KR100446987B1

KR100446987B1 - 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 ｒｅｓｃｕｅｃｌｏｎｉｎｇ용 식물형질전환벡터 ｐＲＣＶ2

Info

Publication number: KR100446987B1
Application number: KR10-2001-0072265A
Authority: KR
Inventors: 박영두; 김형석
Original assignee: 학교법인 경희대학교
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2004-09-01
Also published as: KR20030041463A

Abstract

본 발명은 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 rescue cloning용 식물형질전환벡터 pRCV2에 관한 것으로, 유용 돌연변이체를 만들어 유전자의 기능을 탐색하는 T-DNA tagging 연구 및 형질전환 작물에서 나타나는 도입된 유전자의 비정상적인 발현 양상을 연구하기 위하여 개발된 본 발명 식물형질전환용 벡터는 선발 마커로 하이그로마이신 저항성 유전자를 가지고 있고, β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)을 reporter gene으로 갖추고 있으며, tagging을 위해 이용되는 방법인 rescue cloning과 inverse PCR이 보다 효율적으로 수행될 수 있도록 T-border 내부의 제한효소 인식부위, T-border 바깥쪽과 안쪽부분을 바로 시퀀싱할 수 있는 프라이머 사이트가 각각 고려되어 제작되었기 때문에 전이된 T-DNA 내부의 변이와 식물 genomic DNA를 분리 확보하여 분석할 수 있는 보다 효과적이고 간단한 연구방법을 제공할 수 있으며, 더 나아가 T-DNA가 multiple copy로 전이된 형질전환체의 분석도 가능한 효과가 있다.

Description

하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 ｒｅｓｃｕｅｃｌｏｎｉｎｇ용 식물형질전환벡터 ｐＲＣＶ2 {Plant transformation vector pRCV2 containing hygromycin resistance gene for rescue cloning}

본 발명은 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 rescue cloning용 식물형질전환벡터 pRCV2에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Rescue cloning 기술을 이용하여 식물체내 존재하는 유전자의 기능을 탐색하고 아울러 여러 형질전환 작물에서 나타나는 도입된 유전자의 비정상적인 발현 양상을 연구하기 위한 식물형질전환용 벡터의 개발에 관한 것이다.

Rescue cloning이란 아그로박테리움(Agrobacterium)의 T-DNA가 식물체 게놈내에 random하게 도입되는 현상을 이용하여 다수의 돌연변이 형질전환체를 확보하고 이들을 형질전환되지 않은 정상 식물체와 비교하여 유전자의 기능을 비교할 수 있는 T-DNA tagging 기술과 비슷한 점도 있으나 T-DNA가 multiple로 전이되었을 때 이를 한번에 tagging하여 다양한 경로의 plant flanking DNA를 분리할 수 있는 보다 더 효과적인 방법을 말한다. 이러한 Rescue cloning을 위해서는 재클로닝(recloning)이 가능하도록 제작된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 기법에 의해 대상작물의 게놈상에 삽입시켜야하고, 상기 얻어진 형질전환체의 표현형을 정상개체와 비교하여 차이가 있을 경우 삽입된 T-DNA를 재클로닝하여 단편과 단편의 양옆에 flanking된 부분의 염기서열 정보를 얻어내고, 이를 기초로 정상개체와 돌연변이 개체의 표현형적 형질의 차이를 야기했던 유전자의 염기서열 정보를 비교 분석할 수 있어야 한다. 이처럼 아그로박테리움을 이용한 형질전환시 식물체의 게놈상으로 삽입되는 T-DNA 부분과 형질전환체의 삽입된 T-DNA 부분 양옆으로 flanking되는 식물 게놈 부분을 함께 재클로닝 하기 위해서는 형질전환체의 genomic DNA를 제한효소로 절단할 때 전이된 유전자, 즉 T-DNA 부분을 절단하지 않으면서 flanking된 부분을 적당히 포함시킬 수 있는 적절한 제한효소를 선정해야 한다. 또한 제한효소에 의해 절단된 게놈 단편들을 다시 ligation시켜E.coli로 형질전환시키고 배양해서 LB 배지에 평판배양했을 때 원하는 단편만을 선발할 수 있도록 T-DNA 내부에 항생제 저항성 유전자 부분을 삽입시켜야 하고 박테리아 상태에서 증식이 용이하도록 박테리아의 복제기점(bacterial replication origin)이 있어야 한다. 이와 같은 방법을 통해 정상 개체와의 표현형적 차이를 야기시킨 부분을 재클로닝하고 시퀀싱하여 얻은 정보를 토대로 게놈 프로젝트를 통해 얻어진 개체의 전체 염기서열 데이타와 비교하거나 RFLP 마커로 이용하여 염색체상의 위치를 파악할 수 있다. Rescue cloning 기법은 개개의 유전자의 기능을 연구하는 방편으로 비교적 다수의 형질전환체를 얻기 용이하고 개체 전체의 게놈 염기서열이 해독된 애기장대풀에서 널리 이용되고 있으며 최근 담배와 벼에서도 이용 사례가 보고되고 있다.

Rescue cloning 기술은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환에서 자주 발생하는 transgene의 발현이상 문제를 해결하는 방법으로도 이용될 수 있다. Transgene의 발현이상 문제는 도입된 유전자의 발현이 정상적으로 되지 않는 현상으로 이를 gene silencing 현상이라고 하며 최근에 들어 많은 관심을 불러일으키고 있다. 형질전환체에서 발생하는 transgene의 silencing 현상은 도입되는 유전자의 형태나 카피 수에 따라 나타날 수 있으며 또한 여러 개의 transgene이 동시에 도입될 때는 작물의 게놈과 transgene 사이에서 발생하거나 또는 다수의 transgene 상호간에 발생하는 DNA 메틸레이션에 의해서 일어나는 것으로 추정된다. 최근 이러한 silencing 현상에 대한 원인을 밝히려는 연구가 활발히 진행되고 있으며 그 기작이 밝혀지면서 세 가지의 대표적인 가설로 나눠지고 있다. 지금까지 밝혀진 대표적인 가설은 주로 핵산 수준에서의 관계로 DNA-DNA, RNA-RNA 및 DNA-RNA의 상호관계로 나눌 수 있다. 이러한 가설들을 모두 포함하는 의미로 'homology-dependent gene silencing'이라는 용어가 사용되는데 이는 transgene과 식물 자체에 이미 존재하고 있는 내부유전자 상호간의 혹은 다수의 카피 수를 갖는 transgene 상호간의 상동성에 의하여 나타나는 현상 등을 모두 포함하는 의미로 볼 수 있다.

T-DNA tagging 방법을 이용하여 transgene이 식물체의 게놈에 어떤 형태로 도입되는가를 확인할 수 있고 이를 통해 transgene이 게놈내로 도입될 때 방향성이나 카피 수 및 transgene 상호간의 현상, 즉 DNA 메틸레이션 여부 등을 구명하고 더 나아가 게놈내의 도입 위치상의 유사성 혹은 연관성 여부를 파악할 수 있는 중요한 기능을 갖고 있다.

본 발명은 효과적인 Rescue cloning 용 벡터를 개발하여 식물체내 존재하는 유전자의 기능을 탐색하는데 활용하고 아울러 여러 형질전환 작물에서 나타나는 도입된 유전자의 비정상적인 발현 양상을 연구하는데 손쉽게 활용되기 위해 제안되었다. 또한 본 발명은 T-DNA 안과 밖의 염기서열을 손쉽게 시퀀싱할 수 있는 프라이머를 제작하였기 때문에 연구의 용이함을 더하였고 기존의 다른 연구와 달리 양쪽의 flanking된 부분을 동시에 얻을 수 있는 제한효소사용이 가능하도록 벡터 구축과정에서 이미 적절히 조작된 장점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 선택 마커(selection marker)로 하이그로마이신 저항성 유전자, reporter gene으로 β-글루쿠로니다아제 유전자 및 암피실린 저항성 유전자, 박테리아 복제기점을 포함하고, rescue cloning이 보다 효율적으로 수행될 수 있도록 tagging할 개체의 genomic DNA를 T-DNA 부분과 flanking된 부분이 적절히 포함될 수 있도록 절단하는 제한효소 사이트와 T-border 바깥쪽 부분과 안쪽을 바로 시퀀싱할 수 있는 프라이머 사이트를 포함하는 rescue cloning용 식물형질전환벡터 pRCV2를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 식물형질전환벡터 pRCV2가 도입된 형질전환체 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404/pRCV2 및 상기 벡터의 T-border 외부, 내부를 시퀀싱할 수 있는 프라이머를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입된 식물 형질전환체의 유전자 분석방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 식물형질전환에 있어 선택마커로 하이그로마이신 저항성 유전자와 reporter gene을 갖추고 있는 식물형질전환용 벡터 pCAMBIA1301의 T-DNA 내부에 암피실린 저항성 유전자와 박테리아 복제 기점(bacterial replication origin)을 갖추고 있는 부분을 삽입시키고 이때 벡터 내부에 하나씩만 존재하는 제한효소 사이트 중 식물체의 genomic DNA를 적절한 단편으로 절단할 수 있는 제한효소 사이트를 선택하여 제거함으로써 tagging할 개체의 genomic DNA를 T-DNA 부분과 flanking된 부분이 적절히 포함될 수 있도록 절단할 수 있는 제한효소를 선정하였고, T-DNA border 바깥쪽 부분과 T-DNA 내부를 바로 시퀀싱할 수 있는 프라이머를 제작하여 플라스미드 DNA 상태의 개발된 벡터에 시퀀싱 반응을 시켜본 결과 그 기능의 유효함이 확인됨으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 pCAMBIA1301의 다중 클로닝부위에 pBluescriptII KS(+)가 재조합되어 구축된 식물형질전환용 벡터 pRCV2의 개열지도를 나타낸 모식도이다.

도 2는 pCAMBIA1301과 pBluescriptII KS(+)의 다중 클로닝부위에서BamHI,HindⅢ,PstⅠ의 위치를 나타내는 모식도이다.

도 3은 본 발명 벡터인 pRCV2을PstⅠ으로 처리하여 전기영동한 결과이다.

도 4는 pCAMBIA1301과 pBluescriptII KS(+)를BamHⅠ과HindⅢ로 double digestion한 사진과 겔에서 용출(gel elution)하는 과정을 나타낸 것이다.

도 5는 pRCV2 클론을 맵핑하고 hpt 프라이머와 gus 프라이머로 PCR한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 pRCV2의 T-border 외부(오른쪽)를 시퀀싱하기 위해 만든 프라이머로 염기서열을 분석한 결과이다.

도 7은 pRCV2의 T-border 외부(왼쪽)를 시퀀싱하기 위해 만든 프라이머로 염기서열을 분석한 결과이다.

도 8은 pRCV2의 T-border 내부(오른쪽)를 시퀀싱하기 위해 만든 프라이머로 염기서열 분석한 결과이다.

도 9는 pRCV2의 T-border 내부(왼쪽)를 시퀀싱하기 위해 만든 프라이머로 염기서열 분석한 결과이다.

도 10은A. tumefaciensLBA4404에 도입된 pRCV2를 prep하여 hpt 프라이머와 gus 프라이머로 PCR한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 형질전환체인 담배에 전이된 전이 유전자(transgene) copy수를 서던 블럿팅에 의해 확인한 결과이다.

도 12는 형질전환체인 담배에서 추출된 DNA를 HPT primer와 GUS primer를 이용하여 PCR 반응시킨 결과이다.

도 13은 형질전환체인 담배에서 추출된 plasmid DNA에 제한효소 처리하여 T-border 바깥쪽에 flanking된 절편의 크기를 측정한 결과이다.

도 14는 형질전환체인 담배에서 추출된 plasmid DNA를 T-border 바깥쪽을 sequencing할 수 있도록 미리 제작된 primer로 반응시켜 담배의 genome 일부를 포함되어 있음을 확인한 결과이다.

본 발명은 식물형질전환용 벡터 중 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)를 운반하는 pCAMBIA1301에 암피실린 저항성 유전자와 박테리아 복제기점을 갖고있는 pBluescriptII KS(+)을 삽입시켜 tagging 용 벡터(pRCV2)를 제작하고 tagging할 개체의 genomic DNA를 절단하기 위해 이용할 제한효소를 결정하는 단계; 클로닝된 벡터(pRCV2)를 맵핑하여 클로닝이 정확하게 됐는지 여부를 확인하고 선택 마커와 reporter gene이 벡터내에 존재하는지 여부를 PCR로 확인하는 단계; pRCV2의 전체 염기서열을 기초로 T-DNA 양쪽 border 바깥쪽과 안쪽을 시퀀싱할 수 있는 프라이머를 제작하여 제작된 프라이머를 PCR로 증폭하고 염기서열을 분석하여 제대로 바깥쪽과 안쪽을 시퀀싱할 수 있는지 여부를 확인하는 단계; pRCV2를A. tumefaciensLBA4404내로 삽입하고, 삽입된 pRCV2에 선택 마커와 reporter gene이 존재하는지 여부를 PCR을 통해 확인하는 단계로 구성된다.

상기 단계에서 사용되는 플라스미드 pCAMBIA1301은 CAMBIA사로부터 구입하여 사용하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : Rescue cloning을 위한 식물형질전환용 벡터(pRCV2)에서 rescue cloning 시 T-DNA 양쪽의 flanking된 부분을 동시에 얻을 수 있는 제한효소의 결정

Rescue cloning할 개체의 genomic DNA를 절단하기 위한 적절한 제한효소를 결정하기 위해서 도 2에 나타난 바와 같이 pCAMBIA1301의 다중 클로닝부위와 pBluescriptII KS(+)의 다중 클로닝부위에서BamHⅠ과HindⅢ 사이트 사이에 있는 공통되는 제한효소인PstⅠ 사이트 하나를 제거하고자 하였다. pCAMBIA1301의 다중 클로닝부위와 pBluescriptII KS(+)의 다중 클로닝부위는 각각의 벡터 내에서 단지 하나의 제한효소 사이트를 갖고있는 것들로 이들 중 공통된 사이트 하나를 제거하게 되면 pRCV2에서 그 제한효소는 사이트를 완전히 잃게된다. 따라서 pRCV2를 식물체로 전이시킨 후 해당 제한효소로 형질전환 된 식물체의 genomic DNA를 절단하게되면 T-DNA 부분과 양쪽으로 flanking된 부분을 동시에 얻을 수 있게된다.

실시예 2 : Rescue cloning을 위한 식물형질전환용 벡터(pRCV2)의 구축과 형질전환체 Escherichia coli pRCV2(DH5α)의 제작

Rescue cloning을 위한 벡터를 구축하기 위해 도 1에 나타낸 바와 같이 식물형질전환용 벡터 중 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)를 운반하는 pCAMBIA1301의 T-border 내 다중 클로닝부위에 암피실린 저항성 유전자와 박테리아 복제기점을 갖고있는 pBluescriptII KS(+)를 재조합 하고자 하였다. 먼저 pCAMBIA1301의 다중 클로닝부위와 pBluescriptII KS(+)의 다중 클로닝부위에서 공통되는 제한효소 인식부위인PstⅠ 사이트를 제거하기 위해 pCAMBIA1301과 pBluescriptII KS(+)를 각각BamHⅠ과HindⅢ로 절단하였고 이를 페놀로 처리 후 겔에서 용출(gel elution)하여 ligation시켰다 (도 4). Ligation 반응액을E.coli에 형질전환하기 위해 DH5α competent cell을 LB 액체 배지에서 OD₅₇₀이 0.375가 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 다 자란 cell은 원심분리하여 침전시켜 CaCl₂용액으로 펠렛을 침지시켰고 이를 두 번 반복하였다. 이러한 방법으로 준비된 competent cell에 ligation 반응액를 넣고 42℃ 수조에서 1분 30초간 heat shock 한 후 LB 액체배지를 첨가하였고 이를 1시간 정도 배양한 후 한 하이그로마이신(Hygromycin) 50 mg/L와 암피실린 50 mg/L가 첨가된 LB 고체배지에서 하여 다음날 자란 콜로니를 선발하였다. 클로닝이 제대로 되었는지 여부를 확인하기 위하여 선발된 콜로니를 miniprep하였고 이를 맵핑하여 제대로 된 클론을 선발하였으며, hpt 프라이머와 gus 프라이머로 PCR하여 재조합된 벡터 내에 선발 마커와 reporter gene이 존재하는지 여부를 확인하였다(도 5).

상기 식물형질전환용 벡터 pRCV2로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404/pRCV2은 2001년 11월 19일자로 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KFCC11283으로 기탁하였다.

실시예 3 : Rescue cloning을 위한 식물형질전환용 벡터(pRCV2)에 있어 T-border 외부를 시퀀싱할 수 있는 프라이머의 제작

T-DNA border 외부를 시퀀싱하기 위하여 pCAMBIA1301의 전체 염기서열을 기초로 프라이머를 제작하였다 (서열번호1, 서열번호2). pCAMBIA1301의 전체 염기서열은 NCBI genebank에서 얻었고, DNA 염기서열로부터 프라이머를 제작할 수 있는 primer3 program(www- genome. wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)을 이용하여 pCAMBIA1301의 T-left border 안쪽과 T-right border 안쪽의 염기서열을 기초로 각기 바깥쪽으로 염기서열을 읽을 수 있는 프라이머를 제작하였다. 이렇게 제작된 프라이머가 pRCV2의 T-border 외부를 제대로 시퀀싱할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 제작된 프라이머로 PCR 증폭하였고 이를 pCAMBIA1301과 pBluescriptII KS(+)의 전체 염기서열과 비교한 결과 외부를 정확하게 시퀀싱할 수 있음이 확인되었다 (도6, 도7).

실시예 4 : Rescue cloning을 위한 식물형질전환용 벡터(pRCV2)에 있어 T-border 내부를 시퀀싱할 수 있는 프라이머의 제작

T-DNA border 내부를 시퀀싱하기 위하여 pCAMBIA1301의 전체 염기서열을 기초로 프라이머를 제작하였다 (서열번호3, 서열번호4). pBluescriptII KS(+)의 전체 염기서열은 NCBI genebank에서 얻었고, DNA 염기서열로부터 프라이머를 제작할 수 있는 primer3 program(www- genome. wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)을 이용하여 pBluescriptII KS(+)의 암피실린 저항성 유전자 부근 중심의 염기서열을 기초로 각기 바깥쪽으로 염기서열을 읽을 수 있는 프라이머를 제작하였다. 이렇게 제작된 프라이머가 pRCV2의 T-border 내부를 제대로 시퀀싱할 수 있는지 여부를확인하기 위하여 제작된 프라이머로 PCR 증폭하였고 이를 pCAMBIA1301과 pBluescriptII KS(+)의 전체 염기서열을 비교한 결과 내부를 정확하게 시퀀싱 할 수 있음이 확인되었다 (도8, 도9).

실시예 5 : Rescue cloning을 위한 식물형질전환용 벡터(pRCV2)를 도입시킨 A. tumefaciens LBA4404/pRCV2

시퀀싱으로 확인된 pRCV2를 Freeze-thaw 방법을 이용하여A. tumefaciensLBA4404 cell 안으로 삽입하였다. 먼저 LBA4404 competent cell을 YEP 액체 배지에서 OD₆₀₀이 1.0이 될 때까지 28℃에서 배양하였다. 다 자란 세포는 원심분리하여 다운시키고 0.02M CaCl₂로 펠렛을 침지시켜 0.1ml 씩 나눠 담았다. 이러한 방법으로 준비된 competent cell에 pRCV2 플라스미드 DNA를 넣고 이를 액체질소에 얼렸다. 다음으로 37℃ 수조에서 5분 간 heat shock 한 후 YEP 액체배지를 첨가하였고 이를 2시간 정도 배양한 후 한 하이그로마이신(Hygromycin) 50 mg/L가 첨가된 YEP 고체배지에 분주하여 다음날 자란 콜로니를 선발하였다. 제대로 삽입이 되었는지 여부를 확인하기 위하여 선발된 콜로니를 prep하였고 이를 hpt 프라이머와 gus 프라이머로 PCR하여 확인하였다 (도 10).

실시예 6 : 식물형질전환용 벡터(pRCV2)가 도입된 형질전환식물체의 제조

담배 본엽을 직경 1 cm 크기로 자른 절편을 pRCV2 vector를 포함한Agrobacterium에 접종하였고 이를 공동배양배지(MS, 1.5 mg/L BA)에서 3일간 공동배양(co-cultivation)하였다 (3일). 공동배양 후 상기 절편을 하이그로마이신(Hygromycin; 형질전환 선발 marker)과 cefatoxime (Agrobacterium 제거)이 들어있는 배지 (MS, 1.5 mg/L BA, 20 mg/L hygromycin, 200 mg/L cefotaxime, 0.8% agar)에서 선발하였다. 선발배지에서 재분화된 shoot를 뿌리분화배지 (1/2 MS, 200 mg/L cefotaxime, 0.8% agar)로 옮겨 발근을 유도하였으며. 뿌리가 정상적으로 분화된 식물체를 안정화시킨 후 (1-2주일) 토양에서 재배하였다.

실시예 7 : Rescue cloning을 위한 식물형질전환용 벡터(pRCV2)가 도입된 식물체로부터의 rescue cloning

Rescue cloning을 위해서 먼저 형질전환체에 전이된 전이유전자의 copy 수를 서던 블럿팅에 의해 확인하였다(도 11). 확인 후 카피수가 다른 계통들을 선발하여 온실에서 재배하였고 각 계통으로부터 높은 순도의 genomic DNA를 plant genomic isolation kit(Boehringer mannheim, U.S.A)를 이용하여 genomic DNA를 고농도로 추출하였다. 추출된 genomic DNA를PstⅠ으로 처리하였고 절단된 DNA 단편들을 T4DNA 리가제로 self-ligation 시킨 후 이를 gene-pulser(Bio-Rad, U.S.A)를 이용하여 supercompetent cell(Stratagene, U.S.A)로 일렉트로포레이션(electroporation)시켰고 이를 암피실린이 첨가된 LB 배지에 분주하여 37℃에서 배양하여 식물체 DNA 절편이 삽입된 원하는 콜로니를 얻을 수 있었다.

상기의 방법으로 얻어진 콜로니에서 plasmid miniprep kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 plasmid DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 HPT primer와 GUS primer를 이용하여 PCR 반응시켜 추출된 plasmid DNA에 pRCV2가 포함되어 있는지 여부를 확인하였고 (도 12), 제한효소 처리를 통해 T-border 바깥쪽에 flanking된 절편의 크기를 예측하였다 (도 13). 또한 추출된 plasmid DNA는 T-border 바깥쪽을 sequencing할 수 있도록 미리 제작된 primer로 반응시켜 sequencing하였고 이를 통해 담배의 genome 일부를 포함하는 sequence를 얻을 수 있었다 (도 14).

상기의 방법에 의해 구축된 본 발명 rescue cloning용 식물형질전환용 벡터 pRCV2는 다양한 식물체에서 유전자의 기능을 탐색하는 T-DNA tagging 연구 및 도입된 유전자의 비정상적인 발현 양상을 연구하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은A. tumefaciens를 이용한 형질전환 시 이용될 수 있는 선택 마커로 하이그로마이신 저항성 유전자와 reporter gene으로 β-글루쿠로니다아제와 박테리아에 재클로닝(recloning)을 위해 필요한 암피실린 저항성 유전자 및 박테리아 복제기점을 제공하기 때문에 식물체와E.coli에서 적용이 가능하고 따라서 유전자의 기능을 탐색하거나 도입된 유전자의 안정성 및 도입 자체의 기작을 연구하는데 그 폭을 넓힐 수 있는 효과가 있으며, 현재 유전자의 기능을 탐색하는데 tagging 방법이 유용하게 활용되고 있는데 이에 더하여 본 발명은 전이된 T-DNA 내부의 변이와 식물 genomic DNA를 분리 확보하여분석할 수 있을 뿐만 아니라 T-DNA가 multiple copy로 전이됐을 경우에도 분석이 가능하여 유전자의 기능분석에 용이함을 더할 수 있으므로 유전공학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> KYUNGHEE UNIVERSITY <120> Plant transformation vector pRCV2 containing hygromycin resistance gene for rescue cloning <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sequencing the outside of pRCV2 T-border <400> 1 tcccagataa gggaattagg g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sequencing the outside of pRCV2 T-border <400> 2 agcgcgcaaa ctaggataaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sequencing the inside of pRCV2 T-border <400> 3 ataataccgc gccacatagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sequencing the inside of pRCV2 T-border <400> 4 gcggccaact tacttctgac 20

Claims

하이그로마이신 저항성 유전자, β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)유전자를 포함하는 pCAMBIA 1301 벡터내에 암피실린 저항성 유전자와 박테리아 복제기점이 삽입된 것을 특징으로 하는, 도 1의 개열지도로 나타내어지는 식물형질전환용 벡터 pRCV2.
제1항의 식물형질전환용 벡터 pRCV2을 도입시킨 기탁번호가 KFCC11283인 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404/pRCV2(A. tumefaciensLBA4404/pRCV2)
삭제
제1항의 pRCV2 벡터로 형질전환된 식물체로부터 genomic DNA를 추출하고PstI으로 절단한 다음 라이게이션(ligation)시켜 rescue cloning함을 특징으로 하는 형질전환체의 분석방법.
제1항의 벡터 및 서열번호1 내지 서열번호4의 프라이머로 구성된 것을 특징으로 하는 식물형질전환 및 분석용 킷트.