JP2001510021A

JP2001510021A - バナナ植物を遺伝的に形質転換する方法

Info

Publication number: JP2001510021A
Application number: JP2000502651A
Authority: JP
Inventors: ディーンエングラー，; ニールガッターソン，; ギャリーエス．ニスベット，
Original assignee: ゼネカ・リミテッド; ディーエヌエイプラントテクノロジーコーポレイション
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-13
Publication date: 2001-07-31
Also published as: EP0996329A4; US6133035A; EP0996329A1; GT199800108A; CA2296378A1; WO1999003327A1; AU744496B2; SV1998000090A; AU8487898A

Abstract

(57)【要約】バナナ（Ｍｕｓａ属）を、特に、胚形成性材料またはそれに由来する体細胞胚を外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞とのインキュベーションにより形質転換し、そしてそれから再生植物を得ることにより、形質転換する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、一般的に、植物組織培養および高等植物細胞を遺伝的に改変するた
めの方法に関する。より詳細には、本発明は、バナナ植物（Ｍｕｓａ属）を遺伝
的に形質転換し、そしてそれから再生植物を得るための方法に関する。

【０００２】中でも、バナナ（生食用バナナ、プランテーン、および料理用バナナを含む）
は、発展途上国において最も重要な主要食用作物のうちの１つである。実際に、
この果物は、約４億人の人々の主要食物である。近年、バナナ生産は、害虫なら
びに多くの真菌病、細菌病、およびウイルス病により深刻に脅かされている。し
かし、３倍体種において生じる不稔性および倍数性の問題を考えると、失われた
抵抗性特徴をバナナに移入する伝統的な遺伝的改良法は容易には使用され得ない
。

【０００３】バナナ植物における改良形質の育種は、難しくそして時間がかかるので、新品
種のバナナを作出するための好ましい方法は遺伝子操作である。実際に、バナナ
植物の遺伝的改良は科学界の重要な目標である。バナナ植物の遺伝子操作は、数
ある方法論の中でも、外因性ＤＮＡのバナナ細胞への導入技術、および形質転換
された上記細胞の、導入されたＤＮＡが存在すること以外は最初の植物と同一の
バナナ植物への再生技術を含む。遺伝子導入のためのこれらの技術は、好ましく
は、このプロセスの全工程（植物細胞へのＤＮＡ送達から、形質転換された植物
細胞からのインタクトな植物の再生まで）において効率的である。

【０００４】バナナ植物のインビトロ培養のための技術（バナナ組織培養物からの植物の再
生方法を含む）は以前に記載されている。実際に、バナナ組織培養が慣用的に行
われる市販のバナナマイクロプロパゲーション設備がある。しかし、これらの標
準的なマイクロプロパゲーション法は、それらが一般的にＤＮＡ送達と両立でき
ないので、遺伝子導入法の基礎として適切ではない。

【０００５】一般的に、植物は、直接的器官形成、間接的器官形成、または体細胞胚形成に
より組織培養物から再生され得る。バナナ植物を、直接的器官形成および体細胞
胚形成を介して再生するための方法が以前に記載されている。

【０００６】バナナ形質転換について報告された１つの方法は、直接的器官形成およびＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介ＤＮＡ送達の使用を含む。Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）；ＷＯ９５／１５６７８。記載された、バ
ナナ形質転換のための別の方法は、体細胞胚形成およびバイオリスティック（ｂ
ｉｏｌｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡ送達を含む。Ｓａｇｉ（１９９５）。しかし、トラ
ンスジェニックＭｕｓａ植物を作製するための新たなおよび効率的な方法を見出
すことが特に望ましい。

【０００７】（発明の要旨）本発明は、形質転換バナナ植物（Ｍｕｓａ属）を、特に、胚形成性材料（すな
わち、胚形成性カルスもしくは胚形成性細胞懸濁物）またはそれに由来する体細
胞胚を、外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞とのインキ
ュベーション（すなわち共存培養）により形質転換し、そしてそれらから再生植
物を得ることにより作製する方法に関する。本発明の方法は、体細胞胚構造物ま
たは前胚構造物を生成するための供給源組織の培養を含み、次に、これらは培養
されて、胚形成性材料（例えば、胚形成性カルスもしくは胚形成性懸濁物）を生
成する。胚形成性材料は、形質転換された胚形成性材料を生成するためにＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで直接形質転換され得、次いで、形質転換された胚形成性
材料は、形質転換された体細胞胚を生成するために培養される。胚形成性材料は
また、最初に、体細胞胚を生成するために培養され、次いで、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍで形質転換され得、その結果は形質転換された体細胞胚である。

【０００８】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は、好ましくは、形質転換細胞の選択ま
たはスクリーニングを可能にするマーカーの導入を含む。形質転換された体細胞
胚は、形質転換された体細胞胚の数を増加または増大するために培養され得る。
続いて、土壌条件に移され得る成熟した小植物を生成するために発芽が行われる
。

【０００９】本発明の１つの実施態様において、この方法は、以下の工程：（ａ）体細胞性
バナナ植物組織を培養して、少なくとも１つの体細胞胚構造物または前胚構造物
を得る工程；（ｂ）この体細胞胚構造物または前胚構造物を培養して、胚形成性
材料を得る工程；（ｃ）この胚形成性材料を培養して、体細胞胚を得る工程；（
ｄ）工程（ｃ）において生成された体細胞胚を、外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞と共存培養することにより遺伝的に形質転換する工
程であって、このＤＮＡ配列は、代表的に、選択マーカー遺伝子ならびに１つ以
上の発現される目的の遺伝子を含む、工程；（ｅ）形質転換された体細胞胚培養
物を増加させて、さらなる形質転換された体細胞胚を生成する工程；および（ｆ
）この形質転換された体細胞胚を発芽させて、土壌条件に移され得る成熟した小
植物を生成する工程、を包含する。

【００１０】本発明の別の実施態様において、この方法は、以下の工程：（ａ）体細胞性バ
ナナ植物組織を培養して、少なくとも１つの体細胞胚構造物または前胚構造物を
得る工程；（ｂ）この体細胞胚構造物または前胚構造物を培養して、胚形成性材
料を得る工程；（ｃ）胚形成性材料を、外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ細胞と共存培養することにより遺伝的に形質転換する工程であっ
て、このＤＮＡ配列は、代表的に、選択マーカー遺伝子ならびに１つ以上の発現
されるべき目的の遺伝子を含む、工程；（ｄ）形質転換された胚形成性材料を培
養して、形質転換された体細胞胚を得る工程；および（ｅ）形質転換された体細
胞胚を発芽させて、土壌条件に移され得る成熟した小植物を生成する工程、を包
含する。

【００１１】本発明に従うＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介ＤＮＡ送達と体細胞胚形成再生
方法との組み合わせは、予測可能なおよび迅速な様式で新たなバナナ植物を選択
的に育種するための特に有用な技術を提供する。種々の形質（農業経済学的形質
（例えば、耐病性、収量など）および品質形質（例えば、甘味、風味、酸味、色
など）を含む）が、本発明の方法を用いてバナナに安定に導入され得る。

【００１２】（発明の詳細な説明）本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いた形質転換により、特に、胚形
成性材料（例えば、胚形成性カルスもしくは胚形成性細胞懸濁物）またはそれに
由来する体細胞胚培養物を、外因性ＤＮＡ配列を選択的に導入するＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍで形質転換することにより、バナナを遺伝的に形質転換して、遺
伝的に改変されたバナナ細胞、胚、および植物を得る方法に関する。この方法は
、記載されるような、体細胞性バナナ植物組織、胚形成性材料、体細胞胚、導入
されるＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列を有しかつバナナ細胞（例えば、胚形成性カルス
もしくは細胞懸濁物またはそれに由来する体細胞胚）へのそれらの移入を媒介す
るためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、および種々の工程（胚形成性カルス
誘導、胚増殖、ならびに胚および小植物再生を含む）に適切な培養培地の使用を
含み得る。

【００１３】明細書および請求の範囲において使用される以下の用語は、以下の意味を有す
ることが意図される。

【００１４】体細胞胚：体細胞から生じる、接合子胚と同様の構造物。体細胞胚は発芽し、そして供給
源植物の「クローン」になる全植物を形成し得る。換言すれば、体細胞胚から発
芽する全植物は、供給源植物と同一の遺伝子構成を有する。前胚は、体細胞胚に
なる構造物である。

【００１５】胚形成性材料：体細胞胚になり得る細胞（例えば、胚形成性カルスまたは胚形成性細胞懸濁物
）。これらの細胞は、通常、インビトロでの種々の器官の培養により生成される
。胚形成性材料は、体細胞胚へと成熟し得る組織化した構造物（例えば、前胚）
を含み得る。

【００１６】胚形成性カルス：通常、インビトロでの種々の器官の培養により生成される、体細胞胚になり得
る未分化細胞塊。カルスは、固いもの、軟らかいもの、分散性のもの、密集性の
もの、吸収性のもの、乾性のもの、水分が多いものなどであり得る。

【００１７】胚形成性細胞懸濁物：体細胞胚になり得る、液体培地に分散された未分化細胞。これらの未分化細胞
は、通常、インビトロでの種々の器官の培養により生成される。

【００１８】成熟した体細胞胚：形態学的および発生学的に接合子胚に似ており、そして適切な増殖培地に移さ
れた場合に発芽して根およびシュート極（ｓｈｏｏｔｐｏｌｅ）を有する小植
物になり得る、胚形成性細胞に由来する構造物。

【００１９】栄養培地：代表的に、塩、炭素供給源、およびビタミンを、培養される植物細胞の維持を
果たすのに必要な濃度で含む、培地。

【００２０】有効量：記載した工程を果たすのに必要な所定成分の量。

【００２１】作動可能に連結された：２つの核酸間の機能的連結、例えば、プロモーターと第２の配列との間の連結
（ここでプロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始お
よび媒介する）、または配列と３’非翻訳領域／ポリアデニル化シグナルとの間
の連結（ここで一次転写物は切断およびポリアデニル化される）を説明する。一
般的に、作動可能に連結された、とは、連結された核酸配列が隣接し、そして２
つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、隣接しかつ同じリーディ
ングフレーム内にあることを意味する。

【００２２】胚形成性材料の齢：胚形成性材料の齢（代表的に日数で測定される）は、細胞培養の最後の継代培
養からの時間である。従って、「１０日齢未満の」培養物は、１０日未満前に継
代培養された培養物である。

【００２３】本発明での使用のためのバナナ植物組織は、バナナ植物Ｍｕｓａ属の任意の種
（生食用バナナ（核型ＡＡＡ）、プランテーン（核型ＡＡＢ）、および料理用バ
ナナ（核型ＡＢＢ）を含む）から得られ得る。ＢａｎａｎａｓａｎｄＰｌａ
ｎｔａｉｎｓ，Ｓ．Ｇｏｗｅｎ編，ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ，２６
ＢｏｕｎｄｒｙＲｏｗ，ＬｏｎｄｏｎＳＥ１８ＨＮ，ＵｎｉｔｅｄＫｉ
ｎｇｄｏｍ発行，１９９６年増刷，１９９５年初版を参照のこと。例示的な種は
、Ｍｕｓａａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｍｕｓａｂａｌｂｉｓｉａｎａ、Ｍｕｓａｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（Ｍ．ｓａｐｉｅｎｓｉｓ）などを含む。Ｍｕｓａ
ａｃｕｍｉｎａｔａのＡＡＡ品種の種々の品種、特に、Ｃａｖｅｎｄｉｓｈサブ
グループのメンバー（例えば、ＧｒａｎｄＮａｉｎ、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど）
が特に重要である。

【００２４】任意のバナナ植物組織（成熟および未成熟の体細胞性植物組織を含む）は、そ
れが胚形成性材料または体細胞胚を生成し得る限り、本発明における供給源また
は外植片材料として使用され得る。適切な体細胞性植物組織は、雄蕊のみしかも
たない花（すなわち雄花）、雌蕊しかもたない（ｐｉｓｔｏｌａｔｅ）花（すな
わち雌花）、完全花、球茎ディスク（ｄｉｓｃ）、開花茎（ｆｌｏｗｅｒｉｎｇｓｔｅｍ）、包葉などを含む。未成熟花および球茎ディスクは、好ましい体細
胞性植物組織供給源である。

【００２５】好ましい供給源材料は花であり、特に、未成熟花である。未成熟花は、雄花の
つぼみ（ｍａｌｅｂｕｄ）の中の「房（ｈａｎｄ）」に配置される。これらの
花房（ｆｌｏｗｅｒｈａｎｄ）は、約１０〜１２個の個々の花からなり、そし
て雄花のつぼみの中のそれらの位置により同定される（１番目の花房は、花芽分
裂組織の最も近い側の末端に位置する）。本発明における使用に好ましい花房は
、花房番号１５〜３０であり；花房番号２０〜３０がさらにより好ましい。

【００２６】Ｍｕｓａの未成熟花房は単離され、そしてＥｓｃａｌａｎｔＪ．Ｖ．ら（１
９９４，ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ３０：
１８１−１８６）；Ｇｒａｐｉｎ，Ａ．ら（１９９６，ＩｎＶｉｔｒｏＣｅ
ｌｌＤｅｖＢｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ３２：６６−７１）およびＣｏｔｅＦ
．Ｘ．ら（１９９６、ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ９７：２
８５−２９０）（これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書中に援用
される）に記載されるように、胚形成性カルスまたは細胞懸濁物を発生させるた
めに培養され得る。

【００２７】あるいは、胚形成性材料は、時に「頭皮（ｓｃａｌｐ）」と呼ばれる繁殖芽ク
ラスター（ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇｂｕｄｃｌｕｓｔｅｒ）のオーキシン処
理により得られ得、この頭皮は、Ｄｈｅｄ’ａＤら（１９９１，Ｆｒｕｉｔｓ
第４６巻第２号：１２５−１３５）（この開示はその全体が参考として本明
細書中に援用される）において記載されるように、適切なサイトカイニンを補充
した栄養培地上で培養することにより球茎組織スライス上にインビトロで誘導さ
れ得る。ＮｏｖａｋＦ．J．ら（１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第７巻：１５４−１５９）に記載されるように球茎スライス上に発生した前胚培
養物もまた、胚形成性材料を得るためにオーキシン処理とともに使用され得る。

【００２８】導入される外因性ＤＮＡ配列は、通常、形質転換された胚形成性材料またはそ
れに由来する体細胞胚（すなわち、外因性ＤＮＡをそれらの染色体に組込んだ細
胞または胚）のスクリーニングおよび選択を可能にする少なくとも１つの選択マ
ーカー遺伝子、ならびに得られる植物において所望の形質または表現型の発現を
提供するか、増強するか、抑制するか、さもなければ改変するために選択される
１つ以上の目的の遺伝子を有する。このような形質は、農業経済学的形質（例え
ば、耐病性、収量など）および品質形質（例えば、甘味、風味、酸味、色など）
を含む。目的の特定の遺伝子は、ＡＣＣシンターゼ、ＡＣＣオキシダーゼ、Ｒ遺
伝子、植物ホルモン生合成遺伝子または応答遺伝子、インベルターゼ、スクロー
スシンターゼ、スクロースリン酸シンターゼ、ホスホリラーゼ、カロチノイド生
合成遺伝子、およびアントシアニン生合成遺伝子を含む。

【００２９】本明細書中で使用する「目的の遺伝子」は、バナナとは異種であるかまたはバ
ナナに本来あるかのいずれかの、任意の核酸（例えば、遺伝子または遺伝子フラ
グメント）を含む。「異種遺伝子」は異種から生じる遺伝子であるか、または同
種に由来する場合は、その最初の形態から実質的に改変されている遺伝子である
。例えば、コード配列に作動可能に連結された異種プロモーターは、構造遺伝子
が由来する種とは異なる種に由来するプロモーターであるか、または同種に由来
する場合は、一方もしくはその両方がそれらの最初の形態から実質的に改変され
ている。

【００３０】導入される目的の遺伝子は、所望の表現型を付与するポリペプチドをコードす
る構造遺伝子であり得る。あるいは、目的の遺伝子は、バナナ植物内の内因性遺
伝子の転写および／または発現を抑制するか、増強するか、さもなければ改変す
る、転写および／または翻訳制御において役割を果たし得る調節遺伝子であり得
る。遺伝子発現の制御は、観察可能な植物の特徴に直接影響を及ぼし得ることが
認識される。

【００３１】多数のＤＮＡ構築物が、内因性植物遺伝子の発現を抑制するための多数の技術
（例えば、センスもしくはアンチセンス抑制またはリボザイム）において使用さ
れ得る。遺伝子発現のアンチセンスＲＮＡ阻害は示されている；例えば、Ｓｈｅ
ｅｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８８０５−８
８０９（１９８８）およびＨｉａｔｔら、米国特許第４，８０１，３４０号を参
照のこと。遺伝子発現を抑制するためのセンスＤＮＡ配列の使用は、種々の参考
文献（Ｎａｐｏｌｉら（１９９０ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２：２７９−２８９
）および米国特許第５，２８３，１８４号を含む）（これらの開示は、それらの
全体が参考として本明細書中に援用される）において記載される。

【００３２】しばしば、導入される核酸は、それらのネイティブな形態から改変される。例
えば、上記で言及されたセンスおよびアンチセンス構築物は、しばしば、ネイテ
ィブな遺伝子の転写物の全てまたは一部を有し、これは、転写可能なセグメント
の５’末端でプロモーター配列に作動可能に連結され、そして転写可能なセグメ
ントの３’末端で別の遺伝子の３’配列（ポリアデニル化配列を含む）に作動可
能に連結される。当業者に明らかなように、プロモーター配列は、多くの植物の
活性な配列のうちの１つであり得る。あるいは、他の植物の活性なプロモーター
配列は、転写可能なセグメントに連結されて特異的に誘導され得る。プロモータ
ーはバナナに内因性であり得るか、または外因性供給源に由来し得る（例えば、
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒ
ｅ３１３：８１０−８１２（１９８５））。選抜きのプロモーターは、トウモ
ロコシのＵｂｉ１（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ
．，１８，６７５−８９（１９９２））およびＳｙｎｔｈｅｔｉｃＳｕｐｅｒＭＡＳプロモーター（Ｎｉら、ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，７，６
６１−７６（１９９５））である。

【００３３】挿入される構造遺伝子および調節遺伝子は、寄託機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２）から、ならびに他の生物からの単離により（
代表的に、従来のハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８５）に記載される技
術）を用いたゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより）得ら
れ得る。スクリーニングは、（１）他の生物に由来する相同遺伝子を用いた核酸
ハイブリダイゼーション、（２）所望のタンパク質配列をコードする特定の配列
にハイブリダイズするように合成により作製されたプローブ、または（３）ＤＮ
Ａ配列決定および既知の配列との比較、により行われ得る。特定の遺伝子の配列
は、種々のコンピューターデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、国立衛生研究所を含
む）ならびに米国特許庁により維持されるデータベースにおいて見出され得る。

【００３４】目的の遺伝子はまた、相同機能をコードする遺伝子を同定するために相同タン
パク質に対して作られた抗体を用いた、発現ライブラリーの抗体スクリーニング
により同定され得る。トランスポゾンタギングもまた、所望の遺伝子の単離を助
けるために使用され得る。トランスポゾンタギングは、代表的に、標的遺伝子の
変異を含む。トランスポゾンが標的遺伝子に挿入され、そして得られる表現型を
変えた変異遺伝子は単離される。トランスポゾンのためのプローブを用いて、変
異遺伝子が単離され得る。次いで、単離された変異遺伝子のトランスポゾンに隣
接するＤＮＡを用いて、標的遺伝子の正常野生型対立遺伝子が単離され得る。こ
のような技術は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎおよびＷａｌｂｏｔ（１９８７
）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１７：７７１−７７６；Ｄｏｏｎｅｒら（１９８５）Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００：２４０−２４６；ならびにＦｅｄｅ
ｒｏｆｆら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１
：３８２５−３８２９（これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書中
に援用される）において教示される。

【００３５】挿入されるＤＮＡ配列における選択マーカー遺伝子は、通常、形質転換された
カルス、細胞懸濁物、または体細胞胚の選択培地における生存を可能にする機能
をコードする。通常、選択マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性（特に、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｉｎ（登録商標）抵抗性、カナマイシン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性
、ストレプトマイシン抵抗性など）および除草剤抵抗性（特に、クロロスルフロ
ン抵抗性）、栄養マーカーなどをコードする。適切な選択培地の組成は、本明細
書中以下に記載される。

【００３６】目的の遺伝子および選択マーカー遺伝子に加えて、ＤＮＡ配列はまた、形質転
換されたカルス、細胞懸濁物、または体細胞胚の、外因性ＤＮＡ配列の存在およ
び発現についてのスクリーニングを容易にするレポーター遺伝子を含み得る。例
示的なレポーター遺伝子は、本明細書中で以後より詳細に記載されるようなβ−
ガラクトシダーゼを含む。

【００３７】外因性ＤＮＡ配列は、適切なプラスミド上に見出される転移（ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ）ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）領域内に移されたこの配列を有するＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ細胞とのインキュベーションにより、胚形成性カルスもしくは細胞懸
濁物または体細胞胚に導入される。代表的に、バイナリーベクターシステムを使
用して、本発明に従うＤＮＡ配列を導入し得る。第１のプラスミドベクターはＴ
−ＤＮＡ配列を有するが、一方、第２のプラスミドベクターは、通常、Ｔ−ＤＮ
Ａ転移に必須であるが、それ自体は転移されないビルレンス（ｖｉｒ）領域を有
する。両方のプラスミドを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を胚形成性カ
ルス、胚形成性細胞懸濁物、または体細胞胚とともにインキュベートすることに
より、このカルス、細胞懸濁物、または体細胞胚の形質転換は達成され得る。Ｔ
−ＤＮＡは、代表的に、野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの腫瘍誘導性（ｔｕ
ｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）（Ｔｉ）プラスミドのＴ−ＤＮＡに存在する腫瘍
誘導性ｏｎｃ遺伝子を欠失するように改変される。移入されるＤＮＡ配列をＴ−
ＤＮＡ領域に挿入することにより、ＤＮＡ配列の植物ゲノムへの導入がもたらさ
れ得る。本発明のＤＮＡ配列を胚形成性カルス、胚形成性細胞懸濁物、または体
細胞胚に移入するために、他のプラスミド（改変（同時組込み）Ｔｉプラスミド
を含む）がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に利用され得る。

【００３８】組換えバイナリーおよびＴｉプラスミドの構築は、従来の組換えＤＮＡ技術（
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出に記載される技術）を用いて達成され得る。
しばしば、このプラスミドは、適切な宿主（代表的に、Ｅ．ｃｏｌｉ）における
プラスミドの操作および構築を可能にする付加的な選択マーカー遺伝子を含む。
適切な選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン抵抗性、カナマイシン抵抗性、
アンピシリン抵抗性などを含む。

【００３９】ＤＮＡ配列内の遺伝子は、代表的に、バナナ植物宿主に適した適切な転写およ
び翻訳制御配列に連結される。例えば、遺伝子は、代表的に、プロモーターが転
写活性を確実にするのに通常有効な距離に対応した、プロモーターからの距離を
おいて配置される。通常、ポリアデニル化部位および転写終結部位は、遺伝子コ
ード配列の３’末端に提供される。しばしば、必要な制御機能は、構造遺伝子が
他の宿主の標的植物から得られた場合に、この構造遺伝子と共に得られ得る。こ
のようなインタクトな遺伝子は、通常、コード配列、イントロン、プロモーター
、エンハンサー、およびコード配列の上流（５’）または下流（３’）いずれか
の他の全ての調節エレメントを含む。

【００４０】適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
を含む。野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは使用され
得るが、一方、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、使用
前に、「無力化」される（すなわち、その腫瘍誘導活性を取り除かれる）べきで
ある。好ましいＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株は、Ｈ
ｏｅｋｅｍａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９−１８０により記載
されるようなＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄら（１９８６）Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１２９１−１３０１）、ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄら
（１９９３）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ２：２０８−２１）を
含む。

【００４１】所望の外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が調製された
後、それらは、通常、バナナ胚形成性カルスもしくは細胞懸濁物またはそれに由
来する体細胞胚とのインキュベーション前にある期間培養される。最初に、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、栄養素、エネルギー源、およびゲル化剤を含む固形
培地上で培養され得る。適切な栄養素は、塩、トリプトン、および酵母抽出物を
含むが、一方たいていの糖はエネルギー源として適切であり、そしてゲル化剤は
、寒天、Ｇｅｌ−ｒｉｔｅ（登録商標）などであり得る。好ましい培地は、Ｌ−
ＢｒｏｔｈまたはＭｉｎＡ培地である。通常、培地は、プラスミドＤＮＡ配列を
有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを選択するための抗生物質を含む。

【００４２】バナナ体細胞性植物組織から作製され、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに
よる形質転換の標的である、胚形成性材料およびそれに由来する体細胞胚は、好
ましくは、以下の通りに生成される：最初に、バナナ体細胞性組織は、体細胞胚
構造物または前胚構造物を得るために、約２〜４ヶ月間、開始培地上で培養され
る。好ましい開始培地は、Ｍ１培地および改変ＭＳ１培地を含み、これらの両方
は以下の表１に列挙される。Ｍ１の受容可能な範囲および代替成分は、以下の表
２に列挙される。２番目に、これらの体細胞胚構造物または前胚構造物は、胚形
成性材料の発生を誘導し、そしてその量を増大させるために、約４〜６ヶ月間、
増殖培地において培養される。好ましい増殖培地はＭ２およびＺＺを含み、これ
らの両方は以下の表１に列挙される。Ｍ２の受容可能な範囲および代替成分は、
以下の表２に列挙される。３番目に、１つの実施態様において、胚形成性材料は
、それに由来する体細胞胚を得るために、約１ヶ月間、再生培地において培養さ
れる。好ましい再生培地はＭ３を含み、これは以下の表１に列挙される。Ｍ３の
受容可能な範囲および代替成分は、以下の表２に列挙される。４番目に、以下に
説明されるように、体細胞胚は、小植物を生成するために発芽培地において培養
され得る。好ましい発芽培地（Ｍ４）は、以下の表１に列挙される。Ｍ４の受容
可能な範囲および代替成分は、以下の表２に列挙される。

【００４３】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は、体細胞胚構造物または前胚構造物が
開始培地上での培養から得られた後か、胚形成性材料が増殖培地上での培養から
得られた後か、または体細胞胚が再生培地上での培養から得られた後に行われ得
る。しかし、以下でさらに説明されるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質
転換は、増殖培地段階または再生培地段階のいずれかの後に行われることが好ま
しい。

【００４４】ちょうど今記載されたように生成される体細胞胚は、増大した数の形質転換さ
れた胚／形質転換されていない胚を提供するために、繰り返し継代培養され得る
。形質転換されていない体細胞胚は、形質転換のための供給源として直接使用さ
れ得るか、または出発材料としての使用前に継代培養され得る。継代培養は、本
発明の方法のための出発材料源としての体細胞胚の継続的維持を可能にする。

【００４５】所望の形質転換を達成するために、胚形成性材料またはそれに由来する体細胞
胚は、移入される外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞と
ともにインキュベート（すなわち共存培養）される。胚形成性材料の齢（すなわ
ち、最後の継代培養からの時間）は形質転換効率と関連する。最適レベルの形質
転換のために、培養物は約１０日齢未満、好ましくは、約５〜約１０日齢、そし
てより一般的に約７日齢であるべきである。インキュベーションは、好ましくは
共存培養培地において達成され、この培地は、栄養素、エネルギー源、およびＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのビルレンス（ｖｉｒ）領域を誘導して形質転換効率
を向上させるために使用される誘導化合物を含む。誘導可能物は、このようなビ
ルレンスを誘導することが知られている任意のフェノール化合物であり得、好ま
しくは、約１０〜６００Ｍ、好ましくは約１００〜３００Ｍで存在するアセトシ
リンゴン（ＡＳ）である。

【００４６】胚形成性材料、またはそこから誘導される体細胞胚を、適度な温度（代表的に
は約２０℃〜２８℃、好ましくは約２５℃から２７℃の範囲）で、２日間から４
日間、通常は約２日間から３日間、共存培養培地中でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ細胞と混合する。この培地は、好ましくは暗所で保存し、そしてＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍが十分に増殖し、そしてその結果、コロニーが、直接的にまたは
顕微鏡を介してのいずれかで、カルスまたは胚上で観察され得るまで共存培養を
続ける。

【００４７】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞は、約１０⁷〜１０⁹細胞／ｍｌ、好ましくは
約１０⁸細胞／ｍｌの濃度で最初に存在する。通常、カルス材料の計約０．２５から１０ｍｌの沈降細胞体積を、約１から１００ｍｌの全培養体積で使用する。
好ましくは、カルス細胞または体細胞胚およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞
を、共存培養プロセスの間、ろ紙マトリクス（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ＃１）ま
たはガラスマイクロファイバーフィルター上、共存培養培地上に置く。

【００４８】形質転換の完了後、胚形成性材料またはそこから誘導される体細胞胚を、好ま
しくは、水または栄養素、エネルギー源、増殖調節因子などを含む培養培地を用
いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞から洗浄する。形質転換されたカルスま
たは胚を、代表的には約１：３から約１：３０、好ましくは、約１：１０（形質
転換された材料：液体）の体積比で洗浄培地と混合し、そして好ましくは、約５
分間５００ｒｐｍで遠心分離する。ほとんどの細菌を含む、生じる液体画分を除
去するが、カルスまたは胚を含む、より高密度な画分を保存する。洗浄を、任意
の残存するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を殺傷するために、少なくとも後の
洗浄では抗体を使用して、代表的には２回から６回繰り返す。Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍを殺傷し得る任意の抗生物質が使用され得、カルベニシリン（２００
から１０００ｍｇ／ｌ）が好ましい。

【００４９】洗浄後、形質転換された胚形成性材料または体細胞胚を、植物選択薬剤（これ
は、外因性ＤＮＡの部分として導入されたマーカーの存在に基づいて、形質転換
されたカルスまたは胚の同定を許容する）を含む適切な選択培地上に置く。都合
良く、選択培地を、カルスの一部分（代表的には各々約１００−２００ｍｇ）と
共にペトリ皿に置く。選択培地は、例えば、選択薬剤を補充し、そして通常は、
抗Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗生物質を含む、繁殖培地またはＺＺ培地（これ
らの両培地は、本明細書中以下の実験の節に記載される）のような一般的な増殖
培地である。適切な植物選択薬剤には、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（１〜
５０ｍｇ／ｌ）、クロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）（０．０
０１〜０．０５ｍｇ／ｌ）、カナマイシン（１００〜５００ｍｇ／ｌ）などが含
まれる。

【００５０】代表的には、選択培養は、形質転換されたカルス細胞または体細胞胚が増殖し
そして白クリーム色のカルスを産生するが、形質転換されていないカルス細胞お
よび胚は、茶色に変わりそして死滅するのを許容するために十分な時間維持され
る。代表的には、選択培養は、植物選択薬剤の濃度および相対活性に依存して、
約２５〜５０日続けられる。しかし、選択培養を終える主要な判定基準は、繁殖
している細胞（これらは形質転換されている）と繁殖しない細胞（これらは形質
転換されていない）との間の明確な区別にある。

【００５１】生存率は、胚形成性材料（またはそれらから誘導される体細胞胚）が、形質転
換されていることを示すが、標準的アッセイ手順（例えば、サザンブロット、ノ
ザンブロット、制限酵素消化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ）を使
用して、またはレポーター遺伝子の使用によって形質転換を確かめることが、通
常所望される。適切なレポーター遺伝子およびアッセイは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ
，ＧＵＳＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓＵｓｅｒ’ｓＭａｎｕ
ａｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）によって記載され
るようなグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）アッセイおよびＯｗ（１９８６）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２３４：８５６−８５９によって記載されるようなルシフェラーゼアッ
セイを含む。これらのアッセイが、形質転換手順の直後に、または本発明に従っ
て形質転換された植物材料の再分化の間の任意の後の時点で、実施され得ること
が、理解される。

【００５２】好ましくは、形質転換された胚形成性材料、またはそれらから誘導された体細
胞胚は、次いで、十分に形質転換された体細胞胚を産生するために、植物選択薬
剤を含む再生培地に置かれる。この再生培地は、選択薬剤を補充した一般的な増
殖培地（例えば、本明細書中以下の実験の節に記載される増殖培地）であり、通
常、抗Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗生物質を含む。適切な植物選択薬剤には、
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（１〜５０ｍｇ／ｌ）、クロロサルフロン（０
．００１〜０．０５ｍｇ／ｌ）、カナマイシン（１００〜５００ｍｇ／ｌ）など
が含まれる。

【００５３】形質転換された胚形成性材料またはそこから誘導される体細胞胚は、形質転換
された胚形成性材料または体細胞胚が十分に形質転換された体細胞胚を産生する
のを許容するために十分な時間維持される。代表的には、カルス細胞から体細胞
胚（または体細胞胚の増殖）へのこの「再生」は、約２０日間から３０日間続け
られる。

【００５４】選択はまた、発芽段階（ここで、形質転換された胚は、選択薬剤を補充した発
芽培地において好結果に発芽するが、形質転換されていない胚は、発芽しない）
で可能である。初期段階の胚発芽は、胚軸伸長、子葉および葉緑素発達によって
特徴付けられる。発芽の後期段階で、子葉は広がり、胚軸は伸長し、そして主根
は発達する。分化した胚は、発芽培地（これは、本明細書中以下の実験節で詳細
に記載される）において約２週間〜１２週間培養され得る。この結果が、２〜４
枚の葉を有する、長さ１０〜２０ｍｍの体細胞胚である。

【００５５】発芽した胚は、小植物へのさらなる発達のために、種々の培地へ引き続き移植
される。Ｍｕｓａのマイクロプロパゲーションのための多くの適切な培地の例は
、刊行されている。次いで、十分に発達した小植物は、例えば、組織培養小植物
のための従来の様式で温室または他の場所へ移植され得る。

【００５６】生じる小植物の形質転換は、外因性ＤＮＡによって導入された任意の表現型に
ついて植物材料をアッセイすることによって確認され得る。特に、適切なアッセ
イは、特定のレポーター遺伝子（例えば、本明細書中上記に記載されるようなβ
グルクロニダーゼおよび／またはルシフェラーゼ）の存在を決定するために存在
する。ＰＣＲ、制限酵素消化、サザンブロットハイブリダイゼーションおよびノ
ザンブロットハイブリダイゼーションのような他の手順もまた、使用され得る。

【００５７】上記に記載される方法、および以下の実施例に記載される方法は、「Ｇｒａｎ
ｄＮａｉｎ」および「Ｗｉｌｌｉａｍｓ」を含む、多くの異なるＭｕｓａ変種
に適用可能である。特定のプロトコルの好ましい選択は、ある程度は遺伝子型特
異的であり得る。従って、当業者は、種々のＭｕｓａ変種に対して本方法を容易
に適合させ得る。

【００５８】

【表１】

【００５９】

【表２】

【００６０】（実施例１）コスタリカに位置する圃場からのＧｒａｎｄＮａｉｎ花序（「花芽」）を、
出発材料として使用した。花序および苞葉を有する真の茎の末端約２ｃｍが残る
まで、花芽の外部苞葉および花房を除去し、そして捨てた。花芽のこの部分を、
１５分間２０％の漂白溶液中への浸漬、続いて滅菌蒸留水での２回の短時間のす
すぎによって表面滅菌した。第３０番目（大体）の花房が露出するまで、層気流
フード中で滅菌技術を使用して、この残存している花芽上の苞葉および花を、除
去および捨て続けた。この時点から、苞葉は捨てたが、花房が小さくなりすぎて
実際に取り出せなくなるまで（すなわち、大体５番目の花房まで）花房をＭ１培
地上に個別に置いた。花房を、１６時間の明期で、冷白色蛍光下で２８℃に一定
に設定した植物培養室内でインキュベートした。

【００６１】約４ヶ月後、顕微鏡検査は、２７位に位置する花房（すなわち、第２７番目の
花房）が、体細胞胚のクラスターを形成したことを示した。これらの体細胞胚を
、外植体から取り出し、そして２５ｍｌの液体Ｍ２培地を含む２５０ｍｌのＥｒ
ｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコへ移植した。このフラスコを上記に記載した植物培養
室で１００ｒｐｍで振盪した。この培養物に、細胞を覆う約半分の液体を回収し
（しかし細胞自体を除去することは避ける）、そしてこれと新鮮なＭ２培地とを
入れ換えることによって、２ヶ月間新鮮培地を毎週補充した。２ヶ月間の期間の
終わりに、生じた胚形成性懸濁培養物（本明細書中以下「ＥＳＣ１」）を、２つ
の等しい部分に液体および細胞を分け、そして各々において新鮮なＭ２培地を用
いて体積を２５ｍｌにすることにより、２週間ごとに培地補充を実施し、上記に
記載の同じ環境で維持および繁殖させた。

【００６２】ＥＳＣ１の形質転換を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓとの共存培養によって開始した。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥ２１０３の株（これは、プラスミドｐＮＰＴＩＩ２１０３を保
有するＥＨＡ１０１株である）を、液体ＭｉｎＡ培地で増殖させた。培養物を、
液体ＭｉｎＡの添加によって０．１の光学密度（１ｍｌあたり約１０⁸細菌）へ調整し、次いで、共存培養直前に２０Ｍのアセトシリンゴンを補充した。５ｍｌ
のこの細菌培養物を使用して、０．５ｍｌの充填されたＥＳＣ１細胞を覆ってい
る液体を置き換えた。細菌および植物細胞のこの混合物を、約５分間振盪し、次
いで約３分間静置し、その後２．５ｍｌの細菌上清を除去した。残存する細菌懸
濁液およびＥＳＣ１細胞を、４つのガラス繊維フィルターディスク上に分散させ
た。一旦均一に分散させたら、残存する遊離液体（すなわち細菌懸濁液）を除去
した。上面にＥＳＣ１細胞を有する、これらのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに浸
したディスクを、１００Ｍのアセトシリンゴンを補充した固体Ｍ２培地上に置き
、そして暗所にて２４℃、３日間インキュベートした。

【００６３】形質転換されたバナナ細胞についての選択およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
に対する対比選択（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を、２５ｍｇ／ｌのＧ
ｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（選択のため）および５００ｍｇ／ｌカルベニシ
リン（対比選択のため）を補充した固体Ｍ２培地へフィルターディスクを移すこ
とによって実施した。１６時間の明期において２７℃での１ヶ月のインキュベー
ション後、この培養物をフィルターディスクから取り出し、そして上記に記載さ
れるような同じ濃度の選択薬剤および対比選択薬剤を補充したＭ３培地へ移植し
た。球状胚（これは、約１ヶ月後に現れた）を、増殖調節因子、１ｍｇ／ｌのＢ
Ａ、０．５ｍｇ／ｌのジベレリン酸（ＧＡ₃）、選択薬剤および対比選択薬剤である５００ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（
登録商標）を補充した固体Ｍ４培地に置いた。

【００６４】Ｍ４培地での約３週間のインキュベーション後、発芽した胚から新たに現れた
葉におけるβグルクロニダーゼ（「ＧＵＳ」）発現を証明したシュートが現れた
。ＧＵＳは、アッセイした全ての組織において発現された。このことは、発芽し
た胚が十分に形質転換されたことを示す。

【００６５】上記のようなＧＵＳアッセイによって示されるように、選択（すなわち、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）の適用）が、共存培養後１週間遅れた場合、および
４００ｍｇ／ｌのティメントン（Ｔｉｍｅｎｔｏｎ）がカルベニシリンの代わり
に対比選択薬剤として使用された場合、十分に形質転換された植物もまた、この
実験において産生された。

【００６６】（実施例２）実施例１に記載されるように産生しそして維持されたＧｒａｉｎＮａｉｎ胚
形成性懸濁培養物（ＥＳＣ１）を、出発材料として使用した。

【００６７】ＥＳＣ１の形質転換をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥ１３０１株（これは、プラスミドｐＡＬＳ１３０１を保有するＥＨＡ１０１
である）との共存培養によって開始した。接種材料の調製および共存培養を、本
質的に実施例１に記載したように実施した。

【００６８】形質転換されたバナナ細胞ついての選択およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに
対する対比選択を、２５μｇ／ｌのクロロスルフロン（選択のため）および５０
０ｍｇ／ｌのカルベニシリン（対比選択のため）を補充した固体Ｍ２培地へ細胞
を移すことによって実施した。２７℃で１６時間の明期の１ヶ月のインキュベー
ション後、この培養物を、５０μｇ／ｌのクロロスルフロンおよび５００ｍｇ／
ｌのカルベニシリンを補充したＭ３培地へ移した。球状胚（これは、約１ヶ月後
に現れた）を、増殖調節因子（１ｍｇ／ｌのＢＡ、０．５ｍｇ／ｌのＧＡ₃）ならびに選択薬剤および対比選択薬剤（５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、２５μｇ
／ｌのクロロスルフロン）を補充した固体Ｍ４培地に置いた。

【００６９】Ｍ４培地での４週間のインキュベーション後に現れたシュートは、実施例１と
同様に、ＧＵＳアッセイによって示されるように形質転換されたことが証明され
た。

【００７０】実施例１においてのようなＧＵＳアッセイによって示されるように、上記に記
載された条件の以下の変更を適用した場合、十分に形質転換された植物もまた、
本実験で産生された：１μｇ／ｌまたは５０μｇ／ｌのクロロスルフロンの初期
選択、共存培養後の選択薬剤の４週間遅れの適用、ＭＳ塩の代わりにＳＨ塩で調
製し、そして２，４−Ｄの代わりに１ｍｇ／ｌピクロラムを補充したＭ２培地。

【００７１】（実施例３）再生可能なＷｉｌｌｉａｍｓ細胞懸濁液を、以下の改変を有するＤｈｅｄ’ａＤ．ら（１９９１）（前出）によって記載されるプロトコルに本質的に従って
、Ｗｉｌｌｉａｍｓの複数分裂組織発芽培養物から発達させた：「頭皮」または分裂組織発芽クラスターを、正常なシュートチップ培養培地において分裂組織
の高サイトカイニン処理（例えば、５〜１０ｍｇ／ＬのＢＡＰ）を使用して産生
させた。次いでこれらの頭皮を液体ＺＺ培地へ移した。

【００７２】これらの培養物を、２週間で継代培養（４０ｍｌの培地および１０ｍｌの馴化
培地への１．５ｍｌのＰＣＶ）を行ってＺＺ液体培地で維持した。培養物を、何ヶ月間にもわたる増殖の精密さおよび増殖速度について最適化した。懸濁液を
、２週間ごとに継代培養しながら、２５℃（光条件は重要ではない）にて回転式
振盪機（９０ｒｐｍ）で維持した。

【００７３】ＺＺ培地（好ましくは、最後の継代培養以来７日間）の細胞懸濁液を、１ｍｍ
のふるいを通す濾過によって形質転換のために調製した。液体培地を、この濾過
物から除去し、そして残りの細胞をＢＭＳ培地で洗浄した。細胞（２〜３ｍｌの
ＢＭＳ培地において０．５ＰＣＶのアリコート）を、新しい試験管へ移した。

【００７４】バイナリーベクターを、直接の凍結融解形質転換（ＨｏｌｓｔｅｒｓＭら
１９７８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１−１８７）お
よび引き続きの選択を介してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＬＢＡ４４０４株お
よびＥＨＡ１０５株（ＨｏｏｄＥ．Ｅ．ら１９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃＲｅｓｅａｒｃｈ２：２０８−２１８）へ形質転換した。全てのＧＵＳベ
ースのベクターは、共存培養および対比選択（ＶａｎｃａｎｎｅｙｔＧら１
９９０、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：２４５−２５０）後に残って
いる任意の残存Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍでの発現を防止するために、ＧＵＳ
遺伝子のコード領域へスプライスされた植物イントロンを有する。

【００７５】所望のバイナリーベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株のグリセロー
ルストック（−７０℃で保持）を使用して、ＬＢおよびカナマイシン（１００ｍ
ｇ／ｌ）の一晩懸濁を開始した。細菌凝集塊を遠心分離（３０秒間）によって除
去し、次いでこの懸濁液を残存の細菌細胞をペレット化するために遠心分離（１
０分間）した。細菌ペレットを５ｍｌの１／２ＭＳ培地およびアセトシリンゴン
（１００μＭ）で再懸濁し、そして細菌密度を１０⁷〜１０⁸細胞／ｍｌに調整し
た。

【００７６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ細胞懸濁液の形質転換は、プラスミドｐＶＧＩＮ（これは、
ＧＵＳイントロンおよびＮＰＴＩＩ遺伝子を含む）を含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４株およびＥＨＡ１０５株と
の共存培養によって開始した。過剰の培地を、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培養物から除去し、そして３ｍｌの細菌懸濁液を添加した。これらを、３０分間インキュベー
ト（時折反転させて）しておいた。次いで細胞を４．５ｃｍの滅菌フィルターデ
ィスク（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）へ移し、そして過剰な培地を吸い取った。フィル
ターディスクを、固体ＺＺ培地および１００μＭのアセトシリンゴンを含むプレ
ートへ、個々に移した。共存培養を、４８〜７２時間、暗くした２５℃インキュ
ベーターで行った。次いで、細菌増殖を止めるために、フィルターを固体ＺＺ培
地および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンへ移した。

【００７７】形質転換されたバナナ細胞についての選択およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
に対する対比選択を、共存培養させた培養物を、３〜４週間の間、１００ｍｇ／
ｌカナマイシンおよび５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む、液体ＺＺ培地へ
移すことによって行った。次いで、培養物を、安定に形質転換された組織の十分
な選択のために、液体ＺＺおよび１０ｍｇ／ｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ硫酸塩（Ｇ
−４１８）および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンへ移した。形質転換された細
胞集団は、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む培地への移入後、３〜５週間後に現れた。形質転換された状態の胚形成性細胞クラスターを、ＧＵＳアッセイおよびＰＣ
Ｒによって確認した。

【００７８】次いで、安定に形質転換され、迅速に増殖する細胞クラスターは、体細胞胚の
発芽および茎発生（ｃａｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）を介する小植物の十分な再生を
促進するために他の培地移植と共に、Ｄｈｅｄ’ａらによって記載されるような
一連の再生培地に移植され得る。

【００７９】前記の説明および実施例は、説明の目的のみのためのものであって、本発明に
一致すべき保護の範囲を限定するものではない。上記で引用された刊行物、特許
および参考文献の開示は、その全体が本明細書中で援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ガッターソン，ニールアメリカ合衆国カリフォルニア 94618, オークランド，ゴールデンゲイトアベニュー 5169 (72)発明者ニスベット，ギャリーエス. イギリス国アールジー５４エヌエイバークシャー，ウッドレイ，ロチェスターアベニュー５Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD05 AD20 CA05 CA06 CA14 CD02 CD05 CD07 CD08 CD14 CD17 4B024 AA08 AA20 BA80 CA02 DA01 EA10 FA10 GA11 HA01 4B065 AA11Y AA89X AB01 AC20 BA02 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】形質転換バナナ植物を作製する方法であって、バナナ胚形成
性材料を目的の遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで形質転換する工程、
および形質転換された胚形成性材料から形質転換されたバナナ植物を再生する工
程を包含する、方法。
【請求項２】前記胚形成性材料が胚形成性カルスである、請求項１に記載
の方法。
【請求項３】前記胚形成性材料が胚形成性細胞懸濁物である、請求項２に
記載の方法。
【請求項４】前記胚形成性材料が１０日齢未満である、請求項１に記載の
方法。
【請求項５】前記Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが選択マーカーをさらに含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記選択マーカーが、ＮＰＴＩＩまたはＡＬＳからなる群よ
り選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】形質転換バナナ植物を作製する方法であって、バナナ体細胞
胚を目的の遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで形質転換する工程、およ
び形質転換された体細胞胚から形質転換されたバナナ植物を再生する工程を包含
する、方法。
【請求項８】前記Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが選択マーカーをさらに含
む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記選択マーカーが、ＮＰＴＩＩまたはＡＬＳからなる群よ
り選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記形質転換された体細胞胚を増加させて、さらなる形質
転換された胚を生成する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】バナナを遺伝的に形質転換する方法であって、該方法は、
以下の工程：（ａ）体細胞性バナナ植物組織を培地において培養して、少なくとも１つの体
細胞胚構造物または前胚構造物を得る工程；（ｂ）該体細胞胚構造物または前胚構造物を培地において培養して、胚形成性
材料を得る工程；（ｃ）該胚形成性材料を、少なくとも１つの外因性ＤＮＡ配列を有するＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞で形質転換して、形質転換された胚形成性材料を生成
する工程；（ｄ）該形質転換された胚形成性材料を培地において培養して、少なくとも１
つの形質転換された体細胞胚を生成する工程；および（ｅ）該形質転換された体細胞胚を培地において発芽させて、土壌条件に移さ
れ得る成熟した小植物を生成する工程、を包含する、方法。
【請求項１２】工程（ｂ）の前記体細胞胚構造物または前胚構造物が、胚
形成性カルスを得るために培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】工程（ｂ）の前記体細胞胚構造物または前胚構造物が、胚
形成性細胞懸濁物を得るために培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】前記Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが選択マーカーをさらに
含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】前記選択マーカーが、ＮＰＴＩＩまたはＡＬＳからなる群
より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記選択マーカーがＮＰＴＩＩである、請求項１５に記載
の方法。
【請求項１７】前記目的の遺伝子が耐病性遺伝子である、請求項１１に記
載の方法。
【請求項１８】前記形質転換された体細胞胚を増加させて、さらなる形質
転換された体細胞胚を生成する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法
。
【請求項１９】バナナを遺伝的に形質転換する方法であって、該方法は、
以下の工程：（ａ）体細胞性バナナ植物組織を培地において培養して、少なくとも１つの体
細胞胚構造物または前胚構造物を得る工程；（ｂ）該体細胞胚構造物または前胚構造物を培地において培養して、胚形成性
材料を得る工程；（ｃ）該胚形成性材料を培地において培養して、少なくとも１つの体細胞胚を
生成する工程；（ｄ）工程（ｃ）において生成された該体細胞胚を、少なくとも１つの外因性
ＤＮＡ配列を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞で形質転換して、形質転換
された体細胞胚を生成する工程；（ｅ）該形質転換された体細胞胚を増加させて、さらなる形質転換された体細
胞胚を生成する工程；および（ｆ）該形質転換された体細胞胚を発芽させて、土壌条件に移され得る成熟し
た小植物を生成する工程、を包含する、方法。
【請求項２０】工程（ｂ）の前記体細胞胚構造物または前胚構造物が、胚
形成性カルスを得るために培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】工程（ｂ）の前記体細胞胚構造物または前胚構造物が、胚
形成性細胞懸濁物を得るために培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】前記Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが選択マーカーをさらに
含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】前記選択マーカーが、ＮＰＴＩＩまたはＡＬＳからなる群
より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記選択マーカーがＮＰＴＩＩである、請求項２３に記載
の方法。
【請求項２５】前記目的の遺伝子が耐病性遺伝子である、請求項１９に記
載の方法。