたは黒色腫、頭足動物および赤雄鶏（red rooster）から単離することができる。例えば、微生物におけるメラニン類、それらの前駆体および誘導体の製造法を開示している欧州出願第89118346.9号を参照されたし。また、Bernanら，Gene（1985）37:101-110; およびdella-Cioppaら，Bio/Technology（1990）8:634-638を参照されたし。トルエンおよびキシレンを（メチル）ベンジルアルコールに酸化し、またインドールをインジゴに変換するキシレンオキシゲナーゼなどのモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を使用することにより、インジゴを得てもよい。キシレンオキシゲナーゼ遺伝子のクローニングならびにヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、 1990年５月７日付け公開の特開平2-119777号に記載されている。また、インドールをインジゴに変換するナフタレンジオキシゲナーゼなどのジオキシゲナーゼも有用であり、ナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子nahAは、Science（1983）22:16 7に記載されている。シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のナフタレンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の特徴づけにおけるヌクレオチド配列のクローニングに関しては、Kurkelaら，Gene（1988）73:355-362を参照されたし。トリプトファナーゼ遺伝子配列をオキシゲナーゼと共に使用して、インジゴへの変換に利用可能なインドールの量を増加させることができる。トリプトファナーゼ遺伝子配列の起源としては、大腸菌（E．coli）などが挙げられる。（例えば、Deeleyら，(1982)J．Bacteriol．151:942-951を参照されたし）。以下の実施例で示すとおり、pZ7プロモーターを使用することによる、トランスジェニックタバコ植物におけるストレプトマイセス（Streptomyces）からのORF4 38およびチロシナーゼ遺伝子の発現、およびトランジットペプチドの作用により、該遺伝子産物を色素体へ標的化することにより、分裂組織領域および基底花芽における色の修飾などの、組織子房および分裂組織由来の組織の表現型の修飾が得られた。ORF438およびチロシナーゼ遺伝子と共に色素体標的化配列を使用しない同様の実験セットでは、表現型の改変は認められなかった。おそらく、該植物は、その植物細胞サイトゾル中の必要な基質の欠損により、メラニンを産生することができなかったのであろう。色素体標的化配列（トランジットペプチド）は、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（SSU）、および植物脂肪酸の生合成に関連した遺伝子、例えばアシルキャリヤータンパク質（ACP ）、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ、β−ケトアシル−ACPシンターゼおよびアシル−ACPチオエステラーゼまたはLHCPIIの遺伝子などの、植物の核にコードされる多数の色素体タンパク質から入手可能である。色素体への輸送を引き起こすトランジットペプチドのコード配列は、特定のトランジットペプチドのコード配列の全部または一部を含んでいてもよいし、また、特定のトランジットペプチドに結合した成熟タンパク質コード配列の一部を含有していてもよい。当該分野においては、標的タンパク質を色素体オルガネラ中に運搬するのに使用しうるトランジットペプチドの多数の例がある。色素体への運搬が達成される限り、本発明で用いる個々のトランジットペプチドコード配列は決定的なものではない。色素合成タンパク質を色素体オルガネラに標的化するトランジットペプチドを用いる代わりに、所望の構築物を使用して、色素体ゲノムを直接的に形質転換してもよい。この場合、植物色素体中で遺伝子の転写を与えうるプロモーターが望ましい。特に関心があるのは、高レベルの転写を付与するT7プロモーターの使用である。色素体は、T7プロモーターからの転写のための適当なポリメラーゼを含有しないため、T7ポリメラーゼを核構築物から発現させ、前記のとおりトランジットペプチドを用いてそれを色素体に標的化させてもよい。（McBrideら，(1994)P roc．Nat．Acad．Sci．91:7301-7305を参照されたし；また、発明の名称が「植物色素体におけるトランスジェニック構築物の制御化発現（Controlled Express ion of Transgenic Constructs in Plant Plastids）」である1995年６月６日付け同時係属米国特許出願第号、および1993年12月14日付け同時係属米国特許出願第08/167,638号および1994年12月12日付け出願のPCT/US94/14574も参照されたし）。発現を適当な組織または発生段階に限定するために、組織特異的なまたは発生的に調節されたプロモーターが、T7ポリメラーゼの発現に有用かもしれない。例えば、花の色の修飾の場合、所望の組織に対する影響を限定するために、花弁特異的プロモーターからT7ポリメラーゼを発現させてもよい。メラニン合成に関与するチロシン基質を液胞中に蓄積する植物組織の場合には、液胞へのメラニン合成遺伝子の標的化にも関心が持たれる。液胞へ標的化するためのタンパク質シグナルは、トマトからのメタロカルボキシペプチダーゼ阻害剤遺伝子の32アミノ酸Ｎ末端領域（Martineauら，(1991)Mol．Gen．Genet．228:28 1-286）などの、通常は粗面小胞体を越えて輸送される植物遺伝子から得てもよい。シグナル配列に加え、液胞標的化構築物は、該コード化タンパク質のカルボキシ末端に位置する液胞局在化シグナル（VLS）をコードする。適当なシグナル配列およびVLS領域は、他の種々の植物遺伝子から得てもよく、それらは、本発明の構築物中で同様に使用することができる。Chrispeelsら．Cell（1992）68:6 13-616において論評されているとおり、多数の液胞標的化ペプチドが当該分野で公知である。このように、色の生成に関与する遺伝子をコードする配列と、細胞の適当な位置に該遺伝子産物を標的化する配列とを有する本発明の構築物は、種々の植物組織における色の修飾に対して広範な適用性を有すると認められる。これらの色を修飾する構築物と共に使用するための植物転写開始領域は、修飾される個々の植物組織に左右されるであろう。例えば、綿繊維の修飾の場合には、綿繊維特異的プロモーターまたはpZ7プロモーター（本明細書に記載されているもの）が有用かもしれない。本適用の方法で有用かもしれない追加的な綿繊維プロモーターは、発明の名称が「綿繊維転写因子（Cotton Fiber Transcriptional Factors）」であるPearらの1995年７月７日付け同時係属米国特許出願第号に記載されている。花の色の修飾の場合、花、特に花弁で優先的に発現される遺伝子からのプロモーターに関心が持たれる。花における発現に有用なプロモーターとしては、例えば、Holtonら，（1994）TIBTECH，Vol 12，p.40-42に記載されているカルコンシンターゼなどが挙げられる（また、Napoliら，（1990）Plant Cell，Vol 2，p．79 -89；Lipphardtら，(1988)EMBO，7(13)，p．4027-4034;およびToguriら，(1993) Plant Mol Biol，Vol 23，p．933-946も参照されたし）。また、植物組織中の着色色素の産生に関与する遺伝子、例えば、アントシアニン着色経路の酵素であるジヒドロフラバノール還元酵素をコードするトウモロコシ（Maize）A1遺伝子にも関心が持たれる。該A1遺伝子を発現する細胞では、ジヒドロケンペロールが、2−8アルキルロイコペラルゴニジンに変換され、これはさらに、内在性植物酵素によりペラルゴニジン色素にまで代謝されうる。また、綿細胞繊維、植物の花または他の植物組織の修飾では、他のアントシアニンまたはフラボノイド型の色素に関心が持たれるかもしれない。植物の花の色についての論評としては、van Tunenら（Plant Biotechnology Series，Volume 2（1990）D evelopmental Regulation of Plant Gene Expression，D．Grierson編）を参照されたし。商業的に栽培される品種の綿繊維は主として白色であるが、天然に存在する他の綿品種は、褐色または赤褐色の繊維を有する。緑色の繊維を含有する綿系統も同定されている。これらの色の綿系統の存在は、アントシアニン色素経路に必要な前駆体が綿繊維細胞中に存在し、これにより、色の表現型のさらなる修飾が可能となることを示唆する。いくつかの適用では、子房珠皮から発生する構造体およびそれに関連した構造体の他の態様を修飾することに関心が持たれる。例えば、繊維の強度、触感などの綿繊維の種々の態様を修飾することに関心が持たれる。したがって、本発明の構築物中に、PHB生合成用遺伝子などの適当な遺伝子を挿入してもよい［Peoplesら，J．Biol．Chem．（1989）264: 15298-1503および同誌，15293-15397;セルロースシンターゼ触媒サブユニット遺伝子のクローニングおよび配列決定を開示しているSaxena，Plant Molecular Biology（1990）15:673-683;およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびカンジダ・アルビカンス（ Candida albicans）のキチンシンターゼ遺伝子を開示しているBowenら，PNAS（1 992）89:519-523を参照されたし］。アンチセンス配列の転写が望ましい場合には、転写カセットを使用してもよい。ポリペプチドの発現が望ましい場合には、関心のあるＤＮＡ配列の転写および翻訳を与える発現カセットを使用することとなる。種々の変化に関心が持たれ、これらの変化は、特定の糖類、ホルモン、酵素または他の生物学的パラメーターの形成のモジュレーション（増加または減少）を含むことがある。また、これらは、最終的な果実または繊維の組成の修飾、すなわち、水、固体、繊維または糖類の比率および／または量の変化を含む。修飾に関する関心のある他の表現型特性は、ストレス、生物、除草剤、ブラッシング（brushing）、成長調節物質などに対する反応を含む。これらの結果は、転写産物の成熟および／または発現を抑制するよう、天然遺伝子の転写産物に対して相補的（アンチセンス）な転写産物を産生させることにより、あるいは、植物の果実の発生に関連した、内在性または外在性のいずれかの遺伝子の発現を引き起こすことにより１以上の内在性産物、特に、酵素または補因子の発現の抑制を引き起こすことのいずれかにより、得ることができる。発現カセット中で使用する終結領域は、比較的に互換性と考えられるため、大部分の場合に便利であろう。該終結領域は、転写開始領域に固有のものであってもよく、関心のあるＤＮＡ配列に固有のものであってもよく、別の起源に由来するものであってもよい。該終結領域は、天然に存在するものであってもよいし、あるいは、全部または一部が合成的であってもよい。オクトピンシンターゼ遺伝子、ノパリンシンターゼ終結領域などの便利な終結領域が、エイ・ツメファシエンス（A．tumefaciens）のTiプラスミドから入手可能である。いくつかの実施態様では、特定の構築物中で使用する子房組織転写開始領域に固有の３'終結領域を使用するのが望ましいかもしれない。本明細書に記載するとおり、いくつかの場合には、特定の遺伝子産物を特異的な細胞部位に標的化させるために、追加的なヌクレオチド配列が構築物中に存在するであろう。例えば、芳香族着色色素の合成のためのコード配列、特に、チロシン、インドールなどの芳香族化合物を基質として有する酵素のコード配列を構築物中で使用する場合は、該酵素を色素体中へ運搬させる配列（例えば、SSUトランジットペプチド配列）を含めることが好ましい。また、メラニンなどのチロシンに由来する色素の合成の場合、液胞への標的化により、色の修飾が強化されるかもしれない。メラニンの産生では、pZ130プロモーターから発現させるために、ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyces antibioticus）からのチロシナーゼおよびORF438遺伝子（Bermanら，（1985）37:101-110）が綿繊維細胞中に与えられる。ストレプトマイセス（Streptomyces）では、ORF438およびチロシナーゼタンパク質は、同じプロモーター領域から発現される。トランスジェニック植物ゲノム中の構築物からの発現では、該コード領域は、別々のプロモーター領域の調節制御下に置かれてもよい。その２つの遺伝子のプロモーター領域は、同じであっても異なっていてもよい。あるいは、単一の植物プロモーターからのその２つの遺伝子の共役発現が望ましいかもしれない。pZ130プロモーター領域からのチロシナーゼおよびORF438遺伝子産物の発現のための構築物は、以下の実施例に詳しく説明されている。また、追加的なプロモーターが望ましい場合もあり、例えば、所望の遺伝子産物の１つを構成的に発現させ、残りの遺伝子産物を綿繊維組織中でpZ130から発現させるために、CaMV35Sなどの植物ウイルスプロモーターを使用することができる。さらに、既に検討したアブラナ属植物種子プロモーター、E6遺伝子プロモーターなど、綿繊維中での遺伝子発現のための他の植物プロモーターの使用も考慮される。同様に、ある適用では、他の構造的プロモーター、例えば、米国特許第5,106,739号およびComaiら，Plant Mol．Biol．(1990)1 5:373-381に記載されているmas、MacまたはDoubleMacプロモーターも有用かもしれない。複数の遺伝子構築物を含む植物、例えば、メラニン遺伝子、ORF438およびチロシナーゼを発現する植物が望ましい場合には、所望の遺伝子の両方を発現する植物を得るために、両構築物による同時形質転換、あるいは個々の構築物による形質転換、ついで植物育種方法により、該植物を得てもよい。通常は、種々の構築物は、植物細胞における選択マーカーに結合されるであろう。該マーカーが、殺生物剤、特に抗生物質、例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールなどに耐性であると好都合である。使用する特定のマーカーは、導入されているＤＮＡを欠く細胞から形質転換細胞を選択するのを可能にするものであろう。本発明の転写カセットを含むＤＮＡ構築物の成分は、宿主に固有の（内在性）または外来性（外在性）の配列から製造してもよい。外来性は、該構築物が導入される野生型宿主中に、該配列が見出されないことを意味する。異種構築物であれば、子房組織転写開始領域が由来する遺伝子に固有でない少なくとも１つの領域を含有することとなる。該構築物の製造では、ＤＮＡ配列を適当な配向で、また適宜、発現のための適当なリーディングフレーム中に得るために、種々のＤＮＡ断片を操作してもよいし、また、ＤＮＡ断片を結合させるために、アダプターまたはリンカーを使用してもよいし、あるいは、便利な制限部位を付与し、余分なＤＮＡを除去し、制限部位を除去するなどのための他の操作が含まれていてもよい。in vitro突然変異誘発では、挿入、欠失または置換、例えばトランジションおよびトランスバージョンが含まれる場合には、プライマー修復、制限酵素処理、アニーリング、切除、連結などを行なってもよい。該構築物が種々の配列に対して効率的に使用できるよう、ベクターまたはカセットが、子房関連転写開始領域の下流にマルチクローニングサイトを含むと好都合である。種々の工程を行なう場合、操作が適切に行われていることを確認するために、ＤＮＡの量を増幅し、ＤＮＡの分析が可能となるよう、クローニングを行なう。制限酵素処理、突出部分のチューイングバック（chewing back）、フィルインによる平滑末端化、リンカーの連結などの適切な操作により、結合および連結のための該断片の相補的末端を得ることができる。大腸菌（E．coli）において機能する複製系と形質転換細胞の選択を可能にするマーカーとを含む多種多様なクローニングベクターが入手可能である。例示的なベクターとしては、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、ｐACYC184などが挙げられる。したがって、該ベクター中の適当な制限部位に該配列を挿入し、得られたプラスミドを使用して大腸菌（ E．coli）宿主を形質転換し、その大腸菌を適当な栄養培地中で増殖させ、その細胞を収穫し溶解し、そのプラスミドを回収してもよい。分析は、配列分析、制限分析、電気泳動などを含んでいてもよい。各操作の後、最終構築物中で使用すべきＤＮＡ配列を制限酵素処理し、次の配列に結合させてもよい。部分構築物のそれぞれを、同じまたは異なるプラスミド中でクローニングしてもよい。植物細胞宿主中に構築物を導入するための種々の技術を利用することができ、これらは当業者に公知である。これらの技術には、トランスフェクション剤としてエイ・ツメファシエンス（A．tumefaciens）またはエイ・リゾゲネス（A．rhizo genes）を用いるＤＮＡのトランスフェクション、プロトプラスト融合、注入、エレクトロポレーション、パーティクルアクセラレーションなどが含まれる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる形質転換には、Tiプラスミド、特にＴ‐DNAと相同なＤＮＡを含有する大腸菌（E．coli）中でプラスミドを調製することができる。該プラスミドは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）中での複製能を有していても有していなくてもよい。すなわち、それは、例えばpRK2 90などの場合と同様、広域スペクトルの原核複製系を有していても有していなくてもよく、これは１つには、該転写カセットがTiプラスミド中に組込まれるべきか、独立したプラスミド上に保持されるべきかに左右される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）宿主は、植物細胞中へのT-DNAの導入に必要なvir遺伝子を有するプラスミドを含有し、完全なT-DNAを有していても有していなくてもよい。TiまたはRiプラスミドのT-DNAの少なくとも右境界、しばしば左右両方の境界を、該転写構築物の隣接領域として結合させることとなる。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用については、広範に研究されており、以下の文献に詳しく記載されている［EPA第120,516号，Hoekema，In: The Binary Plant Vector System Offset−drukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，1985，Chapter V，Knaufら， Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium，In: Molecula r Genetics of the Bacteria-Plant Interaction，Puhler，A編，Springer-Ver lag，NY．1983，p．245およびAnら，EMBO J．（1985）4:277-284］。感染、パーティクルアクセラレーションおよびエレクトロポレーションでは、T- DNA領域中に見出される特に腫瘍遺伝子を欠く安全化したTiプラスミドを、植物細胞中に導入してもよい。ヘルパープラスミドにより、該構築物をエイ・ツメファシエンス（A．tumefaciens）に導入し、得られたトランスフェクションされた生物を使用して、植物細胞にトランスフェクションする。植物細胞中への該転写カセットの導入を可能にするために、形質転換されたエイ・ツメファシエンス（ A．tumefaciens）またはエイ・リゾゲネス（A．rhizogenes）と共に外植片を培養してもよい。あるいは、植物ゲノム中への組込みを増強するために、トランスポゼースと共に、境界としてトランスポゾンの末端反復を使用してもよい。この場合、該転写構築物がゲノム中に組込まれたら、それが比較的安定に組込まれるよう、トランスポゼースの発現は誘導可能であるべきである。ついでトランスジェニック植物細胞を適当な選択培地中に入れて、トランスジェニック細胞を選択し、ついでそれをカルスにまで成長させ、シュートを成長させ、そして発根培地中で成長させることにより該シュートから小植物を産生させる。トランスジェニック細胞および植物中の導入遺伝子の存在を確認するために、当業者に公知の方法を用いてサザンブロット分析を行なうことができる。導入遺伝子の発現産物は、該産物の性質に応じて、種々の方法のいずれかで検出することができ、これらの方法としては、例えば、適当な植物部分または細胞中の色素の形成を検出するため免疫アッセイ、酵素アッセイ、目視検査などが挙げられる。トランスジェニック植物が得られたら、それを成長させて、所望の表現型を有する果実を産生させてもよい。果実または果実の一部（例えば、綿繊維）を収穫し、および／または、その種子を集める。その種子は、所望の特徴を有する追加的な植物を成長させるための起源として使用できることがある。トランスジェニク植物およびトランスジェニック細胞なる語は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック細胞のいずれかに由来する植物および細胞を含む。同じまたは異なる植物起源からの関連転写開始領域を得るために、本発明で有用かもしれない他の配列を単離するための分子プローブとして、本発明で提供される種々の配列を使用してもよい。本発明で提供される配列から得ることができる関連転写開始領域は、該プローブに対して少なくとも約60％の相同性を、そして、より好ましい領域は、より一層大きな割合の相同性を示すであろう。特に重要なのは、本明細書に記載の時機および組織パラメーターを有する関連転写開始制御領域を得ることである。例えば、プローブpZ130を使用することにより、少なくとも７つの追加的なクローンが同定されているが、さらに特徴づけすることはなされていない。したがって、本出願に記載の技術および当該分野で公知の他の技術（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual（Cold S pring Harbor，New York）1982）を用いることにより、本発明に記載の子房組織転写を指令しうる他の転写開始領域を決定してもよい。また、該構築物を植物再生系と共に使用して、植物細胞および植物を得ることができる。また、該構築物を使用して、それにより産生される果実の表現型を修飾してもよい。花の色の修飾では、カーネーション、バラ、ガーバ（gerba）、ユリ、ラン、ペチュニアおよびキクの形質転換などの種々の顕花植物種の形質転換が望ましい。綿への適用の場合、綿の種々の品種および系統が、記載されている方法で有用かもしれない。栽培される綿種としては、西半球で生じたゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）およびジー・ババデンセ（G．babadense）（非常に長期間安定、またはピーマ綿）、および東半球の作物であるジー・ヘルバセウム（G ．herbaceum）およびジー・アルボレウム（G．arboreum）などが挙げられる。以下の実施例は、限定的なものではなく、例示として記載するものである。実験以下の寄託は、American Type Culture Collection（ATCC）（12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852）になされている。バクテリオファージCalgene L ambda 116およびCalgene Lambda 140は、それぞれ本発明の転写開始領域を含有し、 1989年７月13日に寄託されており、それぞれ受託番号第40632号および第40631号を与えられている。実施例１開花前のトマトの子房ｃＤＮＡバンクの構築および子房特異的クローンのスクリーニングｃＤＮＡライブラリーの調製トマト植物（Lycopersicon esculetum cv UC82B）を、温室条件下で成長させた。Manssonら，Mol．Gen．Genet．（1985）200:356-361に記載のとおりに、ポリ( A)＋ＲＮＡを単離した。未開花トマトの花（開花前段階）の子房から調製したポリ(A)＋ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。これは、BRL ｃＤＮＡクローニングキットを製造業者の指示（BRL; Bethesda，MD）に従い使用することにより行なった。得られた二本鎖ｃＤＮＡへの制限エンドヌクレアーゼEcoRIリンカー（107 8，New England Biolabs; Beverly，MA）の付加を、DNA Cloning Vol.I: A Prac tical Approach，Glover編(BRL Press，Oxford 1985)第2章に記載されている方法を用いることにより行なった。ファージLambda ZAP（Stratagene; LaJolla，C A）のEcoRI部位中への該ｃＤＮＡのクローニング、および得られた組換えファージのパッケージング（GigaPack Gold，Stratageneを使用）を、それぞれの市販のプロトコール書に記載されているとおりに行なった。前記のとおりに、同じ開花前段階のｍＲＮＡから、２つのｃＤＮＡライブラリーを調製した。第１のライブラリーに比べて有意に長いｃＤＮＡを含有する第２のライブラリーの場合、該クローニング操作の前に、ポリ(A)＋ＲＮＡサンプルをＲＮＡスピンカラム（Boehringer Mannheim Biochemicals; Indianapolis，IN ）中で製造業者の指示に従い移動させた。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング第１のｃＤＮＡライブラリーを、開花前ｍＲＮＡ、葉ｍＲＮＡおよび稚苗ｍＲＮＡから作製した³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いるディファレンシャルハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。開花前ｍＲＮＡのみとのハイブリダイゼーションに基き、クローンを選択した。選択されたLambda ZAP（Stratagene ）クローンに対応するｃＤＮＡを、該ファージベクターから切り出し、プラスミドとして増殖させた（該製造業者の指示に従った）。1000個のｃＤＮＡの最初のスクリーニングから、それらのｃＤＮＡ挿入断片の配列に基く５つのクラスに含まれる30個の選択されたクローンを単離した。さらに研究するために、２つのクローン（クローンpZ7およびpZ8）を選択した。pZ7およびpZ8のＤＮＡ配列は、それぞれ図１および図４の下線部分として示されている。第2のｃＤＮＡライブラリーからの数千個の組換えクローンを、放射能標識されたｃＤＮＡプローブ混合物によるプラークハイブリダイゼーションにより選択した（Stratagene Cloning Kit Instruction Manualに記載されているとおりに行なった）。第2のライブラリーからの約3000個の組換えクローンをpZ7およびpZ8 ＤＮＡプローブでスクリーニングすることにより、強力なハイブリダイゼーションシグナルを有する14個のクローンが選択された。選択されたクローンを、該ファージベクターから切り出し、プラスミドとして増殖させた。各クローンからＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで切断し、ついで0.7％アガロースゲル中で電気泳動した。Maniatisら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor，New York，1982）に記載されているとおりに、関心のある遺伝子を表す放射能標識プローブ（pZ7およびpZ8）で重複ブロットハイブリダイゼーションを行なった。pZ7とハイブリダイズする７個のクローンおよびpZ8とハイブリダイズする３個のクローンを選択した。これらのうち、各プローブの場合に最も長かったpZ130（pZ7とハイブリダイズしたもの）およびpZ70（pZ8とハイブリダイズしたもの）を、さらに特徴づけし、追加的な実験で使用した。実施例２ｃＤＮＡクローンの分析ノーザン分析該ｃＤＮＡクローンの組織特異性が、以下のとおり示された。開花後１、２、３、４、５、６、７、10、14、17および21日、開花および開花前段階のトマトの子房、トマトの葉および体制未形成のトマトカルスから、EckerおよびDavis（Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，84:5203(1987)）の方法の以下の改変法により、ＲＮＡを単離した。核酸の最初の沈殿の後、該ペレットを、ジエチルピロカルボナート（DEP）で処理された水２ml（氷上）に再懸濁した。該溶液を、１mM MgCl₂に移し、１/４用量の８M LiClを加えた。該サンプルをよく混合し、４℃で一晩保存した。ついで該サンプルを8,000RPM、４℃で20分間遠心した。該ペレットを乾燥し、前記のとおりにDEP処理水（氷上）に再懸濁し、もう一度エタノール沈殿させた。該ＲＮＡを、Fourneyら，Focus（1988）10:5-7に記載されている方法によりホルムアルデヒド／アガロースゲル上で電気泳動し、Nytran膜（Schleicher & Schuell; Keene，NH）上に固定化し、³²P標識プローブとハイブリダイズさせた。³²P標識pZ7 EcoRI挿入ＤＮＡまたはpZ8 EcoRI挿入ＤＮＡによるノーザン分析に基くと、これらの遺伝子は共に、トマト品種UC82Bでは開花時に最も強く発現され、開花の前および１日後では、それよりいくらか弱く発現されることが明らかである。図６は、種々の発生段階のトマトの花を、そしてその直下に、同じ発生段階の花から切り取られた代表的な子房を示す。図６からわかるとおり、両遺伝子の発現は、開花の開始後２日までに既に劇的に減少している。pZ7プローブとハイブリダイズするｍＲＮＡ種のサイズは約800ntであり、pZ8プローブとハイブリダイズするｍＲＮＡ種のサイズは約500ntであった。開花の２日後からは、pZ8 ＲＮＡの蓄積は見掛け上比較的低レベルで維持されていたが、pZ7 ＲＮＡの蓄積はどんどん減少し続け、開花の３週間後までにこの分析による検出は不可能となった。未熟で緑色の果実成熟段階より古いトマト果実から単離されたＲＮＡサンプルにおいては、pZ8 ＲＮＡの蓄積は、前記の方法では検出できなかった。pZ7またはpZ8とハイブリダイズするＲＮＡは、カルス組織では見出されなかった。pZ7とハイブリダイズするＲＮＡは、葉組織では見出されなかった。より長時間露光させると、pZ8の場合にほとんど検出不可能なハイブリダイゼーションシグナルが、葉のＲＮＡで認められた。発現レベルｃＤＮＡプローブに対応するメッセージの存在量を、該クローンからin vitro で合成された既知量のＲＮＡのハイブリダイゼーション強度を開花段階および３週齢のトマト子房からのＲＮＡのものと比較することにより決定した。この分析は、pZ7およびpZ8 ｃＤＮＡが、開花段階のトマト子房中の豊富なＲＮＡクラスを表すことを示し、それぞれ、該メッセージの約５％および２％であった。細胞特異性ｃＤＮＡプローブの細胞特異性は、in situハイブリダイゼーションの技術を用いることにより示すことができる。開花前段階のUC82Bトマトの子房を、４％パラホルムアルデヒド、リン酸緩衝食塩水（PBS）、５mM MgCl₂溶液（pH7.4）（PB Sは、10mMのリン酸緩衝液、pH7.4、150mM NaClである）中で一晩固定した（Sing erら，Biotechniques（1986）4:230-250）。固定後、該組織を、等級化tert-ブチルアルコール（TBA）系列中に通し（50％アルコールから開始した）Paraplast で浸透させ、そして、切片化するためにパラフィン塊に成型した（Berlynおよび Miksche，Botanical Microtechnique and Cytochemistry，(1976)，Iowa）。包埋された子房を、Reichert Hstostatロータリーミクロトーム上で、厚さ８μmの切片に横方向に切断した。５〜７個の子房切片を有するパラフィンリボンを、ゼラチンークロムアルミサブベッド（subbed）スライド（BerlynおよびMiksche(19 76)前掲）に張り付け、in situハイブリダイゼーションを行なうまで、ダストを含まない箱に収容した。ハイブリダイゼーションの準備が整ったスライドを、キシレン中で脱パラフィン化し、エタノール水和系列通すことにより再水和させた（Singerら，前掲（1986）に記載のとおり行なった）。 100μlの20×SSC、20μlの10％BSA、100μlの750mM DTT、200μlの50％硫酸デキストラン、50μlのRNアシンおよび30μlの無菌水よりなる２×ハイブリダイゼーション混合物を調製した。T3およびT7ＲＮＡポリメラーゼin vitro転写（Ribopr obe Promega BiotecまたはStratagene）反応液を製造業者のプロトコールに従い使用して、関心のあるｃＤＮＡから、センスおよびアンチセンスの³⁵S-RNAプローブを作製した。2.5μlのｔＲＮＡ（20mg/ml）、2.5μlのサケ精子ＤＮＡ（10m g/ml）および４×10⁶cpm/プローブを、凍結乾燥器を用いて乾燥した。ついでこの混合物を、１スライド当たり25μlの２×ハイブリダイゼーション混合物を含有する25μlの90％ホルムアミドに再懸濁した。40μlのこのハイブリダイゼーション混合物を、各スライド上に載せた。その切片の上にカバーグラスを載せ、端をゴムのりで密封した。スライドを、ガラススライド箱の内側のスライドホルダーに入れ、ふたをし、一晩37℃のドライオーブンに入れて、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後処理は、Singerら，（1986），前掲に記載されているとおりに行なった。 KODAK Materials for Light Microscope(KODAK(1986); Rochester，NY)に記載されているとおりに、液体乳剤NTB-3を用いて、オートラジオグラフィーを行なった。耐光性の箱の中で約２週間、スライドを露光させた。そのオートラジオグラフィースライドを現像した後、切片を0.05％トルイジンブルー中で染色し、ついで、等級化アルコール系列（キシレン：100％エタノール，１：１)により、ついで100％キシレンの２回の取り替えにより脱水した（各溶液中で５分間）。カバーグラスにCytoseal（VWR; San Francisco，CA）をつけ、乾燥するまでスライドウォーマー上に保った（45〜50℃、１〜２日）。このようにして、オートラジオグラフィーのスライドを、顕微鏡検査のために準備した。開花前のトマト子房をセンスおよびアンチセンスの35S-pZＲＮＡとハイブリダイズさせたると、該アンチセンス転写物は、該子房の外果皮領域および該胚珠の外部領域（珠皮）と特異的にハイブリダイズした。該センス転写物（陰性対照）は、ハイブリダイゼーションを示さなかった。開花前のトマトの子房を、センスおよびアンチセンスの35S-pZ8 ＲＮＡとハイブリダイズさせると、該アンチセンス転写物は、該子房の内部中心領域および該胚珠の外部領域と特異的にハイブリダイズした。該センス転写物は、ハイブリダイゼーションを示さなかった。要するに、pZ7およびpZ8に対応する遺伝子にコードされるｍＲＮＡ転写物は、トマト果実発生の非常に特異的な段階で豊富に発現され、主に、開花時および開花の１日前および後に発現された。さらに、該転写物は、その発生段階の間に、トマト子房細胞型の特異的なサブセット中で、特に珠皮（pZ7およびpZ8）および子房の外果皮（pZ7）および内部中心領域（pZ8）において発現された。実施例３ pZ130 およびpZ70cＤＮＡクローンの配列決定ｃＤＮＡ pZ130およびpZ70クローンの完全なＤＮＡ配列を、Sangerら（1971）のジデオキシ法を用いて決定した。pZ130およびpZ70の両方のＤＮＡ配列は、３つのフレームに翻訳された。それぞれの最も長いオープンリーディングフレームの配列を、図１（pZ130）および図４（pZ70）に示す。実施例４遺伝子ファミリーの分析 Maniatisら，前掲（1982）に記載されているとおりに、サザン分析を行なった。品種UC82Bからの全トマトＤＮＡを、BamHI、EcoRIおよびHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移した。pZ130またはpZ7 0のランダムプライミングにより得られた³²P標識プローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行なった。単純なハイブリダイゼーションパターンは、pZ 130およびpZ70をコードする遺伝子が、該トマトゲノム中の数個またはおそらく１つだけのコピー中に存在することを示した。 pZ130ハイブリダイゼーションプローブを用いて、制限エンドヌクレアーゼBglII で消化されたトマトゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせる追加的な分析は、この遺伝子が、実際には、小さな（約５〜７メンバー）遺伝子ファミリーのメンバーであることを示した。しかしながら、もとのpZ7 ｃＤＮＡクローンは、より長い pZ130クローンの３'非翻訳領域に制限された配列よりなるものであるが、BglII で消化されたトマトゲノムＤＮＡを用いるサザン分析に基けば、それは１つのバンドと強くハイブリダイズし、そして恐らく弱くではあるが第２のバンドとハイブリダイズする。実施例５ゲノムクローンpZ130およびpZ70の調製２つのゲノムクローン（ｃＤＮＡクローンpZ130およびpZ70のそれぞれを代表するもの）を、以下のとおり得た。制限エンドヌクレアーゼSau3Aで部分消化されたトマト品種UC82BのＤＮＡから構築されたゲノムライブラリーを、製造業者の指示（Stratagene; La Jolla，CA）に従い、ラムダファージベクターであるラムダFIX中で確立した。³²P標識pZ130およびpZ70をプローブとして用いて、このライブラリーをスクリーニングした。pZ70とハイブリダイズするトマトゲノムからの約14.5kbの配列を含有するゲノムクローンを単離した。pZ70プローブとハイブリダイズする領域が、Calgene Lambdal16の約２kbのXbaI-HindIII制限断片内で見出された（図５を参照されたし）。トマトゲノムからの約13kbの配列を含有し、pZ130（およびpZ7）とハイブリダイズする第2のゲノムクローンを単離した。p Z130プローブとハイブリダイズする領域が、Calgene Lambda140のより大きなEco RI-HindIII制限断片内で見出された（図３を参照されたし）。pCGN2015 の調製 pCGN2015の調製では、pCGN565をHhaIで消化し、ヤエナリヌクレアーゼで平滑化し、得られた断片を、EcoRVで消化されたBluescriptKSM13-（Stratagene）ベクター中に挿入して、pCGN2008を作製した。pCGN2008を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、クレノウで平滑化し、1156bpのクロラムフェニコール断片を単離した。Bl uescriptKSM13+（Stratagene）をDraIで消化し、2273bpの断片を単離し、pCGN20 08クロラムフェニコール断片と連結して、pCGN2015を作製した。pCGN2901 ／pCGN2902の調製 pCGN2901は、pZ130ゲノムクローンのpZ7とハイブリダイズする領域を囲む領域を含有し、これは５'方向の約1.8kbおよび３'方向の約４kbを含む。pCGN2901を調製するために、Calgene Lambda 140をSalIで消化し、pZ7とハイブリダイズする領域を含有する得られた断片を、pCGN2015中にpCGN2015のユニークなSalI部位に挿入して、pCGN2901を作製した。 pCGN2902は、Calgene Lambda 140のSalI消化に由来するpZ130ゲノムのもう一方のSalI断片（pZ7とハイブリダイズしないもの）を含有しており、これもpCGN201 5構築物中に挿入した。実施例６ pZ130 発現構築物の調製 pCGN2901から単離されたプラスミドＤＮＡを、NcoIで完全に消化し、ついで、ヤエナリから単離したエキソヌクレアーゼ（Promega，Madison，WI）で処理して、 NcoI認識配列の一部を構成するATG配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列を除去した。ついで該サンプルをSacIで完全に消化した。ついで、得られた約1.8kbの５'SacIからNcoIまでの断片を、以下のとおり調製されたpUC由来アンピシリン耐性プラスミドpCGP261（以下に記載のもの）中に挿入した。pCGP261をXbaIで完全に消化し、該一本鎖ＤＮＡ配列をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片での処理によりフィルインし、該pCGP261ＤＮＡをSacIで再消化した。得られた発現構築物は、転写の５'から３'方向に、Lambda 140に由来する子房組織プロモーター、tmr遺伝子およびtmr３'転写終結領域を含有していた。プラスミドpCGP261は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オクトピンTiプラスミドpTi15955（Barkerら，Plant Molec．Biol ．(1983)2:335-350で配列決定されているもの）からの8,762位〜9,836位の配列を含有する。この領域は、イソペンテニルトランスフェラーゼをコードするtmr と称される遺伝子座の完全コード領域（Akiyoshiら，PNAS（1984）81:4776-4780 ）、転写開始ATGコドンの５'側の８bp、転写停止TAGコドンの３'側の341bpの配列を含有する。プラスミドpCG261は、以下のとおり作製した。プラスミドpCGN1278（これは、19 89年７月19日付け同時係属米国出願第382,176号に記載されており、該出願の全体を参考として本明細書に組み入れるものとする）を、XbaIおよびEcoRIで消化した。得られた一本鎖ＤＮＡ配列を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片での処理によりフィルインした。ついで、tmr遺伝子を含有するXbaIからEcoRIまでの断片を、ベクターm13 Bluescriptマイナス（Stratagene Inc.，La Jolla，CA）中にSmaI部位で連結して、プラスミドpCGP259を得た。ATG翻訳開始コドンの上流で見出される領域のすべておよびtmr遺伝子コード領域のいくつかを、pCGP259を BspMIおよびBstXIで消化することにより除去した。得られたコード領域と、最初のATGコドンの上流で見出されるもとの配列の８bpとを、プラスミド中に再導入し、XbaI部位を、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを介してプラスミド中に導入した：5' AATTAGATG CAGGTCCATAAGTTTTTTCTAGACGCG 3'。得られたプラスミドはpCGP261である。ついで、pZ130遺伝子５'およびtmr遺伝子コードおよび３'領域構築物を含有するpCGP261のXbaIからKpnIの断片を、pCGN1557などのバイナリーカセット中に挿入し、トランスジェニック植物を作製した（前記の同時係属米国出願第382,176号を参照されたし）。実施例７ pZ130 プロモーターカセットの調製 pZ130カセットは、転写開始部位の５'側に1.8bp（pCGN2909）または５kb（pCG N2928）のＤＮＡおよびpZ130遺伝子の３'領域（TAA停止コドンから1.2kb下流の部位）を含有する。該pZ130カセットを以下のとおり構築した。転写開始領域 pCGN2901（前記を参照されたし）から単離されたプラスミドＤＮＡを、NcoIで完全に消化し、ついで、ヤエナリから単離されたエキソヌクレアーゼ（Promega，M adison，WI）で処理して、NcoI認識配列の一部を構成するATG配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列を除去した。ついで該サンプルをSacIで完全に消化した。ついで、得られた1.8kbの５'のSacIからNcoIまでの断片を、pCGN2015（前記）中に挿入して、pCGN2904を作製した。重複した制限酵素部位を除去し、後のクローニングをより容易にするために、pC GN2904から単離されたプラスミドＤＮＡを、SalIおよびEcoRIで完全に消化し、p Z130の５'配列を含有する得られた1.8kbの断片を、pBluescriptII（Stratagene; La Jolla，CA）中に挿入して、pCGN2907を作製した。転写および翻訳終結領域 pCGN2901から単離されたプラスミドＤＮＡを、EcoRIおよびBamHIで完全に消化した。pZ130コード領域の下流（３'）に位置する得られた0.72kbのEcoRIからBamHI までの断片を、pCGN2907中に挿入して、pCGN2908を作製した。 pZ130遺伝子TAA停止コドン、および停止コドンと下流（３'）のEcoRI部位との間にそれらの配列を含む約0.5kbのＤＮＡ配列の挿入、および外来遺伝子の挿入を容易にするためのユニークな制限部位の付加を、以下のとおり行なった。以下の部位：PstI-SphI-SmaI-ClaIを有するポリリンカーを作製し、pZ130遺伝子 TAA停止コドンおよびそれに続く（３'）pZ130遺伝子３'領域配列の13塩基対を含ませるために、配列5' GTTCCTGCAGCATGCCCGGGATCGATAATA ATTAAGTGAGGC 3'を含むポリリンカー／「プライマー」を合成した。EcoRI制限部位と、pZ130遺伝子TA A停止コドンの約0.5kb ３'側に位置する該EcoRI部位に直接隣接するpZ130遺伝子３'領域の16塩基対とを有する「プライマー」を作製するために、配列5' CAAGAA TTCATAATATTATATATAC 3'を含むもう１つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらの合成オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で使用した。該PCRでは、サーマルサイクラー（Perkin-Elmer/Cetus，Norwalk，CT）中で製造業者の指示に従い、pCGN2901から単離されたプラスミドを基質として使用した。得られた0.5kbのＤＮＡ産物を、PstIおよびEcoRIで完全に消化し、得られた0.5kbのＤＮＡ断片を、pCGN2908中に挿入して、pCGN2909を作製した。PstI 部位からEcoRI部位までの0.5kbの領域の完全なＤＮＡ配列を、Sangerら（1971）のジデオキシ法を用いて決定して、PCR反応中にオリゴヌクレオチドプライマー間に配列の誤りが生じていないことを確認した。このように、pZ130カセットpCGN2909は、808位のSalI部位から2636位（図２を参照されたし）までの５'pZ130ＤＮＡ配列、遺伝子挿入に使用するのに便利なユニークなPstI、SphIおよびSmaI部位、および3173位のTAA停止コドン（図２）から4 380位のBamHI部位までの３’pZ130 ＤＮＡ配列を含む。実施例８試験構築物の調製および分析 β−グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を使用して、pZ130-GUS構造体の発現および組織特異性を評価した。GUSは、非常に安定な酵素を産生し、植物組織におけるバックグラウンド（内在性）の酵素活性がほとんど又は全くなく、蛍光性または分光光度測定用の基質を用いて容易にアッセイされるため、植物系において有用なレポーター遺伝子である（例えば、Jefferson，Plant Mol．Rep.（ 1987）5:387-405を参照されたし）。トランスジェニック植物における酵素蓄積パターンを分析するために使用することができるGUS酵素活性についての組織化学的染色も、利用可能である（Jefferson(1987)，前掲）。 pZ130カセットpCGN2928は、pCGN2059の3.2 KpnIからSalIまでの断片を、pCGN290 9のKpnIおよびSalI部位中に挿入することにより調製した。pCGN2059は、pCGN290 2の3.2 SalIからBglIIまでの断片をM13mp19中に挿入することにより調製した。したがって、pCGN2928は、図２の808位に位置するSalI部位の上流の追加的な約3 .2kbのpZ130 ＤＮＡ配列を含む以外はpCGN2909と同一である。試験構築物pCGN2917およびpCGN2918の調製これらの構築物は、1.8kbのpZ130 ５'配列、GUS遺伝子コード領域、および1.2kb のpZ130 ３'配列を含有する。pZ2917とpCGN2918とは、バイナリーベクタープラスミドの残りの要素（例えば、CaMVからの35Sプロモーター）に対するpZ130/GUS 構造の配向のみが互いに異なる。これらの構築物は、pRAJ250（Jefferson（1987）前掲）のPstI断片、またはGUS コード領域を含有するPstI断片を有する他の任意のプラスミド構築物を、pCGN29 09のPstI部位に挿入することにより作製した。pZ130遺伝子プロモーター領域に関してセンス配向でGUS遺伝子を有する得られたプラスミドを、pCGN2914と称することとした。pZ130/GUS構造体をXbaIからKpnIまでの断片として切り出し、バイナリーベクターpCGN1557およびpCGN1558中にクローニングして、それぞれpCGN 2917およびpCGN2918を作製した。pCGN1557およびpCGN1558は、McBrideおよびSum merfelt，Plant Mol．Bio．（1990）14:269-296に記載されている。試験構築物pCGN2926の調製この構築物は、５kbのpZ130 ５'配列、GUS遺伝子コード領域、および1.2kbのp Z130 ３'配列を含有する。それは、pCGN2059の3.2kbのKpnIからSalIまでの断片を、pCGN2914のKpnIおよびSalI部位中に挿入することにより作製した。得られたプラスミドを、pCGN2923と称することとした。ついでpZ130/GUS/pZ130構造体を、XbaIからKpnIまでの断片としてpCGN2923から切り出し、バイナリーベクターpC GN1557中にクローニングして、pCGN2926を得た。GUS 酵素活性の分析形質転換体のβ−グルクロニダーゼ活性は、Jefferson（1987）前掲に概説されているとおりに、４−メチル−ウンベリフェリルグルクロニダーゼを基質として使用することにより測定した。GUS酵素活性は、形質転換された植物の子房中で容易かつ定量的に検出され、非形質転換トマト植物から単離された子房においておよび形質転換された植物の葉から認められる活性バックグラウンドに比べて非常に高かった。興味深いことに、形質転換体をpCGN2917とpCGN2918とで比較した際、35S CaMVエンハンサー領域（pCGN1558）への接近が、子房特異的活性を減少または除去しうることが判明した。実施例９ PZ −７綿形質転換外植片の調製コカー（Coker）315の種子の表面を、50％Clorox（2.5％次亜塩素酸ナトリウム）中に20分間入れ、無菌蒸留水中で３回洗浄することにより消毒した。表面消毒の後、25mlの１/２×MS塩：１/２×B5ビタミン：1.5％グルコース：0.3％ゲルライトを含有する25×150の無菌管中で種子を発芽させた。苗を暗所中28℃で７日間成長させた。７日目に、苗を28±２℃の明所に入れた。同時培養および植物の再生バイナリープラスミドpCGN2917およびpCGN2926を含有するエイ・ツメファシエンス（A．tumefaciens）2760株の単一コロニーを、５mlのMG/Lブロスに移し、30℃ で一晩成長させた。細菌培養液を、同時培養の直前にMG/Lで１×10⁸細胞/mlまで希釈した。胚軸を８日齢の苗から切り出し、0.5〜0.7cmの切片に切り、タバコフィーダープレート（Horschら，1985）上に載せた。フィーダープレートは、抗生物質を含まないカルス開始培地（Callus Initiation Medium；CIM）（MS塩：B5 ビタミン：３％グルコース：0.1mg/L 2,4-D：0.1mg/Lカイネチン：0.3％ゲルライト，オートクレーブする前にpHを5.8に調整）を含有するペトリ平板上に1.0ml のタバコ浮遊培養をプレーティングすることにより、使用の１日前に調製した。使用前に、無菌の濾紙ディスク（Whatman#1）を支持細胞上に載せた。すべての切片を調製した後、各切片をエイ・ツメファシエンス（A．tumefaciens）培養中へ浸漬し、無菌ペーパータオル上にブロットし、該タバコフィーダープレートに戻した。該フィーダープレート上での同時培養の２日後、胚軸切片を、75mg/Lのカナマイシンおよび500mg/Lのカルベニシリンを含有する新鮮なカルス開始培地上に載せた。組織を28±２℃、30uE 16:8の明期：暗期で４週間インキュベートした。４週間で、完全な外植片を、抗生物質を含有する新鮮なカルス開始培地へ移した。第２継代での２週間後、カルスを該外植片から取り出し、カルス開始培地と再生培地（Regeneration Medium）（MS塩：40mM KNO₃：10mM NH₄Cl：B5ビタミン：３％グルコース：0.3％ゲルライト：400mg/Lカーブ(carb)：75mg/Lカナマイシン）とで分割した。胚形成カルスを、開始後２〜６ヶ月で同定し、新鮮な再生培地上にサブクローニングした。発芽のために胚を選択し、静置液体胚パルシング培地（Embryo Pulsi ng Medium）（StewartおよびHsu培地：0.01mg/l NAA：0.01mg/Lカイネチン：0.2 mg/L GA3）に入れ、30℃で一晩インキュベートした。胚をペーパータオルにブロットし、ゲルライト（Gelrite）で固化された40mlのStewartおよびHsu培地を含有するマジェンタ（Magenta）箱に入れた。発芽胚を、28±２℃ 50uEm^-2s^-1 16: 8の光周期で維持した。根づいた小植物を土壌に移し、温室中で定着させた。生育箱内の綿の成長条件は、以下のとおりである：16時間の光周期、約80〜85℃ の温度、約500μアインシュタインの光度。温室内の綿の成長条件は、以下のとおりである：少なくとも400μアインシュタインの光度での14〜16時間の光周期、昼温度90〜95°F、夜温度70〜75°F、約80％までの相対湿度。植物の分析温室で成長させたT1植物からの花を、開花時に温室中で標識した。綿の花のつぼみ（綿花芽）、花、莢などを、これらの植物から種々の発生段階で収穫し、GUS 活性に関してアッセイした。GUS蛍光および組織化学的アッセイを、Jefferson（ 1987）前掲に記載のとおり、手で切った切片上で行なった。各構築物（pCGN2917およびpCGN2926）からの少なくとも10の事象（トランスジェニック植物）を、Growth Chambers/Greenhouseに送った。2917個の植物の約80％（9/11）および2926個の植物の100％（12/12）が、蛍光アッセイまたは組織化学的アッセイのいずれかにより検出可能なレベルでGUSを発現した。pCGN2917およびpCGN2926でトランスフェクションされた植物のいくつかからの綿の花のつぼみを、GUSを発現している細胞が青く染まる組織化学的分析により、GUS発現に関してアッセイした。予備分析は、すべての植物が、発生中の花部分でGUSを発現したことを示す。子房および葯は、非常に濃く染まった。ほう葉および室壁が青い場合もあった。これらの植物の５、９および12DPAの莢からの繊維も、GUSを発現していた。つぼみを付けた時から開花後53日までの段階の発生中の莢上で、いくつかのGUS アッセイを行なった。GUS活性は、つぼみおよび花では非常に高い。莢における活性は、植物によって異なる。2926個の植物のうちの２個（43および53dpa）からの繊維中に、活性があった。 β−グルクロニダーゼは、非常に安定な酵素であり、したがって、GUS活性の存在は、遺伝子発現と一過性的に直接相関しないかもしれない。しかしながら、子房珠皮に由来する組織および／または構造体での発現の特異性は、有意であった。子房珠皮に由来しない他の組織は、バックグラウンドを超えるGUS活性を全く示さなかった。GUSの分解の相違および発現の相違は、発現パターンの多様性を説明するかもしれない。綿とトマトとの発現の比較最初のMUGアッセイは、pCGN2917およびpCGN2918でトランスフェクションされたトマトおよび綿植物からの組織上で行なった。GUS活性は、トマトの根、茎および葉ならびに分裂組織および花部分で見出された。活性の量は、植物により異なっていた。綿では、活性は花部分で最高であったが、いくつかの植物の根および茎で検出可能であった。 2926および2917からのT2トマト植物は、開花時に標識されている。これらの植物は、カナマイシン（kan）およびGUSの両方の発現について既に試験されている。その組織が成熟するにつれて、それをアッセイし写真撮影することとなる。実施例10 トランスジェニックメラニン合成遺伝子の発現メラニン合成の遺伝子を発現させるための植物形質転換用のバイナリー構築物は、以下のとおり調製する。ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Stre ptomyces antibioticus）のmelオペロン（Bernanら，（1985）34:101-110）を、 BclI断片として、Bluescriptベクター中にサブクローニングする。NcoIおよびBa mHI部位を、ORF438のATG開始コドン（それを含む）に直接隣接した５'側に突然変異誘発により挿入する。得られたプラスミドは、pCGN4229である。pCGN4229を、ORF438停止コドンの直後にPstI部位を挿入し、tyrA座の停止コドンにNcoIおよびBamHI部位を付加することにより、さらに突然変異誘発し、それにより、突然変異誘発されたmelオペロンを得る。プラスミドベクターからのPstI部位は、tyr Aコード領域の３'側に直接隣接して同様に位置している。 pZ130コード配列の開始METのATGコドンを含むNcoI部位を再挿入するために、pZ1 30カセットpCGN2909を突然変異誘発させて、pCGN4228を得る。pZ130転写終結領域の３'末端のBamHI部位を欠失させ、その位置にAscIリンカー断片を挿入するために、pCGN4228を突然変異させて、pCGN4235を得る。また、３’BamHI部位を欠失させ、pZ130転写開始領域の５'側（Xho/SalI消化し、クレノウ処理したpCGN42 28）にAscIリンカーを挿入するために、pCGN4228を突然変異誘発させて、pCGN42 41を得る。ストレプトマイセス（Streptomyces）ORF438領域を、突然変異誘発させたmelオペロン構築物をNcoIおよびPstIで消化することにより得、Nco/Pstで消化されたp CGN4235中に挿入する。tyrA領域を、その突然変異誘発されたmelオペロン構築物からのNcoI/PstI断片として、Nco/Pstで消化されたpCGN4241中にクローニングする。該トランジットペプチドと該成熟タンパク質の12アミノ酸とをコードするタバコリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子の断片を、NcoI/B amHI断片としてORF438コード配列を有するリーディングフレーム中に挿入する。該断片を、tyrAコード配列の前に同様に挿入する。得られた構築物は、pZ130 ５ 'および３'調節領域からの発現に適した位置にトランジットペプチド／ORF438およびトランジットペプチド／tyrA融合体を含有する。 ORF438およびtyrA構築物の挿入のためのバイナリーベクター（図７を参照されたし）をpCGN1578（McBrideら，前掲）から調製するが、これは、pCGN1578リンカー領域を、以下の制限消化部位：Asp718/Asc/Pac/XbaI/BamHI/Swa/Sse/HindIII （図８を参照されたし）を含有するリンカー領域で置換することにより行なう。これにより、pCGN1578PASSが得られる。Asc、Pac、SwaおよびSseは、８塩基の認識部位を切断する制限酵素である。該酵素のうち、AscおよびPacはNew England Biolabsから、SwaはBoehringer Manheimから、そしてSseはTakara(日本)から入手可能である。 ORF438 pZ130構築物を、pCGN1578PASS中にAsp/Asc断片として挿入する。tyrA pZ 130構築物を、ORF438 pZ130構築物の隣にAsc/Xba断片として挿入する。実施例11 タバコ植物におけるトランスジェニックメラニン合成遺伝子の発現トランスジェニックタバコ植物は、実施例８〜10に記載の技術およびＤＮＡ構築物を用いて作製した。一組の未形質転換植物を、対照として使用した。この以下の実験で使用した未形質転換対照植物は、正常な成長および発生表現型を示した（表１を参照されたし）。トランスジェニック植物の最初の組は、これらのタバコ植物のサイトゾル中でのメラニン合成に関与するORF438およびtyrAの両遺伝子を発現するバイナリーベクターpCGN4269を使用して得た。pCGN4269を使用して得たトランスジェニック植物は、ORF438およびtyrA遺伝子産物の発現を駆動するために使用したトマトからの pZ130転写および翻訳領域を含むＤＮＡ構築物を含有していた。メラニン合成遺伝子のサイトゾル特異的発現により、未形質転換対照タバコと比較して正常な表現型を有するトランスジェニック植物が得られた（表１）。メラニン産生のための基質がサイトゾル中に高レベルで存在しないと予想されるため、これらの植物においてはメラニン合成は検出できない。トランスジェニック植物の第2の組は、メラニン合成遺伝子から発現されるポリペプチドをこれらの植物の色素体へ特異的に標的化するバイナリーベクターpCGN 4272を使用して得た。pCGN4272で形質転換されたトランスジェニック植物は、トマトpZ130転写および翻訳開始領域、およびORF438遺伝子に結合したタバコSSUトランジットペプチドと成熟SSUポリペプチドの６アミノ酸領域とをコードするＤＮＡ、およびtyrA遺伝子に結合したタバコSSUトランジットペプチドと成熟SSUポリペプチドの６アミノ酸領域とをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡ構築物を含有していた。該トランジットペプチドは、ORF438およびtyrA遺伝子産物をこれらの植物の色素体へ輸送するよう方向づけするために使用した。メラニン合成ORF438 およびtyrA産物の色素体標的化発現により、改変された表現型を有する植物が得られた（表１を参照されたし）。表現型の改変には、分裂組織の不全、成長抑制、小さな葉、および新しい葉の萎縮が含まれていた。植物の色の改変も認められた。すなわち、該トランスジェニック植物のいくつかは、対照植物と比べて、分裂組織の黄色化、および該植物の種々の部分および分裂組織の性質をもつ異なる領域にわたり黒色の縞を示した。さらに、これらのトランスジェニック植物の基底花芽は、サイトゾル特異的メラニン合成遺伝子産物を発現したトランスジェニック植物と比べて、あるいは対照植物と比べて、非常に濃かった。pZ7プロモーターが、子房および分裂組織に由来する組織中で外来遺伝子発現を引き起こすことは公知である。この表現型の観察は、色素体中のチロシンアミノ酸プールの枯渇および／または植物の成長および発生に対するオーキシン様メラニン化合物の効果によるものであると考えられる。実施例12 色素合成遺伝子を標的化するための構築物着色化合物の生合成に関与する細菌遺伝子のコード配列および色素体または液胞中へのコード化タンパク質の輸送を方向づけする配列を含有する構築物が好ましい。該配列を、NcoI/EcoRI断片上に存在するよう操作し、ついでそれをさらに操作して、植物組織中での転写を付与するのに有用な転写開始領域を付加する。有用なプロモーターには、例えば、pZ7、T7（色素体の発現の場合）、および綿繊維または植物花弁中での発現を付与しうる種々のプロモーターが含まれる。色素体への標的化の場合には、該構築物は、適当なコード配列を有するリーディングフレーム中に位置する成熟タンパク質（Tssu）の12アミノ酸とトランジットペプチドとをコードするタバコリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子の断片を含有する。インジゴ産生の場合には、pCGN5128（Tssu::tn a）およびpCGN5129（Tssu::pig）が、色素体標的化に有用である。tnaなる名称は、トリプトファンをインドールに変換する酵素である大腸菌（E．coli）からのトリプトファナーゼをコードする遺伝子を表す（Stewartら，（1986）J Bacte riol 166:217-223）。pigなる名称は、インドールからインジゴを産生するロドコッカス（Rhodococcus）からのインジゴ産生のためのタンパク質のコード配列に対して使用される（Hartら，（1990）J Gen Microbiol 136:1357-1363）。tna およびpigは共に、PCRにより得た。pCGN5128およびpCGN5129では、SSUからのトランジットは、タバコの54アミノ酸のトランジットペプチドと、成熟した小サブユニットタンパク質からの12アミノ酸とを含む。植物中でのメラニン産生の場合には、構築物pCGN5075（Tssu::TyrA）およびpCGN 5076（Tssu::ORF438）が、色素体標的化に有用である。このアプローチでは、メラニン合成は、ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyces a ntibioticus）からの２つのタンパク質、すなわち、チロシンをメラニンに変換するtryA、および銅結合においてtyrA酵素を補助すると考えられているORF438（ Bernanら，（1985）Gene 37:101-110）の発現から生じる。両タンパク質は、PCR により得た。pCGN5076およびpCGN5075においても、SSUからのトランジットは、タバコの54アミノ酸のトランジットペプチドと、成熟した小サブユニットからの 12アミノ酸とを含む。メラニン合成遺伝子の液胞への標的化の場合には、構築物は、適当なコード配列を有するリーディングフレーム中に位置するメタロカルボキシペプチダーゼ阻害剤遺伝子の断片（これは、そのタンパク質の完全な32アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドおよび成熟タンパク質の６アミノ酸をコードする（CPI+６））（Martin eauら，前掲）を含む。シグナルペプチドに加えて、液胞の局在化シグナル（VLS ）をコードする配列を、該タンパク質をコードする配列の３'側に挿入する。したがって、液胞中でのメラニン産生では、CPI+6::tyrA::VLSおよびCPI+6::ORF43 8::VLSを使用する。本実施例では、使用したVLSは、Martineauらに記載されているメタロカルボキシペプチダーゼ阻害剤遺伝子のC末端を越えたところから得た８アミノ酸である。前記の結果により示されるとおり、関心のある遺伝子の発現を、トマト果実および綿繊維を含む子房組織由来の細胞中で得ることができ、適当な標的化配列と組み合わされた色素合成に関与する遺伝子の発現により、選択された植物組織中での色表現型の修飾が生じる。本明細書中で引用したすべての刊行物および特許出願は、参考として本明細書中に組み入れるものとする。このことは、個々それぞれの刊行物または特許出願が、具体的かつ個別的に組み入れられることを示すものである。以上の発明は、明瞭化および理解の目的のための例示および具体例により、ある程度は詳しく説明されているが、当業者であれば、添付されている請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それに対して何らかの変化および修飾を加えてもよいと容易に理解するであろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．転写方向に作動可能的に結合した成分として、植物の核にコードされた遺伝子からの輸送シグナルコード配列と、色素の合成に必要なタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとを含んでなるＤＮＡ配列。２．該輸送シグナルコード配列が、色素体トランジットペプチドをコードする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。３．該配列が、前記の植物の核にコードされた遺伝子の成熟タンパク質コード領域の一部をさらに含む、請求項２に記載のＤＮＡ配列。４．該輸送シグナルコード配列が、粗面小胞体を横切る輸送を引き起こすシグナルペプチドをコードする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。５．該配列が、該オープンリーディングフレームの３'側に、液胞局在化シグナルをさらに含む、請求項４に記載のＤＮＡ配列。６．該色素がメラニンまたはインジゴである、請求項１に記載のＤＮＡ配列。７．該オープンリーディングフレームが、細菌遺伝子からのものである、請求項６に記載のＤＮＡ配列。８．該細菌遺伝子が、ORF438、tyrA、pigおよびtnaよりなる群から選ばれる、請求項７に記載のＤＮＡ配列。９．請求項１に記載のＤＮＡ配列に機能的に結合した植物細胞中での転写のためのプロモーターを含んでなるＤＮＡ構築物。 10．該植物細胞が綿繊維細胞である、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。 11．該プロモータがトマトpZ7プロモーターである、請求項10に記載のＤＮＡ構築物。 12．該植物細胞が花弁細胞である、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。 13．請求項９に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる植物細胞。 14．請求項13に記載の細胞を含んでなる植物。 15．植物組織における色の表現型を変えるための方法であって、色素生合成経路中のタンパク質の発現のための構築物（該構築物は、機能的に結合した成分として、該植物組織の細胞中で機能する転写開始領域、植物の核にコードされた遺伝子からの輸送シグナルコード配列、色素の合成に必要なタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、および該植物組織の細胞中で機能する転写終結領域を含む）を含むＤＮＡで植物細胞を形質転換し（この場合、該植物組織は、該タンパク質の基質を含む）、そして該植物細胞を成長させて、該組織（該組織中で、該タンパク質が、該基質と反応して、該色素を産生する）を含む植物を得ることを含んでなる方法。 16．該輸送シグナルコード配列が、色素体トランジットペプチドをコードする、請求項15に記載の方法。 17．該輸送シグナルコード配列が、粗面小胞体を横切る輸送を引き起こすシグナルペプチドをコードする、請求項15に記載の方法。 18．該ＤＮＡが、色素生合成経路中の２つのタンパク質の発現のための構築物を含み、該構築物のそれぞれが、i）からiv）の成分を含み、前記の２つのタンパク質が、同じ遺伝子にコードされない、請求項16に記載の方法。 19．該ＤＮＡが、色素生合成経路中の２つのタンパク質の発現のための構築物を含み、該構築物のそれぞれが、i）からiv）の成分を含み、前記の２つのタンパク質が、同じ遺伝子にコードされない、請求項17に記載の方法。 20．該色素がメラニンであり、前記のタンパク質がtyrAおよびORF438にコードされる、請求項18または19に記載の方法。 21．該色素がインジゴであり、該タンパク質がtnaおよびpigである、請求項18 に記載の方法。 22．植物組織が綿のいがである、請求項15に記載の方法。 23．該植物組織が花弁である、請求項15に記載の方法。